特許 7575501 ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６およびＥＧＦＲに結合するタンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-21

(45)【発行日】2024-10-29

(54)【発明の名称】ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６およびＥＧＦＲに結合するタンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20241022BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20241022BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/28

A61P35/00

A61K39/395 N

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/13

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2022581464

(86)(22)【出願日】2021-08-05

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-28

(86)【国際出願番号】 US2021044737

(87)【国際公開番号】W WO2022031965

(87)【国際公開日】2022-02-10

【審査請求日】2023-04-03

(31)【優先権主張番号】63/061,510

(32)【優先日】2020-08-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】519288755

【氏名又は名称】ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】チュン， アン エフ．

(72)【発明者】

【氏名】ドラビック， ステイシー ブイ．

(72)【発明者】

【氏名】グリンバーグ， アシャ

(72)【発明者】

【氏名】ジュオ， ゾン ショーン

(72)【発明者】

【氏名】リハースカ， カティア

(72)【発明者】

【氏名】モーガン， クリストファー ライアン

(72)【発明者】

【氏名】ワグトマン， ニコライ

【審査官】井関 めぐみ

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／０３５９３９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１８－５３２３９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１９／１５７３６６（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １６／４６

Ｃ０７Ｋ １６／２８

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｎ １５／１３

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位；
（ｂ）ＥＧＦＲに結合する第２の抗原結合部位；および
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位
を含むタンパク質であって、
前記第２の抗原結合部位が、配列番号１３５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および配列番号１３９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、
（ｉ）前記ＶＨは、それぞれ、配列番号１３６、１４６および１３８の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含み；前記ＶＬは、それぞれ、配列番号１４０、１４１および１５１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびにＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で番号付けされる１位のＡｓｐ（Ｄ）を含む；
（ｉｉ）前記ＶＨは、それぞれ、配列番号１３６、１３７および１３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み；前記ＶＬは、それぞれ、配列番号１４０、１４１および１５１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む；または
（ｉｉｉ）前記ＶＨは、それぞれ、配列番号１３６、１４６および１３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み；前記ＶＬは、それぞれ、配列番号１４０、１４１および１４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびにＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で番号付けされる１位のＡｓｐ（Ｄ）を含み、
Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で番号付けして、前記第２の抗原結合部位の前記ＶＨが３９位のＧｌｎ（Ｑ）を含み、前記第２の抗原結合部位の前記ＶＬが８７位のＴｙｒ（Ｙ）を含む、タンパク質。

【請求項2】

（ｉ）前記ＶＨが配列番号１４５と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１５０と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、必要に応じて、（ａ）前記ＶＨが配列番号１４５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１５０のアミノ酸配列を含むか、または（ｂ）前記ＶＨが配列番号１７０のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１７１のアミノ酸配列を含む、
（ｉｉ）前記ＶＨが配列番号１３５と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１５０と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、必要に応じて、前記ＶＨが配列番号１３５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１５０のアミノ酸配列を含む、あるいは
（ｉｉｉ）前記ＶＨが配列番号１４５と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１４７と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、必要に応じて
、前記ＶＨが配列番号１４５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１４７のアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載のタンパク質。

【請求項3】

前記第２の抗原結合部位が一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を含み、前記ｓｃＦｖが配列番号１５２、１５４、および１４８からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、必要に応じて、前記ｓｃＦＶが、配列番号１５２、１５４または１４８のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のタンパク質。

【請求項4】

前記タンパク質が配列番号１６７、１６８および１６６からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、必要に応じて、前記ポリペプチドが、配列番号１６７、１６８または１６６のアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項5】

前記第２の抗原結合部位が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される５ｎＭよりも小さいまたはそれに等しい解離定数（Ｋ_Ｄ）で、ヒトＥＧＦＲに結合する、および／または前記第２の抗原結合部位が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される６ｎＭよりも小さいまたはそれに等しい解離定数（Ｋ_Ｄ）で、アカゲザルＥＧＦＲに結合する、請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項6】

ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位がＦａｂ断片であり、ＥＧＦＲに結合する前記第２の抗原結合部位がｓｃＦｖである、請求項１から３および５のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項7】

前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、請求項６に記載のタンパク質。

【請求項8】

前記ジスルフィド架橋が、Ｋａｂａｔナンバリングスキーム下で番号付けされる前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前記軽鎖可変ドメインのＣ１００との間に形成される、請求項７に記載のタンパク質。

【請求項9】

（ｉ）前記重鎖可変ドメインが、フレキシブルリンカーを介して前記軽鎖可変ドメインに連結しており、必要に応じて、前記フレキシブルリンカーが配列番号１１９に示される（Ｇ _４ Ｓ） _４ アミノ酸配列を含む、および／または
（ｉｉ）前記重鎖可変ドメインが前記軽鎖可変ドメインのＣ末端に位置する、
請求項６から８のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項10】

ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、それぞれ、配列番号８１、８２および１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項11】

ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、それぞれ、配列番号８１、８２および９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項12】

前記第１の抗原結合部位の前記ＶＨが配列番号９５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第１の抗原結合部位の前記ＶＬが配列番号８５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、必要に応じて、前記第１の抗原結合部位の前記ＶＨが配列番号９５のアミノ酸配列を含み、前記第１の抗原結合部位の前記ＶＬが配列番号８５のアミノ酸配列を含む、請求項８または９に記載のタンパク質。

【請求項13】

前記抗体ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１抗体ＦｃドメインのヒンジおよびＣＨ２ドメインを含み、必要に応じて、前記抗体Ｆｃドメインまたはその部分が、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２または配列番号１１８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項14】

前記抗体Ｆｃドメインが２つのポリペプチド鎖を含むヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインを含み、
（ｉ）前記ポリペプチド鎖の１つが、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＫ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含み；他のポリペプチド鎖が、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含む、および／または
（ｉｉ）前記ポリペプチド鎖の１つが、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＹ３４９Ｃ置換を含み；他のポリペプチド鎖が、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＳ３５４Ｃ置換を含む、
請求項１１に記載のタンパク質。

【請求項15】

（ｉ）（ａ）配列番号１６７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；
（ｂ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号１６５のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド；
（ｉｉ）（ａ）配列番号１６８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；
（ｂ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号１６５のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド；あるいは
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号１６６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；
（ｂ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号１６５のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド
を含む請求項１に記載のタンパク質。

【請求項16】

請求項１から１３のいずれか一項に記載のタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む製剤。

【請求項17】

請求項１から１３のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含む細胞。

【請求項18】

請求項１から１３のいずれか一項に記載のタンパク質を含む、がんを処置する方法における使用のための組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その開示全体があらゆる目的のためにこれにより参照により本明細書に組み込まれる２０２０年８月５日に出願された米国仮特許出願第６３／０６１，５１０号に基づく利益および優先権を主張する。
配列表

【0002】

本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年８月４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＤＦＹ－０８４ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔ命名され、サイズが１６９，７８６バイトである。

【0003】

発明の分野
本出願は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する多重特異性結合タンパク質に関する。

【背景技術】

【0004】

背景
相当な研究努力にもかかわらず、がんは、世界中の国々で重大な臨床のおよび経済的な負担であり続けている。世界保健機関（ＷＨＯ）によれば、がんは２番目の死因である。既存の処置モダリティの中には、外科手術、放射線療法、化学療法、生物学的療法、免疫療法、ホルモン療法、幹細胞移植および精密医療がある。これらの領域における広範な研究にもかかわらず、特に最も高悪性度のがんに対して、非常に有効で治癒的な解決手段はまだ特定されていない。さらに、既存の抗がん処置モダリティの多くは、相当な有害副作用を有する。

【0005】

がん免疫療法は、高度に特異的であり、患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を促進することができるので、望ましい。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの融合タンパク質は、腫瘍細胞およびＴ細胞に結合して、腫瘍細胞の破壊を促進する、文献に記載されているがん免疫療法である。ある特定の腫瘍関連抗原およびある特定の免疫細胞に結合する抗体が文献に記載されている。例えば、ＷＯ２０１６／１３４３７１およびＷＯ２０１５／０９５４１２を参照されたい。

【0006】

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の成分であり、循環リンパ球のおよそ１５％を構成する。ＮＫ細胞は、事実上全ての組織に浸潤し、元々、事前の感作の必要性なしに腫瘍細胞を有効に死滅させる能力によって特徴付けられた。活性化ＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞と類似の手段によって－すなわち、パーフォリンおよびグランザイムを含有する細胞溶解性顆粒（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ｇｒａｎｕｌｅ）を介して、ならびにデスレセプター経路を介して、標的細胞を死滅させる。活性化ＮＫ細胞はまた、ＩＦＮ－γなどの炎症性サイトカインおよび他の白血球の標的組織への動員を促進するケモカインを分泌する。

【0007】

ＮＫ細胞は、その表面上のさまざまな活性化受容体および抑制性受容体を介してシグナルに応答する。例えば、ＮＫ細胞が健康な自己細胞に遭遇した場合、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化を介してその活性が阻害される。あるいは、ＮＫ細胞が外来細胞またはがん細胞に遭遇した場合、その活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲ、ＤＮＡＭ１）を介して活性化される。ＮＫ細胞はまた、その表面上のＣＤ１６受容体を介して一部の免疫グロブリンの定常領域によっても活性化される。活性化に対するＮＫ細胞の全体的な感度は、刺激シグナルと抑制シグナルの合計に依存する。ＮＫＧ２Ｄは、本質的に全てのナチュラルキラー細胞によって発現されるＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＮＫＧ２Ｄは、活性化受容体として働く。ＮＫＧ２Ｄは、Ｔ細胞上でも見出され、これは、共刺激性受容体として作用する。ＮＫＧ２Ｄを介してＮＫ細胞機能をモジュレートする能力は、悪性腫瘍を含むさまざまな治療状況において有用である。

【0008】

上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）過剰発現または活動過剰をもたらす変異は、非小細胞肺がん、肛門がん、神経膠芽腫および頭頸頚部の上皮性腫瘍を含む多くのがんに関連している。これらのＥＧＦＲが関与する体細胞変異は、その定常的な活性化をもたらし、これは、未制御の細胞分裂を生じる。神経膠芽腫では、ＥＧＦＲｖＩＩＩと呼ばれるＥＧＦＲのより特異的な変異またはあまり特異的ではない変異が、多くの場合に観察される。ＥＧＦＲまたはファミリーメンバーの変異、増幅または誤調節は、結腸直腸がん、腎細胞癌、膀胱がん、子宮頸がん、卵巣がん、膵臓がんおよび肝臓がんを含む他の固形腫瘍と関係する。
抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、ネシツムマブおよびザルツムマブが開発されている。しかしながら、より高い有効性を有し、有害効果が低減されたがんの処置における使用のための新しい有用な抗体および関連する療法についての必要性が残されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【文献】国際公開第２０１６／１３４３７１号

【文献】国際公開第２０１５／０９５４１２号

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

要旨
本出願は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体、ＣＤ１６受容体、およびＥＧＦＲに結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。このようなタンパク質は、１種より多くのＮＫ活性化受容体と結合することができ、ＮＫＧ２Ｄへの天然リガンドの結合を遮断し得る。ある特定の実施形態では、タンパク質はヒトのＮＫ細胞を刺激することができる。一部の実施形態では、タンパク質は、ヒトならびにげっ歯類およびカニクイザルなどの他の種のＮＫ細胞を刺激することができる。本明細書に開示されるタンパク質のいずれか１つを含有する製剤；タンパク質を発現している１つまたは複数の核酸を含有する細胞；およびタンパク質を使用して腫瘍細胞死を増強する方法も提供される。

【0011】

したがって、本出願の一態様は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位；（ｂ）ＥＧＦＲに結合する第２の抗原結合部位；および（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位を含むタンパク質であって、第２の抗原結合部位は、（ｉ）それぞれ、配列番号１３６、１５７および１３８の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；ならびにそれぞれ、配列番号１４０、１４１および１５１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；または（ｉｉ）それぞれ、配列番号１３６、１４６および１３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号１４０、１４１および１４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含むＶＬを含む、タンパク質を提供する。

【0012】

一部の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号１３６、１５７および１３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、ＶＬは、それぞれ、配列番号１４０、１４１および１５１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。

【0013】

一部の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号１３６、１４６および１３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、ＶＬは、それぞれ、配列番号１４０、１４１および１５１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。

【0014】

一部の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号１３６、１３７および１３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、ＶＬは、それぞれ、配列番号１４０、１４１および１５１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。

【0015】

一部の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号１３６、１４６および１３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、ＶＬは、それぞれ、配列番号１４０、１４１および１４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。

【0016】

一部の実施形態では、ＶＨは配列番号１４５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１５０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは配列番号１４５のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１５０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは配列番号１７０のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１７１のアミノ酸配列を含む。

【0017】

一部の実施形態では、ＶＨは配列番号１３５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１５０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは配列番号１３５のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１５０のアミノ酸配列を含む。

【0018】

一部の実施形態では、ＶＨは配列番号１４５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１４７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは配列番号１４５のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１４７のアミノ酸配列を含む。

【0019】

本出願の別の態様は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位；（ｂ）ＥＧＦＲに結合する第２の抗原結合部位；および（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位を含むタンパク質であって、第２の抗原結合部位は、配列番号１３５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１３９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含み、ＶＨは、配列番号１３５と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で番号付けされるＳ６２Ｒ置換を含み、ならびに／またはＶＬは、配列番号１３９と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で番号付けされるＤ９２Ｒ置換および／もしくはＦ８７Ｙ置換を含む、タンパク質を提供する。

【0020】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号１３５と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で番号付けされるＳ６２Ｒ置換を含む。一部の実施形態では、ＶＬは、配列番号１３９と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で番号付けされるＤ９２Ｒ置換を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号１３５と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で番号付けされるＳ６２Ｒ置換を含み、ＶＬは、配列番号１３９と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で番号付けされるＤ９２Ｒ置換を含む、請求項６に記載のタンパク質。

【0021】

上記の態様のいずれか１つの一部の実施形態では、ＶＬは、配列番号１３９と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で番号付けされるＦ８７Ｙ置換を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のタンパク質。

【0022】

一部の実施形態では、第２の抗原結合部位が一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を含み、ｓｃＦｖが配列番号１５２、１５４、１４８および１５８からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一のまたはそれを含むアミノ酸配列を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のタンパク質。

【0023】

一部の実施形態では、本開示のタンパク質は、配列番号１６７、１６８および１６６からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一のまたはそれを含むアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0024】

一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される５ｎＭよりも小さいまたはそれに等しい解離定数（Ｋ_Ｄ）で、ヒトＥＧＦＲに結合する。一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される６ｎＭよりも小さいまたはそれに等しい解離定数（Ｋ_Ｄ）で、アカゲザルＥＧＦＲに結合する。

【0025】

一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位がＦａｂ断片であり、ＥＧＦＲに結合する第２の抗原結合部位がｓｃＦｖである。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位がｓｃＦｖであり、ＥＧＦＲに結合する第２の抗原結合部位がＦａｂ断片である。一部の実施形態では、タンパク質は、ＥＧＦＲに結合する追加の抗原結合部位をさらに含む。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位がｓｃＦｖであり、ＥＧＦＲに結合する第２のおよび追加の抗原結合部位がそれぞれＦａｂ断片である。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位がｓｃＦｖであり、ＥＧＦＲに結合する第２のおよび追加の抗原結合部位がそれぞれｓｃＦｖである。一部の実施形態では、第２のおよび追加の抗原結合部位のアミノ酸配列が同一である。

【0026】

一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常ドメインまたはその部分に連結しており、ｓｃＦｖが重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲに結合するそれぞれのｓｃＦｖは、Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常ドメインまたはその部分に連結しており、ｓｃＦｖが重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ヒンジは、アミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙをさらに含む。

【0027】

一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ内で、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する。一部の実施形態では、ＥＧＦＲに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する。一部の実施形態では、ジスルフィド架橋は、Ｋａｂａｔナンバリングスキーム下で番号付けされる重鎖可変ドメインのＣ４４と軽鎖可変ドメインのＣ１００との間に形成される。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ内で、重鎖可変ドメインは、フレキシブルリンカーを介して、軽鎖可変ドメインに連結している。一部の実施形態では、ＥＧＦＲに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、重鎖可変ドメインは、フレキシブルリンカーを介して、軽鎖可変ドメインに連結している。一部の実施形態では、フレキシブルリンカーは（Ｇ_４Ｓ）_４（配列番号１１９）を含む。

【0028】

一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ内で、重鎖可変ドメインが軽鎖可変ドメインのＣ末端に位置する。一部の実施形態では、ＥＧＦＲに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、重鎖可変ドメインが軽鎖可変ドメインのＣ末端に位置する。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ内で、重鎖可変ドメインが軽鎖可変ドメインのＮ末端に位置する。

【0029】

一部の実施形態では、ＥＧＦＲに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＮ末端に位置する。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂ断片は、抗原結合部位とＦｃまたはその部分との間に位置しない。一部の実施形態では、ＥＧＦＲに結合するＦａｂ断片は抗原結合部位とＦｃまたはその部分との間に位置しない。

【0030】

一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、それぞれ、配列番号８１、８２および１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、それぞれ、配列番号８１、８２および９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。一部の実施形態では、第１の抗原結合部位のＶＨが配列番号９５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部位のＶＬが配列番号８５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の抗原結合部位のＶＨが配列番号９５のアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部位のＶＬは配列番号８５のアミノ酸配列を含む。

【0031】

一部の実施形態では、抗体ＦｃドメインはヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む。一部の実施形態では、抗体ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、抗体Ｆｃドメインまたはその部分は、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２または配列番号１１８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。

【0032】

一部の実施形態では、抗体Ｆｃドメインの少なくとも１つのポリペプチド鎖は、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９から選択される１つまたは複数の位置に１つまたは複数の変異を含む。一部の実施形態では、抗体Ｆｃドメインの少なくとも１つのポリペプチド鎖は、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＱ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９ＤおよびＫ４３９Ｅから選択される１つまたは複数の変異を含む。

【0033】

一部の実施形態では、抗体重鎖定常領域の１つのポリペプチド鎖は、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９から選択される１つまたは複数の位置に１つまたは複数の変異を含み；抗体重鎖定常領域の他のポリペプチド鎖は、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９から選択される１つまたは複数の位置に１つまたは複数の変異を含む。一部の実施形態では、抗体重鎖定常領域の１つのポリペプチド鎖は、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＫ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含み；抗体重鎖定常領域の他のポリペプチド鎖は、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含む。

【0034】

一部の実施形態では、抗体重鎖定常領域の１つのポリペプチド鎖は、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＹ３４９Ｃ置換を含み；抗体重鎖定常領域の他のポリペプチド鎖は、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＳ３５４Ｃ置換を含む。

【0035】

本出願の別の態様は、（ａ）配列番号１６７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；（ｂ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および（ｃ）配列番号１６５のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含むタンパク質を提供する。

【0036】

本出願の別の態様は、（ａ）配列番号１６８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；（ｂ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および（ｃ）配列番号１６５のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含むタンパク質を提供する。

【0037】

本出願の別の態様は、（ａ）配列番号１６６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；（ｂ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および（ｃ）配列番号１６５のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含むタンパク質を提供する。

【0038】

本出願の別の態様は、本明細書に開示されるタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む製剤を提供する。

【0039】

本出願の別の態様は、本明細書に開示されるタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含む細胞を提供する。一部の実施形態では、配列番号１６７または配列番号１６９のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含む細胞である。

【0040】

本出願の別の態様は、本明細書に開示される精製タンパク質を提供する。一部の実施形態では、タンパク質は、遠心分離、深層濾過、細胞溶解、ホモジナイゼーション、凍結－解凍、アフィニティ精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーからなる群から選択される方法を使用して精製される。

【0041】

本出願の別の態様は、腫瘍細胞死を増強する方法であって、腫瘍細胞およびナチュラルキラー細胞を、有効量の本明細書に開示されるタンパク質または本明細書に開示される製剤に曝露するステップを含み、腫瘍細胞がＥＧＦＲを発現する、方法を提供する。

【0042】

本出願の別の態様は、がんを処置する方法であって、有効量の本明細書に開示されるタンパク質または製剤をそれを必要とする患者に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、がんは固形腫瘍である。一部の実施形態では、がんは、肺がん、乳がん、腎臓がん、結腸直腸がん、胃がん、脳がん、神経膠腫、膀胱がん、頭頸部がん、膀胱がん、膵臓がんおよび肝臓がん、子宮頸がん、卵巣がんまたは前立腺がんである。一部の実施形態では、がんはＥＧＦＲを発現する。

【0043】

本出願に記載されるＴｒｉＮＫＥＴのこれらのおよび他の態様ならびに利点は、以下の図面、詳細な説明および特許請求の範囲によって説明される。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位；
（ｂ）ＥＧＦＲに結合する第２の抗原結合部位；および
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位
を含むタンパク質であって、
前記第２の抗原結合部位が、
（ｉ）それぞれ、配列番号１３６、１５７および１３８の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；ならびにそれぞれ、配列番号１４０、１４１および１５１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；または
（ｉｉ）それぞれ、配列番号１３６、１４６および１３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号１４０、１４１および１４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含むＶＬ
を含む、タンパク質。
（項目２）
前記ＶＨが、それぞれ、配列番号１３６、１５７および１３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、前記ＶＬが、それぞれ、配列番号１４０、１４１および１５１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、項目１に記載のタンパク質。
（項目３）
前記ＶＨが、それぞれ、配列番号１３６、１４６および１３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、前記ＶＬが、それぞれ、配列番号１４０、１４１および１５１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、項目２に記載のタンパク質。
（項目４）
前記ＶＨが、それぞれ、配列番号１３６、１３７および１３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、前記ＶＬが、それぞれ、配列番号１４０、１４１および１５１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、項目２に記載のタンパク質。
（項目５）
前記ＶＨが、それぞれ、配列番号１３６、１４６および１３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、前記ＶＬが、それぞれ、配列番号１４０、１４１および１４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、項目１に記載のタンパク質。
（項目６）
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位；
（ｂ）ＥＧＦＲに結合する第２の抗原結合部位；および
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位
を含むタンパク質であって、
前記第２の抗原結合部位が、配列番号１３５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１３９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含み、
前記ＶＨが、配列番号１３５と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で番号付けされるＳ６２Ｒ置換を含み、ならびに／または前記ＶＬが、配列番号１３９と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で番号付けされるＤ９２Ｒ置換および／もしくはＦ８７Ｙ置換を含む、タンパク質。
（項目７）
前記ＶＨが、配列番号１３５と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で番号付けされるＳ６２Ｒ置換を含む、項目６に記載のタンパク質。
（項目８）
前記ＶＬが、配列番号１３９と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で番号付けされるＤ９２Ｒ置換を含む、項目６に記載のタンパク質。
（項目９）
前記ＶＨが、配列番号１３５と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で番号付けされるＳ６２Ｒ置換を含み、前記ＶＬが、配列番号１３９と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で番号付けされるＤ９２Ｒ置換を含む、項目６に記載のタンパク質。
（項目１０）
前記ＶＬが、配列番号１３９と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で番号付けされるＦ８７Ｙ置換を含む、項目１から９のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１１）
前記ＶＨが配列番号１４５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１５０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１から３および６から１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１２）
前記ＶＨが配列番号１４５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１５０のアミノ酸配列を含むか、または前記ＶＨが配列番号１７０のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１７１のアミノ酸配列を含む、項目１から３および６から１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１３）
前記ＶＨが配列番号１３５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１５０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１、２、４、６、８および１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１４）
前記ＶＨが配列番号１３５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１５０のアミノ酸配列を含む、項目１、２、４、６、８、１０および１３のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１５）
前記ＶＨが配列番号１４５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１４７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１、５から７および１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１６）
前記ＶＨが配列番号１４５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１４７のアミノ酸配列を含む、項目１、５から７、１０および１５のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１７）
前記第２の抗原結合部位が一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を含み、前記ｓｃＦｖが配列番号１５２、１５４、１４８および１５８からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１から１６のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１８）
前記ｓｃＦｖが配列番号１５２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１から３、６から１２および１７のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１９）
前記ｓｃＦＶが配列番号１５２のアミノ酸配列を含む、項目１から３、６から１２、１７および１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目２０）
前記ｓｃＦＶが配列番号１５４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１、２、４、６、８、１０、１３、１４および１７のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目２１）
前記ｓｃＦＶが配列番号１５４のアミノ酸配列を含む、項目１、２、４、６、８、１０、１３、１４、１７および２０のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目２２）
前記ｓｃＦＶが配列番号１４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１、５から７、１０および１５から１７のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目２３）
前記ｓｃＦＶが配列番号１４８のアミノ酸配列を含む、項目１、５から７、１０、１５から１７および２２のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目２４）
前記タンパク質が配列番号１６７、１６８および１６６からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項目１から２３のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目２５）
前記ポリペプチドが配列番号１６７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１から３、６から１２、１７から１９および２４のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目２６）
前記ポリペプチドが配列番号１６７のアミノ酸配列を含む、項目１から３、６から１２、１７から１９、２４および２５のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目２７）
前記ポリペプチドが配列番号１６８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１、２、４、６、８、１０、１３、１４、１７、２０、２１および２４のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目２８）
前記ポリペプチドが配列番号１６８のアミノ酸配列を含む、項目１、２、４、６、８、１０、１３、１４、１７、２０、２１、２４および２７のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目２９）
前記ポリペプチドが配列番号１６６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１、５から７、１０、１５から１７および２２から２４のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目３０）
前記ｓｃＦｖが配列番号１６６のアミノ酸配列を含む、項目１、５から７、１０、１５から１７、２２から２４および２９のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目３１）
前記第２の抗原結合部位が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される５ｎＭよりも小さいまたはそれに等しい解離定数（Ｋ _Ｄ ）で、ヒトＥＧＦＲに結合する、項目１から３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目３２）
前記第２の抗原結合部位が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される６ｎＭよりも小さいまたはそれに等しい解離定数（Ｋ _Ｄ ）で、アカゲザルＥＧＦＲに結合する、項目１から３１のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目３３）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位がＦａｂ断片であり、ＥＧＦＲに結合する前記第２の抗原結合部位がｓｃＦｖである、項目１から１６、３１および３２のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目３４）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位がｓｃＦｖであり、ＥＧＦＲに結合する前記第２の抗原結合部位がＦａｂ断片である、項目１から１６、３１および３２のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目３５）
ＥＧＦＲに結合する追加の抗原結合部位をさらに含む、項目１から１６、３１および３２のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目３６）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位がｓｃＦｖであり、ＥＧＦＲに結合する前記第２のおよび前記追加の抗原結合部位がそれぞれＦａｂ断片である、項目３５に記載のタンパク質。
（項目３７）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位がｓｃＦｖであり、ＥＧＦＲに結合する前記第２のおよび前記追加の抗原結合部位がそれぞれｓｃＦｖである、項目３５に記載のタンパク質。
（項目３８）
前記第２のおよび前記追加の抗原結合部位のアミノ酸配列が同一である、項目３５から３７のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目３９）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖが、Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常ドメインまたはその部分に連結しており、前記ｓｃＦｖが重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、項目３４および３６から３８のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目４０）
ＥＧＦＲに結合するそれぞれのｓｃＦｖが、Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常ドメインまたはその部分に連結しており、前記ｓｃＦｖが重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、項目３３および３７から３９のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目４１）
前記ヒンジが、アミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙをさらに含む、項目３９または４０に記載のタンパク質。
（項目４２）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、項目３４および３６から４１のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目４３）
ＥＧＦＲに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、項目３３および３７から４２のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目４４）
前記ジスルフィド架橋が、Ｋａｂａｔナンバリングスキーム下で番号付けされる前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前記軽鎖可変ドメインのＣ１００との間に形成される、項目４２または４３に記載のタンパク質。
（項目４５）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが、フレキシブルリンカーを介して、前記軽鎖可変ドメインに連結している、項目３４および３６から４４のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目４６）
ＥＧＦＲに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが、フレキシブルリンカーを介して、前記軽鎖可変ドメインに連結している、項目３３および３７から４５のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目４７）
前記フレキシブルリンカーが（Ｇ _４ Ｓ） _４ （配列番号１１９）を含む、項目４５または４６に記載のタンパク質。
（項目４８）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが前記軽鎖可変ドメインのＣ末端に位置する、項目３４および３６から４７のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目４９）
ＥＧＦＲに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが前記軽鎖可変ドメインのＣ末端に位置する、項目３３および３７から４８のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目５０）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが前記軽鎖可変ドメインのＮ末端に位置する、項目３４および３６から４７のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目５１）
ＥＧＦＲに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが前記軽鎖可変ドメインのＮ末端に位置する、項目３３、３７から４８および５０のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目５２）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記Ｆａｂ断片が抗原結合部位と前記Ｆｃまたはその部分との間に位置しない、項目３３、４０から４１、４３から４４、４６から４７、４９および５１のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目５３）
ＥＧＦＲに結合するＦａｂ断片が抗原結合部位と前記Ｆｃまたはその部分との間に位置しない、項目３４、３６、３８から３９、４１から４２、４４から４５、４７から４８および５０のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目５４）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、それぞれ、配列番号８１、８２および１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、項目１から５３のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目５５）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、それぞれ、配列番号８１、８２および９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、項目５４に記載のタンパク質。
（項目５６）
前記第１の抗原結合部位の前記ＶＨが配列番号９５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第１の抗原結合部位の前記ＶＬが配列番号８５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目５４または５５に記載のタンパク質。
（項目５７）
前記第１の抗原結合部位の前記ＶＨが配列番号９５のアミノ酸配列を含み、前記第１の抗原結合部位の前記ＶＬが配列番号８５のアミノ酸配列を含む、項目５４から５６のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目５８）
前記抗体ＦｃドメインがヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む、項目１から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目５９）
前記抗体ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインである、項目１から５８のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目６０）
前記抗体Ｆｃドメインまたはその部分が、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２または配列番号１１８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目５９に記載のタンパク質。
（項目６１）
前記抗体Ｆｃドメインの少なくとも１つのポリペプチド鎖が、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９から選択される１つまたは複数の位置に１つまたは複数の変異を含む、項目５９または６０に記載のタンパク質。
（項目６２）
前記抗体Ｆｃドメインの少なくとも１つのポリペプチド鎖が、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＱ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９ＤおよびＫ４３９Ｅから選択される１つまたは複数の変異を含む、項目５９から６１のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目６３）
前記抗体重鎖定常領域の１つのポリペプチド鎖が、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９から選択される１つまたは複数の位置に１つまたは複数の変異を含み；前記抗体重鎖定常領域の他のポリペプチド鎖が、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９から選択される１つまたは複数の位置に１つまたは複数の変異を含む、項目５９から６２のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目６４）
前記抗体重鎖定常領域の１つのポリペプチド鎖が、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＫ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含み；前記抗体重鎖定常領域の他のポリペプチド鎖が、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含む、項目６３に記載のタンパク質。
（項目６５）
前記抗体重鎖定常領域の１つのポリペプチド鎖が、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＹ３４９Ｃ置換を含み；前記抗体重鎖定常領域の他のポリペプチド鎖が、配列番号１１８と比較して、ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされるＳ３５４Ｃ置換を含む、項目６３または６４に記載のタンパク質。
（項目６６）
（ａ）配列番号１６７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；
（ｂ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号１６５のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド
を含むタンパク質。
（項目６７）
（ａ）配列番号１６８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；
（ｂ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号１６５のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド
を含むタンパク質。
（項目６８）
（ａ）配列番号１６６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；
（ｂ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号１６５のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド
を含むタンパク質。
（項目６９）
前記項目のいずれか一項に記載のタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む製剤。
（項目７０）
項目１から６８のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含む細胞。
（項目７１）
腫瘍細胞死を増強する方法であって、腫瘍細胞およびナチュラルキラー細胞を、有効量の項目１から６８のいずれか一項に記載のタンパク質または項目６９に記載の製剤に曝露するステップを含み、前記腫瘍細胞がＥＧＦＲを発現する、方法。
（項目７２）
がんを処置する方法であって、有効量の項目１から６８のいずれか一項に記載のタンパク質または項目６９に記載の製剤をそれを必要とする患者に投与するステップを含む方法。
（項目７３）
前記がんが固形腫瘍である、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記がんが、肺がん、乳がん、腎臓がん、結腸直腸がん、胃がん、脳がん、神経膠腫、膀胱がん、頭頸部がん、膀胱がん、膵臓がんおよび肝臓がん、子宮頸がん、卵巣がんまたは前立腺がんである、項目７２または７３に記載の方法。
（項目７５）
前記がんがＥＧＦＲを発現する、項目７２から７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
配列番号１６７のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含む細胞。
（項目７７）
配列番号１６９のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含む細胞。
（項目７８）
精製タンパク質である、項目１から６８のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目７９）
遠心分離、深層濾過、細胞溶解、ホモジナイゼーション、凍結－解凍、アフィニティ精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーからなる群から選択される方法を使用して精製されている、項目７８に記載のタンパク質。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1】図１は、ヘテロ二量体多重特異性結合抗体、例えば、三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）を表す。各アームは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたは腫瘍関連抗原に対応する結合ドメインのいずれかを表すことができる。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび腫瘍関連抗原結合ドメインは共通の軽鎖を共有することができる。

【0045】

【図2-1】図２Ａ～２Ｅは、多重特異性結合タンパク質、例えば、三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）の５つの例示的なフォーマットを示す。図２Ａに示されるように、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたは腫瘍関連抗原結合ドメインのいずれかがｓｃＦｖフォーマットをとることができる（左アーム）。ＮＫＧ２Ｄ標的化ｓｃＦｖ、腫瘍関連抗原標的化Ｆａｂ断片、およびヘテロ二量体化抗体定常領域を含有する抗体は、本明細書ではＦ３－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。腫瘍関連抗原標的化ｓｃＦｖ、ＮＫＧ２Ｄ標的化Ｆａｂ断片、およびＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化抗体定常領域／ドメインを含有する抗体は、本明細書ではＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる（図２Ｅ）。図２Ｂに示されるように、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび腫瘍関連抗原結合ドメインの両方がｓｃＦｖフォーマットをとることができる。図２Ｃ～２Ｄは、腫瘍関連抗原に結合する２つの抗原結合部位およびヘテロ二量体化抗体定常領域に融合したＮＫＧ２Ｄ結合部位を含む３つの抗原結合部位を有する抗体を示す。これらの抗体フォーマットは、本明細書ではＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。図２Ｃは、２つの腫瘍関連抗原結合部位がＦａｂ断片フォーマットであり、ＮＫＧ２Ｄ結合部位がｓｃＦｖフォーマットであることを示している。図２Ｄは、腫瘍関連抗原結合部位がｓｃＦｖフォーマットであり、ＮＫＧ２Ｄ結合部位がｓｃＦｖフォーマットであることを示している。図２Ｅは、腫瘍標的化ｓｃＦｖ、ＮＫＧ２Ｄ標的化Ｆａｂ断片、およびＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化抗体定常領域／ドメイン（「ＣＤドメイン」）を含有する三重特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）を表す。抗体フォーマットは、本明細書ではＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。ある特定の例示的な多重特異性結合タンパク質では、抗体定常領域上のヘテロ二量体化変異が、一方の定常ドメイン上のＫ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ；ならびに反対の位置の定常ドメイン上のＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔを含む（ＣＤドメイン中に三角形の鍵と鍵穴の形状として示される）。Ｆａｂ断片の重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの間の太い棒はジスルフィド結合を表す。

【図2-2】同上。

【0046】

【図3】図３は、ＩｇＧ様形状を維持する三機能性二重特異性抗体であるＴｒｉｏｍａｂ形態のＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。このキメラは、２つの親抗体に由来する、それぞれ１つの軽鎖および１つの重鎖を有する２つの半抗体からなる。Ｔｒｉｏｍａｂ形態は、ラット抗体の１／２およびマウス抗体の１／２を含有するヘテロ二量体構築物であり得る。

【0047】

【図4】図４は、ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）（ＫＩＨ）技術を伴う、ＫｉＨ Ｃｏｍｍｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ形態のＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。ＫｉＨは、標的１および２に結合する２つのＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。ＫｉＨフォーマットのＴｒｉＮＫＥＴは、２つの異なる重鎖および両重鎖と対形成する共通の軽鎖を含有する、標的１および標的２に結合する２つのＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物であり得る。

【0048】

【図5】図５は、天然に存在するフレキシブルリンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせて、四価ＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））形態のＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。ＤＶＤ－Ｉｇ（商標）は、抗原２を標的化する可変ドメインが抗原１を標的化するＦａｂ断片の可変ドメインのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である。ＤＶＤ－Ｉｇ（商標）形態は通常のＦｃを含有する。

【0049】

【図6】図６は、Ｆｃに融合した、標的１および標的２に結合する２つのＦａｂ断片を含有するヘテロ二量体構築物である、直交Ｆａｂ断片界面（Ｏｒｔｈｏ－Ｆａｂ）形態のＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。軽鎖（ＬＣ）－重鎖（ＨＣ）対形成は直交界面によって確保される。ヘテロ二量体化はＦｃ中の変異によって確保される。

【0050】

【図7】図７は、２－ｉｎ－１ ＩｇフォーマットのＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。

【0051】

【図8】図８は、Ｆｃに融合した、標的１および標的２に結合する２つの異なるＦａｂ断片を含有するヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態のＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。ヘテロ二量体化はＦｃ中の静電ステアリング変異によって確保される。

【0052】

【図9】図９は、Ｆａｂアーム交換形態におけるＴｒｉＮＫＥＴを表す図である：重鎖および結合した軽鎖（半分子）を別の分子からの重鎖－軽鎖ペアと交換することによりＦａｂ断片アームを交換する抗体は、二重特異性抗体をもたらす。Ｆａｂアーム交換形態（ｃＦａｅ）は、標的１および２に結合する２つのＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。

【0053】

【図10】図１０は、標的１および２に結合する２つのＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である、ＳＥＥＤボディ形態（ＳＥＥＤ Ｂｏｄｙ ｆｏｒｍ）のＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。

【0054】

【図11】図１１は、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーが使用される、ＬｕＺ－Ｙ形態のＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。ＬｕＺ－Ｙ形態は、Ｆｃに融合した、標的１および２に結合する２つの異なるｓｃＦａｂを含有するヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、ＦｃのＣ末端に融合したロイシンジッパーモチーフによって確保される。

【0055】

【図12】図１２は、Ｃｏｖ－Ｘボディ形態のＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。

【0056】

【図13】図１３Ａ～１３Ｂは、抗原１を標的化する１つのＦａｂ断片がカッパＬＣを含有し、抗原２を標的化する第２のＦａｂ断片がラムダＬＣを含有する、ヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物である、κλボディ形態のＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。図１３Ａはκλボディの一形態の例示的な図であり；図１３Ｂは別のκλボディの例示的な図である。

【0057】

【図14】図１４は、共にＦｃドメインに融合している、標的１に結合するＦａｂ断片および標的２に結合するｓｃＦａｂを含む、Ｏａｓｃ－Ｆａｂヘテロ二量体構築物を表す図である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃドメイン中の変異によって確保される。

【0058】

【図15】図１５は、抗原１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されているＦｃを含有するヘテロ二量体構築物である、ＤｕｅｔＭａｂを表す図である。Ｆａｂ断片１および２は、正しい軽鎖および重鎖の対形成を確保する示差的Ｓ－Ｓ架橋を含有する。

【0059】

【図16】図１６は、標的１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを有するヘテロ二量体構築物である、Ｃｒｏｓｓ ｍＡｂを表す図である。ＣＬおよびＣＨ１ドメイン、ならびにＶＨおよびＶＬドメインが切り替えられ、例えば、ＣＨ１がＶＬとインラインで融合しており、ＣＬがＶＨとインラインで融合している。

【0060】

【図17】図１７は、抗原２に結合するＦａｂ断片が、抗原１に結合するＦａｂ断片のＨＣのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である、Ｆｉｔ－Ｉｇを表す図である。構築物は野生型Ｆｃを含有する。

【0061】

【図18】図１８は、ＶＨにＳ６２Ｒ置換（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下）を有するパニツムマブの構造モデリングを示す図であり、ここで、このＡｒｇとＶＬの１位のＡｓｐとの間の水素結合は、ＶＨ－ＶＬ界面の安定化に寄与し得る。

【0062】

【図19】図１９は、ＶＬにＦ８７Ｙ置換（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下）を有するパニツムマブの構造モデリングを示す図であり、ここで、このＴｙｒとＶＨの３９位のＧｌｎとの間の水素結合は、ＶＨ－ＶＬ界面の安定化に寄与し得る。

【0063】

【図20】図２０は、ＶＬにＤ９２Ｒ置換（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下）を有するパニツムマブの構造モデリングを示す図であり、ここで、このＡｒｇ（ＣＤＲＬ３中）とＶＬの３２位のＴｙｒ（ＣＤＲＬ１中）との間のファンデルワールス接触は、パラトープの安定化に寄与し得る。

【0064】

【図21】図２１は、ヒトＥＧＦＲへのＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１結合の滴定についてのＳＰＲセンサーグラムである。

【0065】

【図22】図２２は、ヒトＥＧＦＲへのＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－２結合の滴定についてのＳＰＲセンサーグラムである。

【0066】

【図23】図２３は、ヒトＥＧＦＲへのＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３結合の滴定についてのＳＰＲセンサーグラムである。

【0067】

【図24】図２４は、ヒトＥＧＦＲへのＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－４結合の滴定についてのＳＰＲセンサーグラムである。

【0068】

【図25】図２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｃおよび２５Ｄは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析によって決定される、それぞれ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．４のＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１（図２５Ａ）、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－２（図２５Ｂ）およびＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３（図２５Ｃ）についてのサーモグラムを示すプロットである。

【0069】

【図26】図２６Ａおよび２６Ｂは、ＤＳＣ分析によって決定される、それぞれ、２０ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭのトレハロース、０．０１％のＰＳ８０、ｐＨ６．０のＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３（図２６Ａ）およびＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－４（図２６Ｂ）についてのサーモグラムを示すプロットである。

【0070】

【図27】図２７は、ＥＧＦＲ陽性Ｈ２１７２がん細胞に対する、一連の濃度のＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１（「ＥＧＦＲ１」）、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－２（「ＥＧＦＲ２」）、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３（「ＥＧＦＲ３」）およびパニツムマブの結合親和性を示すプロットである。

【0071】

【図28】図２８は、一連の濃度のＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１（「ＥＧＦＲ１」）、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３（「ＥＧＦＲ３」）、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－４（「ＥＧＦＲ４」）およびセツキシマブの存在下でのＥＧＦＲ発現Ｈ２１７２がん細胞のＮＫ細胞媒介溶解を示すプロットである。

【0072】

【図29】図２９は、一連の濃度のＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３（「ＥＧＦＲ３」）、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－４（「ＥＧＦＲ４」）およびセツキシマブの存在下でのＥＧＦＲ陽性７８６－０がん細胞のＣＤ８^＋Ｔ細胞媒介溶解を示すプロットである。

【0073】

【図30】図３０は、一連の濃度のＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１（「ＥＧＦＲ１」）、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－２（「ＥＧＦＲ２」）、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３（「ＥＧＦＲ３」）およびセツキシマブの存在下でＥＧＦＲ陽性ＢＴ－４７４がん細胞とインキュベートした場合のＮＫ細胞からのＩＦＮ－γ産生を示すプロットである。

【0074】

【図31】図３１は、一連の濃度のＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１（「ＥＧＦＲ１」）、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３（「ＥＧＦＲ３」）およびセツキシマブの存在下でＥＧＦＲ陽性ＢＴ－４７４がん細胞とインキュベートした場合のＩＬ－２活性化ＮＫ細胞からのＩＦＮ－γ産生を示すプロットである。

【0075】

【図32】図３２は、一連の濃度のＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１（「ＥＧＦＲ１」）、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－２（「ＥＧＦＲ２」）、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３（「ＥＧＦＲ３」）、パニツムマブおよびセツキシマブの存在下での７２時間のＥＧＦＲ陽性細胞系の増殖を示すプロットである。

【0076】

【図33】図３３は、フローサイトメトリーによって測定される、一連の濃度のＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１（「ＥＧＦＲ１」）、ＦｃドメインにＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）変異を有するＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１のバリアント（「ＥＧＦＲ１－ＣＤ１６ｓｉ」）、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３（「ＥＧＦＲ３」）、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－４（「ＥＧＦＲ４」）およびセツキシマブの存在下での２時間のインキュベーション後の抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）の結果として、マクロファージによって貪食されたＥＧＦＲ発現標的細胞のパーセンテージを示すプロットである。

【0077】

【図34-1】図３４Ａ～３４Ｄは、示されるアイソタイプ対照またはＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴで処置されたＥＧＦＲ陽性ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞を異種移植されたヌードマウスにおける経時的な腫瘍体積を示すプロットである。図３４Ａは、示される時点で３００μｇ、１００μｇまたは３０μｇのＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴで処置されたマウスにおける腫瘍体積を示す。図３４Ｂは、示される時点で３００μｇのアイソタイプ対照またはＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴで処置されたマウスにおける腫瘍体積を示す。図３４Ｃは、示される時点で１００μｇのアイソタイプ対照またはＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴで処置されたマウスにおける腫瘍体積を示す。図３４Ｄは、示される時点で３０μｇのアイソタイプ対照またはＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴで処置されたマウスにおける腫瘍体積を示す。

【図34-2】同上。

【0078】

【図35】図３５Ａ～３５Ｂは、示されるアイソタイプ対照、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴまたはセツキシマブで処置されたＥＧＦＲ陽性ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞を異種移植されたヌードマウスにおける経時的な腫瘍体積または体重を示すプロットである。図３５Ａは、示される時点で１００μｇのアイソタイプ対照、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴまたはセツキシマブで処置されたマウスにおける腫瘍体積を示す。図３５Ｂは、示される時点で１００μｇのアイソタイプ対照、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴまたはセツキシマブで処置されたマウスにおける体重を示す。

【発明を実施するための形態】

【0079】

本願は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびにＥＧＦＲに結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＥＧＦＲに結合する追加の抗原結合部位をさらに含む。本願はまた、このような多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびにがんを処置するなどの目的のために、このような多重特異性結合タンパク質および医薬組成物を使用する治療方法を提供する。本願に記載される多重特異性結合タンパク質のさまざまな態様を以下の節で示すが、ある特定の節に記載される多重特異性結合タンパク質の態様は、いずれの特定の節にも限定されるべきではない。

【0080】

本願の理解を促進するために、いくつかの用語および句を以下で定義する。

【0081】

本明細書で使用される「ａ」および「ａｎ」という用語は「１つまたは複数」を意味し、文脈が不適切でない限り、複数形を含む。

【0082】

本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に参加する免疫グロブリン分子の部分を指す。ヒト抗体では、抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多様な範囲は「超可変領域」と呼ばれ、これらは「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知のより保存された隣接範囲の間に挿入されている。よって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間におよびこれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子では、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域が、抗原結合表面を形成するように三次元空間で互いに対して配置されている。抗原結合表面は、結合抗原の三次元表面と相補的であり、重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。ラクダおよび軟骨魚類などのある特定の動物では、抗原結合部位が単一抗体鎖によって形成されて、「単一ドメイン抗体」をもたらす。抗原結合部位は、インタクト抗体、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合断片、または単一ポリペプチドで重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインに接続するためのペプチドリンカーを使用したｓｃＦｖなどの組換えポリペプチドに存在することができる。

【0083】

本明細書で使用される「腫瘍関連抗原」という用語は、それだけに限らないが、がんに関連するタンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、脂質を含む任意の抗原を意味する。このような抗原は、悪性細胞上、または腫瘍関連血管、細胞外基質、間葉系間質もしくは免疫浸潤物などの腫瘍微小環境中で発現され得る。本開示のある特定の実施形態では、「腫瘍関連抗原」という用語はＥＧＦＲを指す。

【0084】

本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書に記載される方法および組成物によって処置される生物を指す。このような生物には、好ましくは、それだけに限らないが、哺乳動物（例えば、マウス、類人猿、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれ、より好ましくは、ヒトが含まれる。

【0085】

本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な化合物（例えば、本願に記載される化合物）の量を指す。有効量は、１回または複数回の投与、塗布または投与量で投与することができ、特定の製剤に限定されることも、投与経路に限定されることも意図していない。本明細書で使用される場合、「処置する」という用語は、状態、疾患、障害などの改善をもたらす、任意の効果、例えば軽減すること、減少させること、モジュレートすること、改善することもしくは排除すること、またはその症状を改善することを含む。

【0086】

本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、活性剤と、組成物をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの診断的または治療的使用に特に適したものにする、不活性または活性の担体の組合せを指す。

【0087】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝食塩溶液、水、エマルジョン（例えば、油／水型もしくは水／油型エマルジョンなど）、およびさまざまな種類の湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかを指す。組成物はまた、安定剤および保存剤を含むことができる。担体、安定剤およびアジュバントの例については、例えば、Ｍａｒｔｉｎ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１５ｔｈ Ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ． Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ ［１９７５］を参照されたい。

【0088】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、対象に投与すると、本願に記載される化合物またはその活性代謝産物もしくは残基を提供することができる、本願に記載される化合物の任意の薬学的に許容される塩（例えば、酸または塩基）を指す。当業者に公知のように、本願の化合物の「塩」は、無機酸または有機酸および無機塩基または有機塩基から得られ得る。例示的な酸としては、それだけに限らないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられる。シュウ酸などの他の酸も、それ自体は薬学的に許容されないが、本願の化合物およびその薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製に使用され得る。

【0089】

例示的な塩基としては、それだけに限らないが、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア、および式ＮＷ_４ ^＋（式中、ＷはＣ_１～４アルキルである）の化合物などが挙げられる。

【0090】

例示的な塩としては、それだけに限らないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩（ｆｌｕｃｏｈｅｐｔａｎｏａｔｅ）、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩などが挙げられる。塩の他の例としては、Ｎａ^＋、ＮＨ_４ ^＋およびＮＷ_４ ^＋（式中、ＷはＣ_１～４アルキル基である）等などの適切なカチオンと複合した本願の化合物のアニオンが挙げられる。

【0091】

治療的使用については、本願の化合物の塩が、薬学的に許容されるとして企図される。しかしながら、薬学的に許容されない酸および塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において用途を見出し得る。

【0092】

本明細書で使用される場合、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体、ＥｒｂＢ－１、またはヒトにおけるＨＥＲ１としても公知）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ００５３３（ヒト）のタンパク質、ならびに関連するアイソフォームおよびオルソログを指す。

【0093】

本明細書を通して、組成物が特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている場合、またはプロセスおよび方法が特定のステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている場合、さらに、列挙される成分から本質的になるまたはそれからなる組成物が存在すること、ならびに列挙される処理ステップから本質的になるまたはそれからなる本願によるプロセスおよび方法が存在することが企図される。

【0094】

一般に、パーセンテージを指定する組成物は、特に指定しない限り、重量による。さらに、変数が定義を伴わない場合、変数の前の定義が支配する。
Ｉ．タンパク質

【0095】

本願は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびにＥＧＦＲに結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、本明細書に記載される医薬組成物および治療方法に有用である。ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体への多重特異性結合タンパク質の結合によって、腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞の破壊に向けたナチュラルキラー細胞の活性が増強される。腫瘍抗原発現腫瘍細胞への多重特異性結合タンパク質の結合によって、これらの細胞をナチュラルキラー細胞に近づけ、ナチュラルキラー細胞による腫瘍細胞の直接的および間接的破壊が促進される。ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６および別の標的に結合する多重特異性結合タンパク質は、国際出願公開第ＷＯ２０１８１４８４４５号およびＷＯ２０１９１５７３６６号に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれない。一部の例示的な多重特異性結合タンパク質のさらなる説明を以下に提供する。

【0096】

多重特異性結合タンパク質の第１の成分はＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞に結合する抗原結合部位であり、該細胞は、それだけに限らないが、ＮＫ細胞、γδＴ細胞およびＣＤ８^＋αβＴ細胞を含み得る。ＮＫＧ２Ｄに結合すると、多重特異性結合タンパク質は、ＵＬＢＰ６およびＭＩＣＡなどの天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合してＮＫ細胞を活性化するのを遮断し得る。

【0097】

多重特異性結合タンパク質の第２の成分はＥＧＦＲに結合する抗原結合部位である。ＥＧＦＲ発現細胞は、例えば、固形腫瘍、例えば、肺がん、乳がん、腎臓がん、結腸直腸がん、胃がん、脳がん、神経膠腫、膀胱がん、頭頸部がん、膀胱がん、膵臓がんおよび肝臓がん、子宮頸がん、卵巣がんまたは前立腺がんなどの適応症で見出され得る。ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、パニツムマブに由来する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＥＧＦＲに対する熱安定性を増加させ、それに対する親和性を保持するＶＨおよびＶＬにおける変異を有する。

【0098】

多重特異性結合タンパク質の第３の成分は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、肥満細胞および濾胞樹状細胞を含む白血球の表面上のＦｃ受容体であるＣＤ１６を発現する細胞に結合する抗体Ｆｃドメインもしくはその部分または抗原結合部位である。

【0099】

多重特異性結合タンパク質の追加の抗原結合部位は、同じ腫瘍関連抗原（ＥＧＦＲ）に結合してもよい。ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位はｓｃＦｖであり、ＥＧＦＲに結合する第２のおよび追加の抗原結合部位はそれぞれＦａｂ断片である。ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位はｓｃＦｖであり、ＥＧＦＲに結合する第２のおよび追加の抗原結合部位はそれぞれｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位はＦａｂ断片であり、ＥＧＦＲに結合する第２のおよび追加の抗原結合部位はそれぞれｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位はＦａｂであり、ＥＧＦＲに結合する第２のおよび追加の抗原結合部位はそれぞれＦａｂ断片である。

【0100】

抗原結合部位はそれぞれ、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよく（例えば、抗体のように配置される、または一緒に融合してｓｃＦｖを形成する）、または抗原結合部位の１つもしくは複数が、単一ドメイン抗体、例えばラクダ抗体のようなＶ_ＨＨ抗体もしくは軟骨魚類で見られる抗体のようなＶ_ＮＡＲ抗体であってもよい。

【0101】

一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、第１の抗原結合部位に存在する軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインが組み込まれる。

【0102】

本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質はさまざまなフォーマットをとることができる。例えば、１つのフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン軽鎖、第２の免疫グロブリン重鎖および第２の免疫グロブリン軽鎖を含むヘテロ二量体多重特異性抗体である（図１）。第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインポリペプチド、第１の重鎖可変ドメインおよび必要に応じて、第１のＣＨ１重鎖ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の軽鎖可変ドメインおよび必要に応じて、第１の軽鎖定常ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の免疫グロブリン重鎖と一緒になって、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位を形成する。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインポリペプチド、第２の重鎖可変ドメインおよび必要に応じて、第２のＣＨ１重鎖ドメインを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の軽鎖可変ドメインおよび必要に応じて、第２の軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン重鎖と一緒になって、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、第１のＦｃドメインポリペプチドおよび第２のＦｃドメインポリペプチドは一緒になって、ＣＤ１６に結合することができる（図１）。一部の実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖は第２の免疫グロブリン軽鎖と同一である。

【0103】

別の例示的なフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第２の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含むヘテロ二量体多重特異性抗体を伴う（例えば、図２Ａ）。一部の実施形態では、第１の免疫グロブリン重鎖は、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して、対形成し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、またはＥＧＦＲに結合する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインで構成された一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）に融合した第１のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインポリペプチドを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインポリペプチド、第２の重鎖可変ドメインおよびＣＨ１重鎖ドメインを含む。免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む。一部の実施形態では、第２の免疫グロブリン重鎖は免疫グロブリン軽鎖と対形成し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、またはＥＧＦＲに結合し、ただし、第１のＦｃドメインポリペプチドがＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖに融合する場合、第２の免疫グロブリン重鎖は、ＥＧＦＲに結合するがＮＫＧ２Ｄに結合しない、およびその逆の免疫グロブリン軽鎖と対形成する。一部の実施形態では、第１の免疫グロブリン重鎖中のｓｃＦｖはＥＧＦＲに結合し、第２の免疫グロブリン重鎖中の重鎖可変ドメインおよび免疫グロブリン軽鎖中の軽鎖可変ドメインは、対形成する場合、ＮＫＧ２Ｄに結合する（例えば、図２Ｅ）。一部の実施形態では、第１の免疫グロブリン重鎖中のｓｃＦｖはＮＫＧ２Ｄに結合し、第２の免疫グロブリン重鎖中の重鎖可変ドメインおよび免疫グロブリン軽鎖中の軽鎖可変ドメインは、対形成する場合、ＥＧＦＲに結合する。一部の実施形態では、第１のＦｃドメインポリペプチドおよび第２のＦｃドメインポリペプチドは一緒になって、ＣＤ１６に結合することができる（例えば、図２Ａ）。

【0104】

別の例示的なフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖および第２の免疫グロブリン重鎖を含むヘテロ二量体多重特異性抗体を伴う（例えば、図２Ｂ）。一部の実施形態では、第１の免疫グロブリン重鎖は、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して、対形成し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、またはＥＧＦＲに結合する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインで構成された一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）に融合した第１のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第２の免疫グロブリン重鎖は、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して、対形成し、ＮＫＧ２ＤまたはＥＧＦＲに結合する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインで構成された一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）に融合した第２のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインポリペプチドを含み、ただし、第１のＦｃドメインポリペプチドがＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖに融合する場合、第２のＦｃドメインポリペプチドは、ＥＧＦＲに結合するがＮＫＧ２Ｄに結合しない、およびその逆のｓｃＦｖに融合する。一部の実施形態では、第１のＦｃドメインポリペプチドおよび第２のＦｃドメインポリペプチドは一緒になって、ＣＤ１６に結合することができる（例えば、図２Ｂ）。

【0105】

一部の実施形態では、上記の一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）はヒンジ配列を介して抗体定常ドメインに連結している。一部の実施形態では、ヒンジはアミノ酸Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒを含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖ（例えば、ＥＧＦＲに結合するｓｃＦｖまたはＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ）および抗体重鎖定常ドメインを接続するヒンジは、アミノ酸Ａｌａ－Ｓｅｒを含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖ（例えば、ＥＧＦＲに結合するｓｃＦｖまたはＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ）および抗体重鎖定常ドメインを接続するヒンジは、アミノ酸Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含む。一部の他の実施形態では、ヒンジはアミノ酸Ａｌａ－ＳｅｒおよびＴｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙを含む。ヒンジ配列は、標的抗原への結合の柔軟性を提供し、柔軟性と最適な形状寸法との間のバランスをとることができる。

【0106】

一部の実施形態では、上記の一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）は重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成して、ｓｃＦｖの安定性を増強する。例えば、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４残基と軽鎖可変ドメインのＣ１００残基との間に形成され得、アミノ酸位置はＫａｂａｔで番号付けされる。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインはフレキシブルリンカーを介して軽鎖可変ドメインに連結している。任意の適切なリンカー、例えば、（Ｇ_４Ｓ）_４リンカー（（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）_４（配列番号１１９））を使用することができる。ｓｃＦｖの一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは軽鎖可変ドメインのＮ末端に位置する。ｓｃＦｖの一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは軽鎖可変ドメインのＣ末端に位置する。

【0107】

本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質は、１つまたは複数の追加の抗原結合部位をさらに含むことができる。追加の抗原結合部位（複数可）は、必要に応じてリンカー配列を介して、定常領域ＣＨ２ドメインのＮ末端または定常領域ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合し得る。ある特定の実施形態では、追加の抗原結合部位（複数可）は、必要に応じてジスルフィド安定化されている一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）の形態をとって、四価または三価多重特異性結合タンパク質をもたらす。例えば、多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位、ＥＧＦＲに結合する第２の抗原結合部位、ＥＧＦＲに結合する追加の抗原結合部位、およびＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常領域もしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第４の抗原結合部位を含む。これらの抗原結合部位のいずれか１つは、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ、例えば上記のｓｃＦｖの形態をとることができる。

【0108】

一部の実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位とは異なるＥＧＦＲのエピトープに結合する。一部の実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位と同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位と同じ重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位と同じ重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を含む。一部の実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位と同じアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列とは異なる重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を含む。一部の実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位の配列と異なるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第２の抗原結合部位および追加の抗原結合部位は、異なる腫瘍関連抗原に結合する。一部の実施形態では、第２の抗原結合部位および追加の抗原結合部位は、異なる抗原に結合する。例示的なフォーマットを図２Ｃおよび図２Ｄに示す。したがって、多重特異性結合タンパク質は、ＥＧＦＲの二価の結合（ｂｉｖａｌｅｎｔ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）を提供することができる。多重特異性結合タンパク質によるＥＧＦＲの二価の結合は、腫瘍細胞表面上のＥＧＦＲを安定化し、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を増強することができる。多重特異性結合タンパク質によるＥＧＦＲの二価の結合は、腫瘍細胞への多重特異性結合タンパク質のより強力な結合を付与し、それによって、腫瘍細胞に対する、特に低レベルのＥＧＦＲを発現している腫瘍細胞に対するＮＫ細胞のより強力な細胞傷害性応答を促進することができる。

【0109】

多重特異性結合タンパク質は、追加のフォーマットをとることができる。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＩｇＧ様形状を維持する三機能性二重特異性抗体である、Ｔｒｉｏｍａｂ形態である。このキメラは、２つの親抗体に由来する、それぞれ１つの軽鎖および１つの重鎖を有する２つの半抗体からなる。

【0110】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質はＫｉＨ形態であり、ノブイントゥホール（ＫｉＨ）技術が関与する。ＫｉＨは、Ｃ_Ｈ３ドメインを操作して、各重鎖に「ノブ」または「ホール」のいずれかを作製して、ヘテロ二量体化を促進することを伴う。「ノブイントゥホール（ＫｉＨ）」Ｆｃ技術の裏にある概念は、小さな残基を嵩高い残基で置換することにより（例えば、ＥＵナンバリングのＴ３６６Ｗ_ＣＨ３Ａ）、「ノブ」を一方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ａ）に導入することであった。「ノブ」を収容するために、ノブに最も近い隣接残基を小さな残基で置き換えることにより（例えば、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ_ＣＨ３Ｂ）、相補的な「ホール」面が他方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ｂ）上に作製された。「ホール」変異は、構造に指南されたファージライブラリークリーニングによって最適化された（Ａｔｗｅｌｌ Ｓ、Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ、Ｗｅｌｌｓ ＪＡ、Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．、Ｓｔａｂｌｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ ｆｒｏｍ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｏｆ ａ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （１９９７） ２７０（１）：２６－３５）。ＫｉＨ ＦｃバリアントのＸ線結晶構造（Ｅｌｌｉｏｔｔ ＪＭ、Ｕｌｔｓｃｈ Ｍ、Ｌｅｅ Ｊ、Ｔｏｎｇ Ｒ、Ｔａｋｅｄａ Ｋ、Ｓｐｉｅｓｓ Ｃ、ｅｔ ａｌ．、Ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｎｏｂ ａｎｄ ｈｏｌｅ ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｈａｌｆ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ＣＨ２－ＣＨ３ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （２０１４） ４２６（９）：１９４７－５７；Ｍｉｍｏｔｏ Ｆ、Ｋａｄｏｎｏ Ｓ、Ｋａｔａｄａ Ｈ、Ｉｇａｗａ Ｔ、Ｋａｍｉｋａｗａ Ｔ、Ｈａｔｔｏｒｉ Ｋ． Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ＦｃγＲｓ． Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０１４） ５８（１）：１３２－８）によって、ヘテロ二量体化が、ＣＨ３ドメイン間コア界面で立体相補性によって駆動される疎水性相互作用によって熱力学的に好まれる一方で、ノブ－ノブおよびホール－ホール界面は、それぞれ、立体障害および好ましい相互作用の破壊のためにホモ二量体化を好まないことが実証された。

【0111】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、天然に存在するフレキシブルリンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせて、四価ＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））形態である。

【0112】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、直交Ｆａｂ界面（Ｏｒｔｈｏ－Ｆａｂ）形態である。ｏｒｔｈｏ－Ｆａｂ ＩｇＧ手法（Ｌｅｗｉｓ ＳＭ、Ｗｕ Ｘ、Ｐｕｓｔｉｌｎｉｋ Ａ、Ｓｅｒｅｎｏ Ａ、Ｈｕａｎｇ Ｆ、Ｒｉｃｋ ＨＬ、ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｆａｂ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２０１４） ３２（２）：１９１－８）では、構造に基づく領域設計が、他方のＦａｂ断片にいかなる変化も与えることなく、一方のＦａｂ断片のみにＬＣおよびＨＣ_{ＶＨ－ＣＨ１}界面での相補的変異を導入する。

【0113】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２－ｉｎ－１ Ｉｇフォーマットである。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合した、標的１および標的２に結合する２つの異なるＦａｂ断片を含有するヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態である。ヘテロ二量体化はＦｃ中の静電ステアリング変異によって確保される。

【0114】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原１を標的化するＦａｂ断片１がカッパＬＣを含有し、抗原２を標的化するＦａｂ断片２がラムダＬＣを含有する、ヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物である、κλボディ形態である。図１３Ａはκλボディの一形態の例示的な図であり；図１３Ｂは別のκλボディの例示的な図である。

【0115】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質はＦａｂ断片アーム交換形態である（重鎖および結合した軽鎖（半分子）を別の分子からの重鎖－軽鎖ペアと交換することによりＦａｂアームを交換する抗体は、二重特異性抗体をもたらす）。

【0116】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質はＳＥＥＤボディ形態である。鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）プラットフォームは、天然抗体の治療用途を拡大する機能であり、非対称および二重特異性抗体様分子を生成するために設計された。このタンパク質操作プラットフォームは、保存されたＣＨ３ドメイン内の免疫グロブリンの構造的に関連する配列の交換に基づく。ＳＥＥＤ設計は、ＡＧおよびＧＡ ＳＥＥＤ ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を退ける一方で、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の効率的な生成を可能にする（Ｍｕｄａ Ｍ． ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ． Ｓｅｌ． （２０１１、２４（５）：４４７－５４））。

【0117】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質はＬｕＺ－Ｙ形態である、そこでは、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーが使用される（Ｗｒａｎｉｋ、ＢＪ． ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （２０１２）、２８７：４３３３１－９）。

【0118】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質はＣｏｖ－Ｘボディ形態である。二重特異性ＣｏｖＸボディでは、２つの異なるペプチドが分岐アゼチジノンリンカーを使用して結合されて、部位特異的に温和な条件下で足場抗体に融合されている。ファーマコフォアは機能的活性を担う一方、抗体足場は長い半減期およびＩｇ様分布を与える。ファーマコフォアは、化学的に最適化することができる、または他のファーマコフォアで置き換えて、最適化されたもしくは特有の二重特異的抗体を生成することができる（Ｄｏｐｐａｌａｐｕｄｉ ＶＲ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ （２０１０）、１０７（５２）；２２６１１－２２６１６）。

【0119】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合している、標的１に結合するＦａｂ断片および標的２に結合するｓｃＦａｂを含む、Ｏａｓｃ－Ｆａｂヘテロ二量体形態である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃ中の変異によって確保される。

【0120】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体構築物である、ＤｕｅｔＭａｂ形態である。Ｆａｂ断片１および２は、正しいＬＣおよびＨＣの対形成を確保する示差的Ｓ－Ｓ架橋を含有する。

【0121】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ヘテロ二量体化によって安定化されたＦｃに融合した、標的１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂ形態である。ＣＬおよびＣＨ１ドメイン、ならびにＶＨおよびＶＬドメインが切り替えられ、例えば、ＣＨ１がＶＬとインフレームで融合しており、ＣＬがＶＨとインフレームで融合している。

【0122】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原２に結合するＦａｂ断片が、抗原１に結合するＦａｂ断片のＨＣのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である、Ｆｉｔ－Ｉｇ形態である。構築物は野生型Ｆｃを含有する。

【0123】

多重特異性結合タンパク質の個々の成分を下記により詳細に記載する。
ＮＫＧ２Ｄ結合部位

【0124】

ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体ならびにＥＧＦＲへの結合の際に、多重特異性結合タンパク質は、１種より多くのＮＫ活性化受容体と結合することができ、ＮＫＧ２Ｄへの天然リガンドの結合を遮断し得る。一部の実施形態では、タンパク質は、ヒトならびにげっ歯類およびカニクイザルなどの他の種のＮＫ細胞を刺激することができる。一部の実施形態では、タンパク質は、ヒトならびにカニクイザルなどの他の種のＮＫ細胞を刺激することができる。

【0125】

表１は、組み合わせて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列挙している。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインはＦａｂフォーマットに配置される。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは一緒に融合して、ｓｃＦｖを形成する。

【0126】

表１に列挙されるＮＫＧ２Ｄ結合部位は、ＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性が異なり得るにもかかわらず、全てヒトＮＫ細胞を活性化する。

【0127】

特に指示しない限り、表１に提供されるＣＤＲ配列はＫａｂａｔナンバリングで決定される。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1-9】

【0128】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ（例えば、ヒトＮＫＧ２Ｄ）に結合する第１の抗原結合部位は、表１に開示される抗体のＶＨと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および表１に開示される同じ抗体のＶＬと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、表１に開示される抗体のＶＨおよびＶＬ配列の、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１－３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ参照）、Ｃｈｏｔｈｉａ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ ＆ Ｌｅｓｋ Ａ Ｍ、（１９８７）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６： ９０１－９１７参照）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ Ｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．、（１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２： ７３２－７４５参照）または当技術分野において公知の任意の他のＣＤＲ決定方法で決定される、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、表１に開示される抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。

【0129】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、例えば、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を有する、ならびに／または配列番号１のＣＤＲ１（配列番号２）、ＣＤＲ２（配列番号３）およびＣＤＲ３（配列番号４）配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことによって、配列番号１に由来する重鎖可変ドメインを含む。配列番号１に関連する重鎖可変ドメインをさまざまな軽鎖可変ドメインと連結して、ＮＫＧ２Ｄ結合部位を形成することができる。例えば、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインが組み込まれる第１の抗原結合部位は、配列番号５、６、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および４６に由来する配列から選択される軽鎖可変ドメインがさらに組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインならびに配列番号５、６、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および４６から選択される配列のいずれか１つと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインが組み込まれる。

【0130】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３２と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号２７または２８、２９および３０または３１（例えば、それぞれ、配列番号２７、２９および３０、またはそれぞれ、配列番号２８、２９および３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ、配列番号３３、３４および３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ、配列番号２７または２８、２９および３０または３１（例えば、それぞれ、配列番号２７、２９および３０、またはそれぞれ、配列番号２８、２９および３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号３３、３４および３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

【0131】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４２と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号３７または３８、３９および４０または４１（例えば、それぞれ、配列番号３７、３９および４０、またはそれぞれ、配列番号３８、３９および４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ、配列番号４３、４４および４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ、配列番号３７または３８、３９および４０または４１（例えば、それぞれ、配列番号３７、３９および４０、またはそれぞれ、配列番号３８、３９および４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号４３、４４および４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

【0132】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号２７、２９および４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ、配列番号５０、３４および５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ、配列番号２７、２９および４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号５０、３４および５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

【0133】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号５３または５４、５５および５６または５７（例えば、それぞれ、配列番号５３、５５および５６、またはそれぞれ、配列番号５４、５５および５７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ、配列番号５９、６０および６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ、配列番号５３または５４、５５および５６または５７（例えば、それぞれ、配列番号５３、５５および５６、またはそれぞれ、配列番号５４、５５および５７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号５９、６０および６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

【0134】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６８と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号６３または６４、６５および６６または６７（例えば、それぞれ、配列番号６３、６５および６６、またはそれぞれ、配列番号６４、６５および６７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ、配列番号５９、６０および６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ、配列番号６３または６４、６５および６６または６７（例えば、それぞれ、配列番号６３、６５および６６、またはそれぞれ、配列番号６４、６５および６７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号５９、６０および６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

【0135】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号８９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号９２と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号５３または５４、５５および９０または９１（例えば、それぞれ、配列番号５３、５５および９０、またはそれぞれ、配列番号５４、５５および９１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ、配列番号９３、４４および９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ、配列番号５３または５４、５５および９０または９１（例えば、それぞれ、配列番号５３、５５および９０、またはそれぞれ、配列番号５４、５５および９１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号９３、４４および９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

【0136】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号７１または１１５、７２および７３または７４（例えば、それぞれ、配列番号７１、７２および７３、またはそれぞれ、配列番号１１５、７２および７４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ、配列番号７６、７７および７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ、配列番号７１または１１５、７２および７３または７４（例えば、それぞれ、配列番号７１、７２および７３、またはそれぞれ、配列番号１１５、７２および７４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号７６、７７および７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

【0137】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号７９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号８０または８１、８２および８３または８４（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２および８３、またはそれぞれ、配列番号８１、８２および８４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ、配列番号８０または８１、８２および８３または８４（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２および８３、またはそれぞれ、配列番号８１、８２および８４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

【0138】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号９５のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号８０または８１、８２および９６または９７（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２および９６、またはそれぞれ、配列番号８１、８２および９７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ、配列番号８０または８１、８２および９６または９７（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２および９６、またはそれぞれ、配列番号８１、８２および９７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

【0139】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号９８のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号８０または８１、８２および９９または１００（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２および９９、またはそれぞれ、配列番号８１、８２および１００）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ、配列番号８０または８１、８２および９９または１００（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２および９９、またはそれぞれ、配列番号８１、８２および１００）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

【0140】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号１０１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号８０または８１、８２および１０２または１０３（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２および１０２、またはそれぞれ、配列番号８１、８２および１０３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ、配列番号８０または８１、８２および１０２または１０３（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２および１０２、またはそれぞれ、配列番号８１、８２および１０３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

【0141】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号８０または８１、８２および１０５または１０６（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２および１０５、またはそれぞれ、配列番号８１、８２および１０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ、配列番号８０または８１、８２および１０５または１０６（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２および１０５、またはそれぞれ、配列番号８１、８２および１０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

【0142】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号１０７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号８０または８１、８２および１０８または１０９（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２および１０８、またはそれぞれ、配列番号８１、８２および１０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ、配列番号８０または８１、８２および１０８または１０９（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２および１０８、またはそれぞれ、配列番号８１、８２および１０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

【0143】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号１１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号８０または８１、８２および１１１または１１２（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２および１１１、またはそれぞれ、配列番号８１、８２および１１２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ、配列番号８０または８１、８２および１１１または１１２（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２および１１１、またはそれぞれ、配列番号８１、８２および１１２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号８６、７７および８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

【0144】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号１１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１１４と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0145】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号１１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１１７と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0146】

多重特異性結合タンパク質はＮＫＧ２Ｄ発現細胞に結合することができ、これらの細胞は、それだけに限らないが、ＮＫ細胞、γδＴ細胞およびＣＤ８^＋αβＴ細胞を含む。ＮＫＧ２Ｄに結合すると、多重特異性結合タンパク質は、ＵＬＢＰ６およびＭＩＣＡなどの天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合してＮＫ細胞を活性化するのを遮断し得る。

【0147】

多重特異性結合タンパク質は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、肥満細胞および濾胞樹状細胞を含む白血球の表面上のＦｃ受容体であるＣＤ１６を発現している細胞に結合する。本開示に記載されるタンパク質は、２ｎＭ～１２０ｎＭ、例えば、２ｎＭ～１１０ｎＭ、２ｎＭ～１００ｎＭ、２ｎＭ～９０ｎＭ、２ｎＭ～８０ｎＭ、２ｎＭ～７０ｎＭ、２ｎＭ～６０ｎＭ、２ｎＭ～５０ｎＭ、２ｎＭ～４０ｎＭ、２ｎＭ～３０ｎＭ、２ｎＭ～２０ｎＭ、２ｎＭ～１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約１４ｎＭ、約１３ｎＭ、約１２ｎＭ、約１１ｎＭ、約１０ｎＭ、約９ｎＭ、約８ｎＭ、約７ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４．５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、約０．５ｎＭ～約１ｎＭ、約１ｎＭ～約２ｎＭ、約２ｎＭ～３ｎＭ、約３ｎＭ～４ｎＭ、約４ｎＭ～約５ｎＭ、約５ｎＭ～約６ｎＭ、約６ｎＭ～約７ｎＭ、約７ｎＭ～約８ｎＭ、約８ｎＭ～約９ｎＭ、約９ｎＭ～約１０ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約２ｎＭ～約１０ｎＭ、約３ｎＭ～約１０ｎＭ、約４ｎＭ～約１０ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約６ｎＭ～約１０ｎＭ、約７ｎＭ～約１０ｎＭまたは約８ｎＭ～約１０ｎＭの間のＫ_Ｄの親和性でＮＫＧ２Ｄに結合する。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、１０～６２ｎＭのＫ_ＤでＮＫＧ２Ｄに結合する。
ＥＧＦＲ結合部位

【0148】

一態様では、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびにＥＧＦＲに結合する多重特異性結合タンパク質であって、ＥＧＦＲ結合部位が、パニツムマブに由来する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨおよびＶＬに変異を有する、多重特異性結合タンパク質を提供する。本開示に記載されるＶＨおよびＶＬ配列において個々にまたは組み合わせて企図される変異は、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で、ＶＨにおけるＳ６２Ｒ、ＶＬにおけるＤ９２Ｒ、および／またはＶＬにおけるＦ８７Ｙを含む。これらの変異が、抗原結合部位の熱安定性を増加させ、ＥＧＦＲに対するその親和性を保持することを発見した。表２は、ＥＧＦＲに結合することができる、重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメインおよびｓｃＦｖ配列の一部の例示的な配列を列挙している。ＣＤＲ配列は、示される通りＣｈｏｔｈｉａナンバリング下で同一である。太字の残基は変異した残基を示し、イタリック体の配列はポリペプチドリンカーを示す。

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【0149】

ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位のアミノ酸配列は、ＶＬ（例えば、配列番号１３９、１４７または１５０）のＣ末端に追加のアルギニン（Ｒ）残基を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＶＬアミノ酸配列のＣ末端に追加のアルギニン（Ｒ）残基を含有するＶＬアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。

【0150】

ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位のアミノ酸配列は、パニツムマブの配列と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で、ＶＨにおけるＳ６２Ｒ、ＶＬにおけるＤ９２Ｒ、およびＶＬにおけるＦ８７Ｙから選択される１つまたは複数の変異を含む。ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲ（例えば、ヒトＥＧＦＲ）に結合する第２の抗原結合部位は、表１に開示されるＥＧＦＲ－バインダー１のＶＨと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および表１に開示されるＥＧＦＲ－バインダー１のＶＬと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲ（例えば、ヒトＥＧＦＲ）に結合する第２の抗原結合部位は、表２に開示されるＥＧＦＲ－バインダー２、ＥＧＦＲ－バインダー３またはＥＧＦＲ－バインダー４のＶＨと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および表２に開示されるＥＧＦＲ－バインダー２、ＥＧＦＲ－バインダー３またはＥＧＦＲ－バインダー４のＶＬと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、表２に開示されるＥＧＦＲ－バインダー２、ＥＧＦＲ－バインダー３またはＥＧＦＲ－バインダー４のＶＨおよびＶＬ配列の、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１－３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ参照）、Ｃｈｏｔｈｉａ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ ＆ Ｌｅｓｋ Ａ Ｍ、（１９８７）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６： ９０１－９１７参照）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ Ｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．、（１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２： ７３２－７４５参照）または当技術分野において公知の任意の他のＣＤＲ決定方法で決定される、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、表２に開示されるＥＧＦＲ－バインダー２、ＥＧＦＲ－バインダー３またはＥＧＦＲ－バインダー４の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。

【0151】

ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位のアミノ酸配列は、パニツムマブの配列と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で、ＶＨにおけるＳ６２ＲおよびＶＬにおけるＦ８７Ｙの変異を含む。ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１３５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１３９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１４５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号１４７と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、表２に開示されるＥＧＦＲ－バインダー２のＶＨおよびＶＬ配列の、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１－３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ参照）、Ｃｈｏｔｈｉａ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ ＆ Ｌｅｓｋ Ａ Ｍ、（１９８７）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６： ９０１－９１７参照）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ Ｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．、（１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２： ７３２－７４５参照）または当技術分野において公知の任意の他のＣＤＲ決定方法で決定される、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号１３６、１４６および１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ、配列番号１４０、１４１および１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ、配列番号１３６、１４６および１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号１４０、１４１および１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１４８または１４９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１４８または１４９と同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１４８と同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１４９と同一のアミノ酸配列を含む。

【0152】

ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位のアミノ酸配列は、パニツムマブの配列と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で、ＶＨにおけるＳ６２Ｒ、ＶＬにおけるＦ８７Ｙ、およびＶＬにおけるＤ９２Ｒの変異を含む。ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１３５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１３９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１４５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号１５０と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１７０を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号１７１を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、表２に開示されるＥＧＦＲ－バインダー３のＶＨおよびＶＬ配列の、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１－３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ参照）、Ｃｈｏｔｈｉａ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ ＆ Ｌｅｓｋ Ａ Ｍ、（１９８７）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６： ９０１－９１７参照）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ Ｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．、（１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２： ７３２－７４５参照）または当技術分野において公知の任意の他のＣＤＲ決定方法で決定される、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号１３６、１４６および１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ、配列番号１４０、１４１および１５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ、配列番号１３６、１４６および１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号１４０、１４１および１５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１５２または１５３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１５２または１５３と同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１５２と同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１５３と同一のアミノ酸配列を含む。

【0153】

ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位のアミノ酸配列は、パニツムマブの配列と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で、ＶＬにおけるＦ８７Ｙ、およびＶＬにおけるＤ９２Ｒの変異を含む。ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１３５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１３９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１３５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号１５０と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、表２に開示されるＥＧＦＲ－バインダー４のＶＨおよびＶＬ配列の、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１－３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ参照）、Ｃｈｏｔｈｉａ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ ＆ Ｌｅｓｋ Ａ Ｍ、（１９８７）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６： ９０１－９１７参照）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ Ｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．、（１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２： ７３２－７４５参照）または当技術分野において公知の任意の他のＣＤＲ決定方法で決定される、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号１３６、１３７および１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ、配列番号１４０、１４１および１５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ、配列番号１３６、１３７および１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号１４０、１４１および１５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１５４または１５５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１５４と同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１５５と同一のアミノ酸配列を含む。

【0154】

ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位のアミノ酸配列は、パニツムマブの配列と比較して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下で、ＶＬにおけるＦ８７Ｙ、およびＶＬにおけるＤ９２Ｒ、および必要に応じてＶＨにおけるＳ６２Ｒの変異を含む。ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１３５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１３９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１５６と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号１５０と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、表２に開示されるコンセンサスＶＨおよびＶＬ配列の、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１－３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ参照）、Ｃｈｏｔｈｉａ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ ＆ Ｌｅｓｋ Ａ Ｍ、（１９８７）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６： ９０１－９１７参照）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ Ｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．、（１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２： ７３２－７４５参照）または当技術分野において公知の任意の他のＣＤＲ決定方法で決定される、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ、配列番号１３６、１５７および１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ、配列番号１４０、１４１および１５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ、配列番号１３６、１５７および１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号１４０、１４１および１５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１５８または１５９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１５８と同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１５９と同一のアミノ酸配列を含む。

【0155】

あるいは、ＥＧＦＲ、そのアイソフォーム、そのバリアント、その成熟細胞外断片、またはＥＧＦＲのドメインを含有する断片のアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることにより、ＥＧＦＲに結合することができる新規な抗原結合部位を同定することができる。

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【0156】

一部の実施形態では、配列番号１６０～１６３によって定義されるアミノ酸配列、そのバリアント、その成熟細胞外断片、またはＥＧＦＲのドメインを含有する断片への結合についてスクリーニングすることにより、ＥＧＦＲに結合することができる新規な抗原結合部位を同定することができる。

【0157】

前記実施形態のそれぞれでは、ＥＧＦＲに結合するｓｃＦｖ、ＶＨおよび／またはＶＬ配列が、ＥＧＦＲに結合するそれらの能力に影響を及ぼすことなく、ＶＨおよび／またはＶＬのフレームワーク領域にアミノ酸の変更（例えば、少なくとも１、２、３、４、５または１０のアミノ酸置換、欠失または付加）を含有し得ることが本明細書で企図される。例えば、ＥＧＦＲに結合するｓｃＦｖ、ＶＨおよび／またはＶＬ配列が、システインヘテロ二量体化変異を含有して、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のジスルフィド架橋の形成を促進し得ることが本明細書で企図される。

【0158】

ある特定の実施形態では、本明細書に開示される多重特異性結合タンパク質の第２の抗原結合部位は、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭもしくは４ｎＭ未満またはそれに等しいＫ_Ｄ値（それよりも大きいまたはそれに等しい親和性）でヒトＥＧＦＲまたはその細胞外領域に結合する。ある特定の実施形態では、本出願の抗原結合部位は、４ｎＭ未満またはそれに等しいＫ_Ｄ値（それよりも大きいまたはそれに等しい親和性）でヒトＥＧＦＲまたはその細胞外領域に結合する。ある特定の実施形態では、本出願の抗原結合部位は、約２．０ｎＭ、２．１ｎＭ、２．２ｎＭ、２．３ｎＭ、２．４ｎＭ、２．５ｎＭ、２．６ｎＭ、２．７ｎＭ、２．８ｎＭ、２．９ｎＭ、３．０ｎＭ、３．１ｎＭ、３．２ｎＭ、３．３ｎＭ、３．４ｎＭ、３．５ｎＭ、３．６ｎＭ、３．７ｎＭ、３．８ｎＭ、３．９ｎＭ、４．０ｎＭ、４．１ｎＭ、４．２ｎＭ、４．３ｎＭ、４．４ｎＭ、４．５ｎＭ、４．６ｎＭ、４．７ｎＭ、４．８ｎＭ、４．９ｎＭもしくは５．０ｎＭ未満またはそれに等しいＫ_Ｄ値（それよりも大きいまたはそれに等しい親和性）でヒトＥＧＦＲまたはその細胞外領域に結合する。ある特定の実施形態では、本出願の抗原結合部位は、約１．０～３．５ｎＭ、１．０～４．０ｎＭ、１．０～４．５ｎＭ、１．０～５．０ｎＭ、１．５～３．５ｎＭ、１．５～４．０ｎＭ、１．５～４．５ｎＭ、１．５～５．０ｎＭ、２．０～３．５ｎＭ、２．０～４．０ｎＭ、２．０～４．５ｎＭ、２．０～５．０ｎＭ、２．５～３．５ｎＭ、２．５～４．０ｎＭ、２．５～４．５ｎＭ、２．５～５．０ｎＭ、３．０～３．５ｎＭ、３．０～４．０ｎＭ、３．０～４．５ｎＭまたは３．０～５．０ｎＭの範囲のＫ_Ｄ値でヒトＥＧＦＲまたはその細胞外領域に結合する。

【0159】

ある特定の実施形態では、本明細書に開示される多重特異性結合タンパク質の第２の抗原結合部位は、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭもしくは４ｎＭ未満またはそれに等しいＫ_Ｄ値（それよりも大きいまたはそれに等しい親和性）でアカゲザルＥＧＦＲまたはその細胞外領域に結合する。ある特定の実施形態では、本出願の抗原結合部位は、約１～１０ｎＭ、１～６ｎＭ、２～１０ｎＭ、２～６ｎＭ、３～１０ｎＭ、３～６ｎＭ、４～１０ｎＭ、４～６ｎＭ、５～１０ｎＭまたは５～６ｎＭの範囲のＫ_Ｄ値でアカゲザルＥＧＦＲまたはその細胞外領域に結合する。

【0160】

ある特定の実施形態では、本明細書に開示される多重特異性結合タンパク質の第２の抗原結合部位は、配列番号１３５および１３９のＶＨおよびＶＬ配列を有する対応する抗原結合部位よりも高い熱安定性を有し、ここで、第２の抗原結合部位は、ＶＨにおけるＧ４４Ｃ変異およびＶＬにおけるＧ１００Ｃ変異を含まない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される多重特異性結合タンパク質の第２の抗原結合部位は、配列番号１４３および１４４のアミノ酸配列を有する対応する抗原結合部位よりも高い熱安定性を有し、ここで、第２の抗原結合部位は、それぞれ、ＶＬ－ＶＨまたはＶＨ－ＶＬの方向のｓｃＦｖフォーマットをとる。熱安定性を測定する方法としては、それだけに限らないが、例えば下記の実施例３に開示される、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）が挙げられる。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位が、ＶＬ－ＶＨの方向のｓｃＦｖフォーマットをとる場合、第２の抗原結合部位の融解温度（例えば、ＤＳＣによって測定されるＦ３’フォーマットのＴｒｉＮＫＥＴのＴｏｎｓｅｔまたはＴｍ１）は、配列番号１４３のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖの対応する融解温度よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃または６℃高い。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位が、ＶＨ－ＶＬの方向のｓｃＦｖフォーマットをとる場合、第２の抗原結合部位の融解温度（例えば、ＤＳＣによって測定されるＦ３’フォーマットのＴｒｉＮＫＥＴのＴｏｎｓｅｔまたはＴｍ１）は、配列番号１４４のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖの対応する融解温度よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃または６℃高い。
Ｆｃドメイン

【0161】

Ｆｃドメイン内では、ＣＤ１６結合が、ヒンジ領域およびＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内では、ＣＤ１６との相互作用が、アミノ酸残基Ａｓｐ２６５－Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７－Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７－Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４－Ｓｅｒ２３９、およびＣＨ２ドメイン中の炭水化物残基Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに主に集中している（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４０６ （６７９３）：２６７－２７３参照）。公知のドメインに基づいて、例えば、ファージディスプレイライブラリーもしくは酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリーを使用することにより、ＣＤ１６に対する結合親和性を増強もしくは減少させるように変異を選択することができる、または相互作用の公知の三次元構造に基づいて変異を設計することができる。したがって、ある特定の実施形態では、抗体Ｆｃドメインまたはその部分は、ヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む。

【0162】

ヘテロ二量体抗体重鎖の組立は、同じ細胞中で２つの異なる抗体重鎖配列を発現させることにより達成することができるが、これは各抗体重鎖のホモ二量体の組立ならびにヘテロ二量体の組立をもたらし得る。ヘテロ二量体の優先的な組立の促進は、ＵＳ１３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０およびＵＳ１４／８３０３３６に示されるように、各抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメイン中に異なる変異を組み込むことにより達成することができる。例えば、ヒトＩｇＧ１に基づくＣＨ３ドメインで、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが互いに選択的にヘテロ二量体化することを可能にするアミノ酸置換の異なるペアをこれらの２つの鎖内に組み込んで、変異を導入することができる。以下に例示されるアミノ酸置換の位置は全てＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされている。

【0163】

１つのシナリオでは、第１のポリペプチド中のアミノ酸置換が元のアミノ酸をアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）から選択されるより大きなアミノ酸で置き換え、第２のポリペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸置換が元のアミノ酸（複数可）をアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）またはバリン（Ｖ）から選択されるより小さなアミノ酸（複数可）で置き換えて、結果としてより大きなアミノ酸置換（突出部）がより小さなアミノ酸置換（窪み）の表面にはまる。例えば、一方のポリペプチドがＴ３６６Ｗ置換を組み込むことができ、他方がＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む３つの置換を組み込むことができる。

【0164】

本願の抗体重鎖可変ドメインを、必要に応じて、ＣＨ１ドメインを含むまたは含まない、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ定常領域などの抗体定常領域と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列に連結することができる。一部の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域またはＩｇＧ４定常領域などのヒト抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。一実施形態では、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分は、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１１８）と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。一部の他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスまたはウマなどの別の哺乳動物の抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。

【0165】

一部の実施形態では、ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片に連結した抗体定常ドメインは、ＣＤ１６に結合することができる。一部の実施形態では、タンパク質は、抗体Ｆｃドメインの部分（例えば、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインの部分）が組み込まれ、ここで、抗体Ｆｃドメインは、ヒンジおよびＣＨ２ドメイン（例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジおよびＣＨ２ドメイン）、ならびに／またはヒトＩｇＧ抗体のアミノ酸配列２３４～３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。

【0166】

ヒトＩｇＧ１定常領域と比較して、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１および／またはＫ４３９で、１つまたは複数の変異を定常領域に組み込むことができる。例示的な置換としては、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｑ３４７Ｒ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｒ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９ＤおよびＫ４３９Ｅが挙げられる。

【0167】

ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に組み込むことができる変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１および／またはＶ１７３にあり得る。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκに組み込むことができる変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４および／またはＴ１６４にあり得る。

【0168】

あるいは、アミノ酸置換を、表４に示される以下の置換のセットから選択することができる。

【表4】

【0169】

あるいは、アミノ酸置換を、表５に示される以下の置換のセットから選択することができる。

【表5】

【0170】

あるいは、アミノ酸置換を、表６に示される以下の置換のセットから選択することができる。

【表6】

【0171】

あるいは、各ポリペプチド鎖中の少なくとも１つのアミノ酸置換を表７から選択することができる。

【表7】

【0172】

あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換を、第１のポリペプチドの列に示される位置（複数可）が任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチドの列に示される位置（複数可）が任意の公知の正に帯電したアミノ酸によって置き換えられている、表８の以下の置換のセットから選択することができる。

【表8】

【0173】

あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換を、第１のポリペプチドの例に示される位置（複数可）が任意の公知の正に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチドの列に示される位置（複数可）が任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられている、表９の以下のセットから選択することができる。

【表9】

【0174】

あるいは、アミノ酸置換を表１０の以下のセットから選択することができる。

【表10】

【0175】

あるいは、またはさらに、第１または第２のポリペプチド鎖のいずれかにＳ３５４Ｃ、および反対側のポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃを導入して、２つのポリペプチドの界面内に人工的なジスルフィド架橋を形成することにより、ヘテロ多量体タンパク質の構造的安定性を増加させることができる。

【0176】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、位置Ｔ３６６でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0177】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、位置Ｔ３６６でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0178】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0179】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0180】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0181】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0182】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｋ３６０およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９およびＦ４０５からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0183】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９およびＦ４０５からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｋ３６０、Ｑ３４７およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0184】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0185】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0186】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0187】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0188】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0189】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0190】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0191】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0192】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0193】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0194】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

【0195】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
例示的な多重特異性結合タンパク質

【0196】

抗体定常領域にそれぞれ連結したＥＧＦＲに結合する抗原結合部位およびＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位を含むＴｒｉＮＫＥＴの例を下記に列挙し、ここで、抗体定常領域は、２つのＦｃ鎖のヘテロ二量体化を可能にする変異を含む。

【0197】

ＴｒｉＮＫＥＴは、Ｆ３フォーマットで企図される、すなわち、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位はＦａｂであり、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位はｓｃＦｖである。下に示される全てのＴｒｉＮＫＥＴは、Ｆ３’フォーマットである、すなわち、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位はｓｃＦｖであり、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位はＦａｂである。それぞれのＴｒｉＮＫＥＴでは、ｓｃＦｖは、ＶＨおよびＶＬ領域にＣｙｓの置換を含んで、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のジスルフィド架橋の形成を促進し得る。

【0198】

ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬは、リンカー、例えばペプチドリンカーを介して接続され得る。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーはフレキシブルリンカーである。リンカーのアミノ酸組成に関して、ペプチドは、柔軟性を付与する特性、本出願のタンパク質の他のドメインの構造および機能を妨げない特性、ならびにプロテアーゼからの切断に耐える特性により選択される。例えば、グリシンおよびセリン残基は、一般に、プロテアーゼ耐性を提供する。ある特定の実施形態では、ＶＬは、Ｎ末端またはＣ末端で、（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）_４（（Ｇ_４Ｓ）_４）リンカー（配列番号１１９）を介してＶＨに連結される。

【0199】

リンカー（例えば、フレキシブルリンカー）の長さは、「短い」、例えば０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２アミノ酸残基、または「長い」、例えば少なくとも１３アミノ酸残基であり得る。ある特定の実施形態では、リンカーは、１０～５０、１０～４０、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、１５～２０、２０～５０、２０～４０、２０～３０または２０～２５アミノ酸残基長である。

【0200】

ある特定の実施形態では、リンカーは、（ＧＳ）_ｎ（配列番号１２０）、（ＧＧＳ）_ｎ（配列番号１２１）、（ＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１２２）、（ＧＧＳＧ）_ｎ（配列番号１２３）、（ＧＧＳＧＧ）_ｎ（配列番号１２４）および（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１２５）配列を含むか、またはそれからなり、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。ある特定の実施形態では、リンカーは、表１１に列挙される配列番号１１９および１２６～１３４から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【表11】

【0201】

Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴでは、ＥＧＦＲ結合ｓｃＦｖは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーを介してＦｃのＮ末端に連結される。Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、柔軟性と最適な形状寸法との間のバランスをとるために、エルボーヒンジ領域配列に含まれる。ある特定の実施形態では、追加配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙを、Ｎ末端またはＣ末端で、ヒンジのＡｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒに付加することができる。

【0202】

これらの例示的なＴｒｉＮＫＥＴを記載するために本明細書で使用される場合、Ｆｃは、抗体のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。それぞれの例示的なＴｒｉＮＫＥＴでは、ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインポリペプチドは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔの変異を含み、Ｆａｂに連結したＦｃドメインポリペプチドは、ヘテロ二量体を形成するために、マッチング変異Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインポリペプチドは、Ｆａｂに連結したＦｃ上のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する、ＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ置換をさらに含む。これらの置換は、このサブセクションに記載される配列において太字である。

【0203】

例えば、本開示に記載されるＴｒｉＮＫＥＴはＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－２である。ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－２は、（ａ）Ｆｃドメインポリペプチドに連結した、ＶＬに対してＣ末端に位置するＶＨの方向の、表２に提供されるＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－２（ＶＬ－ＶＨ）配列、ならびに（ｂ）重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含むＡ４９ＭＩに由来するＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片を含み、ここで、ＣＨ１ドメインはＦｃドメインポリペプチドに接続されている。ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－２は、３つのポリペプチド：ＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－２（ＶＬ－ＶＨ）－Ｆｃ（配列番号１６６）、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ（配列番号１６４）およびＡ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬ（配列番号１６５）を含む。
ＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－２（ＶＬ－ＶＨ）－Ｆｃ（配列番号１６６）。太字の残基はＦｃドメイン中の変異した残基を示す。

【化1】

Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ（配列番号１６４）。太字の残基はＦｃドメイン中の変異した残基を示し、下線を引いた配列はＣＤＲ配列を示す。

【化2】

Ａ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬ（配列番号１６５）。下線を引いた配列はＣＤＲ配列を示す。

【化3】

【0204】

ＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－２（ＶＬ－ＶＨ）－Ｆｃ（配列番号１６６）は、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインポリペプチドに連結したＥＧＦＲ結合ｓｃＦｖの完全配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインポリペプチドは、下記に記載されるように、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ中に、ヘテロ二量体化のためにＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換、ならびにＹ３４９Ｃ置換とのジスルフィド結合を形成するためにＳ３５４Ｃ置換を含む。ｓｃＦｖは、（Ｇ_４Ｓ）_４リンカー（配列番号１１９）を介して表２のＥＧＦＲ－バインダー２の軽鎖可変ドメインのＣ末端に接続された表２のＥＧＦＲ－バインダー２の重鎖可変ドメインを含み、ここで、ｓｃＦｖは、それぞれ、Ｇ４４およびＳ１００にＶＨおよびＶＬ領域のＣｙｓの置換をさらに含み、それによって、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のジスルフィド架橋の形成を容易にする。

【0205】

Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ（配列番号１６４）は、Ｆｃドメインに接続された、ＮＫＧ２Ｄ結合Ａ４９ＭＩの重鎖可変ドメイン（配列番号９５）およびＣＨ１ドメインを含む、Ｆａｂ断片の重鎖部分を表す。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ中のＦｃドメインポリペプチドは、ＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－２（ＶＬ－ＶＨ）－Ｆｃ中のＦｃポリペプチドにおけるＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するＣＨ３ドメインにおけるＹ３４９Ｃ置換を含む。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃにおいて、Ｆｃドメインは、ＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－２（ＶＬ－ＶＨ）－Ｆｃ中のＦｃとのヘテロ二量体化のためにＫ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換も含む。

【0206】

Ａ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬ（配列番号１６５）は、ＮＫＧ２Ｄ結合Ａ４９ＭＩの軽鎖可変ドメイン（配列番号８５）および軽鎖定常ドメインを含む、Ｆａｂ断片の軽鎖部分を表す。

【0207】

別の例では、本開示に記載されるＴｒｉＮＫＥＴはＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３である。ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３は、（ａ）Ｆｃドメインポリペプチドに連結した、ＶＬに対してＣ末端に位置するＶＨの方向の、表２に提供されるＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－３（ＶＬ－ＶＨ）配列、ならびに（ｂ）重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含むＡ４９ＭＩに由来するＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片を含み、ここで、ＣＨ１ドメインはＦｃドメインポリペプチドに接続されている。ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３は、３つのポリペプチド：ＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－３（ＶＬ－ＶＨ）－Ｆｃ（配列番号１６７）、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ（配列番号１６４）およびＡ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬ（配列番号１６５）を含む。
ＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－３（ＶＬ－ＶＨ）－Ｆｃ（配列番号１６７）。太字の残基はＦｃドメイン中の変異した残基を示す。

【化4】

【0208】

ＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－３（ＶＬ－ＶＨ）－Ｆｃ（配列番号１６７）は、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＥＧＦＲ結合ｓｃＦｖの完全配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインポリペプチドは、下記に記載されるように、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ中に、ヘテロ二量体化のためにＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換、ならびにＹ３４９Ｃ置換とのジスルフィド結合を形成するためにＳ３５４Ｃ置換を含む。ｓｃＦｖは、（Ｇ_４Ｓ）_４リンカー（配列番号１１９）を介して表２のＥＧＦＲ－バインダー３クローンの軽鎖可変ドメインのＣ末端に接続された表２のＥＧＦＲ－バインダー３の重鎖可変ドメインを含み、ここで、ｓｃＦｖは、それぞれ、Ｇ４４およびＳ１００にＶＨおよびＶＬ領域のＣｙｓの置換をさらに含み、それによって、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のジスルフィド架橋の形成を容易にする。

【0209】

別の例では、本開示に記載されるＴｒｉＮＫＥＴはＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－４である。ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－４は、（ａ）Ｆｃドメインポリペプチドに連結した、ＶＬに対してＣ末端に位置するＶＨの方向の、表２に提供されるＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－４（ＶＬ－ＶＨ）配列、ならびに（ｂ）重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含むＡ４９ＭＩに由来するＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片を含み、ここで、ＣＨ１ドメインはＦｃドメインポリペプチドに接続されている。ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－４は、３つのポリペプチド：ＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－４（ＶＬ－ＶＨ）－Ｆｃ（配列番号１６８）、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ（配列番号１６４）およびＡ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬ（配列番号１６５）を含む。
ＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－４（ＶＬ－ＶＨ）－Ｆｃ（配列番号１６８）。太字の残基はＦｃドメイン中の変異した残基を示す。

【化5】

【0210】

ＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－４（ＶＬ－ＶＨ）－Ｆｃ（配列番号１６８）は、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインポリペプチドに連結したＥＧＦＲ結合ｓｃＦｖの完全配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインポリペプチドは、下記に記載されるように、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ中に、ヘテロ二量体化のためにＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換、ならびにＹ３４９Ｃ置換とのジスルフィド結合を形成するためにＳ３５４Ｃ置換を含む。ｓｃＦｖは、（Ｇ_４Ｓ）_４リンカー（配列番号１１９）を介して表２のＥＧＦＲ－バインダー４クローンの軽鎖可変ドメインのＣ末端に接続された表２のＥＧＦＲ－バインダー４クローンの重鎖可変ドメインを含み、ここで、ｓｃＦｖは、それぞれ、Ｇ４４およびＳ１００にＶＨおよびＶＬ領域のＣｙｓの置換をさらに含み、それによって、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のジスルフィド架橋の形成を容易にする。

【0211】

ある特定の実施形態では、本開示に記載されるＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインポリペプチドがＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔの置換を含み、ＥＧＦＲ結合ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインポリペプチドがヘテロ二量体を形成するためにマッチング置換Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗを含むことを除いて、ＥＷ－ＲＶＴ Ｆｃ変異を含む上記に記載される例示的なＴｒｉＮＫＥＴの１つと同一である。ある特定の実施形態では、本開示に記載されるＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインポリペプチドがＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含み、ＥＧＦＲ結合ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインポリペプチドがヘテロ二量体を形成するためにＴ３６６Ｗの「ノブ」置換を含むことを除いて、ＫｉＨ Ｆｃ変異を含む上記に記載される例示的なＴｒｉＮＫＥＴの１つと同一である。

【0212】

当業者であれば、タンパク質の産生および／または貯蔵の間に、Ｎ末端グルタミン酸（Ｅ）またはグルタミン（Ｑ）が環化してラクタムを形成し得る（例えば、自発的に、または産生および／もしくは貯蔵の間に存在する酵素によって触媒されて）ことを認識するであろう。したがって、ポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端残基がＥまたはＱである一部の実施形態では、ＥまたはＱがピログルタミン酸で置き換えられた対応するアミノ酸配列も本明細書で企図される。

【0213】

当業者であれば、タンパク質の産生および／または貯蔵の間に、タンパク質のＣ末端リシン（Ｋ）が除去され得る（例えば、自発的に、または産生および／もしくは貯蔵の間に存在する酵素によって触媒されて）ことも認識するであろう。そのようなＫの除去は、多くの場合、そのＣ末端にＦｃドメインを含むタンパク質で観察される。したがって、ポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、Ｆｃドメイン配列）のＣ末端残基がＫである一部の実施形態では、Ｋが除去された対応するアミノ酸配列も本明細書で企図される。

【0214】

上記の多重特異性結合タンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して作製することができる。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第１の核酸配列を第１の発現ベクターにクローニングすることができ；第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列を第２の発現ベクターにクローニングすることができ；免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列を第３の発現ベクターにクローニングすることができ；第１、第２および第３の発現ベクターを一緒に宿主細胞に安定的にトランスフェクトして、多量体タンパク質を生成することができる。

【0215】

多重特異性結合タンパク質の最高収量を達成するために、異なる比の第１、第２および第３の発現ベクターを調査して、宿主細胞へのトランスフェクションのための最適な比を決定することができる。トランスフェクション後、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡法またはＣｌｏｎｅｐｉｘなどの当技術分野で公知の方法を使用して、単一クローンを細胞バンク生成のために単離することができる。

【0216】

クローンを、バイオリアクタースケールアップおよび多重特異性結合タンパク質の維持された発現に適した条件下で培養することができる。遠心分離、深層濾過、細胞溶解、ホモジナイゼーション、凍結－解凍、アフィニティ精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーを含む当技術分野で公知の方法を使用して、多重特異性結合タンパク質を単離および精製することができる。
ＩＩ．多重特異性結合タンパク質の特徴

【0217】

本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位と、ＥＧＦＲに結合する腫瘍関連抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する抗原結合部位とを含む。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴフォーマットで例示されるように、同じ腫瘍関連抗原（ＥＧＦＲ）に結合する追加の抗原結合部位を含有する（例えば、図２Ｃおよび２Ｄ）。

【0218】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、対応するモノクローナル抗体、すなわち、多重特異性結合タンパク質に組み込まれるものと同じＥＧＦＲ抗原結合部位を含有するモノクローナル抗体と類似の熱安定性を示す。

【0219】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＮＫ細胞などのＮＫＧ２Ｄおよび／またはＣＤ１６を発現している細胞と、ある特定の腫瘍細胞などのＥＧＦＲを発現している細胞に同時に結合する。ＮＫ細胞への多重特異性結合タンパク質の結合によって、ＥＧＦＲを発現している腫瘍細胞の破壊に向けたＮＫ細胞の活性が増強され得る。ＮＫ細胞が、ストレスが与えられた標的細胞に対してより強力な細胞傷害性を示すことが報告されている（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．、（２０１４） Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ． ２１（１）：５－１４参照）。理論によって拘束されることを望まないが、ＮＫ細胞がＴｒｉＮＫＥＴによって細胞の集団に結合する場合、ＮＫ細胞は、ストレスが与えられた標的細胞（例えば、悪性細胞および腫瘍微小環境中の細胞）を選択的に殺滅し得ることが強調される。この機構は、ＴｒｉＮＫＥＴの特異性の増加および毒性の低減に寄与し得、ＥＧＦＲの発現が所望の標的細胞に限定されない場合でさえストレスが与えられた細胞の選択的な排除を可能にする。

【0220】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、対応する抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（すなわち、多重特異性結合タンパク質に組み込まれるものと同じＥＧＦＲ結合部位を含有するモノクローナル抗体）と類似の親和性でＥＧＦＲに結合する。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、対応するモノクローナル抗体よりも、免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞）によってＥＧＦＲを発現している腫瘍細胞の殺滅を媒介するのにより有効である。

【0221】

ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲに対する結合部位を含む本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質は、ＥＧＦＲを発現している細胞と共培養すると、初代ヒトＮＫ細胞を活性化する。ＮＫ細胞活性化は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮ－γサイトカイン産生の増加によって示される。さらに、対応する抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体と比較して、多重特異性結合タンパク質は、ＥＧＦＲを発現している細胞の存在下で、ヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示す。

【0222】

一部の実施形態では、ＥＧＦＲに対する結合部位を含む本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質は、ＥＧＦＲを発現している細胞と共培養すると、静止および／またはＩＬ－２活性化ヒトＮＫ細胞の活性を増強する。

【0223】

一部の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する対応するモノクローナル抗体と比較して、 多重特異性結合タンパク質は、中レベルおよび低レベルのＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞の標的化において利点を提供する。

【0224】

一部の実施形態では、ＥＧＦＲに対して一価の本明細書に開示される多重特異性結合タンパク質、例えば、Ｆ３またはＦ３’フォーマットのものは、二価である対応する抗ＥＧＦＲ ｍＡｂと比較して、皮膚に関する毒性を低減または遅延させる。

【0225】

一部の実施形態では、ＴｒｉＮＫＥＴの二価Ｆ４フォーマット（すなわち、ＴｒｉＮＫＥＴがＥＧＦＲに結合する追加の抗原結合部位を含む）は、ＴｒｉＮＫＥＴがＥＧＦＲに結合する活性を改善し、事実上、腫瘍細胞の表面上の高レベルのＴｒｉＮＫＥＴの発現および維持を安定化する。一部の実施形態では、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴは、対応するＦ３－ＴｒｉＮＫＥＴまたはＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴよりも強力な腫瘍細胞の殺滅を媒介する。
ＩＩＩ．治療用途

【0226】

本出願は、本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質および／または本明細書に記載される医薬組成物を使用して、がんを処置するための方法を提供する。本方法を使用して、ＥＧＦＲを発現しているさまざまながんを処置することができる。

【0227】

治療方法は、処置されるがんに従って特徴付けることができる。処置されるがんは、がん細胞の表面上で発現する特定の抗原の存在に従って特徴付けることができる。

【0228】

ＥＧＦＲの発現によって特徴付けられるがんとしては、限定されないが、固形腫瘍がんが挙げられる。例えば、ある特定の実施形態では、がんは、頭頸部がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、神経膠腫、腎細胞癌、膀胱がん、子宮頸がん、卵巣がん、膵臓がんまたは肝臓がんである。ある特定の実施形態では、がんは、肺がん（それだけに限らないが、小細胞肺癌または肺腺癌を含む）、乳がん、乳房の浸潤性腺管癌、腎臓がん、従来の多形神経膠芽腫、結腸がん、結腸腺癌、胃がん、脳がん、神経膠芽腫、膀胱、頭頸部がん、卵巣がんまたは前立腺がんである。

【0229】

本明細書に記載されるタンパク質、コンジュゲート、細胞および／または医薬組成物を使用して、がん細胞またはがん微小環境中の細胞がＥＧＦＲを発現するがんに限定されないさまざまながんを処置することができることが企図される。

【0230】

一部の実施形態では、がんは固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、がんは、乳がん、卵巣がん、食道がん、膀胱がんまたは胃がん、唾液腺導管癌、肺腺癌または子宮がんの攻撃的形態、例えば子宮漿液性子宮内膜癌である。一部の他の実施形態では、がんは、脳がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、白血病、肺がん、肝臓がん、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、胃がん、精巣がんまたは子宮がんである。さらに他の実施形態では、がんは、血管形成腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫（例えば、血管肉腫または軟骨肉腫）、喉頭がん、耳下腺がん、胆道がん（ｂｉｌｉａｒｙ ｔｒａｃｔ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺がん、末端黒子型黒色腫、日光角化症、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管がん、肛門がん、肛門直腸がん、星細胞系腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆道がん（ｂｉｌｉａｒｙ ｃａｎｃｅｒ）、骨がん、骨髄がん、気管支がん、気管支腺癌、カルチノイド、胆管癌、軟骨肉腫、脈絡叢乳頭腫／癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、明細胞癌、結合組織がん、嚢胞腺腫、消化器系がん、十二指腸がん、内分泌系がん、卵黄嚢腫瘍、子宮内膜過形成、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞がん、上衣がん、上皮細胞がん、ユーイング肉腫、眼と眼窩のがん、女性性器がん、限局性結節性過形成、胆嚢がん、胃幽門部がん、胃底部がん、ガストリノーマ、神経膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓がん、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道がん、肝細胞癌、ホジキン病、回腸がん、インスリノーマ、上皮内腫瘍、上皮間扁平上皮腫瘍、肝内胆管がん、浸潤性扁平上皮癌、空腸がん、関節がん、カポジ肉腫、骨盤がん、大細胞癌、大腸がん、平滑筋肉腫、悪性黒子型黒色腫、リンパ腫、男性性器がん、悪性黒色腫、悪性中皮腫瘍、髄芽腫、髄上皮腫、髄膜がん、中皮がん、転移性癌、口腔がん、粘液性類表皮癌、多発性骨髄腫、筋がん、鼻道がん、神経系がん、神経上皮腺癌、結節型黒色腫、非上皮性皮膚がん、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起神経膠がん（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔がん、骨肉腫、乳頭状漿液性腺癌、陰茎がん、咽頭がん、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、直腸がん、腎細胞癌、呼吸器系がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、副鼻腔がん、皮膚がん、小細胞癌、小腸がん、平滑筋がん、軟部組織がん、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎がん、扁平上皮癌、横紋筋がん、中皮下がん、表在拡大型黒色腫、Ｔ細胞白血病、舌がん、未分化癌、尿管がん、尿道がん（ｕｒｅｔｈｒａ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱がん、泌尿器系がん、子宮頸がん、子宮体がん、ブドウ膜黒色腫、膣がん、疣状癌、ビポーマ、外陰がん、高分化癌またはウィルムス腫瘍である。

【0231】

ある特定の他の実施形態では、がんは、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫である。ある特定の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病または中枢神経系（ＣＮＳ）原発リンパ腫などのＢ細胞リンパ腫である。ある特定の他の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞性リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫または末梢性Ｔ細胞リンパ腫などのＴ細胞リンパ腫である。

【0232】

処置されるがんは、がん細胞の表面上で発現する特定の抗原の存在に従って特徴付けることができる。ある特定の実施形態では、がん細胞は、ＥＧＦＲに加えて、以下の１つまたは複数を発現することができる：ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ＴＲＯＰ２、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４およびＰＤ１。
ＩＶ．併用療法

【0233】

本願の別の態様は併用療法を提供する。本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質は、がんを処置するための追加の治療剤と組み合わせて使用することができる。

【0234】

がんの処置で併用療法の一部として使用され得る例示的な治療剤としては、例えば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、サイマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミゾール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－２アルファ、インターフェロン－ベータ、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）、コロニー刺激因子－１、コロニー刺激因子－２、デニロイキン・ジフチトクス、インターロイキン－２、黄体ホルモン放出因子、およびその同族受容体に対する示差的結合、または増加もしくは減少した血清半減期を示し得る上記薬剤のバリエーションが挙げられる。

【0235】

がんの処置で併用療法の一部として使用され得る薬剤の追加のクラスは免疫チェックポイント阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント阻害剤としては、（ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７－Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７－Ｈ４および（ｖｉｉ）ＴＩＭ３の１つまたは複数を阻害する薬剤が挙げられる。ＣＴＬＡ４阻害剤であるイピリムマブは、黒色腫の処置について米国食品医薬品局によって承認されている。

【0236】

がんの処置で併用療法の一部として使用され得るさらに他の薬剤は、非チェックポイント標的を標的化するモノクローナル抗体剤（例えば、ハーセプチン）および非細胞傷害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）である。

【0237】

抗がん剤のさらに他のカテゴリーには、例えば、（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Ｂｃｒ－Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、ブルトンチロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫとｍＴＯＲの両方の阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤＋２－クロロ－デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１とＤＨＯＤＨの両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼ－ＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤およびＷＥＥ１阻害剤から選択される阻害剤；（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５またはＩＣＯＳのアゴニスト；ならびに（ｉｉｉ）ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦおよびＧ－ＣＳＦから選択されるサイトカインが含まれる。

【0238】

本願のタンパク質を、原発巣の外科的除去の補助として使用することもできる。

【0239】

多重特異性結合タンパク質および追加の治療剤の量ならびに相対的な投与のタイミングは、所望の組合せ治療効果を達成するために選択され得る。例えば、併用療法を、このような投与を必要とする患者に投与する場合、組合せの治療剤、または治療剤を含む１つまたは複数の医薬組成物は、例えば、逐次的に、併せて、一緒に、同時になどの任意の順序で投与され得る。さらに、例えば、多重特異性結合タンパク質は、追加の治療剤（複数可）がその予防的もしくは治療的効果を発揮する時間の間に投与され得る、または逆もまた同様である。
Ｖ．医薬組成物

【0240】

本開示はまた、治療有効量の本明細書に記載されるタンパク質を含有する医薬組成物を特徴とする。組成物は、さまざまな薬物送達システムに使用するために製剤化することができる。１つまたは複数の生理学的に許容される賦形剤または担体を適切な製剤化のために組成物に含めることもできる。本明細書で開示される組成物において使用するための適切な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．、１７ｔｈ ｅｄ．、１９８５に見出される。薬物送達のための方法の簡潔な概要については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ （Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３、１９９０）を参照されたい。

【0241】

ある特定の実施形態では、組成物は、薬物送達製剤であり得る。本明細書に記載の静脈内薬物送達製剤は、バッグ、ペンまたはシリンジに含有され得る。ある特定の実施形態では、バッグはチューブおよび／または針を含むチャネルに接続され得る。ある特定の実施形態では、製剤は凍結乾燥製剤または液体製剤であり得る。ある特定の実施形態では、製剤はフリーズドライ（凍結乾燥）され得、約１２～６０個のバイアルに含有され得る。ある特定の実施形態では、製剤はフリーズドライされ得、４５ｍｇのフリーズドライ製剤は１個のバイアルに含有され得る。ある特定の実施形態では、約４０ｍｇ～約１００ｍｇのフリーズドライ製剤は１個のバイアルに含有され得る。ある特定の実施形態では、１２、２７または４５個のバイアルのフリーズドライ製剤を合わせて、静脈内薬物製剤中の治療用量のタンパク質を得る。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であり得、約２５０ｍｇ／バイアル～約１０００ｍｇ／バイアルとして保管され得る。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であり得、約６００ｍｇ／バイアルとして保管され得る。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であり得、約２５０ｍｇ／バイアルとして保管され得る。

【0242】

これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され得る、または滅菌濾過され得る。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装され得る、または凍結乾燥され得、凍結乾燥調製物は投与前に無菌水性担体と合わせられる。調製物のｐＨは、典型的には３～１１の間、例えば、５～９の間または６～８の間、ある特定の実施形態では、７～８の間、例えば７～７．５となる。固体形態の得られた組成物は、各々が一定量の上記の１種または複数種の薬剤を含有する、複数の単回投与単位に包装され得る。固体形態の組成物はまた、柔軟な量で容器に包装することもできる。

【0243】

ある特定の実施形態では、本開示は、本開示に記載されるタンパク質を、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水および水酸化ナトリウムと組み合わせて含む、貯蔵寿命が延長された製剤を提供する。

【0244】

ある特定の実施形態では、ｐＨ緩衝溶液中に本開示に記載されるタンパク質を含む水性製剤が調製される。本願のバッファーは、約４～約８、例えば約４．５～約６．０、もしくは約４．８～約５．５の範囲のｐＨを有し得る、または約５．０～約５．２のｐＨを有し得る。上に列挙されるｐＨまでの中間の範囲も本開示の一部であることが意図される。例えば、上限および／または下限として上に列挙される値のいずれかの組合せを使用した値の範囲が含まれることが意図される。ｐＨをこの範囲内に制御するバッファーの例としては、酢酸バッファー（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸バッファー（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸バッファー、ヒスチジンバッファー、クエン酸バッファーおよび他の有機酸バッファーが挙げられる。

【0245】

ある特定の実施形態では、製剤は、ｐＨを約４～約８の範囲に維持するためにクエン酸塩およびリン酸塩を含有する緩衝液系を含む。ある特定の実施形態では、ｐＨ範囲は、約４．５～約６．０、または約ｐＨ４．８～約５．５、または約５．０～約５．２のｐＨ範囲であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液系は、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物および／またはリン酸二水素ナトリウム二水和物を含む。ある特定の実施形態では、緩衝液系は、約１．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約０．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム（例えば、０．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約１．５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物（例えば、１．５３ｍｇ／ｍＬ）、約０．９ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物（例えば、０．８６ｍｇ／ｍＬ）および約６．２ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍＬ）を含む。ある特定の実施形態では、緩衝液系は、約１～約１．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸、約０．２５～約０．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム、約１．２５～約１．７５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物、約０．７～約１．１ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物および約６．０～約６．４ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムを含む。ある特定の実施形態では、製剤のｐＨは水酸化ナトリウムで調整される。

【0246】

等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）として作用し、抗体を安定化し得るポリオールを製剤に含めてもよい。ポリオールは、製剤の所望の等張性に関して変えることができる量で製剤に添加される。ある特定の実施形態では、水性製剤は等張性であり得る。添加されるポリオールの量をポリオールの分子量に関して変化させてもよい。例えば、二糖（トレハロースなど）と比較して、少量の単糖（例えば、マンニトール）が添加され得る。ある特定の実施形態では、等張化剤として製剤に使用され得るポリオールはマンニトールである。ある特定の実施形態では、マンニトール濃度は約５～約２０ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約７．５～約１５ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約１０～約１４ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約１２ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、ポリオールであるソルビトールが製剤に含まれ得る。

【0247】

界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）または界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）を製剤に添加してもよい。例示的な界面活性剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０等）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。添加される界面活性剤の量は、製剤化抗体の凝集を減少させる、および／または製剤中の微粒子の形成を最小化する、および／または吸着を減少させるようなものとする。ある特定の実施形態では、製剤はポリソルベートである界面活性剤を含み得る。ある特定の実施形態では、製剤は界面活性剤ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ（登録商標） ８０を含有し得る。Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを記載するために使用される用語である（Ｆｉｅｄｌｅｒ、Ｌｅｘｉｋｏｎ ｄｅｒ Ｈｉｆｓｓｔｏｆｆｅ、Ｅｄｉｔｉｏ Ｃａｎｔｏｒ Ｖｅｒｌａｇ Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ、４ｔｈ ｅｄｉ．、１９９６参照）。ある特定の実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬの間、または約０．５ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬの間のポリソルベート８０を含有し得る。ある特定の実施形態では、約０．１％のポリソルベート８０が製剤に添加され得る。

【0248】

実施形態では、本明細書に記載のタンパク質産物は液体製剤として製剤化される。液体製剤は、ゴム栓で閉じられ、アルミニウム圧着シールクロージャーで密封されたＵＳＰ／Ｐｈ Ｅｕｒ Ｉ型５０Ｒバイアル中１０ｍｇ／ｍＬ濃度で提供され得る。栓は、ＵＳＰおよびＰｈ Ｅｕｒを遵守したエラストマー製であり得る。ある特定の実施形態では、バイアルに、６０ｍＬの抽出可能な体積を可能にするために、６１．２ｍＬのタンパク質産物溶液が充填され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は０．９％食塩溶液で希釈され得る。

【0249】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の液体製剤は、安定化レベルの糖と組み合わせた１０ｍｇ／ｍＬ濃度溶液として調製され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は水性担体中で調製され得る。ある特定の実施形態では、安定剤は、静脈内投与に望ましくないまたは不適切な粘度をもたらし得る量以下の量で添加され得る。ある特定の実施形態では、糖は二糖、例えばスクロースであり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、緩衝剤、界面活性剤および保存剤の１つまたは複数も含み得る。

【0250】

ある特定の実施形態では、液体製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸および／または塩基の添加によって調節され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、塩基は水酸化ナトリウムであり得る。

【0251】

凝集に加えて、脱アミドが、発酵、収集／細胞清澄化、精製、原体／医薬品貯蔵中、および試料分析中に起こり得る、ペプチドおよびタンパク質の一般的な産物バリアントである。脱アミドは、タンパク質からＮＨ_３が失われて、加水分解を受け得るスクシンイミド中間体を形成することである。スクシンイミド中間体は、親ペプチドの１７ダルトンの質量減少をもたらす。その後の加水分解によって、１８ダルトンの質量増加がもたらされる。スクシンイミド中間体の単離は、水性条件下での不安定性のために困難である。よって、脱アミドは、典型的には１ダルトンの質量増加として検出可能である。アスパラギンの脱アミドは、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸をもたらす。脱アミドの速度に影響を及ぼすパラメーターには、ｐＨ、温度、溶媒の誘電率、イオン強度、一次配列、局所的ポリペプチドコンフォメーションおよび三次構造が含まれる。ペプチド鎖中のＡｓｎに隣接するアミノ酸残基は脱アミド速度に影響を及ぼす。タンパク質配列中のＡｓｎに続くＧｌｙおよびＳｅｒは脱アミドに対するより高い感受性をもたらす。

【0252】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の液体製剤は、タンパク質産物の脱アミドを防ぐためのｐＨおよび湿度の条件下で保存され得る。

【0253】

本明細書の目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与にとって安全で非毒性であり）、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、滅菌食塩溶液、リンゲル液またはデキストロース溶液が含まれる。

【0254】

保存剤を必要に応じて本明細書の製剤に添加して細菌作用を減少させてもよい。保存剤の添加は、例えば、マルチユース（複数回投与）製剤の製造を容易にし得る。

【0255】

静脈内（ＩＶ）送達は、特定の例で、例えば、患者がＩＶ経路を介して全ての薬物を受けて移植後に入院している場合の投与経路であり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、投与前に０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈される。ある特定の実施形態では、注射用希釈医薬品は等張性であり、静脈内注入による投与に適している。

【0256】

ある特定の実施形態では、塩またはバッファー成分は１０ｍＭ～２００ｍＭの量で添加され得る。塩および／またはバッファーは、薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを用いてさまざまな公知の酸（無機および有機）から得られる。ある特定の実施形態では、バッファーはリン酸バッファーであり得る。ある特定の実施形態では、バッファーは、グリシン酸バッファー、炭酸バッファー、クエン酸バッファーであり得、この場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして働き得る。

【0257】

保存剤を必要に応じて本明細書の製剤に添加して、細菌作用を減少させてもよい。保存剤の添加は、例えば、マルチユース（複数回投与）製剤の製造を容易にし得る。

【0258】

本明細書の目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与にとって安全で非毒性であり）、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、滅菌食塩溶液、リンゲル液またはデキストロース溶液が含まれる。

【0259】

本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質およびリオプロテクタント（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含む凍結乾燥製剤で存在し得る。リオプロテクタントは糖、例えば二糖であり得る。ある特定の実施形態では、リオプロテクタントはスクロースまたはマルトースであり得る。凍結乾燥製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、増量剤および／または保存剤の１つまたは複数を含み得る。

【0260】

凍結乾燥医薬品の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は、少なくとも１：２のタンパク質のスクロースまたはマルトースに対する重量比であり得る。ある特定の実施形態では、タンパク質のスクロースまたはマルトースに対する重量比は１：２～１：５であり得る。

【0261】

ある特定の実施形態では、製剤のｐＨは、凍結乾燥前に、薬学的に許容される酸および／または塩基の添加によって調節され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される塩基は水酸化ナトリウムであり得る。

【0262】

凍結乾燥前に、本明細書に記載のタンパク質を含有する溶液のｐＨは６～８の間に調整され得る。ある特定の実施形態では、凍結乾燥医薬品のためのｐＨ範囲は７～８であり得る。

【0263】

ある特定の実施形態では、塩またはバッファー成分は１０ｍＭ～２００ｍＭの量で添加され得る。塩および／またはバッファーは、薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを用いてさまざまな公知の酸（無機および有機）から得られる。ある特定の実施形態では、バッファーはリン酸バッファーであり得る。ある特定の実施形態では、バッファーは、グリシン酸バッファー、炭酸バッファー、クエン酸バッファーであり得、この場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして働き得る。

【0264】

ある特定の実施形態では、「増量剤」が添加され得る。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に嵩（ｍａｓｓ）を加え、凍結乾燥ケークの物理構造に寄与する（例えば、開孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケークの製造を容易にする）化合物である。例示的な増量剤には、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコールおよびソルビトールが含まれる。本願の凍結乾燥製剤はこのような増量剤を含有し得る。

【0265】

保存剤を必要に応じて本明細書の製剤に添加して、細菌作用を減少させてもよい。保存剤の添加は、例えば、マルチユース（複数回投与）製剤の製造を容易にし得る。

【0266】

ある特定の実施形態では、凍結乾燥医薬品は、水性担体で再構成され得る。本明細書の目的の水性担体は、薬学的に許容され（例えば、ヒトへの投与にとって安全で非毒性であり）、凍結乾燥後の、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な水性担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、滅菌食塩溶液、リンゲル液またはデキストロース溶液が含まれる。

【0267】

ある特定の実施形態では、本明細書に開示の凍結乾燥医薬品は、注射用滅菌水、ＵＳＰ（ＳＷＦＩ）または０．９％塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰのいずれかで復元される。復元中、凍結乾燥粉末が溶液に溶解する。

【0268】

ある特定の実施形態では、本明細書に開示の凍結乾燥タンパク質産物は、約４．５ｍＬの注射用水に再構成され、０．９％食塩溶液（塩化ナトリウム溶液）で希釈される。

【0269】

本明細書に記載の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性となることなく、特定の患者、組成物および投与様式にとって所望の治療反応を達成するのに有効な有効成分の量を得るように変化させることができる。

【0270】

具体的な用量は、各患者に均一な用量、例えば、５０～５０００ｍｇのタンパク質であり得る。あるいは、患者の用量を、患者のおおよその体重または表面積に適合させることができる。適切な投与量の決定における他の因子には、処置または予防される疾患または状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別および健康状態が含まれ得る。処置のための適切な投与量を決定するのに必要な計算のさらなる改良は、特に投与量情報および本明細書に開示されるアッセイに照らして、当業者によって日常的に行われる。投与量はまた、適切な用量－反応データと合わせて使用される投与量を決定するための公知のアッセイの使用を通して決定することもできる。個々の患者の投与量は、疾患の進行を監視しながら調整することができる。患者における標的化可能な構築物または複合体の血中レベルを測定して、有効濃度に達するまたはこれを維持するために投与量を調整する必要があるかどうかを確かめることができる。薬理ゲノミクスを使用して、どの標的化可能な構築物および／または複合体、ならびにその投与量が所与の個体にとって十中八九有効であるかを決定することができる（Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３０８： ４３－５３、２００１； Ｓｔｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３０８： ３３－４１、２００１）。

【0271】

一般に、体重に基づく投与量は、体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ～約１００ｍｇ、例えば約０．０１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0272】

用量は、毎日、毎週、毎月もしくは毎年１回もしくは複数回、またはさらには２～２０年毎に１回で与えられ得る。当業者であれば、測定された滞留時間および体液または組織中の標的化可能な構築物または複合体の濃度に基づいて、投与の反復率を容易に推定することができる。本明細書に記載の組成物の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、腔内、カテーテルを通した灌流によるまたは直接病巣内注射によることができる。投与は、毎日１回または複数回、毎週１回または複数回、毎月１回または複数回、あるいは毎年１回または複数回であり得る。

【0273】

上記の説明は、本願の複数の態様および実施形態を説明している。本出願は、態様および実施形態の全ての組合せおよび並べ替えを具体的に企図する。

【実施例】

【0274】

以下の実施例は、単なる例示であり、本出願に記載される多重特異性結合タンパク質の範囲または内容を決して限定することを意図するものではない。
（実施例１）
ＳＰＲおよびＤＣＳ分析を使用するＥＧＦＲ結合界面の選択

【0275】

この実施例は、パニツムマブよりも熱安定性が改善されたパニツムマブに由来するＥＧＦＲ結合部位を開発するために設計した。簡潔には、ＥＧＦＲ（ＰＤＢ ＩＤ：５ＳＸ４）のＤ３ドメインとの複合体におけるパニツムマブＦａｂの結晶構造に基づいて選択した単一の点変異をそれぞれ含有する２５の構築物を設計した。十分に発現しなかった３つの構築物以外は、ＥＧＦＲ結合部位を生成して、結合親和性および熱安定性に対する変異の影響を評価した。それぞれのｓｃＦｖ構築物はまた、ＶＨにおけるＧ４４Ｃ置換およびＶＬにおけるＧ１００Ｃ置換を含有していた。ヒトおよびアカゲザルＥＧＦＲについての動態および親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して評価した。結果を表１２に示す。それぞれの変異に対する影響が微小であったことを考えて、親和性の著しい低減を引き起こしたものを考慮から除外した。８つの構築物の熱安定性を、実施例３に記載される方法を使用して、示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）によってさらに評価した。結果を表１３に示す。

【表12-1】

【表12-2】

【表13】

【0276】

これらの結果に基づいて、以下の変異が、親和性および熱安定性を最も有効に改善／保持すると決定した：
・重鎖：Ｓ６２Ｒ（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下）
・軽鎖：Ｆ８７Ｙ、Ｄ９２Ｒ（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下）

【0277】

これらの変異の構造モデリングを図１８～２０に示す。図１８に示されるように、パニツムマブのＶＨ鎖のＳ６２Ｒ変異は、モデリングによれば、ＶＬのＤ１と追加の水素結合を導き、ＶＨ／ＶＬ界面の安定性に寄与することが分かった。図１９に示されるように、パニツムマブのＶＬ鎖のＦ８７Ｙ変異は、モデリングによれば、ＶＨのＱ３９と追加の水素結合を導き、ＶＨ／ＶＬ界面の安定性に寄与することが分かった。図２０に示されるように、元は親和性を改善するため（ＥＧＦＲのＮ４４９への結合のため）に設計されたパニツムマブのＶＬ鎖のＣＤＲ３のＤ９２Ｒ変異は、予想外にも、モデリングによれば、ＣＤＲＬ１のＹ３２と追加のファンデルワールス接触を形成し、パラトープを安定化することが分かった。

【0278】

その後、親和性および熱安定性に対する変異の組合せの影響を、それぞれ、ＳＰＲおよび示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して評価した。ＳＰＲ分析からの結果を表１４に示し、ＤＳＣ分析からの結果を表１５に示す。

【表14-1】

【表14-2】

【表15】

＊－Ｈは重鎖における変異を表し； －Ｌは軽鎖における変異を表し； ＰＡＮＩはパニツムマブフレームワークを表す。
＊＊追加ピークがピーク１とピーク２との間で観察された。

【0279】

表１４および１５におけるＰＡＮＩ－Ｈ＿Ｓ６２Ｒ－Ｌ＿Ｆ８７Ｙ－Ｌ＿Ｄ９２Ｒ（本明細書の以下で「ＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－３」）およびＰＡＮＩ－Ｈ＿Ｓ６２Ｒ－Ｌ＿Ｆ８７Ｙ（本明細書の以下で「ＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－２」）は、最良の親和性および熱安定性を実証した。Ｌ：Ｇ１００ＣおよびＨ：Ｇ４４Ｃの変異は、ジスルフィド結合を促進して、ＶＬおよびＶＨ鎖の対形成を増強する。
（実施例２）
ＴｒｉＮＫＥＴの表面プラズモン共鳴分析

【0280】

この実施例は、ＥＧＦＲに対するある特定のパニツムマブ由来ＥＧＦＲ結合部位の結合親和性を評価するために設計した。パニツムマブおよびそのバリアントに由来するｓｃＦｖを含有する４つのＴｒｉＮＫＥＴ、すなわち、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－２、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３およびＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－４（上記の「例示的な多重特異性結合タンパク質」サブセクション参照）を構築した。組換えヒトおよびアカゲザルＥＧＦＲについてのＥＧＦＲ結合構築物の動態および親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器を使用して、ＳＰＲによって測定した。試料を抗ｈＦｃ ＩｇＧチップ上に捕捉し、ある範囲の濃度のヒトまたはアカゲザル組換えＥＧＦＲ－Ｈｉｓを、捕捉された試験物上に注入した。実験を３７℃の生理的温度で行った。データを、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｉｎｓｉｇｈｔ評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して分析した。

【0281】

ＳＰＲ分析からの結合センサーグラムを図２１～２４に示す。図２１は、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１の滴定についてのＳＰＲ分析を示し、図２２は、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－２の滴定についてのＳＰＲ分析を示し、図２３は、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３の滴定についてのＳＰＲ分析を示し、図２４は、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１の滴定についてのＳＰＲ分析を示す。これらの分析から計算されたパラメーターを表１６に示す。結果は、目的の変異が、ＥＧＦＲに対する多重特異性結合タンパク質の親和性に対する実質的な影響を有していなかったことを実証した。

【表16】

（実施例３）
ＴｒｉＮＫＥＴの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析

【0282】

この実施例は、ＤＳＣ分析を使用して、ＴｒｉＮＫＥＴ構築物の熱安定性を評価するために設計した。簡潔には、試験物を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ脱塩カラムを使用して、選択した緩衝液に緩衝液交換した。次いで、溶出液を同じ緩衝液で０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。３２５μＬの試料を、対応する緩衝液ブランクを用いて９６ウェルのディープウェルプレートにロードし、Ｍｉｃｒｏｃａｌ ＰＥＡＱ－ＤＳＣ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して分析した。温度を、６０℃／時間の速度で２０～２５℃から１００℃まで上昇させた。緩衝液バックグラウンドを、分析物の前に３連で実行した。最も代表的な緩衝液ブランクを、分析前のそれぞれの分析物の走査から減算した。データを、非２状態モデルを用いて、ＤＳＣ分析ソフトウェアを使用してフィットさせ、Ｔ_{ｏｎｓｅｔ}およびＴ_ｍｓを報告した。

【0283】

ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１を使用して、ベースラインとしての融解曲線を得、変曲点、特にＴ－ｏｎｓｅｔ（分子が融解を開始する温度）およびｓｃＦｖの安定性に関連するＴｍ１を特定した。その後、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－２、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３およびＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－４を同じ方法を使用して分析した。

【0284】

表１７および図２５Ａ～２５Ｄは、ＰＢＳ、ｐＨ７．４緩衝液における試験からのＤＳＣ分析結果を示す。図２５Ａは、ＰＢＳ、ｐＨ７．４緩衝液におけるＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１についてのＤＳＣ分析を示す。図２５Ｂは、ＰＢＳ、ｐＨ７．４緩衝液におけるＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－２についてのＤＳＣ分析を示す。図２５Ｃは、ＰＢＳ、ｐＨ７．４緩衝液におけるＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３についてのＤＳＣ分析を示す。図２５Ｄは、ＰＢＳ、ｐＨ７．４緩衝液におけるＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－４についてのＤＳＣ分析を示す。表１８ならびに図２６Ａおよび２６Ｂは、２０ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭのトレハロース、０．０１％のＰＳ８０、ｐＨ６．０における試験からのＤＳＣ分析結果を示す。図２６Ａは、２０ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭのトレハロース、０．０１％のＰＳ８０、ｐＨ６．０緩衝液におけるＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３についてのＤＳＣ分析を示す。図２６Ｂは、２０ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭのトレハロース、０．０１％のＰＳ８０、ｐＨ６．０緩衝液におけるＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３についてのＤＳＣ分析を示す。ＤＳＣ分析は、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３（図２５Ｃ）がＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－２（図２５Ｂ）と比較して熱安定性が改善され、順にＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１（図２５Ａ）と比較して熱安定性が改善されたことを明らかにした。結果は、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３（図２６Ａ）およびＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－４（図２６Ｂ）の類似の熱安定性も示した。しかしながら、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－４は、加速熱安定性研究（４０℃で４週間、データは示さない）下で分解がより生じやすく、これは、安定性に対するＳ６２Ｒ重鎖変異の利益を強調する。

【表17】

【表18】

（実施例４）
ＥＧＦＲ陽性細胞へのＴｒｉＮＫＥＴ結合の評価

【0285】

この実施例は、細胞表面上で発現したＥＧＦＲに対するＥＧＦＲ標的化ＴｒｉＮＫＥＴの結合親和性を評価するために設計した。非小細胞肺癌に由来するＨ２１７２ヒトがん細胞系を使用した。簡潔には、Ｈ２１７２細胞を、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－２、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３またはパニツムマブとともに４℃で０．５時間インキュベートした。インキュベーション後、ＴｒｉＮＫＥＴおよびパニツムマブのＥＧＦＲ^＋細胞への結合パターンを、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、二次のみの対照に対するＭＦＩ倍率を報告した。

【0286】

図２７は、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－２、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３またはパニツムマブとのインキュベーション後のＥＧＦＲ陽性細胞への結合を示す。これらのＥＧＦＲ標的化ＴｒｉＮＫＥＴは、ｎＭ以下の濃度、およびパニツムマブと類似またはより高い最大結合で細胞に結合した。
（実施例５）
初代ヒトＮＫ細胞またはＣＤ８＋細胞の細胞傷害性アッセイ

【0287】

この実施例は、ＥＧＦＲを発現がん細胞に対する免疫エフェクター細胞の細胞傷害性を媒介するＥＧＦＲ標的化ＴｒｉＮＫＥＴの能力を評価するために設計した。簡潔には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心法を使用してヒト末梢血バフィーコートから単離した。単離ＰＢＭＣを洗浄し、ＮＫ細胞またはＣＤ８＋細胞単離のために調製した。ＮＫ細胞を、磁気ビーズによる負の選択技術を使用して単離し、単離ＮＫ細胞の純度は典型的には＞９０％ＣＤ３－ＣＤ５６＋であった。単離ＮＫ細胞を、補充サイトカインなしの培養培地中で一晩静置し、翌日、細胞傷害性アッセイに使用した。ＣＤ８＋を、磁気ビーズによる負の選択技術を使用して単離し、ＣＤ８＋細胞の純度は典型的には＞９０％ＣＤ３＋ＣＤ８＋であった。単離ＣＤ８＋Ｔ細胞を、拡大のために、ＩＬ－１５を有する培地中で６～１３日間インキュベートした。

【0288】

細胞傷害性アッセイのために、ＥＧＦＲを発現しているヒトがん細胞系を培養物から収集し、細胞をＨＢＳで洗浄し、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＤ０１１６）で標識するために成長培地に１０^６／ｍＬで再懸濁した。標的細胞の標識については製造業者の使用説明書に従った。標識後、細胞をＨＢＳで３回洗浄し、培養培地に０．５～１．０×１０^５／ｍＬで再懸濁した。バックグラウンドウェルを調製するために、標識細胞のアリコートを取っておき、遠心して細胞から培地を除いた。１００μＬの培地を３連でウェルに慎重に添加して、ペレット化細胞を乱さないようにした。１００μＬのＢＡＴＤＡ標識細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。複数のウェルを、標的細胞からの自発的放出のために保全し、複数のウェルを、標的細胞の最大溶解のために１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘの添加によって調製した。モノクローナル抗体（例えば、セツキシマブ）またはＥＧＦＲに対するＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３およびＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－４）を培養培地に希釈し、５０μＬの希釈ｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを各ウェルに添加した。静止ＮＫ細胞を培養物から収集し、細胞を洗浄し、所望のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比に応じて、培養培地に１０^５～２．０×１０^６個細胞／ｍＬで再懸濁した。５０μｌのＮＫ細胞懸濁液を合計２００μｌの培養体積になるようプレートの各ウェルに添加した。プレートを５％ＣＯ_２で、３７℃で２～３時間インキュベートした後、アッセイを行った。

【0289】

２～３時間培養した後、プレートをインキュベーターから取り出し、２００ｇで５分間遠心分離することにより、細胞をペレット化した。２０μＬの培養物上清を製造業者から提供された新しいマイクロプレートに移し、２００μＬの室温ユーロピウム溶液を各ウェルに添加した。プレートを光から保護し、２５０ｒｐｍで１５分間、プレートシェーカー上でインキュベートし、次いで、Ｖｉｃｔｏｒ ３またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３Ｘ機器のいずれかを使用して読み取った。特異的溶解％を以下の通り計算した：
特異的溶解％＝（（実験放出－自発的放出）／（最大放出－自発的放出））×１００％。

【0290】

図２８および２９に示されるように、ＥＧＦＲ ＴｒｉＮＫＥＴまたは抗ＥＧＦＲ ｍＡｂのセツキシマブの存在下のそれぞれＨ２１７２細胞（図２８）および７８６－０細胞（図２９）のヒトＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の溶解物を、２時間のインキュベーション内に観察した。両方の系において、複数のドナーにわたって（データは示さない）、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴはｎＭ以下のＥＣ５０値を有していた。低い活性から活性が存在しないセツキシマブと比較して、ＴｒｉＮＫＥＴは、より大きい最大特異的溶解および効力を提供した。
（実施例６）
ＴｒｉＮＫＥＴによって媒介されるＮＫ ＩＦＮ－ガンマ産生の評価

【0291】

この実施例は、ＥＧＦＲ発現がん細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化するＥＧＦＲ標的化ＴｒｉＮＫＥＴの能力を評価するために設計した。簡潔には、ＢＴ－４７４ ＥＧＦＲ発現がん細胞は標的細胞として働いた。単離ＮＫ細胞（複数のヒトドナーに由来する）を、補充サイトカインなしの培養培地中または組換えヒトＩＬ－２を有する培養培地中のいずれかで一晩静置した。静止ＮＫ細胞を、エフェクター細胞（ＮＫ細胞）の標的細胞に対する比（Ｅ：Ｔ比）が２：１で標的細胞とともに２４時間インキュベートした一方、ＩＬ－２活性化ＮＫ細胞を、Ｅ：Ｔ比が１：１で標的細胞とともに２４時間インキュベートした。インキュベーション後、ＮＫ細胞からのＩＦＮ－γの分泌を、製造業者Ｍｅｓｏｓｃａｌｅの使用説明書に従って、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキットを使用して分析した。プレートをＶｉｃｔｏｒ ３またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３Ｘ機器のいずれかを使用して読み取った。

【0292】

図３０および図３１は、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴまたは抗ＥＧＦＲ ｍＡｂのセツキシマブの存在下でのＢＴ－４７４細胞とのインキュベーション後、それぞれ、静止ＮＫ細胞（図３０）およびＩＬ－２活性化ＮＫ細胞（図３１）からの生じたＩＦＮ－ガンマ産生を示す。両方の場合において、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴは、セツキシマブで処理された細胞と比較して、ＮＫ細胞によるＩＦＮ－ガンマのより高い産生を媒介した。
（実施例７）
ＥＧＦＲ細胞増殖アッセイ

【0293】

この実施例は、エフェクター細胞の非存在下でＥＧＦＲ発現ヒトがん細胞系Ｈ２９２の増殖に対するＥＧＦＲ ＴｒｉＮＫＥＴの影響を評価するために設計した。簡潔には、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴおよび抗ＥＧＦＲ－ｍＡｂのセツキシマブおよびパニツムマブを希釈し、Ｈ２９２細胞とともに７２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞増殖を、製造業者の使用説明書に従って、Ｃｅｌｌ－ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏを使用して測定した。

【0294】

図３２は、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴまたは抗ＥＧＦＲ ｍＡｂの存在下でのＨ２９２細胞増殖を示す。抗ＥＧＦＲ ｍＡｂで処理された細胞は、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴで処理されたものよりも低い増殖を示した。これは、ＴｒｉＮＫＥＴおよびｍＡｂの価数の相違－ＴｒｉＮＫＥＴは一価であるが、ｍＡｂは二価である－に原因があり、ｍＡｂにおいて観察された皮膚関連毒性とのＥＧＦＲ標的化の関連を考えると、より低い価数のＴｒｉＮＫＥＴを使用する利益を実証した。
（実施例８）
ＡＤＣＰ活性アッセイ

【0295】

この実施例は、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴの存在下でＥＧＦＲ発現標的細胞とインキュベートした場合のマクロファージの抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）活性を評価するために設計した。簡潔には、ＰＢＭＣを、密度勾配遠心法を使用してヒト末梢血バフィーコートから単離した。単離ＰＢＭＣを洗浄し、単球単離のために調製した。単球細胞を、磁気ビーズによる負の選択技術を使用して単離し、単離単球細胞の純度は典型的には＞９０％ＣＤ１４であった。単球は、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４中で６日間インキュベートすることによってマクロファージに分化した。

【0296】

マクロファージを収集し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで標識し、ＣＦＳＥ標識標的細胞（８：１）および分子とともに２時間インキュベートした。細胞を染色し、ＦＡＣＳ解析のために調製した。ファゴサイトーシスを以下：
ファゴサイトーシス％＝親ゲート「標的＋」のうちの標的＋およびエフェクター＋％
の通り計算した。

【0297】

図３３に示されるように、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－３およびＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－４の存在下でＥＧＦＲ発現Ｈ２９２細胞とインキュベートされたマクロファージは、抗ＥＧＦＲ ｍＡｂのセツキシマブの存在下でインキュベートされたものよりも高いＡＤＣＰ活性を示した。結果は、ＣＤ１６に結合するＴｒｉＮＫＥＴの能力がＦｃドメインにおけるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）変異によって抑止された場合に、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ－１のＡＤＣＰ活性が失われたことも示した。
（実施例９）
ｉｎ ｖｉｖｏでのＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴの抗腫瘍有効性

【0298】

この実施例は、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴがｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍機能を誘発するかを試験するために設計した。簡潔には、ヌードマウスに、４×１０^６個のＮＣＩ－Ｈ２９２腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍サイズが平均して約９０ｍｍ^３体積になったときに（接種後７日目）、マウスを異なる処置群に無作為化した。マウスを、ｈＩｇＧ１アイソタイプ、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴまたはセツキシマブで週に２回腹腔内（ＩＰ）処置した。

【0299】

ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴは、アイソタイプ処置動物と比較して、３００μｇ／用量または１００μｇ／用量で投与されたマウスにおいてＮＣＩ－Ｈ２９２腫瘍成長を有意に低減した（ｐ＜０．０１；図３４Ａ～Ｃ）。図３４Ａは、３００μｇ、１００μｇ、３０μｇのＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ、またはｈＩｇＧ１アイソタイプ対照で処置された個々のマウスの平均腫瘍体積を示す。図３４Ｂは、３００μｇのＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ、またはｈＩｇＧ１アイソタイプ対照で処置された個々のマウスの腫瘍体積を示す。図３４Ｃは、１００μｇのＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ、またはｈＩｇＧ１アイソタイプ対照で処置された個々のマウスの腫瘍体積を示す。図３４Ｄは、３０μｇのＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ、またはｈＩｇＧ１アイソタイプ対照で処置された個々のマウスの腫瘍体積を示す。図３４Ａ、図３４Ｂおよび図３４Ｃに示されるように、３００μｇおよび１００μｇのＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴによるマウスの処置は、ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較して、腫瘍体積を有意に低減した。図３４Ｄに示されるように、３０μｇ／用量のＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴによるマウスの処置は、ｈＩｇＧ１処置対照群と比較して、腫瘍進行を有意に遅延させた。

【0300】

ｉｎ ｖｉｖｏでのＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴ用量滴定に加えて、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴによって媒介される抗腫瘍有効性を、等モル用量の１００μｇセツキシマブでのセツキシマブと比較した。図３５Ａに示されるように、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴによる個々のマウスの処置は、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍応答の誘導においてセツキシマブと同じくらい強力であった。

【0301】

特に、ＥＧＦＲ－ＴｒｉＮＫＥＴおよびセツキシマブのレジメンは、ＮＣＩ－Ｈ２９２腫瘍保持マウスによって十分な耐容性を示すと思われた。体重に対する臨床観察も効果もなかった（図３５Ｂ）。
参照による組み込み

【0302】

そうでないと述べられない限り、本明細書で参照される特許文献および科学論文の各々の開示全体は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
均等物

【0303】

本願は、その精神からも本質的な特徴からも逸脱することなく、他の具体的な形態で具体化され得る。そのため、前記実施形態は、あらゆる点で、本明細書に記載される本願を限定するのではなく、例示的なものとみなされるべきである。よって、本願の範囲は、前記説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価性の意味および範囲に入る全ての変更がそこに包含されることが意図される。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34-1】

【図34-2】

【図35】

【配列表】

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