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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-24
(45)【発行日】2024-11-01
(54)【発明の名称】再生ヒト皮膚組織の製造法
(51)【国際特許分類】
A61L 27/60 20060101AFI20241025BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20241025BHJP
A61K 35/36 20150101ALI20241025BHJP
A61K 35/33 20150101ALI20241025BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20241025BHJP
【ＦＩ】
A61L27/60 ZNA
A61L27/38 300
A61K35/36
A61K35/33
C12N5/071
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2020122407
(22)【出願日】2020-07-16
(65)【公開番号】P2022018946
(43)【公開日】2022-01-27
【審査請求日】2023-06-16
(73)【特許権者】
【識別番号】502285457
【氏名又は名称】学校法人順天堂
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】池田 志斈
(72)【発明者】
【氏名】池田 有里
【審査官】柴原 直司
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１６－０１６２６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００９－２１９４９１（ＪＰ，Ａ）
【文献】日本美容皮膚科学会雑誌，2015年，25, [2]，p.264(P-56)
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｌ ２７／６０
Ａ６１Ｌ ２７／３８
Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｔｒａｎｓ ｗｅｌｌ上にヒト線維芽細胞をコラーゲンゲルに包埋し播種し培養した後、その上にヒトメラノサイトに誘導したヒト脂肪組織由来幹細胞を播種し、さらにその上にヒトケラチノサイトを播種し培養し、その際にＴｒａｎｓ ｗｅｌｌ ｕｐｐｅｒにメラノサイト特異的培地を含有することを特徴とする、ヒト成熟メラノサイト、ヒトケラチノサイト及びヒト線維芽細胞を含有する再生ヒト皮膚組織の製造法。
【請求項2】
前記ヒトメラノサイトに誘導したヒト脂肪組織由来幹細胞が、ヒトメラノサイト前駆細胞を含有するヒト脂肪組織前駆細胞をメラノサイト特異的培地で培養した細胞である請求項1記載の再生ヒト皮膚組織の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、再生ヒト皮膚組織の製造法に関する。
【背景技術】
【0002】
重症熱傷、皮膚潰瘍、分節型尋常性白斑等の皮膚疾患に対する治療手段として、自家及び他家（同種）培養皮膚、色素細胞の移植が行なわれている。また、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞（非特許文献１）、間葉系幹細胞（非特許文献２、３）、Ｍｕｓｅ細胞（非特許文献４、５）等を皮膚の再生医療に用いる試みもなされつつある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【文献】PLoS One, 2012:7(12):e52787
【文献】Am. J. Pathol. 173:803-814,2008
【文献】Immunotherapy 4:1859-1867, 2012
【文献】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:8639-8643, 2010
【文献】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108:9875-9880, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
しかし、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の表皮角化細胞への分化は誘導率が低く、また、腫瘍形成の可能性の問題がある。骨髄間葉系細胞は採取が容易でない等の問題がある。
従って、容易に入手可能な細胞を用いた再生皮膚組織の製造法の開発が望まれており、本発明はケラチノサイト、メラノサイト及び線維芽細胞を含む再生皮膚組織の製造法を提供することにある。
従って、容易に入手可能な細胞を用いた再生皮膚組織の製造法の開発が望まれており、本発明はケラチノサイト、メラノサイト及び線維芽細胞を含む再生皮膚組織の製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
そこで本発明者は、容易に採取が可能な皮下脂肪組織に着目して検討してきたところ、全く意外にも、脂肪組織幹細胞中にメラノサイト前駆細胞が分化誘導をかける前に既に存在していることを見出した。そして、そのメラノサイト前駆細胞はメラノサイト特異的培地で培養すれば、メラノサイト特異的マーカー蛋白を明確に発現するようになることも見出した。さらに、これらのメラノサイト前駆細胞を、ヒト線維芽細胞及びヒトケラチノサイトと共に培養すれば、ヒト成熟メラノサイト、ヒトケラチノサイト及びヒト線維芽細胞を含有する再生ヒト皮膚組織が得られることを見出し、本発明を完成した。
【0006】
すなわち、本発明は、次の［１］～［３］を提供するものである。
［１］ヒトメラノサイト前駆細胞を含有するヒト脂肪組織幹細胞を、ヒト線維芽細胞及びヒトケラチノサイトと共に培養することを特徴とする、ヒト成熟メラノサイト、ヒトケラチノサイト及びヒト線維芽細胞を含有する再生ヒト皮膚組織の製造法。
［２］ヒトメラノサイト前駆細胞を含有するヒト脂肪組織幹細胞が、ヒトメラノサイト前駆細胞を含有するヒト脂肪組織幹細胞、又はヒトメラノサイト前駆細胞を含有するヒト脂肪組織幹細胞をメラノサイト特異的培地で培養した細胞である［１］記載の再生ヒト皮膚組織の製造法。
［３］前記ヒト線維芽細胞及びヒトケラチノサイトと共に行う培養系が、コラーゲンゲル中で、ヒト線維芽細胞、ヒトケラチノサイト及び前記ヒト脂肪組織幹細胞を培養する系である［１］又は［２］記載の再生ヒト皮膚組織の製造法。
［１］ヒトメラノサイト前駆細胞を含有するヒト脂肪組織幹細胞を、ヒト線維芽細胞及びヒトケラチノサイトと共に培養することを特徴とする、ヒト成熟メラノサイト、ヒトケラチノサイト及びヒト線維芽細胞を含有する再生ヒト皮膚組織の製造法。
［２］ヒトメラノサイト前駆細胞を含有するヒト脂肪組織幹細胞が、ヒトメラノサイト前駆細胞を含有するヒト脂肪組織幹細胞、又はヒトメラノサイト前駆細胞を含有するヒト脂肪組織幹細胞をメラノサイト特異的培地で培養した細胞である［１］記載の再生ヒト皮膚組織の製造法。
［３］前記ヒト線維芽細胞及びヒトケラチノサイトと共に行う培養系が、コラーゲンゲル中で、ヒト線維芽細胞、ヒトケラチノサイト及び前記ヒト脂肪組織幹細胞を培養する系である［１］又は［２］記載の再生ヒト皮膚組織の製造法。
【発明の効果】
【0007】
本発明で用いる脂肪組織由来幹細胞は、脂肪組織１ｇから約５×１０3個と骨髄組織由来幹細胞に比べて５００倍多く採取可能であり、入手が容易である。また、脂肪組織由来幹細胞は抗原性が低く、免疫抑制作用を有することから、これらから分化誘導されるヒト成熟メラノサイトも抗原性が低く、皮膚に移植が可能である。また、本発明で得られる再生皮膚組織は、ヒトケラチノサイト、ヒト成熟メラノサイトだけでなく線維芽細胞も有し、皮膚の表皮から基底層及び真皮までの機能を有するため、種々の皮膚疾患や老化皮膚への対処が可能である。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】脂肪組織幹細胞の免疫染色結果を示す。
【図2】脂肪組織幹細胞の免疫染色結果を示す。
【図3-1】脂肪組織幹細胞のＲＴ－ＰＣＲ結果を示す。
【図3-2】脂肪組織幹細胞のＲＴ－ＰＣＲ結果を示す。
【図4】ｓｉＲＮＡ法で脂肪組織幹細胞のＨＭＢ４５をノックダウンした結果を示す。
【図5】脂肪組織幹細胞のウェスタンブロッティングの結果を示す。
【図6】脂肪組織幹細胞のウェスタンブロッティングの結果を示す。
【図7】脂肪組織幹細胞の免疫電顕の結果を示す。
【図8】３次元培養後の組織のＨＭＢ４５とチロシナーゼ（ＴＹＲ）の発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明は、ヒトメラノサイト前駆細胞を含有するヒト脂肪組織幹細胞を、ヒト線維芽細胞及びヒトケラチノサイトと共に培養することを特徴とする、ヒト成熟メラノサイト、ヒトケラチノサイト及びヒト線維芽細胞を含有する再生ヒト皮膚組織の製造法である。
【0010】
本発明の製造法の原料は、ヒトメラノサイト前駆細胞を含有するヒト脂肪組織幹細胞である。
原料である脂肪組織幹細胞は、脂肪組織、例えば皮下脂肪組織をコラゲナーゼ処理後、遠心分離により間質血管細胞群を分離することにより採取することができる。
得られた脂肪組織幹細胞であることは、（１）この細胞が、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ９０及びＣＤ１０５陽性であること、（２）この細胞を、３－イソブチル－１－メチルキサンチン、ビオチン、パントテン酸塩、ロシグリタゾン、デキサメサゾン、インスリン等の存在下に培養して脂肪細胞へ分化すること、を確認すればよい。
脂肪組織幹細胞は、患者に対して拒絶反応を生じないヒトを含む動物由来であればよいが、自家細胞が望ましい。
原料である脂肪組織幹細胞は、脂肪組織、例えば皮下脂肪組織をコラゲナーゼ処理後、遠心分離により間質血管細胞群を分離することにより採取することができる。
得られた脂肪組織幹細胞であることは、（１）この細胞が、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ９０及びＣＤ１０５陽性であること、（２）この細胞を、３－イソブチル－１－メチルキサンチン、ビオチン、パントテン酸塩、ロシグリタゾン、デキサメサゾン、インスリン等の存在下に培養して脂肪細胞へ分化すること、を確認すればよい。
脂肪組織幹細胞は、患者に対して拒絶反応を生じないヒトを含む動物由来であればよいが、自家細胞が望ましい。
【0011】
本発明者は、採取が容易な皮下脂肪組織から分離したヒト脂肪組織幹細胞中に、ヒトメラノサイト前駆細胞が存在することを初めて見出した。すなわち、後記実施例に示すように、ａ）免疫染色により、メラノサイトのマーカータンパクである、ＭｅｌａｎＡ、ＭＡＴＰ、ＨＭＢ４５（前駆メラノソームタンパク）、ＬＡＭＰ１、ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＭｅｌＥＭ、Ｍｅｌ２が分化誘導前のヒト脂肪組織幹細胞で発現しており、ｂ）ＲＴ－ＰＣＲで、分化誘導前のヒト脂肪組織幹細胞でＭＩＴＦ、ＫＩＴ、ＰＡＸ３のメラノサイトの転写因子が発現しており、ｃ）ｓｉＲＮＡ法でヒト脂肪組織幹細胞のＨＭＢ４５をノックダウンすると、この細胞おけるＨＭＢ４５の発現が消褪し、ｄ）ウェスタンブロッティングにおいて、分化誘導前のヒト脂肪組織幹細胞でＨＭＢ４５とＭＩＴＦが発現しており、ｅ）免疫電顕でも、分化誘導前の脂肪細胞幹細胞でＨＭＢ４５が発現していることを確認した。
本発明では、このようにヒトメラノサイト前駆細胞を含有するヒト脂肪組織幹細胞を使用することができる。
本発明では、このようにヒトメラノサイト前駆細胞を含有するヒト脂肪組織幹細胞を使用することができる。
【0012】
また、ヒトメラノサイト前駆細胞を含有するヒト脂肪組織幹細胞は、メラノサイト特異的培地で培養すると、メラノサイトマーカータンパクの発現がさらに増強するので、本発明においては、このヒトメラノサイト前駆細胞を含有するヒト脂肪組織幹細胞をメラノサイト特異的培地で培養したヒト脂肪組織幹細胞を用いるのがより好ましい。ここで、メラノサイトマーカータンパクの発現増強は、前記免疫染色、ＲＴ－ＰＣＲ、ｓｉＲＮＡ法によるＨＭＢ４５ノックダウン、ウェスタンブロッティング、免疫電顕により確認することができる。
メラノサイト特異的培地としては、例えば、基礎培地としてＫＵＲＡＢＯ社のＤｅｒｍａＬｉｆｅ（登録商標）ＢＭ（ＫＵＲＡＢＯ）にＤｅｒｍａＬｉｆｅ（登録商標）Ｍ ＬｉｆｅＦａｃｔｏｒｓ（Ｌ－グルタミン１５ｍＬ、エピネフリン０．５ｍＬ、インスリン０．５ｍＬ、ＳｔｉＭｅｌ８（登録商標）ＬｉｆｅＦａｃｔｏｒ５ｍＬ、アスコルビン酸０．５ｍＬ、塩化カルシウム１．０ｍＬ、ゲンタマイシン／アンフォテリシン０．５ｍＬ）を添加したものを使用できる。
その他に上記培地にさらにＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））５０ｎｇ/ｍｌ、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ３（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）１００ｎＭ、ＳＣＦ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）１０ｎｇ/ｍＬ、ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）１．６６ｍｇ／Ｌ、Ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ（Ｎａｃａｌａｉ）２５μＭ ｉｎ ｅｔｈａｎｏｌを添加した培地も使用できる。
メラノサイト特異的培地としては、例えば、基礎培地としてＫＵＲＡＢＯ社のＤｅｒｍａＬｉｆｅ（登録商標）ＢＭ（ＫＵＲＡＢＯ）にＤｅｒｍａＬｉｆｅ（登録商標）Ｍ ＬｉｆｅＦａｃｔｏｒｓ（Ｌ－グルタミン１５ｍＬ、エピネフリン０．５ｍＬ、インスリン０．５ｍＬ、ＳｔｉＭｅｌ８（登録商標）ＬｉｆｅＦａｃｔｏｒ５ｍＬ、アスコルビン酸０．５ｍＬ、塩化カルシウム１．０ｍＬ、ゲンタマイシン／アンフォテリシン０．５ｍＬ）を添加したものを使用できる。
その他に上記培地にさらにＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））５０ｎｇ/ｍｌ、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ３（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）１００ｎＭ、ＳＣＦ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）１０ｎｇ/ｍＬ、ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）１．６６ｍｇ／Ｌ、Ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ（Ｎａｃａｌａｉ）２５μＭ ｉｎ ｅｔｈａｎｏｌを添加した培地も使用できる。
【0013】
ヒト脂肪組織幹細胞をメラノサイト特異的培地で培養するには、例えば、コラーゲンIV（５μｇ/ｍＬ 新田ゼラチン）コートしたシャーレにヒト脂肪組織幹細胞を播種しヒト脂肪組織幹細胞専用培地（ＡＤＳＣ－ＢＭ， ＬＯＮＺＡ）を用いて３～７日程度培養を行うのが好ましい。その後メラノサイト特異的培地に培地交換を行い、７～１４日程度培養を行うのが好ましい。
【0014】
ヒトメラノサイト前駆細胞を含有するヒト脂肪組織幹細胞を、ヒト線維芽細胞及びヒトケラチノサイトと共に培養する。
ヒト線維芽細胞としては、ヒト真皮線維芽細胞が好ましい。
線維芽細胞は、結合組織から採取することができ、例えば、皮膚を径５ｍｍ大で切り取り、その真皮成分より採取することができる。
ヒトケラチノサイトとしては、例えば、ＫＵＲＡＢＯ社の凍結ＮＨＥＫを使用することができる。
ヒト線維芽細胞としては、ヒト真皮線維芽細胞が好ましい。
線維芽細胞は、結合組織から採取することができ、例えば、皮膚を径５ｍｍ大で切り取り、その真皮成分より採取することができる。
ヒトケラチノサイトとしては、例えば、ＫＵＲＡＢＯ社の凍結ＮＨＥＫを使用することができる。
【0015】
これらの細胞の共培養手段としては、３次元培養法が好ましく、皮膚組織を再生する点から、コラーゲンゲル中で、ヒト線維芽細胞、ヒトケラチノサイト及び前記ヒト脂肪組織幹細胞を培養する系であるのがより好ましい。さらには、皮膚組織においては、線維芽細胞を含有する真皮の上層に基底層を介してメラノサイト及びケラチノサイトを含有する表皮が存在することから、コラーゲンゲル中に線維芽細胞を包埋培養したヒトケラチノサイトと前記ヒト脂肪組織幹細胞を重ねて培養する３次元培養系が好ましい。ここで、コラーゲンゲルは、Ｉ型及びＩＶ型コラーゲンゲルであるのが好ましい。
３次元培養法の培養条件は、まず６ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ）とＴｒａｎｓ ｗｅｌｌのコラーゲンIVコート（５μｇ/ｍＬ）を行う。Ｔｒａｎｓ ｗｅｌｌ上に線維芽細胞を５．０ｘ１０４～１．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌでコラーゲンＩゲルに包埋し播種し２日程度培養する。２日経過後、その上にメラノサイトに誘導したヒト脂肪組織由来幹細胞を２．５ｘ１０４～５．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌで播種する。さらにその上にＮＨＥＫを５．０ｘ１０４～１．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌで播種し、その後１４～１５日程度培養する。培地は６ｗｅｌｌのｌｏｗｅｒはＮＨＤＦ Ｍｅｄｉｕｍとして１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を使用（２ｍｌ/ｗｅｌｌ）。Ｔｒａｎｓ ｗｅｌｌ ｕｐｐｅｒには、上記のメラノサイト特異的培地を５００μＬとＮＨＥＫ ＭｅｄｉｕｍとしてＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２（インスリン、ｈＥＧＦ、ハイドロコーチゾン、ＢＰＥを添加；ｋｕｒａｂｏ）５００μＬを添加する。２日に一回程度培地交換を施行するのが好ましい。
３次元培養法の培養条件は、まず６ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ）とＴｒａｎｓ ｗｅｌｌのコラーゲンIVコート（５μｇ/ｍＬ）を行う。Ｔｒａｎｓ ｗｅｌｌ上に線維芽細胞を５．０ｘ１０４～１．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌでコラーゲンＩゲルに包埋し播種し２日程度培養する。２日経過後、その上にメラノサイトに誘導したヒト脂肪組織由来幹細胞を２．５ｘ１０４～５．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌで播種する。さらにその上にＮＨＥＫを５．０ｘ１０４～１．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌで播種し、その後１４～１５日程度培養する。培地は６ｗｅｌｌのｌｏｗｅｒはＮＨＤＦ Ｍｅｄｉｕｍとして１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を使用（２ｍｌ/ｗｅｌｌ）。Ｔｒａｎｓ ｗｅｌｌ ｕｐｐｅｒには、上記のメラノサイト特異的培地を５００μＬとＮＨＥＫ ＭｅｄｉｕｍとしてＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２（インスリン、ｈＥＧＦ、ハイドロコーチゾン、ＢＰＥを添加；ｋｕｒａｂｏ）５００μＬを添加する。２日に一回程度培地交換を施行するのが好ましい。
【0016】
このような３次元培養により、表皮基底層にヒト成熟メラノサイトが誘導され、得られた３次元培養皮膚は、ヒト成熟メラノサイト、ヒトケラチノサイト及びヒト線維芽細胞を含有する再生ヒト皮膚組織である。ここで、ヒトメラノサイト前駆細胞がヒト成熟メラノサイトに分化したことは、チロシナーゼ、すなわちメラニン合成に必須の酵素が発現していることで確認できる。
【0017】
本発明方法によれば、入手が容易なヒト脂肪組織幹細胞を原料として用い、簡便な操作により、ヒト成熟メラノサイト、ヒトケラチノサイト及びヒト線維芽細胞を含有する再生ヒト皮膚組織が得られる。従って、本発明によれば、表皮や毛髪などの再生が可能となる。また、本発明の製造法の過程を検討することにより、皮膚疾患の治療手段や老化皮膚への対処手段の研究が可能となる。
【実施例】
【0018】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【0019】
［材料及び方法］
（１）ヒト脂肪組織幹細胞の採取
１）皮下脂肪組織を採取し、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄した。コラゲナーゼに浸した後１０％仔ウシ血清含有ダルベッコ変法イーグル培地にてコラゲナーゼを中和した。
２）４０μｍのナイロンメッシュを通して残渣を除去した。１２００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈殿物を回収した。再び１０％仔ウシ血清含有ダルベッコ変法イーグル培地５ｍｌに溶解し、培養プレートに播種して数日間培養し、培養プレート底面に接着したものが脂肪組織幹細胞である。
３）フローサイトメトリーにてＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５が陽性であることを確認した。
４）得られた細胞を播種して１０％仔ウシ血清含有Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地にて培養後、３％仔ウシ血清及び３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ、ビオチン、ｐａｎｔｈｏｔｈｅｎａｔｅ、ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ、デキサメサゾン、ヒトインスリン含有Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地に変えて３日間培養した。次に前記培地より３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅを除いたものに変更後、３日ごとに培地を交換し、約１２日間培養する。本細胞をＯｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色にて脂肪細胞に分化していることを確認した。以上の手順３）、４）によって本細胞が脂肪組織幹細胞であることを確認した。
（１）ヒト脂肪組織幹細胞の採取
１）皮下脂肪組織を採取し、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄した。コラゲナーゼに浸した後１０％仔ウシ血清含有ダルベッコ変法イーグル培地にてコラゲナーゼを中和した。
２）４０μｍのナイロンメッシュを通して残渣を除去した。１２００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈殿物を回収した。再び１０％仔ウシ血清含有ダルベッコ変法イーグル培地５ｍｌに溶解し、培養プレートに播種して数日間培養し、培養プレート底面に接着したものが脂肪組織幹細胞である。
３）フローサイトメトリーにてＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５が陽性であることを確認した。
４）得られた細胞を播種して１０％仔ウシ血清含有Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地にて培養後、３％仔ウシ血清及び３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ、ビオチン、ｐａｎｔｈｏｔｈｅｎａｔｅ、ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ、デキサメサゾン、ヒトインスリン含有Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地に変えて３日間培養した。次に前記培地より３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅを除いたものに変更後、３日ごとに培地を交換し、約１２日間培養する。本細胞をＯｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色にて脂肪細胞に分化していることを確認した。以上の手順３）、４）によって本細胞が脂肪組織幹細胞であることを確認した。
【0020】
（２）ヒト線維芽細胞
皮膚を径５ｍｍ大で切り取り、その真皮成分より採取することができる。具体的には、線維芽細胞は、同意を得た患者皮膚より採取し培養を行った。
皮膚を径５ｍｍ大で切り取り、その真皮成分より採取することができる。具体的には、線維芽細胞は、同意を得た患者皮膚より採取し培養を行った。
【0021】
（３）ヒトケラチノサイト
ＫＵＲＡＢＯ社の凍結ＮＨＥＫを使用した。
ＫＵＲＡＢＯ社の凍結ＮＨＥＫを使用した。
【0022】
（４）免疫染色
ＨＭＢ４５を多重染色、ＭｅｌａｎＡ、ＭＡＴＰ、ＭｅｌＥＭ、ＭＩＴＦ、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、Ｍｅｌ２を免疫染色する。
Ｎｕｎｃ４ｗｅｌｌプレートにカバーガラスをのせ、コラーゲンIVコーティングを施行。その上に誘導したヒト脂肪組織由来幹細胞、ヒト脂肪組織由来幹細胞、メラノーマ細胞を６０～７０％程度になるまで培養した。
４％パラホルムアルデヒドを用いて常温で１５分固定を行う。１０％Ｎｏｒｍａｌ Ｇｏａｔ Ｓｅｒｕｍと０．１％サポニン又は０．１％Ｔｒｉｔｏｎ/ＰＢＳを用いてブロッキング施行。２％ＢＳＡ/ＰＢＳに０．１％サポニンを加えたもの、または２％ＢＳＡ/ＰＢＳ単独に一次抗体としてＡｎｔｉ－ＨＭＢ４５ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ ａｂ７３３ Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｋ ＩｇＧ）１/５０希釈とＡｎｔｉ－ＬＡＭＰ１ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｌｙｓｏｓｏｍｅ Ｍａｒｋｅｒ（Ａｂｃａｍ ａｂ２４１７０ Ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ＩｇＧ）１/５００希釈を添加する、またはＭｅｌＥＭ＿ＤＳＨＢ（希釈せずに添加、 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｂａｎｋ、 ｈｏｓｔ ｍｏｕｓｅ） Ａｎｔｉ－ＭＩＴＦ ａｎｔｉｂｏｄｙ （ａｂ２０６６３ Ａｂｃａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 ｈｏｓｔ ｒａｂｂｉｔ）１/２５０, Ａｎｔｉ－Ｍｅｌａｎ Ａ ａｎｔｉｂｏｄｙ （ａｂ２１０５４６ Ａｂｃａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 ｈｏｓｔ ｒａｂｂｉｔ）１/１０００、Ｍｅｌ２ （Ａｎｔｉ－Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｂ１２８７５９、Ａｂｃａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 ｈｏｓｔ ｍｏｕｓｅ）１/５００、ＭＡＴＰ （ｓｃ－３７７３９７, Ａｂｃａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, ｈｏｓｔ ｍｏｕｓｅ）１/５０, Ａｎｔｉ－Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ａｂ７３８、 Ａｂｃａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, ｈｏｓｔ ｍｏｕｓｅ）１/２５０を添加し４℃ ｏｖｅｒｎｉｇｈｔで一次抗体反応を行う。
２％ＢＳＡ/ＰＢＳに０．１％サポニンを加えたもの、または２％ＢＳＡ/ＰＢＳ単独に二次抗体としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） １/３００希釈とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） １/５００希釈を使用、またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） １/４００希釈とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）） １/４００希釈を使用し室温で１時間二次抗体反応を行う。洗浄後、Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ, ＣＡ, ＵＳＡ）を滴下し固定する。
その後キーエンス蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｏｓａｋａ）で解析、撮影を行った。
ＨＭＢ４５を多重染色、ＭｅｌａｎＡ、ＭＡＴＰ、ＭｅｌＥＭ、ＭＩＴＦ、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、Ｍｅｌ２を免疫染色する。
Ｎｕｎｃ４ｗｅｌｌプレートにカバーガラスをのせ、コラーゲンIVコーティングを施行。その上に誘導したヒト脂肪組織由来幹細胞、ヒト脂肪組織由来幹細胞、メラノーマ細胞を６０～７０％程度になるまで培養した。
４％パラホルムアルデヒドを用いて常温で１５分固定を行う。１０％Ｎｏｒｍａｌ Ｇｏａｔ Ｓｅｒｕｍと０．１％サポニン又は０．１％Ｔｒｉｔｏｎ/ＰＢＳを用いてブロッキング施行。２％ＢＳＡ/ＰＢＳに０．１％サポニンを加えたもの、または２％ＢＳＡ/ＰＢＳ単独に一次抗体としてＡｎｔｉ－ＨＭＢ４５ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ ａｂ７３３ Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｋ ＩｇＧ）１/５０希釈とＡｎｔｉ－ＬＡＭＰ１ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｌｙｓｏｓｏｍｅ Ｍａｒｋｅｒ（Ａｂｃａｍ ａｂ２４１７０ Ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ＩｇＧ）１/５００希釈を添加する、またはＭｅｌＥＭ＿ＤＳＨＢ（希釈せずに添加、 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｂａｎｋ、 ｈｏｓｔ ｍｏｕｓｅ） Ａｎｔｉ－ＭＩＴＦ ａｎｔｉｂｏｄｙ （ａｂ２０６６３ Ａｂｃａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 ｈｏｓｔ ｒａｂｂｉｔ）１/２５０, Ａｎｔｉ－Ｍｅｌａｎ Ａ ａｎｔｉｂｏｄｙ （ａｂ２１０５４６ Ａｂｃａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 ｈｏｓｔ ｒａｂｂｉｔ）１/１０００、Ｍｅｌ２ （Ａｎｔｉ－Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｂ１２８７５９、Ａｂｃａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 ｈｏｓｔ ｍｏｕｓｅ）１/５００、ＭＡＴＰ （ｓｃ－３７７３９７, Ａｂｃａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, ｈｏｓｔ ｍｏｕｓｅ）１/５０, Ａｎｔｉ－Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ａｂ７３８、 Ａｂｃａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, ｈｏｓｔ ｍｏｕｓｅ）１/２５０を添加し４℃ ｏｖｅｒｎｉｇｈｔで一次抗体反応を行う。
２％ＢＳＡ/ＰＢＳに０．１％サポニンを加えたもの、または２％ＢＳＡ/ＰＢＳ単独に二次抗体としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） １/３００希釈とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） １/５００希釈を使用、またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） １/４００希釈とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）） １/４００希釈を使用し室温で１時間二次抗体反応を行う。洗浄後、Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ, ＣＡ, ＵＳＡ）を滴下し固定する。
その後キーエンス蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｏｓａｋａ）で解析、撮影を行った。
【0023】
（５）ＲＴ－ＰＣＲ
６ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ）にコラーゲンIVコートを施行し、誘導したヒト脂肪組織由来幹細胞、ヒト脂肪組織由来幹細胞、陽性コントロールとしてメラノーマ細胞を培養した。
ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ ｋｉｔ （Ｔｏｙｏｂｏ, Ｏｓａｋａ, Ｊａｐａｎ）を用いて２ μｇの ＲＮＡを ｃＤＮＡにする。ＴａｑＭａｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ, ＣＡ, ＵＳＡ）を用い１μｇ ｃＤＮＡをＳｔｅｐ Ｏｎｅ Ｐｌｕｓ ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて５０サイクルまわす。
内在性コントロールとしてβ-actinを基準とし、ＨＭＢ４５ （Ｇｅｎｅ Ａｌｉａｓ： ＰＭＥＬ, Ｈｓ００１７３８５４＿Ｍ１）, ＫＩＴ （Ｈｓ００１７４０２９＿Ｍ１）, ＭＩＴＦ （Ｈｓ０１１１７２９４＿Ｍ１） ａｎｄ ＰＡＸ３ （Ｈｓ００２４０９５０＿Ｍ１） の発現上昇を確認した。
相対的ｍＲＮＡレベルを算出するのに２－ΔΔＣｔを使った比較のサイクル閾値（ｃｔ）方法を用いた。
６ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ）にコラーゲンIVコートを施行し、誘導したヒト脂肪組織由来幹細胞、ヒト脂肪組織由来幹細胞、陽性コントロールとしてメラノーマ細胞を培養した。
ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ ｋｉｔ （Ｔｏｙｏｂｏ, Ｏｓａｋａ, Ｊａｐａｎ）を用いて２ μｇの ＲＮＡを ｃＤＮＡにする。ＴａｑＭａｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ, ＣＡ, ＵＳＡ）を用い１μｇ ｃＤＮＡをＳｔｅｐ Ｏｎｅ Ｐｌｕｓ ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて５０サイクルまわす。
内在性コントロールとしてβ-actinを基準とし、ＨＭＢ４５ （Ｇｅｎｅ Ａｌｉａｓ： ＰＭＥＬ, Ｈｓ００１７３８５４＿Ｍ１）, ＫＩＴ （Ｈｓ００１７４０２９＿Ｍ１）, ＭＩＴＦ （Ｈｓ０１１１７２９４＿Ｍ１） ａｎｄ ＰＡＸ３ （Ｈｓ００２４０９５０＿Ｍ１） の発現上昇を確認した。
相対的ｍＲＮＡレベルを算出するのに２－ΔΔＣｔを使った比較のサイクル閾値（ｃｔ）方法を用いた。
【0024】
（６）ｓｉＲＮＡ法によるＨＭＢ４５のノックダウン
誘導したヒト脂肪組織由来幹細胞、ヒト脂肪組織由来幹細胞を６ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ）に播種し二日間培養した。
ｓｉＲＮＡ－１ （ｓｉＲＮＡ ＩＤ♯：Ｓ１２８６１,ｓｅｎｓｅ： ５‘－ＧＧＵＵＡＵＣＵＧＧＧＵＣＡＡＣＡＡＵｔｔ－３’（配列番号１） ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ： ３‘－ＡＵＵＧＵＵＧＡＣＣＣＡＧＡＵＡＡＣＣｔｇ－５’（配列番号２））, ｓｉＲＮＡ－２ （ｓｉＲＮＡ ＩＤ♯：Ｓ１２８５９, ｓｅｎｓｅ： ５‘－ＡＧＡＡＧＵＵＧＵＧＧＧＵＡＣＵＡＣＡｔｔ－３’（配列番号３） ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ： ３‘－ＵＧＵＡＧＵＡＣＣＣＡＣＡＡＣＵＵＣＵｇｔ－５’（配列番号４））, ｓｉＲＮＡ－３ （ｓｉＲＮＡ ＩＤ♯：Ｓ１２８６０, ｓｅｎｓｅ： ５‘－ＵＡＵＣＡＵＧＣＣＵＧＧＵＣＡＡＧＡＡｔｔ－３’（配列番号５） ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ： ３‘－ＵＵＣＵＵＧＡＣＣＡＧＧＣＡＵＧＡＵＡａｇ－５’（配列番号６））の３つのＨＭＢ４５を対象としたｓｉＲＮＡをＳｉｌｅｎｃｅｒ ｓｅｌｅｃｔ ｓｉＲＮＡ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ, ＵＳＡ）によりデザインした。
ＯｐｔｉＭｅｍ と Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉ ＭＡＸ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｔｈｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ, ＵＳＡ）を用いて３０ｐｍｏｌ ＳｉＲＮＡ１.２．３をｓｉＲＮＡ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ （Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ ♯４３９０８４３）, ｓｉＲＮＡ－Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ＧＡＰＤＨ （Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ ♯４３９０８４９）とともに遺伝子導入した。
４８時間後にリアルタイムＰＣＲでＨＭＢ４５の発現が抑制されていることを確認した。
誘導したヒト脂肪組織由来幹細胞、ヒト脂肪組織由来幹細胞を６ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ）に播種し二日間培養した。
ｓｉＲＮＡ－１ （ｓｉＲＮＡ ＩＤ♯：Ｓ１２８６１,ｓｅｎｓｅ： ５‘－ＧＧＵＵＡＵＣＵＧＧＧＵＣＡＡＣＡＡＵｔｔ－３’（配列番号１） ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ： ３‘－ＡＵＵＧＵＵＧＡＣＣＣＡＧＡＵＡＡＣＣｔｇ－５’（配列番号２））, ｓｉＲＮＡ－２ （ｓｉＲＮＡ ＩＤ♯：Ｓ１２８５９, ｓｅｎｓｅ： ５‘－ＡＧＡＡＧＵＵＧＵＧＧＧＵＡＣＵＡＣＡｔｔ－３’（配列番号３） ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ： ３‘－ＵＧＵＡＧＵＡＣＣＣＡＣＡＡＣＵＵＣＵｇｔ－５’（配列番号４））, ｓｉＲＮＡ－３ （ｓｉＲＮＡ ＩＤ♯：Ｓ１２８６０, ｓｅｎｓｅ： ５‘－ＵＡＵＣＡＵＧＣＣＵＧＧＵＣＡＡＧＡＡｔｔ－３’（配列番号５） ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ： ３‘－ＵＵＣＵＵＧＡＣＣＡＧＧＣＡＵＧＡＵＡａｇ－５’（配列番号６））の３つのＨＭＢ４５を対象としたｓｉＲＮＡをＳｉｌｅｎｃｅｒ ｓｅｌｅｃｔ ｓｉＲＮＡ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ, ＵＳＡ）によりデザインした。
ＯｐｔｉＭｅｍ と Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉ ＭＡＸ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｔｈｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ, ＵＳＡ）を用いて３０ｐｍｏｌ ＳｉＲＮＡ１.２．３をｓｉＲＮＡ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ （Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ ♯４３９０８４３）, ｓｉＲＮＡ－Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ＧＡＰＤＨ （Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ ♯４３９０８４９）とともに遺伝子導入した。
４８時間後にリアルタイムＰＣＲでＨＭＢ４５の発現が抑制されていることを確認した。
【0025】
（７）ウェスタンブロッティング
６ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ）にコラーゲンIVコートを施行し、誘導したヒト脂肪組織由来幹細胞、ヒト脂肪組織由来幹細胞、陽性コントロールとしてメラノサイトを培養した。
Ｍ－ＰＥＲ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ と１/１００希釈したＰｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ （Ｐ８３４０,Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて細胞の蛋白回収を行う。
１０％ Ｔｒｉｓ－ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ, Ｈｅｒｃｕｌｅｓ, ＣＡ, ＵＳＡ）を用いて電気泳動を行い、ニトロセルロースメンブレンに転写する。
Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅに５％スキムミルクを溶かし、ブロッキングを施行。抗ＨＭＢ４５抗体（１：１００； ｆｒｏｍ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と抗ＭＩＴＦ抗体（１μｇ/ｍＬ； ｆｒｏｍ Ａｂｃａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） β－ａｃｔｉｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （１：２０００； ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ, Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, ＣＡ, ＵＳＡ）に浸し、４℃ overnightで一次抗体反応を行う。洗浄後、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ （１：２０００, Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, ＵＳＡ）とａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ （１：２０００, Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, ＵＳＡ）を用いて二次抗体反応を一時間室温で行う。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ （Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ,ＵＳＡ）で標識しＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００ ｓｙｓｔｅｍ （Ｃｙｔｉｖａ, Ｔｏｋｙｏ, Ｊａｐａｎ）で解析を行った。
６ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ）にコラーゲンIVコートを施行し、誘導したヒト脂肪組織由来幹細胞、ヒト脂肪組織由来幹細胞、陽性コントロールとしてメラノサイトを培養した。
Ｍ－ＰＥＲ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ と１/１００希釈したＰｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ （Ｐ８３４０,Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて細胞の蛋白回収を行う。
１０％ Ｔｒｉｓ－ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ, Ｈｅｒｃｕｌｅｓ, ＣＡ, ＵＳＡ）を用いて電気泳動を行い、ニトロセルロースメンブレンに転写する。
Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅに５％スキムミルクを溶かし、ブロッキングを施行。抗ＨＭＢ４５抗体（１：１００； ｆｒｏｍ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と抗ＭＩＴＦ抗体（１μｇ/ｍＬ； ｆｒｏｍ Ａｂｃａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） β－ａｃｔｉｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （１：２０００； ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ, Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, ＣＡ, ＵＳＡ）に浸し、４℃ overnightで一次抗体反応を行う。洗浄後、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ （１：２０００, Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, ＵＳＡ）とａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ （１：２０００, Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, ＵＳＡ）を用いて二次抗体反応を一時間室温で行う。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ （Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ,ＵＳＡ）で標識しＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００ ｓｙｓｔｅｍ （Ｃｙｔｉｖａ, Ｔｏｋｙｏ, Ｊａｐａｎ）で解析を行った。
【0026】
（８）免疫電顕
Ｎｕｎｃ４ｗｅｌｌプレートにカバーガラスをのせ、コラーゲンIVコーティングを施行。その上に誘導したヒト脂肪組織由来幹細胞、ヒト脂肪組織由来幹細胞、メラノーマ細胞を６０～７０％程度になるまで培養した。
０．１ Ｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ７．２） で緩衝された４％パラホルムアルデヒドで固定し、４℃で一晩置く。ＰＢＳで３回洗浄し０．１５％ ｇｌｙｃｉｎｅ ｉｎ ＰＢＳにつけ、０．１ＭＰＢに入りの１２％ゼラチンに包埋した。ペレットを氷上で１ｍｍ３以内に切り、２．３Ｍスクロース入りの０．１ＭＰＢに４℃で一晩浸し、ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｈｏｌｄｅｒ （Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｖｉｅｎｎａ, Ａｕｓｔｒｉａ）に配置し、使用するまで液体窒素で保存する。
Ｌｅｉｃａ ＵＣ７/ＦＣ７で－８０℃で４００ｎｍの厚さに切り、２％ ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅと２．３Ｍ ｓｕｃｒｏｓｅを１：１で配合したものにつけ、ａｍｉｎｏ ｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙ ｓｉｌａｎｅ （Ｍａｔｓｕｎａｍｉ Ｇｌａｓｓ, Ｋｉｓｈｉｗａｄａ, Ｊａｐａｎ）でコーティングされたガラスに置く。
その後、切片にｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ＨＭＢ４５ａｎｔｉｂｏｄｙ （１：５０, Ａｂｃａｍ ａｂ７３３, Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ, ＵＫ） を用いて一晩４℃で一次抗体反応を行う。Ａｌｅｘａ ４８８ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （１：２００, Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ, Ｃａｒｌｓｂａｄ, ＣＡ）を用いて一時間常温で二次抗体反応を行う。ＤＡＰＩによる核染色後に蒸留水で希釈した５０％グリセロールで封入し、ＢＺ－Ｘ７００ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ （Ｋｅｙｅｎｃｅ, Ｏｓａｋａ, Ｊａｐａｎ）で観察した。
免疫電子顕微鏡についてはＬｅｉｃａ ＵＣ７/ＦＣ７により－１２０℃で７０ｎｍまでの厚さの超薄型凍結切片を作成。２％メチルセルロースと２．３Ｍスクロースを１：１に配合した液に入れｎｉｃｋｅｌ ｇｒｉｄに移動した。切片は０．１５％のグリシンを含むＰＢＳですすぎ、１％ＢＳＡ入りのＰＢＳで洗浄後、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ＨＭＢ４５ａｎｔｉｂｏｄｙ （１：５, Ａｂｃａｍ ａｂ７３３, Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ, ＵＫ）を用いて一晩４℃で一次抗体反応を行う。
ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ １２ ｎｍ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ （１：４０, Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ, Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ, ＭＥ）を用いて二次抗体反応を行った。切片は１％ＧＡ入りのＰＢＳで洗浄し、０．４％ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ （ｐＨ ４．０）を用いて１．８％ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅの薄い層に封入し、乾燥後にＨｉｔａｃｈｉ ＨＴ７７００ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ （Ｈｉｔａｃｈｉ, Ｔｏｋｙｏ, Ｊａｐａｎ）で観察した。
Ｎｕｎｃ４ｗｅｌｌプレートにカバーガラスをのせ、コラーゲンIVコーティングを施行。その上に誘導したヒト脂肪組織由来幹細胞、ヒト脂肪組織由来幹細胞、メラノーマ細胞を６０～７０％程度になるまで培養した。
０．１ Ｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ７．２） で緩衝された４％パラホルムアルデヒドで固定し、４℃で一晩置く。ＰＢＳで３回洗浄し０．１５％ ｇｌｙｃｉｎｅ ｉｎ ＰＢＳにつけ、０．１ＭＰＢに入りの１２％ゼラチンに包埋した。ペレットを氷上で１ｍｍ３以内に切り、２．３Ｍスクロース入りの０．１ＭＰＢに４℃で一晩浸し、ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｈｏｌｄｅｒ （Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｖｉｅｎｎａ, Ａｕｓｔｒｉａ）に配置し、使用するまで液体窒素で保存する。
Ｌｅｉｃａ ＵＣ７/ＦＣ７で－８０℃で４００ｎｍの厚さに切り、２％ ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅと２．３Ｍ ｓｕｃｒｏｓｅを１：１で配合したものにつけ、ａｍｉｎｏ ｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙ ｓｉｌａｎｅ （Ｍａｔｓｕｎａｍｉ Ｇｌａｓｓ, Ｋｉｓｈｉｗａｄａ, Ｊａｐａｎ）でコーティングされたガラスに置く。
その後、切片にｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ＨＭＢ４５ａｎｔｉｂｏｄｙ （１：５０, Ａｂｃａｍ ａｂ７３３, Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ, ＵＫ） を用いて一晩４℃で一次抗体反応を行う。Ａｌｅｘａ ４８８ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （１：２００, Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ, Ｃａｒｌｓｂａｄ, ＣＡ）を用いて一時間常温で二次抗体反応を行う。ＤＡＰＩによる核染色後に蒸留水で希釈した５０％グリセロールで封入し、ＢＺ－Ｘ７００ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ （Ｋｅｙｅｎｃｅ, Ｏｓａｋａ, Ｊａｐａｎ）で観察した。
免疫電子顕微鏡についてはＬｅｉｃａ ＵＣ７/ＦＣ７により－１２０℃で７０ｎｍまでの厚さの超薄型凍結切片を作成。２％メチルセルロースと２．３Ｍスクロースを１：１に配合した液に入れｎｉｃｋｅｌ ｇｒｉｄに移動した。切片は０．１５％のグリシンを含むＰＢＳですすぎ、１％ＢＳＡ入りのＰＢＳで洗浄後、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ＨＭＢ４５ａｎｔｉｂｏｄｙ （１：５, Ａｂｃａｍ ａｂ７３３, Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ, ＵＫ）を用いて一晩４℃で一次抗体反応を行う。
ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ １２ ｎｍ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ （１：４０, Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ, Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ, ＭＥ）を用いて二次抗体反応を行った。切片は１％ＧＡ入りのＰＢＳで洗浄し、０．４％ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ （ｐＨ ４．０）を用いて１．８％ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅの薄い層に封入し、乾燥後にＨｉｔａｃｈｉ ＨＴ７７００ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ （Ｈｉｔａｃｈｉ, Ｔｏｋｙｏ, Ｊａｐａｎ）で観察した。
【0027】
（９）３次元培養
コラーゲンゲル液としては、ｔｙｐｅ１ ｃｏｌｌａｇｅｎ （３ｍｇ/ｍＬ）と ５－ｆｏｌｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＭＥとｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎを ７：２：１（ｐｕｒｃｈａｓｅｄ ｆｒｏｍ Ｎｉｔｔａ Ｇｅｌａｔｉｎ Ｃｏｒｐ, Ｏｓａｋａ, Ｊａｐａｎ）の比率で混ぜたものを使用した。
ＮＨＤＦ（５．０ｘ１０４～１．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌ）をコラーゲンゲル包埋したものをコラーゲンIVコートしたＩＷＡＫＩの１２ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｔｒａｎｓ ｗｅｌｌに７５０μＬ/ｗｅｌｌずつ播種し、３７℃で３０分培養し上下に培地を入れる。２日後にＮＨＥＭまたは誘導したヒト脂肪組織由来幹細胞を２．５～５．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌでＮＨＤＦコラーゲンゲルの上に重ね、さらにその上にＮＨＥＭを５．０ｘ１０４～１．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌで播種する。
１５日培養後、４％ＰＦＡで固定し、パラフィン包埋を行う。脱パラフィンと賦活化後にｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ （１：２００； ｆｒｏｍ Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でブロッキングを施行。
ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＨＭＢ４５ （１：２５； ｆｒｏｍ ＡｂｃａｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とＴＹＲ （１：１００； ｆｒｏｍ Ａｂｃａｍ, Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて一晩４℃で一次抗体反応を行う。
ＰＢＳで洗浄後、０．３％Ｈ２Ｏ２／メタノールで内因性ペルオキシダーゼブロッキングを３０分間施行。洗浄後、ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ｂｉｏｔｉｎ ＩｇＧ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ （１：３００； ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）を用いて常温1時間二次抗体反応を行う。標識試薬としてＡｖｉｄｉｎ （１：３００；ｆｒｏｍ ＤＡＫＯ）を用いて６０分反応を行う。
その後ＤＡＢ（ＰＢＳ５０ｍＬ＋ＤＡＢ５００μＬ＋Ｈ２Ｏ２ １０μＬ）で５分間発色を行い、１分間ヘマトキシリンで核染色を行う。洗浄し、脱水、透徹、封入を行い顕微鏡で観察する。
コラーゲンゲル液としては、ｔｙｐｅ１ ｃｏｌｌａｇｅｎ （３ｍｇ/ｍＬ）と ５－ｆｏｌｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＭＥとｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎを ７：２：１（ｐｕｒｃｈａｓｅｄ ｆｒｏｍ Ｎｉｔｔａ Ｇｅｌａｔｉｎ Ｃｏｒｐ, Ｏｓａｋａ, Ｊａｐａｎ）の比率で混ぜたものを使用した。
ＮＨＤＦ（５．０ｘ１０４～１．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌ）をコラーゲンゲル包埋したものをコラーゲンIVコートしたＩＷＡＫＩの１２ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｔｒａｎｓ ｗｅｌｌに７５０μＬ/ｗｅｌｌずつ播種し、３７℃で３０分培養し上下に培地を入れる。２日後にＮＨＥＭまたは誘導したヒト脂肪組織由来幹細胞を２．５～５．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌでＮＨＤＦコラーゲンゲルの上に重ね、さらにその上にＮＨＥＭを５．０ｘ１０４～１．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌで播種する。
１５日培養後、４％ＰＦＡで固定し、パラフィン包埋を行う。脱パラフィンと賦活化後にｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ （１：２００； ｆｒｏｍ Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でブロッキングを施行。
ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＨＭＢ４５ （１：２５； ｆｒｏｍ ＡｂｃａｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とＴＹＲ （１：１００； ｆｒｏｍ Ａｂｃａｍ, Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて一晩４℃で一次抗体反応を行う。
ＰＢＳで洗浄後、０．３％Ｈ２Ｏ２／メタノールで内因性ペルオキシダーゼブロッキングを３０分間施行。洗浄後、ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ｂｉｏｔｉｎ ＩｇＧ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ （１：３００； ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）を用いて常温1時間二次抗体反応を行う。標識試薬としてＡｖｉｄｉｎ （１：３００；ｆｒｏｍ ＤＡＫＯ）を用いて６０分反応を行う。
その後ＤＡＢ（ＰＢＳ５０ｍＬ＋ＤＡＢ５００μＬ＋Ｈ２Ｏ２ １０μＬ）で５分間発色を行い、１分間ヘマトキシリンで核染色を行う。洗浄し、脱水、透徹、封入を行い顕微鏡で観察する。
【0028】
［結果］
（１）（脂肪組織幹細胞中にメラノサイト前駆細胞が存在すること）
ａ)免疫染色の結果、メラノサイトのマーカータンパクである、Ｍｅｌａｎ Ａ、ＭＡＴＰ、ＨＭＢ４５、ＬＡＭＰ１、ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＭｅｌＥＭ、Ｍｅｌ２が分化誘導前の脂肪組織幹細胞（ＡＤＳｃ）で発現されており、またメラノサイト系培養液で培養した本細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｅ）でその発現は増強する（図１）。そしてそれは、特にメラノサイトのマスター遺伝子といわれるＭＩＴＦにおいて顕著である（図２）。
（１）（脂肪組織幹細胞中にメラノサイト前駆細胞が存在すること）
ａ)免疫染色の結果、メラノサイトのマーカータンパクである、Ｍｅｌａｎ Ａ、ＭＡＴＰ、ＨＭＢ４５、ＬＡＭＰ１、ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＭｅｌＥＭ、Ｍｅｌ２が分化誘導前の脂肪組織幹細胞（ＡＤＳｃ）で発現されており、またメラノサイト系培養液で培養した本細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｅ）でその発現は増強する（図１）。そしてそれは、特にメラノサイトのマスター遺伝子といわれるＭＩＴＦにおいて顕著である（図２）。
【0029】
ｂ）ＲＴ－ＰＣＲの結果、分化誘導前の脂肪組織幹細胞（２２８５１）でＭＩＴＦ、ＫＩＴ、ＰＡＸ３のメラノサイトの転写因子が発現されており、メラノサイト系培養液で培養した本細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｅ）でその発現は増強する（図３－１及び図３－２）。
【0030】
ｃ） ｓｉＲＮＡ法で脂肪組織幹細胞（２２８５１ ｃｅｌｌ）のＨＭＢ４５（前駆メラノソームタンパク）をノックダウンすると、本細胞におけるＨＭＢ４５の発現が消退する（図４）。
【0031】
ｄ）ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇにおいても、分化誘導前の脂肪組織幹細胞（２２８５１）でＨＭＢ４５とＭＩＴＦが発現されており（図５）、メラノサイト系培養液で培養した本細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌｓ）でその発現は増強する（図６）。
【0032】
ｅ)免疫電顕でも、分化誘導前の脂肪組織幹細胞（ＡＳＣ）でＨＭＢ４５が発現されており、メラノサイト系培養液で培養した本細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ＡＳＣ）でその発現は増強することが観察される（図７）。
【0033】
（２）３次元培養において、脂肪細胞幹細胞中のメラノサイト前駆細胞が成熟メラノサイトの分化誘導されたこと
正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＥＫ）と正常表皮メラノサイト（ＮＨＥＭ）、あるいはＮＨＥＫとメラノサイト系培養液で培養した脂肪組織幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌｓ）を、線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲル上で３次元培養し表皮モデルを作成すると、その表皮基底層で、両培養系においてチロシナーゼ（ＴＹＲ）とＨＭＢ４５を発現する細胞がみられ、正常表皮構造に類似した色素細胞分布が再現された（図８）。
正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＥＫ）と正常表皮メラノサイト（ＮＨＥＭ）、あるいはＮＨＥＫとメラノサイト系培養液で培養した脂肪組織幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌｓ）を、線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲル上で３次元培養し表皮モデルを作成すると、その表皮基底層で、両培養系においてチロシナーゼ（ＴＹＲ）とＨＭＢ４５を発現する細胞がみられ、正常表皮構造に類似した色素細胞分布が再現された（図８）。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】