特許 7576806 テトラサイクリンとＣｕｍａｔｅに基づく共制御配列

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-24

(45)【発行日】2024-11-01

(54)【発明の名称】テトラサイクリンとＣｕｍａｔｅに基づく共制御配列

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20241025BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241025BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241025BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241025BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241025BHJP

【ＦＩ】

C12N15/63 100Z

C12N1/15 ZNA

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2022571240

(86)(22)【出願日】2020-09-16

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-04

(86)【国際出願番号】 CN2020115520

(87)【国際公開番号】W WO2021232632

(87)【国際公開日】2021-11-25

【審査請求日】2023-01-20

(31)【優先権主張番号】202010442506.3

(32)【優先日】2020-05-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】522414475

【氏名又は名称】シンセン・エウレカ・バイオテクノロジー・カンパニー・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＥＮＺＨＥＮ ＥＵＲＥＫＡ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】シュエ，ボォーフゥ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，インフゥイ

(72)【発明者】

【氏名】リウ，クゥー

(72)【発明者】

【氏名】マー，モー

【審査官】岡部 佐知子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第０２／０８８３４６（ＷＯ，Ａ２）

【文献】Molecular Therapy，2008年，Vol.16, No.3，PP.500-507

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／６３

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

テトラサイクリンによって制御されたトランスアクチベーターｒｔＴＡに結合できる少なくとも２コピーのＴｅｔＯ－オペレーター配列と、ＴＡＴＡボックス配列を含む１コピーの最小プロモーター配列と、ｃｕｍａｔｅによって制御された転写抑制因子ＣｙｍＲに結合できる少なくとも１コピーのＣｕＯ－オペレーター配列とを、この順番で含む核酸分子であって、前記ＣｕＯ－オペレーター配列は、前記ＴＡＴＡボックス配列の３’端の下流にあり、前記ＴＡＴＡボックスとの距離間隔は、３０ｂｐ～５０ｂｐである核酸分子。

【請求項2】

前記ＣｕＯ－オペレーター配列と前記ＴＡＴＡボックスとの距離間隔は、５０ｂｐである、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項3】

前記ＴｅｔＯ－オペレーター配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示され、及び／又は前記最小プロモーター配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示され、及び／又は前記ＣｕＯ－オペレーター配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示される、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項4】

前記核酸分子の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示される、請求項３に記載の核酸分子。

【請求項5】

３’端にスプライシング可能なイントロン配列をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項7】

前記ベクターは、発現ベクターであり、前記発現ベクターは、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子の３’端の下流にある目的核酸断片を含み、前記目的核酸断片の転写は、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子によって制御される、請求項６に記載のベクター。

【請求項8】

請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項６又は７に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項9】

請求項７に記載のベクター、ｒｔＴＡのコード配列及びＣｙｍＲのコード配列を宿主細胞に導入するステップ（１）と、
（１）を経た前記宿主細胞においてｒｔＴＡとＣｙｍＲを発現するステップ（２）と、
（２）を経た前記宿主細胞にテトラサイクリン又はその誘導体及びｃｕｍａｔｅ又はその機能的類似体を提供するステップ（３）と、
を含み、
ここで、前記誘導体は、ドキシサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン及びデオキシテトラサイクリンからなる群から選択され、そして
前記機能的類似体は、ｐ－エチル安息香酸、ｐ－プロピル安息香酸、ｐ－イソプロピル安息香酸、ｐ－イソブチル安息香酸、ｐ－ｔｅｒｔ－ブチル安息香酸、ｐ－ｎ－ジメチルアミノ安息香酸及びｐ－ｎ－エチルアミノ安息香酸からなる群から選択される、
前記宿主細胞において目的核酸断片の発現を誘導する方法。

【請求項10】

前記ｒｔＴＡは、ｒｔＴＡ_ａｄｖ又はｒｔＴＡ_３Ｇである、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記ｒｔＴＡのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８に示される、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

前記ＣｙｍＲのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５に示される、請求項９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、目的核酸断片の転写を制御するための、テトラサイクリンとＣｕｍａｔｅ依存性の核酸配列に関する。具体的には、本開示は、目的核酸断片の転写を制御するための核酸配列に関し、前記核酸配列は、リバーステトラサイクリン依存性のトランスアクチベーター（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ、ｒｔＴＡ）に結合する少なくとも２コピーのＴｅｔＯ－オペレーター配列（Ｔｅｔ ｏｐｅｒａｔｏｒ、ＴｅｔＯ）と、ＴＡＴＡボックス配列を含む１コピーの最小プロモーター配列と、ＣｙｍＲ転写抑制因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）に結合する少なくとも１コピーのＣｕＯ－オペレーター配列（Ｃｕｍａｔｅ ｏｐｅｒａｔｏｒ、ＣｕＯ）と、を含む。さらに、上記核酸配列の３’端の下流と、制御された目的核酸断片の５’端の上流との間にスプライシング可能なイントロン配列がさらに存在し、それは、誘導なしのリークがないまま、誘導後の転写活性をさらに向上させることに用いることができる。さらに、本開示は、以上の制御配列を含むベクター、ウィルス、細胞、トランスジェニック植物又は動物にさらに関する。

【背景技術】

【0002】

遺伝子発現は、転写、ＲＮＡスプライシング、翻訳と翻訳後修飾を含むいくつかのステップを制御することによって、遺伝子発現への制御を実現することができ、転写ステップで特定の遺伝子又は目的核酸断片を制御することは最も広く、最も有効な発現制御方式である。細胞、植物又は動物体内の特定の遺伝子及び核酸断片の転写及び発現のオン又はオフを外因性要素によって制御する誘導発現系は、生物基礎科学研究、生物製薬、遺伝子治療、細胞治療、トランスジェニック植物又は動物の改良などの分野で重要な役割を果たしている。通常、上記誘導発現系は、設計上に、１）一般的に転写活性化因子又は抑制因子に結合して目的核酸断片の転写を制御することができる、オペレータ（ｏｐｅｒａｔｏｒ）を含む核酸配列のような、制御された目的核酸断片の５’端の上流にある１部の特定核酸配列（この核酸配列は、以下で応答エレメントと呼ばれる）、２）外部要素の制御下で上記特定の核酸配列に結合又は分離することができ、一般的に転写活性化又は抑制機能を有し、通常は発現タンパク質である単一又は複数の制御因子２つの部分からなる。外部要素は、温度、光などの環境要素であってもよく、又は、生命活動に関与する代謝物、ホルモン、金属イオン、人工化合物などの成分物質であってもよい。

【0003】

「テトラサイクリン誘導発現系（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｓｙｓｔｅｍ又はＴｅｔ Ｓｙｓｔｅｍ）」は、現在では科学研究と商業上で最も広く使用されている誘導発現系のうちの１つである（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｈ．Ｂｕｊａｒｄ（１９９２）．「Ｔｉｇｈｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８９（１２）：５５４７－５５５１．，米国特許番号５，８８８，９８１， ５，８１４，６１８， ６，００４，９４１， ５，８１４，６１８， ７，５４１，４４６，ＷＯ９６／０１３１３とＷＯ００／７５３４７を参照する（上記文献は、参照としてここに取り込まれる））。それは、テトラサイクリン依存性の制御因子と、ＴｅｔＯオペレーターを含む応答エレメントとで構成され、ＴｅｔＯオペレーターを含む応答エレメントに連結された目的核酸断片の転写をテトラサイクリン誘導の方式で調節する。ＴｅｔＯオペレーターを含む応答エレメントは、テトラサイクリンのない条件下で転写活性化因子に結合し、結合後に下流の制御された目的核酸断片の転写を開始することができ、組成型アクティブプロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の下流、制御された目的核酸断片の上流に、テトラサイクリンのない条件下でテトラサイクリン依存性の抑制因子に結合し、下流の制御された目的核酸断片の転写を抑制することもできる。従来には、テトラサイクリン依存性の制御因子は、テトラサイクリンがない条件下ではＴｅｔＯオペレーターに結合し、テトラサイクリンがある条件下ではＴｅｔＯオペレーターから分離する。例えばこの原理に基づいて設計された活性化因子は、環境におけるテトラサイクリンを除去することによって、制御された目的核酸断片の転写を開始することができる（米国特許番号５，４６４，７５８，６，９１４，１２４，５，７８９，１５６，６，２７１，３４８，ＷＯ９６／０１３１３とＷＯ００／７５３４７）。その後に、リバーステトラサイクリン依存性の制御因子が開発され、それは、テトラサイクリンがある条件下でのみＴｅｔＯオペレーターに結合する。リバーステトラサイクリン依存性の活性化因子は、環境においてテトラサイクリンを添加することにより、制御された目的核酸断片の転写を活性化することができ（米国特許番号５，６５４，１６８， ６，１３６，９５４， ５，７８９，１５６， ６，２７１，３４８， ６，０８７，１６６， ６，２７１，３４１， ７，５４１，４４６，ＷＯ９６／０１３１３とＷＯ００／７５３４７）、例えば、培地においてテトラサイクリンを添加することにより、制御された目的核酸断片の転写を活性化するか、又はトランスジェニック動物にテトラサイクリンを投与して遺伝子工学によって体内に導入された制御された目的遺伝子の転写と発現を活性化する。

【0004】

誘導条件下での制御された核酸断片の転写活性と非誘導条件でのリーク転写活性は、誘導発現系の優劣を評価する２つの重要な指標であり、良い誘導発現系は、より高い誘導転写活性とより低いリーク転写活性を有する必要がある。テトラサイクリン誘導系は、１回目の報告以来、多くの実験室で最適化され、その性能は、向上し続けている。主な最適化は、テトラサイクリン依存性の制御因子と、ＴｅｔＯオペレーターを含む応答エレメントとを含む。テトラサイクリン依存性の制御因子の最適化は、主に以下に集中されている：（１）誘導後の転写活性をできるだけ維持する状況下で、無誘導条件下でのリーク転写活性を低下させ、誘導／リーク転写活性の比を高める。（２）制御因子とテトラサイクリン及びその誘導体を誘導剤として結合する特異性と親和性を最適化し、より低いテトラサイクリン及びその誘導体の濃度で最大の誘導転写活性に達するとともに、誘導剤のない条件での制御因子と応答エレメントの親和性を低下させる。（Ｚｈｏｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）．「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｅｔ－Ｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｖｉｒａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．」Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３（１９）：１３８２－１３９０．，米国特許番号８，３８３，３６４， ７，５４１，４４６を参照する）。ＴｅｔＯオペレーターを含む応答エレメントを最適化することは、主に以下に集中されている：（１）ＴｅｔＯオペレーターのコピー数と連結配列を最適化する。応答エレメントの性能を向上させるとともに、マルチコピー連続ＴｅｔＯオペレーター配列の安定性特にウイルスベクター上での安定性を向上させる。（２）誘導後の転写活性に顕著な影響を与えない条件下で、最小プロモーター（ｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の無誘導基礎リーク転写活性を低下させ、誘導／リーク転写活性の比を高める（Ｌｏｅｗ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｅｔ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｗｉｔｈ ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．」ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １０：８１．，米国特許番号９，１８１，５５６を参照する）。現在では広く使用されている商業テトラサイクリン誘導系は、主にＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社のＴｅｔ－Ｏｎ(R) Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ファイル番号：ＰＴ３８９８－１（１０２３１２）であり、そのうちのテトラサイクリン依存性のトランスアクチベーターｒｔＴＡと、ＴｅｔＯオペレーターを含む応答エレメントＴＲＥ（マルチコピーの連続ＴｅｔＯオペレーター配列と最小プロモーター配列を含む核酸配列、 Ｔｅｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ、以下ではＴＲＥと呼ばれる）は、以下でそれぞれｒｔＴＡ_ａｄｖとＴＲＥ_ａｄｖと呼ばれる）、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ(R) Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ファイル番号：ＰＴ３９４５－１（１０１６１２））とＴｅｔ－Ｏｎ(R) ３Ｇ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ファイル番号：ＰＴ５１４８－１（０１０８１４）、そのうちのテトラサイクリン依存性の制御因子ｒｔＴＡと、ＴｅｔＯオペレーターを含む応答エレメントＴＲＥは、以下でそれぞれｒｔＴＡ_３ＧとＴＲＥ_３Ｇと呼ばれる）である。

【0005】

Ｃｕｍａｔｅ誘導系（Ｃｕｍａｔｅ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａのｐ－ｃｙｍオペロンから開発され、組成型活性プロモーターＴＡＴＡボックスの下流にあるＣｕＯオペレーターとＣｕｍａｔｅ及びその誘導体依存性の、ＣｕＯオペレーターに結合できる抑制因子ＣｙｍＲタンパク質からなる。Ｃｕｍａｔｅがない条件下で、ＣｙｍＲタンパク質は、ＣｕＯオペレーターに結合し、下流で制御された目的核酸断片の転写を抑制し、ＣｙｍＲタンパクがＣｕｍａｔｅに結合すると、それとＣｕＯオペレーターとの親和性が低下して分離され、下流で制御された目的核酸断片の転写が抑制されなくなった。例えばＣｕＯオペレーターを制御された目的核酸断片と組成型活性プロモーター配列との間に連結するとともに、細胞内にＣｙｍＲ抑制因子を組成的に活発に発現させる。培地においてＣｕｍａｔｅ及びその誘導体誘導剤がない場合、発現したＣｙｍＲタンパク質は、ＣｕＯオペレーターに結合して制御された目的核酸断片の転写を阻害し、培地に誘導剤が添加された場合、Ｃｕｍａｔｅ及びその誘導体に結合したＣｙｍＲタンパク質とＣｕＯオペレーターとが分離し、制御された目的核酸断片の転写が阻害されなくなった（ＷＯ０２０８８３４６Ａ２、ＷＯ２００６０３７２１５Ａ１を参照する（上記文献は、参照としてここに取り込まれる）。

【0006】

Ｃｕｍａｔｅ誘導系の最適化は、以下に集中されている：（１）最短の有効ＣｕＯオペレーター配列を最適化する。（２）水に溶けることができる、ｐ－ｃｕｍａｔｅと機能的に類似したＣｕｍａｔｅ及び誘導体誘導剤をスクリーニングする。（３）ＣｙｍＲ活性化因子（例えば、ＣｙｍＲとＨＳＶ ＶＰ－１６転写活性化ドメインを構築する融合タンパク質）と、マルチコピーの連続ＣｕＯオペレーターを含む応答エレメント（配列は、複数の反復ＣｕＯ配列と下流の最小プロモーターとを含む）からなるＴｅｔ－Ｏｆｆに類似した誘導系を構築する。Ｃｕｍａｔｅ誘導剤がない条件下で、ＣｙｍＲ活性化因子は、ＣｕＯオペレーターに結合して制御された目的核酸断片の転写を活性化し、Ｃｕｍａｔｅ誘導剤がある条件下で、ＣｙｍＲ活性化因子は、ＣｕＯオペレーターから分離し、制御された目的核酸断片の転写が停止される。（４）リバースＣｙｍＲ活性化因子（突然変異とスクリーニングによって、リバースＣｙｍＲは、Ｃｕｍａｔｅ誘導剤がある時にＣｕＯオペレーターに結合し、Ｃｕｍａｔｅ誘導剤がない時にＣｕＯオペレーターから分離し、リバースＣｙｍＲとＨＳＶ ＶＰ－１６転写活性化ドメインの融和タンパク質を構築してリバースＣｙｍＲ活性化因子とする）と、マルチコピーの連続ＣｕＯオペレーターを含む応答エレメントからなるＴｅｔ－Ｏｎに類似した誘導系を構築する。Ｃｕｍａｔｅ誘導剤がある条件下で、リバースＣｙｍＲ活性化因子は、応答エレメントに結合し、制御された目的核酸断片の転写を活性化し、Ｃｕｍａｔｅ誘導剤がない条件下で、リバースＣｙｍＲ活性化因子は、応答エレメントから分離し、制御された目的核酸断片の転写を停止した（Ｍｕｌｌｉｃｋ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）．「Ｔｈｅ ｃｕｍａｔｅ ｇｅｎｅ－ｓｗｉｔｃｈ：ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．」ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ６：４３．； ＷＯ０２０８８３４６Ａ２、ＷＯ２００６０３７２１５Ａ１を参照する）。現在では広く使用されているＣｕｍａｔｅ誘導系は、主にＳＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＳｐａｒＱ Ｃｕｍａｔｅ Ｓｗｉｔｃｈシステム（ファイル番号：１－０９０８１０）である。

【0007】

現在の様々な誘導発現系の開発と改良において、主な最適化は、いずれも無誘導条件下での制御された目的核酸断片の基礎リーク転写活性の制御に集中されており、誘導条件下での転写活性は、最適化の重点ではないため、誘導発現系によって制御された目的核酸断片の誘導後転写活性は、一般的な組成型活性プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の制御下での転写活性よりも低い。バイオテクノロジーの開発において、目的核酸断片の誘導後の絶対転写活性を向上させることは、無誘導条件下でのリーク転写活性を制御することと同様に重要である。例えば、生物製薬分野において、細胞毒性を有する組換えタンパク質又はウイルスベクターを生産するには、目的核酸断片コードのタンパク質の誘導後の発現量を高める必要があるだけでなく、生産細胞株の培養状態と安定性を保証するために、目的核酸断片の無誘導条件下でのリーク発現量を制御する必要もある。そのため、誘導条件下での目的核酸断片の転写活性を向上させることができるとともに、無誘導条件下での該目的核酸断片のリーク転写活性を制御できる誘導発現系は、バイオテクノロジーの多くの分野での研究、開発と産業化を広範に促進することができる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本開示は、テトラサイクリンとＣｕｍａｔｅ依存性の、目的核酸断片転写を制御できる核酸配列に関し、具体的には、前記核酸配列は、リバーステトラサイクリン又はその誘導体依存性のトランスアクチベーター（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ、ｒｔＴＡ）に結合する少なくとも２コピーのＴｅｔＯオペレーター配列（Ｔｅｔ ｏｐｅｒａｔｏｒ、ＴｅｔＯ）と、ＴＡＴＡボックス配列を含む１コピーの最小プロモーター配列と、ＣｙｍＲ転写抑制因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）に結合する少なくとも１コピーのＣｕＯ－オペレーター配列（Ｃｕｍａｔｅ ｏｐｅｒａｔｏｒ、ＣｕＯ）と、を含む。さらに、上記核酸配列の３’端の下流と、制御された目的核酸断片の５’端の上流との間に存在するスプライシング可能なイントロン配列は、誘導なしのリークがないまま、誘導後の転写活性をさらに向上させることができる。さらに、本開示は、以上の制御配列を含み且つ遺伝子発現を制御することを目的とするベクター、ウィルス、細胞、トランスジェニック植物又は動物にさらに関する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

「目的核酸断片」という用語は、一般的にデオキシリボ核酸断片（ＤＮＡ断片）を指し、応用目的に基づいて、遺伝子、例えばタンパク質をコードする核酸配列を指してもよく、一部のリボ核酸（ＲＮＡ）、例えばＲＮＡウィルスの全部又は一部のゲノムＲＮＡ断片、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡと略称される）、小干渉リボ核酸（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡと略称される）、長鎖非コードリボ核酸（ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｄｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ、ＬｎｃＲＮＡと略称される）、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムのガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、ｇＲＮＡ）、転移リボ核酸（ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ、ｔＲＮＡと略称される）、リボソームリボ核酸（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ、ｒＲＮＡと略称される）、アプタマー（Ａｐｔａｍｅｒｓ）、他の核酸に結合できるリボ核酸断片、特定のタンパク質に結合できるリボ核酸断片、又は任意の一部のリボ核酸であってもよく、以上の一部又は複数の核酸配列の組み合わせであってもよい。

【0010】

「ベクター」という用語は、外来遺伝物質、例えば上記目的核酸断片を他の細胞に人為的に運搬し、その中で複製及び／又は発現させるための媒体として一般的に使用される内包核酸分子である。機能的には、すべてのベクターは、一般的に外来目的核酸断片のクローニングと運搬に用いることができ、同時に核酸断片の転写とタンパク質の発現のために特別に設計された発現ベクターもある。プラスミド、ウィルスベクター、コスミド（ｃｏｓｍｉｄｓ）と人工染色体は、ベクターの４つの主なタイプである。ここで、最も一般的に使用されるベクターは、プラスミドである。全てのエンジニアリングプラスミドベクターは、いずれも細菌内で複製された複製開始点と、目的核酸断片を挿入するためのマルチクローニングサイトと、陽性菌株を選択するためのマーカー遺伝子とを含む。ウィルスベクターは、別の一般的なベクターであり、通常は、遺伝物質、例えば目的核酸断片を細胞に搬送するために用いられる。このプロセスは、生体内（インビボ）又は細胞培養物内（インビトロ）で行うことができる。ウイルス自体が進化した様々な分子メカニズム、例えば、遺伝物質への保護、受容体に基づく宿主細胞への選択、宿主細胞内への遺伝物質の送達、宿主細胞内での複製及び／又は発現、宿主細胞の成長、代謝、増殖複製及び防御メカニズムへの調整、高等動物体内における免疫系への阻害及び／又は逃避に基づき、目的核酸断片を感染した標的細胞内に効果的に移転することができる。ウイルスベクターは、分子生物学的研究に用いられるほか、遺伝子治療、細胞治療、免疫治療、ワクチン開発にもよく用いられる。

【0011】

通常、誘導発現系は、制御された目的核酸断片の誘導後転写活性を増強するとともに、無誘導条件下でのリーク転写活性を増加させ、無誘導条件下でのリーク転写活性を制御する一般的なポリシー、例えば点突然変異によるトランスアクチベーターの誘導剤なし条件下でのオペレーターとの親和性の低下又はオペレーターの下流の最小プロモーターの基礎活性の低下は、いずれも誘導後の最大転写活性に影響を与える。これにより、ほとんどの単一誘導発現系は、いずれも無誘導条件下でのリーク転写活性を平衡化するために、誘導条件下で制御された目的核酸断片の転写活性化活性を低下させた。複数の制御コンポーネントを含む複合誘導発現系を設計することは、上記問題を解決する有効な方向である。本開示により実現された複合誘導発現系において、一方で、第１の誘導発現系における活性化因子と相応な応答エレメントとの組み合わせの誘導後の最大転写活性を最適化して向上させ、他方で、第２の誘導発現系における抑制因子と相応な応答エレメントとの組み合わせにより、複合誘導発現系の向上させたリーク転写活性を制御し、前記複合誘導発現系は、例えば第１の誘導発現系としてＴｅｔ－Ｏｎ誘導発現系を用い、第２の誘導発現系としてＣｕｍａｔｅ誘導発現系を用いる。上記複合誘導発現系の複合応答エレメント配列は、リバーステトラサイクリン又はその誘導体によって制御されたトランスアクチベーター（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ、ｒｔＴＡ）に結合する少なくとも２コピーのＴｅｔＯオペレーター配列（ｔｅｔ ｏｐｅｒａｔｏｒ）と、ＴＡＴＡボックス配列を含む１コピーの最小プロモーター配列と、ＣｙｍＲ転写抑制因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）に結合する少なくとも１コピーのＣｕＯオペレーター配列（ＣｕＯ ｏｐｅｒａｔｏｒ）と、を含む。

【0012】

本発明者らは、Ｔｅｔ－ＯｎとＣｕｍａｔｅ複合誘導発現系の誘導転写活性と誘導なしのリーク転写活性が、（１）マルチコピーＴｅｔＯオペレーター及びその連結核酸配列、（２）ＴＲＥ応答エレメントにける最小プロモーター配列、（３）ＣｕＯオペレーターと最小プロモーターにおけるＴＡＴＡボックスの相対位置の３つの条件の影響を受けることと、第３世代のＴｅｔ－ＯｎシステムにおけるＴＲＥ_３Ｇ応答エレメントが第２世代のＴｅｔ－ＯｎシステムにおけるＴＲＥ_ａｄｖ応答エレメントより厳密に制御され、より低い非誘導リーク転写活性があることと、ＣｕＯオペレーターとＴＡＴＡボックスとが近いほどリーク転写活性に対する制御が厳しくなるが、誘導転写活性に対する影響が大きくなり、遠いほどリーク転写活性に対する制御が弱くなるが誘導転写活性に対する影響が小さくなることとを発見した。以上の発見に基づき、目的核酸断片の転写を制御するための本開示の核酸配列は、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示される、テトラサイクリン又はその誘導体によって制御されたトランスアクチベーターｒｔＴＡに結合できる少なくとも２コピー（例えば２、３、４、５、６、７又はより多く、好ましくは７つ）のＴｅｔＯ－オペレーター配列と、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示され、より好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示される、ＴＡＴＡボックス配列を含む１部の最小プロモーター配列と、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示される、ｃｕｍａｔｅによって制御された転写抑制因子ＣｙｍＲに結合できるＣｕＯ－オペレーター配列と、を含む。好ましくは、少なくとも１つのＣｕＯオペレーター配列は、上記プロモーターＴＡＴＡボックスの下流にあり、好ましくはＴＡＴＡボックスの下流の１０ｂｐから１００ｂｐの間、例えば１４ｂｐ、３０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐにあり、さらに好ましくは、ＣｕＯ配列は、ＴＡＴＡボックスの下流の３０ｂｐから５０ｂｐの間に１つのみあり、さらに、ＣｕＯ配列は、ＴＡＴＡボックスの下流の３０ｂｐ又は５０ｂｐの位置に１つのみある。好ましくは、目的核酸断片の転写を制御するための本開示の核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示され、より好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示される。

【0013】

発現プラスミドにおけるプロモーターの下流にあるイントロンは、一般的にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写の安定性を向上させることができるとともに、ｍＲＮＡの細胞核外への転移効率を向上させることができる（Ａｋｅｆ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．「Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｐｏｒｔ ｏｆ ｂｅｔａ－ｇｌｏｂｉｎ ｍＲＮＡ ｂｙ ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｌｅｍｅｎｔｓ．」ＲＮＡ ２１（１１）：１９０８－１９２０を参照する）、そして目的核酸断片の発現量を向上させることができる。本発明者らは、単一誘導発現系における応答エレメントの３’端の下流にスプライシング可能なイントロンを連結することも同様に誘導後の制御された目的核酸断片の発現量を向上させることができるが、制御された目的核酸断片の誘導なしのリーク発現量を著しく増加させることができることを発見した。本開示に記載のテトラサイクリンとＣｕｍａｔｅ依存性の複合応答エレメント配列の３’端の下流と、制御された目的核酸断片の５’端の上流との間にスプライシング可能なイントロン配列を連結することは、誘導なしのリーク発現量を著しく増加させることなく、誘導発現量を著しく向上させることができる。これに基づき、本開示において、好ましくは、前記テトラサイクリンとＣｕｍａｔｅ依存性の複合応答エレメント配列の３’端の下流と、目的核酸断片の５’端の上流との間にスプライシング可能なイントロン断片を連結する。上記イントロンの選択には、特定の制限がなく、当業者が理解できるように、哺乳動物細胞においてＲＮＡスプライシング（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ）を行うことができる配列は、いずれも上記機能を実現することができる。選択可能なイントロン配列は、一般的なクローンベクター上のイントロン、例えばウサギβ－グロブリンイントロン、ヒトβ－グロブリンと免疫グロブリン重鎖イントロン由来のハイブリッドイントロン、ＥＦ－１αイントロンＡ、ＳＶ４０イントロン、アデノウイルスと免疫グロブリン重鎖イントロン由来のハイブリッドイントロン、修飾されたヒトサイトメガロウイルスイントロン、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）とマウスマイクロウィルス（ＭＭＶ）イントロン由来のハイブリッドイントロン、ニワトリβ－アクチンとウサギβ－グロブリンイントロン由来のキメラとｍＰ１イントロンを含むが、それらに限らず、任意の真核生物の任意の遺伝子の任意のイントロン、又は、イントロンスプライシング規則に基づいて設計された人工イントロン配列であってもよい。本開示の実施例で使用されるイントロン配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるものであってもよい。

【0014】

上記Ｔｅｔ－ＯｎとＣｕｍａｔｅ複合誘導発現系は、テトラサイクリン又はその誘導体とＣｕｍａｔｅ誘導剤（Ｃｕｍａｔｅ又はその機能的類似体）なしの環境で、ｒｔＴＡトランスアクチベーターは、複合応答エレメントに結合できず、同時にＣｙｍＲ抑制因子は、複合応答エレメントにおけるＣｕＯオペレーターに結合して、制御された目的核酸断片のｒｔＴＡトランスアクチベーターの非特異的結合又は最小プロモーターの基礎活性によるリーク転写活性をさらに阻害し、Ｃｕｍａｔｅ誘導剤のみの環境で、ｒｔＴＡトランスアクチベーターと、Ｃｕｍａｔｅ誘導剤に結合したＣｙｍＲ抑制因子は、いずれも複合応答エレメントに結合せず、制御された目的核酸断片は、ｒｔＴＡトランスアクチベーターの非特異的結合又は最小プロモーターの基礎活性により、極低量の転写を引き起こし、テトラサイクリン又はその誘導体のみの環境で、ｒｔＴＡトランスアクチベーターは、複合応答エレメントにおけるＴｅｔＯオペレーターに結合して制御された目的核酸断片転写を活性化するが、ＣｙｍＲ抑制因子は、同時に複合応答エレメントにおけるＣｕＯオペレーターに結合して制御された目的核酸断片を限定的に転写することができ、テトラサイクリン又はその誘導体とＣｕｍａｔｅ誘導剤とが共存する環境で、ｒｔＴＡトランスアクチベーターは、複合応答エレメントにおけるＴｅｔＯオペレーターに結合し、同時にＣｕｍａｔｅ誘導剤に結合したＣｙｍＲ抑制因子は、複合応答エレメントにおけるＣｕＯオペレーターから分離して、制御された目的核酸断片の最大の活性転写を可能にする。上記ｒｔＴＡトランスアクチベーター核酸コード配列は、好ましくはヒトコドンによって最適化されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８であり、ＣｙｍＲは、好ましくはヒトコドンによって最適化されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５である。

【0015】

上記Ｔｅｔ－ＯｎとＣｕｍａｔｅ複合誘導発現系は、生物学的基礎科学研究、生物学的製薬、遺伝子治療、細胞治療、トランスジェニック植物又は動物改良においていずれも応用することができ、細胞、動物又は植物において、タンパク質をコードする核酸配列の転写のオン又はオフを制御し、非タンパク質コード核酸配列の転写のオンとを制御することを含むが、それらに限らない。例えばＲＮＡウィルスの全部又は一部のゲノムＲＮＡ断片、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡと略称される）、小干渉リボ核酸（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡと略称される）、長鎖非コードリボ核酸（ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｄｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ、ＬｎｃＲＮＡと略称される）、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムのガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、ｇＲＮＡ）、転移リボ核酸（ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ、ｔＲＮＡと略称される）、リボソームリボ核酸（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ、ｒＲＮＡと略称される）、アプタマー（Ａｐｔａｍｅｒｓ）、他の核酸に結合できるリボ核酸断片、特定のタンパク質に結合できるリボ核酸断片、又は任意の一部のリボ核酸であってもよく、以上の一部又は複数の核酸配列の組み合わせであってもよい。一方で、上記Ｔｅｔ－ＯｎとＣｕｍａｔｅ複合誘導発現系は、遺伝子治療、細胞治療又は免疫治療分野におけるウィルスベクターの発現と生産に用いることができ、細胞傷害活性、又は不安定的なタンパク質の発現と生産に用いることができ、ワクチン分野における弱毒性ワクチン又はウィルス様粒子（ｖｉｒａｌ ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃａＬ、ＶＬＰと略称される）ワクチンの発現生産に用いることができ、トランスジェニック動物又は植物における目的核酸断片の転写発現のオン又はオフの制御に用いることができる。

【0016】

本開示において、Ｔｅｔ－Ｏｎ誘導発現系に用いることができるテトラサイクリン及びその誘導体は、テトラサイクリンに構造的に類似する化合物を含み、それは、本開示の前記テトラサイクリン依存性のトランスアクチベーターｒｔＴＡに結合することができ、その結合定数Ｋａは、少なくとも１０^－６Ｍに達し、好ましくは、その結合定数Ｋａは、１０^－９Ｍ以上である。テトラサイクリン誘導体は、例えば、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）、アンヒドロテトラサイクリン（Ａｔｃ）、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン及びデオキシテトラサイクリンから選択されてもよい。

【0017】

本開示において、Ｃｕｍａｔｅ誘導発現系に用いることができる、抑制因子ＣｙｍＲに結合するＣｕｍａｔｅ機能的類似体は、例えばｐ－エチル安息香酸、ｐ－プロピル安息香酸、ｐ－イソプロピル安息香酸、ｐ－イソブチル安息香酸、ｐ－ｔｅｒｔ－ブチル安息香酸、ｐ－ｎ－ジメチルアミノ安息香酸、ｐ－ｎ－エチルアミノ安息香酸、及び例えば米国特許番号７，７４５，５９２に記述されている他のＣｕｍａｔｅ機能的類似体から選択されてもよい。

【0018】

本開示のテトラサイクリンとＣｕｍａｔｅの共制御配列を含むベクターに導入できる宿主細胞は、原理的に、任意の細胞、例えば、細菌、真菌、動物細胞又は植物細胞であってもよい。他方で、本開示に記載のテトラサイクリンとＣｕｍａｔｅの共制御配列は、ウィルスベクターによって用いることができ、例えば製造されたウィルスベクターに含まれる核酸断片には、本開示のテトラサイクリンとＣｕｍａｔｅの共制御配列が含まれ、ＤＮＡウィルスベクター（例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス）内にデオキシリボ核酸として存在し、ＲＮＡウィルスベクター（例えばレトロウイルス）内にリボ核酸として存在する。

【0019】

当業者が理解できるように、転写が本開示の制御核酸配列によって制御された目的核酸断片については、その転写が本開示の制御核酸配列によって制御され得る限り、特に制限はない。

【0020】

一態様では、本開示は、以下を提供する：

【0021】

第１項．テトラサイクリン又はその誘導体によって制御されたトランスアクチベーターｒｔＴＡに結合できる少なくとも２コピーのＴｅｔＯ－オペレーター配列と、ＴＡＴＡボックス配列を含む１コピーの最小プロモーター配列と、ｃｕｍａｔｅによって制御された転写抑制因子ＣｙｍＲに結合できる少なくとも１コピーのＣｕＯ－オペレーター配列と、を含む核酸配列であって、前記ＣｕＯ－オペレーター配列は、前記ＴＡＴＡボックス配列の３’端の下流にあり、前記ＴＡＴＡボックスとの距離間隔は、１０ｂｐ～１００ｂｐである核酸配列。

【0022】

第２項．前記ＣｕＯ－オペレーター配列と前記ＴＡＴＡボックスとの距離間隔は、３０ｂｐ～５０ｂｐである、第１項に記載の核酸配列。

【0023】

第３項．前記ＣｕＯ－オペレーター配列と前記ＴＡＴＡボックスとの距離間隔は、５０ｂｐである、第１項に記載の核酸配列。

【0024】

第４項．前記ＴｅｔＯ－オペレーター配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示され、及び／又は前記最小プロモーター配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示され、及び／又は前記ＣｕＯ－オペレーター配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示される、第１項に記載の核酸配列。

【0025】

第５項．前記核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示される、第４項に記載の核酸配列。

【0026】

第６項．前記核酸配列は、３’端にスプライシング可能なイントロン配列をさらに含む、第１～５項のいずれか一項に記載の核酸配列。

【0027】

第７項．第１～６項のいずれか一項に記載の核酸配列を含むベクター。

【0028】

第８項．前記ベクターは、発現ベクターであり、前記発現ベクターは、第１～６項のいずれか一項に記載の核酸配列の３’端の下流にある目的核酸断片を含み、前記目的核酸断片の転写は、第１～６項のいずれか一項に記載の核酸配列によって制御される、第７項に記載のベクター。

【0029】

第９項．第１～６項のいずれか一項に記載の核酸配列又は第７項又は８項に記載のベクターを含む宿主細胞。

【0030】

第１０項．
第８項に記載のベクター、ｒｔＴＡのコード配列及びＣｙｍＲのコード配列を宿主細胞に導入するステップ（１）と、
（１）を経た前記宿主細胞においてｒｔＴＡとＣｙｍＲを発現するステップ（２）と、
（２）を経た前記宿主細胞にテトラサイクリン又はその誘導体及びｃｕｍａｔｅ又はその機能的類似体を提供するステップ（３）と、を含む、前記宿主細胞において目的核酸断片の発現を誘導する方法。

【0031】

第１１項．前記ｒｔＴＡは、ｒｔＴＡ_ａｄｖ又はｒｔＴＡ_３Ｇである、第１０項に記載の方法。

【0032】

第１２項．前記ｒｔＴＡのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８に示される、第１０項に記載の方法。

【0033】

第１３項．前記ＣｙｍＲのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５に示される、第１０項に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】目的核酸断片の誘導発現量と誘導なしのリーク発現量に対する、実施例２におけるＣｕＯオペレーターの複合応答エレメントにおける位置及び数の影響を示す。図１Ａ：ＤＯＸ誘導剤のみの添加、ＤＯＸとＣｕａｍｔｅ誘導剤との同時添加に対応するＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ検出実験のＲＬＵ値を示す。図１Ｂ：Ｃｕｍａｔｅ誘導剤を添加した場合とＣｕａｍｔｅ誘導剤を添加しなかった場合のＲＬＵの比を示す。

【図2】目的核酸断片の誘導発現量と誘導なしのリーク発現量に対する、実施例３における単一制御応答エレメント、複合制御応答エレメント及び応答エレメントの下流に連結されたイントロンの影響を示す。図２Ａ：ＤＯＸとＣｕｍａｔｅ誘導剤の有無に対応するＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ検出実験のＲＬＵ値を示す。図２Ｂ：ＤＯＸとＣｕｍａｔｅ誘導剤の有無のＲＬＵ値の比を示す。

【図3】ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ複合応答エレメント誘導発現と誘導なしのリーク発現に対する実施例４における異なるイントロンの影響を示す。図３Ａ：ＤＯＸとＣｕｍａｔｅ誘導剤の有無に対応するＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ検出実験のＲＬＵ値を示す。図３Ｂ：ＤＯＸとＣｕｍａｔｅ誘導剤の有無のＲＬＵ値の比を示す。

【図4】実施例５におけるＴＲＥ_３ＧＣｕＯとＴＲＥ_３ＧＣｕＯ－ＢＧＩによって制御された目的核酸断片の異なる誘導組み合わせでの誘導転写活性を示す。縦座標は、異なる誘導剤条件下でのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ検出実験のＲＬＵ値を示し、４色の棒グラフは、誘導剤を添加した４つの組み合わせを示し、途中の横線上の数字は、対応する誘導条件下と無誘導条件下（白色）でのＲＬＵ比を表す。

【発明を実施するための形態】

【0035】

本発明の技術案を説明するために以下の実施例が提供されるが、以下の実施例は、本発明の範囲と精神を制限するものとみなされるべきではない。

【0036】

実施例１：プラスミド構築方法

【0037】

以下の実施例で使用される分子クローニング技術、例えば、ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅、ＤＮＡ断片の制限酵素による切断、ＤＮＡ断片のゲル回収、二部以上のＤＮＡ断片のＴ４ ＤＮＡリガーゼ連結、連結生成物コンピテント細胞の形質転換、プラスミドの少量調製及び同定等の方法は、いずれも本分野の周知技術である。以下の実施例では、ＰＣＲ酵素（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｆ－５３０Ｓ）、制限酵素（ＮＥＢ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５２２４０４１）、ＤＮＡ断片ゲル回収キット（Ｏｍｅｇａ、Ｄ２５００－０２）、プラスミド抽出ミニキット（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＤＰ１０５－０３）、コンピテント細胞（ＸＬ－１０ Ｇｏｌｄ、湖南豊暉生物科学技術有限会社、ＪＺ０１１）という試薬に関し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示される核酸配列は、本開示の前記プラスミド構築のためにジェンスクリプト社によって合成され、プラス配列決定同定は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって完了される。表１は、構築プラスミドのプライマ情報であり、表２は、付録配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のエレメントの構成説明であり、表３は、プラスミドにおける各機能エレメントの説明であり、表４は、本開示で構築されたプラスミド番号及び対応する名称である。以下の実施例に係るプラスミドの各々で採用されるエレメント配列情報は、本開示を実施する一例であり、当業者は、以下の実施例で使用されるプラスミド上の各々のエレメント配列を、生物学的機能が類似した他のエレメント配列に置換することも、本開示に記載の効果を達成することができると期待することができ、プラスミドの骨格配列（例えば複製の原点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）、抵抗性遺伝子など）、酵素切断サイト配列、トランスポゾン反復配列、誘導系応答エレメント配列、インスレーター（Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）配列、プロモーター配列、イントロン配列、ポリアデニル酸シグナル（ＰｏｌｙＡ）配列、異なるコドンで最適化された遺伝子配列、上記各機能エレメント配列と遺伝子配列の変異体、及び各機能エレメント配列と遺伝子配列のクローニング位置、クローニング順序とクローニング方向を含むが、それらに限らない。具体的なプラスミド構築方法は、以下の通りである：

【0038】

１．プラスミド１８ＢＦ００７の構築：合成配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（２９００ｂｐ）をＮｏｔＩとＡｓｉＳＩで切断してプラスミド１８ＢＦ００３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のＮｏｔＩとＡｓｉＳＩの切断サイトに連結することにより、プラスミド１８ＢＦ００７を構築する。

【0039】

２．プラスミド１８ＢＦ０１１の構築：１８ＢＦ００７プラスミドをＭｌｕＩとＳｐｈＩで切断し、１７３０ｂｐ断片をゲルで回収してそれを１８ＢＦ００３プラスミドのＭｌｕＩとＳｐｈＩの切断サイトに連結することにより、プラスミド１８ＢＦ０１１を構築する。

【0040】

３．プラスミド１８ＢＦ２１０の構築：合成配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（１２０８ｂｐ）をＳｐｅＩとＡｇｅＩで切断してプラスミド１８ＢＦ０１１のＡｖｒＩＩとＡｇｅＩの切断サイトに連結することにより、プラスミド１８ＢＦ２１０を構築する。

【0041】

４．プラスミド１８ＢＦ２１１、１８ＢＦ２１２、１８ＢＦ２１３、１８ＢＦ２１４、１８ＢＦ２１５、１８ＢＦ２１６、１８ＢＦ２１７と１８ＢＦ２１８の構築：合成配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（９０８ｂｐ）、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（８８０ｂｐ）、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（８９０ｂｐ）と配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（８４５ｂｐ）をそれぞれＭｌｕＩとＣｌａＩで切断してプラスミド１８ＢＦ２１０のＭｌｕＩとＣｌａＩの切断サイトに連結することにより、プラスミド１８ＢＦ２１２、１８ＢＦ２１１、１８ＢＦ２１４と１８ＢＦ２１３をそれぞれ構築する。プラスミド１８ＢＦ２１１、１８ＢＦ２１２、１８ＢＦ２１３と１８ＢＦ２１４をそれぞれＢｓｔＢＩで切断し、ＤＮＡ断片３９３２ｂｐ（１８ＢＦ２１１）、３９６０ｂｐ（１８ＢＦ２１２）、３８９７ｂｐ（１８ＢＦ２１３）と３９４２ｂｐ（１８ＢＦ２１４）をそれぞれゲルで回収し、Ｔ４リガーゼで連結してプラスミド１８ＢＦ２１５、１８ＢＦ２１６、１８ＢＦ２１７と１８ＢＦ２１８をそれぞれ構築する。

【0042】

５．プラスミド１８ＢＦ２２９、１８ＢＦ２３２、１８ＢＦ２３３、１８ＢＦ２３４、１８ＢＦ２３５、１８ＢＦ２３６、１８ＢＦ２３７、１８ＢＦ２４０と１８ＢＦ２４１の構築：ｐＧＬ３～Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１７５１）をテンプレートとして、Ｌｕｃ－Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）とＬｕｃ－Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）をプライマとして、ＰＣＲによってｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子断片（１７２８ｂｐ）を増幅し、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断処理し、プラスミド１８ＢＦ２１０、１８ＢＦ２１７、１８ＢＦ２１８、１８ＢＦ２１５、１８ＢＦ２１６、１８ＢＦ２１１、１８ＢＦ２１２、１８ＢＦ２１３と１８ＢＦ２１４のＢａｍＨＩとＸｈｏＩの切断サイトにそれぞれ連結することにより、プラスミド１８ＢＦ２２９、１８ＢＦ２３２、１８ＢＦ２３３、１８ＢＦ２３４、１８ＢＦ２３５、１８ＢＦ２３６、１８ＢＦ２３７、１８ＢＦ２４０と１８ＢＦ２４１を構築する。

【0043】

６．プラスミド１８ＢＦ２５１、１８ＢＦ２５２、１８ＢＦ２５３、１８ＢＦ２５４、１８ＢＦ２５５、１８ＢＦ２５６と１８ＢＦ２５７の構築：合成配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（４１４ｂｐ）、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（４１４ｂｐ）、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（４１５ｂｐ）、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（４７２ｂｐ）、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（５８８ｂｐ）、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３（７０４ｂｐ）と配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２（３７６ｂｐ）をそれぞれＭｌｕＩとＣｌａＩで切断してプラスミド１８ＢＦ２３５のＭｌｕＩとＣｌａＩの切断サイトにそれぞれ連結することにより、プラスミド１８ＢＦ２５１、１８ＢＦ２５２、１８ＢＦ２５３、１８ＢＦ２５４、１８ＢＦ２５５、１８ＢＦ２５６と１８ＢＦ２５７をそれぞれ構築する。

【0044】

７．プラスミド１８ＢＦ２６１、１８ＢＦ２６２、１８ＢＦ２６３と１８ＢＦ２６４の構築：配列１７をテンプレートとして、ＢＧＩ（Ｃ＆Ｒ）－Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）とＢＧＩ（Ｃ＆Ｒ）－Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）をプライマとして、ＰＣＲによってＢＧＩ（Ｃ＆Ｒ）イントロン配列（１０３６ｂｐ）を増幅し、ｐＥＦ１ａｌｐｈａ－ＩＲＥＳ－ＡｃＧＦＰ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとして、Ｉｎｔｒｏｎ（ＥＦ－１ａ）－Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）とＩｎｔｒｏｎ（ＥＦ－１ａ）－Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）をプライマとして、ＰＣＲによってＩｎｔｒｏｎ（ＥＦ－１ａ）イントロン配列（９６２ｂｐ）を増幅し、ｐＳＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ１７２１）プラスミドをテンプレートとして、Ｉｎｔｒｏｎ（ｐＳＩ）－Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）とＩｎｔｒｏｎ（ｐＳＩ）－Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）をプライマとして、ＰＣＲによってＩｎｔｒｏｎ（ｐＳＩ）イントロン配列（１５２ｂｐ）を増幅し、以上の３つのＰＣＲ生成物をそれぞれＣｌａＩとＢａｍＨＩで切断処理し、プラスミド１８ＢＦ２３５のＣｌａＩとＢａｍＨＩの切断サイトに連結することにより、プラスミド１８ＢＦ２６１、１８ＢＦ２６３と１８ＢＦ２６４を構築する。合成された配列１４（２１０ｂｐ）をＣｌａＩとＢａｍＨＩで切断し、プラスミド１８ＢＦ２３５のＣｌａＩとＢａｍＨＩ切断サイト連結することにより、プラスミド１８ＢＦ２６２を構築する。

【0045】

８．プラスミド１９ＢＦ０７５と１９ＢＦ０７４の構築：合成された配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（６３３ｂｐ）と配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６（１４９６ｂｐ）をそれぞれＣｌａＩとＸｈｏＩ及びＳｐｅＩとＡｇｅＩで切断処理して１８ＢＦ００７プラスミドのＣｌａＩとＸｈｏＩの切断サイト及びＡｖｒＩＩとＡｇｅＩの切断サイトに順次連結することにより、１９ＢＦ０７３プラスミドを構築する。合成された配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７（１９７９ｂｐ）をＭｌｕＩとＡｇｅＩで切断して１８ＢＦ００７プラスミドのＭｌｕＩとＡｇｅＩの切断サイトに連結し、ＣＭＶ－ＢＧＩ－ＭＣＳ－ｐＡ配列を置換することにより、１８ＢＦ００８プラスミドを構築する。合成された配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８（７６８ｂｐ）と配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９（７６５ｂｐ）をそれぞれＣｌａＩとＸｈｏＩで切断して１８ＢＦ００８プラスミドのＣｌａＩとＸｈｏＩの切断サイトにそれぞれ連結することにより、１８ＢＦ０８５と１８ＢＦ０８４プラスミドをそれぞれ構築する。プラスミド１９ＢＦ０７３をＳｐｅＩとＡｇｅＩで切断し、３８２１ｂｐ断片をゲルで回収してそれを１８ＢＦ０８５と１８ＢＦ０８４プラスミドのＡｖｒＩＩとＡｇｅＩの切断サイトにそれぞれ連結することにより、１９ＢＦ０７５と１９ＢＦ０７４プラスミドをそれぞれ構築する。

【0046】

９．プラスミド１８ＢＦ０１９の構築：合成された配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１（１０４４ｂｐ）と配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０（１３２０ｂｐ）をそれぞれＢａｍＨＩとＸｈｏＩ及びＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで切断して１８ＢＦ０１１プラスミドのＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩの切断サイトに連結することにより、１８ＢＦ０１９プラスミドを構築する。

【0047】

１０．プラスミド１９ＢＦ２２９、１９ＢＦ２３５と１９ＢＦ２３７の構築：プラスミド１８ＢＦ２２９、１８ＢＦ２３５と１８ＢＦ２３７をそれぞれＭｌｕＩとＡｇｅＩで切断し、４６０５ｂｐ（１８ＢＦ２２９）、３８４７ｂｐ（１８ＢＦ２３５）と４３４１ｂｐ（１８ＢＦ２３７）断片をそれぞれゲルで回収してそれを１８ＢＦ００７プラスミドのＭｌｕＩとＡｇｅＩの切断サイトにそれぞれ連結することにより、１９ＢＦ２２９、１９ＢＦ２３５と１９ＢＦ２３７プラスミドをそれぞれ構築する。

【0048】

【表1】

【0049】

【表2】

【0050】

【表3】

【0051】

【表4】

【0052】

実施例２：誘導発現量と誘導なしのリーク発現量に対するＣｕＯオペレーター位置及び数の影響

【0053】

本実施例に記載の実験は、ＣｕＯオペレーターのＴｅｔ－ＯｎとＣｕｍａｔｅ複合応答エレメントにおける位置とコピー数が、複合応答エレメント誘導発現量と誘導なしのリーク発現量に対する影響を研究と検証し、最適なＣｕＯオペレーター位置とコピー数を最適化して確認することである。本実施例は、ＴＲＥ_３Ｇ応答エレメントにおける７ｘＴｅｔＯ配列と最小プロモーター配列＃１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）に基づき、ＴＡＴＡボックスの下流の１０ｂｐから１００ｂｐ間隔の範囲内に、それぞれ１４ｂｐ、３０ｂｐ、５０ｂｐと１００ｂｐ間隔の位置にＣｕＯオペレーター配列を連結してＴＲＥ_３ＧＣｕＯ_１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８における１０－３１７ｂｐ）、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ_３０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ_５０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）と ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ_１００（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０における１０－４０３ｂｐ）応答エレメントを設計し、以上の応答エレメントの３’端の下流にＬｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子配列を連結し、プラスミド１８ＢＦ２５１、１８ＢＦ２５２、１８ＢＦ２３５と１８ＢＦ２５３を構築した。さらに、マルチコピーＣｕＯオペレーターの影響を研究するために、ＴＡＴＡボックスの下流の５０ｂｐ間隔の位置に、２、４と６コピーＣｕＯオペレーター配列をそれぞれ挿入してＴＲＥ_３ＧＣｕＯ_２ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１における１０－４１１ｂｐ）、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ_４ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２における１０－５２７ｂｐ）とＴＲＥ_３ＧＣｕＯ_６ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３における１０－６４３ｂｐ）応答エレメントを設計し、以上の応答エレメントの下流の３’端にＬｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子配列を連結し、プラスミド１８ＢＦ２５４、１８ＢＦ２５５と１８ＢＦ２５６を構築した。ｒｔＴＡ_３ＧとＣｙｍＲ遺伝子を安定的に発現させる２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_３Ｇ－ＣｙｍＲ細胞内に、上記プラスミドを瞬時にトランスフェクションし、ＤＯＸとＣｕｍａｔｅ誘導剤とを同時に添加したサンプルと、ＤＯＸ誘導剤のみを添加した対照のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ蛍光値を測定することによって、最適化されたＣｕＯオペレーターの最適位置と数を検証した。具体的な実験方法は、以下の通りである：

【0054】

１．ＳＢトランスポゾンシステムで２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_ａｄｖ－ＣｙｍＲと２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_３Ｇ－ＣｙｍＲ細胞を構築する。

【0055】

２９３Ｔ細胞を６０ｍｍシャーレあたり１．５Ｅ＋０６個の細胞に接種し、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境で、１０％のＦＢＳ（ＥｘＣｅｌｌ，１１Ｈ１１６）が添加されたＤＭＥＭ（Ｓｉｇａｍ、Ｄ６４２９）完全培地で培養した。２４時間培養した後、ＰＥＩ方法でトランスフェクションを行い、トランスフェクションの時に６０ｍｍシャーレあたり５００μＬのトランスフェクション試薬を加え、ここで、プラスミドの総量が５．５ｕｇであり、プラスミドの総量とＰＥＩ ＭＡＸ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２４７６５－１）との質量比は、１：４である。ここで、プラスミド１９ＢＦ０７４：１８ＢＦ０１９のモル比１０：１でトランスフェクションを行って２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_ａｄｖ－ＣｙｍＲ細胞を取得し、プラスミド１９ＢＦ０７５：１８ＢＦ０１９のモル比１０：１でトランスフェクションを行って２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_３Ｇ－ＣｙｍＲ細胞を取得した。プラスミドとＰＥＩ ＭＡＸとを均一に混合し、１５分間静置した後にシャーレに添加し、３時間トランスフェクションした後、培地をＤＭＥＭ完全培地に交換し、トランスフェクション操作を完了した。２４時間トランスフェクションした後、パンクレアチンで細胞を消化してすべて１００ｍｍのシャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、４３０１６７）に接種し、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ、生工Ａ６００２３０－０００１）薬物で少なくとも三世代スクリーニングした後、細胞は、薬物の圧力で成長して元の２９３Ｔ細胞と一致した後、以下の実験を行った。

【0056】

２．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ蛍光強度に基づいてＤＯＸとＣｕｍａｔｅ誘導又はＤＯＸのみ誘導条件下での各応答エレメント効能を検出する

【0057】

２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_３Ｇ－ＣｙｍＲ細胞をウェルあたり２．５Ｅ＋０４個の細胞に９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３９１６）に接種し、培地は、１００マイクロリットルＤＭＥＭ完全培地である。２４時間培養した後、ＰＥＩ方法で１８ＢＦ２３４（ＴＲＥ_３Ｇ）、１８ＢＦ２５１（ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ_１４）、１８ＢＦ２５２（ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ_３０）、１８ＢＦ２３５（ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ_５０）、１８ＢＦ２５３（ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ_１００）、１８ＢＦ２５４（ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ_２ｘ）、１８ＢＦ２５５（ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ_４ｘ）と１８ＢＦ２５６（ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ_６ｘ）というプラスミドをトランスフェクションし、トランスフェクションの時にウェルあたり１０μＬのトランスフェクション試薬を加え、ここで、プラスミドの総量が０．３ｕｇであり、０．０１ｕｇの上記８つの測定すべきプラスミドと０．２９マイクログラムの１８ＢＦ００３空プラスミドとを含む。プラスミドの総量とＰＥＩ ＭＡＸ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２４７６５－１）との質量比は、１：４であり、各種のプラスミドを６ウェルにトランスフェクションした。３時間トランスフェクションした後にＤＭＥＭ完全培地を交換し、そのうちの３ウェル内に誘導剤１ｕｇ／ｍｌのＤＯＸ（塩酸ドキシサイクリン（ＤＯＸ）を加え、生工生物工学（上海）株式会社、Ａ６００８８９）と２００ｕｇ／ｍｌのＣｕｍａｔｅ（Ａｌａｄｄｉｎ、Ｉ１０７７６５）、他の３ウェル内に１ｕｇ／ｍｌのＤＯＸのみを添加した。２４時間トランスフェクションした後、Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ^(R) Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２６１０）キットを用い、その操作説明（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＦＢ０３７）に従って各ウェルの相対蛍光単位ＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）を検出し、検出器は、蛍光マイクロプレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＶｉｃｔｏｒＶ）である。

【0058】

結果は、図１に示され、ＣｕＯオペレーター配列は、Ｔｅｔ－Ｏｎ誘導発現系応答エレメントの誘導発現量に影響を与え、ＣｕＯオペレーターは、ＴＲＥ応答エレメントＴＡＴＡボックスに近いほど、誘導後の発現量が低い。しかしＣｕＯオペレーターとＴＡＴＡボックスとの距離が大きくなるにつれて、Ｃｕｍａｔｅ誘導なしのリーク発現量が高くなった。誘導後発現量、Ｃｕｍａｔｅ誘導なしのリーク発現量とＣｕｍａｔｅ誘導／リーク発現量の比等の結果を統合し、ＣｕＯとＴＡＴＡボックスとの間隔が３０ｂｐから５０ｂｐの間に結果が最適であり、誘導発現量がそれぞれ３．０６Ｅ＋０６ ＲＬＵと４．５３Ｅ＋０６ ＲＬＵであり、それぞれＴＲＥ_３Ｇ応答エレメント誘導発現量の４４．５％と６６．０％であり、Ｃｕｍａｔｅ誘導発現系に基づく誘導／リーク発現量の比がそれぞれＴＲＥ_３Ｇ応答エレメントの４．２１倍と２．８１倍であると決定した。ＣｕＯオペレーターのコピーを２、４又は６に増加させると、誘導後の発現量をさらに低減させ、Ｃｕｍａｔｅ誘導／リーク発現量の比を増加させない。以上の結果に基づき、ＴＲＥ応答エレメントＴＡＴＡボックスから３０ｂｐ～５０ｂｐを離れた距離にＣｕＯオペレーターを挿入し、１コピーのみを挿入することが最適条件である。

【0059】

ＴＲＥ_ａｄｖ応答エレメントにおける７ｘＴｅｔＯ配列と最小プロモーター配列＃２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）に基づき、ＴＡＴＡボックスの下流に３２ｂｐと５２ｂｐを離れた位置にＣｕＯオペレーター配列を連結し、上記方法でＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯ_３２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）とＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯ_５２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）応答エレメントを設計し、以上の応答エレメントの３’端の下流にＬｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子配列を連結し、プラスミド１８ＢＦ２５７と１８ＢＦ２３３を構築した。上記と同様の実験方法で、誘導発現量がそれぞれ３．２６＋０６ ＲＬＵと４．８８Ｅ＋０６ ＲＬＵであり、それぞれＴＲＥ_ａｄｖ応答エレメント誘導発現量の３７．８％と５３．４％であり、Ｃｕａｍｔｅ誘導発現系に基づく誘導／リーク発現量の比がそれぞれＴＲＥ_ａｄｖ応答エレメントの４．９７倍と３．２３倍であると検出した。その後の実施例は、ＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯ_５２とＴＲＥ_３ＧＣｕＯ_５０応答エレメントで実験を行い、ＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯとＴＲＥ_３ＧＣｕＯ応答エレメントとそれぞれ表記した。

【0060】

実施例３：誘導発現量と誘導なしのリーク発現量に対する単一制御／複合制御及びイントロンの影響

【0061】

Ｔｅｔ－Ｏｎ誘導発現系において、ＴＲＥ応答エレメントのＴｅｔＯオペレーター連結配列と最小プロモーター配列及びトランスアクチベーターｒｔＴＡの異なる突然変異体は、誘導転写活性とリーク転写活性に統合的に影響を与える。なお、応答エレメントの３’端の下流、制御された目的核酸断片の５’端の上流にスプライシング可能なイントロン配列を連結することにより、メッセンジャーリボ核酸の輸送と安定性を補強する可能性があるが、同様に誘導発現系応答エレメントの誘導転写活性とリーク転写活性に影響を与える可能性もある。これに基づき、本実施例は、（１）ＴＲＥ_ａｄｖとＴＲＥ_３Ｇ応答エレメント配列に基づいて設計されたＴｅｔ－ＯｎとＣｕｍａｔｅ複合応答エレメントＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯとＴＲＥ_３ＧＣｕＯ、（２）イントロン連結の有無、（３）トランスアクチベーターｒｔＴＡ_ａｄｖ又はｒｔＴＡ_３Ｇによる制御、という３つの条件の組み合わせでのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子誘導発現量と誘導／リーク発現量の比を比較して最適な複合応答エレメント設計案を確認した。本実施例では、合計で８つの設計案を比較し、それぞれは、ＴＲＥ_ａｄｖ（１８ＢＦ２３２）、ＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯ（１８ＢＦ２３３）、ＴＲＥ_３Ｇ（１８ＢＦ２３４）、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ（１８ＢＦ２３５）、ＴＲＥ_ａｄｖ－ＢＧＩ（１８ＢＦ２４０、応答エレメントがＴＲＥ_ａｄｖであり、応答エレメントの３’端とＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子の５’端との間にヒトβ－グロブリンイントロンが連結される）、ＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯ－ＢＧＩ（１８ＢＦ２４１、応答エレメントがＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯであり、応答エレメントの３’端とＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子の５’端との間にヒトβ－グロブリンイントロンが連結される）、ＴＲＥ_３Ｇ－ＢＧＩ（１８ＢＦ２３６、応答エレメントがＴＲＥ_３Ｇであり、応答エレメントの３’端とＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子の５’端との間にヒトβ－グロブリンイントロンが連結される）とＴＲＥ_３ＧＣｕＯ－ＢＧＩ（１８ＢＦ２３７、応答エレメントがＴＲＥ_３ＧＣｕＯであり、応答エレメントの３’端とＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子の５’端との間にヒトβ－グロブリンイントロンが連結される）である。プロモーターＣＭＶ－ＢＧＩ（１８ＢＦ２２９、プロモーターがＣＭＶであり、ＣＭＶプロモーターの３’端とＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子の５’端との間にヒトβ－グロブリンイントロンを連結する）を陽性対照とした。ｒｔＴＡ_ａｄｖとＣｙｍＲ遺伝子を安定的に発現させる２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_ａｄｖ－ＣｙｍＲ細胞内と、ｒｔＴＡ_３ＧとＣｙｍＲ遺伝子を安定的に発現させる２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_３Ｇ－ＣｙｍＲ細胞内に、上記プラスミドをそれぞれ瞬時にトランスフェクションし、ＤＯＸとＣｕｍａｔｅ誘導剤を添加したサンプルと、誘導なし対照のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ蛍光値を測定することによって、最適な複合応答エレメント組み合わせを検証した。具体的な実験方法は、以下の通りである：

【0062】

実施例２の中で構築された２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_ａｄｖ－ＣｙｍＲと２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_３Ｇ－ＣｙｍＲ細胞をウェルあたり２．５Ｅ＋０４個の細胞に９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３９１６）に接種し、培地は、１００マイクロリットルＤＭＥＭ完全培地である。２４時間培養した後、ＰＥＩ方法で上記９つのプラスミドをトランスフェクションし、トランスフェクションの時にウェルあたり１０μＬのトランスフェクション試薬を加え、ここで、プラスミドの総量が０．３ｕｇであり、０．０１ｕｇの上記９つの測定すべきプラスミドと０．２９マイクログラムの１８ＢＦ００３空プラスミドとを含む。プラスミドの総量とＰＥＩ ＭＡＸ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２４７６５－１）との質量比は、１：４であり、各種のプラスミドをそれぞれ２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_ａｄｖ－ＣｙｍＲと２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_３Ｇ－ＣｙｍＲ細胞に６ウェルにトランスフェクションした。３時間トランスフェクションした後にＤＭＥＭ完全培地を交換し、各種の細胞のうちの３ウェル内に誘導剤１ｕｇ／ｍｌのＤＯＸと２００ｕｇ／ｍｌのＣｕｍａｔｅを加え、他の３ウェル内に等量培地を加えて対照する。２４時間トランスフェクションした後、Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ^(R) Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２６１０）キットを用い、その操作説明（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＦＢ０３７）に従って各ウェルの相対蛍光単位ＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）を検出し、検出器は、蛍光マイクロプレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＶｉｃｔｏｒＶ）である。

【0063】

実験結果は、図２に示され、（１）ＴＲＥＣｕＯ複合応答エレメントは、ＴＲＥ単一制御応答エレメントより、誘導／リーク発現量の比が１から２桁著しく向上した。ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ複合応答エレメントは、ＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯ複合応答エレメントより、リーク発現をよりよく制御することができる。２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_ａｄｖ－ＣｙｍＲ細胞において、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯとＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯの誘導／リーク発現量の比は、それぞれ１５６５と１３４５倍であり、１６．４％向上し、２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_３Ｇ－ＣｙｍＲ細胞において、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯとＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯの誘導／リーク発現量の比は、それぞれ２６３５と１９１５倍であり、３７．６％向上した。しかしＴＲＥＣｕＯ複合応答エレメントは、ＴＲＥ単一制御応答エレメントより、誘導発現量が著しく低下した。２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_ａｄｖ－ＣｙｍＲ細胞において、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯとＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯの誘導発現量は、それぞれ対応するＴＲＥ_３ＧとＴＲＥ_ａｄｖ単一制御応答エレメントの５０．４％と３６．３％であり、２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_３Ｇ－ＣｙｍＲ細胞において、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯとＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯの誘導発現量は、それぞれ単一制御応答エレメントの６１．８％と４０．３％である。（２）誘導発現量面において、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ複合応答エレメントは、ＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯ複合応答エレメントより、下流のイントロンに対してより敏感で、イントロンＢＧＩのある設計において、誘導発現量が著しく向上した。ＴＲＥ_３ＧＣｕＯとＴＲＥ_３ＧＣｕＯ－ＢＧＩの誘導発現量は、２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_ａｄｖ－ＣｙｍＲ細胞において、それぞれ３．４Ｅ＋０６ ＲＬＵと１０．６Ｅ＋０６ ＲＬＵであり、それぞれは、ＴＲＥ_３Ｇの誘導発現量の５０．４％と１５７．９％であり、イントロンを連結することにより、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ複合応答エレメントの誘導後発現量は、２．１３倍向上することができ、２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_３Ｇ－ＣｙｍＲ細胞において、それぞれ４．２４Ｅ＋０６と１１．３Ｅ＋０６であり、それぞれは、ＴＲＥ_３Ｇの誘導発現量の６１．８％と１６５．０％であり、イントロンを連結することにより、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ複合応答エレメント誘導後発現量は、１．６７倍向上することができる。（３）誘導後発現量を比較し、トランスアクチベーターｒｔＴＡ_３Ｇは、８つの設計案において、ｒｔＴＡ_ａｄｖと有意差がなかったが、誘導／リーク発現量の比でｒｔＴＡ_３Ｇには著しい優位性があり、その８つの設計案の誘導／リーク発現量の比の平均値は、１１１０倍でｒｔＴＡ_ａｄｖの１．６８倍（ｒｔＴＡ_ａｄｖ誘導／リーク発現量の比の平均値が６６１倍）である。

【0064】

以上の結果に基づき、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ複合応答エレメントは、ＴＲＥ_ａｄｖとＴＲＥ_３Ｇ及びＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯ複合応答エレメントより、リーク発現をより良く制御する能力を持ち、下流にイントロンＢＧＩを連結した後にＴＲＥ_３ＧＣｕＯ複合応答エレメントによるリーク発現の制御を維持するとともに、その誘導発現量を大幅に向上させることができる。ｒｔＴＡ_３Ｇによる制御の条件下で、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ－ＢＧＩの誘導発現量は、それぞれＴＲＥ_ａｄｖの８０．６％であり、ＴＲＥ_ａｄｖ－ＢＧＩの８０．５％であり、ＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯの１９９．９％であり、ＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯ－ＢＧＩの１４７．０％であり、ＴＲＥ_３Ｇの１６５．０％であり、ＴＲＥ_３Ｇ－ＢＧＩの８１．５％とＴＲＥ_３ＧＣｕＯの２６７．２％であり、組成型活性プロモーターＣＭＶ－ＢＧＩの８４．７％に達し、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ－ＢＧＩの誘導／誘導なし発現量の比は、それぞれＴＲＥ_ａｄｖの２４．５倍、ＴＲＥ_ａｄｖ－ＢＧＩの４３．４倍、ＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯの１．２倍、ＴＲＥ_ａｄｖＣｕＯ－ＢＧＩの１．６倍、ＴＲＥ_３Ｇの５．９倍、ＴＲＥ_３Ｇ－ＢＧＩの８．９倍とＴＲＥ_３ＧＣｕＯの０．８倍である。

【0065】

実施例４：ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ複合応答エレメント誘導発現と誘導なしのリーク発現に対する異なるイントロンの影響

【0066】

上記実施例３において、イントロンＢＧＩを連結することにより、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ複合誘導応答エレメントの誘導転写活性及びＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ目的遺伝子の発現量を著しく向上させた。本実施例は、他のイントロンが同様の効果を有するか否かを検証した。本実施例は、４つの一般的なプラスミドベクター上のイントロンをＴＲＥ_３ＧＣｕＯ複合応答エレメントの３’端の下流とｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子の５’端の上流との間にクローニングし、ＢＧＩ（Ｃ＆Ｒ）、Ｉｎｔｒｏｎ（ｍＰ１）、Ｉｎｔｒｏｎ（ＥＦ－１ａ）とＩｎｔｒｏｎ（ｐＳＩ）イントロンを含むプラスミド１８ＢＦ２６１、１８ＢＦ２６２、１８ＢＦ２６３と１８ＢＦ２６４をそれぞれ構築し、プラスミド構築の具体的な方法は、実施例１に記述されている。ｒｔＴＡ_３ＧとＣｙｍＲ遺伝子を安定的に発現させる２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_３Ｇ－ＣｙｍＲ細胞内に、上記プラスミド及びＴＲＥ_３ＧＣｕＯ（１８ＢＦ２３５）、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ－ＢＧＩ（１８ＢＦ２３７）とＣＭＶ－ＢＧＩ（１８ＢＦ２２９）プラスミドをそれぞれ瞬時にトランスフェクションし、ＤＯＸとＣｕｍａｔｅ誘導剤を添加したサンプルと、誘導なし対照のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ蛍光値を測定することによって、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ複合応答エレメントの誘導発現と誘導なしのリーク発現に対する各イントロンの影響を検証した。具体的な実験方法は、以下の通りである：

【0067】

２９３Ｔ－ｒｔＴＡ_３Ｇ－ＣｙｍＲ細胞をウェルあたり２．５Ｅ＋０４個の細胞に９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３９１６）に接種し、培地は、１００マイクロリットルＤＭＥＭ完全培地である。２４時間培養した後、ＰＥＩ方法で上記７つのプラスミドをそれぞれトランスフェクションし、トランスフェクションの時にウェルあたり１０μＬのトランスフェクション試薬を加え、ここで、プラスミドの総量が０．３ｕｇであり、０．０１ｕｇの上記７つの測定すべきプラスミドと０．２９マイクログラムの１８ＢＦ００３空プラスミドとを含む。プラスミドの総量とＰＥＩ ＭＡＸ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２４７６５－１）との質量比は、１：４であり、各種のプラスミドを６ウェルにトランスフェクションした。３時間トランスフェクションした後にＤＭＥＭ完全培地を交換し、そのうちの３ウェル内に誘導剤１ｕｇ／ｍｌのＤＯＸと２００ｕｇ／ｍｌのＣｕｍａｔｅを加え、他の３つのウェル内に等量培地を添加した。２４時間トランスフェクションした後、Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ^(R) Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２６１０）キットを用い、その操作説明（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＦＢ０３７）に従って各ウェルの相対蛍光単位ＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）を検出し、検出器は、蛍光マイクロプレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＶｉｃｔｏｒＶ）である。

【0068】

実験結果は、図３に示され、４つの他のイントロンを含むプラスミド１８ＢＦ２６１、１８ＢＦ２６２、１８ＢＦ２６３と１８ＢＦ２６４は、誘導発現量と誘導／リーク発現量の比でＴＲＥ_３ＧＣｕＯ－ＢＧＩ（１８ＢＦ２３７）と有意差がなく、いずれも実施例３に記載のＴＲＥ_３ＧＣｕＯ－ＢＧＩの設計効果に達することができる。イントロンにおいて、スプライシングを行うために、５’ スプライシングサイト（５’ ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅ）、３’ スプライシングサイト（３’ ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅ）及びスプライシング分岐サイト（ｂｒａｎｃｈ ｐｏｉｎｔ）を必要とする。本実施例は、上記条件に合致する、スプライシング可能なイントロンがいずれも本開示に記載の実験効果に達することができると証明した。そのため、本開示に記載の効果は、特定のイントロン配列によって拘束されるべきではなく、哺乳動物細胞においてＲＮＡスプライシング（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ）を行うことができる配列は、いずれも上記機能を実現することができる。選択可能なイントロン配列は、一般的なクローンベクター上のイントロン、例えばウサギβ－グロブリンイントロン、ヒトβ－グロブリンと免疫グロブリン重鎖イントロン由来のハイブリッドイントロン、ＥＦ－１αイントロンＡ、ＳＶ４０イントロン、アデノウイルスと免疫グロブリン重鎖イントロン由来のハイブリッドイントロン、修飾されたヒトサイトメガロウイルスイントロン、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）とマウスマイクロウィルス（ＭＭＶ）イントロン由来のハイブリッドイントロン、ニワトリβ－アクチンとウサギβ－グロブリンイントロン由来のキメラとｍＰ１イントロンを含むが、それらに限らず、任意の真核生物の任意の遺伝子の任意のイントロン、又は、イントロンスプライシング規則に基づいて設計された人工イントロン配列であってもよい。

【0069】

実施例５：ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ複合応答エレメントの異なる誘導組み合わせでの誘導転写活性を研究する。

【0070】

本実施例は、Ｔｅｔ－ＯＮとＣｕｍａｔｅ複合によって制御された、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ又はＴＲＥ_３ＧＣｕＯ－イントロンに基づいて設計された、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅをレポーター遺伝子とする安定細胞系を構築し、これらの細胞系に基づき、誘導剤なし、Ｃｕｍａｔｅのみ添加、ＤＯＸのみ添加又はＤＯＸとＣｕｍａｔｅ誘導剤同時添加の４つの誘導条件の組み合わせで、レポーター遺伝子の異なる誘導転写活性を検出した。本実施例は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子のみを例として、原則として、本開示に記載の方法は、目的核酸断片の影響を受けない。具体的な実験方法は、以下の通りである：

【0071】

１．ＳＢトランスポゾンシステムによりＤＯＸとＣｕｍａｔｅ複合制御Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ安定化細胞系を構築する：

【0072】

２９３Ｔ細胞を６０ｍｍシャーレあたり１．５Ｅ＋０６個の細胞に接種し、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境で、１０％のＦＢＳ（ＥｘＣｅｌｌ，１１Ｈ１１６）が添加されたＤＭＥＭ（Ｓｉｇａｍ、Ｄ６４２９）完全培地で培養した。２４時間培養した後、ＰＥＩ方法でトランスフェクションし、トランスフェクションの時に６０ｍｍシャーレあたり５００μＬのトランスフェクション試薬を加え、プラスミドの総量が５．５ｕｇであり、プラスミドの総量とＰＥＩ ＭＡＸ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２４７６５－１）との質量比は、１：４であり、合計３つのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ安定化細胞系を構築した。ここでプラスミドのトランスフェクションは、１９ＢＦ０７５：１９ＢＦ２２９：１８ＢＦ０１９のモル比５：５：１でトランスフェクションを行って２９３Ｔ（Ｔ＆Ｃ）－ＣＭＶ－ＢＧＩ－Ｌｕｃ細胞を取得し、ここでプラスミドのトランスフェクションは、１９ＢＦ０７５：１９ＢＦ２３５：１８ＢＦ０１９のモル比５：５：１でトランスフェクションを行って２９３Ｔ（Ｔ＆Ｃ）－ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ－Ｌｕｃ細胞を取得し、ここでプラスミドのトランスフェクションは、１９ＢＦ０７５：１９ＢＦ２３７：１８ＢＦ０１９のモル比５：５：１でトランスフェクションを行って２９３Ｔ（Ｔ＆Ｃ）－ＴＲＥ_３ＧＣｕＯ－ＢＧＩ－Ｌｕｃ細胞を取得した。プラスミドとＰＥＩ ＭＡＸとを均一に混合し、１５分間静置した後にシャーレに添加し、３時間トランスフェクションした後、培地をＤＭＥＭ完全培地に交換し、トランスフェクション操作を完了した。２４時間トランスフェクションした後、パンクレアチンで細胞を消化してすべて１００ｍｍのシャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、４３０１６７）に接種し、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ、生工Ａ６００２３０－０００１）薬物で少なくとも三世代スクリーニングした。細胞は、薬物の圧力で成長して元の２９３Ｔ細胞と一致した後、更に極限希釈法で上記３つの細胞をそれぞれウェルあたり１個の細胞に希釈して９６ウェルプレートに接種し、細胞がウェルの底面積の約５０％まで成長した時、蛍光顕微鏡下でＥＧＦＰの緑色蛍光強度が強く、発光が均一なウェルを選択し、各種の細胞は、３つの独立したクローンを選択して以下の実験を行った。

【0073】

２．異なるＤＯＸとＣｕｍａｔｅとの組み合わせによりＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現を誘導する：

【0074】

上記３つの細胞のそれぞれの３つの独立したクローンを、ウェルあたり２．５Ｅ＋０４個の細胞に９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３９１６）に接種し、各クローンは、８ウェルを接種し、培地は、１００マイクロリットルのＤＭＥＭ完全培地である。２４時間培養した後、培地を交換して各細胞クローンの８つの培養ウェル内に重複ウェルを取り、（１）等量培地、（２）最終濃度２００ｕｇ／ｍｌのＣｕｍａｔｅ、（３）最終濃度１ｕｇ／ｍｌのＤＯＸ又は（４）最終濃度１ｕｇ／ｍｌのＤＯＸと２００ｕｇ／ｍｌのＣｕｍａｔｅをそれぞれ添加した。さらに２４時間培養後、Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ^(R) Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２６１０）キットを用い、その操作説明（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＦＢ０３７）に従って各ウェルの相対蛍光単位ＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）を検出し、検出器は、蛍光マイクロプレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＶｉｃｔｏｒＶ）である。

【0075】

実験結果は、図４に示され、Ｃｕｍａｔｅのみを添加した条件下で、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯとＴＲＥ_３ＧＣｕＯ－ＢＧＩの誘導転写活性は、１．３６Ｅ＋０４ ＲＬＵと４．１６Ｅ＋０４ ＲＬＵであり、無誘導条件よりそれぞれ４．３１倍と３．２７倍向上した。ＤＯＸのみを添加した条件下で、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯとＴＲＥ_３ＧＣｕＯ－ＢＧＩの誘導転写活性は、２．１４Ｅ＋０５ ＲＬＵと５．３４Ｅ＋０５ ＲＬＵであり、無誘導条件よりそれぞれ６７．６６倍と４２．０７倍向上し、Ｃｕｍａｔｅのみを添加した誘導条件より１５．７１倍と１２．８６倍向上した。ＤＯＸとＣｕｍａｔｅを同時に添加した条件下で、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯとＴＲＥ_３ＧＣｕＯ－ＢＧＩの誘導転写活性は、７．５４Ｅ＋０６ ＲＬＵと１．２９Ｅ＋０７ ＲＬＵであり、無誘導条件よりそれぞれ２３８１．０５倍と１０１１．８１倍向上し、Ｃｕｍａｔｅのみを添加した誘導条件より５５２．９９倍と３０９．２７倍向上し、ＤＯＸのみを添加した誘導条件より３５．１９倍と２４．０５倍向上した。以上の結果に基づき、ＴＲＥ_３ＧＣｕＯとＴＲＥ_３ＧＣｕＯ－ＢＧＩ複合応答エレメントは、異なる誘導剤制御組み合わせに従って、異なる転写活性レベルで目的核酸断片の誘導転写活性を制御することができ、その制御範囲は、それぞれ４．３１倍から２３８１．０５倍と３．２７倍から１０１１．８１倍であり、ＤＯＸとＣｕｍａｔｅ誘導剤を同時に添加する時、最大誘導転写活性は、それぞれＣＭＶプロモーターの４７．８４％と８１．５４％に達することができる。さらにＤＯＸ及び／又はＣｕｍａｔｅ誘導剤の濃度を最適化する条件下で、さらに異なる転写活性レベルで目的核酸断片の転写活性を精密に制御することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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