特許 7576180 ＧｌｘＲ蛋白質変異体またはこれを利用したスレオニン生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-22

(45)【発行日】2024-10-30

(54)【発明の名称】ＧｌｘＲ蛋白質変異体またはこれを利用したスレオニン生産方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/31 20060101AFI20241023BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241023BHJP

   C12P 13/08 20060101ALI20241023BHJP

【ＦＩ】

C12N15/31

C12N1/21 ZNA

C12P13/08 C

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2023541941

(86)(22)【出願日】2022-01-06

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-24

(86)【国際出願番号】 KR2022000204

(87)【国際公開番号】W WO2022149865

(87)【国際公開日】2022-07-14

【審査請求日】2023-07-11

(31)【優先権主張番号】10-2021-0003609

(32)【優先日】2021-01-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12899P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12900P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12901P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12902P

(73)【特許権者】

【識別番号】507406611

【氏名又は名称】シージェイ チェルジェダン コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】110001818

【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ

(72)【発明者】

【氏名】ソ，イ‐スル

(72)【発明者】

【氏名】クォン，ス・ヨン

(72)【発明者】

【氏名】イ，クァン・ウ

(72)【発明者】

【氏名】シム，ジヒョン

【審査官】田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】特表２００５－５３６１９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１８－１１３９６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８－５２２６１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】JOURNAL OF BACTERIOLOGY，2004年，Vol.186, No.11，pp.3453-3460，DOI: 10.1128/JB.186.11.3453-3460.2004

【文献】J. Mol. Biol.，2000年，Vol.299，pp.295-310

【文献】Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1993年，Vol.90，pp.6081-6085

【文献】FEMS Microbiol Lett，2010年，Vol.304，pp.107-115，DOI:10.1111/j.1574-6968.2009.01884.x

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｐ １３／０８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（１）乃至（４）からなる群より選択された変異を含み、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、ＧｌｘＲ（ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ ｂｙｐａｓｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）蛋白質変異体。
（１）配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から４５番目のアミノ酸位置に相応する残基がアラニン、セリン、フェニルアラニン、またはリジンに置換；
（２）配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から６６番目のアミノ酸位置に相応する残基がアラニン、フェニルアラニン、またはリジンに置換；
（３）配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から１６６番目のアミノ酸位置に相応する残基がアスパラギン酸、フェニルアラニン、またはリジンに置換；および
（４）配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から１６８番目のアミノ酸位置に相応する残基がアラニン、フェニルアラニン、またはリジンに置換。

【請求項2】

請求項１に記載のＧｌｘＲ蛋白質変異体をコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項3】

請求項１に記載のＧｌｘＲ蛋白質変異体および前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体をコードするポリヌクレオチドからなる群より選択された１種以上を含む、微生物。

【請求項4】

前記微生物は、Ｌ－スレオニン生産能を有するものである、請求項３に記載の微生物。

【請求項5】

前記微生物は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）である、請求項３に記載の微生物。

【請求項6】

前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項５に記載の微生物。

【請求項7】

請求項３乃至６のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養する段階を含む、Ｌ－スレオニンの生産方法。

【請求項8】

前記方法は、培養された培地または微生物からＬ－スレオニンを回収する段階をさらに含む、請求項７に記載のＬ－スレオニンの生産方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願（ら）との相互引用
本出願は、２０２１年１月１１日付大韓民国特許出願第１０－２０２１－０００３６０９号に基づいた優先権の利益を主張し、当該大韓民国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。

【0002】

本出願は、ＧｌｘＲ蛋白質変異体またはこれを利用したスレオニン生産方法に関する。

【背景技術】

【0003】

Ｌ－スレオニンは、必須アミノ酸の一種で飼料または食品添加剤、医薬品の合成原料および医薬用輸液剤として使用されている。Ｌ－スレオニンは、主に微生物醗酵技術により生産され、例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、またはプロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属微生物などを利用して生産され得る。

【0004】

最近はコリネバクテリウム属菌株を利用したＬ－スレオニンの製造方法を改善するために多くの試みが行われている。遺伝子組換え技術の発展によりランダム突然変異法により開発されたＬ－スレオニン生産株を対象として部位特異的遺伝子置換、遺伝子増幅および欠失などを導入してより向上したＬ－スレオニン生産株の開発に対する技術が報告されている。また、他のバクテリア由来の外来遺伝子を導入する試みもある。

【0005】

このような努力にも、Ｌ－スレオニンのような有用物質の生産能を向上させる技術の開発は依然として要求されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】米国公開特許第２０１６－０３６９３１０号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

一例は、新規なＧｌｘＲ蛋白質変異体を提供する。前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から４５番目、６６番目、１６６番目、および１６８番目からなる群より選択された一つ以上および／またはこれに（前記選択された一つ以上の位置に）相応する位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチドであり得る。前記ポリペプチドは、代謝過程を調節する主な転写調節因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）の機能を有するものであり得る。

【0008】

他の例は、前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0009】

他の例は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

【0010】

他の例は、前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体、前記ポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、またはその組み合わせを含む微生物を提供する。

【0011】

他の例は、前記微生物を培地で培養する段階を含むスレオニンの生産方法を提供する。

【0012】

前記微生物は、コリネバクテリウム属微生物であり得る。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本出願で提供される一例は、ＧｌｘＲ蛋白質および／またはこれをコードするｇｌｘＲ遺伝子を改良してスレオニンの生産量が向上した（増加された）菌株を開発することと関連した技術を提供する。一例において、前記スレオニンは、Ｌ－スレオニンであり得る。

【0014】

前記目的を達成するための本出願の一態様は、ＧｌｘＲ蛋白質のアミノ酸配列でＮ－末端から４５番目、６６番目、１６６番目、および１６８番目からなる群より選択された一つ以上および／またはこれに（前記選択された一つ以上の位置に）相応する位置のアミノ酸残基が他の種類のアミノ酸残基に置換された、ＧｌｘＲ蛋白質変異体を提供するものであり得る。

【0015】

本明細書で、「ＧｌｘＲ（ＣＲＰ－ｌｉｋｅ ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｌｏｂａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ；例えば、Ｃｇ０３５０」は、炭素代謝だけでなく多様な細胞機能の調節に関与して多様な遺伝子を調節するグローバル調節因子（ｇｌｏｂａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）を意味し得、例えば、グリオキシル酸バイパス酵素であるイソクエン酸リアーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｌｙａｓｅ）および／またはリンゴ酸シンターゼ（ｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子（例えば、ａｃｅＡ（ｃｇ２５６０）およびａｃｅＢ（ｃｇ２５５９））の発現を調節するものであり得る。

【0016】

前記ＧｌｘＲ蛋白質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１のアミノ酸配列からなるものであり得、前記ＧｌｘＲ蛋白質をコードするｇｌｘＲ遺伝子は、配列番号２の核酸配列を含むかまたは配列番号２の核酸配列からなるものであり得る。配列番号１のアミノ酸配列と配列番号２の核酸配列は下記表１に記載した。

【0017】

前記ＧｌｘＲ蛋白質のアミノ酸配列およびＧｌｘＲ蛋白質をコードする遺伝子（例えば、ｇｌｘＲ）の塩基配列（核酸配列）は、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のような当業界に公知のデータベースから容易に得ることができ、例えばＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＷＰ＿００３８５５８１０．１であり得る。

【0018】

【表1】

【0019】

本出願で用語「相応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」は、ポリペプチドで列挙される位置のアミノ酸残基であるか、またはポリペプチドで列挙される残基と類似あるいは同一であるかまたは相同なアミノ酸残基を称する。相応する位置のアミノ酸を確認することは、特定の配列を参照する配列の特定のアミノ酸を決定することであり得る。本出願に使用された「相応領域」は、一般的に関連蛋白質またはレファレンス（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）蛋白質での類似または対応する位置を称する。

【0020】

例えば、任意のアミノ酸配列を配列番号１とアラインメントし（ａｌｉｇｎ）、これに基づいて前記アミノ酸配列の各アミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸残基と相応するアミノ酸残基の数字位置を参照してナンバリングすることができる。例えば、本出願に記載されたもののような配列アラインメントアルゴリズムは、クエリシーケンス（「参照配列」ともいう）と比較してアミノ酸の位置、または置換、挿入または欠失などの改変が発生する位置を確認することができる。

【0021】

このようなアラインメントには、例えば、ニードルマン－ブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３）、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅ）プログラム（ＥＭＢＯＳＳ： Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ， Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００）， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６： ２７６－２７７）などを利用することができるが、これに制限されずに当業界に知られた配列アラインメントプログラム、ペアワイズシーケンス（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）比較アルゴリズムなどを適切に使用することができる。

【0022】

本出願で、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが「特定の核酸配列（塩基配列）またはアミノ酸配列を含むまたは前記配列からなる」とは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが前記特定の核酸配列（塩基配列）またはアミノ酸配列を必須で含むことを意味し得、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの本来の機能および／または目的とする機能を維持する範囲で前記特定の核酸配列（塩基配列）またはアミノ酸配列に変異（欠失、置換、改変、および／または付加）が加えられた「実質的に同等な配列」を含むもの（または前記変異を排除しないもの）と解釈され得る。一例において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが「特定の核酸配列（塩基配列）またはアミノ酸配列を含むまたは前記配列からなる」とは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが（ｉ）前記特定の核酸配列（塩基配列）またはアミノ酸配列を必須で含むか、または（ｉｉ）前記特定の核酸配列（塩基配列）またはアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の相同性または同一性を有する核酸配列またはアミノ酸配列からなるかまたはこれを必須で含み、本来の機能および／または目的とする機能を維持することを意味し得る。一例において、前記目的とする機能は、微生物のＬ－スレオニン生産能を増加させたり付与する機能を意味し得る。

【0023】

本出願で、「相同性」は、二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド部分間の同一性のパーセントを意味する。一つの部分から他の一つの部分までの配列間の相同性は、知られている当該技術により決定され得る。例えば、相同性は、配列情報をアラインメントし、容易に入手可能なコンピュータプログラムを利用して二つのポリヌクレオチド分子または二つのポリペプチド分子間の配列情報、例えば点数（ｓｃｏｒｅ）、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、および類似度（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）などの媒介変数（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を直接アラインメントして決定され得る。前記コンピュータプログラムは、ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）、ＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＣＬＣ ｂｉｏ）、ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ）などであり得る。また、ポリヌクレオチド間の相同性は、相同領域間の安定した二本鎖をなす条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションした後、一本鎖特異的ヌクレアーゼで分解させ、分解された断片の大きさを確認することによって決定することができる。

【0024】

本出願で、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、二つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列の相互間の類似の程度を意味し、百分率で表示され得る。相同性および同一性の用語は、時々相互交換的に利用され得る。

【0025】

保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムにより決定され、使用されるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に利用され得る。実質的に、相同性を有するか（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は、一般的に配列全体または一部分と中間または高いストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）でハイブリッドすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドで一般のコドンまたはコドン縮重性を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることが自明である。

【0026】

任意の二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するか否かは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） ［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］：２４４４でのようなデフォルトパラメータを利用して「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定され得る。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ： Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ， Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６： ２７６－２７７）（バージョン５．０．０または以降のバージョン）で行われるような、ニードルマン－ブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（ Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３）を使用して決定され得る（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２： ３８７ （１９８４））， ＢＬＡＳＴＰ， ＢＬＡＳＴＮ， ＦＡＳＴＡ （Ａｔｓｃｈｕｌ， ［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ， Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］： ４０３ （１９９０）； Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ， Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ， ［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４，および［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／．］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８： １０７３を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを利用して相同性、類似性または同一性を決定することができる。

【0027】

ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ （１９８１） ２：４８２に開示されたとおり、例えば、 Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９７０）， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４８：４４３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを利用して配列情報を比較することによって決定され得る。要約すれば、ＧＡＰプログラムは、二つの配列のうち、より短いものにおける記号の全体数で、類似の配列された記号（つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割った値と定義することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは（１）二進法の比較マトリックス（同一性のために１、そして非同一性のために０の値を含有する）およびＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ．， Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ． ３５３－３５８ （１９７９）により開示されたとおり、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ６７４５の加重した比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティおよび各ギャップで各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開始ペナルティ１０、ギャップ拡張ペナルティ０．５）；および（３）末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。

【0028】

一態様は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から、４５番目、６６番目、１６６番目、および１６８番目からなる群より選択された一つ以上および／またはこれに（前記選択された一つ以上の位置に）相応する位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたＧｌｘＲ蛋白質変異体を提供することができる。前記「他のアミノ酸」とは、配列番号１の４５番目、６６番目、１６６番目、および１６８番目からなる群より選択された一つ以上および／またはこれに（前記選択された一つ以上の位置に）相応する位置に位置するアミノ酸を除いた他のアミノ酸を意味し得る。

【0029】

一例による変異体は、配列番号１で記載されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％または９９．９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列で配列番号１のアミノ酸配列の４５番目、６６番目、１６６番目、および１６８番目からなる群より選択された一つ以上および／またはこれに（前記選択された一つ以上の位置に）相応する位置のアミノ酸残基が他の種類のアミノ酸残基に置換されたポリペプチドを含むことができる。また、このような相同性または同一性を有し、ＧｌｘＲ蛋白質と同一であるか相応する活性を有する蛋白質であれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有する変異体も本出願の範囲内に含まれることは自明である。

【0030】

一例において、下記（１）乃至（４）からなる群より選択された変異を含む、ＧｌｘＲ（ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ ｂｙｐａｓｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）蛋白質変異体を提供することができる：

【0031】

（１）配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から４５番目のアミノ酸残基（例えば、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、グルタメート、ｇｌｕｔａｍａｔｅ））がアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、またはリジン（ｌｙｓｉｎｅ）に置換；

【0032】

（２）配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から６６番目のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ、アスパルテート、ａｓｐａｒｔａｔｅ））残基がアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、またはリジン（ｌｙｓｉｎｅ）に置換；

【0033】

（３）配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から１６６番目のアミノ酸残基（例えば、スレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ））がアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ、ａｓｐａｒｔａｔｅ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、またはリジン（ｌｙｓｉｎｅ）に置換；および

【0034】

（４）配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から１６８番目のアミノ酸残基（例えば、グルタミン酸）がアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、またはリジン（ｌｙｓｉｎｅ）に置換。

【0035】

また、本出願の変異体は、前記配列番号１のアミノ酸配列を基準として４５番目、６６番目、１６６番目、および１６８番目からなる群より選択された一つ以上および／またはこれに（前記選択された一つ以上の位置に）相応する位置のアミノ酸残基が他の種類のアミノ酸残基に置換され、前記配列番号３乃至１５のうちの選択されたアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％または９９．９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。また、このような相同性または同一性を有し、本出願の変異体に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有する変異体も本出願の範囲内に含まれることは自明である。

【0036】

例えば、前記アミノ酸配列のＮ－末端、Ｃ－末端そして／または内部に本出願の変異体の機能を変更しない配列追加または欠失、自然的に発生することができる突然変異、サイレント突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）または保存的置換を有する場合である。

【0037】

前記「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、一つのアミノ酸を類似する構造的および／または化学的性質を有するまた他のアミノ酸に置換させることを意味する。このようなアミノ酸置換は、一般的に残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）での類似性に基づいて発生することができる。通常、保存的置換は、蛋白質またはポリペプチドの活性にほとんど影響を与えないかまたは影響を付与されないことができる。

【0038】

本出願で用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」は、一つ以上のアミノ酸が保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）および／または改変（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されて前記変異体の変異前のアミノ酸配列と相違しているが機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）または特性（ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）が維持されるポリペプチドを称する。このような変異体は、一般的に前記ポリペプチドのアミノ酸配列のうち、一つ以上のアミノ酸を改変し、前記改変されたポリペプチドの特性を評価して同定（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）され得る。つまり、変異体の能力は、変異前のポリペプチドに比べて増加するか、変化しないか、または減少されることがある。また、一部の変異体は、Ｎ－末端リーダー配列または膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）のような一つ以上の部分が除去された変異体を含むことができる。他の変異体は、成熟蛋白質（ｍａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）のＮ－および／またはＣ－末端から一部分が除去された変異体を含むことができる。前記用語「変異体」とは、変異型、改変、変異型ポリペプチド、変異された蛋白質、変異および変異体などの用語（英語表現ではｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、ｍｕｔａｎｔ、ｍｕｔｅｉｎ、ｄｉｖｅｒｇｅｎｔなど）が互換して使用され得るが、変異された意味で使用される用語であればこれに制限されない。また、変異体は、ポリペプチドの特性と２次構造に最小限の影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含むことができる。例えば変異体のＮ－末端には翻訳と同時に（ｃｏ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）または翻訳後に（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）蛋白質の転座（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）に関与するシグナル（またはリーダー）配列がコンジュゲートされ得る。また前記変異体は、確認、精製、または合成することができるように他の配列またはリンカーとコンジュゲートされ得る。

【0039】

一例によれば、前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体は、配列番号３乃至配列番号１５からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むか、または前記アミノ酸配列からなるものであり得る。配列番号３乃至配列番号１５のアミノ酸配列は下記表２に記載した。

【0040】

【表2】

【0041】

一例によるＧｌｘＲ蛋白質変異体は、変異前のＧｌｘＲ蛋白質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなるＧｌｘＲ蛋白質）のように、グローバル転写調節因子（ｇｌｏｂａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）であり、例えば、グリオキシル酸バイパス遺伝子（ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ ｂｙｐａｓｓ ｇｅｎｅｓ；例えば、ａｃｅ Ａおよび／またはａｃｅ Ｂ）に対する調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）の機能を有するものであり得る。

【0042】

一例によるＧｌｘＲ蛋白質変異体は、変異前のＧｌｘＲ蛋白質（野生型蛋白質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなるＧｌｘＲ蛋白質））より活性が減衰したものであり得る。前記「ＧｌｘＲ蛋白質の活性が減衰した」ことは、細胞内でグローバル転写調節因子の活性程度が変異前の蛋白質に比べて減少したことを意味し得る。前記減衰は、ＧｌｘＲ蛋白質をコードする遺伝子の変異などにより蛋白質自自体の活性が本来の微生物（例えば、野生型、親菌株、宿主微生物、非改変型微生物など）が有している蛋白質の活性に比べて減少した場合と、ＧｌｘＲ蛋白質をコードする遺伝子の転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）阻害および／または翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）阻害などにより前記酵素の発現水準が低下して細胞内で全体的な酵素活性程度が低い場合、これらの組み合わせも含むことができる。

【0043】

本出願で、前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体は、変異型ＧｌｘＲ蛋白質、ＧｌｘＲ変異体、変異型ＧｌｘＲと同一の意味で使用され得る。

【0044】

他の態様は、ＧｌｘＲ蛋白質変異体をコードする、ポリヌクレオチドを提供することができる。

【0045】

本出願で、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位（ｍｏｎｏｍｅｒ）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）で一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖であり、より具体的には、前記変異体をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。

【0046】

前記ポリヌクレオチドは、一例によるＧｌｘＲ蛋白質変異体をコードするポリヌクレオチド配列であれば、制限なしに含まれ得る。一例によるポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から、４５番目、６６番目、１６６番目、および１６８番目からなる群より選択された一つ以上および／またはこれに（前記選択された一つ以上の位置に）相応する位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたＧｌｘＲ蛋白質変異体をコードする核酸配列を含むかまたは前記核酸配列からなることができ、例えば配列番号３乃至配列番号１５からなる群より選択されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むかまたは前記核酸配列からなることができる。

【0047】

前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮重性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）または一例による変異体を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、一例による変異体のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な改変が行われ得る。したがって、コドン縮重性（ｃｏｄｏｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により前記配列番号３乃至配列番号１５のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはこれと相同性（または同一性）を有するポリペプチドをコードすることができるポリヌクレオチドも含まれ得る。

【0048】

一例によるポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から製造され得るプローブ、例えば、一例によるポリヌクレオチド配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションできる配列であれば制限なしに含まれ得る。前記「ストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は文献（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９； Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ９．５０－９．５１， １１．７－１１．８参照）に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性が高いポリヌクレオチド同士で、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性または同一性を有するポリヌクレオチド同士でハイブリダイゼーションし、それより相同性または同一性が低いポリヌクレオチド同士でハイブリダイゼーションしない条件、または通常のサザンハイブリダイゼーション（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、具体的に６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、より具体的に６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度および温度で、１回、具体的に２回乃至３回洗浄する条件を列挙することができる。

【0049】

ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーにより塩基間のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が可能であっても、二つの核酸が相補的配列を有することを要求する。本出願で、「相補的」は、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述することに使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、一例によるポリヌクレオチドはまた、実質的に類似の核酸配列だけでなく全体配列に相補的な単離された核酸断片を含むことができる。

【0050】

具体的に、一例によるポリヌクレオチドと相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５０℃乃至６５℃（例えば、５５℃）のＴｍ値でハイブリダイゼーション段階を含むハイブリダイゼーション条件を用い、前述した条件を用いて探知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であり得るが、これに制限されるのではなく、その目的により当業者により適切に調節され得る。

【0051】

前記ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションする適切なストリンジェンシーは、ポリヌクレオチドの長さおよび相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野によく知られている（例えば、Ｊ ． Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９； Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ９．５０－９．５１， １１．７－１１．８参照）。

【0052】

また他の態様は、前記ポリヌクレオチドを含む、ベクターを提供することができる。前記ベクターは、前記ポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させるための発現ベクターであり得るが、これに制限されない。

【0053】

本出願で、「ベクター」は、適した宿主内で目的ポリペプチドを発現させることができるように適した発現調節領域（または発現調節配列）に作動可能に連結された前記目的ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ調製物を含むことができる。前記発現調節領域は、転写を開始することができるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする配列、および転写および解読の終結を調節する配列を含むことができる。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムと関係なく複製されたり機能することができ、ゲノムそれ自体に組み込まれ得る。

【0054】

本出願で使用されるベクターは、特に限定されず、当業界に知られた任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換えられた状態のプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、およびＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系およびｐＥＴ系などを使用することができる。具体的にはｐＤＺ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを使用することができる。

【0055】

一例において、細胞内染色体挿入用ベクターを通じて染色体内に蛋白質（例えば、ＧｌｘＲ蛋白質）をコードするポリヌクレオチドを変異されたポリヌクレオチドに交替させることができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に知られた任意の方法、例えば、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により行われ得るが、これに限定されない。前記染色体挿入の有無を確認するための選別マーカ（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含むことができる。選別マーカは、ベクターで形質転換された細胞を選別、つまり、目的ポリヌクレオチド分子の挿入の有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面変異型蛋白質の発現のような選択可能表現型を付与するマーカを使用することができる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境では選別マーカを発現する細胞だけ生存したり他の表現形質を示したりするため、形質転換された細胞を選別することができる。

【0056】

本出願で、「形質転換」は、標的ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞あるいは微生物内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコーディングするポリペプチドが発現することができるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現さえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なくこれら全てを含むことができる。また、前記ポリヌクレオチドは、目的ポリペプチド（例えば、前記ＧｌｘＲ変異体）をコーディングするＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現することができるものであれば、如何なる形態でも導入され得る。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自律的に発現するのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入され得る。前記発現カセットは、通常前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位および翻訳終結信号を含むことができる。前記発現カセットは、自律複製が可能な発現ベクター形態であり得る。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであり得るが、これに制限されない。前記形質転換させる方法は、遺伝子を細胞内に導入する方法であれば制限なしに含まれ、宿主細胞に応じて当該分野で公知されたとおり適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）沈澱、マイクロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、レトロウイルス感染（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポゾーム法、および／または酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などを使用することができるが、これに限られない。

【0057】

前記ベクターは、適した宿主内で目的蛋白質（例えば、前記ＧｌｘＲ変異体）を発現させることができるように適した調節配列に作動可能に連結された前記目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドの核酸配列を含有するＤＮＡ調製物であり得る。前記調節配列は、転写を開始することができるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および解読の終結を調節する配列を含むことができる。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムと関係なく複製されたり機能したりすることができ、ゲノムそれ自体に組み込まれ得る。

【0058】

本出願で、「作動可能に連結された」とは、本出願の目的変異体をコーディングするポリヌクレオチドの転写を開始および媒介するようにするプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。

【0059】

また他の態様は、前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体、前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体をコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含むベクターからなる群より選択された１種以上を含む、微生物（または、菌株、組換え細胞）を提供することができる。本出願で「微生物」は、単細胞バクテリアを含むものであり得る。

【0060】

本出願で、「菌株（または、微生物）」は、野生型微生物や自然的または人為的に遺伝的改変が起こった微生物を全て含み、外部遺伝子が挿入されたり内在的遺伝子の活性が強化されたり不活性化されるなどの原因により特定の機序が減衰または強化された微生物であって、目的とするポリペプチド、蛋白質または産物の生産のために遺伝的改変（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む微生物であり得る。

【0061】

前記微生物（または、菌株、組換え細胞）は、前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体、一例によるポリヌクレオチドおよび一例によるポリヌクレオチドを含むベクターのうちのいずれか一つ以上を含む菌株；前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体または一例によるポリヌクレオチドを発現するように改変された菌株；前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体、または一例によるポリヌクレオチドを発現する菌株（例えば、組換え菌注）；または前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体活性を有する菌株（例えば、組換え菌注）であり得るが、これに制限されない。

【0062】

一例において、前記微生物（または菌株、組換え細胞）は、スレオニン（例えば、Ｌ－スレオニン）生産能を有するものであり得る。前記微生物（または菌株、組換え細胞）は、非改変微生物、組換え前の細胞、親菌株、および／または野生型菌株よりスレオニン生産能が向上するか、またはスレオニン生産能がない非改変微生物、組換え前の細胞、親菌株および／または野生型菌株とは異なり、スレオニン生産能が付与されたものであり得る。

【0063】

本出願で、「スレオニン（例えば、Ｌ－スレオニン）生産能を有する」とは、自然的にスレオニン生産能を有する細胞および／または微生物、またはスレオニン生産能がない親菌株にスレオニン生産能が付与された微生物を意味する。一例によるＧｌｘＲ蛋白質変異体が導入されることによって前記微生物がＬ－スレオニン生産能を有する場合、および／またはＬ－スレオニン生産能を有していない微生物に前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体が導入されることによって前記微生物がＬ－スレオニン生産能を有するようになる場合を意味するために使用され得る。例えば、Ｌ－スレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物とは、天然型微生物自体またはスレオニン生産機序と関連した外部遺伝子が挿入されたり内在的遺伝子の活性を強化させたり減衰または不活性させて向上したＬ－スレオニン生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物を意味し得る。

【0064】

一例によるＧｌｘＲ蛋白質変異が導入された微生物は、同種の非改変微生物と比較して、スレオニン（例えば、Ｌ－スレオニン）生産が増加したものであり得る。

【0065】

本出願で、「非改変微生物」は、微生物に自然的に発生し得る突然変異を含む菌株を除くのではなく、野生型菌株または天然型菌株自体であるか、自然的または人為的要因による遺伝的変異で形質が変化する前の菌株を意味し得る。例えば、前記非改変微生物は、一例によるＧｌｘＲ変異体が導入されないかまたは導入される前の菌株を意味し得る。前記「非改変微生物」は、「改変前菌株」、「改変前微生物」、「非変異菌株」、「非改変菌株」、「非変異微生物」または「基準微生物」と互換して使用され得る。前記でＧｌｘＲ蛋白質変異が微生物に導入されるとのことは、前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体、前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体をコードするポリヌクレオチド、および／または前記ポリヌクレオチドを含むベクターを微生物に導入することを意味し得る。一例において前記スレオニン生産能の増加の有無を比較する対象菌株である、蛋白質非改変微生物は、ＡＴＣＣ１３０３２菌株、ＫＣＣＭ１２０００Ｐ菌株、および／またはＫＣＣＭ１２１２０Ｐ菌株であり得るが、これに制限されない。

【0066】

一例として、前記生産能が増加された組換え菌株は、変異前親菌株または非改変微生物に比べて、スレオニン生産能が約１％以上、約２．５％以上、約５％以上、約６％以上、約７％以上、約８％以上、約９％以上、約１０％以上、約１０．５％以上、約１１％以上、約１１．５％以上、約１２％以上、約１２．５％以上、約１３％以上、約１３．５％以上、約１４％以上、約１４．５％以上、約１５％以上、約１５．５％以上、約１６％以上、約１６．５％以上、約１７％以上、約１７．５％以上、約１８％以上、約１８．５％以上、約１９％以上、約１９．５％以上、約２０％以上、約２０．５％以上、約２１％以上、約２１．５％以上、約２２％以上、約２２．５％以上、約２３％以上、約２３．５％以上、約２４％以上、約２４．５％以上、約２５、約２５．５％以上、約２６％以上、約２６．５％以上、約２７％以上（上限値は特別な制限はなく、例えば、約２００％以下、約１５０％以下、約１００％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、または約３５％以下であり得る）増加したものであり得る。他の例で、前記生産能が増加された組換え菌株は、変異前親菌株または非改変微生物に比べて、スレオニン生産能が約１．１倍以上約１．１２倍以上、約１．１３倍以上、１．１５倍以上、１．１６倍以上、１．１７倍以上、１．１８倍以上、１．１９倍以上、約１．２倍以上、約１．２５倍以上、約１．２６倍以上、または約１．３倍以上（上限値は特別な制限はなく、例えば、約１０倍以下、約５倍以下、約３倍以下、または約２倍以下であり得る）増加したものであり得る。前記用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などを全て含む範囲で、約という用語の後に出る数値と同等または類似の範囲の数値を全て含むが、これに制限されない。

【0067】

前記ポリヌクレオチドの宿主細胞ゲノム（染色体）内の挿入または宿主細胞内在遺伝子（例えば、ｇｌｘＲ遺伝子）がＧｌｘＲ蛋白質変異体をコードするようにする変異導入は、公知の方法を当業者が適切に選択して行うことができ、例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼシステム（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ；例えば、（ａ）ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９蛋白質など）、そのコード遺伝子、または前記遺伝子を含むベクター；および（ｂ）ガイドＲＮＡ（例、ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）など）、そのコードＤＮＡ、または前記ＤＮＡを含むベクターを含む混合物（例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼ蛋白質とガイドＲＮＡの混合物など）、複合体（例えば、リボ核酸融合蛋白質（ＲＮＰ）、組換えベクター（例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼコード遺伝子およびガイドＲＮＡコードＤＮＡを共に含むベクターなど）などからなる群で選択された一つ以上）を使用して行われ得るが、これに制限されるのではない。一例による微生物でポリヌクレオチドの一部または全体の改変（例えば、前述した蛋白質変異体をコーディングするための改変）は、（ａ）微生物内染色体挿入用ベクターを利用した相同組換えまたは遺伝子はさみ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ｅ．ｇ．， ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）を利用したゲノム編集および／または（ｂ）紫外線および放射線などのような光および／または化学物質処理により誘導され得るが、これに制限されない。前記遺伝子の一部または全体の改変方法にはＤＮＡ組換え技術による方法が含まれ得る。例えば、目的遺伝子と相同性があるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはベクターを前記微生物に注入して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が起こるようにすることによって遺伝子の一部または全体の欠損が行われ得る。前記注入されるヌクレオチド配列またはベクターは、優性選別マーカを含むことができるが、これに制限されるのではない。

【0068】

前記微生物（または菌株、組換え細胞）は、追加的にスレオニン生産が増加するようにする変異を含むことができ、前記変異の位置および／または変異対象になる遺伝子および／または蛋白質の種類は、スレオニン生産が増加するようにするものであれば制限なしに含まれ得る。前記組換え細胞は、形質転換が可能な細胞であれば制限なしに使用可能になり得る。

【0069】

前記ＧｌｘＲ蛋白質変異が導入されてスレオニン生産能が増加したりスレオニン生産能が付与されたりした微生物と区別するためにＧｌｘＲ蛋白質変異が導入される前の微生物を、前記ＧｌｘＲ蛋白質変異が導入される前の微生物を宿主微生物（または親菌株、非改変微生物）で表現することができる。

【0070】

一例において、前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、および／または前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む微生物は、
（ｉ）ゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）に加えて、前記ポリヌクレオチドおよび／または前記組換えベクターをさらに含むか、および／または
（ｉｉ）内在のＧｌｘＲ蛋白質コード遺伝子（例えば、ｇｌｘＲ遺伝子）として、前記ポリヌクレオチドを含むことを意味し得る。

【0071】

前記（ｉｉ）「内在のＧｌｘＲ蛋白質コード遺伝子（例えば、ｇｌｘＲ遺伝子）として、前記ポリヌクレオチドを含む」とのことは、（ａ）前記ポリヌクレオチドが内在のＧｌｘＲ蛋白質コード遺伝子（例えば、ｇｌｘＲ遺伝子）を代替して含まれる（挿入される）か、および／または（ｂ）内在のＧｌｘＲ蛋白質コード遺伝子（例えば、ｇｌｘＲ遺伝子）が遺伝子編集（ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）技術により前記ポリヌクレオチドの核酸配列（つまり、ＧｌｘＲ蛋白質変異体をコードする核酸配列）を有するように変移されることを意味するものであり得る。

【0072】

一例において、前記ＧｌｘＲ蛋白質またはこれをコードする遺伝子は、宿主微生物由来（内在）のものまたはこれと異なる微生物由来（外来）のものであり得る。

【0073】

一例において、前記微生物（または菌株、組換え細胞）は、一例によるポリヌクレオチドが染色体内に組み込まれたものであり得、例えば、一例によるポリヌクレオチドは、染色体内の遺伝子部位で天然（ｎａｔｉｖｅ）ｇｌｘＲ遺伝子に対して交換されたり追加の遺伝子部位に組み込まれたものであり得る。

【0074】

前記微生物は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）微生物であり得る。

【0075】

前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウムアンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウムアセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウムアセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウムアルカノリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、コリネバクテリウムカルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウムリリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ）、コリネバクテリウムメラセコーラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）、コリネバクテリウムサーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウムエフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウムヘルクリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ）、コリネバクテリウムクルディラクティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウムデセルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウムスタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、コリネバクテリウムシングルラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウムハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウムストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウムアンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウムポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウムイミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウムテスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）、および／またはコリネバクテリウムフラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）などであり得る。

【0076】

前記微生物（または菌株、組換え細胞）は、形質転換を通じて人工的に製造されたり、または自然的に発生するものを全て含むことができる。例えば、前記微生物（または菌株、組換え細胞）は、一例によるＧｌｘＲ蛋白質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに形質転換されたものであり得る。

【0077】

前記微生物（または菌株、組換え細胞）は、一具体例によるポリヌクレオチド配列が染色体内に組み込まれたものであり得る。相同組換えは、一例によるベクターの使用と共に、ベクターにより細胞内に伝達される一例によるポリヌクレオチドに対する染色体上のＤＮＡセグメントの交換を許容する。ベクターの環状ＤＮＡ分子および染色体上の標的ＤＮＡの間の効率的な組換えのために、一例によるポリヌクレオチドを含有する交換されるＤＮＡ領域には端部に標的部位に相同性であるヌクレオチド配列が提供され；これらはベクターの組み込みおよびＤＮＡの交換部位を決定する。例えば、一例によるポリヌクレオチドは、染色体内で天然遺伝子部位で天然ｇｌｘＲ遺伝子に対して交換され得るか、追加の遺伝子部位に組み込まれ得る。

【0078】

他の態様は、前記微生物（または菌株、組換え細胞）を培地で培養する段階を含む、スレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）の生産方法を提供することができる。前記スレオニンは、Ｌ－スレオニンであり得る。前記微生物（または菌株、組換え細胞）については前述したとおりである。

【0079】

本出願で、「培養」は、前記微生物（または菌株、組換え細胞）を適当に調節された環境条件で成長させることを意味する。前記培養は、当業界に知られた適切な培地と培養条件により行われ得、適切な方式で特定の菌株の要件を満たさなければならず、通常の技術者により適切に改変され得る。前記培養方法は例えば、回分式培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加式培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、またはこれらの組み合わせの培養を含むことができるが、これに限定されるのではない。

【0080】

本出願で、「培地」は、本出願のコリネバクテリウムグルタミカム菌株を培養するために必要とする栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存および発達に不可欠な水を始めとして栄養物質および成長因子などを供給する。具体的に、一例による微生物の培養に使用される培地およびその他培養条件は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば特別な制限なしにいずれも使用することができるが、一例による微生物を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸および／またはビタミンなどを含有する通常の培地内で、好気的条件下で温度、ｐＨなどを調節しながら培養することができる。

【0081】

一例において、微生物（または菌株、組換え細胞）を培養するための培地は、文献［“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ” ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ＵＳＡ， １９８１）］を参照することができるが、これに限定されるのではない。

【0082】

前記炭素源としては、ブドウ糖、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどのような炭水化物；マンニトル、ソルビトールなどのような糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などのような有機酸；グルタミン酸、メチオニン、リジンなどのようなアミノ酸などが含まれ得る。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米ぬか、キャッサバ、サトウキビ残渣やとうもろこし浸漬液のような天然の有機栄養源を使用することができ、具体的にはブドウ糖および殺菌された前処理糖蜜（つまり、還元糖に転換された糖蜜）などのような炭水化物を使用することができ、その他の適正量の炭素源を制限なしに多様に利用することができる。これら炭素源は、単独で使用したり２種以上を組合わせて使用したりすることができ、これに限定されるのではない。

【0083】

前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのような無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのようなアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆粕またはその分解生成物などのような有機窒素源を使用することができる。これら窒素源は、単独で使用したり２種以上を組合わせて使用したりすることができ、これに限定されるのではない。

【0084】

前記リン源としては、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、またはこれに対応するナトリウム含有塩などが含まれ得る。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを使用することができ、それ以外にアミノ酸、ビタミンおよび／または適切な前駆体などが含まれ得る。これら構成成分または前駆体は、培地に回分式または連続式で添加され得る。しかし、これに限定されるのではない。

【0085】

また、培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有することができ、これに限定されるのではない。それ以外に、アミノ酸およびビタミンのような必須成長物質が含まれ得る。また培地に適切な前駆体を使用することができる。前記培地または個別成分は培養過程で培養液に適切な方式により回分式でまたは連続式で添加され得るが、これに限定されるのではない。

【0086】

一例によれば、前記培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などのような化合物を培地に適切な方式で添加して、培地のｐＨを調整することができる。また、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡生成を抑制することができる。また、培地の好気状態を維持するために、培地内に酸素または酸素含有気体を注入したり嫌気および微好気状態を維持するために気体の注入なしにあるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入したりすることができ、これに限定されるのではない。

【0087】

一例によれば、前記培養温度は、２０℃乃至４５℃、２５℃乃至４０℃、または３０℃乃至３７℃を維持することができる。培養期間は、有用物質（例えば、Ｌ－スレオニン）が所望する生産量で得られる時まで続くことができ、例えば、１０乃至１６０時間であり得る。

【0088】

一例によるスレオニン生産方法は、一例による微生物（または菌株、組換え細胞）を準備する段階、前記微生物を培養するための培地を準備する段階、またはこれらの組み合わせ（順序に関係なし、ｉｎ ａｎｙ ｏｒｄｅｒ）を、例えば、前記培養する段階以前に、さらに含むことができる。

【0089】

一例によるスレオニン生産方法は、培養された培地（培養培地）および／または微生物（または菌株、組換え細胞）からスレオニンを分離および／または回収する段階をさらに含むことができる。前記分離および／または回収する段階は、前記培養する段階以降にさらに含まれ得る。前記培養培地は、微生物（または菌株、組換え細胞）を培養した培地を意味し得る。

【0090】

前記スレオニンを分離および／または回収する段階は、培養方法（例えば回分式、連続式または流加式培養方法など）により当該分野に公知の適した方法を利用して培地、培養液、または微生物から目的とするアミノ酸（例えば、Ｌ－スレオニン）を収集（ｃｏｌｌｅｃｔ）することであり得る。例えば、遠心分離、ろ過、結晶化蛋白質沈澱剤による処理（塩析法）、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈澱、結晶化、超音波破砕、限外ろ過、透析法、電気泳動、分別溶解（例えば硫酸アンモニウム沈澱）、ＨＰＬＣ、および／またはクロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、疎水性、液体、および大きさ排除）などの方法を使用することができるが、これに制限されない。

【0091】

一例によるスレオニンの生産方法は、さらに精製段階を含むことができる。前記精製は、当該技術分野に公知の適した方法を利用して行うことができる。一例において、前記スレオニン生産方法が分離および／または回収段階と精製段階を全て含む場合、スレオニンを精製する段階を前記分離および／または回収する段階以前または以降にさらに含むか、前記分離および／または回収段階と精製段階は順序に関係なく異時的（または連続的）に行われるか、同時にまたは一つの段階で統合されて行われ得るが、これに制限されるのではない。

【0092】

他の態様は、前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体、前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、および前記ポリヌクレオチドまたはベクターを含む微生物（または菌株、組換え細胞）からなる群より選択された１種以上を含む、スレオニン（例えば、Ｌ－スレオニン）生産用組成物を提供することができる。前記変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物、培地、およびスレオニンなどは、前述したとおりである。

【0093】

一例において、前記生産用組成物は、アミノ酸生産用組成物に通常使用される任意の適した賦形剤をさらに含むことができ、このような賦形剤は、例えば保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤または等張化剤などであり得るが、これに限定されるのではない。

【0094】

他の態様は、前記ＧｌｘＲ蛋白質変異体、これをコードするポリヌクレオチド、および／または前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを微生物に導入（例えば、形質転換）させる段階を含む、前記微生物のスレオニン（例えば、Ｌ－スレオニン）生産能増加方法または前記微生物にスレオニン（例えば、Ｌ－スレオニン）生産能を付与する方法を提供することができる。

【発明の効果】

【0095】

一例によるＧｌｘＲ蛋白質変異体は、微生物に導入されて、副産物の生産量を減少させ、スレオニン生産能を顕著に増加させることができる。

【発明を実施するための形態】

【0096】

以下、本出願を実施例および実験例を通じてより詳細に説明する。しかし、これら実施例および実験例は、本出願を例として説明するためのものであり、本出願の範囲がこれら実施例および実験例に限定されるのではない。

【0097】

実施例１：ｇｌｘＲ遺伝子ＯＲＦ内変異導入用ベクターライブラリーの作製
コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のＧｌｘＲ蛋白質（配列番号１）の発現量またはその活性が変化された変異体を発掘するために以下の方法でベクターライブラリーを作製した。

【0098】

まず、ＷＴ菌株（ＡＴＣＣ１３０３２）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてｇｌｘＲ遺伝子の塩基配列（配列番号２）で１３３乃至１３５番目、１９６乃至１９８番目、４９６乃至４９８番目、５０２乃至５０４番目位置で前後にそれぞれ約１０００ｂｐ離れた位置に５’断片および３’断片に制限酵素ＳｍａＩ認識部位を挿入したプライマー配列番号１６および配列番号１７を合成した。

【0099】

具体的に、ｇｌｘＲ遺伝子の５’および３’末端に位置したＤＮＡ断片（各１０００ｂｐ）がｐＤＺベクター（大韓民国公開特許第１０－２００８－００２５３５５号）に連結された形態に作製された。ＷＴ菌株の染色体を鋳型として５’末端遺伝子断片はプライマー配列番号１６および１８を利用、３’末端遺伝子断片はプライマー配列番号１７および１９を利用してＰＣＲを通じて作製された。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分間重合を２４回繰り返した後、７２℃で１０分間重合反応を行った。増幅されたＤＮＡ断片をＱｕｉａｇｅｎ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して精製した後、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として使用した。

【0100】

一方、制限酵素ＳｍａＩで処理した後、６５℃で６０分間熱処理したｐＤＺベクターと前記ＰＣＲを通じて増幅した挿入ＤＮＡ断片をＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。前記菌株をカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれているＬＢ固体培地に塗抹した。プライマー配列番号２０および２１を利用したＰＣＲを通じて目的とした遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、公知のプラスミド抽出法を利用してプラスミドを獲得した。前記プラスミドはｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｅ４５Ａ）と命名した。

【0101】

同様な方法でプライマー配列番号１６および２８、１７および２９を利用してｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｄ６６Ａ）、プライマー配列番号１６および３４、１７および３５を利用してｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｔ１６６Ｄ）、プライマー配列番号１６および４０、１７および４１を利用してｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｅ１６８Ａ）を作製した。

【0102】

本実施例で用いたプライマーの核酸配列は下記表３に記載した。

【0103】

【表3】

【0104】

前記のように配列番号１の４５番目、６６番目、１６６番目、１６８番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型ポリペプチドを含む総４種のベクターｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｅ４５Ａ）、ｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｄ６６Ａ）、ｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｔ１６６Ｄ）、ｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｅ１６８Ａ）を作製し、このベクターはそれぞれＧｌｘＲ蛋白質の４５番目のアミノ酸グルタメート（グルタミン酸、Ｅ）をアラニン（Ａ）に、６６番目のアミノ酸アスパルテート（アスパラギン酸、Ｄ）をアラニン（Ａ）に、１６６番目のアミノ酸スレオニン（Ｔ）をアスパルテート（Ｄ）に、１６８番目のアミノ酸グルタメート（Ｅ）をアラニン（Ａ）に置換することができるベクターである。

【0105】

実施例２：野生型コリネバクテリウム属微生物基盤のｇｌｘＲ変異株のＬ－スレオニン生産能の評価
本実施例で、野生種コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２を基盤として、ＡＴＣＣ１３０３２菌株が内在的に有する野生型ＧｌｘＲ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号１）で４５番目のアミノ酸であるグルタメートをアラニンに、６６番目のアミノ酸であるアスパルテートをアラニンに、１６６番目のアミノ酸であるスレオニンをアスパルテートに、１６８番目のアミノ酸であるグルタメートをアラニンにそれぞれ置換されたｇｌｘＲ変異株のＬ－スレオニン生産能を評価してみようとした。

【0106】

実施例１で作製したｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｅ４５Ａ）、ｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｄ６６Ａ）、ｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｔ１６６Ｄ）、ｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｅ１６８Ａ）ベクターを前記ＡＴＣＣ１３０３２菌株に電気パルス法で形質転換した。このようにｇｌｘＲ遺伝子に異種性塩基置換変異が導入された菌株をそれぞれＡＴＣＣ１３０３２ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ（Ｅ４５Ａ）、ＡＴＣＣ１３０３２ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ（Ｄ６６Ａ）、ＡＴＣＣ１３０３２ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ（Ｔ１６６Ｄ）、ＡＴＣＣ１３０３２ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ（Ｅ１６８Ａ）と命名した。ＡＴＣＣ１３０３２菌株を対照群として使用して作製された菌株４種［ＡＴＣＣ１３０３２ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ（Ｅ４５Ａ）、ＡＴＣＣ１３０３２ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ（Ｄ６６Ａ）、ＡＴＣＣ１３０３２ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ（Ｔ１６６Ｄ）、ＡＴＣＣ１３０３２ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ（Ｅ１６８Ａ）］を以下のような方法で培養して糖消耗速度、スレオニンおよびリジン生産収率を測定した。

【0107】

まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種して３２℃で２４時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。前記種培地と生産培地の組成はそれぞれ下記表４に記載した。培養終了後、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ２４７８）利用してＬ－リジンとＬ－スレオニンの濃度を測定し、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＹＳＩ２９００）を利用して培地内に残っている糖量（残糖量）を分析して糖消耗速度を測定し、その結果は表５に示した。

【0108】

【表4】

【0109】

【表5】

【0110】

表５に示されているように、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株に比べて、ＧｌｘＲ蛋白質の４５番目、６６番目、１６６番目、および１６８番目のアミノ酸がそれぞれ置換された時、生産されたＬ－スレオニンの濃度は増加し、副産物であるＬ－リジンの濃度は減少した。

【0111】

また、表５に示されているように、ＧｌｘＲ蛋白質の４５番目または６６番目のアミノ酸がアラニンに置換された時、糖消耗速度も改善されることを確認することができた。したがって、親菌株より４５番目または６６番目のアミノ酸がアラニンに置換された変異体（Ｅ４５ＡまたはＤ６６Ａ）が導入された菌株は糖消耗速度が速くなるため、同量のＬ－スレオニンを生産するにかかる時間が短縮し、Ｌ－スレオニン生産能が改善された。

【0112】

実施例３：ｇｌｘＲ遺伝子の４５、６６、１６６、１６８番目のアミノ酸が他の性質のアミノ酸に置換されたベクターライブラリーの作製
前記実施例２でＧｌｘＲ蛋白質の４５、６６、１６６、および１６８番目のアミノ酸をそれぞれ他のアミノ酸に置換した時、糖消耗速度およびＬ－スレオニンの生性能が向上することを確認した。ＧｌｘＲ蛋白質（配列番号１）の４５、６６、１６６、および１６８番目のアミノ酸をまた他の性質のアミノ酸に置換した時の効果を追加的に確認するために野生型のアミノ酸を前記変異を含むアミノ酸に置換を試みた。実施例２で確認した変異であるＥ４５Ａ、Ｄ６６Ａ、Ｔ１６６Ｄ、Ｅ１６８Ａを含む総１３種の異種性塩基置換変異を導入するために実施例１と同様な方法でそれぞれの組換えベクターを作製した。

【0113】

プライマー配列番号１６および２２、１７および２３を利用してｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｅ４５Ｓ）、プライマー配列番号１６および２４、１７および２５を利用してｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｅ４５Ｆ）、プライマー配列番号１６および２６、１７および２７を利用してｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｅ４５Ｋ）、プライマー配列番号１６および３０、１７および３１を利用してｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｄ６６Ｆ）、プライマー配列番号１６および３２、１７および３３を利用してｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｄ６６Ｋ）、プライマー配列番号１６および３６、１７および３７を利用してｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｔ１６６Ｆ）、プライマー配列番号１６および３８、１７および３９を利用してｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｔ１６６Ｋ）、プライマー配列番号１６および４２、１７および４３を利用してｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｅ１６８Ｆ）、プライマー配列番号１６および４４、１７および４５を利用してｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｅ１６８Ｋ）をそれぞれ作製した。本実施例で使用したプライマーの核酸配列は前記表３に記載した。

【0114】

実施例４：野生型コリネバクテリウム属微生物基盤のｇｌｘＲ遺伝子の４５、６６、１６６、１６８番目のアミノ酸変異株に対するＬ－スレオニン生産能の分析
前記実施例３で作製されたベクターライブラリーをＡＴＣＣ１３０３２菌株に電気パルス法で形質転換した。このようにｇｌｘＲ遺伝子に異種性塩基置換変異が導入された菌株をＡＴＣＣ１３０３２ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ＊（Ｅ４５Ｓ）、ＡＴＣＣ１３０３２ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ＊（Ｅ４５Ｆ）、ＡＴＣＣ１３０３２ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ＊（Ｅ４５Ｋ）、ＡＴＣＣ１３０３２ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ＊（Ｄ６６Ｆ）、ＡＴＣＣ１３０３２ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ＊（Ｄ６６Ｋ）、ＡＴＣＣ１３０３２ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ＊（Ｔ１６６Ｆ）、ＡＴＣＣ１３０３２ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ＊（Ｔ１６６Ｋ）、ＡＴＣＣ１３０３２ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ＊（Ｅ１６８Ｆ）、ＡＴＣＣ１３０３２ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ＊（Ｅ１６８Ｋ）と命名した。

【0115】

ＡＴＣＣ１３０３２菌株を対照群として使用して実施例２のような方法で培養してＬ－スレオニンとＬ－リジン生産能、および糖消耗速度を測定し、その結果を表６に記載した。

【0116】

【表6】

【0117】

実験結果、ＧｌｘＲ蛋白質（配列番号１）で４５番目のアミノ酸であるグルタミン酸がアラニン、セリン、フェニルアラニン、またはリジンに置換された場合、菌株にＬ－スレオニン（Ｔｈｒ）生産能が付与され、糖消耗速度も改善され、リジンのような副産物の生産は減少した。また、ＧｌｘＲ蛋白質（配列番号１）で６６番目のアミノ酸であるアスパルテートがアラニン、フェニルアラニン、またはリジンに置換された場合、菌株にＬ－スレオニン生産能が付与され、リジンのような副産物の生産は減少した。また、ＧｌｘＲ蛋白質（配列番号１）で１６６番目のアミノ酸であるスレオニンがアスパルテート、フェニルアラニン、またはリジンに置換された場合、菌株にＬ－スレオニン生産能が付与され、リジンのような副産物の生産は減少した。またＧｌｘＲ蛋白質（配列番号１）で１６８番目のアミノ酸であるグルタミン酸がアラニン、フェニルアラニン、またはリジンに置換された場合、菌株にＬ－スレオニン生産能が付与され、Ｌ－リジンのような副産物の生産は減少した。

【0118】

実施例５：スレオニン生産株基盤のｇｌｘＲ変異株に対するＬ－スレオニン生産能および成長速度の分析
本実施例でｇｌｘＲ変異導入によるスレオニン濃度および成長速度をより明確に調べるために実施例１で作製されたベクター４種をＬ－スレオニン生産菌株に導入してＬ－スレオニンの生産能を評価しようとした。Ｌ－スレオニン生産菌株を作製するために野生種コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２からスレオニン生合成経路で第１の重要な酵素として作用するＬｙｓＣ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）のフィードバック阻害（ｆｅｅｄｂａｃｋ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）解消のために野生型ＬｙｓＣ蛋白質をコードする遺伝子の１１２８～１１３１番目の塩基配列を既存のＴＴＧからＡＡＧに変え、野生型ＬｙｓＣ蛋白質のＮ末端から３７７番目のアミノ酸であるロイシンがリジンに置換された形態の変異体ＬｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）変異が導入された菌株を作製した。ＬｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）のアミノ酸配列は配列番号４６として下記表７に記載した。

【0119】

変異導入のための組換えベクターは、以下のような方法で作製された。ＬｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）変異が導入された菌株を作製するためにＡＴＣＣ１３０３２菌株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてｌｙｓＣ遺伝子の１１２８～１１３１番目位置で前後にそれぞれ約５００ｂｐ離れた位置に５’断片および３’断片に制限酵素ＳｍａＩ認識部位を挿入したプライマー配列番号４７および４８を合成した。ＬｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）異種性塩基置換変異を導入するためにｌｙｓＣ遺伝子の１１２８～１１３１番目の塩基配列を置換するためのプライマー配列番号４９および５０を合成した。

【0120】

具体的に、ｐＤＺ－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）プラスミドは、ｌｙｓＣ遺伝子の５’および３’末端に位置したＤＮＡ断片が（各５１５、５３８ｂｐ）ｐＤＺベクターに連結された形態に作製された。ＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体を鋳型として５’末端遺伝子断片は、プライマー配列番号４７および４９を利用してＰＣＲを通じて作製した。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間変性後、９４℃で１分間変性、５６℃で１分間アニーリング、７２℃で４０秒間重合を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間重合反応を行った。同様な方法でｌｙｓＣ遺伝子の３’末端に位置した遺伝子断片は、配列番号４８および５０を利用してＰＣＲを通じて作製した。増幅されたＤＮＡ断片をＱｕｉａｇｅｎ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して精製した後、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として使用した。

【0121】

一方、制限酵素ＳｍａＩで処理した後、６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクターと前記ＰＣＲを通じて増幅した挿入ＤＮＡ断片をＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。前記菌株をカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれているＬＢ固体培地に塗抹した。プライマー配列番号４７および４８を利用したＰＣＲを通じて目的とした遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、公知のプラスミド抽出法を利用してプラスミドを獲得した。前記プラスミドは、ｐＤＺ－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）と命名した。本実施例で使用したプライマーの核酸配列は下記表７に記載した。

【0122】

【表7】

【0123】

前記で作製されたｐＤＺ－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）をコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株に電気パルス法で形質転換した。このようにｌｙｓＣ遺伝子に異種性塩基置換変異が導入された菌株をＣＪＰ１と命名した。前記ＣＪＰ１は、ＣＡ０１－２３０７と命名されて、２０１７年３月２９日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託して受託番号ＫＣＣＭ１２０００Ｐが付与された。

【0124】

前記作製されたＫＣＣＭ１２０００Ｐ菌株にＬ－スレオニン、Ｌ－イソロイシン生合成経路の共通的中間体であるホモセリン（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ）を生産するホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；Ｈｏｍ）をコードする遺伝子に変異を導入した。具体的に、野生型ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の１２１８～１２２１番目の塩基配列を既存のＴＴＧからＡＡＧに置換して、野生型ホモセリンデヒドロゲナーゼのＮ末端から４０７番目のアミノ酸であるアルギニンがヒスチジンに置換された形態の変異体Ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）変異が導入された菌株を作製した。Ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）のアミノ酸配列は、配列番号５１として下記表８に記載した。変異導入のための組換えベクターは、以下のような方法で作製された。

【0125】

まず、ＡＴＣＣ１３０３２菌株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてｈｏｍ遺伝子の１２１９～１２２１番目位置で前後にそれぞれ約６００ｂｐ離れた位置に５’断片および３’断片に制限酵素ＳａｌＩ認識部位を挿入したプライマー配列番号５２および５３を合成した。Ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）異種性塩基置換変異を導入するためにｈｏｍ遺伝子の１２１９～１２２１番目の塩基配列を置換するためのプライマー配列番号５４および５５を合成した。

【0126】

具体的に、ｐＤＺ－ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）プラスミドは、ｈｏｍ遺伝子の５’および３’末端に位置したＤＮＡ断片が（各６００ｂｐ）ｐＤＺベクターに連結された形態に作製された。ＷＴ菌株の染色体を鋳型として５’末端遺伝子断片は、プライマー配列番号５２および５４を利用してＰＣＲを通じて作製した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間変性後、９４℃で１分間変性、５６℃で１分間アニーリング、７２℃で４０秒間重合を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間重合反応を行った。同様な方法でｈｏｍ遺伝子の３’末端に位置した遺伝子断片は、配列番号５３および５５を利用してＰＣＲを通じて作製した。増幅されたＤＮＡ断片をＱｕｉａｇｅｎ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して精製した後、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として使用した。

【0127】

一方、制限酵素ＳａｌＩで処理した後、６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクターと前記ＰＣＲを通じて増幅した挿入ＤＮＡ断片をＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。前記菌株をカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれているＬＢ固体培地に塗抹した。プライマー配列番号５２および５３を利用したＰＣＲを通じて目的とした遺伝子が挿入されたベクターに形質転換されたコロニーを選別した後、公知のプラスミド抽出法を利用してプラスミドを獲得した。前記プラスミドは、ｐＤＺ－ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）と命名した。本実施例で用いたプライマーの核酸配列は下記表８に記載した。

【0128】

【表8】

【0129】

前記で作製されたｐＤＺ－ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）をＫＣＣＭ１２０００Ｐに電気パルス法で形質転換した。このようにｈｏｍ遺伝子に異種性塩基置換変異が導入された菌株をＫＣＣＭ１２０００Ｐ－Ｒ３９８Ｑと命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に国際寄託してＫＣＣＭ１２１２０Ｐで寄託番号（大韓民国登録特許第１０－１９４７９５９号）が付与された。
実施例１で作製したｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｅ４５Ａ）、ｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｄ６６Ａ）、ｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｔ１６６Ｄ）、ｐＤＺ－ｇｌｘＲ（Ｅ１６８Ａ）ベクターをそれぞれ前記ＫＣＣＭ１２１２０Ｐ菌株に電気パルス法で形質転換した。このようにｇｌｘＲ遺伝子に塩基置換変異が導入された菌株を作製し、ＫＣＣＭ１２１２０Ｐ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ＊（Ｅ４５Ａ）はＣＡ０９－２３７３と、ＫＣＣＭ１２１２０Ｐ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ＊（Ｄ６６Ａ）はＣＡ０９－２３７４と、ＫＣＣＭ１２１２０Ｐ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ＊（Ｔ１６６Ｄ）はＣＡ０９－２３２５と、ＫＣＣＭ１２１２０Ｐ △ｇｌｘＲ：：ｇｌｘＲ＊（Ｅ１６８Ａ）はＣＡ０９－２３２４とそれぞれ命名した。

【0130】

Ｌ－スレオニン生産菌株であるＫＣＣＭ１２１２０Ｐ菌株を対照群として使用してｇｌｘＲ変異株総４種を以下の方法で培養してＬ－スレオニン生産収率、糖消耗速度、およびＬ－リジンのような副産物生産濃度を測定した。

【0131】

種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに前記で獲得した菌株をそれぞれ接種した後、３０℃で２０時間２００ｒｐｍで振盪培養した。下記のＬ－スレオニン生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３２℃で４８時間２００ｒｐｍで振盪培養した。前記種培地と生産培地の組成は、それぞれ下記表９に記載した。培養終了後、ＨＰＬＣとＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＹＳＩ２９００）を利用してＬ－リジン、Ｌ－スレオニンの濃度および糖消耗速度を測定し、その結果を表１０に示した。

【0132】

【表9】

【0133】

【表10】

【0134】

表１０に示されているように、Ｌ－スレオニン生産菌株であるＫＣＣＭ１２１２０Ｐ菌株を対照群としてｇｌｘＲ変異株４種（ＣＡ０９－２３７３、ＣＡ０９－２３７４、ＣＡ０９－２３２５、ＣＡ０９－２３２４）を培養してＬ－スレオニンと副産物（Ｌ－リジン）生産濃度を測定した結果、対照群に比べて、ｇｌｘＲ遺伝子に置換変異が導入された菌株４種は、全てＬ－リジンを含む他副産物の生産量を減少させたり大きな変化がなかったが、Ｌ－スレオニンの生産量が大きく増加したことを確認することができた。また、ＣＡ０９－２３７３、ＣＡ０９－２３７４、ＣＡ０９－２３２５、およびＣＡ０９－２３２４菌株の全てが対照群より糖消耗速度が改善されたため、同量のＬ－スレオニンを生産するにかかる時間が短縮し、Ｌ－スレオニン生産能が改善されたことを確認することができた。

【0135】

前記ＣＡ０９－２３７３、ＣＡ０９－２３７４、ＣＡ０９－２３２５およびＣＡ０９－２３２４菌株は、２０２０年１２月１７日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に国際寄託してそれぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１２９０１Ｐ、ＫＣＣＭ１２９０２Ｐ、ＫＣＣＭ１２９００Ｐ、およびＫＣＣＭ１２８９９Ｐが付与された。

【0136】

以上の説明から、本発明が属する技術分野における当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施可能であることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は全ての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味および範囲、そしてその等価概念から導き出される全ての変更または改変された形態が本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。

【0137】

［受託番号］
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１２８９９Ｐ
受託日付：２０２０１２１７

寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１２９００Ｐ
受託日付：２０２０１２１７

寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１２９０１Ｐ
受託日付：２０２０１２１７

寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１２９０２Ｐ
受託日付：２０２０１２１７

【配列表】

0007576180000001.app