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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-23
(45)【発行日】2024-10-31
(54)【発明の名称】修飾植物胚乳特異的プロモータとその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/82 20060101AFI20241024BHJP
C12N 15/84 20060101ALI20241024BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241024BHJP
C12N 5/04 20060101ALI20241024BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20241024BHJP
A01H 6/46 20180101ALI20241024BHJP
A01H 6/00 20180101ALI20241024BHJP
A01H 6/54 20180101ALI20241024BHJP
A01H 6/20 20180101ALI20241024BHJP
A01H 6/14 20180101ALI20241024BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241024BHJP
【ＦＩ】
C12N15/82 126Z
C12N15/84 Z ZNA
C12N5/10
C12N5/04
A01H5/00 A
A01H6/46
A01H6/00
A01H6/54
A01H6/20
A01H6/14
C12P21/02 C
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2023547732
(86)(22)【出願日】2021-08-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-01
(86)【国際出願番号】 CN2021112887
(87)【国際公開番号】W WO2022078049
(87)【国際公開日】2022-04-21
【審査請求日】2023-06-07
(31)【優先権主張番号】202011109663.9
(32)【優先日】2020-10-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】523142582
【氏名又は名称】武漢禾元生物科技股▲フン▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110002516
【氏名又は名称】弁理士法人白坂
(72)【発明者】
【氏名】楊代常
(72)【発明者】
【氏名】李坤鵬
【審査官】田ノ上 拓自
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０４９６２５５７（ＣＮ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／８２
Ｃ１２Ｎ １５／８４
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ ５／０４
Ａ０１Ｈ ５／００
Ａ０１Ｈ ６／４６
Ａ０１Ｈ ６／００
Ａ０１Ｈ ６／５４
Ａ０１Ｈ ６／２０
Ａ０１Ｈ ６／１４
Ｃ１２Ｐ ２１／０２
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるヌクレオチド配列のプロモータを有する修飾植物胚乳特異的発現プロモータ。
【請求項2】
請求項１に記載の植物胚乳特異的発現プロモータを含む発現カセット。
【請求項3】
請求項１に記載の植物胚乳特異的発現プロモータを含む組換発現ベクター。
【請求項4】
請求項１に記載の植物胚乳特異的発現プロモータを含む宿主アグロバクテリウム。
【請求項5】
請求項１に記載の植物胚乳特異的発現プロモータを含む遺伝子形質転換植物又は細胞株。
【請求項6】
遺伝子操作された植物又は遺伝子形質転換植物の調製における請求項１の植物胚乳特異的発現プロモータの使用。
【請求項7】
組換タンパク質又は代謝物を発現する遺伝子操作された植物又は遺伝子形質転換植物の調製における請求項１の植物胚乳特異的発現プロモータの使用。
【請求項8】
前記植物は、単子葉植物又は双子葉植物である請求項６に記載の使用。
【請求項9】
前記単子葉植物は、イネ、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、クリ、ソルガム、又はオーツであり、前記双子葉植物は、ダイズ、セイヨウアブラナ、又はヒマワリである請求項８に記載の使用。
【請求項10】
請求項１に記載の植物胚乳特異的発現プロモータを使用した組換タンパク質の調製方法であって、１）請求項１に記載の前記植物胚乳特異的発現プロモータを使用して、イネ胚乳細胞特異的媒介ベクターを構築することと、
２）組換タンパク質遺伝子を合成することと、
３）ステップ１）の前記ベクターをステップ２）の前記遺伝子に操作可能に結合することにより、前記プロモータによって媒介された組換タンパク質発現のためのベクターを得ることと、
４）ステップ３）の前記発現ベクターによって植物を形質転換し、前記胚乳中に前記組換タンパク質を発現することと、
５）前記植物から前記組換タンパク質を抽出及び精製することと、を含む方法。
【請求項11】
前記組換タンパク質は、ネコ血清アルブミンである請求項１０に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子工学とバイオテクノロジーの分野に属し、特に、人工修飾植物胚乳特異的プロモータＥｎｈＧｔ１３ａ及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
植物遺伝子工学を通じた植物細胞中の種々の組換タンパク質の発現及び作成も、分子薬学として既知であり、組換タンパク質産物は、植物性医薬品（ＰＭＰ）として既知である。現在、遺伝子操作された植物において発現の成功した組換薬剤には、ホルモン、抗体、酵素、サイトカイン、血漿タンパク質因子、及びワクチンがある。分子薬学は、組換タンパク質生成において多数の効果を示してきており、特にイネ胚乳は、理想的な組換タンパク質発現システムとして以下の効果を有している。１）モデル植物として、イネは、明確な遺伝子背景と詳細なゲノム情報とを有する。２）成熟した遺伝子形質転換技術である。３）イネは、自家受粉を行い、他家受粉の頻度は非常に低く、通常は１～５％未満であり、遺伝的浮動の頻度は、０．０３６％しかなく、花粉は葯を離れた後、５分でその活動を失い、バイオセイフティが良好である。４）イネの種子は、成熟及び乾燥後に、組換タンパク質の理想的な貯蔵場所を提供するものであり、そこで組換タンパク質が容易には劣化しない。５）種子は、長期貯蔵可能である。６）イネ胚乳は、可溶性の低い数種の貯蔵タンパク質を含有し、標的タンパク質の分離及び精製に有利である。７）最近の研究において、イネ胚乳中で生成された組換糖タンパク質が低い免疫原性を示すことを示している。８）イネは、田畑での育成及び管理がより容易であるため、遺伝子操作されたイネの大規模耕作が促進される。
【0003】
組換タンパク質の発現レベルは、生成コスト及び市場競争力に直接影響し、ＰＭＰ産物が市場に入れるか否かに影響を及ぼす鍵となる。したがって、組換タンパク質発現の連続的な改善が、分子薬学の研究における恒常的なテーマである。過去２０年間、植物細胞中の組換タンパク質の発現レベルを向上するために、広範な研究が行われ、多大な進歩を遂げてきた。組換タンパク質の発現を向上するストラテジーは、主に、以下の側面を焦点にしている。１）転写アクティビティの高いプロモータを使用することで、外来遺伝子の転写レベルを上げて種子中の組換タンパク質の特異的発現を可能にする。２）イネに好適なコドンを備えた標的遺伝子のコドン最適化により、ｍＲＮＡの不安定性を生じる希少コドンと潜在的なイントロンスプライシング部位を回避して、翻訳段階での組換タンパク質発現を改善し得るようにする。３）特異的５’及び３’ＵＴＲの選択により、翻訳開始とｍＲＮＡ安定性を向上することができる。４）特異的細胞内空胞に組換タンパク質を位置づける特異的タンパク質ソートシグナルを使用することで、組換タンパク質の発現レベルを上昇させるのみならず、下流の分離及び精製を促進する。特に、イネ胚乳に特異的な、より強いプロモータＧｔｌ及びＧｔ１３ａ等を使用するなど、より強いプロモータを選択することが最も効果的である。例えば、Ｇｔ１３ａプロモータの転写アクティビティは、Ｇｔｌより少なくとも４８．８％高い（Ｎｉｎｇら、２００８年、イネ胚乳において発現した組換ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の経口投与によるマウスの白血球を増加することができる。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ．３０：１６７９～１６８６）。
【0004】
特許第ＺＬ２００５１００１９０８４．４号及び第ＺＬ２００６１００１９２８５．９号は、イネ貯蔵タンパク質Ｇｔ１３ａプロモータの使用について記載している。Ｇｔ１３ａプロモータは、天然のイネをコードする１３のイネ貯蔵グルテニン遺伝子のうち、最も転写アクティビティの高いプロモータであるが（Ｋｕｓａｂａら（２００３年）低グルテリン含有量１：イネにおけるＲＮＡサイレンシングを介したグルテリン多重遺伝子族を抑制する優性突然変異、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １５：１４５５～１４６７）、イネ胚乳細胞における組換ヒト血清アルブミンの収率は、２．７５ｇ／ｋｇ玄米までに達した（Ｈｅら（２０１１年）遺伝子形質転換イネ種子からの機能的ヒト血清アルブミンの大規模生成、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，米国，２０１１年，ｖｏｌ．１０８（４７）：１９０７８～１９０８３）。イネ胚乳細胞中の組換タンパク質の発現をさらに増加させるには、Ｇｔ１３ａプロモータがイネ貯蔵タンパク質遺伝子の中でも最も強いプロモータであるため、天然においてＧｔ１３ａプロモータよりも強いプロモータを見つけることは困難である。したがって、イネ胚乳細胞中の組換タンパク質のさらに高い発現を駆動するために、Ｇｔ１３ａよりも転写アクティビティの高いプロモータを人工的に作成する必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、イネ胚乳細胞における組換タンパク質の発現をさらに向上するための、人工修飾胚乳特異的プロモータタＥｎｈＧｔ１３ａ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｔ１３ａ）とその使用を提供することである。発現に負の調節を行ういくつかの転写シス作用性エレメント（リプレッサ）が、除去され、Ｇｔ１３ａ（Ｏｓ０１ｇ０７６２５００、ＥＵ２６４１０２）におけるシス作用性エレメントへの部位特異的突然変異によって、発現に正の調節を行う新たなシス作用性エレメント（エンハンサ、又はＴＡＴＡカセット及びマトリクス付着領域（ＭＡＲ）のエンハンサ等）が生成される。一過性ＧＵＳ遺伝子発現によって試験されたプロモータの転写アクティビティの増加と、外来タンパク質の発現のさらなる増加とが、イネ胚乳において認められる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、以下の技術的解決を提供するものである。
【0007】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５のいずれか１つに示されるようなヌクレオチド配列を有する修飾植物胚乳特的プロモータであって、特に、以下のヌクレオチド配列を有する。
【0008】
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるようなＤＮＡ配列を有する。この配列は、Ｇｔ１３ａプロモータ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示される）の５’末端の２８１ベースの削除によるＧｔ１３ａΔ２８１ｂｐ欠失プロモータである。又は、
【0009】
２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるようなＤＮＡ配列を有する。この配列は、３２２位、７０８位、及び７１２位における部位特異的Ｇ→Ｔ突然変異と、７３３位における部位特異的Ｇ→Ａ突然変異とを伴う、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるようなＤＮＡ配列による人工修飾ＡＴリッチプロモータである。又は、
【0010】
３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるようなＤＮＡ配列を有する。この配列は、６２０位にＣＣからＴＴの突然変異を示して新たなＣＡＡＴを生じ、３４０位に配列ＴＡＣＡＡＡＴＧＡＴＧＴＧＴＣＡＡＴＴＡ ＣＡを挿入してＣＡＡＴエレメントを３回反復した、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるような新たな候補プロモータＧｔ１３ａΔ２８１＋ＣＡＡＴモチーフである。又は、
【0011】
４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されるようなＤＮＡ配列を有する。この配列は、３０１～３２２位においてＡＡＧＴＣＡＴＡＡＣＴＧＡＴモチーフを削除し、５５５位においてＣＡＧＴＧエレメントを削除し、７０８位においてＧＡＡＡＧからＣＡＡＴＴの突然変異を伴う、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるようなＤＥＬの新たな候補プロモータである。又は、
【0012】
５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示されるようなＤＮＡ配列を有する。この配列は、８０８位及び８４１位に配列ＡＴＡＴＡＴＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＴＴＣＡＴ及びＡＡＣＡＡＡＣＴＣＴＡＴＣＴＴ ＡＡＣＡＴＴを各々挿入してＧＣＮ４エレメントを増加させた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるような新たなＧＣＮ４エレメントリッチ候補プロモータである。
【0013】
本発明の新たな植物胚乳特異的プロモータは、配列表のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるようなヌクレオチド配列を有することが好ましい。最も好適なプロモータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるようなヌクレオチド配列を有する。
【0014】
本発明はまた、上記植物胚乳特異的プロモータのうちのいずれか１つを含む発現カセットも提供する。
【0015】
本発明はまた、上記植物胚乳特異的プロモータのうちのいずれか１つを含む組換発現ベクターも提供する。
【0016】
本発明はまた、上記植物胚乳特異的プロモータのいずれか１つを含む宿主バクテリアも提供する。
【0017】
本発明はまた、上記胚乳特異的プロモータの１つを含む遺伝子操作された植物細胞株、又は遺伝子形質転換植物、又は細胞株も提供する。
【0018】
本発明はまた、遺伝子操作されたか、又は遺伝子形質転換された植物の調製における上記植物胚乳特異的プロモータと、その使用も提供する。
【0019】
本発明はまた、いずれかの組換タンパク質又は代謝物を発現する遺伝操作されたか、又は遺伝子形質転換された植物における上記植物胚乳特異的プロモータの使用も提供する。
【0020】
上記植物胚乳特異的プロモータを使用することによる外来遺伝子の植物胚乳特異的発現の育種方法も、本発明の範囲内である。
【0021】
外来遺伝子の胚乳特異的発現を伴う植物の育種方法は、胚乳における外来遺伝子を特異的に発現する遺伝子形質転換植物に対するスクリーニングを行うために、植物発現ベクターを植物に形質転換することを含む。
【0022】
上述した遺伝子形質転換植物はいずれも、単子葉植物又は双子葉植物である。単子葉植物は、イネ、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、クリ、ソルガム、又はオーツ等のイネ科の植物であってもよく、双子葉植物は、ダイズ、セイヨウアブラナ、又はヒマワリであってもよい。
【0023】
本発明はまた、請求項１に記載の植物胚乳特異的プロモータを使用した組換タンパク質の作成方法であって、
１）請求項１に記載の植物胚乳特異的発現プロモータを使用して、イネ胚乳細胞特異的媒介ベクターを構築することと、
２）組換タンパク質遺伝子を合成することと、
３）ステップ１）のベクターをステップ２）の遺伝子に操作可能に結合することにより、プロモータによって駆動された組換タンパク質発現のためのベクターを得ることと、
４）ステップ３）の発現ベクターによって植物を形質転換し、胚乳中に前記組換タンパク質を発現することと、
５）植物から組換タンパク質を抽出及び精製することと、を含む方法も提供する。
本発明の特定の実施形態において、組換ネコ血清アルブミン（ＦＳＡ）の調製方法を提供し、ＦＳＡの遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示されるようなヌクレオチド配列を有する。
１）請求項１に記載の植物胚乳特異的発現プロモータを使用して、イネ胚乳細胞特異的媒介ベクターを構築することと、
２）組換タンパク質遺伝子を合成することと、
３）ステップ１）のベクターをステップ２）の遺伝子に操作可能に結合することにより、プロモータによって駆動された組換タンパク質発現のためのベクターを得ることと、
４）ステップ３）の発現ベクターによって植物を形質転換し、胚乳中に前記組換タンパク質を発現することと、
５）植物から組換タンパク質を抽出及び精製することと、を含む方法も提供する。
本発明の特定の実施形態において、組換ネコ血清アルブミン（ＦＳＡ）の調製方法を提供し、ＦＳＡの遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示されるようなヌクレオチド配列を有する。
【発明の効果】
【0024】
Ｇｔ１３ａプロモータと比較すると、本発明の修飾プロモータの有利な効果は、以下において反映される。
１）新たなプロモータ配列は、Ｇｔ１３ａの削除によって得られ、これにより非修飾プロモータに比較して７．２％、βグルコシダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の転写アクティビティを増加させる。
１）新たなプロモータ配列は、Ｇｔ１３ａの削除によって得られ、これにより非修飾プロモータに比較して７．２％、βグルコシダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の転写アクティビティを増加させる。
【0025】
２）新たなプロモータは、ＥｎｈＧｔ１３ａとして指定され、削除バージョンのＧｔ１３ａにおけるシス要素のコア領域の突然変異によって得られるが、インビトロにおけるイネの未成熟胚乳一過性ＧＵＳ発現システムを使用したＧｔ１３ａプロモータと比較して、相対ＧＵＳアクティビティが２８．５２％増加する。
【0026】
３）本発明のＥｎｈＧｔ１３ａは、外来遺伝子の安定的な発現を駆動し、胚乳バイオリアクタ中の外来組換タンパク質ＦＳＡのレベルは、非修飾Ｇｔ１３ａに比較して４６．５７％、著しく増加した。
【0027】
４）イネ胚乳における本発明の駆動ＧＵＳレポータ遺伝子発現のＥｎｈＧｔ１３ａプロモータは、あらゆる胚乳種子植物に好適であり、特に、医薬用タンパク質を発現する、遺伝子操作されたイネの種類の育種に好適である、
【0028】
５）本発明のＥｎｈＧｔ１３ａプロモータは、胚乳における外来タンパク質の発現及び蓄積を著しく改善することができ、これにより、バイオテクノロジーを使用した種子品質及び分子薬学の改善の研究基礎をなし、広範にわたる適用が見込まれる。
【0029】
本発明によると、新たな植物胚乳特異的プロモータは、構造遺伝子、調節遺伝子、構造遺伝子のアンチセンス遺伝子及び調節遺伝子のアンチセンス遺伝子、代謝物を調節する遺伝子、代謝物を調節する遺伝子のアンチセンス遺伝子の発現を駆動するための、医薬用又は産業用タンパク質、又はポリペプチド遺伝子、構造遺伝子、調節遺伝子、構造遺伝子のアンチセンス遺伝子、調節遺伝子のアンチセンス遺伝子でコードされた遺伝子に融合される。
【0030】
組換タンパク質発現ベクターは、プラスミド内に上記発現カセットと、デリバリベクターとを含有することによって構築される組換タンパク質発現ベクターである。組換タンパク質発現ベクターは、組換タンパク質植物発現ベクターであり、組換タンパク質発現ベクターは、上記発現カセットを含み、この発現カセットを植物宿主細胞、組織、又は器官に形質転換することができ、その子種は、自らを宿主のゲノム内に組み込む能力を有する。
【0031】
組換タンパク質発現ベクターは、遺伝子操作された遺伝子形質転換植物細胞、組織、又は器官と、これから分化及び再生を行う完全植物及びそのクローン又は子孫とを得るために、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、微量注入、アグロバクテリウム媒介又は遺伝子銃等、従来の遺伝子形質転換アプローチを使用して、植物細胞、組織、又は器官に形質転換することができる。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【発明を実施するための形態】
【0033】
本発明の効果をよりよく理解できるように、本発明の技術的提案について、実施例及び図面データにより、以下に詳細に説明する。提供される例は、例示的な本発明の方法として解釈されなければならず、どのような意味においても本発明によって明らかにされる技術的提案及び保護の範囲を限定することを意味するものでない。
【0034】
実験材料
ベクターｐＯｓＰＭＰ４２、ベクターｐＯｓＰＭＰ００２：Ｎｉｎｇら、２００８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ．３０：１６７９～１６８６に従って調製した。
ゴールドマイクロキャリア：Ｃａｔ．Ｎｏ．：１６５２２６３，ＢｉｏＲａｄ， Ｉｎｃ．
ｐＢＩ２２１ベクター：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．，米国
ｐＵＣ５７ベクター：ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
大腸菌株ＤＨ５α：Ｃａｔ．Ｎｏ：９０５７，Ｔａｋａｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
アグロバクテリウムプラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１３００：Ｃａｔ．Ｎｏ：ＨＧ－ＶＺＣ０３２３、ＣＡＭＢＩＡ（オーストラリア）
イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）：Ｖａｒｉｅｔｙ ９－２－５
アグロバクテリウムＥＨＡ１０５：Ｃａｔ．Ｎｏ：ＭＦ２３０２－１０００ＵＬ，ＭＫＢｉｏ Ｉｎｃ．
遺伝子銃ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ：ＢｉｏＲａｄ Ｉｎｃ．
マイクロプレートリーダ：スペクトロフォトメータ，Ｖａｒｉｏｓｋａｎ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．
ベクターｐＯｓＰＭＰ４２、ベクターｐＯｓＰＭＰ００２：Ｎｉｎｇら、２００８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ．３０：１６７９～１６８６に従って調製した。
ゴールドマイクロキャリア：Ｃａｔ．Ｎｏ．：１６５２２６３，ＢｉｏＲａｄ， Ｉｎｃ．
ｐＢＩ２２１ベクター：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．，米国
ｐＵＣ５７ベクター：ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
大腸菌株ＤＨ５α：Ｃａｔ．Ｎｏ：９０５７，Ｔａｋａｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
アグロバクテリウムプラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１３００：Ｃａｔ．Ｎｏ：ＨＧ－ＶＺＣ０３２３、ＣＡＭＢＩＡ（オーストラリア）
イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）：Ｖａｒｉｅｔｙ ９－２－５
アグロバクテリウムＥＨＡ１０５：Ｃａｔ．Ｎｏ：ＭＦ２３０２－１０００ＵＬ，ＭＫＢｉｏ Ｉｎｃ．
遺伝子銃ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ：ＢｉｏＲａｄ Ｉｎｃ．
マイクロプレートリーダ：スペクトロフォトメータ，Ｖａｒｉｏｓｋａｎ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．
【0035】
［実施例１］イネ胚乳プロモータＧＴ１３ａのクローニング、シークエンシング、及びバイオインフォマティクス分析
１．イネ胚乳特異的プロモータＧＴ１３ａの部位特異的突然変異
植物シス作用性エレメント用のオンライン分析ツールであるＰＬＡＮＴＣＡＲＥ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｐｓｂ．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／ｗｅｂｔｏｏｌｓ／ｐｌａｎｔｃａｒｅ／ｈｔｍｌ）を使用して、イネ胚乳Ｇｔ１３ａプロモータ配列のバイオインフォマティクス分析を実施した。これらの結果は、イネ胚乳Ｇｔ１３ａプロモータが、ＡＡＣＡモチーフ、ＣＡＡＴボックス、及びＧＣＮ４モチーフ等の胚乳特異的調節エレメントを有することを示した。本発明により、表１のとおり、５つの人工修飾プロモータ配列を設計した。
１．イネ胚乳特異的プロモータＧＴ１３ａの部位特異的突然変異
植物シス作用性エレメント用のオンライン分析ツールであるＰＬＡＮＴＣＡＲＥ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｐｓｂ．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／ｗｅｂｔｏｏｌｓ／ｐｌａｎｔｃａｒｅ／ｈｔｍｌ）を使用して、イネ胚乳Ｇｔ１３ａプロモータ配列のバイオインフォマティクス分析を実施した。これらの結果は、イネ胚乳Ｇｔ１３ａプロモータが、ＡＡＣＡモチーフ、ＣＡＡＴボックス、及びＧＣＮ４モチーフ等の胚乳特異的調節エレメントを有することを示した。本発明により、表１のとおり、５つの人工修飾プロモータ配列を設計した。
【0036】
【表1】
【0037】
表１中、
プロモータＧｔ１３ａΔ２８１ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）は、プロモータＧｔ１３ａの５’末端における２８１ｂｐの削除によって得た。これは、負の転写調節ＷＲＫＹの２つのシス作用性エレメントを含むものであった。
プロモータＧｔ１３ａΔ２８１ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）は、プロモータＧｔ１３ａの５’末端における２８１ｂｐの削除によって得た。これは、負の転写調節ＷＲＫＹの２つのシス作用性エレメントを含むものであった。
【0038】
プロモータＧｔ１３ａΔ２８１ｂｐ＋ＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に基づいて得られたが、３２２位、７０８位、及び７１２位にてＧ→Ｔを、７３３位にてＧ→Ａを含み、新たなマトリクス結合領域とＴＡＴＡ ＢＯＸ５（ＴＴＡＴＴＴ）とを生成し、７１０位にて点突然変異を含んで、転写アクティベータシス作用性エレメントＴＡＡＡＧを生成し、７０１位及び７０６位にて点突然変異を含んで、ＴＡＴＡ ＢＯＸ５（ＴＴＡＴＴＴ）を生成し、７１０位にて点突然変異を含んで転写アクティベータシス作用性エレメントＴＡＡＡＧを生成し、７０１位及び７０６位にて点突然変異を含んでＴＡＴＡ ＢＯＸ配列を作成した。
【0039】
プロモータＧｔ１３ａΔ２８１＋ＣＡＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に基づいて得られたが、６２０位にてＣＣ～ＴＴの突然変異を含んで新たなＣＡＡＴを生成し、３４０位にＴＡＣＡＡＡＴＧＡＴＧＴＧＴＣＡＡＴＴＡＣＡ配列を挿入して、３つのＣＡＡＴ反復要素を生成した。
【0040】
プロモータＧｔ１３ａΔ２８１／Ｄｅｌ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に基づいて得られたが、５２６位におけるＣＡＧＴＧエレメントを削除し、７０８位にてＧＡＡＡＧ～ＣＡＡＴＴ突然変異を含んでいた。
【0041】
プロモータＧｔ１３ａΔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に基づいて得られたが、８０８位にＡＴＡＴＡＴＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＴＴＣ ＡＴ配列を挿入し、８４１位にＡＡＣＡＡＡＣＴＣＴＡＴＣＴＴＡＡＣＡＴＴ配列を挿入して２つのＧＣＮ４エレメントを作成した。
【0042】
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより、人工修飾プロモータ配列を合成した。合成した配列をＧＵＳ発現ベクターに結合して、異なる人工修飾プロモータに駆動される一連のＧＵＳ遺伝子発現プラスミドを作成した。図１は、ベクターｐＯｓＰＭＰ４２のうちの１つの構造を示している。
【0043】
［実施例２］人工プロモータのＧＵＳ転写アクティビティの検出
人工修飾プロモータが胚乳における転写アクティビティを向上するか否かを検出するために、一過性発現システムとして未成熟イネ胚乳細胞を使用した。人工修飾プロモータによって駆動されるＧＵＳ一過性発現ベクターを構築した。プロモータの転写アクティビティを、インビトロで未成熟なイネ胚乳細胞中のＧＵＳ一過性発現によって検出した。主なステップは、以下のとおりである。
人工修飾プロモータが胚乳における転写アクティビティを向上するか否かを検出するために、一過性発現システムとして未成熟イネ胚乳細胞を使用した。人工修飾プロモータによって駆動されるＧＵＳ一過性発現ベクターを構築した。プロモータの転写アクティビティを、インビトロで未成熟なイネ胚乳細胞中のＧＵＳ一過性発現によって検出した。主なステップは、以下のとおりである。
【0044】
１．ゴールドナノキャリアの事前処理
１）１μｍの直径を備えた５０ｍｇのゴールドマイクロキャリアを秤量し、１．５ｍＬ遠心分離管に入れた。
２）１ｍＬの無水エタノールを添加した。
３）各３０秒の超音波処理後、３０秒の間隔で２分間、氷浴中での超音波処理を施した。
４）４０００ｒｐｍ未満で１秒間、遠心分離を行った後、上澄みを吸引した。
５）１ｍＬの滅菌水を添加し、氷浴中で２分間、超音波処理を施した後、ステップ３及び４を繰り返すことによって上澄みを除去した。
６）ステップ５）を一度繰り返した。
７）１ｍＬの滅菌水を添加し、氷浴中で超音波処理を施し、使用のために再び懸濁させた（５０ｍｇ／ｍＬのゴールドマイクロキャリア懸濁液）。
１）１μｍの直径を備えた５０ｍｇのゴールドマイクロキャリアを秤量し、１．５ｍＬ遠心分離管に入れた。
２）１ｍＬの無水エタノールを添加した。
３）各３０秒の超音波処理後、３０秒の間隔で２分間、氷浴中での超音波処理を施した。
４）４０００ｒｐｍ未満で１秒間、遠心分離を行った後、上澄みを吸引した。
５）１ｍＬの滅菌水を添加し、氷浴中で２分間、超音波処理を施した後、ステップ３及び４を繰り返すことによって上澄みを除去した。
６）ステップ５）を一度繰り返した。
７）１ｍＬの滅菌水を添加し、氷浴中で超音波処理を施し、使用のために再び懸濁させた（５０ｍｇ／ｍＬのゴールドマイクロキャリア懸濁液）。
【0045】
２．ベクターＤＮＡによるコーティング
１）５０μＬのゴールドマイクロキャリア懸濁溶液を取り出す。
２）１５μｇのＧＵＳプラスミドＤＮＡと１５μｇのＬＵＣプラスミドＤＮＡを含有した３０μＬ（２μｇ／μＬ）のプラスミドＤＮＡを添加する。
３）５０μＬの２．５Ｍ塩化カルシウムをボルテックスで徐々に滴下して添加した。
４）２０μＬの０．１Ｍスペルミジンをボルテックスで徐々に滴下して添加した。
５）１分間隔で１０分間、ボルテックスを行うことにより、これらをよく混合した。
６）上澄みを取り除いた。
７）５０μＬの無水エタノールを添加して、チューブの底でゴールドマイクロキャリアを再懸濁させた。
８）さらに５００μＬの無水エタノールを添加して、コーティングされたゴールド粒子を洗浄した。
９）短く遠心分離を行って上澄みを除去した後、すぐに使用できるように４０μＬの無水エタノールで再懸濁させた。
１０）１２μＬの再懸濁液を取り出し、滅菌したキャリア膜の中央に添加した。
１）５０μＬのゴールドマイクロキャリア懸濁溶液を取り出す。
２）１５μｇのＧＵＳプラスミドＤＮＡと１５μｇのＬＵＣプラスミドＤＮＡを含有した３０μＬ（２μｇ／μＬ）のプラスミドＤＮＡを添加する。
３）５０μＬの２．５Ｍ塩化カルシウムをボルテックスで徐々に滴下して添加した。
４）２０μＬの０．１Ｍスペルミジンをボルテックスで徐々に滴下して添加した。
５）１分間隔で１０分間、ボルテックスを行うことにより、これらをよく混合した。
６）上澄みを取り除いた。
７）５０μＬの無水エタノールを添加して、チューブの底でゴールドマイクロキャリアを再懸濁させた。
８）さらに５００μＬの無水エタノールを添加して、コーティングされたゴールド粒子を洗浄した。
９）短く遠心分離を行って上澄みを除去した後、すぐに使用できるように４０μＬの無水エタノールで再懸濁させた。
１０）１２μＬの再懸濁液を取り出し、滅菌したキャリア膜の中央に添加した。
【0046】
３．遺伝子銃による未成熟のイネ胚乳中のＧＵＳ一過性発現
１）未成熟のイネ胚乳の分離。７～１０日間の開花の後、イネ穂を取り出し、７０％アルコールで１分間滅菌し、２０％次亜塩素酸ナトリウムで１５分間滅菌し、滅菌水で５回濯いで、使用に備えた滅菌水中に載置した。
２）適量のＴＡＩＢ（２０ｍＭのＮＨ４ＮＯ３、１００μｇ／ｍＬのセフォタキシム、１００μｇ／ｍＬのチメンチンを補った完全媒体）媒体を、濾紙を２層備えたペトリ皿上に載置した。メスを使用して、未成熟胚で切断した後、完全な未成熟胚乳を優しく引っ張り出し、各皿に約１５ずつの未成熟胚乳が置かれるようにＴＡＩＢを含有する媒体の中央に載置した。
３）メーカーの指示に従い、形質転換のためにＰＤＳ－１０００Ｈｅ遺伝子銃を使用した。
４）２５℃で一晩、撃ち込まれた未成熟胚乳のインキュベーションを行った。
１）未成熟のイネ胚乳の分離。７～１０日間の開花の後、イネ穂を取り出し、７０％アルコールで１分間滅菌し、２０％次亜塩素酸ナトリウムで１５分間滅菌し、滅菌水で５回濯いで、使用に備えた滅菌水中に載置した。
２）適量のＴＡＩＢ（２０ｍＭのＮＨ４ＮＯ３、１００μｇ／ｍＬのセフォタキシム、１００μｇ／ｍＬのチメンチンを補った完全媒体）媒体を、濾紙を２層備えたペトリ皿上に載置した。メスを使用して、未成熟胚で切断した後、完全な未成熟胚乳を優しく引っ張り出し、各皿に約１５ずつの未成熟胚乳が置かれるようにＴＡＩＢを含有する媒体の中央に載置した。
３）メーカーの指示に従い、形質転換のためにＰＤＳ－１０００Ｈｅ遺伝子銃を使用した。
４）２５℃で一晩、撃ち込まれた未成熟胚乳のインキュベーションを行った。
【0047】
４．ＧＵＳ染色の定性的分析
未成熟イネ胚乳におけるＧＵＳ一過性発現システムの生存能力を試験するために、２５℃で１８～２４時間、形質転換された未成熟胚乳のインキュベーションを行った。皿内の媒介流体を吸引し、２ｍｌのＧＵＳ染色溶液を胚乳に直接添加した。３７℃における２～１０時間の発色現像後、観察及び写真撮影を行った。
未成熟イネ胚乳におけるＧＵＳ一過性発現システムの生存能力を試験するために、２５℃で１８～２４時間、形質転換された未成熟胚乳のインキュベーションを行った。皿内の媒介流体を吸引し、２ｍｌのＧＵＳ染色溶液を胚乳に直接添加した。３７℃における２～１０時間の発色現像後、観察及び写真撮影を行った。
【0048】
５．胚乳特異的プロモータによって仲介された相対転写アクティビティの定量的ＧＵＳアッセイ
１）２５℃で２４時間、撃ち込まれた未成熟イネ胚乳のインキュベーションを行った。胚乳を遠心分離管に移し、磨り潰して、５５μＬの抽出液（ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬１Ｘ，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｔｄ．，米国，Ｃａｔ ｎｏ．Ｅ１５００）で抽出し、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。ＧＵＳ及びＬＵＣのアクティビティを各々検出するために、２０μＬの各上澄みサンプルを９６－ウェルＥＬＩＳＡプレートに分配した。
２）ＬＵＣの定量的アッセイ。１００μＬの反応液（ルシフェラーゼ検出試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｔｄ．，米国，Ｃａｔ ｎｏ．Ｅ１５００）を抽出剤中に添加し、２５℃で２５分間、インキュベーションを行った。またマイクロプレートリーダを使用した化学発光法により、これらのサンプルを検出して、ＬＵＶアクティビティを得た。
３）ＧＵＳの定量的アッセイ。１０μＬの４－ＭＵＧ（２ｍｍｏｌ／Ｌ）をサンプルに添加し、３７℃で１時間、インキュベーションを行った。その後、停止溶液（２００ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３）によって反応を停止させた。マイクロプレートリーダを使用して、発光用に４４５ｎｍ、励起光用に３６５ｎｍについて蛍光値を測定した。各サンプルのＧＵＳアクティビティ値を得た。２及び３のステップで測定したＬＵＣ及びＧＵＳのアクティビティ値に基づき、相対ＧＵＳ遺伝子酵素アクティビティを計算した。
１）２５℃で２４時間、撃ち込まれた未成熟イネ胚乳のインキュベーションを行った。胚乳を遠心分離管に移し、磨り潰して、５５μＬの抽出液（ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬１Ｘ，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｔｄ．，米国，Ｃａｔ ｎｏ．Ｅ１５００）で抽出し、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。ＧＵＳ及びＬＵＣのアクティビティを各々検出するために、２０μＬの各上澄みサンプルを９６－ウェルＥＬＩＳＡプレートに分配した。
２）ＬＵＣの定量的アッセイ。１００μＬの反応液（ルシフェラーゼ検出試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｔｄ．，米国，Ｃａｔ ｎｏ．Ｅ１５００）を抽出剤中に添加し、２５℃で２５分間、インキュベーションを行った。またマイクロプレートリーダを使用した化学発光法により、これらのサンプルを検出して、ＬＵＶアクティビティを得た。
３）ＧＵＳの定量的アッセイ。１０μＬの４－ＭＵＧ（２ｍｍｏｌ／Ｌ）をサンプルに添加し、３７℃で１時間、インキュベーションを行った。その後、停止溶液（２００ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３）によって反応を停止させた。マイクロプレートリーダを使用して、発光用に４４５ｎｍ、励起光用に３６５ｎｍについて蛍光値を測定した。各サンプルのＧＵＳアクティビティ値を得た。２及び３のステップで測定したＬＵＣ及びＧＵＳのアクティビティ値に基づき、相対ＧＵＳ遺伝子酵素アクティビティを計算した。
【0049】
６．実験結果
１）未成熟イネ胚乳の一過性発現が作用しているか否かを試験するために、撃ち込みによって媒介された形質転換未成熟胚乳にＧＵＳ染色を実施した。結果は、すべての未成熟イネ胚乳細胞がＧＵＳ染色液で染色可能であったことを示し、これは、未成熟胚乳の一過性発現システムが適正に作用していることを示した（図２）。
２）コントロールとしてＧｔ１３ａプロモータを使用して、未成熟イネ胚乳細胞中の５つの修飾胚乳特異的プロモータに対する相対ＧＵＳアクティビティアッセイの試験を行った。
１）未成熟イネ胚乳の一過性発現が作用しているか否かを試験するために、撃ち込みによって媒介された形質転換未成熟胚乳にＧＵＳ染色を実施した。結果は、すべての未成熟イネ胚乳細胞がＧＵＳ染色液で染色可能であったことを示し、これは、未成熟胚乳の一過性発現システムが適正に作用していることを示した（図２）。
２）コントロールとしてＧｔ１３ａプロモータを使用して、未成熟イネ胚乳細胞中の５つの修飾胚乳特異的プロモータに対する相対ＧＵＳアクティビティアッセイの試験を行った。
【0050】
結果は、５’末端（Ｇｔ１３ａΔ２８１）で削除された２８１ｂｐのプロモータの相対ＧＵＳアクティビティが、コントロールＧｔ１３ａプロモータに比較して７．２７％増加したことを示している。転写アクティビティ（Ｇｔ１３ａΔ２８１＋ＡＴ）のコア領域に部位特異的突然変異を含むプロモータの相対ＧＵＳアクティビティは、コントロールＧｔ１３ａプロモータと比較して、２８．５３％増加し、著しいレベル（Ｐ＜０．０５）に達した。Ｇｔ１３ａΔ２８１＋ＣＡＡＴの相対ＧＵＳアクティビティは、Ｇｔ１３ａプロモータと比較して２３．０８％減少した。Ｇｔ１３ａΔ２８１＋ＤＥＬの相対ＧＵＳアクティビティは、Ｇｔ１３ａプロモータと比較して６４．４９％減少した。Ｇｔ１３ａΔ２８１＋ＧＣＮ４の相対ＧＵＳアクティビティは、Ｇｔ１３ａプロモータと比較して８６．５３％減少した（図３）。これらの結果は、Ｇｔ１３ａプロモータ（Ｇｔ１３ａΔ２８１）の５’末端と、コア転写調節領域（Ｇｔ１３ａΔ２８１＋ＡＴ）にＡＴの部位特異的突然変異を含むプロモータとの２つの負の調節を行うシス作用性エレメントが削除されたプロモータにより、未成熟胚乳の一過性発現システムにおける転写アクティビティを著しく増加できることを示した。
【0051】
［実施例３］突然変異部位の機能分析
削除及び部位特異的突然変異後に作成された新たなシス要素が生成されたか否かを明らかにするために、転写アクティビティの著しく増加した２つの人工修飾プロモータシス作用性エレメントを、ＰＬＡＣＥＣＡＲＥプロモータ分析ソフトウェアを使用して分析した。
削除及び部位特異的突然変異後に作成された新たなシス要素が生成されたか否かを明らかにするために、転写アクティビティの著しく増加した２つの人工修飾プロモータシス作用性エレメントを、ＰＬＡＣＥＣＡＲＥプロモータ分析ソフトウェアを使用して分析した。
【0052】
Ｇｔ１３ａΔ２８１ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）のシス作用性エレメントの分析結果は、Ｇｔ１３ａの５’末端において削除された２８１ｂｐが、転写の負のレギュレータＷＲＫＹの２つのシス作用性エレメントを含むことを示した（表２を参照のこと）。２つの転写の負のレギュレータＷＲＫＹモチーフをＧｔ１３ａΔ２８１ｂｐから取り除くと、結果として、Ｇｔ１３ａプロモータよりも相対ＧＵＳアクティビティが７．２％増加を示した。
【0053】
【表2】
【0054】
Ｇｔ１３ａΔ２８１ｂｐ＋ＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）の点突然変異の分析では、複数のポジティブな転写調節シス作用性エレメントが、部位特異的ＡＴ突然変異により、すなわち、７０１位及び７０６位におけるＡＴの部位特異点点突然変異によって生成されることを示し、１）ＡＡＧＡＡモチーフの転写リプレッサを取り除き（Ｉｎｔｎａｔｌ Ｒｅｖ Ｃｙｔｏ Ｖｏｌ １１９：５７－９６）、２）新たな核マトリクス付着領域（Ｍａｔｒｉｘ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ， Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２１， ２８１～２８８）及びＴＡＴＡＢＯＸ５（ＴＴＡＴＴＴ）を生成し、３）ＴＡＴＡＢＯＸ配列を追加し、４）７１０位における点突然変異により、転写アクティベータシス作用性エレメントＴＡＡＡＧを生成し、３１７位における点突然変異により、新たなシス作用性エレメントを生成し、組織特異性ＣＡＡＴ ＢＯＸ１とＤＰＢＦ ＣＯＲＥ ＤＣＤＣ３転写アクティベータＺＩＰ結合ファクターを増加させた（表３）。
【0055】
【表3】
【0056】
したがって、本発明のプロモータＧｔ１３ａΔ２８１＋ＡＴは、遺伝子発現を著しく向上した。このプロモータをＥｎｈＧｔ１３ａと指定する（改良Ｇｔ１３ａ）。
【0057】
［実施例４］ＥｎｈＧｔ１３ａプロモータの適用
イネ胚乳細胞におけるＥｎｈＧｔ１３ａを使用した胚乳における組換タンパク質発現を向上する効果を確認するために、各々、Ｇｔ１３ａ及びＥｎｈＧｔ１３ａに媒介されたネコ血清アルブミン（ＦＳＡ）を含有する２つの発現ベクターを構築し、これらを使用して、ＥｎｈＧｔ１３ａプロモータはイネ胚乳細胞中のネコ血清アルブミンの発現を向上することができるか否かを確認した。
イネ胚乳細胞におけるＥｎｈＧｔ１３ａを使用した胚乳における組換タンパク質発現を向上する効果を確認するために、各々、Ｇｔ１３ａ及びＥｎｈＧｔ１３ａに媒介されたネコ血清アルブミン（ＦＳＡ）を含有する２つの発現ベクターを構築し、これらを使用して、ＥｎｈＧｔ１３ａプロモータはイネ胚乳細胞中のネコ血清アルブミンの発現を向上することができるか否かを確認した。
【0058】
１．発現ベクターの構築
発現媒介ベクターは、ＥｎｈＧｔ１３ａプロモータを使用して構築した。Ｇｔ１３ａシグナルペプチドを伴うＥｎｈＧｔ１３ａの９３０ｂｐ ＤＮＡフラグメントを、ｐＢ１２２１ベクターにクローンを行って媒介プラスミドを作成した後、大腸菌株ＤＨ５αに導入し、ｐＯｓＰＭＰ８６２と称されるイネ胚乳特異的媒介ベクター菌株を構築した。
発現媒介ベクターは、ＥｎｈＧｔ１３ａプロモータを使用して構築した。Ｇｔ１３ａシグナルペプチドを伴うＥｎｈＧｔ１３ａの９３０ｂｐ ＤＮＡフラグメントを、ｐＢ１２２１ベクターにクローンを行って媒介プラスミドを作成した後、大腸菌株ＤＨ５αに導入し、ｐＯｓＰＭＰ８６２と称されるイネ胚乳特異的媒介ベクター菌株を構築した。
【0059】
成熟したネコ血清アルブミン遺伝子（遺伝子バンク登録番号ＮＰ＿００１００９９６１．１）のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）をアメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）より得て、ＦＳＡ遺伝子のアミノ酸配列をヌクレオチド配列に変換し、合成ＦＳＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）に示されるようなイネの好適な遺伝暗号を使用して最適化した。ＦＳＡ遺伝子の人工的合成において、制限エンドヌクレアーゼＭｌｙＩ及びＸｈｏＩ部位を遺伝子の両端に追加した後、ｐＯｓＰＭＰ８５０として指定されるｐＵＣ５７ベクター（Ｋｉｎｇｓｒａｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．）にクローンを行った。
【0060】
Ｇｔ１３ａ媒介ＦＳＡ発現ベクターを構築するために、ＭｌｙＩ及びＸｈｏＩによってｐＯｓＰＭＰ８５０ ＤＮＡを消化して合成ＦＳＡ遺伝子を得た後、ｐＯｓＰＭＰ８４８として指定されるＮａｅｌ及びＸｈｏＩによって消化されたｐＯｓＰＭＰ００２媒介ベクターに結合した。ｐＯｓＰＭＰ８４８をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化して発現カセット全体を得て、アグロバクテリウムプラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１３００の同一の酵素部位に結合し、ｐＯｓＰＭＰ８４９として指定されるベクターを生成した（図４）。
【0061】
ＥｎｈＧｔ１３ａ媒介ベクターを構築するために、ＭｙｌＩ及びＸｈｏＩでｐＯｓＰＭＰ ８５０プラスミドＤＮＡを消化して、ＦＳＡ ＤＮＡフラグメントを得た。その後、ＮａｅＩ及びＸｈｏＩによって消化されたプラスミドｐＯｓＰＭＰ８６２に結合した。結果として得られたプラスミドをｐＯｓＰＭＰ８５１と指定した。ｐＯｓＰＭＰ８５１プラスミドＤＮＡは、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化して全体発現カセットＤＮＡフラグメントを得た後、プラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１３００、アグロバクテリウムプラスミドに結合し、同一の酵素で消化した。結果として得られたプラスミドをｐＯｓＰＭＰ８５２と指定した（図４）。
【0062】
ｐＯｓＰＭＰ８４９及びｐＯｓＰＭＰ８５２ベクターを、各々、アグロバクテリウム媒介遺伝子形質転換のために、アグロバクテリウムＥＨＡ１０５に移した。
【0063】
２．アグロバクテリウム媒介遺伝子形質転換プロセス
２．１．カルス細胞
１）成熟したイネの種子の外殻を取り除き、７０％アルコールに１分浸漬して滅菌し、２０％次亜塩素酸ナトリウムでさらに３０分間処理した。
２）滅菌水で５～７回洗浄した。
３）滅菌した種子を、各皿に６～８の種子となるようにして、誘導媒体（Ｎ６媒体）上に接種した。
４）３２℃で約５～７日間、光処理を施した。
２．１．カルス細胞
１）成熟したイネの種子の外殻を取り除き、７０％アルコールに１分浸漬して滅菌し、２０％次亜塩素酸ナトリウムでさらに３０分間処理した。
２）滅菌水で５～７回洗浄した。
３）滅菌した種子を、各皿に６～８の種子となるようにして、誘導媒体（Ｎ６媒体）上に接種した。
４）３２℃で約５～７日間、光処理を施した。
【0064】
２．２．アグロバクテリウムの調製
各々、プラスミドｐＯｓＰＭＰ８４９及びｐＯｓＰＭＰ８５２を含有するアグロバクテリウムを、２８℃で２～３日間、カラマイシンで中央値を含む平皿において培養を行った。
各々、プラスミドｐＯｓＰＭＰ８４９及びｐＯｓＰＭＰ８５２を含有するアグロバクテリウムを、２８℃で２～３日間、カラマイシンで中央値を含む平皿において培養を行った。
【0065】
２．３．接種ループを使用して、アグロバクテリウムの単一コロニーを懸濁液媒体（ＡＡＭ液体媒体）中に入れ、振動（１６０ｒｐｍ）を伴って２８℃でインキュベーションを行った。通常、１００ｍＬの媒体が、インキュベーションループを伴って３～４ループ分、掻き取り可能である。
【0066】
２．４．アグロバクテリウム感染（コインキュベーション）
１）カルス細胞を滅菌した三角フラスコに移した。
２）アグロバクテリウム懸濁液のＯＤ６００値を０．０５～０．１に調整した。
３）カルス細胞を、ＡＡＭ媒体中に懸濁し、連続振動を伴って１．５分間、インキュベーションを行った。
４）アグロバクテリウム溶液を廃棄し、余剰の溶液で滅菌濾過紙上に染みを付け、カルス細胞を滅菌濾過紙上に載置し、３０～４５分間、排水した。
５）滅菌濾過紙を２Ｎ６－ＡＳ媒体上に載置した。その後、５００μＬのＡＳ（アセトシリンゴン、２５０ｍｇ／ｍＬ）含有ＡＡＭを滅菌濾過紙上に滴下し、感染したカルス細胞を濾過紙上に載置し、暗所において２５℃で３日間、共培養した。
１）カルス細胞を滅菌した三角フラスコに移した。
２）アグロバクテリウム懸濁液のＯＤ６００値を０．０５～０．１に調整した。
３）カルス細胞を、ＡＡＭ媒体中に懸濁し、連続振動を伴って１．５分間、インキュベーションを行った。
４）アグロバクテリウム溶液を廃棄し、余剰の溶液で滅菌濾過紙上に染みを付け、カルス細胞を滅菌濾過紙上に載置し、３０～４５分間、排水した。
５）滅菌濾過紙を２Ｎ６－ＡＳ媒体上に載置した。その後、５００μＬのＡＳ（アセトシリンゴン、２５０ｍｇ／ｍＬ）含有ＡＡＭを滅菌濾過紙上に滴下し、感染したカルス細胞を濾過紙上に載置し、暗所において２５℃で３日間、共培養した。
【0067】
２．５．水洗い及びスクリーニング
１）カルス組織を移して三角フラスコを滅菌した。
２）カルス組織を滅菌水で５～７回洗浄した。
３）感染したカルス組織を、０．５ｇ／Ｌのセファレキシンを含有した滅菌水に約３０分間浸漬した後、１８０～２００ＲＰＭ、２８℃で２０～３０分間振った。
４）抗生物質を含有した滅菌水を注ぎ出し、濾過紙を含む滅菌ペトリ皿で三角フラスコを上下逆にして約１５分間載置した。
５）滅菌濾過紙上でカルス組織を乾燥させた。
６）カルス組織を、ＨＰＴ抗生物質を含有する選択的媒体に２０～３０日間移した。
１）カルス組織を移して三角フラスコを滅菌した。
２）カルス組織を滅菌水で５～７回洗浄した。
３）感染したカルス組織を、０．５ｇ／Ｌのセファレキシンを含有した滅菌水に約３０分間浸漬した後、１８０～２００ＲＰＭ、２８℃で２０～３０分間振った。
４）抗生物質を含有した滅菌水を注ぎ出し、濾過紙を含む滅菌ペトリ皿で三角フラスコを上下逆にして約１５分間載置した。
５）滅菌濾過紙上でカルス組織を乾燥させた。
６）カルス組織を、ＨＰＴ抗生物質を含有する選択的媒体に２０～３０日間移した。
【0068】
２．６．カルス組織分化
２０～３０日間の選択後、ＨＰＴ抵抗を含むカルス組織を分化媒体（Ｎ６媒体）に移し、２６度で２０～３０日間、光の中でインキュベーションを行った。
２０～３０日間の選択後、ＨＰＴ抵抗を含むカルス組織を分化媒体（Ｎ６媒体）に移し、２６度で２０～３０日間、光の中でインキュベーションを行った。
【0069】
２．７．発根
２０～３０日間の分化後、分化された植物を分化媒体から外し、１／２ＭＳを含有する媒体に移し、光の下、２８℃で３０日間、インキュベーションを行って発根を行い、成長させるために田畑に移した。
２０～３０日間の分化後、分化された植物を分化媒体から外し、１／２ＭＳを含有する媒体に移し、光の下、２８℃で３０日間、インキュベーションを行って発根を行い、成長させるために田畑に移した。
【0070】
３．遺伝子操作された種苗における同定及び植え付け
３．１．ゲノムＤＮＡの抽出
１）Ｔ０世代ＨＰＴ－ポジティブ植物から得た約２ｃｍの葉をチューブ内に入れ、６００μＬのＣＴＡＢ抽出緩衝液（２％ＣＴＡＢ、１．３８Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を添加し、バイブレータクラッシャで磨り潰した後、６５℃水浴において６０分間インキュベーションを行った。同一容量のクロロホルム／イソアミルアルコールを添加し、反転で優しく混合し、１２０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離を行った。上澄みを新たな１．５ｍｌ遠心分離管に移し、同一容量のイソプロパノールを添加し、反転で優しく混合した。室温で６０分間インキュベーションを行った後、これらの材料を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを取り除き、ＤＮＡ析出物を事前冷却した７０％エタノール中で濯ぎ、空気乾燥した。その後、ＤＮＡを８０μｌのＴＥ緩衝液中に溶解し、－２０℃で使用に備えて保管した。
３．１．ゲノムＤＮＡの抽出
１）Ｔ０世代ＨＰＴ－ポジティブ植物から得た約２ｃｍの葉をチューブ内に入れ、６００μＬのＣＴＡＢ抽出緩衝液（２％ＣＴＡＢ、１．３８Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を添加し、バイブレータクラッシャで磨り潰した後、６５℃水浴において６０分間インキュベーションを行った。同一容量のクロロホルム／イソアミルアルコールを添加し、反転で優しく混合し、１２０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離を行った。上澄みを新たな１．５ｍｌ遠心分離管に移し、同一容量のイソプロパノールを添加し、反転で優しく混合した。室温で６０分間インキュベーションを行った後、これらの材料を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを取り除き、ＤＮＡ析出物を事前冷却した７０％エタノール中で濯ぎ、空気乾燥した。その後、ＤＮＡを８０μｌのＴＥ緩衝液中に溶解し、－２０℃で使用に備えて保管した。
【0071】
２）ＰＣＲ増幅
遺伝子操作された植物の葉からゲノムＤＮＡを抽出し、ＦＳＡ特異的プライマ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９：ＡＧＣＴＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＧＡに示されるようなフォワードプライマ配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０：ＡＴＣＴＣＧＴＡＧＡＧＧＴＡＣＴＴＧＣＣＧＡに示されるようなリバースプライマ配列）を使用してＰＣＲによって同定した。ＰＣＲアッセイを以下のように実施した。
遺伝子操作された植物の葉からゲノムＤＮＡを抽出し、ＦＳＡ特異的プライマ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９：ＡＧＣＴＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＧＡに示されるようなフォワードプライマ配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０：ＡＴＣＴＣＧＴＡＧＡＧＧＴＡＣＴＴＧＣＣＧＡに示されるようなリバースプライマ配列）を使用してＰＣＲによって同定した。ＰＣＲアッセイを以下のように実施した。
【0072】
１）１μＬのイネゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用し、ポジティブ（プラスミドＤＮＡ）とネガティブ（滅菌水）コントロールを提供した。
２）ＰＣＲ増幅反応には、２．５μＬの１０×緩衝液、０．１５μｌの５Ｕ／μＬ ｒＴａｑａｓｅ、４μＬの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μＬの各フォワード及びリバースプライマが含まれた。２５μＬまでｄｄＨ２Ｏとともに添加した。
３）９４℃で５分間、事前変性を行った後、９４℃で３０秒間、３５サイクルの変性を行い、５５℃で３０秒間アニーリングを行い、７２℃で４０秒間伸長し、７２℃で１０分間、最終伸長を行った。
４）ＰＣＲ増幅産物を、１％アガロースゲル中で電気泳動し、ＥＢで染色した。ＰＣＲの結果をゲルイメージャで観察した。
２）ＰＣＲ増幅反応には、２．５μＬの１０×緩衝液、０．１５μｌの５Ｕ／μＬ ｒＴａｑａｓｅ、４μＬの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μＬの各フォワード及びリバースプライマが含まれた。２５μＬまでｄｄＨ２Ｏとともに添加した。
３）９４℃で５分間、事前変性を行った後、９４℃で３０秒間、３５サイクルの変性を行い、５５℃で３０秒間アニーリングを行い、７２℃で４０秒間伸長し、７２℃で１０分間、最終伸長を行った。
４）ＰＣＲ増幅産物を、１％アガロースゲル中で電気泳動し、ＥＢで染色した。ＰＣＲの結果をゲルイメージャで観察した。
【0073】
４．発現レベルの判定
Ｔ０植物から生じたＴ１生成種子を、ＦＳＡタンパク質アッセイのために収穫した。具体的なステップは以下のとおりである。
１）粗胚乳タンパク質の抽出。５粒の外殻を取り除き（約７７ｍｇの玄米）、米粉に磨り潰し、１ｍＬの抽出液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で室温にて６０分間抽出を行った後、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。上澄みをＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に使用した。
Ｔ０植物から生じたＴ１生成種子を、ＦＳＡタンパク質アッセイのために収穫した。具体的なステップは以下のとおりである。
１）粗胚乳タンパク質の抽出。５粒の外殻を取り除き（約７７ｍｇの玄米）、米粉に磨り潰し、１ｍＬの抽出液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で室温にて６０分間抽出を行った後、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。上澄みをＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に使用した。
【0074】
２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。５０μＬの粗抽出物又は５μｇのＦＳＡ標準タンパク質を、１０μｌのサンプル緩衝液とともに添加、１００℃で５分間、変性させた。１０μＬの各サンプルを１０％のポリプロピレンゲル変性ゲル上に投入し、１６０Ｖで４５分間、電気泳動させた。その後、０．１ｍｇ／ｍＬのＫｏｍａｓ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅで染色し、脱色した後に写真撮影を行った。
【0075】
３）組換ＦＳＡ発現の半定量的分析。同一のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにおける既知の含有量のＦＳＡのグレースケールに基づき、各系統のＦＳＡ発現を半定量的に分析した。各系統のＦＳＡタンパク質含有量をグレースケールに応じて計算した。
【0076】
５．結果及び分析
１）標的遺伝子ポジティブ植物の同定
プロモータ領域特異的配列をフォワードプライマ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示される）として、ＦＳＡ遺伝子特異的配列をリバースプライマ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示される）として使用することにより、１４のｐＯｓＰＭＰ８４９（Ｇｔ１３ａプロモータ）の標的遺伝子ポジティブＴ０植物と、３６のｐＯｓＰＭＰ８５２（ＥｎｈＧｔ１３ａ）の標的遺伝子ポジティブ植物とを、ＰＣＲによって得た（図５）。これらの植物を成熟するまで育成し、このうち、合計１０のｐＯｓＰＭＰ８４９の植物が種子を生じた、合計２０のｐＯｓＰＭＰ８５２の植物が種子を生じた。
１）標的遺伝子ポジティブ植物の同定
プロモータ領域特異的配列をフォワードプライマ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示される）として、ＦＳＡ遺伝子特異的配列をリバースプライマ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示される）として使用することにより、１４のｐＯｓＰＭＰ８４９（Ｇｔ１３ａプロモータ）の標的遺伝子ポジティブＴ０植物と、３６のｐＯｓＰＭＰ８５２（ＥｎｈＧｔ１３ａ）の標的遺伝子ポジティブ植物とを、ＰＣＲによって得た（図５）。これらの植物を成熟するまで育成し、このうち、合計１０のｐＯｓＰＭＰ８４９の植物が種子を生じた、合計２０のｐＯｓＰＭＰ８５２の植物が種子を生じた。
【0077】
２）ＦＳＡ発現の半定量的分析
各下部のＦＳＡ発現を大まかに推定するために、参照として既知のＦＳＡ濃度の同一のＰＡＧＥゲルを使用してグレースケール比較を実施し、ＦＳＡの発現レベルをグレースケールに基づいて推定した。中でも、ｐＯｓＰＭＰ８４９発現ＦＳＡの７系列（図６）と、ｐＯｓＰＭＰ８５２発現ＦＳＡの１１株（図７）を分析した。結果を図８に示す。ｐＯｓＰＭＰ８４９のＦＳＡ発現レベルは、３．０８～１０．０１ｍｇ／ｇの玄米の範囲で、６．７１ｍｇ／ｇの玄米を平均とした。ｐＯｓＰＭＰ８５２のＦＳＡ発現は、２．３１～１３．８６ｍｇ／ｇの玄米の範囲で、９．８４ｍｇ／ｇの玄米を平均とした。ＥｎｈＧｔ１３ａプロモータ媒介ＦＳＡ発現は、３．１３ｍｇ／ｇの玄米分増加し、Ｇｔ１３ａプロモータ媒介ＦＳＡ発現よりも４６．５７％高かった。これらの結果は、ＥｎｈＧｔ１３ａプロモータがイネ胚乳中の組換タンパク質の発現を著しく増加可能であることを示した。
各下部のＦＳＡ発現を大まかに推定するために、参照として既知のＦＳＡ濃度の同一のＰＡＧＥゲルを使用してグレースケール比較を実施し、ＦＳＡの発現レベルをグレースケールに基づいて推定した。中でも、ｐＯｓＰＭＰ８４９発現ＦＳＡの７系列（図６）と、ｐＯｓＰＭＰ８５２発現ＦＳＡの１１株（図７）を分析した。結果を図８に示す。ｐＯｓＰＭＰ８４９のＦＳＡ発現レベルは、３．０８～１０．０１ｍｇ／ｇの玄米の範囲で、６．７１ｍｇ／ｇの玄米を平均とした。ｐＯｓＰＭＰ８５２のＦＳＡ発現は、２．３１～１３．８６ｍｇ／ｇの玄米の範囲で、９．８４ｍｇ／ｇの玄米を平均とした。ＥｎｈＧｔ１３ａプロモータ媒介ＦＳＡ発現は、３．１３ｍｇ／ｇの玄米分増加し、Ｇｔ１３ａプロモータ媒介ＦＳＡ発現よりも４６．５７％高かった。これらの結果は、ＥｎｈＧｔ１３ａプロモータがイネ胚乳中の組換タンパク質の発現を著しく増加可能であることを示した。
【0078】
まとめると、転写を向上するエンハンサ及び転写をブロックするリプレッサ等、プロモータ領域には種々のシス作用性エレメントがある。これらのシス作用性エレメントは、トランス作用因子と相互作用して、遺伝子の空間的及び時間的発現と、発現のレベルも調節する。大抵は、トランス作用因子は、これらのシス作用性エレメントを通じて遺伝子転写の正又は負の調節を行う。プロモータ領域に核マトリクス接着領域の導入によっても、ＲＮＡ合成酵素のプロモータ領域への進入を著しく向上することで、転写アクティビティを増加させる。
【0079】
本発明では、転写の負の調節を行うシス作用性エレメントを取り除くか、又は転写の正の当接を行う新たなシス作用性エレメントと核マトリクス付着領域を生成するか、のいずれかにより、Ｇｔ１３ａプロモータのキーとなるシス作用性エレメントの部位特異的突然変異によって天然の胚乳特異的プロモータＧｔ１３ａよりも転写アクティビティの強い新たなプロモータＥｎｈＧｔ１３ａが得られる。胚乳特異的プロモータＥｎｈＧｔ１３ａの相対ＧＵＳアクティビティは、Ｇｔ１３ａのインビトロの未成熟胚乳一過性発現システムにおけるＧｔ１３ａよりも２８．５２％高い。ＥｎｈＧｔ１３ａプロモータによって媒介される組換ネコ血清アルブミン（ＦＳＡ）の発現は、９．８４ｍｇ／ｇの玄米に達し、６．７１ｍｇ／ｋｇの玄米のＧｔ１３ａ媒介ＦＳＡを超える４６．５７％の増加に達した。
【0080】
これらの結果は、本発明のＥｎｈＧｔ１３ａプロモータが、イネ胚乳におけるβグルコシダーゼ（ＧＵＳ）レポータ遺伝子の発現を媒介するため、胚乳種子を有するあらゆる植物に好適であり、特に、医薬用タンパク質を発現する、遺伝子操作されたイネの種類の育種に好適であることを示している。本発明のＥｎｈＧｔ１３ａプロモータは、胚乳における外来遺伝子の発現及び蓄積を著しく高めることができ、バイオテクノロジーを使用した種子品質及び分子薬学の改善のための研究の基礎を築くもので、多大な適用が見込まれる。
【0081】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１
＞Ｇｔ１３ａΔ２８１
TGAAACAATA TTATGAGTAA TGTGTGAGCA TTATGGGACC ACGAAATAAA AAAAGAACAT TTTTATGAGC AGTGTGTTCT CAATGAGCCT TGAATGTTAT CACCCAGGAT AAGAAACCCT TAAGCAATGA AACATGCAAG CGTTTAATGT GCAAAGTTGG CATTCTCCAC GACATAATGC AAAAGAAGAT ATAATCTATG ACATAGCAAG TCATGCATCA TTTCATGCCT CTGTCAACCT ATTCATTTCT AGTCATCTAG GTAAGTATCT TAAGCTAAAG TGTTAGAACT TCCCATACAT AAGTCATAAC TGATGACAAT TGGGTGTAAC ACATGACAAA CCAGAGAGTC AAGCAAGATA AAGCAAAAGG ATGTGTACAT AAAACTACAG AGCTATATGT CATGTTGCGA AAAGAGGAGA GCTTATAAGA CAAGCCATGA CTCAAAAAAA ATTCACATGC CTACTGTGGC CCATATATCA TGCAACAATC CAAAAACTCA CAGGTCTCGG TGTTGATCGT GTCAACATGT GACCACCCTA AAAACTCTTC ACTAAATATT AAAGTATTGC TAGAACAGAG CTTCAAGATA TAAGTCATGA TCACCAACAA CCATGTTCAA AAAGAAATAG AAAGCTATGG CACAGCAACA AAAAGCAAAA GCATGCATGG ATATAATCTT TAACATCATC CATGTCATAT TGCAAAAGAA AGAAAGAGAG AACAATACAA ATGATGTGTC AATTACACAT CCATCATTAT CCATCCACCT TCCGTGTACC ACACTTCATA TATCATGAGT CACTTCATGT CTGGACATTA ACAAACTCTA TCTTAACATT CAAATGCATG AGACTTTATC TCACTATAAA TGCACAATGA TTTAGCATTG TTTCTCACAA AACCATTCAA GTTCATTAGT ACTACAACAA
＞Ｇｔ１３ａΔ２８１
TGAAACAATA TTATGAGTAA TGTGTGAGCA TTATGGGACC ACGAAATAAA AAAAGAACAT TTTTATGAGC AGTGTGTTCT CAATGAGCCT TGAATGTTAT CACCCAGGAT AAGAAACCCT TAAGCAATGA AACATGCAAG CGTTTAATGT GCAAAGTTGG CATTCTCCAC GACATAATGC AAAAGAAGAT ATAATCTATG ACATAGCAAG TCATGCATCA TTTCATGCCT CTGTCAACCT ATTCATTTCT AGTCATCTAG GTAAGTATCT TAAGCTAAAG TGTTAGAACT TCCCATACAT AAGTCATAAC TGATGACAAT TGGGTGTAAC ACATGACAAA CCAGAGAGTC AAGCAAGATA AAGCAAAAGG ATGTGTACAT AAAACTACAG AGCTATATGT CATGTTGCGA AAAGAGGAGA GCTTATAAGA CAAGCCATGA CTCAAAAAAA ATTCACATGC CTACTGTGGC CCATATATCA TGCAACAATC CAAAAACTCA CAGGTCTCGG TGTTGATCGT GTCAACATGT GACCACCCTA AAAACTCTTC ACTAAATATT AAAGTATTGC TAGAACAGAG CTTCAAGATA TAAGTCATGA TCACCAACAA CCATGTTCAA AAAGAAATAG AAAGCTATGG CACAGCAACA AAAAGCAAAA GCATGCATGG ATATAATCTT TAACATCATC CATGTCATAT TGCAAAAGAA AGAAAGAGAG AACAATACAA ATGATGTGTC AATTACACAT CCATCATTAT CCATCCACCT TCCGTGTACC ACACTTCATA TATCATGAGT CACTTCATGT CTGGACATTA ACAAACTCTA TCTTAACATT CAAATGCATG AGACTTTATC TCACTATAAA TGCACAATGA TTTAGCATTG TTTCTCACAA AACCATTCAA GTTCATTAGT ACTACAACAA
【0082】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
＞Ｇｔ１３ａΔ２８１＋ＡＴ
TGAAACAATA TTATGAGTAA TGTGTGAGCA TTATGGGACC ACGAAATAAA AAAAGAACAT TTTTATGAGC AGTGTGTTCT CAATGAGCCT TGAATGTTAT CACCCAGGAT AAGAAACCCT TAAGCAATGA AACATGCAAG CGTTTAATGT GCAAAGTTGG CATTCTCCAC GACATAATGC AAAAGAAGAT ATAATCTATG ACATAGCAAG TCATGCATCA TTTCATGCCT CTGTCAACCT ATTCATTTCT AGTCATCTAG GTAAGTATCT TAAGCTAAAG TGTTAGAACT TCCCATACAT AAGTCATAAC TGATGACAAT TTGGTGTAAC ACATGACAAA CCAGAGAGTC AAGCAAGATA AAGCAAAAGG ATGTGTACAT AAAACTACAG AGCTATATGT CATGTTGCGA AAAGAGGAGA GCTTATAAGA CAAGCCATGA CTCAAAAAAA ATTCACATGC CTACTGTGGC CCATATATCA TGCAACAATC CAAAAACTCA CAGGTCTCGG TGTTGATCGT GTCAACATGT GACCACCCTA AAAACTCTTC ACTAAATATT AAAGTATTGC TAGAACAGAG CTTCAAGATA TAAGTCATGA TCACCAACAA CCATGTTCAA AAAGAAATAG AAAGCTATGG CACAGCAACA AAAAGCAAAA GCATGCATGG ATATAATCTT TAACATCATC CATGTCATAT TGCAAAATAA ATAAAGAGAG AACAATACAA ATGATATGTC AATTACACAT CCATCATTAT CCATCCACCT TCCGTGTACC ACACTTCATA TATCATGAGT CACTTCATGT CTGGACATTA ACAAACTCTA TCTTAACATT CAAATGCATG AGACTTTATC TCACTATAAA TGCACAATGA TTTAGCATTG TTTCTCACAA AACCATTCAA GTTCATTAGT ACTACAACAA
＞Ｇｔ１３ａΔ２８１＋ＡＴ
TGAAACAATA TTATGAGTAA TGTGTGAGCA TTATGGGACC ACGAAATAAA AAAAGAACAT TTTTATGAGC AGTGTGTTCT CAATGAGCCT TGAATGTTAT CACCCAGGAT AAGAAACCCT TAAGCAATGA AACATGCAAG CGTTTAATGT GCAAAGTTGG CATTCTCCAC GACATAATGC AAAAGAAGAT ATAATCTATG ACATAGCAAG TCATGCATCA TTTCATGCCT CTGTCAACCT ATTCATTTCT AGTCATCTAG GTAAGTATCT TAAGCTAAAG TGTTAGAACT TCCCATACAT AAGTCATAAC TGATGACAAT TTGGTGTAAC ACATGACAAA CCAGAGAGTC AAGCAAGATA AAGCAAAAGG ATGTGTACAT AAAACTACAG AGCTATATGT CATGTTGCGA AAAGAGGAGA GCTTATAAGA CAAGCCATGA CTCAAAAAAA ATTCACATGC CTACTGTGGC CCATATATCA TGCAACAATC CAAAAACTCA CAGGTCTCGG TGTTGATCGT GTCAACATGT GACCACCCTA AAAACTCTTC ACTAAATATT AAAGTATTGC TAGAACAGAG CTTCAAGATA TAAGTCATGA TCACCAACAA CCATGTTCAA AAAGAAATAG AAAGCTATGG CACAGCAACA AAAAGCAAAA GCATGCATGG ATATAATCTT TAACATCATC CATGTCATAT TGCAAAATAA ATAAAGAGAG AACAATACAA ATGATATGTC AATTACACAT CCATCATTAT CCATCCACCT TCCGTGTACC ACACTTCATA TATCATGAGT CACTTCATGT CTGGACATTA ACAAACTCTA TCTTAACATT CAAATGCATG AGACTTTATC TCACTATAAA TGCACAATGA TTTAGCATTG TTTCTCACAA AACCATTCAA GTTCATTAGT ACTACAACAA
【0083】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
＞Ｇｔ１３ａΔ２８１＋ＣＡＡＴ
TGAAACAATA TTATGAGTAA TGTGTGAGCA TTATGGGACC ACGAAATAAA AAAAGAACAT TTTTATGAGC AGTGTGTTCT CAATGAGCCT TGAATGTTAT CACCCAGGAT AAGAAACCCT TAAGCAATGA AACATGCAAG CGTTTAATGT GCAAAGTTGG CATTCTCCAC GACATAATGC AAAAGAAGAT ATAATCTATG ACATAGCAAG TCATGCATCA TTTCATGCCT CTGTCAACCT ATTCATTTCT AGTCATCTAG GTAAGTATCT TAAGCTAAAG TGTTAGAACT TCCCATACAT AAGTCATAAC TGATGACAAT TGGGTGTAAC ACATGACCAA TACAAATGAT GTGTCAATTA CACATGAGAG TCAAGCAAGA TAAAGCAAAA GGATGTGTAC ATAAAACTAC AGAGCTATAT GTCATGTTGC GAAAAGAGGA GAGCTTATAA GACAAGCCAT GACTCAAAAA AAATTCACAT GCCTACTGTG GCCCATATAT CATGCAACAA TCCAAAAACT CACAGGTCTC GGTGTTGATC GTGTCAATAT GTGACCACCC TAAAAACTCT TCACTAAATA TTAAAGTATT GCTAGAACAG AGCTTCAAGA TATAAGTCAT GATCACCAAC AATTATGTTC AAAAAGAAAT AGAAAGCTAT GGCACAGCAA CAAAAAGCAA AAGCATGCAT GGATATAATC TTTAACATCA TCCATGTCAT ATTGCAAAAG AAAGAAAGAG AGAACAATAC AAATGATGTG TCAATTACAC ATCCATCATT ATCCATCCAC CTTCCGTGTA CCACACTTCA TATATCATGA GTCACTTCAT GTCTGGACAT TAACAAACTC TATCTTAACA TTCAAATGCA TGAGACTTTA TCTCACTATA AATGCACAAT GATTTAGCAT TGTTTCTCAC AAAACCATTC AAGTTCATTA GTACTACAAC AA
＞Ｇｔ１３ａΔ２８１＋ＣＡＡＴ
TGAAACAATA TTATGAGTAA TGTGTGAGCA TTATGGGACC ACGAAATAAA AAAAGAACAT TTTTATGAGC AGTGTGTTCT CAATGAGCCT TGAATGTTAT CACCCAGGAT AAGAAACCCT TAAGCAATGA AACATGCAAG CGTTTAATGT GCAAAGTTGG CATTCTCCAC GACATAATGC AAAAGAAGAT ATAATCTATG ACATAGCAAG TCATGCATCA TTTCATGCCT CTGTCAACCT ATTCATTTCT AGTCATCTAG GTAAGTATCT TAAGCTAAAG TGTTAGAACT TCCCATACAT AAGTCATAAC TGATGACAAT TGGGTGTAAC ACATGACCAA TACAAATGAT GTGTCAATTA CACATGAGAG TCAAGCAAGA TAAAGCAAAA GGATGTGTAC ATAAAACTAC AGAGCTATAT GTCATGTTGC GAAAAGAGGA GAGCTTATAA GACAAGCCAT GACTCAAAAA AAATTCACAT GCCTACTGTG GCCCATATAT CATGCAACAA TCCAAAAACT CACAGGTCTC GGTGTTGATC GTGTCAATAT GTGACCACCC TAAAAACTCT TCACTAAATA TTAAAGTATT GCTAGAACAG AGCTTCAAGA TATAAGTCAT GATCACCAAC AATTATGTTC AAAAAGAAAT AGAAAGCTAT GGCACAGCAA CAAAAAGCAA AAGCATGCAT GGATATAATC TTTAACATCA TCCATGTCAT ATTGCAAAAG AAAGAAAGAG AGAACAATAC AAATGATGTG TCAATTACAC ATCCATCATT ATCCATCCAC CTTCCGTGTA CCACACTTCA TATATCATGA GTCACTTCAT GTCTGGACAT TAACAAACTC TATCTTAACA TTCAAATGCA TGAGACTTTA TCTCACTATA AATGCACAAT GATTTAGCAT TGTTTCTCAC AAAACCATTC AAGTTCATTA GTACTACAAC AA
【0084】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
＞Ｇｔ１３ａΔ２８１／Ｄｅｌ
TGAAACAATA TTATGAGTAA TGTGTGAGCA TTATGGGACC ACGAAATAAA AAAAGAACAT TTTTATGAGC AGTGTGTTCT CAATGAGCCT TGAATGTTAT CACCCAGGAT AAGAAACCCT TAAGCAATGA AACATGCAAG CGTTTAATGT GCAAAGTTGG CATTCTCCAC GACATAATGC AAAAGAAGAT ATAATCTATG ACATAGCAAG TCATGCATCA TTTCATGCCT CTGTCAACCT ATTCATTTCT AGTCATCTAG GTAAGTATCT TAAGCTAAAG TGTTAGAACT TCCCATACAT GACAATTTGG TGTAACACAT GACAAACCAG AGAGTCAAGC AAGATAAAGC AAAAGGATGT GTACATAAAA CTACAGAGCT ATATGTCATG TTGCGAAAAG AGGAGAGCTT ATAAGACAAG CCATGACTCA AAAAAAATTC ACATGCCTAC TGTGGCCCAT ATATCATGCA ACAATCCAAA AACTCACAGG TCTCGGTGTT GATCGTGTCA AACCACCCTA AAAACTCTTC ACTAAATATT AAAGTATTGC TAGAACAGAG CTTCAAGATA TAAGTCATGA TCACCAACAA CCATGTTCAA AAAGAAATAG AAAGCTATGG CACAGCAACA AAAAGCAAAA GCATGCATGG ATATAATCTT TAACATCATC CATGTCATAT TGCAAAACAA TTAAAGAGAG AACAATACAA ATGATGTGTC AATTACACAT CCATCATTAT CCATCCACCT TCCGTGTACC ACACTTCATA TATCATGAGT CACTTCATGT CTGGACATTA ACAAACTCTA TCTTAACATT CAAATGCATG AGACTTTATC TCACTATAAA TGCACAATGA TTTAGCATTG TTTCTCACAA AACCATTCAA GTTCATTAGT ACTACAACAA
＞Ｇｔ１３ａΔ２８１／Ｄｅｌ
TGAAACAATA TTATGAGTAA TGTGTGAGCA TTATGGGACC ACGAAATAAA AAAAGAACAT TTTTATGAGC AGTGTGTTCT CAATGAGCCT TGAATGTTAT CACCCAGGAT AAGAAACCCT TAAGCAATGA AACATGCAAG CGTTTAATGT GCAAAGTTGG CATTCTCCAC GACATAATGC AAAAGAAGAT ATAATCTATG ACATAGCAAG TCATGCATCA TTTCATGCCT CTGTCAACCT ATTCATTTCT AGTCATCTAG GTAAGTATCT TAAGCTAAAG TGTTAGAACT TCCCATACAT GACAATTTGG TGTAACACAT GACAAACCAG AGAGTCAAGC AAGATAAAGC AAAAGGATGT GTACATAAAA CTACAGAGCT ATATGTCATG TTGCGAAAAG AGGAGAGCTT ATAAGACAAG CCATGACTCA AAAAAAATTC ACATGCCTAC TGTGGCCCAT ATATCATGCA ACAATCCAAA AACTCACAGG TCTCGGTGTT GATCGTGTCA AACCACCCTA AAAACTCTTC ACTAAATATT AAAGTATTGC TAGAACAGAG CTTCAAGATA TAAGTCATGA TCACCAACAA CCATGTTCAA AAAGAAATAG AAAGCTATGG CACAGCAACA AAAAGCAAAA GCATGCATGG ATATAATCTT TAACATCATC CATGTCATAT TGCAAAACAA TTAAAGAGAG AACAATACAA ATGATGTGTC AATTACACAT CCATCATTAT CCATCCACCT TCCGTGTACC ACACTTCATA TATCATGAGT CACTTCATGT CTGGACATTA ACAAACTCTA TCTTAACATT CAAATGCATG AGACTTTATC TCACTATAAA TGCACAATGA TTTAGCATTG TTTCTCACAA AACCATTCAA GTTCATTAGT ACTACAACAA
【0085】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
＞Ｇｔ１３ａΔ２８１＋ＧＣＮ４
TGAAACAATA TTATGAGTAA TGTGTGAGCA TTATGGGACC ACGAAATAAA AAAAGAACAT TTTTATGAGC AGTGTGTTCT CAATGAGCCT TGAATGTTAT CACCCAGGAT AAGAAACCCT TAAGCAATGA AACATGCAAG CGTTTAATGT GCAAAGTTGG CATTCTCCAC GACATAATGC AAAAGAAGAT ATAATCTATG ACATAGCAAG TCATGCATCA TTTCATGCCT CTGTCAACCT ATTCATTTCT AGTCATCTAG GTAAGTATCT TAAGCTAAAG TGTTAGAACT TCCCATACAT AAGTCATAAC TGATGACAAT TGGGTGTAAC ACATGACAAA CCAGAGAGTC AAGCAAGATA AAGCAAAAGG ATGTGTACAT AAAACTACAG AGCTATATGT CATGTTGCGA AAAGAGGAGA GCTTATAAGA CAAGCCATGA CTCAAAAAAA ATTCACATGC CTACTGTGGC CCATATATCA TGCAACAATC CAAAAACTCA CAGGTCTCGG TGTTGATCGT GTCAACATGT GACCACCCTA AAAACTCTTC ACTAAATATT AAAGTATTGC TAGAACAGAG CTTCAAGATA TAAGTCATGA TCACCAACAA CCATGTTCAA AAAGAAATAG AAAGCTATGG CACAGCAACA AAAAGCAAAA GCATGCATGG ATATAATCTT TAACATCATC CATGTCATAT TGCAAAAGAA AGAAAGAGAG AACAATACAA ATGATGTGTC AATTACACAT CCATCATTAT CCATCCACCT TCCGTGTACC ACACTTCATA TATCATGAGT CACTTCATAT ATCATGAGTC ACTTCATGTC TGGACATTAA CAAACTCTAT CTTAACATTA ACAAACTCTA TCTTAACATT CAAATGCATG AGACTTTATC TCACTATAAA TGCACAATGA TTTAGCATTG TTTCTCACAA AACCATTCAA GTTCATTAGT ACTACAACAA
＞Ｇｔ１３ａΔ２８１＋ＧＣＮ４
TGAAACAATA TTATGAGTAA TGTGTGAGCA TTATGGGACC ACGAAATAAA AAAAGAACAT TTTTATGAGC AGTGTGTTCT CAATGAGCCT TGAATGTTAT CACCCAGGAT AAGAAACCCT TAAGCAATGA AACATGCAAG CGTTTAATGT GCAAAGTTGG CATTCTCCAC GACATAATGC AAAAGAAGAT ATAATCTATG ACATAGCAAG TCATGCATCA TTTCATGCCT CTGTCAACCT ATTCATTTCT AGTCATCTAG GTAAGTATCT TAAGCTAAAG TGTTAGAACT TCCCATACAT AAGTCATAAC TGATGACAAT TGGGTGTAAC ACATGACAAA CCAGAGAGTC AAGCAAGATA AAGCAAAAGG ATGTGTACAT AAAACTACAG AGCTATATGT CATGTTGCGA AAAGAGGAGA GCTTATAAGA CAAGCCATGA CTCAAAAAAA ATTCACATGC CTACTGTGGC CCATATATCA TGCAACAATC CAAAAACTCA CAGGTCTCGG TGTTGATCGT GTCAACATGT GACCACCCTA AAAACTCTTC ACTAAATATT AAAGTATTGC TAGAACAGAG CTTCAAGATA TAAGTCATGA TCACCAACAA CCATGTTCAA AAAGAAATAG AAAGCTATGG CACAGCAACA AAAAGCAAAA GCATGCATGG ATATAATCTT TAACATCATC CATGTCATAT TGCAAAAGAA AGAAAGAGAG AACAATACAA ATGATGTGTC AATTACACAT CCATCATTAT CCATCCACCT TCCGTGTACC ACACTTCATA TATCATGAGT CACTTCATAT ATCATGAGTC ACTTCATGTC TGGACATTAA CAAACTCTAT CTTAACATTA ACAAACTCTA TCTTAACATT CAAATGCATG AGACTTTATC TCACTATAAA TGCACAATGA TTTAGCATTG TTTCTCACAA AACCATTCAA GTTCATTAGT ACTACAACAA
【0086】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
＞Ｇｔ１３ａ （Ｃｏｎｔｒｏｌ）
TCACACCTTA TGTAAAGTAT TTGTTGCAAG AAAAGTCTAA GATGACAGCA ACCTGCTGAG AAGAACAACT GACGATGTCA TAAGGAGAGG GAGCTTTTCG ATAGGTGCCG TGCAGTTCAA AGAGTTAGTT AGCAGTAGGA TGAAGATTTT TGCACATGGC AATGAGAAGT TAATTATGGT GTAGGCAACC CAAATGAAAC ACCAAAATAT GCACAAGACA GTTTGTTGTA TTCTGTAGTA CAGAATAAAC TAAAGTAATG AAAGAAGATG GTGTTAGAAA ATGAAACAAT ATTATGAGTA ATGTGTGAGC ATTATGGGAC CACGAAATAA AAAAAGAACA TTTTTATGAG CAGTGTGTTC TCAATGAGCC TTGAATGTTA TCACCCAGGA TAAGAAACCC TTAAGCAATG AAACATGCAA GCGTTTAATG TGCAAAGTTG GCATTCTCCA CGACATAATG CAAAAGAAGA TATAATCTAT GACATAGCAA GTCATGCATC ATTTCATGCC TCTGTCAACC TATTCATTTC TAGTCATCTA GGTAAGTATC TTAAGCTAAA GTGTTAGAAC TTCCCATACA TAAGTCATAA CTGATGACAA TTGGGTGTAA CACATGACAA ACCAGAGAGT CAAGCAAGAT AAAGCAAAAG GATGTGTACA TAAAACTACA GAGCTATATG TCATGTTGCG AAAAGAGGAG AGCTTATAAG ACAAGCCATG ACTCAAAAAA AATTCACATG CCTACTGTGG CCCATATATC ATGCAACAAT CCAAAAACTC ACAGGTCTCG GTGTTGATCG TGTCAACATG TGACCACCCT AAAAACTCTT CACTAAATAT TAAAGTATTG CTAGAACAGA GCTTCAAGAT ATAAGTCATG ATCACCAACA ACCATGTTCA AAAAGAAATA GAAAGCTATG GCACAGCAAC AAAAAGCAAA AGCATGCATG GATATAATCT TTAACATCAT CCATGTCATA TTGCAAAAGA AAGAAAGAGA GAACAATACA AATGATGTGT CAATTACACA TCCATCATTA TCCATCCACC TTCCGTGTAC CACACTTCAT ATATCATGAG TCACTTCATG TCTGGACATT AACAAACTCT ATCTTAACAT TCAAATGCAT GAGACTTTAT CTCACTATAA ATGCACAATG ATTTAGCATT GTTTCTCACA AAACCATTCA AGTTCATTAG TACTACAACA A
＞Ｇｔ１３ａ （Ｃｏｎｔｒｏｌ）
TCACACCTTA TGTAAAGTAT TTGTTGCAAG AAAAGTCTAA GATGACAGCA ACCTGCTGAG AAGAACAACT GACGATGTCA TAAGGAGAGG GAGCTTTTCG ATAGGTGCCG TGCAGTTCAA AGAGTTAGTT AGCAGTAGGA TGAAGATTTT TGCACATGGC AATGAGAAGT TAATTATGGT GTAGGCAACC CAAATGAAAC ACCAAAATAT GCACAAGACA GTTTGTTGTA TTCTGTAGTA CAGAATAAAC TAAAGTAATG AAAGAAGATG GTGTTAGAAA ATGAAACAAT ATTATGAGTA ATGTGTGAGC ATTATGGGAC CACGAAATAA AAAAAGAACA TTTTTATGAG CAGTGTGTTC TCAATGAGCC TTGAATGTTA TCACCCAGGA TAAGAAACCC TTAAGCAATG AAACATGCAA GCGTTTAATG TGCAAAGTTG GCATTCTCCA CGACATAATG CAAAAGAAGA TATAATCTAT GACATAGCAA GTCATGCATC ATTTCATGCC TCTGTCAACC TATTCATTTC TAGTCATCTA GGTAAGTATC TTAAGCTAAA GTGTTAGAAC TTCCCATACA TAAGTCATAA CTGATGACAA TTGGGTGTAA CACATGACAA ACCAGAGAGT CAAGCAAGAT AAAGCAAAAG GATGTGTACA TAAAACTACA GAGCTATATG TCATGTTGCG AAAAGAGGAG AGCTTATAAG ACAAGCCATG ACTCAAAAAA AATTCACATG CCTACTGTGG CCCATATATC ATGCAACAAT CCAAAAACTC ACAGGTCTCG GTGTTGATCG TGTCAACATG TGACCACCCT AAAAACTCTT CACTAAATAT TAAAGTATTG CTAGAACAGA GCTTCAAGAT ATAAGTCATG ATCACCAACA ACCATGTTCA AAAAGAAATA GAAAGCTATG GCACAGCAAC AAAAAGCAAA AGCATGCATG GATATAATCT TTAACATCAT CCATGTCATA TTGCAAAAGA AAGAAAGAGA GAACAATACA AATGATGTGT CAATTACACA TCCATCATTA TCCATCCACC TTCCGTGTAC CACACTTCAT ATATCATGAG TCACTTCATG TCTGGACATT AACAAACTCT ATCTTAACAT TCAAATGCAT GAGACTTTAT CTCACTATAA ATGCACAATG ATTTAGCATT GTTTCTCACA AAACCATTCA AGTTCATTAG TACTACAACA A
【0087】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
＞ＦＳＡ－ＤＮＡ
GAGTCTAGCG GAGGCCCACC AGAGCGAGAT CGCCCACCGC TTCAACGACC TCGGCGAGGA GCACTTCCGC GGCCTCGTGC TCGTGGCCTT CAGCCAGTAC CTCCAGCAGT GCCCGTTCGA GGACCACGTG AAGCTCGTGA ACGAGGTGAC CGAGTTCGCC AAGGGCTGCG TGGCCGACCA GAGCGCCGCC AACTGCGAGA AGAGCCTCCA CGAGCTCCTC GGCGACAAGC TCTGCACCGT GGCCAGCCTC CGCGACAAGT ACGGCGAGAT GGCCGACTGC TGCGAGAAGA AGGAGCCGGA GCGCAACGAG TGCTTCCTCC AGCACAAGGA CGACAACCCG GGCTTCGGCC AGCTCGTGAC CCCGGAGGCC GACGCCATGT GCACCGCCTT CCACGAGAAC GAGCAGCGCT TCCTCGGCAA GTACCTCTAC GAGATCGCCC GCCGCCACCC GTACTTCTAC GCCCCGGAGC TCCTCTACTA CGCCGAGGAG TACAAGGGCG TGTTCACCGA GTGCTGCGAG GCCGCCGACA AGGCCGCCTG CCTCACCCCG AAGGTGGACG CCCTCCGCGA GAAGGTGCTC GCCAGCAGCG CCAAGGAGCG CCTCAAGTGC GCCAGCCTCC AGAAGTTCGG CGAGCGCGCC TTCAAGGCCT GGAGCGTGGC CCGCCTCAGC CAGAAGTTCC CGAAGGCCGA GTTCGCCGAG ATCAGCAAGC TCGTGACCGA CCTCGCCAAG ATCCACAAGG AGTGCTGCCA CGGCGACCTC CTAGAGTGCG CCGACGACCG CGCCGACCTC GCCAAGTACA TCTGCGAGAA CCAGGACAGC ATCAGCACCA AGCTCAAGGA GTGCTGCGGC AAGCCGGTGC TAGAGAAGAG CCACTGCATC AGCGAGGTGG AGCGCGACGA GCTCCCGGCC GACCTCCCGC CGCTCGCCGT GGACTTCGTG GAGGACAAGG AGGTGTGCAA GAACTACCAG GAGGCCAAGG ACGTGTTCCT CGGCACCTTC CTCTACGAGT ACAGCCGCCG CCACCCGGAG TACAGCGTGA GCCTCCTCCT CCGCCTCGCC AAGGAGTACG AGGCCACCCT AGAGAAGTGC TGCGCCACCG ACGACCCGCC GGCCTGCTAC GCCCACGTGT TCGACGAGTT CAAGCCGCTC GTGGAGGAGC CGCACAACCT CGTGAAGACC AACTGCGAGC TCTTCGAGAA GCTCGGCGAG TACGGCTTCC AGAACGCCCT CCTCGTGCGC TACACCAAGA AGGTGCCGCA GGTGAGCACC CCGACCCTCG TGGAGGTGAG CCGCAGCCTC GGCAAGGTGG GCAGCAAGTG CTGCACCCAC CCGGAGGCCG AGCGCCTCAG CTGCGCCGAG GACTACCTCA GCGTGGTGCT CAACCGCCTC TGCGTGCTCC ACGAGAAGAC CCCGGTGAGC GAGCGCGTGA CCAAGTGCTG CACCGAGAGC CTCGTGAACC GCCGCCCGTG CTTCAGCGCC CTCCAGGTGG ACGAGACCTA CGTGCCGAAG GAGTTCAGCG CCGAGACCTT CACCTTCCAC GCCGACCTCT GCACCCTCCC GGAGGCCGAG AAGCAGATCA AGAAGCAGAG CGCCCTCGTG GAGCTCCTCA AGCACAAGCC GAAGGCCACC GAGGAGCAGC TCAAGACCGT GATGGGCGAC TTCGGCAGCT TCGTGGACAA GTGCTGCGCC GCCGAGGACA AGGAGGCCTG CTTCGCCGAG GAGGGCCCGA AGCTCGTGGC CGCCGCCCAG GCCGCCCTCG CCTGAGCTCG AG
＞ＦＳＡ－ＤＮＡ
GAGTCTAGCG GAGGCCCACC AGAGCGAGAT CGCCCACCGC TTCAACGACC TCGGCGAGGA GCACTTCCGC GGCCTCGTGC TCGTGGCCTT CAGCCAGTAC CTCCAGCAGT GCCCGTTCGA GGACCACGTG AAGCTCGTGA ACGAGGTGAC CGAGTTCGCC AAGGGCTGCG TGGCCGACCA GAGCGCCGCC AACTGCGAGA AGAGCCTCCA CGAGCTCCTC GGCGACAAGC TCTGCACCGT GGCCAGCCTC CGCGACAAGT ACGGCGAGAT GGCCGACTGC TGCGAGAAGA AGGAGCCGGA GCGCAACGAG TGCTTCCTCC AGCACAAGGA CGACAACCCG GGCTTCGGCC AGCTCGTGAC CCCGGAGGCC GACGCCATGT GCACCGCCTT CCACGAGAAC GAGCAGCGCT TCCTCGGCAA GTACCTCTAC GAGATCGCCC GCCGCCACCC GTACTTCTAC GCCCCGGAGC TCCTCTACTA CGCCGAGGAG TACAAGGGCG TGTTCACCGA GTGCTGCGAG GCCGCCGACA AGGCCGCCTG CCTCACCCCG AAGGTGGACG CCCTCCGCGA GAAGGTGCTC GCCAGCAGCG CCAAGGAGCG CCTCAAGTGC GCCAGCCTCC AGAAGTTCGG CGAGCGCGCC TTCAAGGCCT GGAGCGTGGC CCGCCTCAGC CAGAAGTTCC CGAAGGCCGA GTTCGCCGAG ATCAGCAAGC TCGTGACCGA CCTCGCCAAG ATCCACAAGG AGTGCTGCCA CGGCGACCTC CTAGAGTGCG CCGACGACCG CGCCGACCTC GCCAAGTACA TCTGCGAGAA CCAGGACAGC ATCAGCACCA AGCTCAAGGA GTGCTGCGGC AAGCCGGTGC TAGAGAAGAG CCACTGCATC AGCGAGGTGG AGCGCGACGA GCTCCCGGCC GACCTCCCGC CGCTCGCCGT GGACTTCGTG GAGGACAAGG AGGTGTGCAA GAACTACCAG GAGGCCAAGG ACGTGTTCCT CGGCACCTTC CTCTACGAGT ACAGCCGCCG CCACCCGGAG TACAGCGTGA GCCTCCTCCT CCGCCTCGCC AAGGAGTACG AGGCCACCCT AGAGAAGTGC TGCGCCACCG ACGACCCGCC GGCCTGCTAC GCCCACGTGT TCGACGAGTT CAAGCCGCTC GTGGAGGAGC CGCACAACCT CGTGAAGACC AACTGCGAGC TCTTCGAGAA GCTCGGCGAG TACGGCTTCC AGAACGCCCT CCTCGTGCGC TACACCAAGA AGGTGCCGCA GGTGAGCACC CCGACCCTCG TGGAGGTGAG CCGCAGCCTC GGCAAGGTGG GCAGCAAGTG CTGCACCCAC CCGGAGGCCG AGCGCCTCAG CTGCGCCGAG GACTACCTCA GCGTGGTGCT CAACCGCCTC TGCGTGCTCC ACGAGAAGAC CCCGGTGAGC GAGCGCGTGA CCAAGTGCTG CACCGAGAGC CTCGTGAACC GCCGCCCGTG CTTCAGCGCC CTCCAGGTGG ACGAGACCTA CGTGCCGAAG GAGTTCAGCG CCGAGACCTT CACCTTCCAC GCCGACCTCT GCACCCTCCC GGAGGCCGAG AAGCAGATCA AGAAGCAGAG CGCCCTCGTG GAGCTCCTCA AGCACAAGCC GAAGGCCACC GAGGAGCAGC TCAAGACCGT GATGGGCGAC TTCGGCAGCT TCGTGGACAA GTGCTGCGCC GCCGAGGACA AGGAGGCCTG CTTCGCCGAG GAGGGCCCGA AGCTCGTGGC CGCCGCCCAG GCCGCCCTCG CCTGAGCTCG AG
【0088】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８
＞ＦＳＡ－ＡＡ
EAHQSEIAHR FNDLGEEHFR GLVLVAFSQY LQQCPFEDHV KLVNEVTEFA KGCVADQSAA NCEKSLHELL GDKLCTVASL RDKYGEMADC CEKKEPERNE CFLQHKDDNP GFGQLVTPEA DAMCTAFHEN EQRFLGKYLY EIARRHPYFY APELLYYAEE YKGVFTECCE AADKAACLTP KVDALREKVL ASSAKERLKC ASLQKFGERA FKAWSVARLS QKFPKAEFAE ISKLVTDLAK IHKECCHGDL LECADDRADL AKYICENQDS ISTKLKECCG KPVLEKSHCI SEVERDELPA DLPPLAVDFV EDKEVCKNYQ EAKDVFLGTF LYEYSRRHPE YSVSLLLRLA KEYEATLEKC CATDDPPACY AHVFDEFKPL VEEPHNLVKT NCELFEKLGE YGFQNALLVR YTKKVPQVST PTLVEVSRSL GKVGSKCCTH PEAERLSCAE DYLSVVLNRL CVLHEKTPVS ERVTKCCTES LVNRRPCFSA LQVDETYVPK EFSAETFTFH ADLCTLPEAE KQIKKQSALV ELLKHKPKAT EEQLKTVMGD FGSFVDKCCA AEDKEACFAE EGPKLVAAAQ AALA
＞ＦＳＡ－ＡＡ
EAHQSEIAHR FNDLGEEHFR GLVLVAFSQY LQQCPFEDHV KLVNEVTEFA KGCVADQSAA NCEKSLHELL GDKLCTVASL RDKYGEMADC CEKKEPERNE CFLQHKDDNP GFGQLVTPEA DAMCTAFHEN EQRFLGKYLY EIARRHPYFY APELLYYAEE YKGVFTECCE AADKAACLTP KVDALREKVL ASSAKERLKC ASLQKFGERA FKAWSVARLS QKFPKAEFAE ISKLVTDLAK IHKECCHGDL LECADDRADL AKYICENQDS ISTKLKECCG KPVLEKSHCI SEVERDELPA DLPPLAVDFV EDKEVCKNYQ EAKDVFLGTF LYEYSRRHPE YSVSLLLRLA KEYEATLEKC CATDDPPACY AHVFDEFKPL VEEPHNLVKT NCELFEKLGE YGFQNALLVR YTKKVPQVST PTLVEVSRSL GKVGSKCCTH PEAERLSCAE DYLSVVLNRL CVLHEKTPVS ERVTKCCTES LVNRRPCFSA LQVDETYVPK EFSAETFTFH ADLCTLPEAE KQIKKQSALV ELLKHKPKAT EEQLKTVMGD FGSFVDKCCA AEDKEACFAE EGPKLVAAAQ AALA
【0089】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９
＞ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ
AGCTACCAGG GCAACAGCGA
＞ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ
AGCTACCAGG GCAACAGCGA
【0090】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０
＞ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ
ATCTCGTAGA GGTACTTGCC GA
＞ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ
ATCTCGTAGA GGTACTTGCC GA
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】