特許 7575401 断片化が低減した抗アルファベータＴＣＲ結合ポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-21

(45)【発行日】2024-10-29

(54)【発明の名称】断片化が低減した抗アルファベータＴＣＲ結合ポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20241022BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241022BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241022BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 5/14 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 5/16 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 5/38 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 17/14 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20241022BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 39/44 20060101ALI20241022BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K16/28

C07K16/46

A61P43/00 105

A61P37/02

A61P19/02

A61P29/00 101

A61P1/04

A61P25/00

A61P3/10

A61P17/06

A61P17/00

A61P37/08

A61P11/00

A61P5/14

A61P5/16

A61P25/02

A61P5/38

A61P1/16

A61P9/00

A61P21/00

A61P7/06

A61P21/04

A61P17/14

A61P37/06

A61K39/395 U

A61K39/395 G

A61K47/68

A61K9/08

A61K9/19

A61K39/44

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2021559058

(86)(22)【出願日】2020-04-02

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-12

(86)【国際出願番号】 US2020026304

(87)【国際公開番号】W WO2020206063

(87)【国際公開日】2020-10-08

【審査請求日】2023-03-29

(31)【優先権主張番号】62/828,601

(32)【優先日】2019-04-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500034653

【氏名又は名称】ジェンザイム・コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ホアウエイ・チウ

【審査官】松井 一泰

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５２７８０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０３－２１９８９６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－ １９／００

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトαβＴＣＲ／ＣＤ３複合体と特異的に結合する結合ポリペプチドであって、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、および定常領域を含み：
軽鎖可変領域は、配列番号２６、２７、および２８に記載されたアミノ酸配列をそれぞれ含む、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み；
配列番号２８は、アミノ酸配列Ｑ－Ｑ－Ｗ－Ｓ－Ｓ－Ｘ₁－Ｘ₂－Ｌ－Ｔを含み（式中、Ｘ₁ はアミノ酸Ｓであり、Ｘ₂はＰおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸である）；
重鎖可変領域は、配列番号７、１２、１３、１５、および１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；および
定常領域はヒト由来である、前記結合ポリペプチド。

【請求項2】

Ｘ₂はＰである、請求項１に記載の結合ポリペプチド。

【請求項3】

軽鎖可変領域は、配列番号１４に記載のヒト軽鎖フレームワーク領域をさらに含む、請求項１または２に記載の結合ポリペプチド。

【請求項4】

結合ポリペプチドは、ＶＨ３１と比べて５．０を超えるｐＨで安定性が向上し、ＶＨ３１は、配列番号１６の重鎖可変領域および配列番号１４の軽鎖可変領域を含み、該結合ポリペプチドは、ＶＨ３１と比べて４℃を超える温度で安定性が向上する、請求項１～３のいずれか１項に記載の結合ポリペプチド。

【請求項5】

重鎖可変領域は、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の結合ポリペプチド。

【請求項6】

定常領域は、Ｆｃγ受容体結合を低減する修飾されたグリコシル化パターンを有するＦｃ修飾を含み、該Ｆｃγ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の結合ポリペプチド。

【請求項7】

Ｆｃ修飾は、Ｎ２９７Ｑ／Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ、Ｓ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３０
０Ｓ、およびＳ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓからなる群から選択される、請求項６に記載の結合ポリペプチド。

【請求項8】

結合ポリペプチドはヒト化されており、該結合ポリペプチドはモノクローナル抗体であるか、該結合ポリペプチドは多重特異性であるか、または該結合ポリペプチドは二重特異性である、請求項１に記載の結合ポリペプチド。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか１項に記載の結合ポリペプチドと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物であって、該医薬組成物を含む製剤は、凍結乾燥製剤および液体製剤からなる群から選択される、前記医薬組成物。

【請求項10】

Ｔ細胞媒介性疾患または障害のために対象を治療する方法で使用するための、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項11】

Ｔ細胞媒介性疾患または障害は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、強皮症、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）、乾癬、アトピー性皮膚炎、セリアック病、慢性閉塞性肺疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病（甲状腺）、シェーグレン症候群、ギランバレー症候群、グッドパスチャー症候群、アジソン病、ウェゲナー肉芽腫症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、リウマチ性多発筋痛症、レイノー現象、側頭動脈炎、巨細胞性動脈炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、結節性多発動脈炎、ベーチェット病、原発性胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎、心筋炎、リウマチ熱、強直性脊椎炎、糸球体腎炎、サルコイドーシス、皮膚筋炎、重症筋無力症、多発性筋炎、円形脱毛症、白斑、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、および同種移植片拒絶からなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

請求項１～８のいずれか１項に記載の結合ポリペプチドをコードする核酸。

【請求項13】

請求項１２に記載の核酸を含むベクター。

【請求項14】

請求項１２に記載の核酸を発現する細胞であって、該細胞は哺乳動物細胞である、前記細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み入れられている、２０１９年４月３日に出願された米国仮出願第６２／８２８，６０１号の利益を主張するものである。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている配列表を含有する。２０２０年３月３０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは７０４５０３＿ＳＡ９－２５４ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称で、サイズは３２，６０２バイトである。

【背景技術】

【0003】

モノクローナル抗体は、結合ポリペプチドおよび生物学的治療薬の重要なクラスである。一般に、ポリペプチド骨格は生理的条件下で高度に安定である。それにもかかわらず、重鎖および軽鎖ポリペプチドの断片化は治療的モノクローナル抗体に関する大きな関心事となっている。

【0004】

一般に、タンパク質骨格は生理的条件下で高度に安定している。しかし、様々な機序によって、例えば、自発的反応または酵素反応通じてポリペプチド骨格の切断をもたらす天然の共有結合の破壊によって、断片化が引き起こされる場合がある。さらに、特定の領域およびモチーフ（例えば、Ａｓｎ－Ｐｒｏモチーフ）は、アミノ酸配列、二次元または三次元ポリペプチド構造の柔軟性、ならびに適合しない溶媒および環境条件（例えば、温度およびｐＨ）により断片化をより起こしやすい可能性がある。

【0005】

断片化は、生物学的組成物の製造または保存中のいずれの段階でも起こり得る。断片化は、効力の低下または不要な種および潜在的に免疫原性の種の存在をもたらす可能性があるため、いかなる生物学的治療薬の生産においても断片化の低減が重要な検討事項となる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

故に、製造およびその後の保存中の抗体ポリペプチド鎖の断片化の低減を示す、安定性が改善された抗体組成物が当技術分野で必要である。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本開示は、Ｔ細胞媒介性疾患および障害の治療に有用な改善された組成物および方法を提供する。アルファベータＴ細胞受容体（αβＴＣＲ）と特異的に結合するヒト化結合ポリペプチドが提供される。本明細書に提供される抗αβＴＣＲ組成物は、改善された組成物が、軽鎖可変領域の断片化を低減することによって結合ポリペプチドの安定性を高める少なくとも１つのアミノ酸置換または修飾を含むという点で、公知の組成物より改善している。また、改善された組成物を用いてＴ細胞媒介性疾患および障害を治療するための方法（例えば、移植片対宿主病、自己免疫疾患、および移植片拒絶）も提供される。本明細書で提供される方法は一般に、αβＴＣＲと特異的に結合するヒト化結合ポリペプチドの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。

【0008】

驚くことに、本発明者らは、抗ヒトαβＴＣＲ抗体ＶＨ３１の軽鎖のＡｓｎクリッピング部位を除去すると、この抗体の断片化が低減することを見出した。推定Ａｓｎクリッピング部位は相補性決定領域（ＣＤＲ）内で生じること、無関係の抗体（すなわち、ｓＦＬＴ０１）でのＡｓｎクリッピング部位を除去する以前の試みは抗体断片化を防がなかったことから、この発見は特に驚きである。

【0009】

一態様では、ヒトαβＴＣＲ／ＣＤ３複合体に特異的に結合する結合ポリペプチドであって、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、および定常領域を含み：
軽鎖可変領域は、配列番号２６、２７、および２８に記載されたアミノ酸配列をそれぞれ含む、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み；
配列番号２８は、アミノ酸配列Ｑ－Ｑ－Ｗ－Ｓ－Ｓ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｌ－Ｔを含み（式中、Ｘ_１はＱ、Ｄ、Ｈ、Ｓ、Ｙ、およびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ_２はＰおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸である）；
定常領域はヒト由来である、前記結合ポリペプチドが提供される。

【0010】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＳである。

【0011】

ある特定の実施形態では、Ｘ_２はＰである。

【0012】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＳであり、Ｘ_２はＰである。

【0013】

ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１４に記載のヒト軽鎖フレームワーク領域をさらに含む。

【0014】

ある特定の実施形態では、結合ポリペプチドは、ＶＨ３１と比べて５．０を超えるｐＨで安定性が向上する。

【0015】

ある特定の実施形態では、結合ポリペプチドは、ＶＨ３１と比べて４℃を超える温度で安定性が向上する。

【0016】

ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号７、１２、１３、１５、および１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0017】

ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号７、配列番号１２、および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0018】

ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0019】

ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１５として記載されたアミノ酸配列を含む。

【0020】

ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１６として記載されたアミノ酸配列を含む。

【0021】

ある特定の実施形態では、定常領域は、Ｆｃγ受容体結合を低減する修飾されたグリコシル化パターンを有するＦｃ修飾を含む。

【0022】

ある特定の実施形態では、Ｆｃγ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩからなる群から選択される１つまたはそれ以上の受容体である。

【0023】

ある特定の実施形態では、Ｆｃ修飾は、Ｎ２９７Ｑ／Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ、Ｓ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００Ｓ、およびＳ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓからなる群から選択される。

【0024】

ある特定の実施形態では、Ｆｃ修飾はＮ２９７Ｑ／Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓである。

【0025】

ある特定の実施形態では、Ｆｃ修飾はＳ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００Ｓである。一実施形態では、Ｆｃ修飾はＳ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓである。

【0026】

ある特定の実施形態では、結合ポリペプチドはヒト化されている。

【0027】

ある特定の実施形態では、結合ポリペプチドはモノクローナル抗体である。

【0028】

ある特定の実施形態では、結合ポリペプチドは多重特異性である。

【0029】

ある特定の実施形態では、結合ポリペプチドは二重特異性である。

【0030】

別の態様では、本明細書に記載された結合ポリペプチドと、薬学的に許容される担体または希釈剤をと含む医薬組成物が提供される。

【0031】

別の態様では、本明細書に記載された医薬組成物を含む製剤が提供される。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤である。ある特定の実施形態では、製剤は凍結乾燥製剤である。

【0032】

別の態様では、治療が達成されるように、本明細書に記載された結合ポリペプチドまたは医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、Ｔ細胞媒介性疾患または障害のために対象を治療する方法が提供される。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞媒介性疾患または障害は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、強皮症、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）、乾癬、アトピー性皮膚炎、セリアック病、慢性閉塞性肺疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病（甲状腺）、シェーグレン症候群、ギランバレー症候群、グッドパスチャー症候群、アジソン病、ウェゲナー肉芽腫症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、リウマチ性多発筋痛症、レイノー現象、側頭動脈炎、巨細胞性動脈炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、結節性多発動脈炎、ベーチェット病、原発性胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎、心筋炎、リウマチ熱、強直性脊椎炎、糸球体腎炎、サルコイドーシス、皮膚筋炎、重症筋無力症、多発性筋炎、円形脱毛症、白斑、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、および同種移植片拒絶からなる群から選択される。

【0033】

別の態様では、本明細書に記載された結合ポリペプチドをコードする核酸が提供される。

【0034】

別の態様では、本明細書に記載された核酸を含むベクターが提供される。

【0035】

別の態様では、本明細書に記載された核酸を含む細胞が提供される。一実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞からなる群から選択される。

【0036】

本発明の前述および他の特徴および利点は、添付図面と併せて理解される例示的な実施形態の以下の詳細な説明から、より十分に理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】５週間にわたる高温（４５℃）および示されたｐＨを含む加速条件下の、参照ヒト化抗αβＴＣＲ抗体ＶＨ３１製剤化抗体の断片の低分子量（ＬＭＷ）の出現を示すタンパク質ゲルの写真である。ＨＣ、重鎖；ＬＣ、軽鎖。

【図2】５週間にわたる加速条件下の様々な濃度での参照ＶＨ３１製剤化抗体の効力をプロットする線グラフである。白抜きの四角は、４５℃、ｐＨ８．０で保存された参照ＶＨ３１抗体に対応する；白抜きの丸は、４５℃、ｐＨ５．０で保存された参照ＶＨ３１抗体に対応する；および白抜きの菱形は、対照条件下、すなわち、≦０℃；ｐＨ５．０で保存された参照ＶＨ３１抗体に対応する。

【図3】示された加速条件下で存在した参照ＶＨ３１バンドの、分子量およびＮ末端配列決定に基づき割り当てられた正体を示すタンパク質ゲルの写真である。ＨＣ、重鎖；ＬＣ、軽鎖。

【図4】参照ＶＨ３１軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列（配列番号２５）およびＮ９３／Ｐ９４推定クリッピング部位を描いた図である。

【図5-1】図５Ａ～５Ｃは、参照ＶＨ３１軽鎖のトリプシン消化産物（Ｋａｂａｔナンバリングによるアミノ酸６１～１０２または６１～１０６）のＮ９３／Ｐ９４でのクリッピングから生じる様々な軽鎖断片を示す線グラフである。これらの断片は、ＶＨ３１ ＬＣのアミノ酸残基９４～１０２（図５Ａ）、残基６１～９３（図５Ｂ）、および残基９４～１０６（図５Ｃ）に対応する。１０２および１０６ Ｃ末端は、不完全なトリプシン消化に起因している。

【図5-2】図５－１の続き。

【図6】Ａｓｎ９３（Ｎ９３）での切断が溶液中で生じ得る提案されたプロセスを描いた図である。

【図7】ＬＣ安定性を増強するように作られた様々なＶＨ３１ ＬＣアミノ酸変異を示す図である。

【図8】変異（レーン１～８）または非変異ＬＣのどちらかを含有するＶＨ３１抗体の高発現および純度を示すタンパク質ゲルの一対の写真である。１、Ｎ９３Ｑ；２、Ｎ９３Ｄ；３、Ｎ９３Ｈ；４、Ｎ９３Ｓ；５、Ｎ９３Ｙ；６、Ｎ９３Ａ；８、Ｎ９３Ａ／Ｐ９４Ａ。

【図9】Ｎ９３ＳＬＣ変異を含む抗体の純度は、野生型（ＷＴ）および対照（ＶＨ３１）抗体に匹敵したことを示す、タンパク質ゲル（左のパネル）および３つのＳＥＣ－ＨＰＬＣプロット（右のパネル）の一対の写真である。

【図10】示されたＬＣ変異を含むＶＨ３１抗体の効力をプロットする線グラフである。ＬＣバリアントＮ９３Ｓ（白抜きの菱形記号）を含む抗体は、参照ＶＨ３１（白抜きの四角記号）または野生型（ＷＴ）抗体（白抜きの八角形記号）のどちらかよりわずかに効力が少ないだけであった。

【図11】Ｎ９３Ｓ変異体は、４５℃、ｐＨ８で６週間保存すると野生型（ＷＴ）またはＶＨ３１対照抗体のどちらかと比べて分解が明らかに低減したことを示す（左のパネル）タンパク質ゲルの写真である。右のパネルは、野生型またはＶＨ３１対照抗体のどちらか（それぞれ２０倍を超える損失）と比べて、Ｎ９３Ｓ変異体は加速条件下で効力の損失が著しく少なかった（３倍の損失）ことを示している。

【図12】高温（４５℃）、ｐＨ５．５で６週間保存後の参照ＶＨ３１抗体およびＮ９３Ｓ変異体の断片化を示すタンパク質ゲルの写真である。

【発明を実施するための形態】

【0038】

本開示は、Ｔ細胞媒介性障害（例えば、移植片対宿主病、自己免疫疾患、および同種移植片拒絶）を治療するための改善された組成物および方法を提供する。本明細書で提供される方法は一般に、アルファベータＴ細胞受容体（αβＴＣＲ）に特異的であるヒト化結合ポリペプチドの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。本明細書に提供される抗αβＴＣＲ組成物は、改善された組成物が、軽鎖可変領域の断片化を低減することによって結合ポリペプチドの安定性を改善する１つまたはそれ以上のアミノ酸置換または修飾を含むという点で、公知の組成物より改善している。

【0039】

Ｉ．定義
特に記載がない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されている方法および材料と同様または同等のいかなる方法および材料も、本開示の手法の方法において使用することができる。本明細書に引用されている全ての刊行物は、本開示に関連して使用され得る刊行物の中で報告されている方法論、試薬、およびツールを記載および開示する目的で、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている。

【0040】

本出願の方法および手法は一般に、特に指示のない限り、当技術分野で周知の従来の方法、ならびに本明細書全体にわたって引用され、論じられている様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されている従来の方法に従って行われる。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．編（１９９０）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．；Ｈａｒｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｌｉｍｂｉｒｄ，Ｌ．Ｅ．、およびＧｉｌｍａｎ，Ａ．Ｇ．編（２００１）Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１０版、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｃｏ．；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ，Ｓ．ら編、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．およびＢｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｃ．Ｃ．編（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ～ＩＶ巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら編（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第Ｉ～ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編（１９９９）Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｒｅａｍら編（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｎｅｗｔｏｎ，Ｃ．Ｒ．およびＧｒａｈａｍ，Ａ．編（１９９７）ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ）、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇを参照のこと。

【0041】

ヒトαβＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞の表面に提示されるＴ細胞受容体複合体である。Ｋｕｈｎｓら（２００６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２４：１３３～１３９頁を参照のこと。この複合体は、マウスモノクローナル抗体ＢＭＡ０３１（その全体が参照によって本明細書に組み入れられている欧州特許出願第ＥＰ０４０３１５６号；配列番号１および２を参照のこと）、ならびに本明細書に開示されるヒト化され、安定化された抗体によって標的にされる。

【0042】

マウスＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体ＢＭＡ０３１（Ｂｏｒｓｔら（１９９０）Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（３）：１７５～８８；ＥＰ０４０３１５６）は、アルファ－ベータＴＣＲ／ＣＤ３複合体上の共通の決定基に対して特異的であり、ガンマ－デルタＴＣＲには結合しない。ＢＭＡ０３１は高度に免疫抑制性であり、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）の機序により活性化Ｔ細胞のアポトーシスを誘導することができる（Ｗｅｓｓｅｌｂｏｒｇら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１０）：４３３８～４３４５頁）。インビトロでＢＭＡ０３１は混合リンパ球反応を阻害し、いくつかの固形臓器移植シナリオでの移植片拒絶の予防、および急性移植片対宿主病の治療（Ｋｕｒｒｌｅら（１９８９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．２１（１）：１０１７～１０１９頁）においてＢＭＡ０３１は予備的臨床有効性を示している。ＢＭＡ０３１は、ヒト集団の大多数でヒトＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）と結合しない。そのためＢＭＡ０３１は、Ｔ細胞受容体の架橋を介したＴ細胞活性化を引き起こさず、それ故に、Ｔ細胞活性化または関連サイトカイン放出を誘導しない。この点に関してＢＭＡ０３１のプロフィールは、ＯＫＴ３のプロフィールより極めて好ましい。しかし、ＢＭＡ０３１はマウス抗体であり、そのため、反復投与で誘発されるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を考慮すると、ヒト対象での反復投与に適さない。

【0043】

ＢＭＡ０３１のいくつかのヒト化バージョンが記載されている（例えば、ＷＯ２０１３／０３７４８４；ＥＰ０４０３１５６を参照のこと；また、Ｓｈｅａｒｍａｎら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４３６６～４３７３頁も参照のこと）。ＥＰ０４０３１５６で述べられているように、単なるＣＤＲ移植は抗原結合を保持するのに成功しなかった。有意な「教化」フレームワーク修飾を有する１つのクローン、ＥＵＣＩＶ３は、Ｔ細胞への結合に成功した；しかし、ＥＰ０４０３１５６で述べられているように、αβＴＣＲへの結合は、フローサイトメトリー競合アッセイによって決定された場合の親ＢＭＡ０３１抗体ほど有効ではない。さらに、ＥＵＣＩＶ３はもともと、ＦｃγＲ結合を依然として保持している野生型ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４骨格で生成された。これらのヒト化抗体はそれ故に、Ｔ細胞活性化、増殖および同時サイトカイン放出を可能にし、そのためＢＭＡ０３１の元の特性とはかなり異なっていた。

【0044】

用語「結合タンパク質」または「結合ポリペプチド」は、特に指示のない限り、目的とする標的抗原（例えば、ヒト抗原）への選択的結合に関与する少なくとも１つの結合部位を含有するポリペプチド（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を指すのに使用される。例示的な結合部位には、抗体可変ドメイン、受容体のリガンド結合部位、またはリガンドの受容体結合部位が挙げられる。ある特定の態様では、本明細書に記載された結合ポリペプチドは、複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の）結合部位を含む。

【0045】

用語「抗体」は、特に指示のない限り、抗体全体およびそのような抗体の抗原結合断片を指すのに使用される。例えば、該用語は、４本鎖ＩｇＧ分子、および抗体断片を包含する。

【0046】

本明細書で使用される場合、用語「抗体断片」は、例えば以下にさらに記載されるようなインタクトな完全長抗体の部分を指す。

【0047】

抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭなどの任意のクラス；およびＩｇＧ１またはＩｇＧ４などの任意のサブクラスであってもよい。免疫グロブリンの異なるクラスおよびサブクラスは、異なる適用において有利となり得る異なる特性を有する。例えば、ＩｇＧ４抗体は、Ｆｃ受容体への結合が低減している。

【0048】

天然に存在する免疫グロブリンは、２つの同一の軽鎖（約２４ｋＤａ）および２つの同一の重鎖（約５５または７０ｋＤａ）が四量体を形成する共通のコア構造を有する。各鎖のアミノ末端部分は可変（Ｖ）領域として知られ、各鎖の残りのより保存された定常（Ｃ）領域と区別され得る。

【0049】

免疫グロブリンのアミノ酸配列変異のほとんどは、抗原結合に直接関与する、超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られる各Ｖ領域中の３つの別々の位置に限局している。アミノ末端から進んで、これらの領域はそれぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と名付けられている。ＣＤＲは、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）によって適切な位置に保たれる。アミノ末端から進んで、これらの領域はそれぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と名付けられている。アミノ末端から進んで、Ｖ領域に含まれるこれらの複合領域は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４と名付けられている。ＣＤＲおよびＦＲ領域の位置ならびにナンバリングシステムは、Ｋａｂａｔらによって定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１）、およびオンラインで見出すことができるそのアップデート）。さらに、ＣＤＲ領域の境界は、ＩＭＧＴ命名法によってさらに定義されている。

【0050】

「ヒト化モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、非ヒト抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）が移植されたヒト抗体フレームワークから成る抗体である。ヒトアクセプターフレームワークの変更が行われる場合もある。ヒト化抗体の設計および作製の手順は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第４，８１６，３９７号；米国特許第４，８１６，５６７号；および米国特許第５，２２５，５３９；欧州特許出願第０１２０６９４号；欧州特許出願第０１２５０２３号；欧州特許出願第０１９４２７６号Ｂ１；欧州特許出願第０２３９４００号；欧州特許出願第０５１９５９６号；および国際特許出願ＷＯ８６／０１５３３に記載されている。抗体、ヒト化抗体、ヒト改変抗体、およびそれらの調製方法に関するさらなる詳細は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．およびＤｉｊｂｅｌ，Ｓ．編（２００１、２０１０）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹに見出すことができる。上記に列挙された特許および特許出願公開の各々の内容全体は、参照によって本明細書に組み入れられている。

【0051】

記載された実施形態による抗体の可変領域は、少なくとも一部は、ＢＭＡ０３１をヒト化すること、すなわち、ＢＭＡ０３１のＣＤＲをヒトフレームワークに導入すること、および軽鎖可変領域の断片化を低減することによって結合ポリペプチドの安定性を改善するように１つまたはそれ以上のＶＬ ＣＤＲをさらに修飾することによって得ることができる。ヒト化ＢＭＡ０３１抗体の２つのシリーズが、本明細書に参照によって組み入れられているＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３７４８４に記載されている。これらの２つのシリーズは、本配列番号５～７、１２および１３を含むＨＥＢＥ１シリーズ、ならびに本配列番号８、１５および１６に示される重鎖可変領域を含むＧＬ１ＢＭシリーズである。どちらの場合も、使用される軽鎖可変領域は、本配列番号１４（ＧＬ１ＢＭ ＶＫ４３）に示されているとおりである。使用されるヒトフレームワークは、ＨＥＢＥ１の場合ではＩＧＨ３－２３（本配列番号１７）、ならびにＧＬ１ＢＭの場合ではＩＧＨＶ１－３^＊０１およびＩＧＫＶ３－１１^＊０１（それぞれ、本配列番号１８および１９）である。

【0052】

定常領域は、任意のヒト抗体定常領域に由来してもよい。可変領域遺伝子は、定常領域遺伝子とインフレームで発現ベクターにクローニングされて、重および軽免疫グロブリン鎖を発現させてもよい。そのような発現ベクターは、抗体合成のための抗体産生宿主細胞にトランスフェクトすることができる。

【0053】

ヒト抗体可変領域および定常領域は、配列データベースから得ることができる。例えば、免疫グロブリン配列は、ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭデータベース（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉら、（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４（ｓｕｐｐｌ．１）：Ｄ７８１～Ｄ７８４）またはＶＢａｓｅ ３０（ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）で入手可能である。アグリコシル化抗体は、広範に修飾された機能性を有することができる；Ｂｏｙｄら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１～１３１８頁を参照のこと。「デルタａｂ」またはΔａｂ修飾は、本明細書で使用される場合、Ａｒｍｏｕｒら、（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６１３～２６２４頁に記載されているＦｃ修飾である。抗体Ｆｃ領域のグリコシル化を修飾するための手法は当技術分野で公知であり、化学的、酵素的手段および／または変異手段、例えば、ＣＨ２ドメインのＮ２９７位の変異が挙げられる。アグリコシル化ＩｇＧ分子を産生するために抗体遺伝子を変異させる手段は、ＴａｏおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２５９５～２６０１頁に記載されている。

【0054】

本明細書に記載された抗体との関連における特異性は、特許請求された抗体が、その定義された同族抗原、すなわち、αβＴＣＲ／ＣＤ３複合体を選択的に結合できることを意味する。本明細書に記載された抗体は、Ｔ細胞を含む細胞で発現されたαβＴＣＲ／ＣＤ３複合体と結合する。

【0055】

用語「安定な」、「安定性」、および「安定化された」は、結合ポリペプチドと関連して本明細書で使用される場合、製造、調製、輸送および保存の所与の条件下の熱分解のおよび化学分解または断片化に対する、結合ポリペプチドの抵抗性を指す。「安定な」組成物は、所与の製造、調製、輸送および保存条件下で８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の生物学的活性を保持する。結合ポリペプチドの安定性は、例えば、分解もしくは断片化の程度、または特定の断片のレベル、または凝集物のタイプもしくはサイズに関して、当業者に公知の方法および測定を使用して、対照と比べてまたは出発材料と比べて評価することができる。そのような方法および測定には、参照と比べた、曲線下面積（ＡＵＣ）低減、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、高速（または高圧）サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、およびドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0056】

用語「核酸」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載された抗体をコードするＤＮＡ分子を含む。本明細書に記載された抗体をコードする好ましいＤＮＡ分子は、宿主細胞で抗体遺伝子を発現させるのに適した発現ベクターである。抗体遺伝子発現のための発現ベクターおよび宿主細胞は、当技術分野で公知である；例えば、Ｍｏｒｒｏｗ，Ｋ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎｅｗｓ（２００８年６月１５日）２８（１２）、およびＢａｃｋｌｉｗａｌ，Ｇ．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６（１５）：ｅ９６～ｅ９６を参照のこと。

【0057】

用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書で使用される場合、疾患、障害、または状態を有する患者または対象のケアを指す。治療は、以下のいずれか１つまたは任意の組み合わせを対象とし得るが、これらに限定されない：疾患、障害、もしくは状態の治癒；疾患、障害、もしくは状態の少なくとも１つの症状の改善；および／または疾患、障害、もしくは状態の発生を防止もしくは低減することを目標とする予防もしくは防止行為。ある特定の実施形態では、治療は、疾患、障害、もしくは状態の治癒；または疾患、障害、もしくは状態の少なくとも１つの症状の改善を対象とし得るが、これらに限定されない。

【0058】

用語「対象」は、本明細書で使用される場合、マウス、ラット、アレチネズミ、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、および霊長類を含む任意の哺乳動物を指す。ある特定の実施形態では、対象はヒト以外の哺乳動物である。ある特定の実施形態では、対象はヒト以外の霊長類である。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。

【0059】

ＩＩ．抗体
本開示は、本明細書に記載されたヒト化抗αβＴＣＲ抗体の１つまたはそれ以上の抗原結合断片を、それを必要とする対象に投与する方法を包含する。該抗体の断片は、αβＴＣＲ／ＣＤ３複合体と結合することができる。それらは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦ（ｖ）断片、または個々の軽鎖もしくは重鎖可変領域もしくはその任意の部分を包含する。断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。ある特定の態様では、断片は、インタクトな抗体のＦｃ部分を欠き、循環からより迅速に消失し、および／またはインタクトな抗体より非特異的組織結合が少なくなり得る。ある特定の態様では、断片は、周知の方法を使用して、例えば、パパイン（Ｆａｂ断片を作製するための）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）_２断片を作製するための）などの酵素を用いたタンパク質切断によって、インタクトな抗体から作製されてもよい。

【0060】

ある特定の態様では、抗体および／または抗体断片は、αβＴＣＲ／ＣＤ３複合体に結合する一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を包含する。ある特定の態様では、ｓｃＦｖは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）に作動可能に連結された抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の一方または両方は、αβＴＣＲと結合する結合部位を一緒にまたは個々に形成する。ｓｃＦｖは、アミノ末端にＶＨ領域およびカルボキシ末端にＶＬ領域を含んでもよい。あるいは、ｓｃＦｖは、アミノ末端にＶＬ領域およびカルボキシ末端にＶＨ領域を含んでもよい。さらに、Ｆｖ断片の２つドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらをＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）として作られるようにする合成リンカーによって、組換え法を使用して連結することができる。ｓｃＦｖは、場合により、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間にポリペプチドリンカーをさらに含み得る。

【0061】

抗体および抗体断片は、Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４～５４６頁に記載されている、ＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）断片も包含する。抗体および抗体断片は、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）も包含する。ＨＣＡｂは、これらの機能的抗体が重鎖のみの二量体（「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」と呼ばれる）であるという点で、重鎖可変領域のみを使用した抗原結合領域を形成することが報告されている。したがって、ある特定の態様では、抗体および抗体断片は、αβＴＣＲ／ＣＤ３複合体に特異的に結合するＨＣＡｂであってもよい。抗体および抗体断片は、αβＴＣＲ／ＣＤ３複合体に特異的な小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）または結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体も包含する。これらの構築物は、抗体エフェクター機能を実行するのに必要な免疫グロブリンドメインに融合された抗原結合ドメインを含む一本鎖ポリペプチドである（ＷＯ２００５／０１７１４８を参照のこと）。抗体および抗体断片は、ダイアボディも包含する。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖で発現される二価抗体を指すが、同じ鎖上の２つのドメイン間で対合させるには短すぎるリンカーを使用する。これにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合せざるを得なくなり、それにより２つの抗原結合部位が作出される（例えば、ＷＯ９３／１１１６１を参照のこと）。ダイアボディは、二重特異性または単一特異性であり得る。

【0062】

ある特定の態様では、抗体または抗体断片は、ヒトαβＴＣＲ／ＣＤ３複合体に特異的に結合する。すなわち、そのような抗体または抗体断片は、ヒトαβＴＣＲ／ＣＤ３複合体以外のいかなる標的とも交差反応しない。

【0063】

抗体または抗体断片は、抗体または抗体断片の半減期を増加させるための多糖ポリマー等を含む、ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマーなどの分子を例えば追加することによって、その血清半減期を増加させるように修飾することができる。

【0064】

抗体および抗体断片は、多重特異性または二重特異性であってもよい。例えば、二重特異性抗体または抗体断片は、２つの異なる結合部位（可変領域）を含む単一抗体（または抗体断片）に類似していてもよい。二重特異性抗体は、化学的手法、「ポリドーマ（ｐｏｌｙｄｏｍａ）」法または組換えＤＮＡ法などの様々な方法によって作製することができる。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有することができ、そのうちの少なくとも１つはαβＴＣＲ／ＣＤ３複合体である。他方の特異性は、例えば、インビボでの半減期を延長するためのヒト血清アルブミンに対する特異性を含む、任意の有用なまたは所望の特異性から選択することができる。

【0065】

腫瘍学的用途のための臨床における二重特異性抗体の使用は、悪性腹水の症例での使用が承認された三官能性カツマキソマブ（ＲＥＭＯＶＡＢ（登録商標））、およびフィラデルフィア染色体陰性の再発または難治性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）のための第二選択治療として使用される用途が承認された二重特異性抗体ブリナツモマブ（ＢＬＩＮＣＹＴＯ（登録商標））により今や現実のものになりつつある。これらの抗体は、Ｔ細胞に結合する結合アーム、および腫瘍標的細胞に結合する第２のアームを共通して有し、腫瘍標的のＴ細胞媒介性溶解をもたらす。また共通して、これらの分子は、細胞表面に位置するＣＤ３タンパク質を介してＴ細胞を動員する。ＣＤ３を介した動員の代わりとなるのは、同じく細胞の表面で発現されるαβＴ細胞受容体（αβＴＣＲ）を利用することである。

【0066】

ある特定の例示的な実施形態では、本開示による抗体は、腫瘍関連抗原に対する特異性をαβＴ細胞受容体（αβＴＣＲ）に対する特異性と組み合わせて抗腫瘍抗体を開発するのに使用されてもよい。

【0067】

ＩＩＩ．抗αβＴＣＲ抗体
上述したように、そのようなヒト化抗αβＴＣＲ抗体の２つシリーズが、本明細書に参照によって組み入れられているＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３７４８４に記載されている。これらの２つシリーズはマウス抗αβＴＣＲ抗体ＢＭＡ０３１に基づいており、配列番号５～７、１２および１３を含むＨＥＢＥ１シリーズ、ならびに配列番号８、１５および１６に示される重鎖可変領域を含むＧＬ１ＢＭシリーズを含む。どちらの場合も、使用される軽鎖可変領域は、配列番号１４（ＧＬ１ＢＭ ＶＫ４３）に示されているとおりである。使用されるヒトフレームワークは、ＨＥＢＥ１の場合ではＩＧＨ３－２３（配列番号１７）、ならびにＧＬ１ＢＭの場合ではＩＧＨＶ１－３^＊０１（配列番号１８）およびＩＧＫＶ３－１１^＊０１（配列番号１９）である。

【0068】

表１に列挙された配列において、選択されたＣＤＲは太字で示され、配列番号２６～２８に記載されているとおりである。

【0069】

【表1】

【表2】

【表3】

【0070】

安定化ＧＬ１ＢＭ ＶＫ４３のＬＣＤＲ３（Ｑ－Ｑ－Ｗ－Ｓ－Ｓ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｌ－Ｔ（式中、Ｘ_１はＱ、Ｄ、Ｈ、Ｓ、Ｙ、またはＡであり、Ｘ_２はＰまたはＡである）（配列番号２８））に対する配列番号１４中のＧＬ１ＢＭ ＶＫ４３のＬＣＤＲ３（ＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号２９））の比較により、配列番号２８のアミノ酸Ｘ_１およびＸ_２は、それぞれ配列番号２９のＮおよびＰに対応することが明らかになっている。

【0071】

ある特定の実施形態では、ヒトαβＴＣＲ／ＣＤ３複合体と特異的に結合する結合ポリペプチドであって、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、および定常領域を含み：
軽鎖可変領域は、配列番号２６、２７、および２８に記載されたアミノ酸配列をそれぞれ含む、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み；
配列番号２８は、アミノ酸配列Ｑ－Ｑ－Ｗ－Ｓ－Ｓ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｌ－Ｔを含み（式中、Ｘ_１はＱ、Ｄ、Ｈ、Ｓ、Ｙ、およびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ_２はＰおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸である）；
定常領域はヒト由来である、前記結合ポリペプチドが提供される。

【0072】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＱである。

【0073】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＤである。

【0074】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＨである。

【0075】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＳである。

【0076】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＹである。

【0077】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＡである。

【0078】

ある特定の実施形態では、Ｘ_２はＰである。

【0079】

ある特定の実施形態では、Ｘ_２はＡである。

【0080】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＱであり、Ｘ_２はＰである。

【0081】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＱであり、Ｘ_２はＡである。

【0082】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＤであり、Ｘ_２はＰである。

【0083】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＤであり、Ｘ_２はＡである。

【0084】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＨであり、Ｘ_２はＰである。

【0085】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＨであり、Ｘ_２はＡである。

【0086】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＳであり、Ｘ_２はＰである。

【0087】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＳであり、Ｘ_２はＡである。

【0088】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＹであり、Ｘ_２はＰである。

【0089】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＹであり、Ｘ_２はＡである。

【0090】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＡであり、Ｘ_２はＰである。

【0091】

ある特定の実施形態では、Ｘ_１はＡであり、Ｘ_２はＡである。

【0092】

ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１４によるヒト軽鎖フレームワーク領域をさらに含む。

【0093】

ある特定の実施形態では、結合ポリペプチドは、参照抗体ＶＨ３１と比べて５．０を超えるｐＨで安定性が向上する。

【0094】

ある特定の実施形態では、結合ポリペプチドは、参照抗体ＶＨ３１と比べて４℃を超える温度で安定性が向上する。

【0095】

ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号７、１２、１３、１５、および１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0096】

ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号７、配列番号１２、および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0097】

ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0098】

ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１５として記載されたアミノ酸配列を含む。

【0099】

ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１６として記載されたアミノ酸配列を含む。

【0100】

ＩＶ．修飾された抗αβＴＣＲ抗体
抗αβＴＣＲ抗体は、１つまたはそれ以上の修飾を含んでもよい。本発明による修飾された抗αβＴＣＲ抗体は、当技術分野で公知の任意の手法を使用して作ることができる。

【0101】

ｉ）断片化の低減
用語「断片化」は、結合ポリペプチド組成物と関連して本明細書で使用される場合、それぞれが元の結合ポリペプチドまたはその第１の部分より低い分子量の２つ以上の部分への、結合ポリペプチドまたはその第１の部分の切断を指す。そのような断片化形態には、完全長不対重鎖、完全長不対軽鎖、第２の完全長重鎖と対合された第１の完全長重鎖、部分重鎖と対合された完全長重鎖、第２の部分重鎖と対合された第１の部分重鎖、完全長軽鎖と対合された完全長重鎖、部分軽鎖と対合された完全長重鎖、完全長軽鎖と対合された部分重鎖、部分軽鎖と対合された部分重鎖、第２の完全長重鎖および完全長軽鎖と対合された第１の完全長重鎖、第２の完全長重鎖および部分軽鎖と対合された第１の完全長重鎖、第１の部分軽鎖と対合された第１の完全長重鎖および第２の部分軽鎖と対合された第２の完全長重鎖、部分重鎖および完全長軽鎖と対合された第１の完全長重鎖、部分重鎖および２つの完全長軽鎖と対合された第１の完全長重鎖、部分重鎖および部分軽鎖と対合された第１の完全長重鎖、第２の部分重鎖および完全長軽鎖と対合された第１の部分重鎖、ならびに第２の部分重鎖および部分軽鎖と対合された第１の部分重鎖が挙げられるが、これらに限定されない。

【0102】

本明細書で使用される場合、「断片」は、少なくとも１個のアミノ酸を指す。典型的には、断片は、一緒に連結された２個以上のアミノ酸、より典型的には少なくとも１０、２０、３０、４０、または５０個のそのようなアミノ酸を含むであろう。特に、１つを超えるポリペプチド鎖を含む断片に関して、断片は、例えば、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、または少なくとも７００個のアミノ酸を含み得る。

【0103】

様々な機序によって、例えば、自発的反応（例えば、非酵素反応）または酵素反応を通じてポリペプチド骨格の切断をもたらす天然の共有結合の破壊によって、断片化が引き起こされる場合がある。一般に、タンパク質骨格は生理的条件下で高度に安定している。しかし、特定の領域およびモチーフは、そのアミノ酸配列、二次元または三次元ポリペプチド構造の柔軟性、ならびに適合しない溶媒および環境条件（例えば、温度およびｐＨ）により断片化をより起こしやすい可能性がある。

【0104】

例えば、アミノ酸Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、およびＡｓｎ（Ｎ）は、抗体のポリペプチド骨格において切断を特に起こしやすいことが示されている。例えば、Ｌｉｕ Ｈ．ら Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００９；２０：２２５８～２２６４頁を参照のこと。さらに、Ａｓｎ－Ｐｒｏ（Ｎ－Ｐ）アミド結合は、アンモニアの存在下で完全な切断を受けることが知られている。例えば、Ｔａｒｅｌｌｉ Ｅ．およびＣｏｒｒａｎ Ｐ．Ｈ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．２００３；６２：２４５～２５１頁を参照のこと。

【0105】

断片化は、生物学的組成物の製造または保存中のいずれの段階でも起こり得る。断片化は、効力の低下または不要な種および潜在的に免疫原性の種の存在をもたらす可能性があるため、いかなる生物学的治療薬の生産においても断片化の低減が重要な検討事項となる。

【0106】

いくつかの実施形態では、抗体の５％未満（例えば、４．９、４．８、４．７、４．６、４．５、４．４、４．３、４．２、４．１、４．０、３．９、３．８、３．７、３．６、３．５、３．４、３．３、３．２、３．１、３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１％未満）は、２℃～８℃で少なくとも１カ月（例えば、少なくとも２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、１３カ月、１４カ月、１５カ月、１６カ月、１７カ月、１８カ月、１９カ月、２０カ月、２１カ月、２２カ月、２３カ月、２４カ月、またはそれ以上）にわたる保存後に断片化される。

【0107】

単量体結合ポリペプチドの量、および溶液中に存在する結合ポリペプチドの単量体形態、オリゴマー形態、凝集形態、または断片化形態の量を決定するための方法は、本明細書に記載され、実施例に例示されている。例えば、当業者は、所与の溶液中に存在する中間体全体、断片化された中間体、折り畳まれていない中間体、および／または凝集種のパーセンテージを、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、静的光散乱（ＳＬＳ）、フーリエ変換赤外分光分析（ＦＴＩＲ）、円二色性（ＣＤ）、尿素誘導タンパク質アンフォールディング法、内在性トリプトファン蛍光、非還元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、および示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して決定することができる。本明細書に記載された実施例では、本発明者ら、溶液中の結合ポリペプチドの物理的状態を決定するために、特にＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥの使用を例示する。

【0108】

ｉｉ）免疫原性の低減
ある特定の例示的な実施形態では、抗体、またはその抗原結合部分の免疫原性を減少させるのに脱免疫化が使用され得る。本明細書で使用される場合、用語「脱免疫化」は、１つまたはそれ以上のＴ細胞エピトープを修飾するための、抗体、またはその抗原結合部分の変更を含む（例えば、ＷＯ９８／５２９７６Ａ１、ＷＯ００／３４３１７Ａ２を参照のこと）。例えば、出発抗体由来のＶＨおよびＶＬ配列が分析されてもよく、相補性決定領域（ＣＤＲ）および配列内の他の主な残基との関連でエピトープの位置を示すヒトＴ細胞エピトープ「マップ」が、各Ｖ領域から生成されてもよい。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープは、最終抗体の活性を変えるリスクが低い代替のアミノ酸置換を同定するために分析され得る。アミノ酸置換の組み合わせを含む一連の代替のＶＨおよびＶＬ配列が設計され得、これらの配列はその後、本明細書に開示される方法において使用するために一連の抗αβＴＣＲ抗体または抗αβＴＣＲ抗体断片に組み込まれ得、次いで機能についてテストされる。修飾されたＶおよびヒトＣ領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子は、次いで発現ベクターにクローニングされ得、その後のプラスミドが抗体全体の産生のために細胞株に導入され得る。抗体は、次いで適当な生化学的および生物学的アッセイで比較され得、最適なバリアントが同定され得る。

【0109】

ｉｉｉ）エフェクター機能およびＦｃ修飾
ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、１つまたはそれ以上のエフェクター機能を媒介する抗体定常領域（例えば、ＩｇＧ定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域）を含んでもよい。例えば、補体のＣ１成分の抗体定常領域への結合は、補体系を活性化し得る。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解において重要である。補体の活性化はまた炎症反応も刺激し、自己免疫過敏症にも関与し得る。さらに、抗体は、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する抗体Ｆｃ領域のＦｃ受容体結合部位により、Ｆｃ領域を介して様々な細胞上の受容体に結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体、すなわち、Ｆｃγ受容体）、ＩｇＥ（イプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）およびＩｇＭ（ミュー受容体）を含む、異なるクラスの抗体に特異的な多くのＦｃ受容体がある。細胞表面のＦｃ受容体への抗体の結合は、抗体被覆粒子の貪食および破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、またはＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症性メディエーターの放出、胎盤通過、および免疫グロブリン産生の制御を含む、多くの重要で多様な生物学的応答をトリガーする。

【0110】

ある特定の実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、Ｆｃγ受容体に結合する。代替の実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、１つまたはそれ以上のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ活性）を指示することができない、および／またはＦｃγ受容体と結合することができない定常領域を含んでもよい。

【0111】

本明細書に記載されたある特定の実施形態は、ほぼ同じ免疫原性の、変更がない抗体全体と比較した場合、例えば、エフェクター機能の低下もしくは増強、非共有結合的に二量体化する能力、腫瘍の部位に局在化する能力の増加、血清半減期の低下、および／または血清半減期の増加などの所望の生化学的特性をもたらすように、１つまたはそれ以上の定常領域ドメインの少なくとも１個のアミノ酸が欠失またはさもなければ変更されているヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）を提供する。例えば、本明細書に記載された診断方法および治療方法において使用するためのある特定の抗体、またはその断片は、免疫グロブリン重鎖と同様のポリペプチド鎖を含むが、１つまたはそれ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠くドメイン欠失抗体である。例えば、ある特定の抗体では、修飾された抗体の定常領域の１つの全ドメインが欠失され、例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部が欠失される。

【0112】

ある特定の他の実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、異なる抗体アイソタイプに由来する定常領域（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の２つ以上に由来の定常領域）を含む。他の実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、キメラヒンジ（すなわち、異なる抗体アイソタイプのヒンジドメインに由来するヒンジ部分を含むヒンジ、例えば、ＩｇＧ４分子由来の上部ヒンジドメイン、およびＩｇＧ１中部ヒンジドメイン）を含む。１つの実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、ヒトＩｇＧ４分子由来のＦｃ領域またはその部分、および該分子のコアヒンジ領域のＳｅｒ２２８Ｐｒｏ（Ｓ２２８Ｐ）変異（ＥＵナンバリング）を含む。

【0113】

ある特定の例示的な実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）のＦｃ部分は、エフェクター機能を増加または減少させるために当技術分野で公知の手法を使用して変異させることができる。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活性化（点変異または他の手段による）は、循環修飾抗体のＦｃ受容体結合を低減し、それにより腫瘍局在化を増加させことができる。他のケースでは、本開示と一致する定常領域修飾は補体結合を緩和し、故に血清半減期、およびコンジュゲートされた細胞毒の非特異的結合を低減することになる。定常領域のさらに他の修飾は、抗原特異性または柔軟性の増加により局在化の増強を可能にするジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を修飾するのに使用される。結果として生じる生理学的プロフィール、バイオアベイラビリティ、ならびに腫瘍局在化、体内分布および血清半減期などの修飾の他の生化学的効果は、過度の実験を行うことなく周知の免疫学的手法を使用して容易に測定および定量化することができる。

【0114】

ある特定の実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）で使用されるＦｃドメインは、Ｆｃバリアントである。本明細書で使用される場合、用語「Ｆｃバリアント」は、Ｆｃドメインが由来する野生型Ｆｃドメインと比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＦｃドメインを指す。例えば、ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１抗体に由来する場合、前記ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃバリアントは、前記Ｆｃドメインと比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。

【0115】

Ｆｃバリアントのアミノ酸置換は、Ｆｃドメイン内の任意の位置（すなわち、任意のＥＵ従来型アミノ酸位置）にあってもよい。１つの実施形態では、Ｆｃバリアントは、ヒンジドメインまたはその部分に位置するアミノ酸位置に置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃバリアントは、ＣＨ２ドメインまたはその部分に位置するアミノ酸位置に置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃバリアントは、ＣＨ３ドメインまたはその部分に位置するアミノ酸位置に置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃバリアントは、ＣＨ４ドメインまたはその部分に位置するアミノ酸位置に置換を含む。

【0116】

抗体は、エフェクター機能および／またはＦｃＲ結合の改善（例えば、低下または増強）を与えることが公知の当技術分野において認識されている任意のＦｃバリアントを使用してもよい。前記Ｆｃバリアントには、例えば、その各々が参照によって本明細書に組み入れられている、国際ＰＣＴ公開ＷＯ８８／０７０８９Ａ１、ＷＯ９６／１４３３９Ａ１、ＷＯ９８／０５７８７Ａ１、ＷＯ９８／２３２８９Ａ１、ＷＯ９９／５１６４２Ａ１、ＷＯ９９／５８５７２Ａ１、ＷＯ００／０９５６０Ａ２、ＷＯ００／３２７６７Ａ１、ＷＯ００／４２０７２Ａ２、ＷＯ０２／４４２１５Ａ２、ＷＯ０２／０６０９１９Ａ２、ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２、ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２、ＷＯ０４／０２９２０７Ａ２、ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２、ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２、ＷＯ０４／０７４４５５Ａ２、ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２、ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２、ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１、ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２、ＷＯ０５／０９２９２５Ａ２、ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２、ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１、ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２、およびＷＯ０６／０８５９６７Ａ２または米国特許第５，６４８，２６０号；５，７３９，２７７号；５，８３４，２５０号；５，８６９，０４６号；６，０９６，８７１号；６，１２１，０２２号；６，１９４，５５１号；６，２４２，１９５号；６，２７７，３７５号；６，５２８，６２４号；６，５３８，１２４号；６，７３７，０５６号；６，８２１，５０５号；６，９９８，２５３号；および７，０８３，７８４号に開示されているアミノ酸置換のいずれか１つが挙げられる。

【0117】

１つの例示的な実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、ＥＵ位置２６８（例えば、Ｈ２６８ＤまたはＨ２６８Ｅ）にアミノ酸置換を含むＦｃバリアントを含む。別の例示的な実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、ＥＵ位置２３９（例えば、Ｓ２３９ＤまたはＳ２３９Ｅ）および／またはＥＵ位置３３２（例えば、Ｉ３３２ＤまたはＩ３３２Ｑ）にアミノ酸置換を含む。

【0118】

ある特定の実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、抗体の抗原依存的エフェクター機能、特に抗体の循環半減期を変化させるアミノ酸置換を含むＦｃバリアントを含む。そのような抗体は、これらの置換を欠く抗体と比べた場合、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合の増加または減少のどちらかを示し、それ故に血清中の半減期はそれぞれ増加または減少する。ＦｃＲｎに対する親和性が改善したＦｃバリアントは、より長い血清半減期を有することが見込まれ、そのような分子は、例えば慢性疾患または障害を治療するために、投与された抗体の長い半減期が望まれる哺乳動物を治療する方法において有用な用途を有する。対照的に、ＦｃＲｎ結合親和性が減少したＦｃバリアントはより短い半減期を有すると予想され、そのような分子もまた、例えば、インビボ画像診断のために、または長期間にわたって循環に存在する場合、出発抗体が有毒な副作用を有する状況において、例えば循環時間の短縮が有利である哺乳動物への投与に有用である。ＦｃＲｎ結合親和性が減少したＦｃバリアントはまた、胎盤を通過する可能性が少なく、故に、妊婦の疾患または障害の治療においても有用である。さらに、ＦｃＲｎ結合親和性の低下が望まれ得る他の用途には、脳、腎臓、および／または肝臓への局在化が望まれる用途が挙げられる。１つの例示的な実施形態では、抗体の変化は、血管系からの腎臓糸球体上皮の通過の低下を示す。別の実施形態では、抗体の変化は、脳からの血管腔への血液脳関門（ＢＢＢ）の通過の低下を示す。

【0119】

１つの実施形態では、ＦｃＲｎ結合が変化した抗体は、Ｆｃドメインの「ＦｃＲｎ結合ループ」内に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。ＦｃＲｎ結合ループは、アミノ酸残基２８０～２９９（ＥＵナンバリングによる）から成る。ＦｃＲｎ結合活性を変化させた例示的なアミノ酸置換は、あらゆる目的でその全体が本明細書に参照によって組み入れられている国際ＰＣＴ公開第ＷＯ０５／０４７３２７号に開示されている。ある特定の例示的な実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、以下の置換：Ｖ２８４Ｅ、Ｈ２８５Ｅ、Ｎ２８６Ｄ、Ｋ２９０ＥおよびＳ３０４Ｄ（ＥＵナンバリング）の１つまたはそれ以上を有するＦｃドメインを含む。

【0120】

他の実施形態では、本明細書に記載された診断方法および治療方法において使用するためのヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、グリコシル化を低減または排除するために変化された定常領域、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４重鎖定常領域を有する。例えば、抗体は、抗体のグリコシル化を変化させるアミノ酸置換を含むＦｃバリアントも含むことができる。例えば、前記Ｆｃバリアントは、グリコシル化（例えば、Ｎ－またはＯ－結合型グリコシル化）が低減し得る。例示的な実施形態では、Ｆｃバリアントは、通常はアミノ酸位置２９７（ＥＵナンバリング）に見出されるＮ－結合型グリカンのグリコシル化の低減を含む。別の実施形態では、抗体は、グリコシル化モチーフ（例えば、アミノ酸配列ＮＸＴまたはＮＸＳを含有するＮ－結合型グリコシル化モチーフ）の近くまたは該モチーフ内にアミノ酸置換を有する。特定の実施形態では、抗体は、アミノ酸位置２２８または２９９（ＥＵナンバリング）にアミノ酸置換を有するＦｃバリアントを含む。より特定の実施形態では、抗体は、Ｓ２２８ＰおよびＴ２９９Ａ変異（ＥＵナンバリング）を含むＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域を含む。

【0121】

グリコシル化の低減または変化を与える例示的なアミノ酸置換は、あらゆる目的でその全体が本明細書に参照によって組み入れられている、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ０５／０１８５７２号に開示されている。ある特定の実施形態では、抗体、またはその断片は、グリコシル化を排除するように修飾される。そのような抗体、またはその断片は、「アグリ（ａｇｌｙ）」抗体、またはその断片（例えば、「アグリ」抗体断片）と呼ばれる。科学理論に束縛されるものではないが、アグリ抗体、またはその断片は、インビボでの安全性および安定性プロフィールが改善し得ることが考えられる。例示的なアグリ抗体、またはアグリ抗体断片は、Ｆｃエフェクター機能を欠くＩｇＧ４抗体のアグリコシル化Ｆｃ領域を含み、それにより正常な重要臓器に対するＦｃ媒介性毒性の可能性を排除する。さらに他の実施形態では、アグリ抗体、またはアグリ抗体断片は、変化したグリカンを含む。例えば、アグリ抗体またはアグリ抗体断片は、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７（Ｎ２９７）でＮ－グリカンのフコース残基の数が低減し得る、すなわち、アフコシル化される。別の実施形態では、アグリ抗体またはアグリ抗体断片は、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７でＮ－グリカンのシアル酸残基の数が変化し得る。

【0122】

ｉｖ）共有結合
ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、抗体がその同族エピトープに特異的に結合するのを共有結合が妨げないように、例えば分子の抗体への共有結合によって修飾することができる。例えば、限定する目的ではないが、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合等によって修飾することができる。数多くの化学修飾のいずれも、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化等を含むがこれらに限定されない公知の手法によって実行することができる。さらに、誘導体は、１つまたはそれ以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。

【0123】

ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、さらに、Ｎ末端もしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組み換え的に融合することができ、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的にコンジュゲートすることができる（共有および非共有コンジュゲーションを含む）。例えば、抗αβＴＣＲ抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子、および異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒素などのエフェクター分子に組み換え的に融合され、またはコンジュゲートされる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９５、ＷＯ９１／１４４３８、およびＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；ならびにＥＰ３９６，３８７を参照のこと。

【0124】

ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、インビボでの半減期を増加させるために、または当技術分野で公知の方法を使用した免疫アッセイでの使用のために、１つまたはそれ以上の異種ポリペプチドに融合させることができる。例えば、１つの実施形態では、インビボでの半減期を増加させるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）にコンジュゲートされる。Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６：１０６頁（２００１）；Ｃｈａｐｍａｎ Ａ．Ｐ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１頁（２００２）；またはＷｅｉｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ３０：５１２頁（２００２）。

【0125】

さらに、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）の精製または検出を容易にするために、ペプチドなどの１つまたはそれ以上のマーカー配列に融合することができる。ある特定の実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、特に、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ．、９１３１１）で提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、その多くが市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１～８２４頁（１９８９）に記載されているように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７～７７８頁（１９８４））および「ｆｌａｇ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。

【0126】

ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、例えば、分子の治療的特性を改善するため、標的検出を容易にするため、または対象の撮像もしくは療法のために非コンジュゲート形態で使用することができ、または様々な分子の少なくとも１つにコンジュゲートすることができる。ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、精製が行われる場合、精製前または後のどちらかに標識またはコンジュゲートすることができる。特に、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節物質、医薬品、またはＰＥＧにコンジュゲートすることができる。

【0127】

本開示は、さらに、診断剤または治療剤にコンジュゲートされたヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）を包含する。ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は診断的に使用されて、例えば、臨床検査手順の一環として免疫細胞障害（例えば、ＣＬＬ）の発症または進行を監視して、例えば所与の治療および／または予防レジメンの効能を決定することができる。検出は、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）を検出可能な物質にカップリングして容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、様々なポジトロン放出断層撮影法を使用したポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。本開示による診断法として使用するための抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンについては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドおよびフィコエリスリンが挙げられ；発光材料の例には、ルミノールが挙げられ；生物発光材料の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；適切な放射性材料の例には、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎおよび^９９Ｔｃが挙げられる。

【0128】

本明細書に開示される診断方法および治療方法において使用するためのヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、１つまたはそれ以上の細胞毒（放射性同位体、細胞毒性薬、または毒素など）治療剤、細胞分裂阻害剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節物質、医薬品、免疫学的に活性なリガンド（例えば、結果として生じる分子が、新生物細胞、およびＴ細胞などのエフェクター細胞の両方に結合するリンホカインまたは他の抗体）、またはＰＥＧにコンジュゲートすることができる。

【0129】

別の実施形態では、本明細書に開示される診断方法および治療方法において使用するためのヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、腫瘍細胞増殖を減少させる分子にコンジュゲートすることができる。他の実施形態では、開示された組成物は、薬物またはプロドラッグに結合されたヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）を含んでもよい。本明細書に記載されたさらに他の実施形態は、リシン、ゲロニン、緑膿菌外毒素またはジフテリア毒素等などの特定の生体毒素またはその細胞毒性断片にコンジュゲートされた抗体、またはその断片の使用を含む。どのコンジュゲート抗体または非コンジュゲート抗体を使用するかの選択は、癌のタイプおよびステージ、補助的治療（例えば、化学療法または外部照射）の使用、ならびに対象の状態に依存するであろう。当業者は、本明細書の教示に照らしてそのような選択を容易に行い得ることが理解されるであろう。

【0130】

以前の研究では、同位体で標識された抗腫瘍抗体は、動物モデルにおいておよびいくつかの例ではヒトにおいて腫瘍細胞を破壊するのに成功裏に使用されていることが理解されるであろう。例示的な放射性同位体には、限定されるものではないが、以下が挙げられる：^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^９０Ｙ、^１０５Ｒｈ、^１１１Ｉｎ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１５３Ｓｍ、^１６６Ｈｏ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、および^１８８Ｒｅ。放射性核種は、核ＤＮＡにおける複数の鎖切断を引き起こす電離放射線を生成し、細胞死をもたらすことによって作用する。治療用コンジュゲートを作製するのに使用される同位体は、典型的には、経路長が短い高エネルギーアルファまたはベータ粒子を生成する。そのような放射性核種は、極めて近接する細胞、例えば、コンジュゲートが結合または侵入した新生物細胞を死滅させる。該放射性核種は、非局在化細胞に対してほとんど影響を与えないかまたは影響を与えない。放射性核種は本質的に非免疫原性である。

【0131】

Ｖ．抗体作製
抗体作製は、ヤギ（Ｐｏｌｌｏｃｋら（１９９９）Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１４７～１５７頁を参照のこと）、ニワトリ（Ｍｏｒｒｏｗ，Ｋ．Ｊ．Ｊ．（２０００）Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ ２０：１～５５頁を参照のこと）、マウス（Ｐｏｌｌｏｃｋら、上記を参照のこと）または植物（Ｄｏｒａｎ，Ｐ．Ｍ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１９９～２０４頁；Ｍａ．Ｊ．Ｋ－Ｃ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：６０１～６０６頁；Ｂａｅｚ，Ｊ．ら（２０００）ＢｉｏＰｈａｒｍ．１３：５０～５４頁；Ｓｔｏｇｅｒ，Ｅ．ら（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：５８３～５９０頁を参照のこと）などのトランスジェニック生物を含む、当技術分野で公知の任意の手法によって行うことができる。抗体は、化学合成、または抗体をコードする遺伝子の宿主細胞での発現によって作製することもできる。

【0132】

ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）をコードするポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞でのさらなる増殖または発現のために、プラスミドなどの複製可能な構築物またはベクターに挿入される。記載された実施形態によるヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）の発現に適した構築物またはベクター（例えば、発現ベクター）が当技術分野で利用可能である。宿主細胞において単一コピーもしくは複数コピーで維持されるベクター、または宿主細胞の染色体に組み込まれるようになるベクターを含む様々なベクターが利用可能である。構築物またはベクターは適切な宿主細胞に導入され、ヒト化免疫グロブリンを発現する細胞が培養で作製および維持される。単一のベクターまたは複数のベクターがヒト化免疫グロブリンの発現に使用される。

【0133】

ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）をコードするポリヌクレオチドは容易に単離され、従来の手順（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）を使用して配列決定される。使用することができるベクターには、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、プラスミドが典型的な実施形態であるミニ染色体が挙げられる。一般に、そのようなベクターは、発現を容易にするために軽鎖および／または重鎖ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたシグナル配列、複製起点、１つまたはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列をさらに含む。軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドは、別々のベクターに挿入され、同時にまたは順次同じ宿主細胞に導入され（例えば、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔または形質導入によって）または、所望の場合には、重鎖および軽鎖の両方がそのような導入の前に同じベクターに挿入される。

【0134】

プロモーターは適切な宿主細胞での発現のために提供される。プロモーターは恒常性または誘導性であってもよい。例えば、プロモーターは、コードされたポリペプチドの発現を指示するように、ヒト化免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖をコードする核酸に作動可能に連結することができる。原核生物および真核生物宿主用の様々な適切なプロモーターが利用可能である。原核生物プロモーターには、大腸菌用のｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター；３－ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６リン酸イソメラーゼ、３－ホスホグリセリン酸ムターゼおよびグルコキナーゼが挙げられる。真核生物プロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、メタロチオネインおよび窒素代謝またはマルトース／ガラクトース利用に関与する酵素などの誘導性酵母プロモーター；ポリオーマ、鶏痘およびアデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（特に、前初期遺伝子プロモーター）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ならびに初期または後期シミアンウイルス４０プロモーターなどのウイルスプロモーター、ならびにＥＦ－１アルファ（ＭｉｚｕｓｈｉｍａおよびＮａｇａｔａ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８（１７）：５３２２頁）などの非ウイルスプロモーターを含むＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが挙げられる。当業者は、ヒト化抗体またはその部分を発現させるのに適当なプロモーターを選択することができるであろう。

【0135】

必要に応じて、例えば、高等真核生物の細胞での発現のために、追加のエンハンサーエレメントが、上に記載されたプロモーター中にあることが見出されたものの代わりに、またはこれと共に含まれる。適切な哺乳動物エンハンサー配列は、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、メタロチオニンおよびインスリン由来のエンハンサーエレメントを含む。あるいは、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマ エンハンサー、バキュロウイルスエンハンサーまたはマウスＩｇＧ２ａ遺伝子座などの真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーエレメントを使用してもよい（ＷＯ０４／０９８２３を参照のこと）。そのようなエンハンサーは、プロモーターの上流の部位でベクター上に位置する場合が多いが、他の場所、例えば、未翻訳領域内またはポリアデニル化シグナルの下流に位置することもできる。エンハンサーの選択および配置は、発現に使用される宿主細胞との適合性に基づき得る。

【0136】

さらに、ベクター（例えば、発現ベクター）は、ベクターを有する宿主細胞の選択のための選択可能なマーカー、および複製可能なベクターの場合には複製起点を含んでもよい。抗生物質または薬物耐性を与える産物をコードする遺伝子は一般的な選択可能なマーカーであり、原核生物（例えば、β－ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、ｔｅｔ遺伝子（テトラサイクリン耐性））および真核生物細胞（例えば、ネオマイシン（Ｇ４１８またはジェネティシン）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリン、またはハイグロマイシン５耐性遺伝子）で使用される。ジヒドロ葉酸還元酵素マーカー遺伝子は、様々な宿主でのメトトレキサートを用いた選択を可能にする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子（例えば、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）は、酵母での選択可能なマーカーとして使用される場合が多い。ウイルス（例えば、バキュロウイルス）またはファージベクター、およびレトロウイルスベクターなどの宿主細胞のゲノムに組み込むことができるベクターの使用も企図される。

【0137】

真核生物系では、ポリアデニル化および終結シグナルは、本明細書に記載された抗体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される。そのようなシグナルは、典型的にはオープンリーディングフレームの３’に置かれる。哺乳動物系では、ポリアデニル化／終結シグナルの非限定的な例には、成長ホルモン、伸長因子１アルファおよびウイルス（例えば、ＳＶ４０）遺伝子またはレトロウイルス長末端反復に由来するものが挙げられる。酵母系では、ポリアデニル化／終結シグナルの非限定的な例には、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）およびアルコール脱水素酵素１（ＡＤＨ）遺伝子に由来するものが挙げられる。原核生物系では、ポリアデニル化シグナルは典型的には必要とされず、代わりに、より短い、より定義されたターミネーター配列を使用することが有用である。ポリアデニル化／終結配列の選択は、発現に使用される宿主細胞との適合性に基づき得る。上記に加えて、収量を高めるのに使用される他の特性には、クロマチンリモデリングエレメント、イントロンおよび宿主細胞特異的コドン修飾が挙げられる。本明細書に記載された抗体のコドン使用頻度は、転写物および／または産物収量を増大させるために宿主細胞のコドンバイアスに対応するように修飾される（例えば、Ｈｏｅｋｅｍａ，Ａ．ら（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７（８）：２９１４～２４頁）。コドンの選択は、発現に使用される宿主細胞との適合性に基づき得る。

【0138】

本開示は故に、ヒト化免疫グロブリン、またはその重鎖もしくは軽鎖をコードする単離された核酸分子に関する。本開示はまた、免疫グロブリンおよびその鎖の抗原結合部分をコードする単離された核酸分子にも関する。

【0139】

ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、例えば、適切な宿主細胞での抗体をコードする１つまたはそれ以上の組換え核酸の発現によって作製することができる。宿主細胞は、任意の適切な方法を使用して作製することができる。例えば、本明細書に記載された発現構築物（例えば、１つまたはそれ以上のベクター、例えば、哺乳動物細胞発現ベクター）は適切な宿主細胞に導入され、得られた細胞は、構築物またはベクターの発現に適した条件下で維持される（例えば、培養、動物、植物において）。宿主細胞は、細菌細胞、例えば大腸菌（例えば、株ＤＨ５α（商標））（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）、ＰｅｒＣ６（Ｃｒｕｃｅｌｌ、ライデン、ＮＬ）、枯草菌および／または他の適切な細菌などを含む原核生物；真核生物細胞、例えば真菌もしくは酵母細胞（例えば、ピキア・パストリス、アスペルギルス属種、出芽酵母、分裂酵母、アカパンカビ）、または他の下等真核生物細胞、および高等真核生物の細胞、例えば、昆虫（例えば、ショウジョウバエシュナイダーＳ２細胞、Ｓｆ９昆虫細胞）（ＷＯ９４／１２６０８７）、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標））昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、哺乳動物（例えば、ＣＯＳ細胞、例えばＣＯＳ－１（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ－１６５０）およびＣＯＳ－７（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ－１６５１）、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ－９０９６）、ＣＨＯ ＤＧ４４（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．およびＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７（７）：４２１６～４２２０頁）、２９３（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ－１５７３）、ＨＥＫ、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ－２）、ＣＶＩ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ－７０）、ＷＯＰ（Ｄａｉｌｅｙ，Ｌ．ら（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５４：７３９～７４９頁）、３Ｔ３、２９３Ｔ（Ｐｅａｒ，Ｗ．Ｓ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０：８３９２～８３９６頁）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨｕＴ ７８細胞等、または植物（例えば、タバコ、アオウキクサ属（ｌｅｍｎａ）（アオウキクサ）、および藻類）由来のものであってもよい。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．（１９９３）を参照のこと。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、多細胞生物（例えば、植物または動物）の一部ではなく、例えば、単離された宿主細胞であり、または細胞培養物の一部である。

【0140】

宿主細胞は、スピナーフラスコ、振盪フラスコ、ローラーボトル、ウェーブリアクター（例えば、ｗａｖｅｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ製システム１０００）または中空糸システムで培養することができるが、大規模生産には、撹拌タンクリアクターまたはバッグリアクター（例えば、Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、サマセット、ニュージャージー ＵＳＡ）が特に懸濁培養に使用されることが好ましい。撹拌タンクリアクターは、例えば、スパージャ、バッフルまたは低剪断インペラを使用する通気に適合することができる。気泡塔およびエアリフトリアクターに関して、気泡または酸素気泡による直接通気が使用される。宿主細胞が無血清培養培地で培養される場合、通気プロセスの結果としての細胞損傷を防ぐのに役立つ、プルロニックＦ－６８などの細胞保護剤が培地に補充される。宿主細胞の特性に応じて、マイクロキャリアが足場依存性細胞株の増殖基質として使用され、または細胞が懸濁培養に適合される。宿主細胞、特に脊椎動物宿主細胞の培養は、バッチ、フェドバッチ、反復バッチ処理（Ｄｒａｐｅａｕら（１９９４）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１０３～１０９頁を参照のこと）、拡張バッチ処理または灌流培養などの様々な動作モードを利用することができる。組み換え形質転換哺乳動物宿主細胞は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む培地のような血清含有培地で培養することができるが、そのような宿主細胞は、必要に応じてグルコースなどのエネルギー源および組換えインスリンなどの合成増殖因子を補充された、Ｋｅｅｎら（１９９５）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：１５３～１６３頁に開示されているような無血清培地、またはＰｒｏＣＨＯ（商標）もしくはＵｌｔｒａＣＨＯ（商標）（Ｃａｍｂｒｅｘ ＮＪ、ＵＳＡ）などの市販の培地で培養されることが好ましい。宿主細胞の無血清培養は、それらの細胞が無血清条件での増殖に適合されることを必要とする場合がある。１つの適合アプローチは、そのような宿主細胞を血清含有培地で培養し、宿主細胞が無血清条件への適合をするようになるように培養培地の８０％を無血清培地に繰り返し交換することである（例えば、Ｓｃｈａｒｆｅｎｂｅｒｇ，Ｋ．ら（１９９５）Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ Ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ２１ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ（Ｂｅｕｖｅｒｙ，Ｅ．Ｃ．ら編）、６１９～６２３頁、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓを参照のこと）。

【0141】

記載された実施形態によるヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は培地に分泌され、意図された使用に適した精製の程度を提供する様々な手法を使用してそこから回収され、精製される。例えば、ヒト対象の治療のためのヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）の使用は、治療用抗体を含む培養培地と比べて、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって決定される場合、典型的には少なくとも９５％純度、より典型的には９８％または９９％純度を要求する。第１の例では、培養培地からの細胞残渣が遠心分離を使用して除去され、その後、例えば精密濾過、限外濾過および／または深層濾過を使用して上清の清澄化工程が行われる。あるいは、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、事前に遠心分離することなく精密濾過、限外濾過または深層濾過によって回収される。透析およびゲル電気泳動などの様々な他の手法、ならびにヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、アフィニティークロマトグラフィー（場合により、ポリヒスチジンなどのアフィニティータグシステムを含む）および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（ＵＳ５，４２９，７４６を参照のこと）などのクロマトグラフ法が利用可能である。１つの実施形態では、様々な清澄化工程後、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）は、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを使用して捕捉され、その後、イオン交換および／またはＨＡクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーならびに硫安沈殿などのさらなるクロマトグラフィー工程が行われる。様々なウイルス除去工程も使用される（例えばＤＶ－２０フィルターを使用した例えばナノ濾過）。これらの様々な工程後、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ以上、例えば１００ｍｇ／ｍＬ以上の本明細書に記載された抗体を含む精製調製物が提供され、それ故に、本明細書に記載された別の実施形態を形成する。１００ｍｇ／ｍＬ以上への濃縮物が、超遠心分離によって生成される。そのような調製物は、本明細書に記載された抗体の凝集形態が実質的にない。

【0142】

細菌系は抗体断片の発現に特に適している。そのような断片は、細胞内またはペリプラズム内に局在化される。不溶性ペリプラズムタンパク質は、当業者に公知の方法により抽出およびリフォールドされて活性タンパク質を形成することができる。Ｓａｎｃｈｅｚら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７２：１３～２０頁；Ｃｕｐｉｔ，Ｐ．Ｍ．ら（１９９９）Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：２７３～２７７頁を参照のこと。

【0143】

本開示はまた、核酸、例えば本明細書に記載されたベクター（例えば、発現ベクター）を含む細胞にも関する。例えば、記載された実施形態によるヒト化免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする核酸（すなわち、１つまたはそれ以上の核酸）、またはそのような核酸を含む構築物（例えば、１つまたはそれ以上の構築物、例えば、１つまたはそれ以上のベクター）は、選択された宿主細胞に適した方法（例えば、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、感染）によって適切な宿主細胞に導入され、核酸は、１つまたはそれ以上の発現制御エレメント（例えば、宿主細胞ゲノムに組み込まれるベクター内、細胞でのプロセシングによって作出される構築物内の）に作動可能に連結される、または作動可能に連結されるようになる。宿主細胞は、発現に適した条件下（例えば、誘導因子、適当な塩を補充された適切な培地、増殖因子、抗生物質、栄養サプリメント等の存在下）で維持され、それにより、コードされたポリペプチドが産生される。所望の場合には、コードされたヒト化抗体は、例えば宿主細胞、培養培地、または乳汁から単離される。このプロセスは、トランスジェニック動物または植物（例えば、タバコ）の宿主細胞（例えば、乳腺細胞）での発現を包含する（例えば、ＷＯ９２／０３９１８を参照のこと）。

【0144】

ＶＩ．Ｔ細胞媒介性障害を治療または予防する方法
免疫抑制が正当化される、および／または自己免疫状態が生じるいくつかの状況では、Ｔ細胞活性の抑制が望ましい。したがって、炎症、自己免疫、および／またはそのような機序を含む他の状態などの不適切なまたは望ましくない免疫応答を含む疾患の治療におけるαβＴＣＲ／ＣＤ３複合体の標的化が示される。１つの実施形態では、そのような疾患または障害は、 自己免疫および／または炎症性疾患である。そのような自己免疫および／または炎症性Ｔ細胞媒介性疾患の例には：全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病（ＣＤ）を含む）、多発性硬化症（ＭＳ）、強皮症、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、ならびに他の疾患および障害、例えば、尋常性天疱瘡（ＰＶ）、乾癬、アトピー性皮膚炎、セリアック病、慢性閉塞性肺疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病（甲状腺）、シェーグレン症候群、ギランバレー症候群、グッドパスチャー症候群、アジソン病、ウェゲナー肉芽腫症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、リウマチ性多発筋痛症、レイノー現象、側頭動脈炎、巨細胞性動脈炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、結節性多発動脈炎、ベーチェット病、原発性胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎、心筋炎、リウマチ熱、強直性脊椎炎、糸球体腎炎、サルコイドーシス、皮膚筋炎、重症筋無力症、多発性筋炎、円形脱毛症、ならびに白斑が挙げられるが、これらに限定されない。

【0145】

１つの実施形態では、そのような疾患または障害はＳＬＥである。１つの実施形態では、そのような疾患または障害はＲＡである。１つの実施形態では、そのような疾患または障害はＩＢＤである。１つの実施形態では、そのような疾患または障害はＭＳである。１つの実施形態では、そのような疾患または障害はＴ１Ｄである。

【0146】

別の実施形態では、そのような疾患または障害は、異種移植、同種移植、種間妊娠（ｘｅｎｏｐｒｅｇｎａｎｃｙ）、妊娠高血圧腎症、またはＲｈ病である。

【0147】

特定の実施形態では、記載された実施形態による抗体は、対象の免疫を抑制して移植を助けるのに使用される。そのような使用は、異種移植または同種移植（限定されるものではないが、以下を含む：幹細胞、骨髄、組織、身体のパーツ、および固形臓器の移植）後の一般的な合併症である移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を軽減する。組織には、限定されるものではないが、以下が挙げられる：角膜、強膜、骨、皮膚、血管、および心臓弁。身体のパーツには、限定されるものではないが、以下が挙げられる：顔またはその部分、１つまたはそれ以上の腕またはその部分、１つまたはそれ以上の手またはその部分、１つまたはそれ以上の足またはその部分、および頭皮またはその部分。固形臓器には、限定されるものではないが、以下が挙げられる：心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、胃、小腸、大腸、精巣および卵巣。移植片対宿主病に対する既存の治療の説明については、例えば、Ｓｖｅｎｎｉｌｓｏｎ、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２００５）３５：Ｓ６５～Ｓ６７頁、およびその中に引用されている参考文献を参照のこと。有利には、本開示で提示される抗体は、他の利用可能な療法と組み合わせて使用される。

【0148】

自己免疫疾患の治療に関して、併用療法は、本明細書に記載された抗体を医薬品と一緒に投与することを含み得、医薬品は、抗体と一緒にそのような自己免疫疾患を予防または治療するための有効量を含む。前記自己免疫疾患が１型糖尿病である場合、併用療法は、膵ベータ細胞の増殖を促進し、またはベータ細胞移植を増強する、ベータ細胞増殖もしくは生存因子または免疫調節性抗体などの薬剤の１つまたはそれ以上を包含し得る。前記自己免疫疾患が関節リウマチである場合、前記併用療法は、メトトレキサート、抗ＴＮＦ－α抗体、ＴＮＦ－α受容体－Ｉｇ融合タンパク質、抗ＩＬ－１５もしくは抗ＩＬ－２１抗体、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、または疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）の１つまたはそれ以上を包含し得る。例えば、追加の薬剤は、抗ＴＮＦ剤（例えば、エンブレル（登録商標）、インフリキシマブ（レミケード（登録商標））およびアダリムマブ（ヒュミラ（登録商標））またはリツキシマブ（リツキサン（登録商標））などの生物剤であってもよい。前記自己免疫疾患が造血移植拒絶反応である場合、造血成長因子（例えば、エリスロポエチン、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－１１、トロンボポエチン等）または抗菌薬（例えば、抗菌薬、抗ウイルス、抗真菌薬）が投与される。前記自己免疫疾患が乾癬である場合、追加の薬剤は、タールおよびその誘導体、光線療法、コルチコステロイド、シクロスポリンＡ、ビタミンＤ類似体、メトトレキサート、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）阻害剤、ならびに抗ＴＮＦ－α剤およびリツキサン（登録商標）などの生物剤の１つまたはそれ以上であってもよい。前記自己免疫疾患が、例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である場合、追加の薬剤は、アミノサリチル酸、コルチコステロイド、免疫調節薬、抗生物質、またはレミケード（登録商標）およびヒュミラ（登録商標）などの生物剤の１つまたはそれ以上であってもよい。

【0149】

併用治療は、当業者によって必要または好都合と見なされる任意の方法で実行され、本明細書の目的のために、組み合わせて使用される化合物の順序、量、反復または相対量に関する制限は企図されない。したがって、記載された実施形態による抗体は、療法において使用するための医薬組成物に製剤化することができる。

【0150】

ＶＩＩ．抗αβＴＣＲ抗体の医薬組成物および投与方法
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されたヒト化モノクローナル抗体、もしくはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）、または本開示の前の態様で定義されているアッセイ方法によって識別可能なリガンドを含む医薬組成物が提供される。リガンドは、本明細書で論じられている免疫グロブリン、ペプチド、核酸または小分子であってもよい。それらは、以下の考察では「化合物」と呼ばれる。

【0151】

本明細書に記載された医薬組成物は、活性成分としてＴ細胞活性を調節することができる化合物を含む組成物である。化合物は、任意の薬学的に許容される塩の形態であり、または例えば、必要に応じて、類似体、遊離塩基形態、互変異性体、エナンチオマー、ラセミ体、もしくはそれらの組み合わせである。本明細書に記載された活性成分を含む医薬組成物の活性成分は、例えば、移植片対宿主病の治療において、特定の症例に依存する量で投与される場合、治療的活性を示すように企図される。

【0152】

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されたヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体断片（例えば、抗αβＴＣＲ抗体またはその断片）、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。

【0153】

ある特定の実施形態では、本開示に記載された１つまたはそれ以上の化合物は、上述の状態のいずれかを治療する上で特定の適応症の治療に適していることが公知の、当技術分野において認識されている任意の化合物と組み合わせて使用することができる。したがって、本明細書に記載された１つまたはそれ以上の化合物は、好都合な単一の組成物が対象に投与されるように、前述の適応症の治療に適していることが公知の、当技術分野において認識されている１つまたはそれ以上の化合物と組み合わせることができる。投薬レジメンは、最適な治療反応をもたらすように調整される。

【0154】

例えば、いくつかの分割用量が毎日投与され、または該用量は、治療状況の緊急性によって示されるのに比例して低減される。

【0155】

活性成分は、経口、静脈内（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内もしくは座薬経路、または埋め込み（例えば、徐放分子を使用する）などによる好都合な方法で投与することができる。移植のケースでは、活性成分は、患者に移植される細胞、組織、または臓器を移植の前に処置するのに使用することもできる。これは、例えば、移植片対宿主病の可能性を予防し、減少させ、または移植片対宿主病の症状を和らげるために行われる。

【0156】

投与経路に応じて、活性成分は、前記成分を不活性化する可能性がある酵素、酸および他の天然条件の作用から前記成分を保護する材料にコーティングされることが必要とされる。

【0157】

非経口投与以外の手段によって活性成分を投与するために、活性成分はその不活性化を防ぐ材料によってコーティングされ、または該材料と共に投与されるであろう。例えば、活性成分は、酵素阻害剤と同時投与されるアジュバント、またはリポソームで投与される。アジュバントは最も広義に使用され、インターフェロンなどの任意の免疫刺激化合物を含む。本明細書で企図されるアジュバントには、レゾルシノール、非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ－ヘキサデシルポリエチレンエーテルが挙げられる。酵素阻害剤には、膵臓トリプシンが挙げられる。

【0158】

リポソームには、水中油中水型エマルションおよび従来のリポソームが挙げられる。

【0159】

活性成分は、非経口または腹腔内投与することもできる。

【0160】

分散液も、グリセリン、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中ならびに油中で製造される。保存および使用の通常の条件下では、これらの製造物は微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含有する。

【0161】

注射可能な使用に適した薬学的形態には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射溶液または分散液の即時製造のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合で該形態は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性でなければならない。該形態は製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合には必要とされる粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。

【0162】

微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらされる。ある特定の場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいことがある。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物で使用することによってもたらされる。

【0163】

滅菌注射用溶液は、必要とされる量の活性成分を、必要に応じて、上記に列挙された他の成分のいくつかと共に適当な溶媒に組み入れ、その後濾過滅菌して製造される。一般に、分散液は、滅菌された活性成分を、基礎分散媒および上記に列挙されたものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み入れて製造される。滅菌注射用溶液を製造するための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、活性成分プラス任意の追加の所望の成分の粉末を、前もって滅菌濾過されたその溶液からもたらす真空乾燥および凍結乾燥法である。

【0164】

様々な他の材料は、コーティング剤として、またはさもなければ投与単位の物理的形態を変更するために存在していてもよい。当然ながら、任意の投与単位形態の製造において使用される任意の材料は、薬学的に純粋であり、使用される量において実質的に無毒であるべきである。さらに、活性成分は、持続放出製造物および製剤に組み入れることができる。

【0165】

本明細書で使用される場合「薬学的に許容される担体および／または希釈剤」には、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が挙げられる。ある特定の実施形態では薬学的に許容される担体または希釈剤は、水性流体である。薬学的活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と適合しない場合を除いて、治療用組成物におけるそれらの使用が企図される。補助的活性成分も組成物に組み入れることができる。

【0166】

投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与単位形態で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。投与単位形態は本明細書で使用される場合、治療される哺乳動物対象のための単一剤形として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要とされる薬学的担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含有する。本明細書に記載された新規投与単位形態の仕様は、（ａ）活性物質の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）身体の健康が損なわれる疾患または状態を有する生体における疾患の治療のための活性物質などの化合物の技術分野に特有の制限によって決定づけられ、およびこれに直接依存する。主要な活性成分は、有効量での好都合で有効な投与のために、投与単位形態において適切な薬学的に許容される担体と共に配合される。補助的活性成分を含有する組成物の場合、投与量は、前記成分の通常の用量および投与様式を参照して決定される。

【0167】

投与量には、限定されるものではないが、以下が挙げられる：０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．７ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、２．９ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．１ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．３ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．７ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ、３．９ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．１ｍｇ／ｋｇ、４．２ｍｇ／ｋｇ、４．３ｍｇ／ｋｇ、４．４ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、４．６ｍｇ／ｋｇ、４．７ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、４．９ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、５．１ｍｇ／ｋｇ、５．２ｍｇ／ｋｇ、５．３ｍｇ／ｋｇ、５．４ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、５．６ｍｇ／ｋｇ、５．７ｍｇ／ｋｇ、５．８ｍｇ／ｋｇ、５．９ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、６．１ｍｇ／ｋｇ、６．２ｍｇ／ｋｇ、６．３ｍｇ／ｋｇ、６．４ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、６．６ｍｇ／ｋｇ、６．７ｍｇ／ｋｇ、６．８ｍｇ／ｋｇ、６．９ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、７．１ｍｇ／ｋｇ、７．２ｍｇ／ｋｇ、７．３ｍｇ／ｋｇ、７．４ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、７．６ｍｇ／ｋｇ、７．７ｍｇ／ｋｇ、７．８ｍｇ／ｋｇ、７．９ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、８．１ｍｇ／ｋｇ、８．２ｍｇ／ｋｇ、８．３ｍｇ／ｋｇ、８．４ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇ、８．６ｍｇ／ｋｇ、８．７ｍｇ／ｋｇ、８．８ｍｇ／ｋｇ、８．９ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、９．１ｍｇ／ｋｇ、９．２ｍｇ／ｋｇ、９．３ｍｇ／ｋｇ、９．４ｍｇ／ｋｇ、９．５ｍｇ／ｋｇ、９．６ｍｇ／ｋｇ、９．７ｍｇ／ｋｇ、９．８ｍｇ／ｋｇ、９．９ｍｇ／ｋｇ、１０．０ｍｇ／ｋｇ、１０．１ｍｇ／ｋｇ、１０．２ｍｇ／ｋｇ、１０．３ｍｇ／ｋｇ、１０．４ｍｇ／ｋｇ、１０．５ｍｇ／ｋｇ、１０．６ｍｇ／ｋｇ、１０．７ｍｇ／ｋｇ、１０．８ｍｇ／ｋｇ、１０．９ｍｇ／ｋｇ、１１．０ｍｇ／ｋｇ、１１．１ｍｇ／ｋｇ、１１．２ｍｇ／ｋｇ、１１．３ｍｇ／ｋｇ、１１．４ｍｇ／ｋｇ、１１．５ｍｇ／ｋｇ、１１．６ｍｇ／ｋｇ、１１．７ｍｇ／ｋｇ、１１．８ｍｇ／ｋｇ、１１．９ｍｇ／ｋｇ、１２．０ｍｇ／ｋｇ、１２．１ｍｇ／ｋｇ、１２．２ｍｇ／ｋｇ、１２．３ｍｇ／ｋｇ、１２．４ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、１２．６ｍｇ／ｋｇ、１２．７ｍｇ／ｋｇ、１２．８ｍｇ／ｋｇ、１２．９ｍｇ／ｋｇ、１３．０ｍｇ／ｋｇ、１３．１ｍｇ／ｋｇ、１３．２ｍｇ／ｋｇ、１３．３ｍｇ／ｋｇ、１３．４ｍｇ／ｋｇ、１３．５ｍｇ／ｋｇ、１３．６ｍｇ／ｋｇ、１３．７ｍｇ／ｋｇ、１３．８ｍｇ／ｋｇ、１３．９ｍｇ／ｋｇ、１４．０ｍｇ／ｋｇ、１４．１ｍｇ／ｋｇ、１４．２ｍｇ／ｋｇ、１４．３ｍｇ／ｋｇ、１４．４ｍｇ／ｋｇ、１４．５ｍｇ／ｋｇ、１４．６ｍｇ／ｋｇ、１４．７ｍｇ／ｋｇ、１４．８ｍｇ／ｋｇ、１４．９ｍｇ／ｋｇ、１５．０ｍｇ／ｋｇ、１５．１ｍｇ／ｋｇ、１５．２ｍｇ／ｋｇ、１５．３ｍｇ／ｋｇ、１５．４ｍｇ／ｋｇ、１５．５ｍｇ／ｋｇ、１５．６ｍｇ／ｋｇ、１５．７ｍｇ／ｋｇ、１５．８ｍｇ／ｋｇ、１５．９ｍｇ／ｋｇ、１６．０ｍｇ／ｋｇ、１６．１ｍｇ／ｋｇ、１６．２ｍｇ／ｋｇ、１６．３ｍｇ／ｋｇ、１６．４ｍｇ／ｋｇ、１６．５ｍｇ／ｋｇ、１６．６ｍｇ／ｋｇ、１６．７ｍｇ／ｋｇ、１６．８ｍｇ／ｋｇ、１６．９ｍｇ／ｋｇ、１７．０ｍｇ／ｋｇ、１７．１ｍｇ／ｋｇ、１７．２ｍｇ／ｋｇ、１７．３ｍｇ／ｋｇ、１７．４ｍｇ／ｋｇ、１７．５ｍｇ／ｋｇ、１７．６ｍｇ／ｋｇ、１７．７ｍｇ／ｋｇ、１７．８ｍｇ／ｋｇ、１７．９ｍｇ／ｋｇ、１８．０ｍｇ／ｋｇ、１８．１ｍｇ／ｋｇ、１８．２ｍｇ／ｋｇ、１８．３ｍｇ／ｋｇ、１８．４ｍｇ／ｋｇ、１８．５ｍｇ／ｋｇ、１８．６ｍｇ／ｋｇ、１８．７ｍｇ／ｋｇ、１８．８ｍｇ／ｋｇ、１８．９ｍｇ／ｋｇ、１９．０ｍｇ／ｋｇ、１９．１ｍｇ／ｋｇ、１９．２ｍｇ／ｋｇ、１９．３ｍｇ／ｋｇ、１９．４ｍｇ／ｋｇ、１９．５ｍｇ／ｋｇ、１９．６ｍｇ／ｋｇ、１９．７ｍｇ／ｋｇ、１９．８ｍｇ／ｋｇ、１９．９ｍｇ／ｋｇ、および２０．０ｍｇ／ｋｇを含む、０．０１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ。

【0168】

投与量には、限定されるものではないが、以下も挙げられる：約１００ｎｇ／ｋｇ、約２００ｎｇ／ｋｇ、約３００ｎｇ／ｋｇ、約４００ｎｇ／ｋｇ、約５００ｎｇ／ｋｇ、約６００ｎｇ／ｋｇ、約７００ｎｇ／ｋｇ、約８００ｎｇ／ｋｇ、約９００ｎｇ／ｋｇ、約１マイクログラム／ｋｇ、約２マイクログラム／ｋｇ、約３マイクログラム／ｋｇ、約４マイクログラム／ｋｇ、約５マイクログラム／ｋｇ、約６マイクログラム／ｋｇ、約７マイクログラム／ｋｇ、約８マイクログラム／ｋｇ、約９マイクログラム／ｋｇ、約１０マイクログラム／ｋｇを含む、約１００ｎｇ／ｋｇ～約０．０１ｍｇ／ｋｇ。

【0169】

抗体を含むペプチド化合物の細胞への送達を容易にするために、ペプチドは細胞膜を横断するその能力を改善するように修飾される。例えば、ＵＳ５，１４９，７８２は、細胞膜を越えるタンパク質輸送を増加させるための融合ペプチド、イオンチャネル形成ペプチド、膜ペプチド、長鎖脂肪酸および他の膜添加剤の使用を開示している。これらのおよび他の方法は、参照によって本明細書に組み入れられているＷＯ９７／３７０１６およびＵＳ５，１０８，９２１にも記載されている。

【0170】

さらなる態様では、単独で、または特定の適応症を治療するのに適していることが公知の、当技術分野において認識されている化合物と組み合わせて、疾患の治療において使用するための本明細書に記載された活性成分が提供される。その結果として、異常な免疫応答に関連する疾患を治療する医薬品の製造のための本明細書に記載された活性成分の使用が提供される。

【0171】

さらに、上に記載されているアッセイ方法を使用して識別可能なリガンドの治療有効量を対象に投与することを含む、異常な免疫応答に関連する状態を治療するための方法が提供される。

【0172】

以下に提供される例は、例示のみの目的のためであり、本明細書に記載された組成物および方法に対する制限と見なされるべきではない。

【実施例1】

【0173】

ＶＨ３１抗αβＴＣＲ抗体製剤の加速安定性試験
加速安定性試験をＶＨ３１抗体の様々な製剤で行った。参照または対照ＶＨ３１抗体は、配列番号１６として記載されたアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号１４として記載されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、ＧＬ１ＢＭシリーズの野生型ヒト化抗ヒトαβＴＣＲ抗体である（表１）。冷蔵温度４℃以下で４カ月後の液体製剤では断片化は観察されなかった。しかし、５週間にわたる温度およびｐＨ上昇（すなわち、４５℃；ｐＨ４．０～８．０）を含む加速条件が与えられたＶＨ３１液体製剤では断片が検出された。２つの低分子量（ＬＭＷ）バンドの存在が、ＶＨ３１抗体の軽鎖（ＬＣ）に対応するバンドの消失と相関しているようであり、観察されたＬＭＷ種源の軽鎖断片化を暗に示していることが注目された（図１、矢印）。

【実施例2】

【0174】

ストレスを受けた製剤の効力を評価するための細胞ベースのアッセイ
ＶＨ３１抗αβＴＣＲ抗体は活性化Ｔ細胞を選択的に枯渇させる。加速条件に曝露したＶＨ３１製剤がこの能力を保持するかどうかを決定するために、細胞ベースの効力アッセイを行った。効力アッセイは、Ｔ細胞受容体の活性化、およびアポトーシス経路を刺激する抗αβＴＣＲ抗体のその後の結合に基づいた。

【0175】

ジャーカットＴリンパ球はＴ細胞受容体複合体を発現する。効力アッセイは、ルシフェラーゼ受容体に連結された活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）応答エレメントを含有するジャーカットＴ細胞株を利用した。この改変細胞株を使用して、Ｔ細胞活性化およびその後の抗αβＴＣＲ抗体による活性化シグナルの阻害を調べた。Ｔ細胞受容体複合体の活性化はＮＦＡＴ経路を刺激し、ルシフェラーゼ産生をもたらす。ルシフェラーゼ産生を、次いでルシフェラーゼ基質（例えば、ルシフェリン）および発光検出器を使用して測定した。活性化のレベルはルシフェラーゼ産生に比例する。固定化抗ＣＤ３は、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼジャーカット細胞におけるＮＦＡＴ経路の誘導およびその後のルシフェラーゼ産生により測定した場合、ジャーカットＴ細胞を活性化する。活性化は抗αβＴＣＲ抗体によって用量依存的に阻害される。これは抗αβＴＣＲ効力の定性的測定である。

【0176】

定性的効力アッセイを９６ウェルプレートフォーマットで行った。９６ウェルプレートを抗ＣＤ３ １μｇ／ｍＬで２～８℃、一晩コーティングした。プレートを洗浄し、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼジャーカットＴリンパ球（５×１０^４細胞／ウェル）を抗ＣＤ３コーティングプレートに添加した。Ｔ細胞受容体複合体を活性化するために、細胞を抗ＣＤ３と３７℃および５％ＣＯ_２で５時間インキュベートした。各細胞条件を、次いで複数レベル（０．００３～２００μｇ／ｍＬ）の抗αβＴＣＲ（対照および試料）とさらに１８時間インキュベートした。陰性抗ＣＤ３（０μｇ／ｍＬ）対照および抗αβＴＣＲ（０ μｇ／ｍＬ）対照を各条件に含めた。２回目のインキュベーション工程後、抗αβＴＣＲ希釈液を除去し、細胞を細胞培養溶解試薬で溶解した。ルシフェラーゼ基質および発光プレートリーダーを使用して溶解物をルシフェラーゼ産生について測定した。より高用量の抗αβＴＣＲ抗体は、活性化応答の阻害を示すより低い発光シグナルをもたらすことが予想された。Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏソフトウェアを使用して用量反応データをプロットし、試料用量反応曲線を対照用量反応曲線と目視で比較した。

【0177】

図２のグラフは、細胞ベースの効力アッセイからのデータを示している。５週間にわたる加速条件（すなわち、４５℃；ｐＨ８．０）に曝露したＶＨ３１抗体製剤（白抜きの四角記号）は、５週間にわたるあまり厳しくない条件（すなわち、４５℃；ｐＨ５．０）（白抜きの丸記号）または対照条件（すなわち、≦０℃；ｐＨ５．０；白抜きの菱形記号）に曝露したＶＨ３１製剤と比べて、効力のかなりの喪失を示した。この試験は、軽鎖断片化に起因している可能性がある、ＬＭＷ種の見かけと抗体効力の喪失の関係を示した。

【実施例3】

【0178】

抗体断片の分析
抗体断片を、観察されたバンドの分子量推定、ならびにＮ末端配列決定およびペプチドマッピング試験によってさらに分析した（図３）。ポリペプチドの化学的および酵素的切断は、Ａｓｎ（Ｎ）とＰｒｏ（Ｐ）残基の間で生じることが知られている。したがって、配列決定およびマッピング試験に基づき、軽鎖アミノ酸残基Ｎ９３およびＰ９４を、軽鎖クリッピングの推定位置および同定された断片の源として同定した（図４）。これをさらに確かめるために、ＶＨ３１軽鎖（Ｐ７）をｐＨ４．０～８．０でトリプシン消化に供した。図５のグラフは、酵素的クリッピングがＮ９３／Ｐ９４で生じるとするならば予想される様々な軽鎖断片を示している。これらの断片は、アミノ酸残基９４～１０２（図５Ａ）、残基６１～９３（図５Ｂ）、および残基９４～１０６（図５Ｃ）に対応する。アミノ酸９４～１０２および９４～１０６に対応する２つのＣ末端産物は、不完全なトリプシン消化によるものであった。予想通り、ｐＨの増加は予測した断片の増加と関連していた。

【0179】

Ａｓｎ（Ｎ）は溶液中で、例えばＡｓｎ側鎖の脱アミド化によりＡｓｐ（Ｄ）に変換し得ることが知られている（図６）。ＬＣ断片化の機序をより理解するために、ＬＣ断片を分析して残基９３がＮまたはＤかを決定した。同位体分布は、６１～９３ペプチド断片の大部分がＡｓｎで終わっていることを明らかにした。Ｄ９３に対応する別個のピークは観察されず、ＡｓｎからＡｓｐへの変換と、その後のＡｓｐ／Ｐｒｏ切断がＶＨ３１ ＬＣ断片化の主な原因ではないことを示した。これらの理由のために、その後の改変安定性試験は残基Ｎ９３／Ｐ９４に注目した。

【実施例4】

【0180】

変異誘発による軽鎖（ＬＣ）バリアントの改変
安定性および断片化に対する耐性が向上したＶＨ３１軽鎖バリアントを改変するために、変異誘発アプローチを採った。無関係の抗体（すなわち、ｓＦＬＴ０１）のＡｓｎクリッピング部位を除去する以前の試みは、抗体断片化を防がなかった。さらに複雑なことに、アミノ酸残基Ｎ９３およびＰ９４は軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）内に存在することが注目された。上記を考慮し、軽鎖安定性を増強しながら、抗原結合親和性および抗体効力を同時に保持することを目的として、軽鎖バリアントを合理的に設計した。

【0181】

アミノ酸Ｐｒｏ（Ｐ）は、折り畳まれたタンパク質構造ではほとんど自由がきかない。したがって、ＬＣ ＣＤＲ３のコンフォメーションを不安定化することなく残基９４でＰｒｏを置き換えることは困難であり得ることが想定された。Ａｌａ（Ａ）は、その物理特性のために変異誘発で一般的に使用される。出発点として、残基Ｎ９３およびＰ９４をＡと個々にまたは同時に置き換えた。さらに、互換性があると考えられるアミノ酸特性、例えば、電荷、サイズ、Ｈ結合、極性対非極性等に基づき、いくつかの他の置換を残基Ｎ９３で行った。図７は、行われテストされた様々なアミノ酸置換を示している。

【0182】

野生型抗αβＴＣＲ ＶＨ３１発現ベクターを、変異誘発のテンプレートおよび発現対照として使用した。８組のプライマーを設計し、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してＰＣＲ変異誘発を行った。変異体ＤＮＡを次いでＤＮＡ配列決定によって確認した。

【実施例5】

【0183】

ＬＣバリアントの発現および分析
変異体および野生型（ＷＴ）ＤＮＡをＥｘｐｉ２９３一過性発現系にトランスフェクトした。馴化培地をトランスフェクション４日後に回収し、発現レベルをＯｃｔｅｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアッセイによって測定した。結果（表２に示された）は、αβＴＣＲ野生型（１１４μｇ／ｍＬ培地）および８つの変異体（＞４５μｇ／ｍＬ培地）中７つについて良好な発現を示した。１つの変異体（Ｎ９３Ａ）は、比較的低レベル（１６μｇ／ｍＬ）で発現された。トランスフェクションを８つの変異体全てについて３０ｍＬまでスケールアップした。プロテインＡ精製のために馴化培地を回収した。

【0184】

馴化培地を精製のために１ｍＬ ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ（ＧＥ）カラムに通した。カラムを５カラム容量のＰＢＳ ｐＨ７．２（Ｇｉｂｃｏ）で平衡化した。培地を流速０．５ｍＬ／分で充填し、次いで溶出前に２０カラム容量（ＣＶ）のＰＢＳ ｐＨ７．２で洗浄した。抗体を１０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ３．７５に溶出し、溶出直後に０．２Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ５．５に調整した。全ての試料を、シリンジフィルターを備えた０．２μｍ低タンパク質結合膜で濾過し（回収率５０％～８０％）、Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ３０を使用して試料を濃縮した（回収率１００％）。結果を表２にまとめた。

【0185】

【表4】

【0186】

精製抗体を、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ Ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、１ウェルあたり１．５μｇロードで処理した。結果は、テストした全て変異体がＷＴに匹敵し、良好な純度を有することを示した（図８）。精製変異体を、安定性および機能アッセイによるさらなる特徴付けに供した。

【0187】

αβＴＣＲ Ｎ９３Ｓ変異体の６０ミリリットルスケールのトランスフェクションをＥｘｐｉ２９３一過性発現系で行った。馴化培地をトランスフェクション４日後に回収した。発現レベルをＯｃｔｅｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアッセイによって測定し、３７μｇ／ｍＬであると判定した。

【0188】

ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ（ＧＥ）カラム（１ｍＬ）を精製に使用した。カラムを５ＣＶのＰＢＳ ｐＨ７．２（Ｇｉｂｃｏ）で平衡化した。馴化培地試料を流速０．５ｍＬ／分で充填し、次いで溶出前に２０ＣＶのＰＢＳ ｐＨ７．２で洗浄した。抗体を５ＣＶの１０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ３．７５（合計５ｍＬ）に溶出した。収率はほぼ１００％であった。溶出した抗体を、溶出後０．２Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ５．５に調整した。溶液は、ｐＨ５．５でわずかに濁るようになり、５０ｍＬチューブトップフィルターで濾過した（０．２μｍ ＣＡ、低タンパク質結合）。 濾過回収率は、おそらく比較的大容量の喪失のために７７％であった（合計１．７ｍｇ）。精製抗体およびαβＴＣＲ ＶＨ３１対照を、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ Ｇｅｌｓ（１ウェルあたり２μｇロード）で処理した。結果は、テストした全て変異体がＶＨ３１対照に匹敵することを示した。精製Ｎ９３Ｓおよび予め精製したＷＴおよびＶＨ３１対照をＳＥＣ－ＨＰＬＣで処理し、プロフィールを図９に示した。ＷＴおよびＮ９３Ｓ変異体いずれのＳＥＣプロフィールも、ＶＨ３１対照に匹敵するようであった。

【実施例6】

【0189】

ＬＣバリアントの効力を評価するためのアッセイ
実施例２に記載した定性的効力アッセイを、バリアント軽鎖を含む抗体で繰り返した。野生型および対照抗体は同一のＶＨ３１アミノ酸配列を含んだが、異なる調製物から作製した。野生型ＶＨ３１抗体はＬＣバリアント抗体と一緒に作製したのに対し、対照抗体は別個の大規模調製物から作製した。図１０に示すとおり、ＬＣバリアントＮ９３Ｓを含む抗体は、野生型ＶＨ３１または対照抗体のどちらより効力がわずかに低下したのみであった。対照的に、ＬＣバリアントＮ９３Ｑ、Ｎ９３Ａ、およびＮ９３Ａ／Ｐ９４Ａを含む抗体は全て、いずれの上述の抗体より効力が著しく低下した。これらの結果に基づき、Ｎ９３Ｓバリアントを加速安定性試験の候補として選択した。

【実施例7】

【0190】

ＬＣバリアントの加速安定性試験
ＬＣバリアントＮ９３Ｓを含む抗体を、上昇した温度（すなわち、４５℃）およびｐＨ（すなわち、ｐＨ８．０）に６週間供して、Ｎ９３Ｓアミノ酸置換がＬＣを安定化し、断片化を防ぐかどうかを決定した。上昇した温度およびｐＨ８．０で６週間後、断片化は野生型、参照ＶＨ３１、およびＮ９３Ｓ抗体で観察された。しかし、野生型またはＶＨ３１対照抗体のどちらかと比べて、Ｎ９３Ｓ変異体は分解が明らかに低減した（図１１）。特に、Ｎ９３Ｓ変異体は、野生型またはＶＨ３１対照抗体のどちらか（それぞれ２０倍を超える喪失）と比べて、加速条件下で効力の喪失が著しく低減した（３倍の喪失）。ｐＨ８．０より仮定の抗体薬物質製剤のｐＨに近いｐＨ５．５では、断片化の広まりは６週間時点で著しく少なかった（図１２）。

【0191】

上述の結果は、ＶＨ３１αβＴＣＲ抗体と比べてＮ９３Ｓ変異体が、上昇した温度および上昇したｐＨ下を含む保存条件下でＬＣ安定性および効力の改善を示すことを示した。無関係の抗体（すなわち、ｓＦＬＴ０１）のＡｓｎクリッピング部位を除去する以前の試みは抗体断片化を防がなかったため、これらの結果は驚くべきものであった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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