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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-22
(45)【発行日】2024-10-30
(54)【発明の名称】核酸封入ＡＡＶ中空粒子の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20241023BHJP
C12N 15/35 20060101ALI20241023BHJP
C12N 15/87 20060101ALI20241023BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N15/35 ZNA
C12N15/87 Z
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2021529175
(86)(22)【出願日】2020-07-02
(86)【国際出願番号】 JP2020025961
(87)【国際公開番号】W WO2021002412
(87)【国際公開日】2021-01-07
【審査請求日】2023-06-15
(31)【優先権主張番号】P 2019124647
(32)【優先日】2019-07-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度 国立研究開発法人日本医療研究開発機構 産学連携医療イノベーション創出プログラム「ＡＡＶ中空粒子を活用した核酸医薬のＤＤＳ」委託研究開発 産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】500557048
【氏名又は名称】学校法人日本医科大学
(73)【特許権者】
【識別番号】302019245
【氏名又は名称】タカラバイオ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】岡田 尚巳
(72)【発明者】
【氏名】峰野 純一
(72)【発明者】
【氏名】蝶野 英人
【審査官】福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／１３９６３７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１２／１４４４４６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１３／０３３４０７（ＷＯ，Ａ２）
【文献】Scientific Reports，2017年，Vol.7, No.1:5432，pp.1-13
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の核酸封入中空粒子の製造方法；（１）ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）のＡ領域の配列及びＤ’領域の配列（ＡＤ配列）又はＡＤ配列の相補配列、及び目的の遺伝子配列を含む直鎖状核酸断片を調製する工程、ここで、該ＡＤ配列又はＡＤ配列の相補配列は分子内のアニーリングを生じない、
（２）ＡＡＶの中空粒子を産生する細胞に（１）の核酸断片を導入する工程、及び
（３）（２）の細胞を培養する工程。
【請求項2】
核酸断片が、５’末端から３’末端に向かって、ＡＤ配列又はＡＤ配列の相補配列、及び目的の遺伝子配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項3】
核酸断片が、５’末端から３’末端に向かって、目的の遺伝子配列及び、ＡＤ配列又はＡＤ配列の相補配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項4】
核酸断片が、ＡＡＶ ＩＴＲのＡ’領域の配列を含まない、請求項１記載の方法。
【請求項5】
核酸断片を調製する工程が、核酸増幅反応による核酸断片の増幅を含む工程である、請求項１記載の方法。
【請求項6】
中空粒子を産生する細胞が、ＡＡＶのＣａｐ遺伝子、Ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶのヘルパー機能が導入された細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項7】
核酸断片が２本鎖の核酸又は１本鎖の核酸である、請求項１記載の方法。
【請求項8】
核酸断片のＡＤ配列領域が２本鎖で、目的の遺伝子配列領域が１本鎖の核酸である、請求項１記載の方法。
【請求項9】
ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）のＡ領域の配列及びＤ’領域の配列（ＡＤ配列）又はＡＤ配列の相補配列、及び目的の遺伝子配列を含み、ここで、該ＡＤ配列又はＡＤ配列の相補配列は分子内のアニーリングを生じない、直鎖状核酸断片。
【請求項10】
５’末端から３’末端に向かって、ＡＤ配列又はＡＤ配列の相補配列、及び目的の遺伝子配列を含む、請求項９記載の核酸断片。
【請求項11】
５’末端から３’末端に向かって、目的の遺伝子配列及び、ＡＤ配列又はＡＤ配列の相補配列を含む、請求項９記載の核酸断片。
【請求項12】
ＡＡＶ ＩＴＲのＡ’領域の配列を含まない、請求項９記載の核酸断片。
【請求項13】
２本鎖の核酸又は１本鎖の核酸である、請求項９記載の核酸断片。
【請求項14】
核酸断片のＡＤ配列領域が２本鎖で、目的の遺伝子配列領域が１本鎖の核酸である、請求項９記載の核酸断片。
【請求項15】
請求項９～１４いずれか１項記載の直鎖状核酸断片を包含する、ＡＡＶの核酸封入中空粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸が封入されたＡＡＶ中空粒子を製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒトを含む哺乳動物細胞、組織又は個体に目的の遺伝子を導入し、発現させるために、様々な遺伝子導入技術が開発されている。ウイルスベクターも、その一つであり、レンチウイルス、オンコレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等に由来する種々のベクターが知られている。
【0003】
中でも、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ）ベクターは、近年、遺伝子治療において有用な遺伝子導入ベクターとして期待されている。ＡＡＶは、パルボウイルスに属する非病原性のウイルスで、自己複製能を欠損しているため自律的増殖ができず、増殖にはアデノウイルスやヘルペスウイルスの共感染を必要とするため伝搬性が低いとされている。また宿主において免疫原性が低い性質も有する。そのような特徴から遺伝子導入ベクターとして、安全性が高いという利点を有している。加えて、宿主域が広いことから種々の細胞に感染可能であり、各血清型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１～ＡＡＶ９）に由来するベクターも開発されていることから、それぞれの血清型における感染標的細胞の特異性を応用して、神経細胞、筋細胞、肝細胞等、特定の細胞、組織及び器官への遺伝子導入に利用されている。しかし、ＡＡＶをはじめとする従来のウイルスベクターは、自己複製能の獲得や、野生型ウイルス混入等の様々な問題点があった。
【0004】
上記問題点を解決するため、Ｓａｍｕｌｓｋｉらは、ＡＡＶの外殻タンパク質を構成するキャプシドを調製し、これを薬剤の送達担体として利用することを提唱した（特許文献１）。キャプシドで形成され、内部にＡＡＶウイルスゲノムを含まないＡＡＶ中空粒子は、標的細胞の特異的認識、細胞への吸着と侵入、脱穀等のウイルスの初期感染活性は有するが、自己複製に必要なウイルス由来の遺伝子を有さないためウイルスの増殖活性はない。したがって、中空粒子は、タンパク質や核酸等の薬剤を標的細胞に特異的に送達させることが可能であり、投与個体に対する安全性を兼ね備えた理想的な薬剤送達系（ＤＤＳ：Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）の担体である。
【0005】
Ｓａｍｕｌｓｋｉらは、中空粒子を尿素、熱やｐＨの条件によって一旦変性させ、薬剤を内部に取り込ませた後に再構成させる導入方法を提示している（特許文献１）。しかし、尿素等の変性剤を中空粒子に作用させると、キャプシドが有する初期感染活性が低下し、送達担体としての機能が損なわれる問題があった。また、Ｏｋａｄａらは、界面活性剤を用いて中空粒子にタンパク質や核酸を導入する方法を開示している（特許文献２）。
【0006】
ＡＡＶの複製過程において、ＤＮＡゲノムが環状の２本鎖ＤＮＡ（ｃＡＡＶ）の形態を取りうることが知られている。この２本鎖ＤＮＡは、逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を１つ有している。Ｍｕｓａｔｏｖらは、ＡＡＶのゲノムＤＮＡの複製及び封入には、ＩＴＲのＡ領域の配列及びＤ’領域の配列からなる配列（ＡＤ配列）が必要であることを報告している（非特許文献１）。Ｍｕｓａｔｏｖらは、ＡＤ配列を含む環状２本鎖ＤＮＡを細胞に導入させて、ＤＮＡが封入されたＡＡＶ中空粒子を製造することを開示する。また、Ｏｋａｄａらは、ＡＤ配列及びその相補的な配列（Ａ’領域の配列及びＤ領域の配列）を含む核酸断片を細胞に導入させて、核酸が封入されたＡＡＶ中空粒子を製造すること開示している（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】米国特許第５，８６３，５４１号公報
【文献】国際公開第２０１２／１４４４４６号パンフレット
【文献】国際公開第２０１８／１３９６３７号パンフレット
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｍｕｓａｔｏｖ，ｅｔ ａｌ．，２００２，ｖｏｌ．７６，Ｎｏ．２４， ｐ．１２７９２－１２８０２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、より簡便で効率的な中空粒子内への核酸封入方法を開発し、それを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、より簡便かつ効率的な方法で、ウイルスの初期感染活性を維持したまま核酸が封入された中空粒子を製造することに成功した。また、この核酸封入中空粒子と標的細胞を混合することにより、中空粒子に内包された核酸を該標的細胞内に効果的に導入できることも確認した。本発明は、これらの知見と結果に基づくものであり、以下を提供するものである。
【0011】
すなわち、本発明は、
［１］以下の工程を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の核酸封入中空粒子の製造方法；
（１）ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）のＡ領域の配列及びＤ’領域の配列（ＡＤ配列）及び／又はＡＤ配列の相補配列、及び目的の遺伝子配列を含む直鎖状核酸断片を調製する工程、
（２）ＡＡＶの中空粒子を産生する細胞に（１）の核酸断片を導入する工程、及び
（３）（２）の細胞を培養する工程、
［２］核酸断片が、５’末端から３’末端に向かって、ＡＤ配列及び／又はＡＤ配列の相補配列、及び目的の遺伝子配列を含む、［１］記載の方法、
［３］核酸断片が、５’末端から３’末端に向かって、目的の遺伝子配列、及びＡＤ配列及び／又はＡＤ配列の相補配列を含む、［１］記載の方法、
［４］核酸断片が、ＡＡＶ ＩＴＲのＡ’領域の配列を含まない、［１］記載の方法、
［５］核酸断片を調製する工程が、核酸増幅反応による核酸断片の増幅を含む工程である、［１］記載の方法、
［６］中空粒子を産生する細胞が、ＡＡＶのＣａｐ遺伝子、Ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶのヘルパー機能が導入された細胞である、［１］記載の方法、
［７］ 核酸断片が２本鎖の核酸又は１本鎖の核酸である、［１］記載の方法、
［８］ 核酸断片のＡＤ配列領域が２本鎖で、目的の遺伝子配列領域が１本鎖の核酸である、［１］記載の方法、
［９］ ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）のＡ領域の配列及びＤ’領域の配列（ＡＤ配列）又はＡＤ配列の相補配列、及び目的の遺伝子配列を含む直鎖状核酸断片、
［１０］ ５’末端から３’末端に向かって、ＡＤ配列又はＡＤ配列の相補配列、及び目的の遺伝子配列を含む、［９］記載の核酸断片、
［１１］ ５’末端から３’末端に向かって、目的の遺伝子配列及び、ＡＤ配列又はＡＤ配列の相補配列を含む、［９］記載の核酸断片、
［１２］ ＡＡＶ ＩＴＲのＡ’領域の配列を含まない、［９］記載の核酸断片、
［１３］ ２本鎖の核酸又は１本鎖の核酸である、［９］記載の核酸断片、
［１４］ 核酸断片のＡＤ配列領域が２本鎖で、目的の遺伝子配列領域が１本鎖の核酸である、［９］記載の核酸断片、
［１５］ ［９］～［１４］いずれか１項記載の直鎖上核酸断片を包含する、ＡＡＶの核酸封入中空粒子、に関する。
［１］以下の工程を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の核酸封入中空粒子の製造方法；
（１）ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）のＡ領域の配列及びＤ’領域の配列（ＡＤ配列）及び／又はＡＤ配列の相補配列、及び目的の遺伝子配列を含む直鎖状核酸断片を調製する工程、
（２）ＡＡＶの中空粒子を産生する細胞に（１）の核酸断片を導入する工程、及び
（３）（２）の細胞を培養する工程、
［２］核酸断片が、５’末端から３’末端に向かって、ＡＤ配列及び／又はＡＤ配列の相補配列、及び目的の遺伝子配列を含む、［１］記載の方法、
［３］核酸断片が、５’末端から３’末端に向かって、目的の遺伝子配列、及びＡＤ配列及び／又はＡＤ配列の相補配列を含む、［１］記載の方法、
［４］核酸断片が、ＡＡＶ ＩＴＲのＡ’領域の配列を含まない、［１］記載の方法、
［５］核酸断片を調製する工程が、核酸増幅反応による核酸断片の増幅を含む工程である、［１］記載の方法、
［６］中空粒子を産生する細胞が、ＡＡＶのＣａｐ遺伝子、Ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶのヘルパー機能が導入された細胞である、［１］記載の方法、
［７］ 核酸断片が２本鎖の核酸又は１本鎖の核酸である、［１］記載の方法、
［８］ 核酸断片のＡＤ配列領域が２本鎖で、目的の遺伝子配列領域が１本鎖の核酸である、［１］記載の方法、
［９］ ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）のＡ領域の配列及びＤ’領域の配列（ＡＤ配列）又はＡＤ配列の相補配列、及び目的の遺伝子配列を含む直鎖状核酸断片、
［１０］ ５’末端から３’末端に向かって、ＡＤ配列又はＡＤ配列の相補配列、及び目的の遺伝子配列を含む、［９］記載の核酸断片、
［１１］ ５’末端から３’末端に向かって、目的の遺伝子配列及び、ＡＤ配列又はＡＤ配列の相補配列を含む、［９］記載の核酸断片、
［１２］ ＡＡＶ ＩＴＲのＡ’領域の配列を含まない、［９］記載の核酸断片、
［１３］ ２本鎖の核酸又は１本鎖の核酸である、［９］記載の核酸断片、
［１４］ 核酸断片のＡＤ配列領域が２本鎖で、目的の遺伝子配列領域が１本鎖の核酸である、［９］記載の核酸断片、
［１５］ ［９］～［１４］いずれか１項記載の直鎖上核酸断片を包含する、ＡＡＶの核酸封入中空粒子、に関する。
【発明の効果】
【0012】
本発明により、より簡便で効率的に、核酸が封入された中空粒子を製造する方法が提供される。本発明における「核酸が封入されたＡＡＶ中空粒子」は、直鎖状の核酸断片が封入された、完全なＡＡＶゲノムを保持していないＡＡＶ様粒子であり、通常のＡＡＶとは相違する。
【0013】
本発明の中空粒子の製造方法によれば、ウイルスに由来する配列を少なくして安全性及び細胞毒性を低減させ、従来の方法に比べて簡便かつ高効率に目的の核酸を中空粒子に封入することができる。それによって安全性が高く、かつ標的細胞特異性を有する中空粒子を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】ＡＤ配列を含む直鎖状核酸断片を用いて調製したＡＡＶ中空粒子の力価を測定した結果を示す図である。
【図2】ＡＤ配列を含む直鎖状核酸断片を用いて調製したＡＡＶ中空粒子の力価を測定した結果を示す図である。
【図3】ＡＤ配列を含む直鎖状核酸断片を用いて調製したＡＡＶ中空粒子による遺伝子導入を測定した結果を示す図である。
【図4】ＡＡＶのＩＴＲの領域を示す図である。
【図5】実施例１～３の概要を示す図である。
【図6】実施例４でＡＡＶ中空粒子に封入した直鎖状核酸断片を示す図である。
【図7】ＡＤ配列を含む直鎖状核酸断片を用いて調製したＡＡＶ中空粒子による遺伝子導入を測定した結果を示す図である。
【図8】実施例５でＡＡＶ中空粒子に封入した直鎖状核酸断片を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本明細書において「逆方向末端反復（ＩＴＲ：ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）」は、ＡＡＶのゲノムＤＮＡの両端に存在するシス要素を意味する。ＩＴＲはＡＡＶゲノムＤＮＡの複製、増幅、封入に必須である。ＩＴＲにはＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ、ＲＢＥとも記載される）及び末端分離部位（ＴＲＳ）並びにヘアピン形成を可能にする回文配列が含まれる。ＩＴＲは末端から順に、Ａ領域、Ｂ領域、Ｂ’領域、Ｃ領域、Ｃ’領域、Ａ’領域を含む。Ａ領域とＡ’領域、Ｂ領域とＢ’領域、Ｃ領域とＣ’領域はそれぞれ逆方向の相補配列であり、それぞれの領域がアニーリングして２本鎖となり図４に示すようなハンマーヘッド構造を形成する。Ａ’領域の末端のうち、Ｃ’領域の反対側（３’末端側又は５’末端側）にＤ領域が存在する。
【0016】
本明細書において「３’末端側」とは、ある配列（領域）の３’末端部分の、さらに３’末端の方向に位置することを意味する。同様に、「５’末端側」とは、ある配列（領域）の５’末端部分の、さらに５’末端の方向に位置することを意味する。したがって、本明細書において「３’末端側」又は「５’末端側」と記載されている場合、ある配列（領域）の３’末端部分又は５’末端部分に接して目的の配列等が配置されること、及びある配列（領域）の３’末端部分又は５’末端部分に接しないで目的の配列等が配置される（すなわち、ある配列（領域）の３’末端部分又は５’末端部分と目的の配列等の間に任意の配列が介在する）ことの両方を包含する。
【0017】
本発明において「キャプシド（ｃａｐｓｉｄ）」は、ウイルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ）を構成する要素の１つで、ゲノムＤＮＡ又はコアを取り囲む複数の単位タンパク質（カプソメア：ｃａｐｓｏｍｅｒｅ）からなる外皮（ｃｏａｔ）又は殻（ｓｈｅｌｌ）を意味する。キャプシドの内部にウイルス核酸、コア又は他の物質を何も含まないキャプシドタンパク質のみから構成された粒子を、本明細書では「中空粒子（ｅｍｐｔｙ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」と呼び、「中空キャプシド粒子（ｅｍｐｔｙ ｃａｐｓｉｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」と呼ぶ場合もある。
【0018】
本発明において「目的の遺伝子」は、中空粒子に封入され標的細胞に導入されることが望まれる任意の遺伝子を意味する。目的の遺伝子は、構造遺伝子（例えば、酵素、転写因子、レポーター分子、増殖因子、抗原タンパク質等の機能性タンパク質の遺伝子及びその断片）及び調節遺伝子（例えば、アンチセンスＤＮＡ、機能性ＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム等）をコードする遺伝子等）を含む。さらに、目的の遺伝子は、転写や翻訳を制御する調節エレメント、例えばプロモーター配列、エンハンサー配列、ポリＡ付加シグナル配列、ターミネーター配列等を含んでいてもよい。すなわち、細胞内においてタンパク質や機能性核酸を発現しうる配列を目的の遺伝子とすることができる。
【0019】
以下に本発明について詳細に説明する。
【0020】
１つの態様として、本発明は以下の工程を含むＡＡＶの核酸封入中空粒子の製造方法である；
（１）ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）のＡ領域の配列及びＤ’領域の配列（ＡＤ配列）又はＡＤ配列の相補配列、及び目的の遺伝子配列を含む直鎖状核酸断片を調製する工程、
（２）ＡＡＶの中空粒子を産生する細胞に（１）の核酸断片を導入する工程、及び
（３）（２）の細胞を培養する工程。
（１）ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）のＡ領域の配列及びＤ’領域の配列（ＡＤ配列）又はＡＤ配列の相補配列、及び目的の遺伝子配列を含む直鎖状核酸断片を調製する工程、
（２）ＡＡＶの中空粒子を産生する細胞に（１）の核酸断片を導入する工程、及び
（３）（２）の細胞を培養する工程。
【0021】
（Ａ）核酸を調製する工程
前記（１）工程の直鎖状核酸断片は、ＡＤ配列又はＡＤ配列の相補配列、及び目的の遺伝子配列を含む。ＡＤ配列は、公知の天然ＡＡＶ血清型のゲノムＤＮＡの配列（例えば、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１）が使用できる。各血清型のＩＴＲにおいて、Ａ領域、Ｂ領域、Ｂ’領域、Ｃ領域、Ｃ’領域、Ａ’領域が特定されている。Ｄ領域は、ＩＴＲのＡ’領域の末端のうち、Ｃ’領域の反対側（３’末端側又は５’末端側）に存在する。各血清型のＤ領域の配列及びそのＤ領域の配列に相補的で逆方向の配列であるＤ’領域の配列も特定されている。Ａ領域、Ａ’領域、Ｄ領域、及びＤ’領域は、異なる血清型に由来してもよい。さらに、Ｒｅｐとの結合能及びヘアピン形成能を保持する範囲内において、天然のＡ領域の配列の変異体も使用でき、その場合のＡ’領域の配列は変異体のＡ領域の配列と相補的である。また、本発明は天然のＤ領域の配列の変異体も使用でき、その場合のＤ’領域の配列は変異体のＤ領域の配列と相補的である。
前記（１）工程の直鎖状核酸断片は、ＡＤ配列又はＡＤ配列の相補配列、及び目的の遺伝子配列を含む。ＡＤ配列は、公知の天然ＡＡＶ血清型のゲノムＤＮＡの配列（例えば、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１）が使用できる。各血清型のＩＴＲにおいて、Ａ領域、Ｂ領域、Ｂ’領域、Ｃ領域、Ｃ’領域、Ａ’領域が特定されている。Ｄ領域は、ＩＴＲのＡ’領域の末端のうち、Ｃ’領域の反対側（３’末端側又は５’末端側）に存在する。各血清型のＤ領域の配列及びそのＤ領域の配列に相補的で逆方向の配列であるＤ’領域の配列も特定されている。Ａ領域、Ａ’領域、Ｄ領域、及びＤ’領域は、異なる血清型に由来してもよい。さらに、Ｒｅｐとの結合能及びヘアピン形成能を保持する範囲内において、天然のＡ領域の配列の変異体も使用でき、その場合のＡ’領域の配列は変異体のＡ領域の配列と相補的である。また、本発明は天然のＤ領域の配列の変異体も使用でき、その場合のＤ’領域の配列は変異体のＤ領域の配列と相補的である。
【0022】
本発明で使用する直鎖状核酸断片は、Ａ’領域の配列（配列番号８）を含まない。すなわち、直鎖状核酸断片に含まれるＡ領域の配列との分子内のアニーリングは生じず、Ａ領域の配列の２次構造を形成しない。さらに、直鎖状核酸断片は、５’末端から３’末端に向かって、Ｄ領域の配列－Ａ’領域の配列である配列を含まない。すなわち、直鎖状核酸断片に含まれるＡＤ配列との分子内のアニーリングは生じず、ＡＤ配列の２次構造を形成しない。さらに前記核酸断片は、Ｂ領域、Ｂ’領域、Ｃ領域及びＣ’領域からなる群より選択される少なくとも１つの領域の配列を欠損している。より好適には、前記核酸断片はＢ領域、Ｂ’領域、Ｃ領域及びＣ’領域の配列を欠損している。
【0023】
本発明の一態様として、前記（１）工程の直鎖状核酸断片は、５’末端から３’末端に向かって、ＡＤ配列又はＡＤ配列の相補配列、及び目的の遺伝子配列を含む。また、別の態様の直鎖状核酸断片は、５’末端から３’末端に向かって、目的の遺伝子配列及び、ＡＤ配列又はＡＤ配列の相補配列を含む。
【0024】
前記（１）工程の直鎖状核酸断片は、目的の遺伝子配列を含む。目的の遺伝子はＡＡＶに対して外来性であり得る。
【0025】
前記（１）工程の直鎖状核酸断片は、少なくとも１つのＡＤ配列又はＡＤ配列の相補配列を含む。本発明は、ＡＤ配列又はＡＤ配列の相補配列を１つ含む核酸断片、２つ含む核酸断片、３つ含む核酸断片、４つ含む核酸断片又は５つ以上含む核酸断片、例えば、１～３つ含む核酸断片が使用できる。
【0026】
前記（１）工程の直鎖状核酸断片は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、好ましくはＤＮＡである。さらに当該核酸断片は、相補的な２分子の核酸がアニールした２本鎖の核酸でもよく、１分子の１本鎖の核酸でもよい。なお、直鎖状の核酸とは、核酸の両端が共有結合により結合していないことを意味する。また、核酸断片は全ての配列が２本鎖の核酸でもよく、配列の一部が１本鎖で残部が２本鎖の核酸でもよい。例えば、核酸断片は、ＡＤ配列の領域が２本鎖で、目的の遺伝子配列の領域が１本鎖の核酸としてもよい。なお、核酸断片の２本鎖の部分において、１ヶ所、２ヶ所又は複数ヶ所にリン酸結合（ヌクレオチド結合）を有しない核酸断片でもよい。本発明の一態様として、直鎖状核酸断片は、目的の遺伝子配列を含む１本鎖の核酸、ＡＤ配列を含む１本鎖の核酸、及び目的の遺伝子配列とＡＤ配列に相補的な１本鎖の核酸の３分子をアニールさせた２本鎖の核酸である。なお、ＡＤ配列を含む２本鎖の核酸がＡＤ配列の相補鎖を含み、また、ＡＤ配列の相補鎖を含む２本鎖核酸がＡＤ配列を含むことは当然である。
【0027】
前記（１）工程の直鎖状核酸断片は、公知の核酸調製方法により調製することができる。当該核酸断片は、ＰＣＲ等の核酸増幅反応、化学合成によりインビトロで調製することができる。また当該核酸は、真核細胞内、原核細胞内などのインビボで、ポリメラーゼ反応、複製及び／又は転写により生成した核酸を細胞から精製して調製することができる。なお、この直鎖状核酸断片も一つの態様として本発明に包含される。
【0028】
本発明の一態様として、前記（１）工程の直鎖状核酸断片に含まれるＡＤ配列は、ＡＡＶ２由来の配列であり、そのＡ領域の配列を配列番号９に、Ｄ’領域の配列を配列番号１０に示す。また、ＡＡＶ２のＡ’領域の配列を配列番号８に、Ｄ領域の配列を配列番号１１に示す。また、ＡＡＶ２のＡＤ配列を配列番号１に、ＡＤ配列の相補配列を配列番号１８に示す。
【0029】
前記（１）工程の核酸断片は、天然型核酸、化学修飾核酸、人工核酸、核酸類似体及びそれらの組合せを含む。天然型核酸は、自然界に存在する天然型ヌクレオチドのみが連結してなるＤＮＡ及びＲＮＡである。化学修飾核酸は、人工的に化学修飾をされた核酸であり、例えば、メチルホスホネート型ＤＮＡ／ＲＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡ／ＲＮＡ（ＰＳ化ＤＮＡ／ＲＮＡ）、ホスホルアミデート型ＤＮＡ／ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル型ＤＮＡ／ＲＮＡ等が例示される。人工核酸は、天然型核酸の一部に非天然型ヌクレオチドを含む核酸又は非天然型ヌクレオチドのみが連結してなる核酸である。ここでいう「非天然型ヌクレオチド」とは、前記天然型ヌクレオチドに類似の性質及び／又は構造を有する人工的に構築された又は人工的に化学修飾された自然界に存在しないヌクレオチドをいう。核酸類似体は、天然型核酸に類似の構造及び／又は性質を有する人工的に構築された高分子化合物である。例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ：Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、２’－Ｆ、２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌ（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ（２’－ＭＯＥ）、架橋化核酸、モルフォリノ核酸（ホルフォリノオリゴを含む）等が例示される。架橋化核酸は、ＢＮＡ／ＬＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ／Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ＢＮＡ）が例示される。本発明の一態様として、核酸断片はＡＤ配列又はＡＤ配列の相補配列の領域が天然型核酸で、目的の遺伝子配列の領域が人工核酸である。
【0030】
前記核酸は、必要に応じて、リン酸基、糖及び／又は塩基が標識されていてもよい。標識には、当該分野で公知の標識物質を利用することができる。例えば、放射性同位元素（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ）、ＤＩＧ、ビオチン、蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ、ｃｙ３、ｃｙ５、ｃｙ７、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、Ｒｏｘ、ＴＥＴ、Ｂｏｄｉｐｙ４９３、ＮＢＤ、ＴＡＭＲＡ）、又は発光物質（例えば、アクリジニウムエステル）が挙げられる。
【0031】
前記（１）工程の核酸断片は、公知の精製方法や市販の製品を使用して精製・抽出した核酸を使用することができる。公知の精製方法としては、フェノール／クロロホルム混合液による抽出、アルコール沈澱、カラム精製、フィルター濾過、アガロースゲル電気泳動等による精製方法が例示される。
【0032】
前記核酸断片のサイズは、ＡＡＶ中空粒子に包含可能なサイズであれば限定はされないが、通常は５ｋｂ以下である。また、前記（１）工程の核酸断片は天然の完全なＡＡＶゲノムの配列を含まず、ＡＡＶのＲｅｐ遺伝子及び／又はＡＡＶのＣａｐ遺伝子の配列を欠損している。また、前記核酸断片は天然の完全なＩＴＲの配列を保持していない。
【0033】
（Ｂ）核酸を細胞に導入する工程
前記（１）工程の核酸断片を、ＡＡＶの中空粒子を産生する細胞に導入する。核酸断片を導入する細胞は、例えば、マウス細胞、及び霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）などを含む哺乳類細胞、昆虫細胞などの様々な真核細胞が使用できる。本明細書において、ＡＡＶや核酸封入中空粒子を産生する細胞をパッケージング細胞又はプロデューサー細胞ともいうことがある。適当な哺乳類細胞は、初代細胞及び細胞株を含むがこれらに限定されるものではなく、適当な細胞株として、ＨＥＫ２９３細胞、２９３ＥＢ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＣＨＯ細胞やこれらの細胞から派生した細胞などが挙げられる。適当な昆虫細胞は、初代細胞及び細胞株を含むがこれらに限定されるものではなく、適当な細胞株として、Ｓｆ９細胞やこれらの細胞から派生した細胞などが挙げられる。
前記（１）工程の核酸断片を、ＡＡＶの中空粒子を産生する細胞に導入する。核酸断片を導入する細胞は、例えば、マウス細胞、及び霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）などを含む哺乳類細胞、昆虫細胞などの様々な真核細胞が使用できる。本明細書において、ＡＡＶや核酸封入中空粒子を産生する細胞をパッケージング細胞又はプロデューサー細胞ともいうことがある。適当な哺乳類細胞は、初代細胞及び細胞株を含むがこれらに限定されるものではなく、適当な細胞株として、ＨＥＫ２９３細胞、２９３ＥＢ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＣＨＯ細胞やこれらの細胞から派生した細胞などが挙げられる。適当な昆虫細胞は、初代細胞及び細胞株を含むがこれらに限定されるものではなく、適当な細胞株として、Ｓｆ９細胞やこれらの細胞から派生した細胞などが挙げられる。
【0034】
中空粒子を産生する細胞は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子産物及びｃａｐ遺伝子産物を発現する細胞が使用される。これらの遺伝子産物は、細胞のゲノムに安定に組み込まれたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子によりコードされていてもよく、前記核酸断片の導入前、導入と同時に、又は導入後に細胞中に導入されるベクターによりコードされてもよい。ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子がベクターによりコードされている場合、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子は同一のベクターにコードされていてもよく、それぞれが別のベクターにコードされていてもよい。ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれの血清型のＡＡＶの配列（例えば、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１）であっても使用できる。さらに、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子は同じ血清型由来の配列であってもよく、異なる血清型由来の配列であってもよい。
【0035】
ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をコードするベクターには、中空粒子を産生し得る限りにおいて導入する細胞に適した発現ベクターを用いることができ、ウイルスベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、及び人工染色体が例示される。プラスミドベクターは、必要に応じて、エピソーマルで維持され得るものを使用できる。さらに、ベクターは、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子が細胞内で発現可能なように、適当な発現システム内のプロモーターとターミネーターの制御下に配置してもよい。核酸発現システムとは、遺伝子の発現に必要な発現調節エレメントを、機能可能な状態で少なくとも１組有する系である。発現調節エレメントには、プロモーター及びターミネーターの他、必要に応じてエンハンサー及びポリＡ付加シグナルが含まれる。
【0036】
中空粒子を産生する細胞には、さらにヘルパー機能が導入され得る。ヘルパー機能は、ヘルパーウイルス機能、アクセサリー機能とも呼ばれる。ヘルパー機能の導入には一般にアデノウイルスが使用されるが、例えば１型又は２型単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどのウイルスも使用することができる。ウイルスを使用する場合は、細胞にウイルスをヘルパーウイルスとして感染させる。例えば、アデノウイルスの初期遺伝子の発現のみがＡＡＶ粒子のパッケージングに必要なので、後期遺伝子発現を呈さないアデノウイルスを用いてもよい。後期遺伝子発現を欠損するアデノウイルス変異体（例えばｔｓ１００Ｋ又はｔｓ１４９アデノウイルス変異体）を使用することができる。あるいは、ヘルパーウイルスから単離したヘルパーウイルス機能に必要な核酸を使用し、ヘルパーウイルス機能を提供する核酸構築物を作製して細胞に導入することができる。ヘルパーウイルス機能を提供する構築物はＥ１遺伝子領域、Ｅ２Ａ遺伝子領域、Ｅ４ｏｒｆ６遺伝子及びＶＡ ＲＮＡをコードする遺伝子を含む、１種又は複数種のヘルパーウイルス機能を提供するヌクレオチド配列を含み、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド又は他のウイルスの形で宿主細胞に提供される。
【0037】
前記（１）工程の核酸断片を細胞に導入する方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、ポリエチレンイミン法、エレクトロポレーション法、直接的微量注入法、高速微粒子銃などが使用可能である。また市販の試薬、例えばＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３ Ｒｅａｇｅｎｔ、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２０２０（以上、Ｍｉｒｕｓ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ＣＤ Ｒｅａｇｅｎｔ（以上、ライフテクノロジーズ社製）、ＦｕＧｅｎｅ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ社製）、ＰＥＩ ｍａｘ（コスモバイオ社製）などを用いてもよい。
【0038】
前記（１）工程の核酸断片は、１０６細胞あたり、１ｎｇ～１０μｇ、好ましくは５ｎｇ～１μｇ、より好ましくは１０ｎｇ～５００ｎｇ導入する。
【0039】
（Ｃ）細胞を培養する工程
前記（Ｂ）で核酸断片を導入した細胞の培養は、細胞の種類に応じて公知の培養条件で行うことができる。例えば温度３０～３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５～１０％での培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。所望の細胞の増殖、核酸封入中空粒子の産生が達成できるのであれば前記の範囲以外の温度、湿度、ＣＯ２濃度で実施してもよい。
前記（Ｂ）で核酸断片を導入した細胞の培養は、細胞の種類に応じて公知の培養条件で行うことができる。例えば温度３０～３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５～１０％での培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。所望の細胞の増殖、核酸封入中空粒子の産生が達成できるのであれば前記の範囲以外の温度、湿度、ＣＯ２濃度で実施してもよい。
【0040】
培養用培地は公知の培地を使用することができ、例えばＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ハムＦ１２、ＲＰＭＩ－１６４０などを使用してもよく、これらはＬｏｎｚａ社、サーモフィッシャー社、シグマ・アルドリッチ社などから市販品として入手することができる。培地は無血清培地でもよく、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）やヒト血清由来のアルブミン等を添加した培地でもよい。
【0041】
培養器材としてシャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽又はバイオリアクター等の細胞培養用器材（容器）を使用することができる。なお、バッグとしては、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグが好適である。大量の細胞を必要とする場合には大型培養槽を使用してもよい。
【0042】
培養期間は特に限定はなく、例えば１２時間～１０日間、好適には２４時間～７日間が好ましい。培養中に、細胞内及び／又は培養上清に核酸封入中空粒子、すなわち内部に核酸を保持するＡＡＶ様の粒子が産生される。
【0043】
さらに本発明では、細胞の培養上清や回収した細胞を適当な緩衝液に再懸濁して破砕したもの（細胞破砕液）の遠心上清から、核酸が封入された中空粒子を取得する工程を実施し得る。本発明では、こうして得られた培養上清や細胞破砕液上清は、そのまま、あるいはさらに、例えばフィルター濾過、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離など公知の方法や市販の製品により中空粒子の濃縮、精製等を実施した後、適切な方法、例えば凍結して所望の用途に使用するまで保存することができる。
【0044】
（Ｄ）核酸封入中空粒子及び組成物
本発明は、前記（１）工程の核酸断片が封入された中空粒子（ＡＡＶ様粒子）を提供する。本発明の核酸封入中空粒子は天然の完全なＡＡＶゲノムを保持しておらず、ＡＡＶのＲｅｐ遺伝子及び／又はＡＡＶのＣａｐ遺伝子の配列を含む核酸を保持していない。好適には、本発明の核酸封入中空粒子はさらに、天然の完全なＩＴＲを保持しておらず、Ａ’領域及びＤ領域を保持していない。さらにＢ領域、Ｂ’領域、Ｃ領域、Ｃ’領域からなる群より選択される少なくとも１つの領域の配列を保持していなくても良い。さらに、本発明は前記の核酸封入中空粒子を含む組成物を提供する。本発明の組成物は、本発明の方法で得られる核酸封入中空粒子の少なくとも一つを含むことを特徴とする。
本発明は、前記（１）工程の核酸断片が封入された中空粒子（ＡＡＶ様粒子）を提供する。本発明の核酸封入中空粒子は天然の完全なＡＡＶゲノムを保持しておらず、ＡＡＶのＲｅｐ遺伝子及び／又はＡＡＶのＣａｐ遺伝子の配列を含む核酸を保持していない。好適には、本発明の核酸封入中空粒子はさらに、天然の完全なＩＴＲを保持しておらず、Ａ’領域及びＤ領域を保持していない。さらにＢ領域、Ｂ’領域、Ｃ領域、Ｃ’領域からなる群より選択される少なくとも１つの領域の配列を保持していなくても良い。さらに、本発明は前記の核酸封入中空粒子を含む組成物を提供する。本発明の組成物は、本発明の方法で得られる核酸封入中空粒子の少なくとも一つを含むことを特徴とする。
【0045】
本発明の組成物は、核酸封入中空粒子を有効成分として含む他、担体、及び／又は他の薬剤を含むことができる。組成物中に含まれる核酸封入中空粒子は、異なる２以上のものであってもよい。この場合、異なる２以上の核酸封入中空粒子は、キャプシド等が互いに異なるウイルス由来であってもよいし、及び／又は封入された核酸が互いに異なる種類であってもよい。例えば、標的細胞の異なる複数の核酸封入中空粒子を含んでいてもよい。担体は、組成物の製剤化や生体への適用を容易にし、その作用を阻害又は抑制しない範囲で添加される物質であり、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤又は潤滑沢剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好適には、本発明の組成物には薬学的に許容される担体が使用される。
【0046】
本発明の組成物における核酸封入中空粒子の含有量には特に限定はない。その粒子に包含される核酸の種類及び／又はその有効量、適用される細胞又は個体、適用の方法・経路、適用の目的、組成物の形態（形態、大きさを含む）、並びに前記の担体の種類などを勘案し、適宜定められる。
【0047】
前記の、本発明の核酸封入中空粒子並びに当該中空粒子を含む組成物を使用することにより、細胞や動物個体に遺伝子を導入することができる。このような遺伝子導入方法も本発明の一態様である。細胞への遺伝子導入は、インビトロで組成物と細胞を接触することにより実施することができる。また、ヒトを含む動物個体への遺伝子導入は本発明の組成物を、組織内（例えば筋肉内）、静脈内、皮下及び腹腔内投与等の経路で投与することにより実施される。
【実施例】
【0048】
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【0049】
実施例１ ＤＮＡ断片の導入によるＡＡＶ中空粒子へのパッケージング１
（１）ＡＤ配列を含むＤＮＡ断片の調製
目的の遺伝子として、ヒトＡＴＰ５ｂ遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡをコードする配列番号２に記載する一本鎖のＤＮＡオリゴヌクレオチドと、その相補鎖を化学合成した。それぞれアニーリングさせることにより二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを調製した。前記二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドをｐＥＮＴＲ（商標）／Ｕ６ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）のクローニングサイトにクローニングして組換えプラスミドを作製した。さらに、ＡＡＶ２ゲノムＤＮＡのＩＴＲに存在するＡＤ配列（Ａ領域－Ｄ’領域にわたる６１ｂｐ：配列番号１）を含み、その両端に制限酵素ＳａｌＩ及びＫｐｎＩの認識配列を有する二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、それぞれ化学合成した両鎖をアニーリングさせることにより調製した。この二本鎖ＤＮＡ断片を前記の組換えプラスミドのＵ６プロモーター上流のＳａｌＩサイト－ＫｐｎＩサイト間に挿入し、ＡＴＰ５ｂ ｓｈＲＮＡプラスミドＤＮＡ（プラスミドＡＤ＋）を調製した。このプラスミドは５’末端から順に、ＡＤ配列、Ｕ６プロモーター配列、ｓｈＲＮＡ配列、Ｐｏｌ ＩＩＩターミネーター配列を含む。なお、ＡＤ配列を含まないコントロールプラスミドＤＮＡ（プラスミドＡＤ－）も調製した。これらのプラスミドＤＮＡをシーケンス解析し、意図した配列であることを確認した。
（１）ＡＤ配列を含むＤＮＡ断片の調製
目的の遺伝子として、ヒトＡＴＰ５ｂ遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡをコードする配列番号２に記載する一本鎖のＤＮＡオリゴヌクレオチドと、その相補鎖を化学合成した。それぞれアニーリングさせることにより二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを調製した。前記二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドをｐＥＮＴＲ（商標）／Ｕ６ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）のクローニングサイトにクローニングして組換えプラスミドを作製した。さらに、ＡＡＶ２ゲノムＤＮＡのＩＴＲに存在するＡＤ配列（Ａ領域－Ｄ’領域にわたる６１ｂｐ：配列番号１）を含み、その両端に制限酵素ＳａｌＩ及びＫｐｎＩの認識配列を有する二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、それぞれ化学合成した両鎖をアニーリングさせることにより調製した。この二本鎖ＤＮＡ断片を前記の組換えプラスミドのＵ６プロモーター上流のＳａｌＩサイト－ＫｐｎＩサイト間に挿入し、ＡＴＰ５ｂ ｓｈＲＮＡプラスミドＤＮＡ（プラスミドＡＤ＋）を調製した。このプラスミドは５’末端から順に、ＡＤ配列、Ｕ６プロモーター配列、ｓｈＲＮＡ配列、Ｐｏｌ ＩＩＩターミネーター配列を含む。なお、ＡＤ配列を含まないコントロールプラスミドＤＮＡ（プラスミドＡＤ－）も調製した。これらのプラスミドＤＮＡをシーケンス解析し、意図した配列であることを確認した。
【0050】
前記プラスミドＤＮＡを鋳型に、Ｍ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ（－２０）プライマー及びＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を用いたＰＣＲをそれぞれ実施し、ＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物ＡＤ＋）及びＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物ＡＤ－）の増幅を行った。ＰＣＲ反応液をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて精製し、シーケンス解析にて配列を確認した。
【0051】
（２）２９３ＥＢ細胞への導入
実施例１－（１）で得たそれぞれのプラスミドＤＮＡ及びＤＮＡ断片を、ＡＡＶ９のＣａｐとＡＡＶ２のＲｅｐを発現するプラスミドであるｐＡＡＶ２／９（配列番号３）及びヘルパープラスミドであるｐＡｄ５Ｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ”Ｍａｘ”（コスモバイオ社製）を用いて２９３ＥＢ細胞（国際公開第２０１２／１４４４４６号パンフレット）１×１０８Ｃｅｌｌｓにトランスフェクションした。トランスフェクションしたプラスミドＤＮＡの重量は４４．８μｇ、ＤＮＡ断片の重量はモル比で１０．９μｇに合わせた。トランスフェクション時の培地はＤＭＥＭ（無血清）に、１／１００容量のＧｌｕｔａＭａｘを加えたもので、トランスフェクション後は３７℃、５％ＣＯ２で５日間培養した。
実施例１－（１）で得たそれぞれのプラスミドＤＮＡ及びＤＮＡ断片を、ＡＡＶ９のＣａｐとＡＡＶ２のＲｅｐを発現するプラスミドであるｐＡＡＶ２／９（配列番号３）及びヘルパープラスミドであるｐＡｄ５Ｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ”Ｍａｘ”（コスモバイオ社製）を用いて２９３ＥＢ細胞（国際公開第２０１２／１４４４４６号パンフレット）１×１０８Ｃｅｌｌｓにトランスフェクションした。トランスフェクションしたプラスミドＤＮＡの重量は４４．８μｇ、ＤＮＡ断片の重量はモル比で１０．９μｇに合わせた。トランスフェクション時の培地はＤＭＥＭ（無血清）に、１／１００容量のＧｌｕｔａＭａｘを加えたもので、トランスフェクション後は３７℃、５％ＣＯ２で５日間培養した。
【0052】
（３）ＡＡＶ様粒子の回収
実施例１－（２）で培養した２９３ＥＢ細胞の培養上清を回収後、上清にＤＮａｓｅＩを添加し、遊離ＤＮＡの分解を行った。分解後、核酸封入ＡＡＶ中空粒子（ＡＡＶ様粒子）を含む前記の上清にＡＬ ｂｕｆｆｅｒ （Ｑｉａｇｅｎ社製）を加えて、ＡＡＶキャプシドを溶解し、パッケージングされたＤＮＡの抽出を行った。ＡＡＶ様粒子に含まれるプラスミドＤＮＡとＤＮＡ断片のコピー数を、Ｕ６－Ｆプライマー（配列番号４）とＵ６－Ｒプライマー（配列番号５）を使用した定量ＰＣＲにより解析した（図１）。図１に示すように、ＡＤ配列を含むＤＮＡ断片では、ＡＤ配列を含むプラスミドＤＮＡよりＡＡＶ中空粒子へのパッケージングが高効率で起こることが示された（約１５．２倍）。このようなＤＮＡ断片はＰＣＲにより大量に調製することができ、ＡＡＶ様粒子をより簡便に調製することができることが示された。
実施例１－（２）で培養した２９３ＥＢ細胞の培養上清を回収後、上清にＤＮａｓｅＩを添加し、遊離ＤＮＡの分解を行った。分解後、核酸封入ＡＡＶ中空粒子（ＡＡＶ様粒子）を含む前記の上清にＡＬ ｂｕｆｆｅｒ （Ｑｉａｇｅｎ社製）を加えて、ＡＡＶキャプシドを溶解し、パッケージングされたＤＮＡの抽出を行った。ＡＡＶ様粒子に含まれるプラスミドＤＮＡとＤＮＡ断片のコピー数を、Ｕ６－Ｆプライマー（配列番号４）とＵ６－Ｒプライマー（配列番号５）を使用した定量ＰＣＲにより解析した（図１）。図１に示すように、ＡＤ配列を含むＤＮＡ断片では、ＡＤ配列を含むプラスミドＤＮＡよりＡＡＶ中空粒子へのパッケージングが高効率で起こることが示された（約１５．２倍）。このようなＤＮＡ断片はＰＣＲにより大量に調製することができ、ＡＡＶ様粒子をより簡便に調製することができることが示された。
【0053】
実施例２ ＤＮＡ断片の導入によるＡＡＶ中空粒子へのパッケージング２
（１）２９３ＥＢ細胞への導入
実施例１－（１）で調製したプラスミドＤＮＡ及びＤＮＡ断片を、モル濃度を合わせて２９３ＥＢ細胞に導入した。すなわち、ＡＴＰ５ｂ ｓｈＲＮＡプラスミドＤＮＡ（２９７４ｂｐ）とＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物ＡＤ＋）（７２４ｂｐ）の塩基長より、プラスミドＤＮＡの１／４．１重量（７２４／２０７４）のＤＮＡ断片を使用した以外は、実施例１－（２）と同様の方法で２９３ＥＢ細胞にトランスフェクションし、細胞を培養した。
（１）２９３ＥＢ細胞への導入
実施例１－（１）で調製したプラスミドＤＮＡ及びＤＮＡ断片を、モル濃度を合わせて２９３ＥＢ細胞に導入した。すなわち、ＡＴＰ５ｂ ｓｈＲＮＡプラスミドＤＮＡ（２９７４ｂｐ）とＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物ＡＤ＋）（７２４ｂｐ）の塩基長より、プラスミドＤＮＡの１／４．１重量（７２４／２０７４）のＤＮＡ断片を使用した以外は、実施例１－（２）と同様の方法で２９３ＥＢ細胞にトランスフェクションし、細胞を培養した。
【0054】
（３）ＡＡＶ様粒子の回収
実施例２－（１）で培養した２９３ＥＢ細胞の培養上清を回収後、上清にＢｅｎｚｏｎａｓｅを添加し、遊離ＤＮＡの分解を行った。その後、上清を５０℃で２０分間加熱処理した後、遠心分離して沈殿を除去した。さらに塩化セシウム密度勾配遠心法にて上清中のＡＡＶ様粒子を精製した。実施例１－（３）と同様の方法により、得られたＡＡＶ様粒子に含まれるプラスミドＤＮＡとＤＮＡ断片のコピー数を、定量ＰＣＲにより解析した（図２）。図２に示すように、モル濃度を合わせてトランスフェクションした場合でも、ＡＤ配列を含むＤＮＡ断片では、ＡＤ配列を含むプラスミドＤＮＡより高い効率でＡＡＶ中空粒子へのパッケージングが起こることが示された（約４．６倍）。
実施例２－（１）で培養した２９３ＥＢ細胞の培養上清を回収後、上清にＢｅｎｚｏｎａｓｅを添加し、遊離ＤＮＡの分解を行った。その後、上清を５０℃で２０分間加熱処理した後、遠心分離して沈殿を除去した。さらに塩化セシウム密度勾配遠心法にて上清中のＡＡＶ様粒子を精製した。実施例１－（３）と同様の方法により、得られたＡＡＶ様粒子に含まれるプラスミドＤＮＡとＤＮＡ断片のコピー数を、定量ＰＣＲにより解析した（図２）。図２に示すように、モル濃度を合わせてトランスフェクションした場合でも、ＡＤ配列を含むＤＮＡ断片では、ＡＤ配列を含むプラスミドＤＮＡより高い効率でＡＡＶ中空粒子へのパッケージングが起こることが示された（約４．６倍）。
【0055】
実施例３ ＡＡＶ様粒子による細胞へのトランスダクション
実施例１－（３）で調製したプラスミド（ＡＤ＋）又はＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物ＡＤ＋）を含むＡＡＶ様粒子を、ＨＥＫ２９３細胞に１．０×１０６ｖ．ｇ．／ｃｅｌｌで感染させた。感染３日後にＨＥＫ２９３細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用してＲＮＡを抽出した。プライマーｈＡＴＰ５ｂ－Ｆ（配列番号６）及びプライマーｈＡＴＰ５ｂ－Ｒ（配列番号７）を使用してＡＴＰ５ｂの発現量をＲＴ－ＰＣＲ法により解析した（図３）。図３に示すように、ＤＮＡ断片を含むＡＡＶ様粒子を感染させた細胞は、プラスミドＤＮＡを含むＡＡＶ様粒子を感染させた細胞より、ＡＴＰ５ｂ遺伝子の発現の高いノックダウンが確認された。
実施例１－（３）で調製したプラスミド（ＡＤ＋）又はＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物ＡＤ＋）を含むＡＡＶ様粒子を、ＨＥＫ２９３細胞に１．０×１０６ｖ．ｇ．／ｃｅｌｌで感染させた。感染３日後にＨＥＫ２９３細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用してＲＮＡを抽出した。プライマーｈＡＴＰ５ｂ－Ｆ（配列番号６）及びプライマーｈＡＴＰ５ｂ－Ｒ（配列番号７）を使用してＡＴＰ５ｂの発現量をＲＴ－ＰＣＲ法により解析した（図３）。図３に示すように、ＤＮＡ断片を含むＡＡＶ様粒子を感染させた細胞は、プラスミドＤＮＡを含むＡＡＶ様粒子を感染させた細胞より、ＡＴＰ５ｂ遺伝子の発現の高いノックダウンが確認された。
【0056】
実施例４ ＡＤ配列を付加した修飾核酸のパッケージング１
（１）オリゴヌクレオチドの作製
蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子配列を標的とし、修飾核酸を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドのパッケージングを行った。まず、ＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子のアンチセンス配列ＡＯ（配列番号１２）の３’末端にＡＤ配列（配列番号１）を結合させたオリゴヌクレオチドを合成した。アンチセンス配列の各塩基間のそれぞれ及びアンチセンス配列とＡＤ配列の間の結合はホスホロチオエート結合とし（ＰＳ化）、１、２、３、１３及び１４位のヌクレオチドはＬＮＡとした。このオリゴヌクレオチドに別に合成したＡＤ配列に相補的で天然型のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ＡＤ、配列番号１８）をアニールさせ、修飾オリゴヌクレオチド（Ｎｏ．１）を作製した。さらに、アンチセンス配列の５’末端にＡＤ配列を結合させた修飾オリゴヌクレオチド（Ｎｏ．２）を作製した。また、オリゴヌクレオチドＮｏ．１及び２のアンチセンス配列を陰性コントロール配列ＡＯ－ｃ（配列番号１３）に代えたアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｎｏ．３及び４）、ＡＤ配列をスクランブルＡＤ配列（配列番号１４）に代えたアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｎｏ．５及び６）を作製した。さらに、アンチセンス配列ＡＯのみの配列からなる１本鎖オリゴヌクレオチド（Ｎｏ．７）及び陰性コントロール配列ＡＯ－ｃのみの配列からなる１本鎖オリゴヌクレオチド（Ｎｏ．８）を作製した。これらのオリゴヌクレオチドの構造を図６に示す。
（１）オリゴヌクレオチドの作製
蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子配列を標的とし、修飾核酸を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドのパッケージングを行った。まず、ＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子のアンチセンス配列ＡＯ（配列番号１２）の３’末端にＡＤ配列（配列番号１）を結合させたオリゴヌクレオチドを合成した。アンチセンス配列の各塩基間のそれぞれ及びアンチセンス配列とＡＤ配列の間の結合はホスホロチオエート結合とし（ＰＳ化）、１、２、３、１３及び１４位のヌクレオチドはＬＮＡとした。このオリゴヌクレオチドに別に合成したＡＤ配列に相補的で天然型のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ＡＤ、配列番号１８）をアニールさせ、修飾オリゴヌクレオチド（Ｎｏ．１）を作製した。さらに、アンチセンス配列の５’末端にＡＤ配列を結合させた修飾オリゴヌクレオチド（Ｎｏ．２）を作製した。また、オリゴヌクレオチドＮｏ．１及び２のアンチセンス配列を陰性コントロール配列ＡＯ－ｃ（配列番号１３）に代えたアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｎｏ．３及び４）、ＡＤ配列をスクランブルＡＤ配列（配列番号１４）に代えたアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｎｏ．５及び６）を作製した。さらに、アンチセンス配列ＡＯのみの配列からなる１本鎖オリゴヌクレオチド（Ｎｏ．７）及び陰性コントロール配列ＡＯ－ｃのみの配列からなる１本鎖オリゴヌクレオチド（Ｎｏ．８）を作製した。これらのオリゴヌクレオチドの構造を図６に示す。
【0057】
（２）２９３ＥＢ細胞への導入とＡＡＶ様粒子の回収
実施例４－（１）で得たオリゴヌクレオチドＮｏ．１～８を、実施例１－（２）と同様にプラスミドｐＡＡＶ２／９及びプラスミドｐＡｄ５Ｎとともに、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ”Ｍａｘ”を用いて２９３ＥＢ細胞１×１０８Ｃｅｌｌｓにトランスフェクションした。トランスフェクションしたオリゴヌクレオチドは、０．１、１及び１０ｎＭの濃度とした。トランスフェクション時の培地はＤＭＥＭ（無血清）に、１／１００容量のＧｌｕｔａＭａｘを加えたもので、トランスフェクション後は３７℃、５％ＣＯ２で５日間培養した。
実施例４－（１）で得たオリゴヌクレオチドＮｏ．１～８を、実施例１－（２）と同様にプラスミドｐＡＡＶ２／９及びプラスミドｐＡｄ５Ｎとともに、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ”Ｍａｘ”を用いて２９３ＥＢ細胞１×１０８Ｃｅｌｌｓにトランスフェクションした。トランスフェクションしたオリゴヌクレオチドは、０．１、１及び１０ｎＭの濃度とした。トランスフェクション時の培地はＤＭＥＭ（無血清）に、１／１００容量のＧｌｕｔａＭａｘを加えたもので、トランスフェクション後は３７℃、５％ＣＯ２で５日間培養した。
【0058】
２９３ＥＢ細胞の培養上清を回収後、上清にＤＮａｓｅＩを添加し、遊離ＤＮＡの分解を行った。分解後、核酸封入ＡＡＶ中空粒子（ＡＡＶ様粒子）を含む前記の上清にＡＬ ｂｕｆｆｅｒ （Ｑｉａｇｅｎ社製）を加えて、ＡＡＶキャプシドを溶解し、パッケージングされたＤＮＡの抽出を行った。ＡＡＶ様粒子に含まれるオリゴヌクレオチドのコピー数を、ＩＴＲ－Ｆプライマー（配列番号１５）とＩＴＲ－Ｒプライマー（配列番号１６）を使用した定量ＰＣＲにより解析した（図７）。図７に示すように、ＡＤ配列を含むオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの濃度依存的にＡＡＶ中空粒子へパッケージングされることが示された。なお、ＡＤ配列はオリゴヌクレオチドの３’に結合させた方が高効率であることが示された。
【0059】
実施例５ ＤＮＡ断片の導入によるＡＡＶ中空粒子へのパッケージング３
（１）オリゴヌクレオチドの作製
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のエクソンスキップ治療を想定し、ＤＭＤモデルマウスのジストロフィン遺伝子エクソン２３のエクソンスキップを誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドのＡＡＶ中空粒子へのパッケージングを行った。まず、マウスジストロフィン遺伝子のアンチセンス配列ＡＯ４（配列番号１７）の３’末端にＡＤ配列（配列番号１）を結合させた１本鎖のオリゴヌクレオチドを合成した（ＳｅｑＡ－ＡＤ－Ｆ）。また、アンチセンス配列ＡＯ４（配列番号１７）の３’末端にＡＤ配列に相補的な配列（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ＡＤ、配列番号１８）を結合させた１本鎖のオリゴヌクレオチド（ＳｅｑＡ－ａｓＡＤ）を合成した。アンチセンス配列ＡＯ４（配列番号１７）の３’末端にスクランブルＡＤ配列（配列番号１４）を結合させた１本鎖のオリゴヌクレオチド（ＳｅｑＡ－ｓｃｒＡＤ）を合成した。さらに、別に合成したＡＤ配列に相補的オリゴヌクレオチド（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ＡＤ、配列番号１８）をオリゴヌクレオチドＳｅｑＡ－ＡＤ－Ｆにアニールさせ、ＡＤ配列の領域が２本鎖でアンチセンス配列の領域が１本鎖のオリゴヌクレオチドを調製した（ＡＤ）。これらのオリゴヌクレオチドの構造を図８に示す。
（１）オリゴヌクレオチドの作製
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のエクソンスキップ治療を想定し、ＤＭＤモデルマウスのジストロフィン遺伝子エクソン２３のエクソンスキップを誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドのＡＡＶ中空粒子へのパッケージングを行った。まず、マウスジストロフィン遺伝子のアンチセンス配列ＡＯ４（配列番号１７）の３’末端にＡＤ配列（配列番号１）を結合させた１本鎖のオリゴヌクレオチドを合成した（ＳｅｑＡ－ＡＤ－Ｆ）。また、アンチセンス配列ＡＯ４（配列番号１７）の３’末端にＡＤ配列に相補的な配列（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ＡＤ、配列番号１８）を結合させた１本鎖のオリゴヌクレオチド（ＳｅｑＡ－ａｓＡＤ）を合成した。アンチセンス配列ＡＯ４（配列番号１７）の３’末端にスクランブルＡＤ配列（配列番号１４）を結合させた１本鎖のオリゴヌクレオチド（ＳｅｑＡ－ｓｃｒＡＤ）を合成した。さらに、別に合成したＡＤ配列に相補的オリゴヌクレオチド（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ＡＤ、配列番号１８）をオリゴヌクレオチドＳｅｑＡ－ＡＤ－Ｆにアニールさせ、ＡＤ配列の領域が２本鎖でアンチセンス配列の領域が１本鎖のオリゴヌクレオチドを調製した（ＡＤ）。これらのオリゴヌクレオチドの構造を図８に示す。
【0060】
（２）２９３ＥＢ細胞への導入とＡＡＶ様粒子の回収
実施例５－（１）で得たオリゴヌクレオチドを、実施例１－（２）と同様にプラスミドｐＡＡＶ２／９及びプラスミドｐＡｄ５Ｎとともに、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ”Ｍａｘ”を用いて２９３ＥＢ細胞１．２５×１０８Ｃｅｌｌｓにトランスフェクションした。トランスフェクションしたオリゴヌクレオチドは、３０ｎＭの濃度とした。トランスフェクション時の培地はＤＭＥＭ（無血清）に、１／１００容量のＧｌｕｔａＭａｘを加えたもので、トランスフェクション後は３７℃、５％ＣＯ２で５日間培養した。
実施例５－（１）で得たオリゴヌクレオチドを、実施例１－（２）と同様にプラスミドｐＡＡＶ２／９及びプラスミドｐＡｄ５Ｎとともに、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ”Ｍａｘ”を用いて２９３ＥＢ細胞１．２５×１０８Ｃｅｌｌｓにトランスフェクションした。トランスフェクションしたオリゴヌクレオチドは、３０ｎＭの濃度とした。トランスフェクション時の培地はＤＭＥＭ（無血清）に、１／１００容量のＧｌｕｔａＭａｘを加えたもので、トランスフェクション後は３７℃、５％ＣＯ２で５日間培養した。
【0061】
２９３ＥＢ細胞の培養上清を回収後、ＡＡＶｐｒｏ（登録商標） Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（タカラバイオ社製）を用いてＡＡＶ様粒子を精製した。ＡＡＶ様粒子に含まれるオリゴヌクレオチドのコピー数を、ＩＴＲ－Ｆプライマー（配列番号１５）とＩＴＲ－Ｒプライマー（配列番号１６）を使用した定量ＰＣＲにより解析した（図８）。図８に示すように、ＡＤ配列及び／又はＡＤ配列の相補配列を含む１本鎖のオリゴヌクレオチドがＡＡＶ中空粒子へパッケージングされることが示された。
【産業上の利用可能性】
【0062】
本発明により、より簡便で効率的な中空粒子内への核酸封入方法が提供される。本発明の方法を用いて製造された核酸封入中空粒子や当該核酸封入中空粒子を有効成分とする組成物は、遺伝子治療の研究又は臨床の分野における遺伝子導入方法として有用である。
【配列表フリーテキスト】
【0063】
SEQ ID NO: 1: AD’ region sequence
SEQ ID NO: 2: ATP5b shRNA sequence
SEQ ID NO: 3: pAAV2/9 Vector sequence
SEQ ID NO: 4: U6-F primer
SEQ ID NO: 5: U6-R primer
SEQ ID NO: 6: hATP5b-F
SEQ ID NO: 7: hATP5b-R
SEQ ID NO: 8: A’ region sequence
SEQ ID NO: 9: A region sequence
SEQ ID NO: 10: D’ region sequence
SEQ ID NO: 11: D region sequence
SEQ ID NO: 12: Antisense sequence AO
SEQ ID NO: 13: Antisense sequence AO-c
SEQ ID NO: 14: Scrambled AD sequence
SEQ ID NO: 15: ITR primer-F
SEQ ID NO: 16: ITR primer-R
SEQ ID NO: 17: Antisense sequence AO4
SEQ ID NO: 18: Compliment AD sequence
SEQ ID NO: 2: ATP5b shRNA sequence
SEQ ID NO: 3: pAAV2/9 Vector sequence
SEQ ID NO: 4: U6-F primer
SEQ ID NO: 5: U6-R primer
SEQ ID NO: 6: hATP5b-F
SEQ ID NO: 7: hATP5b-R
SEQ ID NO: 8: A’ region sequence
SEQ ID NO: 9: A region sequence
SEQ ID NO: 10: D’ region sequence
SEQ ID NO: 11: D region sequence
SEQ ID NO: 12: Antisense sequence AO
SEQ ID NO: 13: Antisense sequence AO-c
SEQ ID NO: 14: Scrambled AD sequence
SEQ ID NO: 15: ITR primer-F
SEQ ID NO: 16: ITR primer-R
SEQ ID NO: 17: Antisense sequence AO4
SEQ ID NO: 18: Compliment AD sequence
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】