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特許7575460ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドセット、ポルフィロモナス・ジンジバリス検出方法、歯周病罹患可能性の評価方法、ポルフィロモナス・ジンジバリス検出用キット、及び歯周病の罹患可能性評価用キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-21
(45)【発行日】2024-10-29
(54)【発明の名称】ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドセット、ポルフィロモナス・ジンジバリス検出方法、歯周病罹患可能性の評価方法、ポルフィロモナス・ジンジバリス検出用キット、及び歯周病の罹患可能性評価用キット
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20241022BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20241022BHJP
C12Q 1/689 20180101ALI20241022BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31 ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/689 Z
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2022539500
(86)(22)【出願日】2021-07-27
(86)【国際出願番号】 JP2021027765
(87)【国際公開番号】W WO2022025066
(87)【国際公開日】2022-02-03
【審査請求日】2023-01-27
(31)【優先権主張番号】P 2020127517
(32)【優先日】2020-07-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000005887
【氏名又は名称】三井化学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】的石 かおり
【審査官】大久保 智之
(56)【参考文献】
【文献】特開２０００－１２５８７４（ＪＰ，Ａ）
【文献】韓国公開特許第１０－２０１２－００６２２６５（ＫＲ，Ａ）
【文献】Journal of Medical Microbiology，2013年，Vol.62，pp.1290-1294，https://www.microbiologyresearch.org/content/journal/jmm/10.1099/jmm.0.054247-0#tab2を参照
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－９０
Ｃ１２Ｑ １／００－７０
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（１ａ）、（１ｃ）及び（１ｄ）のいずれか１つに記載のｆｉｍＡ遺伝子認識用のポリヌクレオチドであって、下記（１ａ’）、（１ｃ’）及び（１ｄ’）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドであるリバースプライマーに対するフォワードプライマーである、ポリヌクレオチド、又は、下記（１ａ’）、（１ｃ’）及び（１ｄ’）のいずれか１つに記載のｆｉｍＡ遺伝子認識用のポリヌクレオチドであって、前記（１ａ）、（１ｃ）及び（１ｄ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドであるフォワードプライマーに対するリバースプライマーである、ポリヌクレオチド：
（１ａ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、かつ配列番号１～配列番号３のそれぞれの全長以下の塩基長であるポリヌクレオチド。
（１ｃ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む、１５塩基長～３５塩基長のポリヌクレオチド。
（１ｄ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含む、１５塩基長～３５塩基長のポリヌクレオチド。
（１ａ’）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、かつ配列番号４～配列番号９のそれぞれの全長以下の塩基長である、ポリヌクレオチド。
（１ｃ’）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む、１５塩基長～３５塩基長のポリヌクレオチド。
（１ｄ’）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含む、１５塩基長～３５塩基長のポリヌクレオチド。
【請求項2】
前記（１ａ）が、配列番号３で示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、かつ配列番号３の全長以下の塩基長であるポリヌクレオチドであるか、又は、
前記（１ａ’）が、配列番号７又は配列番号９で示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、かつ配列番号７及び配列番号９のそれぞれの全長以下の塩基長であるポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、かつ配列番号１～配列番号３のそれぞれの全長以下の塩基長であるか、又は配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、かつ配列番号４～配列番号９のそれぞれの全長以下の塩基長である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
下記（２ａ）、（２ｃ）及び（２ｄ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド（Ｆ）と、下記（３ａ）、（３ｃ）及び（３ｄ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド（Ｒ）と、を含むｆｉｍＡ遺伝子認識用のポリヌクレオチドセット。（２ａ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、かつ配列番号１～配列番号３のそれぞれの全長以下の塩基長であるポリヌクレオチド。
（２ｃ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む、１５塩基長～３５塩基長のポリヌクレオチド。
（２ｄ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含む、１５塩基長～３５塩基長のポリヌクレオチド。
（３ａ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、かつ配列番号４～配列番号９のそれぞれの全長以下の塩基長である、ポリヌクレオチド。
（３ｃ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む、１５塩基長～３５塩基長のポリヌクレオチド。
（３ｄ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含む、１５塩基長～３５塩基長のポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記（２ａ）が、配列番号３で示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、かつ配列番号３の全長以下の塩基長であり、前記（３ａ）が、配列番号７又は配列番号９で示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、かつ配列番号７及び配列番号９のそれぞれの全長以下の塩基長である、請求項４に記載のポリヌクレオチドセット。
【請求項6】
前記ポリヌクレオチド（Ｆ）が、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、かつ配列番号１～配列番号３のそれぞれの全長以下の塩基長であり、前記ポリヌクレオチド（Ｒ）が、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、かつ配列番号４～配列番号９のそれぞれの全長以下の塩基長である、請求項４に記載のポリヌクレオチドセット。
【請求項7】
前記ポリヌクレオチド（Ｆ）が配列番号１で示される塩基配列を含み、かつ、前記ポリヌクレオチド（Ｒ）が配列番号４、配列番号５、配列番号６、若しくは配列番号８で示される塩基配列を含む、前記ポリヌクレオチド（Ｆ）が配列番号２で示される塩基配列を含み、かつ、前記ポリヌクレオチド（Ｒ）が配列番号４、配列番号５、若しくは配列番号７で示される塩基配列を含む、
又は、
前記ポリヌクレオチド（Ｆ）が配列番号３で示される塩基配列を含み、かつ、前記ポリヌクレオチド（Ｒ）が配列番号４で示される塩基配列を含む、
請求項４～請求項６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドセット。
【請求項8】
ポルフィロモナス・ジンジバリス検出用である、請求項４～請求項７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドセット。
【請求項9】
歯周病の罹患可能性評価用である、請求項４～請求項７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドセット。
【請求項10】
請求項４～請求項７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドセットを用いた核酸増幅反応工程を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリス検出方法。
【請求項11】
請求項４～請求項７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドセットを用いた核酸増幅反応工程を含む、歯周病罹患可能性の評価方法。
【請求項12】
請求項４～請求項７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドセットを含む、ポルフィロモナス・ジンジバリス検出用キット。
【請求項13】
請求項４～請求項７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドセットを含む、歯周病の罹患可能性評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドセット、ポルフィロモナス・ジンジバリス検出方法、歯周病罹患可能性の評価方法、ポルフィロモナス・ジンジバリス検出用キット、及び歯周病の罹患可能性評価用キットに関する。
【背景技術】
【0002】
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）は、歯周病患者の口腔内から高頻度に検出されることから、歯周病原因菌の一つとして知られている。ポルフィロモナス・ジンジバリスは、線毛遺伝子であるｆｉｍＡを有しており、前記線毛遺伝子ｆｉｍＡは、さらに、Ｉ型、Ｉｂ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、及びＶ型の６種類に分けられる。前記６種類の中でも、ｆｉｍＡ ＩＩ型は、歯周病発症リスクの最も高い型であることが知られている。
【0003】
核酸増幅反応は、迅速、簡便、かつ高感度に標的核酸を増幅できることから、医療分野や食品分野において病原菌等の検出のために広く応用されている。前記ポルフィロモナス・ジンジバリスについても、その線毛遺伝子の一部の塩基配列について核酸増幅反応を行うことで、ポルフィロモナス・ジンジバリスの存在を検出できる。前記核酸増幅反応で使用されるプライマーについては、例えば以下のような知見がある。
【0004】
例えば、特開２０００－１２５８７４号公報には、ポルフィロモナス・ジンジバリスに特異的な検出法が開示されており、前記検出法に用いるオリゴヌクレオチドも記載されている。
【0005】
Ji-Hoi Moon, et al., Development and evaluation of new primers for PCR-based identification of type II fimA of Porphyromonas gingivalis, FEMS Immunol Med Microbiol, 64:425-428, 2012.には、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型を検出できる方法が開示されており、前記検出に用いるプライマーも記載されている。
【0006】
Atsuo Amano, et al., Distribution of Porphyromonas gingivalis Strains with fimA Genotypes in Periodontitis Patients, J Clin Microbiol, 37:1426-1430, 1999.には、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型を検出できる方法が開示されており、前記検出に用いるプライマーも記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、上記特開２０００－１２５８７４号公報、Ji-Hoi Moon, et al., Development and evaluation of new primers for PCR-based identification of type II fimA of Porphyromonas gingivalis, FEMS Immunol Med Microbiol, 64:425-428, 2012.、及びAtsuo Amano, et al., Distribution of Porphyromonas gingivalis Strains with fimA Genotypes in Periodontitis Patients, J Clin Microbiol, 37:1426-1430, 1999.のいずれにおいても、効率良くポルフィロモナス・ジンジバリスを検出できるポリヌクレオチドは得られていない。
【0008】
本開示は、上記に鑑みなされたものであり、ポルフィロモナス・ジンジバリスの線毛遺伝子（ｆｉｍＡ）の初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にすることができるポリヌクレオチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
課題を解決するための具体的手段には、以下の態様が含まれる。
＜１＞ 下記（１ａ）～（１ｄ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
（１ａ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（１ｂ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（１ｃ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（１ｄ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
＜２＞ 塩基数が１５塩基～３５塩基である、前記＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜３＞ 前記（１ａ）が、配列番号３、配列番号７、又は配列番号９で示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含む、前記＜１＞又は＜２＞に記載のポリヌクレオチド。
＜４＞ 配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含む、前記＜１＞又は＜２＞に記載のポリヌクレオチド。
＜５＞ 下記（２ａ）～（２ｄ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド（Ｆ）と、下記（３ａ）～（３ｄ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド（Ｒ）と、を含むポリヌクレオチドセット。
（２ａ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（２ｂ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（２ｃ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（２ｄ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（３ａ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（３ｂ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３ｃ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（３ｄ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
＜６＞ 前記ポリヌクレオチド（Ｆ）及び前記ポリヌクレオチド（Ｒ）の塩基数が、それぞれ独立に、１５塩基～３５塩基である、前記＜５＞に記載のポリヌクレオチドセット。
＜７＞ 前記（２ａ）が、配列番号３で示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、
前記（３ａ）が、配列番号７又は配列番号９で示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含む、前記＜５＞又は＜６＞に記載のポリヌクレオチドセット。
＜８＞ 前記ポリヌクレオチド（Ｆ）が、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、
前記ポリヌクレオチド（Ｒ）が、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含む、前記＜５＞又は＜６＞に記載のポリヌクレオチドセット。
＜９＞ 前記ポリヌクレオチド（Ｆ）が配列番号１で示される塩基配列を含み、かつ、前記ポリヌクレオチド（Ｒ）が配列番号４、配列番号５、配列番号６、若しくは配列番号８で示される塩基配列を含む、
前記ポリヌクレオチド（Ｆ）が配列番号２で示される塩基配列を含み、かつ、前記ポリヌクレオチド（Ｒ）が配列番号４、配列番号５、若しくは配列番号７で示される塩基配列を含む、
又は、
前記ポリヌクレオチド（Ｆ）が配列番号３で示される塩基配列を含み、かつ、前記ポリヌクレオチド（Ｒ）が配列番号４で示される塩基配列を含む、
前記＜５＞～＜８＞のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドセット。
＜１０＞ ポルフィロモナス・ジンジバリス検出用である、前記＜５＞～＜９＞のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドセット。
＜１１＞ 歯周病の罹患可能性評価用である、前記＜５＞～＜９＞のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドセット。
＜１２＞ 前記＜５＞～＜９＞のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドセットを用いた核酸増幅反応工程を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリス検出方法。
＜１３＞ 前記＜５＞～＜９＞のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドセットを用いた核酸増幅反応工程を含む、歯周病罹患可能性の評価方法。
＜１４＞ 前記＜５＞～＜９＞のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドセットを含む、ポルフィロモナス・ジンジバリス検出用キット。
＜１５＞ 前記＜５＞～＜９＞のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドセットを含む、歯周病の罹患可能性評価用キット。
＜１＞ 下記（１ａ）～（１ｄ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
（１ａ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（１ｂ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（１ｃ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（１ｄ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
＜２＞ 塩基数が１５塩基～３５塩基である、前記＜１＞に記載のポリヌクレオチド。
＜３＞ 前記（１ａ）が、配列番号３、配列番号７、又は配列番号９で示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含む、前記＜１＞又は＜２＞に記載のポリヌクレオチド。
＜４＞ 配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含む、前記＜１＞又は＜２＞に記載のポリヌクレオチド。
＜５＞ 下記（２ａ）～（２ｄ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド（Ｆ）と、下記（３ａ）～（３ｄ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド（Ｒ）と、を含むポリヌクレオチドセット。
（２ａ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（２ｂ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（２ｃ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（２ｄ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（３ａ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（３ｂ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３ｃ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（３ｄ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
＜６＞ 前記ポリヌクレオチド（Ｆ）及び前記ポリヌクレオチド（Ｒ）の塩基数が、それぞれ独立に、１５塩基～３５塩基である、前記＜５＞に記載のポリヌクレオチドセット。
＜７＞ 前記（２ａ）が、配列番号３で示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、
前記（３ａ）が、配列番号７又は配列番号９で示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含む、前記＜５＞又は＜６＞に記載のポリヌクレオチドセット。
＜８＞ 前記ポリヌクレオチド（Ｆ）が、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、
前記ポリヌクレオチド（Ｒ）が、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含む、前記＜５＞又は＜６＞に記載のポリヌクレオチドセット。
＜９＞ 前記ポリヌクレオチド（Ｆ）が配列番号１で示される塩基配列を含み、かつ、前記ポリヌクレオチド（Ｒ）が配列番号４、配列番号５、配列番号６、若しくは配列番号８で示される塩基配列を含む、
前記ポリヌクレオチド（Ｆ）が配列番号２で示される塩基配列を含み、かつ、前記ポリヌクレオチド（Ｒ）が配列番号４、配列番号５、若しくは配列番号７で示される塩基配列を含む、
又は、
前記ポリヌクレオチド（Ｆ）が配列番号３で示される塩基配列を含み、かつ、前記ポリヌクレオチド（Ｒ）が配列番号４で示される塩基配列を含む、
前記＜５＞～＜８＞のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドセット。
＜１０＞ ポルフィロモナス・ジンジバリス検出用である、前記＜５＞～＜９＞のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドセット。
＜１１＞ 歯周病の罹患可能性評価用である、前記＜５＞～＜９＞のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドセット。
＜１２＞ 前記＜５＞～＜９＞のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドセットを用いた核酸増幅反応工程を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリス検出方法。
＜１３＞ 前記＜５＞～＜９＞のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドセットを用いた核酸増幅反応工程を含む、歯周病罹患可能性の評価方法。
＜１４＞ 前記＜５＞～＜９＞のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドセットを含む、ポルフィロモナス・ジンジバリス検出用キット。
＜１５＞ 前記＜５＞～＜９＞のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドセットを含む、歯周病の罹患可能性評価用キット。
【発明の効果】
【0010】
本開示によれば、ポルフィロモナス・ジンジバリスの線毛遺伝子（ｆｉｍＡ）の初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にすることができるポリヌクレオチドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】ポルフィロモナス・ジンジバリスの線毛遺伝子ｆｉｍＡ ＩＩ型及びその周辺を含む塩基配列と、該塩基配列に対して、実施例及び比較例で用いられるポリヌクレオチドの塩基配列が対応する位置とを示す。図中、右向きの矢印で示される配列番号の塩基配列は、図１に記載された塩基配列の鎖であることを表し、核酸増幅反応で用いられる場合はフォワードプライマーとなることを表す。一方、左向きの矢印で示される配列番号の塩基配列は、図１に記載された塩基配列の相補鎖であることを表し、核酸増幅反応で用いられる場合はリバースプライマーとなることを表す。図中、５’－は、５’末端側であることを示し、－３’は３’末端側であることを示す。図中、四角枠で囲まれた塩基配列は、それぞれ、上から、配列番号１～配列番号３に共通する塩基配列、配列番号５及び配列番号７に共通する塩基配列、並びに配列番号４、配列番号６、配列番号８、及び配列番号９に共通する塩基配列、を示す。なお図中、配列番号１０及び配列番号１３の表示に関しては、配列番号１０又は配列番号１３で示される塩基配列が核酸増幅反応においてアニーリングしうる位置を示すのであって、配列番号１０及び配列番号１３の実際の塩基配列とは異なる。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本開示に係る実施形態について詳細に説明する。但し、本開示は以下の実施形態に限定されるものではない。以下の開示において、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明示した場合を除き、必須ではない。数値及びその範囲についても同様であり、本開示を制限するものではない。
本開示において「工程」との語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。
本開示において「～」を用いて示された数値範囲には、「～」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本文中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示において組成物中の各成分の含有率は、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計の含有率を意味する。
本開示において「工程」との語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。
本開示において「～」を用いて示された数値範囲には、「～」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本文中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示において組成物中の各成分の含有率は、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計の含有率を意味する。
【0013】
≪ポリヌクレオチド≫
（ポリヌクレオチドの塩基配列）
本開示のポリヌクレオチドは、下記（１ａ）～（１ｄ）のいずれか１つである。
（１ａ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（１ｂ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（１ｃ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（１ｄ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ポリヌクレオチドの塩基配列）
本開示のポリヌクレオチドは、下記（１ａ）～（１ｄ）のいずれか１つである。
（１ａ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（１ｂ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（１ｃ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（１ｄ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【0014】
配列番号１ ：5'-aagctgacaaagcatgatggt-3'
配列番号２ ：5'-aagctgacaaagcatgatgg-3'
配列番号３ ：5'-agctgacaaagcatgatg-3'
配列番号４ ：5'-tattcttaggcgtataaccattgt-3'
配列番号５ ：5'-atagttgttgctgttgaagtttacc-3'
配列番号６ ：5'-attttattcttaggcgtataaccattg-3'
配列番号７ ：5'-agttgttgctgttgaagtttacc-3'
配列番号８ ：5'-ctcaattttattcttaggcgtataaccat-3'
配列番号９ ：5'-tattcttaggcgtataaccat-3'
配列番号２ ：5'-aagctgacaaagcatgatgg-3'
配列番号３ ：5'-agctgacaaagcatgatg-3'
配列番号４ ：5'-tattcttaggcgtataaccattgt-3'
配列番号５ ：5'-atagttgttgctgttgaagtttacc-3'
配列番号６ ：5'-attttattcttaggcgtataaccattg-3'
配列番号７ ：5'-agttgttgctgttgaagtttacc-3'
配列番号８ ：5'-ctcaattttattcttaggcgtataaccat-3'
配列番号９ ：5'-tattcttaggcgtataaccat-3'
【0015】
ポリヌクレオチドが、下記（１ａ）～（１ｄ）のいずれか１つであると、ポルフィロモナス・ジンジバリスの線毛遺伝子（ｆｉｍＡ）の初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にすることができる。
（１ａ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（１ｂ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（１ｃ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（１ｄ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（１ａ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（１ｂ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（１ｃ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（１ｄ）配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【0016】
本開示のポリヌクレオチドの作用は明確ではないが、以下のように推定される。
本開示のポリヌクレオチドは、塩基の長さが適切であるため、鋳型ＤＮＡと安定的に結合することができ、かつポリヌクレオチド内において二次構造が発生しづらい（例えば、ヘアピン構造が発生しづらい）。本開示のポリヌクレオチドは、ＧＣ含量が適切であるためＴｍ値（すなわち、融解温度）が適切となり、核酸増幅反応の各工程（すなわち、熱変性工程、アニーリング工程、及び相補鎖合成工程）において、鋳型ＤＮＡとの結合及び解離を制御しやすい。本開示のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド中において各塩基の偏在が無いため、ポリヌクレオチド内において二次構造（例えばヘアピン構造）が発生しづらく、かつ核酸増幅反応の各工程において、鋳型ＤＮＡとの結合及び解離を制御しやすい。本開示のポリヌクレオチドは、特に３’末端側の塩基配列と鋳型ＤＮＡの塩基配列との配列相補性が高いため、相補鎖合成工程において相補鎖合成が開始されやすい。さらには、本開示のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド同士の相補性が低いため、ポリヌクレオチドダイマー及びポリヌクレオチドの立体構造が発生しづらい。
そして、本開示のポリヌクレオチドは、ポルフィロモナス・ジンジバリスの線毛遺伝子（本開示においては、ｆｉｍＡ）に含まれる塩基配列を核酸増幅できるように設計されている。
よって、本開示のポリヌクレオチドは、核酸増幅反応において、熱変性工程、アニーリング工程、及び相補鎖合成工程の各工程を滞りなく進ませることができる。つまり本開示のポリヌクレオチドは、ポルフィロモナス・ジンジバリスの線毛遺伝子（ｆｉｍＡ）の初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にすることができる。
初期増幅効率が良好であると、ポルフィロモナス・ジンジバリスの核酸量が少量しか存在しない検体であっても核酸増幅反応を行うことができ、つまり高感度でポルフィロモナス・ジンジバリスの存在を検出することができる。核酸増幅効率が良好であると、検体に含まれるポルフィロモナス・ジンジバリスの定量を正確に行うことができる。
なお本開示は、上記推定機構には何ら制限されない。
本開示のポリヌクレオチドは、塩基の長さが適切であるため、鋳型ＤＮＡと安定的に結合することができ、かつポリヌクレオチド内において二次構造が発生しづらい（例えば、ヘアピン構造が発生しづらい）。本開示のポリヌクレオチドは、ＧＣ含量が適切であるためＴｍ値（すなわち、融解温度）が適切となり、核酸増幅反応の各工程（すなわち、熱変性工程、アニーリング工程、及び相補鎖合成工程）において、鋳型ＤＮＡとの結合及び解離を制御しやすい。本開示のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド中において各塩基の偏在が無いため、ポリヌクレオチド内において二次構造（例えばヘアピン構造）が発生しづらく、かつ核酸増幅反応の各工程において、鋳型ＤＮＡとの結合及び解離を制御しやすい。本開示のポリヌクレオチドは、特に３’末端側の塩基配列と鋳型ＤＮＡの塩基配列との配列相補性が高いため、相補鎖合成工程において相補鎖合成が開始されやすい。さらには、本開示のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド同士の相補性が低いため、ポリヌクレオチドダイマー及びポリヌクレオチドの立体構造が発生しづらい。
そして、本開示のポリヌクレオチドは、ポルフィロモナス・ジンジバリスの線毛遺伝子（本開示においては、ｆｉｍＡ）に含まれる塩基配列を核酸増幅できるように設計されている。
よって、本開示のポリヌクレオチドは、核酸増幅反応において、熱変性工程、アニーリング工程、及び相補鎖合成工程の各工程を滞りなく進ませることができる。つまり本開示のポリヌクレオチドは、ポルフィロモナス・ジンジバリスの線毛遺伝子（ｆｉｍＡ）の初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にすることができる。
初期増幅効率が良好であると、ポルフィロモナス・ジンジバリスの核酸量が少量しか存在しない検体であっても核酸増幅反応を行うことができ、つまり高感度でポルフィロモナス・ジンジバリスの存在を検出することができる。核酸増幅効率が良好であると、検体に含まれるポルフィロモナス・ジンジバリスの定量を正確に行うことができる。
なお本開示は、上記推定機構には何ら制限されない。
【0017】
本開示において、配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドであれば特に限定されない。本開示において配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと鋳型ＤＮＡとがアニーリングしやすい観点から、連続する１５塩基以上２９塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることが好ましく、連続する１８塩基以上２３塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることがより好ましい。本開示において配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、その連続する１５塩基以上の塩基配列の部分が、配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち３’末端側の連続する１５塩基以上の塩基配列の部分であることが、相補鎖合成工程において相補鎖合成が開始されやすい観点から好ましい。前記連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと鋳型ＤＮＡとがアニーリングしやすい観点から、連続する１５塩基以上２９塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることが好ましく、連続する１８塩基以上２３塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることがより好ましい。
【0018】
本開示において、配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであれば特に限定されない。本開示においてストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、核酸増幅反応におけるアニーリング工程の条件下でハイブリダイズすることをいう。より具体的には、例えば、４０℃～７０℃の温度で５秒～２分間の条件下でハイブリダイズすることをいう。本開示においてハイブリダイズするとは、２分子のポリヌクレオチド中のそれぞれの塩基同士が水素結合を形成することができれば特に限定されず、２分子のヌクレオチド中のそれぞれの塩基同士が対を形成しない部分を有していてもよい。
【0019】
本開示において、配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであれば特に限定されない。本開示において配列同一性を算出する方法は、国立遺伝学研究所 生命情報・DDBJ研究センターが提供しているCLUSTAL Wをデフォルトパラメータで用いる方法が挙げられる。本開示において配列同一性は、ポリヌクレオチドと鋳型ＤＮＡとがアニーリングしやすい観点から、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがより一層好ましく、１００％であることが特に好ましい。
【0020】
本開示において、配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドであれば特に限定されない。本開示において１個若しくは数個の塩基の範囲は、ポリヌクレオチドと鋳型ＤＮＡとがアニーリングしやすい観点から、１個～５個が好ましく、１個～３個がより好ましく、１個又は２個が特に好ましい。本開示の配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドにおいて、その１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列の部分は、配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち５’末端側の塩基配列の部分であることが、相補鎖合成工程において相補鎖合成が開始されやすい観点から好ましい。
【0021】
本開示のポリヌクレオチドの塩基数は、鋳型ＤＮＡと安定的に結合しやすい観点から、短すぎない塩基数であることが好ましく、かつポリヌクレオチド内において二次構造が発生しづらい（例えば、ヘアピン構造が発生しづらい）観点から、長すぎないことが好ましい。具体的には、本開示のポリヌクレオチドの塩基数は、塩基数が１５塩基～３５塩基であることが好ましく、１８塩基～２９塩基であることがより好ましく、さらに２０塩基～２５塩基であってもよい。
【0022】
本開示のポリヌクレオチドは、初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にできる観点から、配列番号３、配列番号７、又は配列番号９で示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むことが好ましい。本開示のポリヌクレオチドは、初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にできる観点から、配列番号３、配列番号７、又は配列番号９で示される塩基配列を含むことがより好ましい。
【0023】
本開示のポリヌクレオチドは、初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にできる観点から、配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むことが好ましい。本開示のポリヌクレオチドは、初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にできる観点から、配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列を含むことがより好ましく、配列番号１～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列であることがさらに好ましい。
【0024】
本開示のポリヌクレオチドは、例えば核酸増幅のためのプライマーとしての使用の観点から一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。
【0025】
本開示のポリヌクレオチドの５’末端の塩基には、前記塩基の上流側に、さらに１塩基長～１０塩基長である任意の塩基配列又は任意の化合物等が付加されていてもよく、前記塩基配列の配列並びに化合物の分子量及び種類等は特に制限されない。これは、ポリヌクレオチドの５’末端の塩基の上流側は、相補鎖合成工程における相補鎖合成にほとんど影響を与えないからである。なお前記化合物は、例えば核酸の標識に一般的に用いられる蛍光色素等であってもよい。
【0026】
（ポリヌクレオチドの設計方法）
ポルフィロモナス・ジンジバリスのｆｉｍＡ遺伝子の塩基配列は、Fujiwara,T.,Morishima,S., Takahashi,I. and Hamada,S., Molecular cloning and sequencing of the fimbrilin gene of Porphyromonas gingivalis strains and characterization of recombinant proteins, Biochem. Biophys. Res. Commun. 197 (1), 241-247 (1993)に記載されているほか、公知のデータベース(例えば、ＤＤＢＪ又はＮＣＢＩ等）から入手することができる。
ポルフィロモナス・ジンジバリスのｆｉｍＡ遺伝子の塩基配列は、Fujiwara,T.,Morishima,S., Takahashi,I. and Hamada,S., Molecular cloning and sequencing of the fimbrilin gene of Porphyromonas gingivalis strains and characterization of recombinant proteins, Biochem. Biophys. Res. Commun. 197 (1), 241-247 (1993)に記載されているほか、公知のデータベース(例えば、ＤＤＢＪ又はＮＣＢＩ等）から入手することができる。
【0027】
なおポルフィロモナス・ジンジバリスのｆｉｍＡ ＩＩ型遺伝子に特異的な塩基配列を特定するために、種々の細菌のｆｉｍＡ遺伝子の塩基配列情報をデータベース(例えば、ＤＤＢＪ又はＮＣＢＩ等）から入手し、アライメント解析を行うことができる。アライメント解析の方法は、国立遺伝学研究所 生命情報・DDBJ研究センターが提供しているCLUSTAL Wをデフォルトパラメータで用いる方法が挙げられる。
【0028】
本開示において、プライマーの設計は、ポリヌクレオチドの長さ、ＧＣ含量、Ｔｍ値、ポリヌクレオチド間の相補性、又はポリヌクレオチド内の二次構造などを考慮して行うことができる。プライマーの設計は、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばPrimer Express（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）又はGENETYX（ゼネティックス社製）等を用いることもできる。
【0029】
（ポリヌクレオチドの製造方法）
本開示のポリヌクレオチドは、公知であるポリヌクレオチドの合成方法、例えば、ホスホロアミダイト法又はＨ－ホスホネート法等により、ＤＮＡ自動合成装置などを利用して合成することができる。又は、本開示のポリヌクレオチドは、サーモフィッシャーサイエンティフィック社又はユーロフィンジェノミクス社などに委託して合成することもできる。
本開示のポリヌクレオチドは、公知であるポリヌクレオチドの合成方法、例えば、ホスホロアミダイト法又はＨ－ホスホネート法等により、ＤＮＡ自動合成装置などを利用して合成することができる。又は、本開示のポリヌクレオチドは、サーモフィッシャーサイエンティフィック社又はユーロフィンジェノミクス社などに委託して合成することもできる。
【0030】
≪ポリヌクレオチドセット≫
本開示のポリヌクレオチドセットは、下記（２ａ）～（２ｄ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド（Ｆ）と、下記（３ａ）～（３ｄ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド（Ｒ）と、を含むことができる。
（２ａ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（２ｂ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（２ｃ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（２ｄ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（３ａ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（３ｂ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３ｃ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（３ｄ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
本開示のポリヌクレオチドセットは、下記（２ａ）～（２ｄ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド（Ｆ）と、下記（３ａ）～（３ｄ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド（Ｒ）と、を含むことができる。
（２ａ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（２ｂ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（２ｃ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（２ｄ）配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（３ａ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（３ｂ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３ｃ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（３ｄ）配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【0031】
（ポリヌクレオチド（Ｆ））
本開示において、（Ｆ）はフォワードプライマーであることを表す。本開示において、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドであれば特に限定されない。本開示において配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと鋳型ＤＮＡとがアニーリングしやすい観点から、連続する１５塩基以上２１塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることが好ましく、連続する１８塩基以上２１塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることがより好ましい。本開示において配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、その連続する１５塩基以上の塩基配列の部分が、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち３’末端側の連続する１５塩基以上の塩基配列の部分であることが、相補鎖合成工程において相補鎖合成が開始されやすい観点から好ましい。前記連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと鋳型ＤＮＡとがアニーリングしやすい観点から、連続する１５塩基以上２１塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることが好ましく、連続する１８塩基以上２１塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることがより好ましい。
本開示において、（Ｆ）はフォワードプライマーであることを表す。本開示において、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドであれば特に限定されない。本開示において配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと鋳型ＤＮＡとがアニーリングしやすい観点から、連続する１５塩基以上２１塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることが好ましく、連続する１８塩基以上２１塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることがより好ましい。本開示において配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、その連続する１５塩基以上の塩基配列の部分が、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち３’末端側の連続する１５塩基以上の塩基配列の部分であることが、相補鎖合成工程において相補鎖合成が開始されやすい観点から好ましい。前記連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと鋳型ＤＮＡとがアニーリングしやすい観点から、連続する１５塩基以上２１塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることが好ましく、連続する１８塩基以上２１塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることがより好ましい。
【0032】
本開示において、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであれば特に限定されない。本開示においてストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、核酸増幅反応におけるアニーリング工程の条件下でハイブリダイズすることをいう。より具体的には、例えば、４０℃～７０℃の温度で５秒～２分間の条件下でハイブリダイズすることをいう。本開示においてハイブリダイズするとは、２分子のポリヌクレオチド中のそれぞれの塩基同士が水素結合を形成することができれば特に限定されず、２分子のヌクレオチド中のそれぞれの塩基同士が対を形成しない部分を有していてもよい。
【0033】
本開示において、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであれば特に限定されない。本開示において配列同一性を算出する方法は、国立遺伝学研究所 生命情報・DDBJ研究センターが提供しているCLUSTAL Wをデフォルトパラメータで用いる方法が挙げられる。本開示において配列同一性は、ポリヌクレオチドと鋳型ＤＮＡとがアニーリングしやすい観点から、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがより一層好ましく、１００％であることが特に好ましい。
【0034】
本開示において、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドであれば特に限定されない。本開示において１個若しくは数個の塩基の範囲は、ポリヌクレオチドと鋳型ＤＮＡとがアニーリングしやすい観点から、１個～５個が好ましく、１個～３個がより好ましく、１個又は２個が特に好ましい。本開示の配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドにおいて、その１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列の部分は、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち５’末端側の塩基配列の部分であることが、相補鎖合成工程において相補鎖合成が開始されやすい観点から好ましい。
【0035】
（ポリヌクレオチド（Ｒ））
本開示において、（Ｒ）はリバースプライマーであることを表す。本開示において、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドであれば特に限定されない。本開示において配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと鋳型ＤＮＡとがアニーリングしやすい観点から、連続する１５塩基以上２９塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることが好ましく、連続する１８塩基以上２１塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることがより好ましい。本開示において配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、その連続する１５塩基以上の塩基配列の部分が、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち３’末端側の連続する１５塩基以上の塩基配列の部分であることが、相補鎖合成工程において相補鎖合成が開始されやすい観点から好ましい。前記連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと鋳型ＤＮＡとがアニーリングしやすい観点から、連続する１５塩基以上２９塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることが好ましく、連続する１８塩基以上２１塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることがより好ましい。
本開示において、（Ｒ）はリバースプライマーであることを表す。本開示において、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドであれば特に限定されない。本開示において配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと鋳型ＤＮＡとがアニーリングしやすい観点から、連続する１５塩基以上２９塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることが好ましく、連続する１８塩基以上２１塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることがより好ましい。本開示において配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、その連続する１５塩基以上の塩基配列の部分が、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち３’末端側の連続する１５塩基以上の塩基配列の部分であることが、相補鎖合成工程において相補鎖合成が開始されやすい観点から好ましい。前記連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと鋳型ＤＮＡとがアニーリングしやすい観点から、連続する１５塩基以上２９塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることが好ましく、連続する１８塩基以上２１塩基以下の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることがより好ましい。
【0036】
本開示において、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであれば特に限定されない。本開示においてストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、核酸増幅反応におけるアニーリング工程の条件下でハイブリダイズすることをいう。より具体的には、例えば、４０℃～７０℃の温度で５秒～２分間の条件下でハイブリダイズすることをいう。本開示においてハイブリダイズするとは、２分子のポリヌクレオチド中のそれぞれの塩基同士が水素結合を形成することができれば特に限定されず、２分子のヌクレオチド中のそれぞれの塩基同士が対を形成しない部分を有していてもよい。
【0037】
本開示において、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであれば特に限定されない。本開示において配列同一性を算出する方法は、国立遺伝学研究所 生命情報・DDBJ研究センターが提供しているCLUSTAL Wをデフォルトパラメータで用いる方法が挙げられる。本開示において配列同一性は、ポリヌクレオチドと鋳型ＤＮＡとがアニーリングしやすい観点から、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがより一層好ましく、１００％であることが特に好ましい。
【0038】
本開示において、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドであれば特に限定されない。本開示において１個若しくは数個の塩基の範囲は、ポリヌクレオチドと鋳型ＤＮＡとがアニーリングしやすい観点から、１個～５個が好ましく、１個～３個がより好ましく、１個又は２個が特に好ましい。本開示の配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドにおいて、その１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列の部分は、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち５’末端側の塩基配列の部分であることが、相補鎖合成工程において相補鎖合成が開始されやすい観点から好ましい。
【0039】
（ポリヌクレオチド（Ｆ）とポリヌクレオチド（Ｒ）との組み合わせ）
本開示のポリヌクレオチドセットにおけるポリヌクレオチド（Ｆ）とポリヌクレオチド（Ｒ）との組み合わせは、例えば、上述の、（２ａ）と（３ａ）、（２ａ）と（３ｂ）、（２ａ）と（３ｃ）、（２ａ）と（３ｄ）、（２ｂ）と（３ａ）、（２ｂ）と（３ｂ）、（２ｂ）と（３ｃ）、（２ｂ）と（３ｄ）、（２ｃ）と（３ａ）、（２ｃ）と（３ｂ）、（２ｃ）と（３ｃ）、（２ｃ）と（３ｄ）、（２ｄ）と（３ａ）、（２ｄ）と（３ｂ）、（２ｄ）と（３ｃ）、又は（２ｄ）と（３ｄ）、とすることができる。
本開示のポリヌクレオチドセットにおけるポリヌクレオチド（Ｆ）とポリヌクレオチド（Ｒ）との組み合わせは、例えば、上述の、（２ａ）と（３ａ）、（２ａ）と（３ｂ）、（２ａ）と（３ｃ）、（２ａ）と（３ｄ）、（２ｂ）と（３ａ）、（２ｂ）と（３ｂ）、（２ｂ）と（３ｃ）、（２ｂ）と（３ｄ）、（２ｃ）と（３ａ）、（２ｃ）と（３ｂ）、（２ｃ）と（３ｃ）、（２ｃ）と（３ｄ）、（２ｄ）と（３ａ）、（２ｄ）と（３ｂ）、（２ｄ）と（３ｃ）、又は（２ｄ）と（３ｄ）、とすることができる。
【0040】
本開示のポリヌクレオチドセットにおいて、ポリヌクレオチド（Ｆ）及びポリヌクレオチド（Ｒ）の塩基数は、それぞれ独立に、１５塩基～３５塩基とすることができる。
本開示のポリヌクレオチドセットにおけるポリヌクレオチド（Ｆ）及びポリヌクレオチド（Ｒ）の塩基数は、鋳型ＤＮＡと安定的に結合しやすい観点から、短すぎない塩基数であることが好ましく、かつポリヌクレオチド内において二次構造が発生しづらい（例えば、ヘアピン構造が発生しづらい）観点から、長すぎないことが好ましい。具体的には、本開示のポリヌクレオチドセットにおけるポリヌクレオチド（Ｆ）及びポリヌクレオチド（Ｒ）の塩基数は、それぞれ独立に、１５塩基～３５塩基であることが好ましく、１８塩基～２９塩基であることがより好ましく、さらに２０塩基～２５塩基であってもよい。
本開示のポリヌクレオチドセットにおけるポリヌクレオチド（Ｆ）及びポリヌクレオチド（Ｒ）の塩基数は、鋳型ＤＮＡと安定的に結合しやすい観点から、短すぎない塩基数であることが好ましく、かつポリヌクレオチド内において二次構造が発生しづらい（例えば、ヘアピン構造が発生しづらい）観点から、長すぎないことが好ましい。具体的には、本開示のポリヌクレオチドセットにおけるポリヌクレオチド（Ｆ）及びポリヌクレオチド（Ｒ）の塩基数は、それぞれ独立に、１５塩基～３５塩基であることが好ましく、１８塩基～２９塩基であることがより好ましく、さらに２０塩基～２５塩基であってもよい。
【0041】
本開示のポリヌクレオチドセットにおいて、初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にできる観点から、ポリヌクレオチド（Ｆ）は、配列番号３で示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、かつポリヌクレオチド（Ｒ）は、配列番号７又は配列番号９で示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むことが好ましい。本開示のポリヌクレオチドセットにおいて、初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にできる観点から、ポリヌクレオチド（Ｆ）は、配列番号３で示される塩基配列を含み、かつポリヌクレオチド（Ｒ）は、配列番号７又は配列番号９で示される塩基配列を含むことがより好ましい。
【0042】
本開示のポリヌクレオチドセットにおいて、初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にできる観点から、ポリヌクレオチド（Ｆ）は、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、かつポリヌクレオチド（Ｒ）は、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を含むことが好ましい。本開示のポリヌクレオチドセットにおいて、初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にできる観点から、ポリヌクレオチド（Ｆ）は、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列を含み、かつポリヌクレオチド（Ｒ）は、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列を含むことがより好ましく、ポリヌクレオチド（Ｆ）は、配列番号１～配列番号３のいずれか１つで示される塩基配列であって、かつポリヌクレオチド（Ｒ）は、配列番号４～配列番号９のいずれか１つで示される塩基配列であることがさらに好ましい。
【0043】
本開示のポリヌクレオチドセットにおいて、初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にできる観点から、ポリヌクレオチド（Ｆ）は配列番号１で示される塩基配列を含み、かつポリヌクレオチド（Ｒ）は配列番号４、配列番号５、配列番号６、若しくは配列番号８で示される塩基配列を含むことが好ましい。本開示のポリヌクレオチドセットにおいて、初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にできる観点から、ポリヌクレオチド（Ｆ）は配列番号１で示される塩基配列であって、かつポリヌクレオチド（Ｒ）は配列番号４、配列番号５、配列番号６、若しくは配列番号８で示される塩基配列であることがより好ましい。
【0044】
上記の好ましい態様に加えて、本開示のポリヌクレオチドセットにおいて、初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にできる観点から、ポリヌクレオチド（Ｆ）が配列番号２で示される塩基配列を含み、かつポリヌクレオチド（Ｒ）が配列番号４、配列番号５、若しくは配列番号７で示される塩基配列を含むことも好ましい。本開示のポリヌクレオチドセットにおいて、初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にできる観点から、ポリヌクレオチド（Ｆ）が配列番号２で示される塩基配列であって、かつポリヌクレオチド（Ｒ）が配列番号４、配列番号５、若しくは配列番号７で示される塩基配列であることもより好ましい。
【0045】
上記の好ましい態様に加えて、さらには、本開示のポリヌクレオチドセットにおいて、初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にできる観点から、ポリヌクレオチド（Ｆ）が配列番号３で示される塩基配列を含み、かつポリヌクレオチド（Ｒ）が配列番号４で示される塩基配列を含むことも好ましい。本開示のポリヌクレオチドセットにおいて、初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にできる観点から、ポリヌクレオチド（Ｆ）が配列番号３で示される塩基配列であって、かつポリヌクレオチド（Ｒ）が配列番号４で示される塩基配列であることもより好ましい。
【0046】
なお本開示のポリヌクレオチド（Ｆ）は、本開示のポリヌクレオチド（Ｆ）と、本開示のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチド（Ｒ）とを含むポリヌクレオチドセットとしてもよい。また、本開示のポリヌクレオチド（Ｒ）は、本開示のポリヌクレオチド（Ｒ）と、本開示のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチド（Ｆ）とを含むポリヌクレオチドセットとしてもよい。本開示のポリヌクレオチドは、初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にできるように塩基配列が設計されていることから、本開示のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドとのセットであっても、十分に、初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にできる。
【0047】
≪ポルフィロモナス・ジンジバリス検出用ポリヌクレオチドセット≫
本開示のポリヌクレオチドセットは、ポルフィロモナス・ジンジバリス検出用とすることができる。本開示のポルフィロモナス・ジンジバリス検出用ポリヌクレオチドセットは、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型を検出することができる観点から、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型検出用であることが好ましい。本開示のポルフィロモナス・ジンジバリス検出用ポリヌクレオチドセットは、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型を特異的に検出することができる観点から、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型特異的検出用であることがより好ましい。
本開示のポリヌクレオチドセットは、ポルフィロモナス・ジンジバリス検出用とすることができる。本開示のポルフィロモナス・ジンジバリス検出用ポリヌクレオチドセットは、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型を検出することができる観点から、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型検出用であることが好ましい。本開示のポルフィロモナス・ジンジバリス検出用ポリヌクレオチドセットは、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型を特異的に検出することができる観点から、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型特異的検出用であることがより好ましい。
【0048】
前記したように、ポルフィロモナス・ジンジバリスは、線毛の種類によっていくつかの種類に分けられ、線毛の種類によって線毛遺伝子の塩基配列がそれぞれ異なる。本開示のポリヌクレオチドセットにおけるポリヌクレオチド（Ｆ）及びポリヌクレオチド（Ｒ）の塩基配列は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの線毛遺伝子ｆｉｍＡ ＩＩ型に特異的な配列を有する。よって、本開示のポリヌクレオチドセットにおけるポリヌクレオチド（Ｆ）及びポリヌクレオチド（Ｒ）を用いた核酸増幅反応において、ｆｉｍＡ ＩＩ型以外の型であるポルフィロモナス・ジンジバリスの線毛遺伝子に対してアニーリングが起こりづらい。
【0049】
さらに、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型が有する線毛遺伝子ｆｉｍＡの塩基配列は、塩基に変異が入ることによるバリエーションを有する。本開示のポリヌクレオチドセットにおけるポリヌクレオチド（Ｆ）及びポリヌクレオチド（Ｒ）の塩基配列は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの線毛遺伝子ｆｉｍＡ ＩＩ型の中でも特に保存されている塩基配列部位である。よって、本開示のポリヌクレオチドセットにおけるポリヌクレオチド（Ｆ）及びポリヌクレオチド（Ｒ）を用いた核酸増幅反応において、ｆｉｍＡ ＩＩ型であるポルフィロモナス・ジンジバリスの線毛遺伝子に対してアニーリングが起こりやすく、核酸増幅反応を効率良く行うことができる。
【0050】
本開示において、本開示のポリヌクレオチドセットをプライマーとして使用して、後述する検体に対して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はそれを応用したリアルタイムＰＣＲなどの核酸増幅反応を行うことで、少なくとも１コピー数核酸が増幅されれば、対象を検出できたということができる。
【0051】
本開示のポルフィロモナス・ジンジバリス検出用ポリヌクレオチドセットは、後述するＴａｑＭａｎプローブをさらに含んでいてもよい。
【0052】
≪歯周病の罹患可能性評価用ポリヌクレオチドセット≫
本開示のポリヌクレオチドセットは、歯周病の罹患可能性評価用とすることができる。ポルフィロモナス・ジンジバリスは歯周病原因菌の一つであるから、ポルフィロモナス・ジンジバリスを検出することができる本開示のポリヌクレオチドセットは、歯周病の罹患可能性を評価するのに用いることができる。
本開示のポリヌクレオチドセットは、歯周病の罹患可能性評価用とすることができる。ポルフィロモナス・ジンジバリスは歯周病原因菌の一つであるから、ポルフィロモナス・ジンジバリスを検出することができる本開示のポリヌクレオチドセットは、歯周病の罹患可能性を評価するのに用いることができる。
【0053】
本開示において、歯周病の罹患可能性を評価するとは、既に歯周病に罹患している可能性を評価することと、将来的に歯周病に罹患する可能性を評価することとを含む。本開示において、本開示のポリヌクレオチドセットをプライマーとして使用して、後述する検体に対して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はそれを応用したリアルタイムＰＣＲなどの核酸増幅反応を行うことで、少なくとも１コピー数核酸が増幅されれば、歯周病の罹患可能性を有するということができる。
【0054】
本開示の歯周病の罹患可能性評価用ポリヌクレオチドセットは、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型が歯周病発症リスクの最も高い型であることから、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型を指標とした歯周病の罹患可能性評価用ポリヌクレオチドセットであることが好ましい。
【0055】
本開示の歯周病の罹患可能性評価用ポリヌクレオチドセットは、後述するＴａｑＭａｎプローブをさらに含んでいてもよい。
【0056】
≪ポルフィロモナス・ジンジバリス検出方法≫
本開示のポルフィロモナス・ジンジバリス検出方法は、本開示におけるポリヌクレオチドセットを用いた核酸増幅反応工程を含むことができる。
本開示のポルフィロモナス・ジンジバリス検出方法は、本開示におけるポリヌクレオチドセットを用いた核酸増幅反応工程を含むことができる。
【0057】
（核酸増幅反応工程）
本開示の核酸増幅反応工程は、本開示のポリヌクレオチドセットを用いていれば特に限定されず、公知の方法で行うことができる。
本開示の核酸増幅反応工程は、本開示のポリヌクレオチドセットを用いていれば特に限定されず、公知の方法で行うことができる。
【0058】
本開示の核酸増幅反応工程で用いる反応液は、例えば、後述する検体又は検体から抽出された核酸、本開示のポリヌクレオチドセット、核酸合成酵素（例えばＤＮＡポリメラーゼ）、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、水、緩衝液、及び、任意に後述する蛍光試薬又は蛍光標識プローブ等を混合した液とすることができる。前記反応液において、検体又は検体から抽出された核酸の量、本開示のポリヌクレオチドセットの濃度、核酸合成酵素の種類及び濃度、デオキシヌクレオシド三リン酸の種類及び濃度、並びに緩衝液の種類及び濃度等は、当業者が適宜設定することができる。
【0059】
本開示の核酸増幅反応工程は、さらに、熱変性工程、アニーリング工程、及び相補鎖合成工程を含むことができる。前記熱変性工程、アニーリング工程、及び相補鎖合成工程における、各工程の温度、サイクル数、及び時間は、当業者が適宜設定することができる。なお本開示の核酸増幅反応工程は、アニーリング工程と相補鎖合成工程とを同条件で同時に行う、つまり、熱変性工程並びにアニーリング工程及び相補鎖合成工程を１サイクルとする、２－ｓｔｅｐ ＰＣＲであることもできる。
【0060】
本開示の核酸増幅反応工程は、迅速性と定量性に優れている観点から、公知のリアルタイムＰＣＲ装置を使用してリアルタイムＰＣＲを行うことが好ましい。
リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲによる核酸の増幅を継時的に測定することで、増幅率に基づいて標的核酸の定量を行う方法である。この方法には、通常、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計とを一体化させたリアルタイムＰＣＲ専用の装置を用いることができる。
リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲによる核酸の増幅を継時的に測定することで、増幅率に基づいて標的核酸の定量を行う方法である。この方法には、通常、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計とを一体化させたリアルタイムＰＣＲ専用の装置を用いることができる。
【0061】
核酸増幅工程においてリアルタイムＰＣＲを行う場合、リアルタイムＰＣＲの詳細な方法は、例えば、具体的には以下のとおりである、まず、段階希釈した既知量の核酸を標準（スタンダード）としてＰＣＲを行い、サイクル数に対する増幅産物量を測定する。そして、核酸の増幅が指数関数的に起こる領域で一定の増幅産物量になるサイクル数（Ｃｔ値；threshold cycle）を横軸とし、初発の核酸量を縦軸としてプロットして検量線を作成する。未知濃度の検体についても、同じ条件下で反応を行い、Ｃｔ値を求め、この値と検量線から、検体中の標的の核酸量を算出することができる。
【0062】
リアルタイムＰＣＲには、一般的に、核酸増幅産物の検出方法の違いにより、蛍光試薬を用いる方法と、蛍光標識プローブを用いる方法とがある。蛍光試薬を用いる方法としては、プライマーペアと共に二本鎖ＤＮＡに結合することによって蛍光を発する化合物であるインターカレーター（例えば、SYBR Green Iなど）を用いるインターカレーター法が挙げられる。蛍光標識プローブを用いる方法としては、ＴａｑＭａｎプローブ、モレキュラービーコンプローブ、若しくはサイクリングプローブを用いるＴａｑＭａｎ法、モレキュラービーコン法、サイクリングプローブ法などが挙げられる。本開示の核酸増幅反応工程は、インターカレーター法を用いることが好ましく、あるいは核酸増幅産物の特異性の高い検出が可能である観点からＴａｑＭａｎプローブを用いるＴａｑＭａｎ法が好ましい。
【0063】
前記ＴａｑＭａｎ法は、５’末端をＦＡＭ（Fluorescein）又はＨＥＸ（Hexachlorofluorescein）等の蛍光物質で修飾し、３’末端を、ＴＡＭＲＡ、ＮＦＱ（Non Fluorescent Quencher）、又はＥＱ（Eclipse Quencher）等のクエンチャー物質で修飾したポリヌクレオチドプローブ（すなわちＴａｑＭａｎプローブ）を用いる方法である。ＴａｑＭａｎプローブは、さらに、鋳型ＤＮＡと安定な二重鎖構造を形成させてより高い融解温度（Ｔｍ値）を実現させるために、ＭＧＢ（Minor Groove Binder）で修飾されてもよい。ＴａｑＭａｎ法では、ＴａｑＭａｎプローブがＰＣＲの相補鎖合成工程において標的核酸に特異的にハイブリダイズし、相補鎖の合成に伴ってＴａｑＭａｎプローブが分解され、蛍光物質が遊離されることによりＰＣＲ溶液中の蛍光量が増加する。この蛍光量の増加が標的核酸の増幅の指標となり、核酸増幅をリアルタイムで簡便に検出することができる。リアルタイムＰＣＲ法は、上記のポリヌクレオチドセットを用いる以外は、当業者で知られている公知の方法に基づいて、市販のリアルタイムＰＣＲキット又はリアルタイムＰＣＲ装置を用いて、製造元が発行する説明書に従って行えばよい。本開示の核酸増幅反応工程で用いるリアルタイムＰＣＲ装置としては、例えば、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のStep One、タカラバイオ社製のThermal Cycler Dice Real TimeSystem II、又はキアゲン社製のRotor-Gene Q等を用いることができる。
【0064】
本開示のポルフィロモナス・ジンジバリス検出方法において、ポルフィロモナス・ジンジバリスの定量を行うために、検出対象となる菌株のゲノムＤＮＡを標準として検量線を作成してもよく、本開示のポリヌクレオチドセットによって増幅される核酸断片を含むプラスミド等を標準として検量線を作成してもよい。標準として用いるプラスミド（標準プラスミド）としては、本開示のポリヌクレオチドセットによって増幅される核酸断片を少なくとも１種類含むプラスミドであればよい。具体的には、前記標準の段階希釈液を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、検量線を作成し、得られた検量線を基に、検体から増幅された核酸のコピー数を定量することによって、検体中のポルフィロモナス・ジンジバリスの菌数を定量することができる。
【0065】
（検体及び鋳型ＤＮＡ）
なお前記核酸増幅反応工程で使用する、本開示のポルフィロモナス・ジンジバリス検出方法に用いる検体としては、検出対象のポルフィロモナス・ジンジバリスを含む可能性のある検体であれば特に限定されず、例えば、生体の口腔から採取した唾液、歯垢（歯肉縁上歯垢又は歯肉縁下歯垢）、舌苔、又は歯肉溝浸出液などが挙げられる。前記検体としては、血漿若しくは血清等の血液又は尿であってもよい。前記唾液は、口腔から吐出した唾液、又は水等で含嗽して吐出した唾液混合液であってもよい。前記歯垢は、歯科用スケーラー、綿棒、若しくはブラシ等による歯面の刷掃、又はペーパーポイントの挿入等で採取してもよい。前記舌苔は、ブラシ、綿棒、又はガーゼ等で採取してもよい。前記歯肉溝浸出液は、ペーパーポイント等を歯肉溝に挿入して採取してもよい。
なお前記核酸増幅反応工程で使用する、本開示のポルフィロモナス・ジンジバリス検出方法に用いる検体としては、検出対象のポルフィロモナス・ジンジバリスを含む可能性のある検体であれば特に限定されず、例えば、生体の口腔から採取した唾液、歯垢（歯肉縁上歯垢又は歯肉縁下歯垢）、舌苔、又は歯肉溝浸出液などが挙げられる。前記検体としては、血漿若しくは血清等の血液又は尿であってもよい。前記唾液は、口腔から吐出した唾液、又は水等で含嗽して吐出した唾液混合液であってもよい。前記歯垢は、歯科用スケーラー、綿棒、若しくはブラシ等による歯面の刷掃、又はペーパーポイントの挿入等で採取してもよい。前記舌苔は、ブラシ、綿棒、又はガーゼ等で採取してもよい。前記歯肉溝浸出液は、ペーパーポイント等を歯肉溝に挿入して採取してもよい。
【0066】
なお本開示の核酸増幅反応に用いる鋳型ＤＮＡとしては、採取した検体をそのまま鋳型ＤＮＡとして利用してもよく、検体から抽出した核酸を鋳型ＤＮＡとして利用してもよい。上記検体からの核酸の抽出は、公知の核酸抽出方法と同様の手法により行うことができ、例えば、唾液又はペーパーポイント上のプラーク等の検体から、ＳＤＳ法、フェノール法、若しくはエタノール法等の公知の方法を利用することができる。又は、例えばNucreoSpin（登録商標）Blood（キアゲン社製）等の市販のＤＮＡ抽出キット、若しくは自動ＤＮＡ抽出機等を利用することもできる。
【0067】
本開示のポルフィロモナス・ジンジバリス検出方法は、例えば、
生体から得た検体、核酸合成酵素、及び本開示のポリヌクレオチドセットを含む反応液を準備すること、
前記反応液を核酸増幅反応に供すること、及び
前記核酸増幅反応により増幅された核酸を検出すること、
を含み、前記増幅された核酸が検出されたことは、前記検体におけるポルフィロモナス・ジンジバリスの存在を示す、
方法であってもよい。なお反応液の詳細については、前述の核酸増幅反応工程における反応液の説明に記載されているとおりである。
生体から得た検体、核酸合成酵素、及び本開示のポリヌクレオチドセットを含む反応液を準備すること、
前記反応液を核酸増幅反応に供すること、及び
前記核酸増幅反応により増幅された核酸を検出すること、
を含み、前記増幅された核酸が検出されたことは、前記検体におけるポルフィロモナス・ジンジバリスの存在を示す、
方法であってもよい。なお反応液の詳細については、前述の核酸増幅反応工程における反応液の説明に記載されているとおりである。
【0068】
なおポルフィロモナス・ジンジバリスの検出は、前記検出方法において検出された核酸の量に基づいて行われてもよい。核酸の量の検出は、増幅された核酸に結合した蛍光色素からの蛍光強度の測定又は後述するＴａｑＭａｎプローブのように核酸増幅反応の指標となる蛍光強度の測定により行うことができる。検出された核酸の量がより多いことは、検体中におけるポルフィロモナス・ジンジバリスの存在量がより大きいことを示唆する。前記増幅された核酸を検出することは、前記核酸増幅反応中に行われてもよい。例えばリアルタイムＰＣＲによれば、核酸増幅反応と並行して、増幅された核酸を検出することができる。前記検出は、蛍光強度を検出することによる検出であってもよい。
【0069】
≪歯周病罹患可能性の評価方法≫
本開示の歯周病罹患可能性の評価方法は、本開示におけるポリヌクレオチドセットを用いた核酸増幅反応工程を含むことができる。なお本開示の歯周病罹患可能性の評価方法における核酸増幅反応工程は、前記した≪ポルフィロモナス・ジンジバリス検出方法≫における核酸増幅反応工程と同様の態様とすることができる。
本開示の歯周病罹患可能性の評価方法は、本開示におけるポリヌクレオチドセットを用いた核酸増幅反応工程を含むことができる。なお本開示の歯周病罹患可能性の評価方法における核酸増幅反応工程は、前記した≪ポルフィロモナス・ジンジバリス検出方法≫における核酸増幅反応工程と同様の態様とすることができる。
【0070】
前記核酸増幅反応工程で得られた、増幅された核酸のコピー数から、歯周病罹患可能性を評価することができる。より詳細には、本開示のポリヌクレオチドセットをプライマーとして使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はそれを応用したリアルタイムＰＣＲなどの核酸増幅反応を行うことで、少なくとも１コピー数核酸が増幅されれば、歯周病罹患可能性を有すると評価することができる。さらには、前記核酸増幅反応工程において、増幅された核酸のコピー数が多いほど、歯周病罹患可能性が高いと評価することができ、増幅された核酸のコピー数が少ないほど、歯周病罹患可能性が低いと評価することができる。ｆｉｍＡ遺伝子の中でも、特にｆｉｍＡ ＩＩ型遺伝子の核酸が増幅されることで、歯周病罹患可能性が高いと評価できる。また、ｆｉｍＡ ＩＩ型遺伝子の核酸が、他の型のｆｉｍＡ遺伝子（例えばｆｉｍＡ Ｉ型遺伝子等）より多く増幅されることで、歯周病罹患可能性が特に高いと評価できる。
【0071】
本開示の歯周病罹患可能性の評価方法は、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型が歯周病発症リスクの最も高い型であることから、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型を指標とした歯周病罹患可能性の評価方法であることが好ましい。
【0072】
本開示の歯周病罹患可能性の評価方法は、例えば、
生体から得た検体、核酸合成酵素、及び本開示のポリヌクレオチドセットを含む反応液を準備すること、
前記反応液を核酸増幅反応に供すること、及び
前記核酸増幅反応により増幅された核酸を検出すること、
を含み、前記増幅された核酸が検出されたことは、前記検体における歯周病罹患可能性を示す、
方法であってもよい。なお反応液の詳細については、前述の核酸増幅反応工程における反応液の説明に記載されているとおりである。
生体から得た検体、核酸合成酵素、及び本開示のポリヌクレオチドセットを含む反応液を準備すること、
前記反応液を核酸増幅反応に供すること、及び
前記核酸増幅反応により増幅された核酸を検出すること、
を含み、前記増幅された核酸が検出されたことは、前記検体における歯周病罹患可能性を示す、
方法であってもよい。なお反応液の詳細については、前述の核酸増幅反応工程における反応液の説明に記載されているとおりである。
【0073】
なお歯周病罹患可能性の評価は、前記評価方法において検出された核酸の量に基づいて行われてもよい。核酸の量の検出は、増幅された核酸に結合した蛍光色素からの蛍光強度の測定又は後述するＴａｑＭａｎプローブのように核酸増幅反応の指標となる蛍光強度の測定により行うことができる。検出された核酸の量がより多いことは、歯周病罹患可能性がより高いことを示唆する。前記増幅された核酸を検出することは、前記核酸増幅反応中に行われてもよい。例えばリアルタイムＰＣＲによれば、核酸増幅反応と並行して、増幅された核酸を検出することができる。前記検出は、蛍光強度を検出することによる検出であってもよい。
【0074】
≪ポルフィロモナス・ジンジバリス検出用キット≫
本開示のポルフィロモナス・ジンジバリス検出用キットは、本開示のポリヌクレオチドセットを含んでいれば特に限定されない。
本開示のポルフィロモナス・ジンジバリス検出用キットは、本開示のポリヌクレオチドセットを含んでいれば特に限定されない。
【0075】
本開示のポルフィロモナス・ジンジバリス検出用キットは、さらに必要に応じて、核酸抽出用試薬、ＰＣＲ用緩衝液、ｄＮＴＰｓ、若しくはＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲ用試薬、標識物質、滅菌水、標品（例えば標準株など）、分子量マーカー、又は説明書などを含んでいてもよい。
【0076】
≪歯周病の罹患可能性評価用キット≫
本開示の歯周病の罹患可能性評価用キットは、本開示のポリヌクレオチドセットを含んでいれば特に限定されない。
本開示の歯周病の罹患可能性評価用キットは、本開示のポリヌクレオチドセットを含んでいれば特に限定されない。
【0077】
本開示の歯周病の罹患可能性評価用キットは、さらに必要に応じて、核酸抽出用試薬、ＰＣＲ用緩衝液、ｄＮＴＰｓ、若しくはＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲ用試薬、標識物質、滅菌水、標品（例えば標準株など）、分子量マーカー、又は説明書などを含んでいてもよい。
【0078】
≪その他の態様≫
本開示によれば、ポリヌクレオチドセットを含む、歯周病の罹患可能性を診断する方法も提供される。
本開示によれば、ポルフィロモナス・ジンジバリスを検出するためのポリヌクレオチドセットも提供される。
本開示によれば、歯周病の罹患可能性を評価するためのポリヌクレオチドセットも提供される。
本開示によれば、ポルフィロモナス・ジンジバリスを検出するためのポリヌクレオチドセットの使用も提供される。
本開示によれば、歯周病の罹患可能性を評価するためのポリヌクレオチドセットの使用も提供される。
本開示によれば、ポルフィロモナス・ジンジバリス検出用キットの製造におけるポリヌクレオチドセットの使用も提供される。
本開示によれば、歯周病の罹患可能性評価用キットの製造におけるポリヌクレオチドセットの使用も提供される。
上記の態様においても、ポリヌクレオチドセットの詳細については、前述の本開示に係るポリヌクレオチドセットの説明がそのまま当てはまる。
本開示によれば、ポリヌクレオチドセットを含む、歯周病の罹患可能性を診断する方法も提供される。
本開示によれば、ポルフィロモナス・ジンジバリスを検出するためのポリヌクレオチドセットも提供される。
本開示によれば、歯周病の罹患可能性を評価するためのポリヌクレオチドセットも提供される。
本開示によれば、ポルフィロモナス・ジンジバリスを検出するためのポリヌクレオチドセットの使用も提供される。
本開示によれば、歯周病の罹患可能性を評価するためのポリヌクレオチドセットの使用も提供される。
本開示によれば、ポルフィロモナス・ジンジバリス検出用キットの製造におけるポリヌクレオチドセットの使用も提供される。
本開示によれば、歯周病の罹患可能性評価用キットの製造におけるポリヌクレオチドセットの使用も提供される。
上記の態様においても、ポリヌクレオチドセットの詳細については、前述の本開示に係るポリヌクレオチドセットの説明がそのまま当てはまる。
【実施例】
【0079】
以下、本開示を実施例により更に具体的に説明するが、本開示はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」は質量基準である。「％」も同様に質量基準である。
【0080】
≪実施例１≫
（ポリヌクレオチドの合成）
以下の塩基配列で示されるポリヌクレオチドを、外部委託して合成し、脱塩精製を行った。なお以下各ポリヌクレオチドの、ポルフィロモナス・ジンジバリスの遺伝子中に対応する位置について図１に示す。
配列番号１ ：5'-aagctgacaaagcatgatggt-3' （フォワードプライマー）
配列番号２ ：5'-aagctgacaaagcatgatgg-3' （フォワードプライマー）
配列番号３ ：5'-agctgacaaagcatgatg-3' （フォワードプライマー）
配列番号４ ：5'-tattcttaggcgtataaccattgt-3' （リバースプライマー）
配列番号５ ：5'-atagttgttgctgttgaagtttacc-3' （リバースプライマー）
配列番号６ ：5'-attttattcttaggcgtataaccattg-3' （リバースプライマー）
配列番号７ ：5'-agttgttgctgttgaagtttacc-3' （リバースプライマー）
配列番号８ ：5'-ctcaattttattcttaggcgtataaccat-3' （リバースプライマー）
配列番号９ ：5'-tattcttaggcgtataaccat-3' （リバースプライマー）
（ポリヌクレオチドの合成）
以下の塩基配列で示されるポリヌクレオチドを、外部委託して合成し、脱塩精製を行った。なお以下各ポリヌクレオチドの、ポルフィロモナス・ジンジバリスの遺伝子中に対応する位置について図１に示す。
配列番号１ ：5'-aagctgacaaagcatgatggt-3' （フォワードプライマー）
配列番号２ ：5'-aagctgacaaagcatgatgg-3' （フォワードプライマー）
配列番号３ ：5'-agctgacaaagcatgatg-3' （フォワードプライマー）
配列番号４ ：5'-tattcttaggcgtataaccattgt-3' （リバースプライマー）
配列番号５ ：5'-atagttgttgctgttgaagtttacc-3' （リバースプライマー）
配列番号６ ：5'-attttattcttaggcgtataaccattg-3' （リバースプライマー）
配列番号７ ：5'-agttgttgctgttgaagtttacc-3' （リバースプライマー）
配列番号８ ：5'-ctcaattttattcttaggcgtataaccat-3' （リバースプライマー）
配列番号９ ：5'-tattcttaggcgtataaccat-3' （リバースプライマー）
【0081】
なお、各塩基配列間の配列同一性は、例えば以下のとおりである。
配列番号４：配列番号６ 配列同一性９５％
配列番号４：配列番号８ 配列同一性８７％
配列番号６：配列番号８ 配列同一性９２％
配列番号４：配列番号６ 配列同一性９５％
配列番号４：配列番号８ 配列同一性８７％
配列番号６：配列番号８ 配列同一性９２％
【0082】
（検体からの鋳型ＤＮＡ抽出）
検量線用検体として、下記のポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型標準株の純培養液を用いた。臨床検体として、歯周病患者から採取した歯肉溝浸出液を用いた。
検量線用検体として、下記のポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型標準株の純培養液を用いた。臨床検体として、歯周病患者から採取した歯肉溝浸出液を用いた。
【0083】
－検量線用検体－
ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型標準株は、Porphyromonas gingivalis JCM19600（理化学研究所 微生物材料開発室より分譲、Complete genome sequence of the bacterium Porphyromonas gingivalis TDC60, which causes periodontal disease., Watanabe T et al., 2011 J Bacteriol. 193(16):4259-4260）を用いた。前記標準株を培養し、純培養液１ｍｌから、市販のＤＮＡ抽出キット（NucreoSpin（登録商標） Blood、キアゲン社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを、吸光度測定を用いて１ｎｇ／μｌに調製し、さらに０．１ｎｇ／μｌ、０．０１ｎｇ／μｌ、０．００１ｎｇ／μｌ、及び０．０００１ｎｇ／μｌに段階希釈し、これを鋳型ＤＮＡとした。なおゲノムＤＮＡ１ｎｇあたりのポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型標準株の菌数を３．９×１０５個とした。
ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型標準株は、Porphyromonas gingivalis JCM19600（理化学研究所 微生物材料開発室より分譲、Complete genome sequence of the bacterium Porphyromonas gingivalis TDC60, which causes periodontal disease., Watanabe T et al., 2011 J Bacteriol. 193(16):4259-4260）を用いた。前記標準株を培養し、純培養液１ｍｌから、市販のＤＮＡ抽出キット（NucreoSpin（登録商標） Blood、キアゲン社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを、吸光度測定を用いて１ｎｇ／μｌに調製し、さらに０．１ｎｇ／μｌ、０．０１ｎｇ／μｌ、０．００１ｎｇ／μｌ、及び０．０００１ｎｇ／μｌに段階希釈し、これを鋳型ＤＮＡとした。なおゲノムＤＮＡ１ｎｇあたりのポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型標準株の菌数を３．９×１０５個とした。
【0084】
－臨床検体－
ヒト歯肉溝浸出液の採取は以下の通りに行った。口腔内の最も深い歯周ポケットをサンプル採取対象として、前記歯周ポケットの周囲の唾液を除去した後、市販ペーパーポイント(モリタペーパーポイントショート０４、モリタ社製)を挿入し１０秒間静置後、ペーパーポイントを回収した。前記回収の操作を３名の歯周病患者に対して行い、３種類の臨床検体を採取した。前記３種類の臨床検体から、市販のＤＮＡ抽出キット（NucreoSpin（登録商標） Blood、キアゲン社製）を用いてそれぞれ臨床検体１、臨床検体２、及び臨床検体３のＤＮＡを抽出し、鋳型ＤＮＡとした。
ヒト歯肉溝浸出液の採取は以下の通りに行った。口腔内の最も深い歯周ポケットをサンプル採取対象として、前記歯周ポケットの周囲の唾液を除去した後、市販ペーパーポイント(モリタペーパーポイントショート０４、モリタ社製)を挿入し１０秒間静置後、ペーパーポイントを回収した。前記回収の操作を３名の歯周病患者に対して行い、３種類の臨床検体を採取した。前記３種類の臨床検体から、市販のＤＮＡ抽出キット（NucreoSpin（登録商標） Blood、キアゲン社製）を用いてそれぞれ臨床検体１、臨床検体２、及び臨床検体３のＤＮＡを抽出し、鋳型ＤＮＡとした。
【0085】
（リアルタイムＰＣＲによる鋳型ＤＮＡの核酸増幅反応）
上述の方法で得た鋳型ＤＮＡを用いて、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のStep Oneを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲ反応液の組成は以下のとおりとした。
－リアルタイムＰＣＲ反応液の組成（総量１０μｌ）－
鋳型ＤＮＡ １μｌ
配列番号１に記載されたフォワードプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ
配列番号５に記載されたリバースプライマー（１０μＭ） ０．７５μｌ
PowerUpTMSYBR（登録商標）Green Master Mix ５μｌ
（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）
超純水 ２．５μｌ
上述の方法で得た鋳型ＤＮＡを用いて、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のStep Oneを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲ反応液の組成は以下のとおりとした。
－リアルタイムＰＣＲ反応液の組成（総量１０μｌ）－
鋳型ＤＮＡ １μｌ
配列番号１に記載されたフォワードプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ
配列番号５に記載されたリバースプライマー（１０μＭ） ０．７５μｌ
PowerUpTMSYBR（登録商標）Green Master Mix ５μｌ
（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）
超純水 ２．５μｌ
【0086】
核酸増幅反応は、５０℃２分間及び９５℃２分間の前処理の後、９５℃１５秒間の熱変性並びに６０℃１分間のアニーリング及び相補鎖合成を１サイクルとする２－ｓｔｅｐ ＰＣＲを、４０サイクル行った。リアルタイムＰＣＲ終了後、核酸の定量はスタンダードカーブ法にて行い、Threshold cycleはCrossing Point Methodにて設定した。
【0087】
－検量線の評価方法－
検量線用検体を鋳型ＤＮＡとして核酸増幅反応を行ったものに関して、検量線を作成した。検量線は、ＤＮＡのコピー数が２×１０６、２×１０５、２×１０４、２×１０３、２×１０２、及び２×１０１のものを用いて、前記したリアルタイムＰＣＲのソフトウェアで自動的に作成した。検量線は、核酸の増幅が指数関数的に起こる領域で一定の増幅産物量になるサイクル数（Ｃｔ値；threshold cycle）を横軸とし、初発の核酸量（Ｌｏｇ値）を縦軸としてプロットして作成した。検量線について、相関係数Ｒ２（直線性）、Ｙ切片の値、及び傾きを求めた。作成した検量線の結果を、後述する他の実施例及び比較例の結果も含めて表１に示す。なお表１中の配列番号は、各例で使用したポリヌクレオチドの種類を表す。
検量線用検体を鋳型ＤＮＡとして核酸増幅反応を行ったものに関して、検量線を作成した。検量線は、ＤＮＡのコピー数が２×１０６、２×１０５、２×１０４、２×１０３、２×１０２、及び２×１０１のものを用いて、前記したリアルタイムＰＣＲのソフトウェアで自動的に作成した。検量線は、核酸の増幅が指数関数的に起こる領域で一定の増幅産物量になるサイクル数（Ｃｔ値；threshold cycle）を横軸とし、初発の核酸量（Ｌｏｇ値）を縦軸としてプロットして作成した。検量線について、相関係数Ｒ２（直線性）、Ｙ切片の値、及び傾きを求めた。作成した検量線の結果を、後述する他の実施例及び比較例の結果も含めて表１に示す。なお表１中の配列番号は、各例で使用したポリヌクレオチドの種類を表す。
【0088】
初期増幅効率の評価は、以下を基準としてＡ～Ｃで表した。なお検量線のＹ切片は、定量値が１となるリアルタイムＰＣＲのサイクル数を示し、この数値が高いほど初期増幅効率が低く、定量において多量の核酸を必要とするといえる。本開示において、初期増幅効率の評価がＡ又はＢであると、初期増幅効率に優れているといえる。
Ａ： 検量線のＹ切片の値が３３．９以上３９．０未満である。
Ｂ： 検量線のＹ切片の値が３９．０以上４２．０未満である。
Ｃ： 検量線のＹ切片の値が４２．０以上である。
Ａ： 検量線のＹ切片の値が３３．９以上３９．０未満である。
Ｂ： 検量線のＹ切片の値が３９．０以上４２．０未満である。
Ｃ： 検量線のＹ切片の値が４２．０以上である。
【0089】
核酸増幅効率（％）は、核酸増幅効率（％）＝｛１０（－１／検量線の傾き）－１｝×１００の計算式から求めた。核酸増幅効率の評価は、以下を基準としてＡ～Ｃで表した。なお核酸増幅効率が低いと定量において多量の核酸が必要となるほか、非特異的な増幅が起こる可能性が高くなる。本開示において、核酸増幅効率の評価がＡ又はＢであると、核酸増幅効率に優れているといえる。
Ａ： 核酸増幅効率（％）の値が９０％以上１１０％未満である。
Ｂ： 核酸増幅効率（％）の値が８０％以上９０％未満である。
Ｃ： 核酸増幅効率（％）の値が８０％未満である。
Ａ： 核酸増幅効率（％）の値が９０％以上１１０％未満である。
Ｂ： 核酸増幅効率（％）の値が８０％以上９０％未満である。
Ｃ： 核酸増幅効率（％）の値が８０％未満である。
【0090】
－特異性の評価方法－
臨床検体１～臨床検体３を鋳型ＤＮＡとして核酸増幅反応を行ったものについては、特異性の評価に用いた。臨床検体１～臨床検体３のＣｔ値と作成した前記検量線とで、臨床検体中の核酸量を算出した。臨床検体１～臨床検体３に対する特異性の結果を表２に示す。
なお表中、Ｐ．ｇは、ポルフィロモナス・ジンジバリスであることを表す。表中配列番号は、各例で使用したポリヌクレオチドの種類を表す。表中の数値は、検体中のコピー数を示し、例えば２．６Ｅ＋０３は、検体中にポルフィロモナス・ジンジバリスが２．６×１０３コピー数存在する（つまり、検体中のポルフィロモナス・ジンジバリスの菌数が２．６×１０３個である）という結果が得られたことを示す。
臨床検体１～臨床検体３を鋳型ＤＮＡとして核酸増幅反応を行ったものについては、特異性の評価に用いた。臨床検体１～臨床検体３のＣｔ値と作成した前記検量線とで、臨床検体中の核酸量を算出した。臨床検体１～臨床検体３に対する特異性の結果を表２に示す。
なお表中、Ｐ．ｇは、ポルフィロモナス・ジンジバリスであることを表す。表中配列番号は、各例で使用したポリヌクレオチドの種類を表す。表中の数値は、検体中のコピー数を示し、例えば２．６Ｅ＋０３は、検体中にポルフィロモナス・ジンジバリスが２．６×１０３コピー数存在する（つまり、検体中のポルフィロモナス・ジンジバリスの菌数が２．６×１０３個である）という結果が得られたことを示す。
【0091】
なお特異性の評価は、以下を基準としてＡ～Ｃで表した。本開示において、特異性の評価がＡ又はＢであると、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型特異的に検出できたといえる。
Ａ： 臨床検体１におけるコピー数が１×１０３以上１×１０４未満、かつ
臨床検体２におけるコピー数が２×１０４未満、かつ
臨床検体３におけるコピー数が０である。
Ｂ： 臨床検体１におけるコピー数が１×１０３以上１×１０４未満、かつ
臨床検体２におけるコピー数が２×１０４未満、かつ
臨床検体３におけるコピー数が０より大きく１×１０２未満である。
Ｃ： 上記Ａ及びＢに当てはまらない。
Ａ： 臨床検体１におけるコピー数が１×１０３以上１×１０４未満、かつ
臨床検体２におけるコピー数が２×１０４未満、かつ
臨床検体３におけるコピー数が０である。
Ｂ： 臨床検体１におけるコピー数が１×１０３以上１×１０４未満、かつ
臨床検体２におけるコピー数が２×１０４未満、かつ
臨床検体３におけるコピー数が０より大きく１×１０２未満である。
Ｃ： 上記Ａ及びＢに当てはまらない。
【0092】
≪実施例２≫
フォワードプライマーとして配列番号２に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号４に記載されたプライマーを用いるほかは、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。
フォワードプライマーとして配列番号２に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号４に記載されたプライマーを用いるほかは、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。
【0093】
≪実施例３≫
フォワードプライマーとして配列番号２に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号７に記載されたプライマーを用いるほかは、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。
フォワードプライマーとして配列番号２に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号７に記載されたプライマーを用いるほかは、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。
【0094】
≪実施例４≫
フォワードプライマーとして配列番号１に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号６に記載されたプライマーを用いるほかは、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。
フォワードプライマーとして配列番号１に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号６に記載されたプライマーを用いるほかは、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。
【0095】
≪実施例５≫
フォワードプライマーとして配列番号１に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号８に記載されたプライマーを用いるほかは、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。
フォワードプライマーとして配列番号１に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号８に記載されたプライマーを用いるほかは、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。
【0096】
≪実施例６≫
フォワードプライマーとして配列番号２に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号５に記載されたプライマーを用いるほかは、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。
フォワードプライマーとして配列番号２に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号５に記載されたプライマーを用いるほかは、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。
【0097】
≪実施例７≫
フォワードプライマーとして配列番号３に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号４に記載されたプライマーを用いるほかは、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。
フォワードプライマーとして配列番号３に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号４に記載されたプライマーを用いるほかは、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。
【0098】
≪比較例１≫
フォワードプライマーとして配列番号１０に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号１１に記載されたプライマーを用いるほかは、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。なお配列番号１０及び配列番号１１に示される塩基配列は、Ji-Hoi Moon, et al., Development and evaluation of new primers for PCR-based identification of type II fimA of Porphyromonas gingivalis, FEMS Immunol Med Microbiol, 64:425-428, 2012.において、ポルフィロモナス・ジンジバリスのｆｉｍＡ ＩＩ型遺伝子の増幅用として記載されたプライマーの塩基配列である。なお以下の配列番号１０～配列番号１５で示されるポリヌクレオチドについても、同様に、外部委託して合成し、脱塩精製を行った。
配列番号１０：5'-gcatgatggtactcctttga-3' （フォワードプライマー）
配列番号１１：5'-ctgaccaacgagaacccact-3' （リバースプライマー）
フォワードプライマーとして配列番号１０に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号１１に記載されたプライマーを用いるほかは、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。なお配列番号１０及び配列番号１１に示される塩基配列は、Ji-Hoi Moon, et al., Development and evaluation of new primers for PCR-based identification of type II fimA of Porphyromonas gingivalis, FEMS Immunol Med Microbiol, 64:425-428, 2012.において、ポルフィロモナス・ジンジバリスのｆｉｍＡ ＩＩ型遺伝子の増幅用として記載されたプライマーの塩基配列である。なお以下の配列番号１０～配列番号１５で示されるポリヌクレオチドについても、同様に、外部委託して合成し、脱塩精製を行った。
配列番号１０：5'-gcatgatggtactcctttga-3' （フォワードプライマー）
配列番号１１：5'-ctgaccaacgagaacccact-3' （リバースプライマー）
【0099】
≪比較例２≫
フォワードプライマーとして配列番号１２に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号１３に記載されたプライマーを用いるほかは、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。なお配列番号１２及び配列番号１３に示される塩基配列は、Atsuo Amano, et al., Distribution of Porphyromonas gingivalis Strains with fimA Genotypes in Periodontitis Patients, J Clin Microbiol, 37:1426-1430, 1999.において、ポルフィロモナス・ジンジバリスのｆｉｍＡ ＩＩ型遺伝子の増幅用として記載されたプライマーの塩基配列である。
配列番号１２：5'-acaactatacttatgacaatgg-3' （フォワードプライマー）
配列番号１３：5'-aaccccgctccctgtattccga-3' （リバースプライマー）
フォワードプライマーとして配列番号１２に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号１３に記載されたプライマーを用いるほかは、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。なお配列番号１２及び配列番号１３に示される塩基配列は、Atsuo Amano, et al., Distribution of Porphyromonas gingivalis Strains with fimA Genotypes in Periodontitis Patients, J Clin Microbiol, 37:1426-1430, 1999.において、ポルフィロモナス・ジンジバリスのｆｉｍＡ ＩＩ型遺伝子の増幅用として記載されたプライマーの塩基配列である。
配列番号１２：5'-acaactatacttatgacaatgg-3' （フォワードプライマー）
配列番号１３：5'-aaccccgctccctgtattccga-3' （リバースプライマー）
【0100】
≪参考例１≫
ポルフィロモナス・ジンジバリスのＦｉｍＡの型を区別せず、ポルフィロモナス・ジンジバリスの総菌数の検出を行った。具体的には、フォワードプライマーとして配列番号１４に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号１５に記載されたプライマーを用いるほかは、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の作成、及び特異性の評価を行った。なお配列番号１４及び配列番号１５に示される塩基配列は、Hiroshi Maeda, et al., Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQ gene and total bacteria, FEMS Immunol Med Microbiol, 39: 81-86, 2003.において、ポルフィロモナス・ジンジバリスの検出用として記載されたプライマーの塩基配列に基づいて設計した塩基配列である。
配列番号１４：5'-tagcttgctaaggttgatgg-3' （フォワードプライマー）
配列番号１５：5'-caagtgtatgcggttttagt-3' （リバースプライマー）
ポルフィロモナス・ジンジバリスのＦｉｍＡの型を区別せず、ポルフィロモナス・ジンジバリスの総菌数の検出を行った。具体的には、フォワードプライマーとして配列番号１４に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号１５に記載されたプライマーを用いるほかは、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の作成、及び特異性の評価を行った。なお配列番号１４及び配列番号１５に示される塩基配列は、Hiroshi Maeda, et al., Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQ gene and total bacteria, FEMS Immunol Med Microbiol, 39: 81-86, 2003.において、ポルフィロモナス・ジンジバリスの検出用として記載されたプライマーの塩基配列に基づいて設計した塩基配列である。
配列番号１４：5'-tagcttgctaaggttgatgg-3' （フォワードプライマー）
配列番号１５：5'-caagtgtatgcggttttagt-3' （リバースプライマー）
【0101】
≪評価結果≫
（検量線の評価）
ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型標準株のゲノムＤＮＡ及び各ポリヌクレオチドを使用し、前記－検量線の評価方法－に従って得られた検量線の結果を表１に示す。
（検量線の評価）
ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型標準株のゲノムＤＮＡ及び各ポリヌクレオチドを使用し、前記－検量線の評価方法－に従って得られた検量線の結果を表１に示す。
【0102】
【表1】
【0103】
表１に示したとおり、実施例１～実施例７では、初期増幅効率の評価及び核酸増幅効率の評価のいずれにおいても優れていた。一方で、比較例１及び比較例２では、初期増幅効率の評価及び核酸増幅効率の評価のいずれにおいても劣っていた。
【0104】
（特異性の評価）
臨床検体及び各ポリヌクレオチドを使用し、前記－特異性の評価方法－に従って得られた特異性の結果を表２に示す。なお表２中、no dataは、当該試験を行わなかったことを示す。
臨床検体及び各ポリヌクレオチドを使用し、前記－特異性の評価方法－に従って得られた特異性の結果を表２に示す。なお表２中、no dataは、当該試験を行わなかったことを示す。
【0105】
【表2】
【0106】
なお臨床検体１には、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型のみが含まれている。臨床検体２には、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ Ｉ型及び少量のポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型が含まれている。臨床検体３には、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ Ｉ型のみが含まれている。表２に示したとおり、臨床検体（臨床検体１～臨床検体３）の特異性の結果において、実施例１～実施例７では特異性の評価はＡ又はＢであり、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型特異的に検出できた。一方で、比較例１及び比較例２では、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型特異的に検出できなかった。
【0107】
≪実施例８≫
（ＴａｑＭａｎプローブの合成）
以下の塩基配列で示されるＴａｑＭａｎプローブの合成及びＨＰＬＣ精製は、外部委託により行った。詳細には、配列番号１６に記載されたＴａｑＭａｎプローブはサーモフィッシャーサイエンティフィック社に委託し、配列番号１７及び配列番号１８に記載されたＴａｑＭａｎプローブはユーロフィンジェノミクス社に委託した。なお、配列中、ＦＡＭ（Fluorescein）及びＨＥＸ（Hexachlorofluorescein）はいずれもバイオラベリング用蛍光色素標識であり、ＮＦＱはNon Fluorescent Quencherの略称であり、ＭＧＢはMinor Groove Binderの略称であり、ＥＱはEclipse Quencherの略称である。
（ＴａｑＭａｎプローブの合成）
以下の塩基配列で示されるＴａｑＭａｎプローブの合成及びＨＰＬＣ精製は、外部委託により行った。詳細には、配列番号１６に記載されたＴａｑＭａｎプローブはサーモフィッシャーサイエンティフィック社に委託し、配列番号１７及び配列番号１８に記載されたＴａｑＭａｎプローブはユーロフィンジェノミクス社に委託した。なお、配列中、ＦＡＭ（Fluorescein）及びＨＥＸ（Hexachlorofluorescein）はいずれもバイオラベリング用蛍光色素標識であり、ＮＦＱはNon Fluorescent Quencherの略称であり、ＭＧＢはMinor Groove Binderの略称であり、ＥＱはEclipse Quencherの略称である。
【0108】
配列番号１６：5'-FAM-acttcaacagcaacaactat-NFQ-MGB-3'（TaqManプローブ）
配列番号１７：5'-HEX-atagttgttgctgttgaagt-MGB-EQ-3'（TaqManプローブ）
配列番号１８：5'-HEX-cctacgacctattatcctgtat-MGB-EQ-3'（TaqManプローブ）
配列番号１７：5'-HEX-atagttgttgctgttgaagt-MGB-EQ-3'（TaqManプローブ）
配列番号１８：5'-HEX-cctacgacctattatcctgtat-MGB-EQ-3'（TaqManプローブ）
【0109】
（リアルタイムＰＣＲによる鋳型ＤＮＡの核酸増幅反応）
前記鋳型ＤＮＡを用いて、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のStep Oneを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲ反応液の組成は以下のとおりとした。
前記鋳型ＤＮＡを用いて、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のStep Oneを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲ反応液の組成は以下のとおりとした。
【0110】
－リアルタイムＰＣＲ反応液の組成（総量１０μｌ）－
鋳型ＤＮＡ １μｌ
配列番号１に記載されたフォワードプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ
配列番号４に記載されたリバースプライマー（１０μＭ） ０．７５μｌ
配列番号１６に記載されたTaqManプローブ（１μＭ） ２．５μｌ
Probe qPCR Mix（タカラバイオ社製） ５μｌ
鋳型ＤＮＡ １μｌ
配列番号１に記載されたフォワードプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ
配列番号４に記載されたリバースプライマー（１０μＭ） ０．７５μｌ
配列番号１６に記載されたTaqManプローブ（１μＭ） ２．５μｌ
Probe qPCR Mix（タカラバイオ社製） ５μｌ
【0111】
核酸増幅反応は、９５℃３０秒間の前処理の後、９５℃５秒間の熱変性並びに６０℃６０秒間のアニーリング及び相補鎖合成を１サイクルとする２－ｓｔｅｐ ＰＣＲを、４０サイクル行った。リアルタイムＰＣＲ終了後、核酸の定量はスタンダードカーブ法にて行い、Threshold cycleはCrossing Point Methodにて設定した。
【0112】
実施例８における検量線の評価方法は、実施例１に記載の検量線の評価方法と同様に実施した。具体的には、検量線について、相関係数Ｒ２（直線性）、Ｙ切片の値、及び傾きを求め、さらに初期増幅効率の評価、核酸増幅効率の算出、及び核酸増幅効率の評価を行った。検量線の結果を、後述する他の実施例の結果も含めて表３に示す。なお表３中のポリヌクレオチドの配列番号は、各例で使用したポリヌクレオチドの種類を表す。
【0113】
実施例８における特異性の評価方法は、実施例１に記載の特異性の評価方法と同様に実施した。臨床検体１～臨床検体３に対する特異性の結果を表４に示す。なお表中、Ｐ．ｇは、ポルフィロモナス・ジンジバリスであることを表す。表中配列番号は、各例で使用したポリヌクレオチドの種類を表す。表中の数値は、検体中のコピー数を示し、例えば２．６Ｅ＋０３は、検体中にポルフィロモナス・ジンジバリスが２．６×１０３コピー数存在する（つまり、検体中のポルフィロモナス・ジンジバリスの菌数が２．６×１０３個である）という結果が得られたことを示す。
【0114】
≪実施例９≫
ＴａｑＭａｎプローブとして配列番号１７に記載されたプローブを用いるほかは、実施例８と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。
ＴａｑＭａｎプローブとして配列番号１７に記載されたプローブを用いるほかは、実施例８と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。
【0115】
≪実施例１０≫
フォワードプライマーとして配列番号１に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号５に記載されたプライマーを、ＴａｑＭａｎプローブとして配列番号１８に記載されたプローブを用いるほかは、実施例８と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。
フォワードプライマーとして配列番号１に記載されたプライマーを、リバースプライマーとして配列番号５に記載されたプライマーを、ＴａｑＭａｎプローブとして配列番号１８に記載されたプローブを用いるほかは、実施例８と同様にしてリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応、検量線の評価、及び特異性の評価を行った。
【0116】
≪評価結果≫
（検量線の評価）
ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型標準株のゲノムＤＮＡ及び各ポリヌクレオチドを使用し、前記－検量線の評価方法－に従って得られた検量線の結果を表３に示す。
（検量線の評価）
ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型標準株のゲノムＤＮＡ及び各ポリヌクレオチドを使用し、前記－検量線の評価方法－に従って得られた検量線の結果を表３に示す。
【0117】
【表3】
【0118】
表３に示したとおり、実施例８～実施例１０では、初期増幅効率の評価及び核酸増幅効率の評価のいずれにおいても優れていた。また、実施例８～実施例１０において、配列番号１６～配列番号１８に記載されたTaqManプローブは、それぞれ、ＴａｑＭａｎ法に利用可能なプローブであることが確認できた。
【0119】
（特異性の評価）
臨床検体及び各ポリヌクレオチドを使用し、前記－特異性の評価方法－に従って得られた特異性の結果を表４に示す。なお表４中、参考例１は前述の参考例１と同一である。
臨床検体及び各ポリヌクレオチドを使用し、前記－特異性の評価方法－に従って得られた特異性の結果を表４に示す。なお表４中、参考例１は前述の参考例１と同一である。
【0120】
【表4】
【0121】
表４に示したとおり、臨床検体（臨床検体１～臨床検体３）の特異性の結果において、実施例８～実施例１０では特異性の評価はＡであり、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型特異的に検出できた。
【0122】
以上のことから、本開示の実施例では、ポルフィロモナス・ジンジバリスの線毛遺伝子（ｆｉｍＡ）の初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にすることができるポリヌクレオチドを提供することができた。さらに、本開示の実施例では、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型を特異的に検出できるポリヌクレオチドを提供することができた。一方で比較例では、前記のようなポルフィロモナス・ジンジバリスの線毛遺伝子（ｆｉｍＡ）の初期増幅効率及び核酸増幅効率を良好にすることができるポリヌクレオチドを提供することはできず、ポルフィロモナス・ジンジバリスＦｉｍＡ ＩＩ型を特異的に検出できるポリヌクレオチドも提供できなかった。
【0123】
２０２０年７月２８日に出願された日本国特許出願２０２０－１２７５１７号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載されたすべての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
本明細書に記載されたすべての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【0124】
本開示のポリヌクレオチドをプライマーとして用いて核酸増幅反応を実施することにより、ポルフィロモナス・ジンジバリスを検出することができ、又は、歯周病の罹患可能性を評価することができる。
【図1】
【配列表】