▶ ツェー・エス・エル・ベーリング・アクチエンゲゼルシャフトの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-22
(45)【発行日】2024-10-30
(54)【発明の名称】分泌様免疫グロブリンを含む組成物
(51)【国際特許分類】
C07K 1/02 20060101AFI20241023BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241023BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20241023BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241023BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20241023BHJP
C07K 16/06 20060101ALI20241023BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20241023BHJP
【ＦＩ】
C07K1/02 ZNA
A61K39/395 Y
A61P17/02
A61P29/00
A61P31/00
C07K16/06
C12N15/13
【請求項の数】
13
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2020192922
(22)【出願日】2020-11-20
(62)【分割の表示】P 2018204590の分割
【原出願日】2013-03-08
(65)【公開番号】P2021038246
(43)【公開日】2021-03-11
【審査請求日】2020-12-18
【審判番号】
【審判請求日】2023-01-06
(31)【優先権主張番号】12158931.1
(32)【優先日】2012-03-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】12168343.7
(32)【優先日】2012-05-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】501091604
【氏名又は名称】ツェー・エス・エル・ベーリング・アクチエンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(72)【発明者】
【氏名】ブレーズ・コーテジー
(72)【発明者】
【氏名】ステファニー・ロンジェ
(72)【発明者】
【氏名】マリウス・ルートシャー
(72)【発明者】
【氏名】シルヴィア・ミーシャー
(72)【発明者】
【氏名】アードリアン・チュルヒャー
【合議体】
【審判長】長井 啓子
【審判官】高堀 栄二
【審判官】中根 知大
(56)【参考文献】
【文献】米国特許第６９３２９６７（ＵＳ，Ｂ２）
【文献】米国特許第７５９７８９１（ＵＳ，Ｂ２）
【文献】米国特許第７７９４７２１（ＵＳ，Ｂ２）
【文献】米国特許第８０２１６４５（ＵＳ，Ｂ２）
【文献】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７６）Ｖｏｌ．６２，Ｎｏ．２，ｐ．２７１－２７８
【文献】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７４）Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．１，ｐ．２６１－２６８
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
C07K1/00-16/00
ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）２５％未満のＪ鎖含有ＩｇＡおよび／またはＪ鎖含有ＩｇＭを含む血液由来のタンパク質組成物を得る工程、（ｂ）工程（ａ）の組成物と分泌成分を混合する工程
を含む、インビトロにおいて分泌様免疫グロブリンを含む組成物を製造する方法であって、
Ｊ鎖含有ＩｇＡまたはＩｇＭに特異的なアフィニティークロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーの工程を含まない、上記方法。
【請求項2】
分泌様免疫グロブリンが、分泌様ＩｇＡおよび／または分泌様ＩｇＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
工程（ａ）の組成物が、少なくとも５％のＪ鎖連結ＩｇＡを含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
工程（ａ）の組成物が、少なくとも１０％のＪ鎖連結ＩｇＡを含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
工程（ａ）の組成物が、少なくとも２０％のＪ鎖連結ＩｇＡを含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
工程（ａ）の組成物がヒト血液由来である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
工程（ｂ）における分泌成分が組換え分泌成分である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
分泌成分がヒト分泌成分である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
分泌成分が、哺乳動物細胞系において産生される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
分泌成分が、多量体免疫グロブリン受容体ｐｌｇＲの細胞外部分である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
工程（ｂ）において、添加される分泌成分とＩｇＡ二量体／多量体中のＪ鎖の間のモル比が１：１０と１０：１の間の範囲である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記比が１：５と５：１の間の範囲である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記比が１：２と２：１の間の範囲である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
組成物
本発明は、分泌様免疫グロブリン、特に分泌様ＩｇＡおよび／または分泌様ＩｇＭを含む組成物を製造する方法、ならびに該方法によって得ることができる組成物に関する。
本発明は、分泌様免疫グロブリン、特に分泌様ＩｇＡおよび／または分泌様ＩｇＭを含む組成物を製造する方法、ならびに該方法によって得ることができる組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ＩｇＡは、ヒト血漿中において、ＩｇＧの後に２番目に最も量が多いＩｇクラスであり、０．８８～４．１０ｇ／Ｌであることがわかっている。ＩｇＡの２つのサブクラスであるＩｇＡ１およびＩｇＡ２が存在している（図１）（非特許文献１）。これらは、重鎖と軽鎖を連結するジスルフィド結合の点において、および分子のヒンジ領域における顕著な差に起因した抗原多様性の点で異なる。２つのサブクラスのグリコシル化パターンは異なっている：両方のサブクラスの重鎖はＮグリコシル化されている；対照的に、Ｏ－グリコシル化は、ＩｇＡ２の切断型ヒンジ領域に起因して、ＩｇＡ２ではなく、ＩｇＡ１に見出される。
【0003】
ヒトＩｇＡは、２つの主要な形態：血液／血漿中を循環するかまたは粘膜表面に分泌されるかのいずれかで見出されている：血漿中では、ＩｇＡは、主として単量体（８０～９０％）として存在し、骨髄形質細胞によって産生される；血漿中の主要なサブクラスはＩｇＡ１である。
【0004】
多量体ＩｇＡ（ｐｌｇＡ）なる用語は、接続（Ｊ）鎖によって「テールピース」で共有結合的に接続された、二量体、場合により三量体のＩｇＡを示す（図１）。
【0005】
ＩｇＭ分子は、総血清Ｉｇ含有量の１０％を占める。これらは、主に血管内プールに閉じ込められ、一次抗原特異的体液性免疫応答の一部である；系統発生的および個体発生的に、それらは最も初期の抗体（Ａｂ）分子である。ＩｇＭは、Ｊ鎖によって接続された五量体として主に存在し、平面構造に配置される；場合により、ＩｇＭはまた、Ｊ鎖を欠損している六量体形態において見出され得る（非特許文献１）。
【0006】
消化管、呼吸器管および尿生殖器管の粘膜表面、ならびに外分泌腺管は、外部環境から生体の内部コンパートメントを分離する強固な障壁を形成する上皮細胞の層によって内側が覆われている。ヒトにおいて、これらの膨大な表面は４００ｍ２を覆い、外因性の病原体に恒久的に曝露される領域である（非特許文献２）。固有のおよび誘導性の細胞および分子メカニズムの組み合わせは、微生物によるコロニー形成およびエントリー／侵入に対する保護を確実にする。健康な個体では、分泌性ＩｇＡ（ＳｌｇＡ）は、粘膜表面の管腔側で免疫排除機能を満たす最も豊富な抗体（Ａｂ）あり（非特許文献３）、一方、分泌性ＩｇＭ Ａｂは、ＩｇＡ欠損患者に引き継ぐ。ＳｌｇＡは、腸固有層、上気道管または泌尿生殖器管の粘膜形質細胞によって合成される。ＳｌｇＡは、ｐｌｇＡの二量体からなり、約７５ｋＤａの高度にグリコシル化された分泌成分（ＳＣ）である（図１）；同様に、ＳＣに結合した五量体のＪ鎖含有ＩｇＭはＳｌｇＭを構成する。ＳＣは、多量体Ｉｇ受容体（ｐｌｇＲ）の細胞外部分を表す。ｐｌｇＲは、生成部位から粘膜表面へのｐｌｇＡまたは五量体ＩｇＭの経上皮輸送に必要とされ、この場合、ｐｌｇＲ－ｐｌｇＡ／ｐｌｇＲ－ＩｇＭ複合体は、酵素的切断によってＳｌｇＡ／ＳｌｇＭに変換される（非特許文献４）。ＳＣとの結合は、タンパク質分解からＩｇＡまたはＩｇＭを保護する。ＳｌｇＡは、唾液、気管－気管支分泌物、初乳、乳、涙液、腸分泌物および泌尿生殖器分泌物などの漿粘液性分泌物において主要なＩｇである。それは粘膜内層で生成される（したがって、ヒト生体において）最も顕著なＩｇである；約３～５ｇのＳｌｇＡが、腸内腔に毎日分泌さ
れる。このようにして、ＳｌｇＡは、免疫排除に不可欠であり、上皮の完全性を維持する。ＳｌｇＭは、より低いレベルで存在するが、ＳｌｇＡと同じ免疫排除機能を果たす。
れる。このようにして、ＳｌｇＡは、免疫排除に不可欠であり、上皮の完全性を維持する。ＳｌｇＭは、より低いレベルで存在するが、ＳｌｇＡと同じ免疫排除機能を果たす。
【0007】
ポリオウイルス、サルモネラ、またはインフルエンザなどの少数の病原体について、粘膜感染に対する保護は、認可されたワクチンを用いた能動粘膜免疫によって誘導することができる。しかしながら、粘膜病原体の大部分に関して、能動粘膜ワクチンを利用することができない。あるいは、防御レベルのＡｂは、直接、受動免疫によって粘膜表面に送達され得る。天然では、これは、乳を介して、母親抗体をそれらの子孫に伝えることによって、多くの哺乳動物種において生理的に生じる（非特許文献５）。受動粘膜免疫を用いるヒトおよび動物の研究は、口腔、鼻腔内、子宮内、または肺の点滴によって投与されたｐｌｇＡおよびＳｌｇＡ抗体分子が、細菌感染およびウイルス感染を防ぎ、減少させ、または治すことができることを実証している（非特許文献６）。しかしながら、粘膜表面に天然に見出されたＩｇＡの分泌型はほとんど使用されず、ＳｌｇＡの大規模な製造は今までに不可能である。生物工学的方法を用いたＳｌｇＡの構築は魅力的であるが、このような分子は、重要な臨床応用を有する可能性がある（非特許文献７）。同様のことがまた、分泌成分含有ＩｇＭにも適用される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｚｕｅｒｃｈｅｒ ＡＷら、Ｐｌａｓｍａ ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．３ｒｄ ｅｄ．Ｂｉｒｋｈａｅｕｓｅｒ、２０１１年：２７１～３０１頁
【文献】Ｃｏｒｔｈｅｓｙ、Ｂ．（２０１０年）Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：８１７～８２９頁
【文献】Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ、Ａ．Ｊ．ら（２００８年）Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１１～２２頁
【文献】Ｚｕｅｒｃｈｅｒ ＡＷら Ｐｌａｓｍａ ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．３ｒｄ ｅｄ．Ｂｉｒｋｈａｅｕｓｅｒ、２０１１年：１～３１頁
【文献】Ｂｒａｎｄｔｚａｅｇ、Ｐ．（２００３年）Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：３３８２～３３８８頁
【文献】Ｃｏｒｔｈｅｓｙ、Ｂ．（２００３年）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５１～６７頁
【文献】Ｃｏｒｔｈｅｓｙ、Ｂ．（２００２年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：６５～７１頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、驚くべきことに、Ｊ鎖含有免疫グロブリンを最初に精製することなく、血漿由来のＪ鎖含有免疫グロブリン、特にＩｇＡおよび／またはＩｇＭと分泌成分を組み合わせることが可能であることを見出した。本発明は、医学の分野において用いることができ、例えば、対象、特にヒト対象における粘膜表面上での感染の予防および治療のための、分泌様ＩｇＡおよび／またはＩｇＭの大規模製造を可能にする。
【0010】
本発明の一態様は、
（ａ）非精製形態のＪ鎖含有免疫グロブリン、特にＩｇＡおよび／またはＩｇＭを含む血液由来のタンパク質組成物を得る工程；および
（ｂ）工程（ａ）の組成物と分泌成分を混合する工程
を含む、インビトロにおいて、分泌様免疫グロブリン、特にＩｇＡおよび／またはＩｇＭ
を含む組成物を製造する方法である。
（ａ）非精製形態のＪ鎖含有免疫グロブリン、特にＩｇＡおよび／またはＩｇＭを含む血液由来のタンパク質組成物を得る工程；および
（ｂ）工程（ａ）の組成物と分泌成分を混合する工程
を含む、インビトロにおいて、分泌様免疫グロブリン、特にＩｇＡおよび／またはＩｇＭ
を含む組成物を製造する方法である。
【0011】
好ましくは、分泌様免疫グロブリンは、分泌様ＩｇＡである。好ましくは、工程（ａ）の組成物は、少なくとも５％のＪ鎖含有ＩｇＡ、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも３０％を含有し、最も好ましくは、少なくとも５０％のＪ鎖含有ＩｇＡを含有する。好ましくは、工程（ａ）の組成物は、ヒト血液由来であり、例えば、ＩｇＡもしくはさらにはＪ鎖含有ＩｇＡに富んだヒト血漿またはその画分由来であるが、Ｊ鎖含有ＩｇＡの精製は必要とされない。
【0012】
好ましくは、分泌様免疫グロブリンは、分泌様ＩｇＭである。好ましくは、工程（ａ）の組成物は、少なくとも５％のＪ鎖含有ＩｇＭ、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも３０％を含有し、最も好ましくは、少なくとも５０％のＪ鎖含有ＩｇＭを含有する。好ましくは、工程（ａ）の組成物は、ヒト血液由来であり、例えば、ＩｇＭもしくはさらにはＪ鎖含有ＩｇＭに富んだヒト血漿またはその画分由来であるが、Ｊ鎖含有ＩｇＭの精製は必要とされない。
【0013】
工程（ｂ）で使用される分泌成分は、好ましくは組換え分泌成分、より好ましくはヒト組換え分泌成分であり、好ましくは哺乳動物細胞系によって産生される。しかしながら、乳、唾液、粘液または類似の供給源から精製される分泌成分などの天然源からの分泌成分もまた使用することができる。
【0014】
工程（ａ）の組成物における、分泌成分と、ＩｇＡ二量体／多量体またはＩｇＭ五量体中のＪ鎖の間のモル比は、１：１０と１０：１の間、好ましくは１：５と５：１の間、より好ましくは１：２と２：１の間の範囲である。
【0015】
本発明の別の態様において、工程（ａ）の組成物中の分泌成分とＪ鎖の間のモル比は、１：１０と１０：１の間、好ましくは１：５と５：１の間、より好ましくは１：２と２：１の間の範囲である。
【0016】
本発明の別の態様は、本発明の方法によって得ることができる、分泌様ＩｇＡおよび／もしくは分泌様ＩｇＭまたはそれらの組み合わせを含む組成物である。組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含んでもよい。
【0017】
本発明のさらなる態様は、医学的使用のための上記組成物である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
既に上述したように、本発明者らは、驚くべきことに、Ｊ鎖含有免疫グロブリンを最初に精製することなく、血漿由来のＪ鎖含有免疫グロブリン、特にＪ鎖含有ＩｇＡおよび／またはＪ鎖含有ＩｇＭと分泌成分を組み合わせることができることを見出した。本発明は、医学の分野において用いることができ、例えば、対象、特にヒト対象における粘膜表面上での感染の予防および治療のための、分泌様ＩｇＡおよび／または分泌様ＩｇＭの大規模製造を可能にする。
【0019】
本発明の一態様は、
（ａ）非精製形態のＪ鎖含有ＩｇＡおよび／またはＪ鎖含有ＩｇＭを含む血液由来のタンパク質組成物を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）の組成物と分泌成分を混合するまたは合わせる工程
を含む、インビトロにおいて、分泌様免疫グロブリン、特に分泌様ＩｇＡまたは分泌様ＩｇＭを含む組成物を製造する方法である。
（ａ）非精製形態のＪ鎖含有ＩｇＡおよび／またはＪ鎖含有ＩｇＭを含む血液由来のタンパク質組成物を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）の組成物と分泌成分を混合するまたは合わせる工程
を含む、インビトロにおいて、分泌様免疫グロブリン、特に分泌様ＩｇＡまたは分泌様ＩｇＭを含む組成物を製造する方法である。
【0020】
好ましくは、工程（ａ）の組成物は、少なくとも５％（ｗ／ｗ）のＪ鎖含有ＩｇＡ、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは５０％を含有し、最も好ましくは、少なくとも７０％のＪ鎖含有ＩｇＡを含有する。好ましくは、工程（ａ）の組成物は、ヒト血液由来であり、例えば、ＩｇＡもしくはさらにはＪ鎖含有ＩｇＡに富んだヒト血漿またはその画分由来であるが、Ｊ鎖含有ＩｇＡ二量体または多量体の特定の精製工程は必要とされない。したがって、Ｊ鎖含有ＩｇＡは、単量体ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＧなどの他のタンパク質も含む組成物中にある。例えば、組成物は、１０％超の単量体ＩｇＡ、および／または１０％超のＩｇＧ、および／または１０％超のＩｇＭを含んでもよい。Ｊ鎖含有二量体ＩｇＡの富化は、ＩｇＧ、アルブミン、アルファ－１アンチトリプシンおよび凝固因子などの血漿タンパク質の精製のために、ヒト血漿画分の処置の一部として生じ得るが、アフィニティークロマトグラフィーまたはサイズ排除および関連分子量の画分の選択のような、他のタンパク質からＪ鎖含有二量体ＩｇＡおよび多量体を分離するように具体的に設計された精製工程は、工程（ａ）の組成物を得るために必要とされない。
【0021】
本発明の別の好ましい態様において、工程（ａ）の組成物は、少なくとも５％（ｗ／ｗ）のＪ鎖含有ＩｇＭ、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは５０％を含有し、最も好ましくは、少なくとも７０％のＪ鎖含有ＩｇＭを含有する。好ましくは、工程（ａ）の組成物は、ヒト血液由来であり、例えば、ＩｇＭもしくはさらにはＪ鎖含有ＩｇＭに富んだヒト血漿またはその画分由来であるが、Ｊ鎖含有ＩｇＭの特定の精製工程は必要とされない。したがって、Ｊ鎖含有ＩｇＭは、ＩｇＡまたはＩｇＧなどの他のタンパク質も含む組成物中にある。例えば、組成物は、１０％超のＩｇＡ、および／または１０％超のＩｇＧを含んでもよい。Ｊ鎖含有ＩｇＭの富化は、ＩｇＧ、アルブミン、アルファ－１アンチトリプシンおよび凝固因子などの血漿タンパク質の精製のために、ヒト血漿画分の処置の一部として生じ得るが、アフィニティークロマトグラフィーまたはサイズ排除および関連分子量の画分の選択のような、他のタンパク質からＪ鎖含有ＩｇＭを分離するように具体的に設計された精製工程は、工程（ａ）の組成物を得るために必要とされない。
【0022】
本明細書で使用される用語「分泌成分」は、Ｊ鎖含有免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質を意味し、高分子免疫受容体（ｐｌｇＲ）、好ましくは哺乳類ｐｌｇＲ、より好ましくは霊長類ｐｌｇＲ、最も好ましくはヒトｐｌｇＲ、の細胞外部分に関連し、またはそれから誘導可能であり、またはそれと同一である。好ましくは、分泌成分は、Ｊ鎖含有免疫グロブリンに対して増加した安定性を付与する。組成物に含まれる分泌成分は、組換え分泌成分であってもよく、好ましくは哺乳動物細胞系において産生される分泌成分であってもよい。伝統的な狭い意味での分泌成分（本明細書では「天然の分泌成分」と称する。）は、通常、Ｊ鎖を含有する二量体もしくは多量体ＩｇＡまたは五量体ＩｇＭに、分泌中に関連付けられる、高分子免疫グロブリン受容体（ｐｌｇＲ）の細胞外部分である。Ｊ鎖含有ＩｇＡ／ＩｇＭは、上皮細胞の側底面で高分子免疫グロブリン受容体に結合し、トランスサイトーシスによって細胞内に取り込まれる。次に、この受容体複合体は、上皮細胞の管腔表面に輸送される前に、細胞内コンパートメントを通過する。続いて、トランスサイトーシスされたＩｇＡ／ＩｇＭ－ｐｌｇＲ複合体は、タンパク質分解を通じて放出され、天然の分泌成分と称される高分子免疫グロブリン受容体（ｐｌｇＲ）の一部は、Ｊ鎖含有ＩｇＡ／ＩｇＭと結合して留まり、分泌性ＩｇＡ／ＩｇＧを放出する。しかしながら、ＩｇＡの逆トランスサイトーシス、すなわち管腔表面から側底面へのトランスサイトーシスもまた起こるという証拠がある。
【0023】
ヒトｐｌｇＲは、クローニングされ、配列決定され、その配列はＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリーＰ０１８３３として利用可能であり、配列番号１に示される。ヒトｐｌｇＲは、７６４個のアミノ酸残基を有する糖タンパク質であり、シグナルペプチド（残基１～１８
）、細胞外部分（残基１９～６３８）、膜貫通領域（残基６３９～６６１）、および細胞質領域（残基６６２～７６４）を含む。残基１９～６０３は、上述されるようにＪ鎖含有ＩｇＡと結合するものと考えられ、この糖タンパク質の該部分は、通常、分泌成分（本明細書では「天然の分泌成分」と称する。）と称される。
）、細胞外部分（残基１９～６３８）、膜貫通領域（残基６３９～６６１）、および細胞質領域（残基６６２～７６４）を含む。残基１９～６０３は、上述されるようにＪ鎖含有ＩｇＡと結合するものと考えられ、この糖タンパク質の該部分は、通常、分泌成分（本明細書では「天然の分泌成分」と称する。）と称される。
【0024】
本発明の組成物に用いられる分泌成分は、Ｊ鎖含有ＩｇＡと結合することができる任意の細胞外ｐｌｇＲ配列を含むことができる。例えば、分泌成分は、哺乳類供給源、例えば、霊長類、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ラットもしくはマウスまたはそれらの変異体由来のｐｌｇＲの細胞外ドメインを含むことができる。また、いくつかの哺乳類種またはそれらの変異体由来の細胞外ドメインの機能的ハイブリッドは、本発明における使用のために意図され、例えば、分泌成分様タンパク質に異種由来の免疫グロブリン様ドメインを融合することによって調製される。機能的な分泌成分はまた、通常存在する免疫グロブリン様ドメインの選択を融合することによって形成することができ、例えば、ウサギ分泌成分は機能的であって、ドメイン１、４および５のみで構成されている。しかしながら、好ましくは、ヒト分泌成分またはその機能的変異体が用いられる。
【0025】
したがって、本発明の組成物に用いられる分泌成分は、好ましくは、配列番号１の残基１９～６０３またはそれらの機能的変異体を含む。機能的変異体は、欠失、挿入および／または置換を含んでもよく、好ましくは、置換は保存的置換であり、例えば、塩基性アミノ酸残基は別の塩基性アミノ酸に置換され、疎水性アミノ酸は別の疎水性アミノ酸で置換される。変異分泌成分は、配列番号１の残基１９～６０３に対して配列において少なくとも５０％同一であり、好ましくは、配列番号１の残基１９～６０３に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、より好ましくは少なくとも８５％またはさらには９０％、さらにより好ましくは少なくとも９２％、９４％、９５％、９７％、９８％またはさらには９９％同一である。好ましくは、分泌成分は、ｐｌｇＲの細胞外部分、より好ましくはヒトｐｌｇＲの細胞外部分を含み、最も好ましくは、分泌成分は、配列番号１の残基１９～６０３を含みまたはさらにはそれからなる。
【0026】
当業者は、組換え技術によって分泌成分を製造する方法をよく知っている。ＣＨＯ細胞におけるヒト分泌成分の発現の例は、Ｐｈａｌｉｐｏｎら（Ｐｈａｌｉｐｏｎ Ａら（２００２年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １７：１０７～１１５頁）によって報告されているが、本発明は、このシステムによって製造される分泌成分に限定されない。例えば、鋳型としてｐｌｇＲを発現する細胞または組織から単離したＲＮＡを用いて、所望のｃＤＮＡ配列は合成的に製造されまたはＲＴ－ＰＣＲを介してクローニングされ得る。次に、ｃＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ３などの哺乳類発現ベクターに挿入することができる－多くの代替の発現ベクターが利用可能である。続いて、組換え発現ベクターは、ＣＨＯ、Ｃｏｓ、ＨＥＫ２９３またはＢＨＫなどの適切な宿主細胞系に導入される。他の細胞系は入手可能であり、使用することもできる。細胞系にこのようなベクターを導入する方法には、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび当業者に周知の他の技術が含まれる。次に、通常、発現ベクターを保有し、対象とするタンパク質を発現する細胞を選択し、クローニングする。また、ウイルス発現系を用いることができ、例えば、ワクシニアウイルスを用いて、哺乳類細胞中に高レベルでタンパク質を発現させることができ、バキュロウイルス発現系を用いて、昆虫細胞中に高レベルでタンパク質を発現させることができる。酵母または細菌発現系も想定することができ、このような発現系は当業者に知られている。同様に、植物発現系もまた予測され得、このような系は当業者に知られている。
【0027】
本発明の組成物に使用される分泌成分またはその変異体はまた、得られるタンパク質の精製を助けることができるタグ、例えば、ヘキサ－ヒスチジンタグを含んでもよい。このようなタグが切断可能なリンカーを介して結合されている場合、タグは、本発明において使用する前に切断することができる。同様に、分泌成分は融合タンパク質として製造され
得る。再度、融合パートナーが本発明において使用する前に分泌成分から切断され得るように、切断可能なリンカーを使用することができる。
得る。再度、融合パートナーが本発明において使用する前に分泌成分から切断され得るように、切断可能なリンカーを使用することができる。
【0028】
続いて、当業者は、標準的な方法を用いて、発現したタンパク質を精製することができる。組換え分泌成分は、適切な方法、例えば、サイズ排除および／またはイオン交換クロマトグラフィーを用いて高純度に精製することができる。好ましくは、組換え分泌成分の最終調製物は、夾雑物、特に細胞宿主タンパク質を本質的に含まない。しかしながら、分泌成分はまた、未精製形態でＪ鎖含有免疫グロブリンと特異的に結合することができ、Ｊ鎖含有免疫グロブリンとの結合前の精製は本質的でない。
【0029】
分泌成分はまた、天然の供給源から得ることがある、好ましくは、乳、唾液もしくは粘液から得ることができる。好ましくは、分泌成分は、ヒト起源であるが、他の種由来の分泌成分もまた本発明において使用することができる。
【0030】
工程（ａ）の組成物における、分泌成分と、ＩｇＡ二量体／多量体またはＩｇＭ五量体中のＪ鎖の間のモル比は、１：１０と１０：１の間、好ましくは１：５と５：１の間、より好ましくは１：２と２：１の間の範囲である。
【0031】
工程（ａ）の組成物中の分泌成分とＪ鎖の間のモル比は、１：１０と１０：１の間、好ましくは１：５と５：１の間、より好ましくは１：２と２：１の間である。
【0032】
工程（ｂ）に使用される分泌成分の量は、工程（ａ）の組成物における５０部（重量比）のタンパク質に対して少なくとも１部（重量比）の分泌成分であってもよく、好ましくは、工程（ａ）の組成物における４０部、３０部、２０部、１５部、１０部のタンパク質に対して少なくとも１部の分泌成分であってもよく、最も好ましくは、５部のタンパク質に対して少なくとも１部の分泌成分であってもよい。
【0033】
本発明の別の態様は、本発明の方法によって得ることができる、分泌様ＩｇＡを含む組成物である。本発明のさらに別の態様は、本発明の方法によって得ることができる、分泌様ＩｇＭを含む組成物である。なおさらなる態様は、例えば、１：１０と１０：１の間、好ましくは１：５と５：１の間、より好ましくは１：２と２：１の間のモル比で、本発明の方法によって得ることができる、分泌様ＩｇＡと分泌様ＩｇＭを含む組成物である。本発明の別の態様において、組成物におけるＩｇＡとＩｇＭの合わせた含有量は、５０％超、好ましくは６０％超、より好ましくは７０％超、さらにより好ましくは８０％超、さらにより好ましくは９０％超であり、最も好ましくは１００％である。
【0034】
本発明のさらなる態様は、医学的使用のための上述される組成物である。例えば、本発明の組成物は、壊死性腸炎および一般的には粘膜表面の感染を治療するために有利に使用され得る。
【0035】
組成物は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体もしくは賦形剤および／または安定化剤をさらに含むことができる。組成物は、シロップ、ローションのような液体形態、軟膏、投与前に液体で再構成することができる散剤、カプセル剤、丸剤、ゲル、クリーム、ゼリー、制御放出製剤として、または意図された医学的使用に適した任意の他の製剤として製剤化されてもよい。例えば、ＧＩ疾患の治療のために、組成物は、組成物を放出するＧＩ管の所望の領域において溶解する保護コーティングを用いて製剤化することができる。組成物は、吸入によってまたは意図された使用に適した任意の他の経路によって、経口的に摂取され、局所的に、経腸的に投与されてもよい。経口適用について、アシッドポンプ阻害剤が同時投与されてもよい。
【0036】
組成物中のタンパク質は、製剤化される前に、例えば、透析／限外ろ過または他の標準的な方法を用いて濃縮され得る。さらに、組成物は、凍結乾燥され、次に、使用前に適切な溶液を用いて再構成されてもよい。
【0037】
定義
用語「分泌様ＩｇＡ」または「分泌様血漿ＩｇＡ」は、タンパク質分解からのある程度の保護を提供するように働く、分泌成分であるタンパク質またはその機能的変異体と組み合わせてＪ鎖含有（血漿）ＩｇＡを包含することが意図される。典型的には、Ｊ鎖含有ＩｇＡは、２つもしくは４つ、またはさらにはそれ超えるＩｇＡ単量体を含む。典型的には、Ｊ鎖含有ＩｇＡは、インビトロにおいて分泌成分またはその変異体と混合され、すなわち、分泌成分とＪ鎖含有ＩｇＡの間の結合は、トランスサイトーシス中というよりはむしろインビトロで起こる。
用語「分泌様ＩｇＡ」または「分泌様血漿ＩｇＡ」は、タンパク質分解からのある程度の保護を提供するように働く、分泌成分であるタンパク質またはその機能的変異体と組み合わせてＪ鎖含有（血漿）ＩｇＡを包含することが意図される。典型的には、Ｊ鎖含有ＩｇＡは、２つもしくは４つ、またはさらにはそれ超えるＩｇＡ単量体を含む。典型的には、Ｊ鎖含有ＩｇＡは、インビトロにおいて分泌成分またはその変異体と混合され、すなわち、分泌成分とＪ鎖含有ＩｇＡの間の結合は、トランスサイトーシス中というよりはむしろインビトロで起こる。
【0038】
用語「分泌様ＩｇＭ」は、インビトロにおいて、分泌成分と組み合わせてＪ鎖含有（血漿）ＩｇＭまたはその機能的変異体を包含することが意図される。好ましくは、Ｊ鎖含有ＩｇＭは、五量体ＩｇＭである。
【0039】
「Ｊ鎖含有ＩｇＡ二量体または多量体についての特定の精製工程」は、他のタンパク質、例えば単量体ＩｇＡ、他の免疫グロブリン、および他の血漿タンパク質からＪ鎖含有ＩｇＡ二量体または多量体を分離するように具体的に設計された精製プロセスに含まれる精製工程に関する。このような特定の精製工程は、例えば、Ｊ鎖に特異的に結合するリガンドを用いてアフィニティークロマトグラフィー、またはＪ鎖含有ＩｇＡ二量体に対応する分子量のタンパク質を含む画分を選択するサイズ排除クロマトグラフィーを含んでもよい。血漿から組成物を調製するためのプロセスは、イオン交換クロマトグラフィーなどの、ＩｇＡまたはさらにはＪ鎖含有ＩｇＡの富化をもたらす方法を含んでもよく、一方、Ｊ鎖含有ＩｇＡは特異的に精製されない。したがって、「非精製形態のＪ鎖含有ＩｇＡ」は、８０％未満のＪ鎖含有ＩｇＡ、典型的には７０％、６０％または５０％未満のＪ鎖含有ＩｇＡを含む組成物を指し、さらに、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％またはさらには１０％未満のＪ鎖含有ＩｇＡを含んでもよい。
【0040】
「Ｊ鎖含有ＩｇＭについての特定の精製工程」は、他のタンパク質、例えば他の免疫グロブリン、および他の血漿タンパク質からＪ鎖含有ＩｇＭを分離するように具体的に設計された精製プロセスに含まれる精製工程に関する。このような特定の精製工程は、例えば、ＩｇＭまたはＪ鎖に特異的に結合するリガンドを用いてアフィニティークロマトグラフィー、またはＪ鎖含有ＩｇＭ五量体に対応する分子量のタンパク質を含む画分を選択するサイズ排除クロマトグラフィーを含んでもよい。血漿から組成物を調製するためのプロセスは、イオン交換クロマトグラフィーなどの、Ｊ鎖含有ＩｇＭの富化をもたらす方法を含んでもよく、一方、Ｊ鎖含有ＩｇＭは特異的に精製されない。したがって、「非精製形態のＪ鎖含有ＩｇＭ」は、８０％未満のＪ鎖含有ＩｇＭ、典型的には７０％、６０％または５０％未満のＪ鎖含有ＩｇＭを含む組成物を指し、さらに、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％またはさらには１０％未満のＪ鎖含有ＩｇＭを含んでもよい。
【0041】
本明細書で使用する用語「分泌成分」とは、Ｊ鎖含有免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質を意味し、多量体免疫グロブリン受容体（ｐｌｇＲ）、好ましくは哺乳類ｐｌｇＲ、より好ましくは霊長類ｐｌｇＲ、最も好ましくはヒトｐｌｇＲの、細胞外部分に関し、または該部分から誘導し得、または該部分と同一である。好ましくは、分泌成分は、Ｊ鎖含有免疫グロブリンに、増加した安定性を付与する。上記で詳述したように、最も好ましい分泌成分は、ヒト分泌成分であり、例えば、配列番号１の残基１９から６０３に対応する。しかしながら、アミノ酸の欠失、挿入、置換は、それらが機能的タンパク質をもたらす限り、含まれてもよく、すなわち、Ｊ鎖含有ＩｇＡと結合し、好ましくはタンパ
ク質分解からの保護を付与し得るものである。また、他の哺乳動物種由来のホモログを含み、異種由来の一部を含むキメラタンパク質のようなものである。
ク質分解からの保護を付与し得るものである。また、他の哺乳動物種由来のホモログを含み、異種由来の一部を含むキメラタンパク質のようなものである。
【0042】
組成物／調製物中の免疫グロブリンの含有量を記載するために使用されるとき、用語「％［パーセント］」は、重量／重量タンパク質を意味する。
【0043】
図面のリスト
ここで、本発明は、以下の図面および配列表に関して、以下の非制限的な実施例によって例証される。
ここで、本発明は、以下の図面および配列表に関して、以下の非制限的な実施例によって例証される。
【図面の簡単な説明】
【0044】
【図1】単量体、二量体およびＪ鎖含有分泌ＩｇＡの構造の略図を示す。
【図2A】異なる抗体を用いて発色させた、異なるＩｇＡ調製物のウエスタンブロットを示す図である。図２Ａは、抗α鎖抗体、抗Ｊ鎖抗体または抗分泌成分抗体を用いて発色させた、異なるＩｇＡ調製物のウエスタンブロットを示す。
【図2B】異なる抗体を用いて発色させた、異なるＩｇＡ調製物のウエスタンブロットを示す図である。図２Ｂは、抗分泌成分抗体を用いて発色させた、異なる分泌様ＩｇＡ調製物および分泌ＩｇＡ調製物のウエスタンブロットを示す。
【図2C】異なる抗体を用いて発色させた、異なるＩｇＡ調製物のウエスタンブロットを示す図である。図２Ｃは、分泌成分、α鎖およびＪ鎖に対する抗体（複数）を用いて発色させた、分泌様ＩｇＡＦ５の異なるサイズ排除クロマトグラフィー画分のウエスタンブロットを示す。
【図3】固定化した分泌成分を用いたドットブロットを示す図である。図３Ａは、アッセイの設定法のフロー略図を示す。図３Ｂは、Ｊ鎖含有ＩｇＡを捕捉するＳＣを示す。図３Ｃは、Ｊ鎖含有ＩｇＭを捕捉するＳＣを示す。
【図4A】腸洗浄物とともにインキュベートされた、異なるＩｇＡ調製物（Ａ）の経時的な実験のウエスタンブロットを示す図である。ブロットは、抗重鎖抗体を用いて発色させた。
【図4B】腸洗浄物とともにインキュベートされた、異なるＩｇＭ調製物（Ｂ）の経時的な実験のウエスタンブロットを示す図である。ブロットは、抗重鎖抗体を用いて発色させた。
【図5A】異なるＩｇＡ調製物によるシゲラを用いた感染に対する保護を示す図である。図５Ａは、極性化Ｃａｃｏ－２単層におけるシゲラによる経上皮抵抗性の減少、および抗シゲラＳｌｇＡ（Ｐｈａｌｉｐｏｎ Ａら（１９９５年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：７６９～７７８頁参照）、ＩｇＡＦ５およびＳｌｇＡＦ５による、ＴＥＲのこのような減少からの保護を示す。
【図6】陽性対照として用いた抗シゲラＳｌｇＡ（ＳｌｇＡＣ５）、ならびに血漿由来の多量体ＩｇＡＦ５、ＳｌｇＡＦ５、単量体ＩｇＡＦ５およびＩｇＧとともにインキュベーション後に得られた免疫複合体におけるシゲラの画像を示す図である。
【図7】シゲラ単独または様々なＡｂとの組み合わせに曝露された、極性化Ｃａｃｏ－２上皮細胞単層による、サイトカインＴＮＦ－αならびにケモカインＣＸＣＬ８およびＣＣＬ３の分泌を示す図である。
【図8】五量体ＩｇＭ調製物およびＳｌｇＭ調製物による、シゲラを用いた感染に対する保護を示す図である。極性化Ｃａｃｏ－２単層におけるシゲラによる経上皮抵抗性の減少、および抗シゲラＳｌｇＡ（Ｐｈａｌｉｐｏｎ Ａら（１９９５年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：７６９～７７８頁参照）、ＩｇＭおよびＳｌｇＭによる、ＴＥＲのこのような減少からの保護を示す図である。
【0045】
配列番号１は、ヒトｐｌｇＲのタンパク質配列を示す。
【実施例】
【0046】
〔実施例１〕
組換え分泌成分と混合した血漿由来のＩｇＡ調製物のウエスタンブロット
材料と方法
１．１ アフィニティークロマトグラフィーよるおよび／またはＭＰＨＱカラムの連続溶出による血漿からのＩｇＡ調製
ヒト血漿中のＩｇＡは、ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＡＧ（Ｂｅｒｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の商業的に適用されたＩｇＧ精製プロセスに従って、出発材料として血漿ＩｇＡの３種の供給源、すなわち、クリオ除去（cryo-depleted）血漿、再可溶化した冷エタ
ノール画分ペースト、または該カラムを消毒することによって得られた陰イオン交換（ＡＩＥＸ）クロマトグラフィーカラムからのストリップ画分を用いた、製造業者の樹脂プロトコールに従ったＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒトＩｇＡ樹脂（Ｂｉｏａｆｆｉｎｉｔｙ
Ｃｏｍｐａｎｙ ＢＡＣ、Ｎａａｒｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。簡単に述べると、クリオ除去してプールされた血漿、再可溶化したペーストまたはＡＩＥＸストリップ画分を、ＩｇＡ濃度が約１ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に希釈し、次に、カラムのＩｇＡ結合能力を超えないように、ＰＢＳで平衡化したＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒトＩｇＡカラムに充填した。充填後、ＰＢＳでカラムを洗浄し、グリシン緩衝液（ｐＨ３）でＩｇＡを溶出した。溶出液を０．５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）を用いてｐＨ４．５に調整し、１６ｍｇ／ｍＬタンパク質になるまでＰＢＳ中で濃縮した。ヒトの乳由来のＳｌｇＡを同様の方法で精製した。
組換え分泌成分と混合した血漿由来のＩｇＡ調製物のウエスタンブロット
材料と方法
１．１ アフィニティークロマトグラフィーよるおよび／またはＭＰＨＱカラムの連続溶出による血漿からのＩｇＡ調製
ヒト血漿中のＩｇＡは、ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＡＧ（Ｂｅｒｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の商業的に適用されたＩｇＧ精製プロセスに従って、出発材料として血漿ＩｇＡの３種の供給源、すなわち、クリオ除去（cryo-depleted）血漿、再可溶化した冷エタ
ノール画分ペースト、または該カラムを消毒することによって得られた陰イオン交換（ＡＩＥＸ）クロマトグラフィーカラムからのストリップ画分を用いた、製造業者の樹脂プロトコールに従ったＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒトＩｇＡ樹脂（Ｂｉｏａｆｆｉｎｉｔｙ
Ｃｏｍｐａｎｙ ＢＡＣ、Ｎａａｒｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。簡単に述べると、クリオ除去してプールされた血漿、再可溶化したペーストまたはＡＩＥＸストリップ画分を、ＩｇＡ濃度が約１ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に希釈し、次に、カラムのＩｇＡ結合能力を超えないように、ＰＢＳで平衡化したＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒトＩｇＡカラムに充填した。充填後、ＰＢＳでカラムを洗浄し、グリシン緩衝液（ｐＨ３）でＩｇＡを溶出した。溶出液を０．５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）を用いてｐＨ４．５に調整し、１６ｍｇ／ｍＬタンパク質になるまでＰＢＳ中で濃縮した。ヒトの乳由来のＳｌｇＡを同様の方法で精製した。
【0047】
ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＡＧ（Ｂｅｒｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のＩＶＩｇの製造プロセスのＡＩＥＸクロマトグラフィー工程から、画分Ｆ４は、１０ｍＭリン酸塩／３０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ６．５）を用いたＭａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅ、ＣＡ）カラムの後洗浄後、５５ｍＭ酒石酸塩／５ｍＭ酢酸塩（ｐｈ７．６）による溶出によって得られた。次に、画分Ｆ５は、５０ｍＭリン酸塩／２５ｍＭクエン酸塩（ｐＨ５．０）を用いて溶出された。Ｆ４とＦ５は、限外／透析ろ過によってＰＢＳ中で約１ｍＧ／ｍＬにされ、次に、ＩｇＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによってＩｇＧを枯渇させた。ＩｇＡＦ４は、Ｆ４充填のＩｇＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーのフロースルーにおいて直接回収された。ＩｇＡＦ５を得るために、Ｆ５充填のＩｇＳｅｌｅｃｔのフロースルーは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒトＩｇＭ樹脂（Ｂｉｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｍｐａｎｙ ＢＡＣ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによってＩｇＭを枯渇させた。ＩｇＡＦ４およびＩｇＡＦ５は、限外／透析ろ過によって最終濃度にした。
【0048】
１．２ アフィニティークロマトグラフィーよる血漿からのＩｇＭ調製
ヒト血漿ＩｇＭは、ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＡＧ（Ｂｅｒｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の商業的に適用されたＩｇＧ精製プロセスに従って、ＩｇＡについてのセクション１．１に記載したように、出発材料として同じく３種の供給源、すなわち、クリオ除去血漿、再可溶化した冷エタノール画分ペースト、または該カラムを消毒することによって得られた陰イオン交換（ＡＩＥＸ）クロマトグラフィーカラムからのストリップ画分を用いた、製造業者の樹脂プロトコールに従ったＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒトＩｇＭ樹脂（
Ｂｉｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｍｐａｎｙ ＢＡＣ、Ｎａａｒｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。簡単に述べると、クリオ除去してプールされた血漿、再可溶化したペーストまたはＡＩＥＸストリップ画分を、ＩｇＭ濃度が約１ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に希釈し、次に、カラムのＩｇＭ結合能力を超えないように、ＰＢＳで平衡化したＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒトＩｇＭカラムに充填した。充填後、ＰＢＳでカラムを洗浄し、グリシン緩衝液（ｐＨ３）でＩｇＭを溶出した。溶出液を０．５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）を用いてｐＨ４．５に調整し、１０ｍｇ／ｍＬタンパク質になるまでＰＢＳ中で濃縮した。
ヒト血漿ＩｇＭは、ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＡＧ（Ｂｅｒｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の商業的に適用されたＩｇＧ精製プロセスに従って、ＩｇＡについてのセクション１．１に記載したように、出発材料として同じく３種の供給源、すなわち、クリオ除去血漿、再可溶化した冷エタノール画分ペースト、または該カラムを消毒することによって得られた陰イオン交換（ＡＩＥＸ）クロマトグラフィーカラムからのストリップ画分を用いた、製造業者の樹脂プロトコールに従ったＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒトＩｇＭ樹脂（
Ｂｉｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｍｐａｎｙ ＢＡＣ、Ｎａａｒｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。簡単に述べると、クリオ除去してプールされた血漿、再可溶化したペーストまたはＡＩＥＸストリップ画分を、ＩｇＭ濃度が約１ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に希釈し、次に、カラムのＩｇＭ結合能力を超えないように、ＰＢＳで平衡化したＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒトＩｇＭカラムに充填した。充填後、ＰＢＳでカラムを洗浄し、グリシン緩衝液（ｐＨ３）でＩｇＭを溶出した。溶出液を０．５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）を用いてｐＨ４．５に調整し、１０ｍｇ／ｍＬタンパク質になるまでＰＢＳ中で濃縮した。
【0049】
１．３．ウエスタンブロット
ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびニトロセルロース（ＮＣ）メンブレンへのエレクトロトランスファーは、製造業者のプロトコールに従って、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）からのＭｉｎｉ－Ｃｅｌｌシステムを用いて行われた。簡潔には、試料は、それぞれ、還元または非還元条件下で試料緩衝液中で変性させ、ＮｕＰＡＧＥ ＭＯＰＳ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、プレキャスト勾配ゲル、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ４～１２％ １．０ｍｍ １０ウェル上で電気泳動により分離された。ＮＣメンブレン（０．２μｍ）へのウェット転写は、ＸＣｅｌｌ ＩＩブロットモジュール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＮｕＰＡＧＥ転写緩衝液を用いて行われた。次に、メンブレンは、４％Ｒａｐｉｌａｉｔ脱脂粉乳（Ｍｉｇｒｏｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有するＰＢＳ－０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０溶液（ＰＢＳ－Ｔ）中で３０分間ブロックされた。イムノブロッティングについて、ポリクローナルウサギ抗体：１）ウサギ抗ヒトアルファ鎖（Ｄａｋｏ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化：１／５，０００希釈）；２）ウサギ抗ヒトＪ鎖（ＢｉｏＧｅｎｅｘ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ；１／３００希釈）、続く二次抗ウサギＨＲＰコンジュゲート化抗血清（Ｓｉｇｍａ；１／１０，０００希釈）；３）ウサギ抗ヒトＳＣ（Ｄａｋｏ；１／５０００希釈）、続く二次抗ウサギＨＲＰコンジュゲート化抗血清（Ｓｉｇｍａ；１／１０，０００希釈）を用いた。全てのインキュベーションは、４％粉乳を含有するＰＢＳ－Ｔ中で周囲温度にて１～２時間行われた。ＰＢＳ－Ｔを用いた最終洗浄後、メンブレン上の免疫検出は、化学発光によって明らかにされ、デジタル的にＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ４０００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）において記録された。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびニトロセルロース（ＮＣ）メンブレンへのエレクトロトランスファーは、製造業者のプロトコールに従って、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）からのＭｉｎｉ－Ｃｅｌｌシステムを用いて行われた。簡潔には、試料は、それぞれ、還元または非還元条件下で試料緩衝液中で変性させ、ＮｕＰＡＧＥ ＭＯＰＳ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、プレキャスト勾配ゲル、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ４～１２％ １．０ｍｍ １０ウェル上で電気泳動により分離された。ＮＣメンブレン（０．２μｍ）へのウェット転写は、ＸＣｅｌｌ ＩＩブロットモジュール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＮｕＰＡＧＥ転写緩衝液を用いて行われた。次に、メンブレンは、４％Ｒａｐｉｌａｉｔ脱脂粉乳（Ｍｉｇｒｏｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有するＰＢＳ－０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０溶液（ＰＢＳ－Ｔ）中で３０分間ブロックされた。イムノブロッティングについて、ポリクローナルウサギ抗体：１）ウサギ抗ヒトアルファ鎖（Ｄａｋｏ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化：１／５，０００希釈）；２）ウサギ抗ヒトＪ鎖（ＢｉｏＧｅｎｅｘ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ；１／３００希釈）、続く二次抗ウサギＨＲＰコンジュゲート化抗血清（Ｓｉｇｍａ；１／１０，０００希釈）；３）ウサギ抗ヒトＳＣ（Ｄａｋｏ；１／５０００希釈）、続く二次抗ウサギＨＲＰコンジュゲート化抗血清（Ｓｉｇｍａ；１／１０，０００希釈）を用いた。全てのインキュベーションは、４％粉乳を含有するＰＢＳ－Ｔ中で周囲温度にて１～２時間行われた。ＰＢＳ－Ｔを用いた最終洗浄後、メンブレン上の免疫検出は、化学発光によって明らかにされ、デジタル的にＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ４０００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）において記録された。
【0050】
１．４ 組換え分泌成分を用いた血漿由来のＩｇＡの結合
分泌様ＩｇＡは、インビトロにおいて、１００ｍｇのＩｇＡＦ５と４ｍｇの組換えヒト分泌成分（ｒｅｃＳＣ）を組み合わせることによって得られた。結合は、（Ｃｒｏｔｔｅｔ、Ｐ．、およびＣｏｒｔｈｅｓｙ、Ｂ．（１９９８年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５４４５～５４５３頁）において先に報告されているように、ＰＢＳ中で３０分間、室温にて行われた。
分泌様ＩｇＡは、インビトロにおいて、１００ｍｇのＩｇＡＦ５と４ｍｇの組換えヒト分泌成分（ｒｅｃＳＣ）を組み合わせることによって得られた。結合は、（Ｃｒｏｔｔｅｔ、Ｐ．、およびＣｏｒｔｈｅｓｙ、Ｂ．（１９９８年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５４４５～５４５３頁）において先に報告されているように、ＰＢＳ中で３０分間、室温にて行われた。
【0051】
１．５ サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分画
分泌様ＩｇＡを含むＩｇＡＦ５（インビトロにおいてｒｅｃＳＣと結合される）は、ＴＳＫゲル Ｇ３０００ＳＷＸＬ ７．８ｍｍ ＩＤ×３０ｃｍカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上で流速１．５ｍＬ／分にて、サイズ排除クロマトグラフィーのためのＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １０５０ ＨＰＬＣシステムに２００μｇ／２０μＬで注入された。０．７５ｍＬの画分を３０秒間隔で８．０分と１３．５分の保持時間の間に回収した。
分泌様ＩｇＡを含むＩｇＡＦ５（インビトロにおいてｒｅｃＳＣと結合される）は、ＴＳＫゲル Ｇ３０００ＳＷＸＬ ７．８ｍｍ ＩＤ×３０ｃｍカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上で流速１．５ｍＬ／分にて、サイズ排除クロマトグラフィーのためのＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １０５０ ＨＰＬＣシステムに２００μｇ／２０μＬで注入された。０．７５ｍＬの画分を３０秒間隔で８．０分と１３．５分の保持時間の間に回収した。
【0052】
結果
結果を図２に示す。図２Ａは、血漿、再可溶化したペーストおよびＡＩＥＸストリップ画分からアフィニティークロマトグラフィーによって精製したＩｇＡ、または１．１に記
載されるようにＩｇＡＦ５を得るための連続溶出によって精製したＩｇＡと、ヒト乳からのＳｌｇＡとの比較を実証する。分泌成分は、乳からのＳｌｇＡにおいて見出されたが、ヒト血漿から精製したＩｇＡ画分のいずれにも見出されなかった。全ての調製物は、同量のＩｇＡ重鎖／アルファ鎖を含有していた。予測したように、乳由来のＳｌｇＡは、本質的に全てのＩｇＡ分子がＪ鎖含有二量体として存在することが期待されるため、最も多量のＪ鎖を含有していた。Ｊ鎖、したがって血漿から精製されたＩｇＡ中のＪ鎖含有ＩｇＡ二量体の量は低かった。少量の血漿ＩｇＡだけが二量体形態で存在するため、これは予想される。同じ含有量のＪ鎖は、再可溶化されたペーストから精製されたＩｇＡにおいて観察された。驚くべきことに、増加したＩｇＡの画分は、増加したＪ鎖の量によって証明されるように、カラムストリップ画分においてＪ鎖含有二量体として存在した。驚くべきことに、これは、ＩｇＡＦ５においてさらに増加した。この蓄積は、富化のための特定のプロセス工程を適用せずに生じた。
結果を図２に示す。図２Ａは、血漿、再可溶化したペーストおよびＡＩＥＸストリップ画分からアフィニティークロマトグラフィーによって精製したＩｇＡ、または１．１に記
載されるようにＩｇＡＦ５を得るための連続溶出によって精製したＩｇＡと、ヒト乳からのＳｌｇＡとの比較を実証する。分泌成分は、乳からのＳｌｇＡにおいて見出されたが、ヒト血漿から精製したＩｇＡ画分のいずれにも見出されなかった。全ての調製物は、同量のＩｇＡ重鎖／アルファ鎖を含有していた。予測したように、乳由来のＳｌｇＡは、本質的に全てのＩｇＡ分子がＪ鎖含有二量体として存在することが期待されるため、最も多量のＪ鎖を含有していた。Ｊ鎖、したがって血漿から精製されたＩｇＡ中のＪ鎖含有ＩｇＡ二量体の量は低かった。少量の血漿ＩｇＡだけが二量体形態で存在するため、これは予想される。同じ含有量のＪ鎖は、再可溶化されたペーストから精製されたＩｇＡにおいて観察された。驚くべきことに、増加したＩｇＡの画分は、増加したＪ鎖の量によって証明されるように、カラムストリップ画分においてＪ鎖含有二量体として存在した。驚くべきことに、これは、ＩｇＡＦ５においてさらに増加した。この蓄積は、富化のための特定のプロセス工程を適用せずに生じた。
【0053】
図２Ｂは、分泌成分を含むＩｇＡがＩｇＡＦ５に存在しなかったことを示している。ｒｅｃＳＣとの結合後、遊離ｒｅｃＳＣ（７５ｋＤａ）とｒｅｃＳＣに結合した二量体ＩｇＡが見出された。実際に、分泌様血漿ＩｇＡは、乳由来のＳｌｇＡと類似しているようであった。示された実験において使用されたＩｇＡＦ５の調製において、Ｊ鎖含有ＩｇＡＦ５の含有量が約２０％であったことが推定された。実際に、レーン２において観察されたシグナル強度は、１：５に希釈したヒト乳ＳｌｇＡのシグナルに匹敵していた。
【0054】
図２Ｃは、分泌様ＩｇＡＦ５のサイズ排除クロマトグラフィーによって得られた画分中のＳＣ、ＩｇＡアルファ鎖およびＪ鎖の含有量を示している。ｒｅｃＳｃは、多量体形態および二量体形態のようなＩｇＡの高分子量形態に対応する初期の画分において観察された。ＳＣの出現は、Ｊ鎖の出現と一致し、これは、確かに、ＩｇＡＦ５のＳＣ含有画分が二量体のＪ鎖含有画分であることを示した。さらに、ＩｇＡアルファ鎖は、より小さな分子量の画分において検出され、おそらくはＩｇＡＦ５の単量体画分を含むものであった；これらの画分は、ＳＣとＪ鎖を欠いていた。これらのデータは、ｒｅｃＳＣが、ＩｇＡの二量体のＪ鎖含有形態に特異的に結合したＩｇＡの単量体形態と二量体形態を含む血漿由来のＩｇＡと混合したことを示している。
【0055】
図２Ｄは、画分が保持時間８．０分と１３．５分の間に回収された過程でのＳＥＣ実施のクロマトグラムを示す。ＩｇＡ多量体、二量体および単量体を表すピークが示されている。
【0056】
〔実施例２〕
ドットブロット再結合アッセイ（ＤＯＲＡ）
ドットブロット再結合アッセイを用いて、インビトロでの血漿由来のＩｇＡまたはＩｇＭとの固定化された分泌成分の結合を示した。簡単に述べると、図３Ａに示すように、分泌成分をブロッティングメンブレンにドットした；非特異的結合部位をブロックした。その後、１．１および１．２に記載したように得られた血漿（レーン４）、再可溶化したペースト（レーン５）またはＡＩＥＸストリップ画分（レーン６）からのアフィニティークロマトグラフィーによって得られた血漿由来のＩｇＡ（図３Ｂ）またはＩｇＭ（図３Ｃ）をメンブレンに適用した。未結合のＩｇＡまたはＩｇＭを洗い流した後、以下に簡単に記載したように、結合したＩｇＡ／ＩｇＭを検出した。
ドットブロット再結合アッセイ（ＤＯＲＡ）
ドットブロット再結合アッセイを用いて、インビトロでの血漿由来のＩｇＡまたはＩｇＭとの固定化された分泌成分の結合を示した。簡単に述べると、図３Ａに示すように、分泌成分をブロッティングメンブレンにドットした；非特異的結合部位をブロックした。その後、１．１および１．２に記載したように得られた血漿（レーン４）、再可溶化したペースト（レーン５）またはＡＩＥＸストリップ画分（レーン６）からのアフィニティークロマトグラフィーによって得られた血漿由来のＩｇＡ（図３Ｂ）またはＩｇＭ（図３Ｃ）をメンブレンに適用した。未結合のＩｇＡまたはＩｇＭを洗い流した後、以下に簡単に記載したように、結合したＩｇＡ／ＩｇＭを検出した。
【0057】
ＤＯＲＡは、本質的には記載したように行われた（Ｒｉｎｄｉｓｂａｃｈｅｒ、Ｌ．ら（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４２２０～１４２２８頁）が、以下の変更を伴った：ブロッティングメンブレンは、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）からなっていた。ブロッキング溶液は、リン酸緩衝生理食塩水－１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳ－Ｔ）であった。ＩｇＡに富化した粗
調製物は、２００μｌの０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ中でオーバレイインキュベーションのために使用された。検出抗体をＨＲＰに直接結合させた。
調製物は、２００μｌの０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ中でオーバレイインキュベーションのために使用された。検出抗体をＨＲＰに直接結合させた。
【0058】
【0059】
ＩｇＭについての結果を図３Ｃに示す。固定化された分泌成分は、血漿由来のＩｇＭを捕捉することができた。これは、ｒｅｃＳＣが血漿由来のＩｇＭに結合したことを実証する。
【0060】
〔実施例３〕
腸洗浄物を用いた分泌様ＩｇＡおよび分泌様ＩｇＭの消化
それぞれＪ鎖含有ＩｇＡとＩｇＭとの精製された分泌成分の結合の機能的優位性を証明するために、ＩｇＡとＩｇＭは、１．１と１．２段落に記載したように調製した。分泌様ＩｇＡは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いてＪ鎖含有ＩｇＡを富化し、インビトロでその１０μｇと２．５μｇの組換えヒト分泌成分（ｈＳＣｒｅｃ）を組み合わせることによって得られた。分泌様ＩｇＭは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて五量体ＩｇＭを富化し、インビトロでその２５μｇと２．５μｇの組換えヒト分泌成分（ｈＳＣｒｅｃ）を組み合わせることによって得られた。結合は、先に報告されるように（Ｃｒｏｔｔｅｔ、Ｐ．、およびＣｏｒｔｈｅｓｙ、Ｂ．（１９９８年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５４４５～５４５３頁）、ＰＢＳ中で３０分間、室温にて行われた。可能な共有結合複合体への分子の完全性と適切な集合は、非還元および還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ、続くウエスタンブロッティングおよび上記で示されるｈＳＣに特異的な抗血清を用いて免疫検出によって調べられた。
腸洗浄物を用いた分泌様ＩｇＡおよび分泌様ＩｇＭの消化
それぞれＪ鎖含有ＩｇＡとＩｇＭとの精製された分泌成分の結合の機能的優位性を証明するために、ＩｇＡとＩｇＭは、１．１と１．２段落に記載したように調製した。分泌様ＩｇＡは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いてＪ鎖含有ＩｇＡを富化し、インビトロでその１０μｇと２．５μｇの組換えヒト分泌成分（ｈＳＣｒｅｃ）を組み合わせることによって得られた。分泌様ＩｇＭは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて五量体ＩｇＭを富化し、インビトロでその２５μｇと２．５μｇの組換えヒト分泌成分（ｈＳＣｒｅｃ）を組み合わせることによって得られた。結合は、先に報告されるように（Ｃｒｏｔｔｅｔ、Ｐ．、およびＣｏｒｔｈｅｓｙ、Ｂ．（１９９８年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５４４５～５４５３頁）、ＰＢＳ中で３０分間、室温にて行われた。可能な共有結合複合体への分子の完全性と適切な集合は、非還元および還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ、続くウエスタンブロッティングおよび上記で示されるｈＳＣに特異的な抗血清を用いて免疫検出によって調べられた。
【0061】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（４～６週齢）からの腸洗浄物の回収は、公開されている手法（Ｃｒｏｔｔｅｔ、Ｐ．、およびＣｏｒｔｈｅｓｙ、Ｂ．（１９９８年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５４４５～５４５３頁）に従って行われた。インビトロ消化について、１２０ｎｇの精製したＪ鎖含有ＩｇＡおよび再構成した分泌様ＩｇＡは、最終体積が２０μｌのＰＢＳ中で１または２μｌの腸洗浄物と混合され（または混合されず）、図４に指示されるように様々な期間、３７℃にてインキュベートされた（Ｔ＝時間）。ＩｇＭのインビトロ消化について、２５０ｎｇの精製したＩｇＭと分泌様ＩｇＭは、４μｌの腸洗浄物と混合された。２μｌのＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の添加によって反応を停止させ、抗体の重鎖の還元型を検出するウエスタンブロットによる分析まで凍結保存させた。
【0062】
結果を図４ＡとＢに示す。再可溶化したペースト由来のＩｇＡと１．１に記載したように得られたカラムストリップ由来のＩｇＡ、および１．２に記載されるカラムストリップ由来のＩｇＭは、ｒｅｃＳＣとの結合後、それ自体またはそれらの両方のいずれかが使用され、分泌様ＩｇＡ（図４Ａ）または分泌様ＩｇＭ（図４Ｂ）を形成した。ＩｇＡについて、腸内酵素を用いた消化からの４時間後、結合していないＩｇＡのシグナルは減少し始め、これはタンパク質消化を示した；効果は、６時間後および一晩の消化後により強かった。無傷なＩｇＡアルファ鎖はウエスタンブロットによって検出されなかった。対照的に、分泌様ＩｇＡは、腸内プロテアーゼによる消化に対して感受性が非常に小さく、一晩の曝露後でさえ、分泌様ＩｇＡ内のＩｇＡアルファ鎖の大部分は無傷のままであった。
【0063】
ＩｇＭ（図４Ｂ）について、消化から２４時間後と４８時間後に同じ調製物とＩｇＭおよび新たに結合した分泌様ＩｇＭ（ＳｌｇＭ）の比較が示される。分解したミュー鎖断片
の出現は、ＳｌｇＭと比較して、ＩｇＭについてより迅速におよびより広範囲に生じた。これは、ＩｇＡと同様にＩｇＭについて、ｒｅｃＳＣとの結合が改善された構造的安定性を提供していることを確認した。
の出現は、ＳｌｇＭと比較して、ＩｇＭについてより迅速におよびより広範囲に生じた。これは、ＩｇＡと同様にＩｇＭについて、ｒｅｃＳＣとの結合が改善された構造的安定性を提供していることを確認した。
【0064】
全体的に、これは、ｒｅｃＳＣとの特異的な結合が改善された構造的安定性を提供し、例えば、経口経路を介して、消化を起こしやすい血漿ＩｇＡ分子が粘膜適用に適合するようにすることを実証する。
【0065】
〔実施例４〕
シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）
ヒト結腸腺癌上皮Ｃａｃｏ－２細胞系（アメリカン・タイプ・ティッシュ・コレクション）は、（Ｃｒｏｔｔｅｔ、Ｓ．、Ｃｏｒｔｈｅｓｙ－Ｔｈｅｕｌａｚ、Ｉ．、Ｓｐｅｒｔｉｎｉ、Ｆ．、およびＣｏｒｔｈｅｓｙ、Ｂ．（２００２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３３９７８～３３９８６頁）に報告されるように、ポリエステルＳｎａｐｗｅｌｌフィルタ（径１２ｍｍ；細孔径０．４μｍ；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）上に播種された。極性化Ｃａｃｏ－２細胞単層の完全性は、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ－ＥＲＳデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）を測定することによって確認された。高分化型単層のＴＥＲ値は４５０～５５０Ω×ｃｍ２の範囲であった。
シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）
ヒト結腸腺癌上皮Ｃａｃｏ－２細胞系（アメリカン・タイプ・ティッシュ・コレクション）は、（Ｃｒｏｔｔｅｔ、Ｓ．、Ｃｏｒｔｈｅｓｙ－Ｔｈｅｕｌａｚ、Ｉ．、Ｓｐｅｒｔｉｎｉ、Ｆ．、およびＣｏｒｔｈｅｓｙ、Ｂ．（２００２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３３９７８～３３９８６頁）に報告されるように、ポリエステルＳｎａｐｗｅｌｌフィルタ（径１２ｍｍ；細孔径０．４μｍ；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）上に播種された。極性化Ｃａｃｏ－２細胞単層の完全性は、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ－ＥＲＳデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）を測定することによって確認された。高分化型単層のＴＥＲ値は４５０～５５０Ω×ｃｍ２の範囲であった。
【0066】
２×１０７細菌（Ｐｈａｌｉｐｏｎ Ａ．ら（１９９５年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：７６９～７７８頁）は、最終体積が５００μｌの通常のＤＭＥＭ（Ｐ－ＤＭＥＭ；１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０μｇ／ｍｌトランスフェリン、２ｍＭグルタミン、１％非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウムが捕捉されたＤＭＥＭ）中で、１００μｇ ＩｇＡ、１２５μｇ分泌様ＩｇＡ、２７５μｇ ＩｇＭまたは３００μｇ ＳｌｇＭと混合され、１時間室温にて穏やかな撹拌下でインキュベートされた。混合物は、極性化Ｃａｃｏ－２細胞単層を感染させるためにＰ－ＤＭＥＭ中に再懸濁された。
【0067】
極性化Ｃａｃｏ－２細胞単層を使用する１時間前に、Ｃ－ＤＭＥＭは、頂端と側底コンパートメントの両方にＰ－ＤＭＥＭで置換された。次に、頂端培地は、５００μｌの細菌懸濁液（２×１０７細菌）それ自体または抗体と組み合わせて交換された。ＴＥＲ値は、以降の感染開始からの選択された時点で測定された。
【0068】
細胞に付着し、感染させた細菌を定量するために、フィルタ中のＣａｃｏ－２細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞は、氷上で５００μｌの冷溶解緩衝液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７）、０．２％Ｎｏｎｉｄｅｎｔ Ｐ－４０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ８）］中で５分間インキュベートされ、上下にピペティッングすることによって溶解した。細胞溶解物の連続希釈（１０－２～１０－６）をＬＢ寒天プレートに適用し、３７℃でのインキュベーションの２４時間後、コロニー形成単位（ＣＦＵ）は、二重のプレートを目視してカウントすることによって決定した。
ＥＤＴＡ（ｐＨ８）］中で５分間インキュベートされ、上下にピペティッングすることによって溶解した。細胞溶解物の連続希釈（１０－２～１０－６）をＬＢ寒天プレートに適用し、３７℃でのインキュベーションの２４時間後、コロニー形成単位（ＣＦＵ）は、二重のプレートを目視してカウントすることによって決定した。
【0069】
Ｃａｃｏ－２細胞単層の完全性を試験するために、スナップウェルは、４℃での５ｍｌの４％パラホルムアルデヒドによる一晩の固定前にＰＢＳで洗浄された。ＰＢＳでの洗浄後、フィルタを透過処理し、非特異的結合部位は、５％ＦＣＳおよび０．２％トリトンＸ－１００を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔｒ）を用いて、室温で３０分間ブロックした。全ての抗体をＰＢＳ－Ｔｒ中で希釈した。フィルタは、ウサギ抗ヒトＺＯ－１（１／２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに２時間、室温にてインキュベートされ、ＰＢＳ中で洗浄され、続いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７がコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ（１／１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに９０分間、室温にてインキュベートされた。細胞を可視化するために、フィルタは、最終的に、ＰＢＳ中の１００ｎｇ／ｍｌの４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）とともに３０分間インキュベートされた。フィルタは、それらのホルダーに切り出され、１０×または４０×のいずれかの対物を備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０ Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた観察のためにＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ溶液に積層された。画像は、Ｚｅｉｓｓ ＺＥＮ２００９光ソフトウェアを用いて処理された。
ｏｇｅｎ）とともに３０分間インキュベートされた。フィルタは、それらのホルダーに切り出され、１０×または４０×のいずれかの対物を備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０ Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた観察のためにＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ溶液に積層された。画像は、Ｚｅｉｓｓ ＺＥＮ２００９光ソフトウェアを用いて処理された。
【0070】
シゲラ－ＩｇＡ複合体を調べるために、緑色蛍光タンパク質を構成的に発現する細菌を使用した。免疫複合体の形成は、ビオチン化マウス抗ヒトＩｇＡ１／ＩｇＡ２（１／１０、ＢＤ）とともに３０分間室温にて穏やかな撹拌下でインキュベーションし、続くシアニン５をコンジュゲートしたストレプトアビジン（１／４００、ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）とともに３０分間室温にて穏やか撹拌下でインキュベーション後に確認された。ＰＢＳによる３回洗浄は、それぞれの工程間に行われ、全ての抗体は、ＰＢＳ／５％ＦＣＳに希釈された。標識された免疫複合体は、スライドガラス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に置かれ、積層され、６３×対物を備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０ Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて即座に可視化された。画像は、Ｚｅｉｓｓ ＺＥＮ ２００９光ソフトウェアを用いて処理された。
【0071】
極性化Ｃａｃｏ－２細胞単層の側底コンパートメントにおけるヒトＣＸＣＬ８（ＩＬ－８）、ＴＮＦ－αおよびＣＣＬ３（ＭＩＰ－３ａ）は、市販キット（それぞれ、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＥＬＩＳＡによって定量された。
【0072】
結果
シゲラへの極性化腸上皮細胞単層の曝露は、単層の完全性の破壊をもたらし、これはＴＥＲの減少によって証明され（図５Ａ）、大規模な侵入をもたらし、こえは上皮細胞との結合において見られた細菌数の上昇（図５Ｂ）、およびレーザ走査共焦点顕微鏡によって観察される視覚的に損なわれた細胞単層によって証明された。分泌様ＩｇＡの添加は、単層の破壊を遅延され、部分的に阻害した。これは、ＴＥＲの減少の有意な阻害（図５Ａ）、上皮細胞に結合した細菌数の減少（図５Ｂ）、および共焦点顕微鏡におる分析におけるより多くの保存された細胞単層の完全性によって指示された。
シゲラへの極性化腸上皮細胞単層の曝露は、単層の完全性の破壊をもたらし、これはＴＥＲの減少によって証明され（図５Ａ）、大規模な侵入をもたらし、こえは上皮細胞との結合において見られた細菌数の上昇（図５Ｂ）、およびレーザ走査共焦点顕微鏡によって観察される視覚的に損なわれた細胞単層によって証明された。分泌様ＩｇＡの添加は、単層の破壊を遅延され、部分的に阻害した。これは、ＴＥＲの減少の有意な阻害（図５Ａ）、上皮細胞に結合した細菌数の減少（図５Ｂ）、および共焦点顕微鏡におる分析におけるより多くの保存された細胞単層の完全性によって指示された。
【0073】
シゲラ特異的モノクローナルＳｌｇＡ ＳｌｇＡＣ５、多量体ＩｇＡおよび分泌様ＩｇＡの結合は、細菌のみを被覆した単量体ＩｇＡおよびＩｇＧ（図６）と対照的に、複数の細菌の免疫凝集体の形成をもたらした（図６）。特異的ｍＡｂおよび血漿由来のｐｌｇＡおよび分泌様ＩｇＡによる細菌凝集は、図５Ｂにおいて観察されるＣａｃｏ－２細胞への細菌付着の減少に寄与した可能性がある。同じ３つの抗体調製物は、Ｃａｃｏ－２細胞による炎症促進性サイトカイン／ケモカインの生成を顕著に減少させ、一方、単量体ＩｇＡＦ４およびＩｇＧは、効果がなく（ＴＮＦ－αおよびＣＣＬ３）または効果が弱かった（ＣＸＣＬ８）（図７）。これは、分泌および多量体ＩｇＡによるシゲラの中和が、Ｃａｃｏ－２細胞の応答性を減少させ、最終的に、ＩｇＡの全体的な抗炎症性に寄与することを示している。
【0074】
シゲラによる感染からの極性化Ｃａｃｏ－２細胞単層の保護は、同様に、特定のＳｌｇＡＣ５を用いた場合に回復したのと少なくとも同レベルまで、ＩｇＭおよび分泌様ＩｇＭを用いて達成された（図８）。少なくともから１２時間３０分のＴＥＲの維持は、ＩｇＭアイソタイプが、シゲラへの曝露によって誘導された損傷からＣａｃｏ－２単層を保護する中和特性を有することを示している。
【0075】
〔実施例５〕
クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）感染症（ＣＤＩ）の再発
予防
本発明の組成物は、クロストリジウム・ディフィシル感染症のマウスモデルにおいて使用される。
クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）感染症（ＣＤＩ）の再発
予防
本発明の組成物は、クロストリジウム・ディフィシル感染症のマウスモデルにおいて使用される。
【0076】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、先に記載されるように（Ｃｈｅｎ Ｘ、ら．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００８年 Ｄｅｃ；１３５（６）：１９８４～９２頁）、経口抗生物質（カナマイシン、ゲンタマイシン、コリスチン、メトロニダゾールおよびバンコマイシン）の混合物で３日間処理される。２日後、それらには、非経口のリン酸クリンダマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ皮下）が与えられる［－１日目］。１日後［０日］、それらは、０．５×１０５ｃｆｕの毒素産生性Ｃ．ディフィシル菌株１０４６５を用いた強制経口によって抗原投与される。中程度から劇症の大腸炎は、Ｃ．ディフィシル投与から１～５日後に発症する。未処理の場合、これは、大部分の動物において、重症および致命的な大腸炎に急速に進行する。一次感染を治療するために、動物は、Ｃ．ディフィシル抗原投与後の５日間、バンコマイシンを受け、動物は、致死率、ならびに下痢を伴う重度ＣＤＩの有無について監視される。瀕死状態であると判断された動物をペントバルビタールナトリウムの単回注射によって安楽死させる。ＣＤＩの再発を研究するために、一次Ｃ．ディフィシル抗原投与で生き残った動物を２８日目まで観察下で維持される。動物は、７日目から２８日目まで週に３回計量される。バンコマイシン処置の中止後、動物は、バンコマイシンの最終投薬後の日から開始して５日間、ＩｇＡまたは分泌様ＩｇＡ（経口経路を介して４００ｍｇ／ｋｇ体重）を受ける。
【0077】
結果
バンコマイシンで処置された動物は、Ｃ．ディフィシルによる一次感染に対して生き残る。しかしながら、動物のかなりの割合－最大７０％－は、バンコマイシン処置の終了後の３～４日以内に、Ｃ．ディフィシル感染の再発により死亡する。対照的に、感染の再発は、動物が、経口経路を介して分泌様ＩｇＡで処理された場合に予防される。血漿ＩｇＡ単独は、Ｃ．ディフィシル感染の再発予防における分泌様ＩｇＡのように効果的でない（または少なくとも同程度に効果的でない）。
バンコマイシンで処置された動物は、Ｃ．ディフィシルによる一次感染に対して生き残る。しかしながら、動物のかなりの割合－最大７０％－は、バンコマイシン処置の終了後の３～４日以内に、Ｃ．ディフィシル感染の再発により死亡する。対照的に、感染の再発は、動物が、経口経路を介して分泌様ＩｇＡで処理された場合に予防される。血漿ＩｇＡ単独は、Ｃ．ディフィシル感染の再発予防における分泌様ＩｇＡのように効果的でない（または少なくとも同程度に効果的でない）。
【0078】
あるいは、組成物は、Ｗａｔｋｉｎｓら（Ｏｒａｌ Ｄｉｓ ２０１０年、１６：６５５～６６０頁）において報告されているのと同様の口腔粘膜炎モデルで使用される。
【0079】
適切に製剤化されたＩｇＡ製剤（または対照についてはビヒクル溶液）は、最大２８日目までの研究の全期間、シリアンゴールデンハムスターに、予防的に（例えば、－３日目に開始）毎日３回与えられる。急性放射線によって誘導された粘膜炎のモデルにおいて、０日目に、一方の反転させた口腔頬袋を放射線照射（４０Ｇｙ）し、他方の頬袋を対照のために未処置のままにする。あるいは、分割された放射線によって誘導した粘膜炎のモデルにおいて、６０Ｇｙの累積線量が適用され、（Ｗａｔｋｉｎｓ、Ｏｒａｌ Ｄｉｓ ２０１０年、１６：６５５～６６０頁）に記載されるように、７．５Ｇｙの８回の分割に分配される。併用シスプラチンおよび急性放射線によって誘導した粘膜炎のさらに別のモデルにおいて、疾患は、０日目にシスプラチン（５ｍｇ／ｋｇ）および３５Ｇｙの放射線の組み合わせによって誘導される。口腔粘膜炎の臨床評価および体重のモニタリングは、６日目に開始し、研究の終了まで、典型的には２８日目まで毎日行われる。採点システムは（Ｗａｔｋｉｎｓ Ｏｒａｌ Ｄｉｓ、２０１０年 １６：６５５～６６０頁）に記載されている。さらに、組織および血漿試料を回収し、組織学的分析、血漿中の炎症マーカーの決定、および様々な組織の遺伝子発現研究のために、研究全体で適切に処理される。
【0080】
結果
未処置／ビヒクル処理された動物は、口腔粘膜炎を発症し、疾患ピークは１６～１８日目辺りであり、自然治癒は、粘膜炎の回帰によって証明され、１８～２０日目辺りで開始
する。ＩｇＡ、特に分泌様ＩｇＡで処置された動物は、対照動物と比較して有意に低い粘膜炎スコアを有し、体重減少が少なく、同時に軽度の組織学的所見があり、炎症マーカー（限定されないが、炎症サイトカインおよびケモカインを含む）のレベルが減少する。炎症の減少と創傷治癒の促進は、遺伝子発現分析技術によって、ｍＲＮＡ発現レベルで確認される。
未処置／ビヒクル処理された動物は、口腔粘膜炎を発症し、疾患ピークは１６～１８日目辺りであり、自然治癒は、粘膜炎の回帰によって証明され、１８～２０日目辺りで開始
する。ＩｇＡ、特に分泌様ＩｇＡで処置された動物は、対照動物と比較して有意に低い粘膜炎スコアを有し、体重減少が少なく、同時に軽度の組織学的所見があり、炎症マーカー（限定されないが、炎症サイトカインおよびケモカインを含む）のレベルが減少する。炎症の減少と創傷治癒の促進は、遺伝子発現分析技術によって、ｍＲＮＡ発現レベルで確認される。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】