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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-24
(45)【発行日】2024-11-01
(54)【発明の名称】免疫応答抑制剤
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20241025BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20241025BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241025BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20241025BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20241025BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241025BHJP
A61P 37/00 20060101ALI20241025BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20241025BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20241025BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 N
A61K39/395 D
A61K31/711
A61K31/7088
A61P37/06
A61P37/08
A61P25/00
A61P37/00
A61P17/02
A61P25/28
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2021553518
(86)(22)【出願日】2020-10-22
(86)【国際出願番号】 JP2020039693
(87)【国際公開番号】W WO2021085295
(87)【国際公開日】2021-05-06
【審査請求日】2023-08-01
(31)【優先権主張番号】P 2019197223
(32)【優先日】2019-10-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504171134
【氏名又は名称】国立大学法人 筑波大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001070
【氏名又は名称】弁理士法人エスエス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】渋谷 和子
(72)【発明者】
【氏名】渋谷 彰
(72)【発明者】
【氏名】林 杏子
【審査官】柴原 直司
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５３０２６８（ＪＰ，Ａ）
【文献】Anja Fuchs et al.，Cutting Edge: CD96 (Tactile) Promotes NK Cell-Target Cell Adhesion by Interacting with the Polioviru，The Journal of Immunology，2004年，Vol.172, No.7，Pages 3994-3998
【文献】平野 隆 他 ，慢性中耳炎症病態におけるTh17細胞およびIL-17産生γδT細胞の動態，Otology Japan，2013年，Vol.23, No.1，Pages 6-12
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｋ ３１／７０８８
Ａ６１Ｐ ３７／０６
Ａ６１Ｐ １７／００
Ａ６１Ｐ ３７／００
Ａ６１Ｐ ２５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質を含む、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤であって、
前記ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質が、ＣＤ９６に対する特異的結合物質またはＣＤ９６発現阻害剤であり、
前記ＣＤ９６に対する特異的結合物質が抗ＣＤ９６抗体、または抗ＣＤ９６抗体の抗体結合部位を含む抗体断片であり、
前記ＣＤ９６発現阻害剤がＣＤ９６の発現を低減させ、ＣＤ９６のｍＲＮＡに特異的に結合する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、またはアンチセンス核酸であり、
前記ＩＬ－１７産生細胞がγδＴ細胞及びＩＬ－１７を産生するＣＤ４ + Ｔ細胞から選択される少なくとも一種である、免疫応答抑制剤。
【請求項2】
前記ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質が、抗ＣＤ９６抗体である、請求項１に記載のＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤。
【請求項3】
前記ＩＬ－１７産生細胞がγδＴ細胞である、請求項１または２に記載のＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤。
【請求項4】
前記ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤が、ＩＬ－１７産生抑制剤またはＩＬ－２２産生抑制剤である、請求項１～３のいずれか１項に記載のＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載のＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤を含む、γδＴ細胞及び／又はＩＬ－１７を産生するＣＤ４
+
Ｔ細胞から選択される少なくとも一種の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品。
【請求項6】
前記γδＴ細胞及び／又はＩＬ－１７を産生するＣＤ４
+
Ｔ細胞から選択される少なくとも一種の免疫応答が関与する疾病または病態が乾癬、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、脳梗塞、腎炎、肺傷害、または肺線維症である、請求項５に記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫応答抑制剤に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫には、体内に侵入した異物を認識してただちに排除する自然免疫と、侵入した異物の情報をリンパ球が認識し、その情報に基づいて特定の異物を排除する獲得免疫が存在し、主役となる免疫細胞の種類はそれぞれの免疫で異なる。例えば、自然免疫の担当細胞は、マクロファージ、好中球、肥満細胞、樹状細胞などであり、病原体に共通した分子構造を認識するか、サイトカインによって活性化され、感染に対する応答が早いことが特徴である。一方、獲得免疫の担当細胞は、Ｔ細胞およびＢ細胞であり、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体が特異的な病原体を認識すると活性化され、感染に対する応答は遅いが、その反応は強いことが特徴である。
【0003】
ヒトの末梢血中に含まれるＴ細胞のほとんどは、α鎖、β鎖と呼ばれる２つの糖タンパク質から構成されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現しているαβＴ細胞であるが、γ鎖とδ鎖からなるＴＣＲを発現するγδＴ細胞が数％存在している。γδＴ細胞は、Ｔ細胞の１種ではあるものの、サイトカインによって即時に活性化されて炎症性サイトカインを産生することなどから、自然免疫と獲得免疫の境界に位置する細胞であるとされている。γδＴ細胞は、腸管、肺、生殖器上皮内、皮膚など外来抗原に暴露される組織に高頻度に局在している。γδＴ細胞が産生する炎症性サイトカインとしては、ＩＬ（インターロイキン）－１７やＩＦＮ（インターフェロン）－γが知られている。
【0004】
ヒトの末梢血中に含まれる成熟したＴ細胞のほとんどは、細胞表面のマーカー分子としてＣＤ４かＣＤ８のどちらかを発現している。ＣＤ４を発現したＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞として機能し、ＣＤ８を発現したＴ細胞は、キラーＴ細胞として機能する。ヘルパーＴ細胞としては、１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１細胞）と、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２細胞）と呼ばれる２つのサブセットが古くから知られていた。Ｔｈ１細胞はＩＦＮ－γを産生し、マクロファージ活性化を誘導して、主に細胞性免疫や細胞内寄生体の排除に関与する。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ－５やＩＬ－１３産生を介して好酸球の分化を誘導するなどして、液性免疫や細胞外寄生体に関する感染防御に関与する。その後、ＩＬ－１７産生性のＴ細胞が発見され、Ｔｈ１７細胞と名づけられ、Ｔｈ１細胞やＴｈ２細胞とは異なるサブセットとして認識されるようになった。Ｔｈ１７細胞はＩＬ－１７，ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球単球コロニー刺激因子）やＩＬ－２２を産生し、自己免疫やアレルギー応答、細胞外増殖性細菌感染防御などで中心的な役割を果たしていることが明らかになっている。
【0005】
ＩＬＣ（ｉｎｎａｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌ、ＩＬＣ、自然リンパ球）細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞とは異なる、近年同定されたリンパ球群であり、各組織に広く存在する。産生されるサイトカインにより、グループ１～３に分類され、グループ１ＩＬＣ（ＩＬＣ１）はＴｈ１細胞と類似したサイトカイン、すなわちＩＦＮ－γ産生が特徴である。グループ２ＩＬＣ（ＩＬＣ２）は、Ｔｈ２細胞とサイトカイン産生が類似し、ＩＬ－５およびＩＬ－１３を産生する。グループ３ＩＬＣ（ＩＬＣ３）はＴｈ１７細胞とサイトカイン産生が類似し、ＩＬ－１７およびＩＬ－２２の産生が認められる。
【0006】
γδＴ細胞、Ｔｈ１７細胞、ＩＬＣ３細胞等の細胞の免疫応答において産生されるＩＬ－１７は、炎症性のサイトカインの１種である。真菌感染を防ぐ上で重要な役割を果たしている一方で、繊維芽細胞や上皮細胞、血管内皮細胞、マクロファージなど種々の細胞に作用して、炎症性サイトカインやケモカイン、細胞接着因子など、種々の因子を誘導して炎症を誘導することが知られている。したがって、ＩＬ－１７の産生が適切に制御されなければ自己免疫疾患や慢性の炎症性疾患が引き起こされ得る。乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、強皮症、狼瘡などの自己免疫疾患では、ＩＬ－１７が過剰に産生されていることが知られている。また、関節リウマチのモデルとして用いられるコラーゲン誘導関節炎モデル、多発性硬化症や急性散在性脳脊髄炎などのモデルとして用いられるＥＡＥモデル（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ；実験的自己免疫性脳脊髄炎）、アトピー性皮膚炎モデル、ＤＭＢＡ／ＴＰＡ誘導性皮膚腫瘍モデル等では、ＩＬ－１７を産生する細胞が病態の悪化に関与することが報告されている（非特許文献１）。さらに、脳梗塞モデルや腎炎モデルにおいてもＩＬ－１７を産生するγδＴ細胞が病態の悪化に関与することが報告されている（非特許文献２、３）。また、肺傷害や肺線維症の患者においても、ＩＬ－１７の発現量が増加しており、γδＴ細胞、Ｔｈ１７細胞、ＩＬＣ３細胞等によるＩＬ－１７産生が病態に関与することが報告されている（非特許文献４)。
【0007】
したがって、ＩＬ－１７は、これらの疾患を治療または予防するためのターゲットとされている。実際に、抗ＩＬ－１７Ａ抗体製剤であるセクキヌマブ、イキセキズマブ、抗ＩＬ－１７Ａ受容体抗体製剤であるブロダルマブを含むＩＬ－１７阻害薬が開発され、乾癬治療に用いられている(非特許文献５)。
【0008】
ところで、ＣＤ９６は、イムノグリンスーパーファミリーに属するＩ型膜貫通糖タンパク質であり、造血系を起源とする細胞、特にＮＫ細胞（ナチュラルキラー細胞）、αβＴ細胞、およびγδＴ細胞等に発現していることが報告されている（非特許文献６）。ＣＤ９６は、ターゲット細胞上に発現しているＣＤ１５５またはＣＤ１１１をリガンドとしており、これらにより活性化される。ＣＤ９６は、ＮＫ細胞に発現するＣＤ９６が抑制性シグナルを伝える免疫チェックポイント受容体として腫瘍免疫に関与することも知られている（非特許文献７）。しかし、ＣＤ９６が免疫制御系において果たす役割は、未だ不明なことが多い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【文献】Monin et. al., IL-17 family cytokines: signaling mechanisms, biological activities, and therapeutic implications, Cold Spring Hab Pespect Biol., 2018, 10 (4)
【文献】Shichita et. al., Pivotal role of cerebral interleukin-17-producing gamma-delta-T-cells in the delayed phase of ischemic brain injury. Nature Medicine, 2009, vol.15, number 8, 946-951
【文献】Turner et. al.,IL-17A Production by Renal Gamma-delta-T-cells Promotes Kidney injury in Crescentic GN. J Am Soc Nephrol, 2012, 23. 1486-1495
【文献】Gurczynski et al., IL-17 in the lung: the good, the bad, and the ugly, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2018, 314. L6-L16
【文献】日本皮膚科学会乾癬生物学的製剤検討委員会、日本皮膚科学会マニュアル「乾癬における生物学的製剤の使用ガイダンス（2019年版）」
【文献】Georgiev et. al., Coming of Age: CD96 Emerges as Modulator of Immune Responses, frontiers in Immunology, 2018, Vol.9, Article 1072
【文献】Chan et. al., The receptors CD96 and CD226 oppose each other in the regulation of natural killer cell functions, Nature Immunology, 2014, volume 15,431-438
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明者らは、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答機構を解明し、その機構の一部を阻害することによりＩＬ－１７の産生を抑制できれば、ＩＬ－１７を産生する細胞が関与する病態の治療に有効であると考えた。そこで、本発明は、乾癬などの病態を引き起こす、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答機構を解明し、本発明の第一および第二の態様としてＩＬ－１７産生細胞の免疫応答を抑制するための免疫応答抑制剤、さらにＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品を提供することを課題とする。また、本発明の第三の態様としてγδＴ細胞等における免疫応答を誘導するための方法を提供することを課題とする。さらに本発明の第四の態様としてＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品（候補物質）の評価方法を提供することを課題とする。本発明の第五の態様として、γδＴ細胞等における免疫応答を誘導しＩＬ－１７を産生する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した。その結果、以下の構成を有することにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、例えば以下の〔１〕～〔１１〕に関する。
〔１〕ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質を含む、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤。
〔２〕前記ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質が、抗ＣＤ９６抗体である、〔１〕に記載のＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤。
〔３〕前記ＩＬ－１７産生細胞がγδＴ細胞である、〔１〕または〔２〕に記載のＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤。
〔４〕前記ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤が、ＩＬ－１７産生抑制剤またはＩＬ－２２産生抑制剤である、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤。
〔５〕〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤を含む、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品。
〔６〕前記ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態が乾癬、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、脳梗塞、腎炎、肺傷害、肺線維症または皮膚腫瘍である、〔５〕に記載の医薬品。
〔７〕γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程（Ａ）を有する方法。
〔８〕前記工程（Ａ）を行った後に、ＩＬ－１７を評価する工程（Ｂ）を有する、〔７〕に記載の方法。
〔９〕〔８〕に記載の方法を含む、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品の評価方法。
〔１０〕前記ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態が乾癬、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、脳梗塞、腎炎、肺傷害、肺線維症または皮膚腫瘍である、〔９〕に記載の医薬品の評価方法。
〔１１〕γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程（Ａ）を有するＩＬ－１７産生方法。
本発明は、例えば以下の〔１〕～〔１１〕に関する。
〔１〕ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質を含む、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤。
〔２〕前記ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質が、抗ＣＤ９６抗体である、〔１〕に記載のＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤。
〔３〕前記ＩＬ－１７産生細胞がγδＴ細胞である、〔１〕または〔２〕に記載のＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤。
〔４〕前記ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤が、ＩＬ－１７産生抑制剤またはＩＬ－２２産生抑制剤である、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤。
〔５〕〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤を含む、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品。
〔６〕前記ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態が乾癬、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、脳梗塞、腎炎、肺傷害、肺線維症または皮膚腫瘍である、〔５〕に記載の医薬品。
〔７〕γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程（Ａ）を有する方法。
〔８〕前記工程（Ａ）を行った後に、ＩＬ－１７を評価する工程（Ｂ）を有する、〔７〕に記載の方法。
〔９〕〔８〕に記載の方法を含む、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品の評価方法。
〔１０〕前記ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態が乾癬、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、脳梗塞、腎炎、肺傷害、肺線維症または皮膚腫瘍である、〔９〕に記載の医薬品の評価方法。
〔１１〕γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程（Ａ）を有するＩＬ－１７産生方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、乾癬などの病態を引き起こす、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答を抑制するための免疫応答抑制剤、さらにＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品を提供できる。また、γδＴ細胞における免疫応答を誘導するための方法を提供することができる。さらにＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品の評価方法を提供することができる。γδＴ細胞における免疫応答を誘導しＩＬ－１７を産生する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図13】図１３は、ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞とヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＣＤ９６の発現を確認するフローサイトメトリー解析結果である。横軸はＣＤ９６の発現強度を示し、縦軸は細胞数を示す。
【図14】図１４は、健常人７人から得たヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞における、ＣＤ３シグナルおよびＩＬ－２３により増加するＩＬ－１７産生量の、固相化された抗ＣＤ９６抗体による刺激の有無による差を示すグラフである。
【図15】図１５は、健常人６人から得たヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞における、ＣＤ３シグナルによる活性化の、固相化された抗ＣＤ９６抗体による刺激の有無による差を示すグラフである。縦軸は蛍光の平均値を示す。
【図16】図１６は、健常人８人から得たヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞における、ＣＤ３シグナルおよびＩＬ－２３により増加するＩＬ－１７産生量の、固相化された抗ＣＤ９６抗体による刺激の有無による差を示すグラフである。
【図17】図１７は、健常人６人から得たヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞における、ＣＤ３シグナルによる活性化の、固相化された抗ＣＤ９６抗体による刺激の有無による差を示すグラフである。縦軸は蛍光の平均値を示す。
【図18】図１８は、健常人から得たヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞における、ＣＤ３シグナル、ＩＬ－２３及びＣＤ１５５刺激により上昇するＩＬ－１７産生の抗ＣＤ９６中和抗体の有無による差を示すグラフである。
【図23】図２３は、イミキモド誘発乾癬モデルマウスへの抗マウスＣＤ９６中和抗体（ＴＸ１１１．２）予防的投与実験における、コントロール抗体（ｃＩｇ）投与群およびＴＸ１１１．２投与群のイミキモド塗布開始３日目の背部の写真である。
【図24】図２４は、イミキモド誘発乾癬モデルマウスへの抗マウスＣＤ９６中和抗体（ＴＸ１１１．２）予防的投与実験における、イミキモド塗布開始４日目の背部皮膚の紅斑、鱗屑、および皮膚の厚さのグラフである。縦軸は、それぞれ紅斑スコア、鱗屑スコア、皮膚の厚さ（μｍ）を示す。
【図25】図２５は、イミキモド誘発乾癬モデルマウスへの抗マウスＣＤ９６中和抗体（ＴＸ１１１．２）予防的投与実験における、イミキモド塗布開始４日目の背部の皮膚組織ＨＥ染色像（左）および表皮の厚さのグラフ（右）である。
【図27】図２７は、イミキモド誘発乾癬モデルマウスへの抗マウスＣＤ９６中和抗体（ＴＸ１１１．２）治療的投与実験における、コントロール抗体（ｃＩｇ）投与群およびＴＸ１１１．２投与群のイミキモド塗布開始６日目の背部の写真である。
【図28】図２８は、イミキモド誘発乾癬モデルマウスへの抗マウスＣＤ９６中和抗体（ＴＸ１１１．２）治療的投与実験における、イミキモド塗布開始１日目（Ｄ１）および６日目（Ｄ６）の背部皮膚の紅斑、鱗屑、および皮膚の厚さのグラフである。縦軸は、それぞれ紅斑スコア、鱗屑スコア、皮膚の厚さ（μｍ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明は、大きく分けて五つの態様がある。
第一の態様は、ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質を含む、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤である。
第一の態様は、ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質を含む、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤である。
【0015】
第二の態様は、第一の態様のＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤を含む、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品である。
【0016】
第三の態様は、γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程（Ａ）を有する方法である。
【0017】
第四の態様は、第三の態様の方法を含む、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品（候補物質）の評価方法である。
第五の態様は、γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程（Ａ）を有するＩＬ－１７産生方法である。
第五の態様は、γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程（Ａ）を有するＩＬ－１７産生方法である。
【0018】
次に本発明について具体的に説明する。
〈ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質〉
実施例において後述するように、本発明者らは、γδＴ細胞のＩＬ－１７産生は、ＣＤ９６がγδＴ細胞を活性化させることにより増加することを明らかにした。したがって、ＣＤ９６シグナルを阻害すれば、γδＴ細胞の活性化が抑制され、γδＴ細胞のＩＬ－１７産生が抑制されると推測される。すなわち、ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質は、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤として使用することができる。
〈ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質〉
実施例において後述するように、本発明者らは、γδＴ細胞のＩＬ－１７産生は、ＣＤ９６がγδＴ細胞を活性化させることにより増加することを明らかにした。したがって、ＣＤ９６シグナルを阻害すれば、γδＴ細胞の活性化が抑制され、γδＴ細胞のＩＬ－１７産生が抑制されると推測される。すなわち、ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質は、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤として使用することができる。
【0019】
ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【0020】
本発明におけるＣＤ９６、ＣＤ１５５およびＣＤ１１１は、それぞれマウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、ブタ、ならびにサルおよびヒトを含む霊長類などの哺乳動物を由来とするものを含む。本発明におけるＣＤ９６、ＣＤ１５５およびＣＤ１１１は、好ましくは、ヒトのＣＤ９６、ＣＤ１５５およびＣＤ１１１である。
【0021】
ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質としては、例えば、ＣＤ９６に対する特異的結合物質、ＣＤ９６発現阻害剤、ＣＤ１５５に対する特異的結合物質、ＣＤ１５５発現阻害剤、ＣＤ１１１に対する特異的結合物質、ＣＤ１１１発現阻害剤等が挙げられる。ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答を効率的に抑制できることから、ＣＤ９６に対する特異的結合物質、ＣＤ１５５に対する特異的結合物質、またはＣＤ１１１に対する特異的結合物質が好ましく、ＣＤ９６に対する特異的結合物質がより好ましい。
【0022】
ＣＤ９６に対する特異的結合物質、ＣＤ１５５に対する特異的結合物質、またはＣＤ１１１に対する特異的結合物質としては、ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害できる物質であれば特に限定されず、例えば、抗ＣＤ９６である抗体、抗体断片、アプタマー（抗ＣＤ９６抗体、抗ＣＤ９６抗体の断片、ＣＤ９６に対するアプタマー）等、抗ＣＤ１５５である抗体、抗体断片、アプタマー（抗ＣＤ１５５抗体、抗ＣＤ１５５抗体の断片、ＣＤ１５５に対するアプタマー）等、または抗ＣＤ１１１である抗体、抗体断片、アプタマー（抗ＣＤ１１１抗体、抗ＣＤ１１１抗体の断片、ＣＤ１１１に対するアプタマー）等が挙げられる。抗体は、マウス等の動物を免疫することによって作製したものであってもよく、ファージライブラリ等の抗体ライブラリのスクリーニングにより作製したものであってもよい。また、抗体断片は、抗体の抗体結合部位を含む抗体断片であればよく、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。また、アプタマーとしては、例えば、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。ＣＤ９６に対する特異的結合物質、ＣＤ１５５に対する特異的結合物質、またはＣＤ１１１に対する特異的結合物質としては、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答を効率的に抑制できることから、抗ＣＤ９６抗体、抗ＣＤ１５５抗体および抗ＣＤ１１１抗体並びにそれらの断片が好ましく、抗ＣＤ９６抗体およびその断片がより好ましい。
【0023】
また、ＣＤ９６に対する特異的結合物質は、可溶化したＣＤ１５５、または可溶化したＣＤ１１１であってもよい。可溶化したＣＤ１５５としては、例えば、ＣＤ１５５と抗体定常領域との融合タンパク質等が挙げられる。可溶化したＣＤ１１１としては、例えば、ＣＤ１１１と抗体定常領域との融合タンパク質等が挙げられる。また、ＣＤ１５５に対する特異的結合物質、またはＣＤ１１１に対する特異的結合物質は、可溶化したＣＤ９６であってもよい。可溶化したＣＤ９６としては、例えば、ＣＤ９６と抗体定常領域との融合タンパク質等が挙げられる。
【0024】
ＣＤ９６発現阻害剤、ＣＤ１５５発現阻害剤、ＣＤ１１１発現阻害剤としては、ＣＤ９６、ＣＤ１５５、またはＣＤ１１１の発現を低減させ、結果としてＣＤ９６とＣＤ１５５またはＣＤ１１１との結合を阻害できる物質であれば特に限定されず、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、低分子化合物等が挙げられる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部をペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成してもよい。
【0025】
〈抗ＣＤ９６関連分子抗体〉
抗ＣＤ９６抗体、抗ＣＤ１５５抗体および抗ＣＤ１１１抗体（以下、抗ＣＤ９６関連分子抗体ともいう）は、ＣＤ９６、ＣＤ１５５、およびＣＤ１１１（以下、ＣＤ９６関連分子ともいう）の全長タンパク質または部分タンパク質を抗原として、公知の抗体または抗血清の製造法に従って作製することができる。抗ＣＤ９６関連分子抗体は、細胞表面上に発現する部分に結合することが望ましいため、部分タンパク質は、ＣＤ９６関連分子の細胞外領域が望ましい。これらの抗原は、公知のタンパク質発現ならびに精製法によって調製することができる。
抗ＣＤ９６抗体、抗ＣＤ１５５抗体および抗ＣＤ１１１抗体（以下、抗ＣＤ９６関連分子抗体ともいう）は、ＣＤ９６、ＣＤ１５５、およびＣＤ１１１（以下、ＣＤ９６関連分子ともいう）の全長タンパク質または部分タンパク質を抗原として、公知の抗体または抗血清の製造法に従って作製することができる。抗ＣＤ９６関連分子抗体は、細胞表面上に発現する部分に結合することが望ましいため、部分タンパク質は、ＣＤ９６関連分子の細胞外領域が望ましい。これらの抗原は、公知のタンパク質発現ならびに精製法によって調製することができる。
【0026】
抗ＣＤ９６関連分子抗体はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれであってもよい。力価を一定に保つことが容易であることから、モノクローナル抗体が好ましい。抗ＣＤ９６関連分子抗体は、マウス抗体、ラット抗体、モルモット抗体、ハムスター抗体、ウサギ抗体、サル抗体、イヌ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体のいずれであってもよい。また、抗ＣＤ９６関連分子抗体は血中滞留性等の物性を改善するために化学修飾を施したものであってもよい。
【0027】
抗ＣＤ９６関連分子抗体は、定常領域（Ｆｃ領域）を改変したものを用いてもよい。定常領域（Ｆｃ領域）は、一般に、Ｆｃ受容体あるいは補体成分との相互作用によって、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害）や補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）等のエフェクター機能を発揮する。エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域に存在する複合型糖鎖の構造やＦｃ受容体の遺伝子多型などによって大きな影響を受けることが知られている。抗ＣＤ９６関連分子抗体はＦｃ領域に変異を入れることにより、エフェクター機能を発揮しないように改変したものが好ましい。Ｆｃ領域の改変は、公知の方法に従って行うことができる。
【0028】
抗ＣＤ９６関連分子抗体のアイソタイプは特に制限されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等のいずれであってもよい。
【0029】
抗ＣＤ９６関連分子抗体は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【0030】
抗ＣＤ９６関連分子抗体の作製に適した抗原としては、例えば発現ベクターなどによりＣＤ９６関連分子を強制発現させた細胞、ＣＤ９６関連分子発現プラスミドベクター、ＣＤ９６関連分子発現ウイルスベクター等（アデノウイルスベクターなど）等を用いて作製したＣＤ９６関連分子リコンビナントタンパク質等があげられる。ＣＤ９６関連分子リコンビナントタンパク質は、他のタンパク質と融合させてもよいし、タグ等をつけてもよい。タンパク質の安定性の観点から、ＣＤ９６関連分子リコンビナントタンパク質は、ＩｇＧＦｃ等と融合させてキメラタンパク質とすることが好ましい。抗ＣＤ９６関連分子抗体の作製に用いる抗原は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。例えば、抗ＣＤ９６抗体を作製する場合、特異性の高い抗体が効率良く作製できることから、ＣＤ９６を強制発現させた細胞と、ＣＤ９６リコンビナントタンパク質を組み合わせて用いることが好ましい。
【0031】
ポリクローナル抗体は、公知の方法によって作製することができる。例えば、抗原タンパク質あるいは抗原タンパク質とキャリアー蛋白質との混合物で、適当な動物に免疫を行ない、その免疫動物から抗原タンパク質に対する抗体含有物を採取して、必要に応じて抗体の分離精製を行なうことにより作製することができる。用いられる動物としては、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモットが一般的に挙げられる。抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを抗原タンパク質と共に投与することができる。投与は、通常約２週毎に１回ずつ、計約３～１０回程度行なうのが一般的である。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された動物の血液、腹水などから採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、ＥＬＩＳＡ法によって測定することができる。ポリクローナル抗体の分離精製は、例えば、抗原結合固相あるいはプロテインＡ あるいはプロテインＧなどの活性吸着剤を用いた精製法、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法などの免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【0032】
モノクローナル抗体は、公知の方法によって作製することができる。具体的には、抗原を必要に応じてフロイントアジュバントとともに、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１～数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１ヶ月毎に２～５回免疫を行って、最終免疫より約３、４日後に免疫感作された哺乳動物から抗体産生細胞を取得することができる。免疫を施す回数および時間的インターバルは、使用する免疫原の性質などにより、適宜変更すればよい。
【0033】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラーおよびミルシュタインらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、ｖｏｌ．２５６、ｐ４９５～４９７）およびそれに準じた方法に従って行うことができる。即ち、前述したように免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞を細胞融合させることによってハイブリドーマを調製することができる。
【0034】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、マウスから得られた株化細胞、例えばＰ３－Ｕ１、ＮＳ－１、ＳＰ２、６５３、Ｘ６３、ＡＰ－１などを使用することができる。
【0035】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の、前述のマウス免疫感作で用いた抗原に対する反応性を、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ等の測定法によって測定し、当該抗原あるいはハプテンに対して特異的結合を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって行う。そして、通常は抗原を固相化しそこに結合する培養上清中の抗体を、放射性物質、蛍光物質、酵素などで標識した二次抗体で検出する方法が用いられる。また、抗原の発現細胞を用いる場合には、該細胞にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に蛍光で標識した二次抗体を反応させた後、フローサイトメーター等の蛍光検出装置で該細胞の蛍光強度を測定することにより、該細胞膜上の本発明の抗原に結合できるモノクローナル抗体を検出することができる。
【0036】
選択したハイブリドーマクローンからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養するか、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等で培養し、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的および培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持および保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような公知の栄養培地あるいは公知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することができる。
【0037】
モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。
【0038】
抗ＣＤ９６関連分子抗体としては、抗体遺伝子を抗体産生細胞、例えばハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いてもよい。
【0039】
具体的には、目的とする抗体を産生するハイブリドーマや抗体を産生する免疫細胞、例えば感作リンパ球等を癌遺伝子等により不死化させた細胞から、抗体の可変領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えばグアニジン超遠心法等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ファルマシア社製）等を使用してｍＲＮＡを調製する。得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体可変領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ等を用いて行うことができる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには５’－Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ(クローンテック社製）およびＰＣＲを用いた５’－ＲＡＣＥ法を使用することができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
【0040】
目的とする抗体の可変領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込むことができる。または、抗体の可変領域をコードするＤＮＡを、抗体定常領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。目的とする抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー／プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
【0041】
抗体遺伝子の発現は、抗体の重鎖または軽鎖を別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいは重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主を形質転換させてもよい。
【0042】
抗体の作製方法としては、いわゆるファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３、１１０５（２００５））を用いてもよい。具体的には、例えばヒトや動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、ハムスターなど）のＢリンパ球を材料として公知の方法により作製された抗体遺伝子ライブラリー、もしくはヒトや動物のＧｅｒｍ Ｌｉｎｅ配列から選別、および改変して完全合成した抗体遺伝子ライブラリーを、バクテリオファージ、大腸菌、酵母、動物細胞等の細胞表面やリボソーム上等に提示させる。このとき、細胞表面に提示させる抗体の形態としてはＩｇＧ分子、ＩｇＭ分子、Ｆａｂフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント等が挙げられる。
【0043】
こうして得た抗体フラグメント遺伝子は公知の方法によりＩｇＧ抗体遺伝子の対応領域と組替えることにより、抗体遺伝子を得ることができる。そして、このようにして得られた遺伝子を適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて抗体を産生することができる。
【0044】
〈ＣＤ９６に対する特異的結合物質〉
ＣＤ９６は、ヒトでは２つのアイソフォームが存在する膜貫通型タンパク質である。アイソフォーム１は、急性骨髄性白血病で検出されており、アイソフォーム２と比較して追加のアミノ酸を含む。ヒトでは、アイソフォーム２がより一般的な形態であり、アイソフォーム２の予想ドメイン構造は、３つの外部免疫グロブリン様ドメイン（ドメイン１、２、および３）を有する。マウスＣＤ９６は、単一のアイソフォームとして存在し、３つの外部免疫グロブリン様ドメイン（ドメイン１、２、および３）を有する。
ＣＤ９６は、ヒトでは２つのアイソフォームが存在する膜貫通型タンパク質である。アイソフォーム１は、急性骨髄性白血病で検出されており、アイソフォーム２と比較して追加のアミノ酸を含む。ヒトでは、アイソフォーム２がより一般的な形態であり、アイソフォーム２の予想ドメイン構造は、３つの外部免疫グロブリン様ドメイン（ドメイン１、２、および３）を有する。マウスＣＤ９６は、単一のアイソフォームとして存在し、３つの外部免疫グロブリン様ドメイン（ドメイン１、２、および３）を有する。
【0045】
ＣＤ９６に対する特異的結合物質は、ＣＤ９６アイソフォームのうち、少なくとも１つと結合することが好ましい。ヒトＣＤ９６に対する特異的結合物質は、ＣＤ９６アイソフォーム２と結合することが好ましい。
【0046】
ＣＤ９６に対する特異的結合物質は、ＣＤ９６の少なくとも１つの外部免疫グロブリン様ドメインのアミノ酸配列と結合することが好ましい。ＣＤ９６に対する特異的結合物質は、ドメイン１；ドメイン２；ドメイン３；ドメイン１およびドメイン２；ドメイン１およびドメイン３；ドメイン２およびドメイン３；またはドメイン１、ドメイン２、およびドメイン３のアミノ酸配列と結合してもよいが、ドメイン１と結合することが好ましい。ＣＤ９６に対する特異的結合物質は、少なくとも１つの細胞外免疫グロブリン様ドメインに加えて、他のＣＤ９６ドメイン又はアミノ酸配列と結合してもよい。
【0047】
ＣＤ９６に対する特異的結合物質は、ＣＤ９６とＣＤ１５５との結合を阻害、阻止、又はそれと拮抗する。ＣＤ９６に対する特異的結合物質は、ＣＤ１５５と相互作用することが可能なＣＤ９６の細胞外ドメイン又はその一部分に結合することにより、ＣＤ１５５に対するＣＤ９６の結合を少なくとも部分的に阻害又は阻止することが好ましい。
【0048】
ＣＤ９６に対する特異的結合物質は、ＣＤ９６シグナル伝達を阻害又は低減することが好ましい。ＣＤ９６シグナル伝達の阻害又は低減は、ＣＤ１５５との結合を阻害、阻止、又は拮抗することによるものであってもよく、又はＣＤ１５５結合に応答して通常生じるであろうＣＤ９６誘発シグナル伝達を阻止することによるものであってもよい。例として、ＣＤ９６は、免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。ＣＤ９６に対する特異的結合物質は、ＣＤ９６のＩＴＩＭにより媒介されるＣＤ９６シグナル伝達を阻害又は低減する能力を有してもよい。
【0049】
〈抗ＣＤ９６抗体〉
抗ＣＤ９６抗体は、ＣＤ９６に対して特異性を有する抗体であれば特に制限されない。市販または公知の抗ＣＤ９６抗体を用いてもよいし、本明細書で開示したＴＸ１１１．２を用いてもよいし、種々の公知の方法により新たに作製してもよいが、ＴＸ１１１．２が好ましい。
抗ＣＤ９６抗体は、ＣＤ９６に対して特異性を有する抗体であれば特に制限されない。市販または公知の抗ＣＤ９６抗体を用いてもよいし、本明細書で開示したＴＸ１１１．２を用いてもよいし、種々の公知の方法により新たに作製してもよいが、ＴＸ１１１．２が好ましい。
【0050】
市販の抗ＣＤ９６抗体としては、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製のマウス抗ヒトＣＤ９６モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ：ＮＫ９２．３９、ＮＯ.３３８４０２）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製のマウス抗ヒトＣＤ９６モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ：ＮＫ９２．５０．１、ＮＯ．ｓｃ－５３５７４およびｃｌｏｎｅ：ＮＫ９２．３９．１、ＮＯ．ｓｃ－５３５７５）、ＲＳＤ社製のヒツジ抗ヒトＣＤ９６ポリクローナル抗体（ＮＯ．ＡＦ６１９９）等を用いることができる。さらに、市販の抗ＣＤ９６抗体としては、特許第６６１８９０８号公報に記載された４つの市販の抗ヒトＣＤ９６抗体（１Ｃ８、ＮＫ９２．３９、３Ｈ８、ＭＡＡ６３５９）を用いることができる。
【0051】
その他の公知の抗ＣＤ９６抗体は、例えば、特許第６６１８９０８号公報に記載された
以下のような方法で得ることができる。４匹のＣＤ９６ノックアウトマウスを、マウスＣＤ９６外部ドメインタンパク質で免疫し、同様に、４匹のＣＤ９６ノックアウトマウスを、精製したヒトＣＤ９６外部ドメインタンパク質で免疫する。免疫処置は、４週間間隔でおよそ３回行われる。マウスは、３回目の免疫の１０～１２日後に出血させ、血清を、ＥＬＩＳＡにより抗原スクリーニングで滴定する。最も高い抗体価を有するマウスを融合に使用する。あるいは、マウスが十分に応答しない場合、更なる免疫処置を試みる。選択したハイブリドーマをクローニングし、各クローンからｍＡｂ（モノクローナル抗体）を精製した後、個々のヒト又はマウスｍＡｂを、それぞれ、抗ＣＤ９６抗体を特定するためのスクリーニングアッセイ（ＣＤ１５５に対するＣＤ９６の結合アッセイ、ＡＤＣＣアッセイ、およびヒトＣＤ９６抗体によるヒト白血球エフェクター機能調節のアッセイ）、または抗ＣＤ９６抗体によるマウスＮＫ細胞機能調節のアッセイを使用してスクリーニングする。任意選択で、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４抗体等の、ＡＤＣＣを誘導する可能性が低いか又は誘導することができない抗体を特定するために、クローンのアイソタイプ決定を行う。
以下のような方法で得ることができる。４匹のＣＤ９６ノックアウトマウスを、マウスＣＤ９６外部ドメインタンパク質で免疫し、同様に、４匹のＣＤ９６ノックアウトマウスを、精製したヒトＣＤ９６外部ドメインタンパク質で免疫する。免疫処置は、４週間間隔でおよそ３回行われる。マウスは、３回目の免疫の１０～１２日後に出血させ、血清を、ＥＬＩＳＡにより抗原スクリーニングで滴定する。最も高い抗体価を有するマウスを融合に使用する。あるいは、マウスが十分に応答しない場合、更なる免疫処置を試みる。選択したハイブリドーマをクローニングし、各クローンからｍＡｂ（モノクローナル抗体）を精製した後、個々のヒト又はマウスｍＡｂを、それぞれ、抗ＣＤ９６抗体を特定するためのスクリーニングアッセイ（ＣＤ１５５に対するＣＤ９６の結合アッセイ、ＡＤＣＣアッセイ、およびヒトＣＤ９６抗体によるヒト白血球エフェクター機能調節のアッセイ）、または抗ＣＤ９６抗体によるマウスＮＫ細胞機能調節のアッセイを使用してスクリーニングする。任意選択で、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４抗体等の、ＡＤＣＣを誘導する可能性が低いか又は誘導することができない抗体を特定するために、クローンのアイソタイプ決定を行う。
【0052】
その他の公知の抗ＣＤ９６抗体のさらなる例は、国際公開２０１９／０９１４４９号公報に記載された抗ヒトＣＤ９６マウスモノクローナル抗体ｍ１７１８、ｍ１７１９、ｍ１７２０、ｍ１７２１、およびｍ１７２２、ならびにこれらから得られるキメラ抗体およびヒト化抗体である。
【0053】
抗ＣＤ９６抗体としては、市販または公知の抗ＣＤ９６抗体の変異体、キメラ抗体、ヒト化抗体等を用いてもよい。
【0054】
抗ＣＤ９６抗体は、ＣＤ９６に対して特異性を有する抗体のうち、ＣＤ９６シグナル伝達を阻害又は低減する抗体、すなわち、抗ＣＤ９６中和抗体が好ましい。
【0055】
抗ＣＤ９６中和抗体は、特に制限されないが、好ましい例として、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製のマウス抗ヒトＣＤ９６モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ：ＮＫ９２．３９、ＮＯ.３３８４０２）、本明細書で開示したＴＸ１１１．２をあげることができる。
【0056】
抗ＣＤ９６中和抗体は、下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ＣＤＲ１として配列番号１４のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号１５のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号１６のアミノ酸配列、ならびに
下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
ＣＤＲ１として配列番号１７のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号１８のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号１９のアミノ酸配列
を有する抗体であることが好ましい。
ＣＤＲ１として配列番号１４のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号１５のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号１６のアミノ酸配列、ならびに
下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
ＣＤＲ１として配列番号１７のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号１８のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号１９のアミノ酸配列
を有する抗体であることが好ましい。
【0057】
抗ＣＤ９６中和抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する抗体であることが好ましい。
【0058】
抗ＣＤ９６中和抗体は、配列番号１２と少なくとも９０％以上同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１３と少なくとも９０％以上同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する抗体であることが好ましい。
【0059】
抗ＣＤ９６中和抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列のうち、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３以外の領域において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、もしくは欠失したアミノ酸配列であって、配列番号１２と少なくとも９０％以上同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号１３のアミノ酸配列のうち、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３以外の領域において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、もしくは欠失したアミノ酸配列であって、配列番号１３と少なくとも９０％以上同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域重鎖可変領域を有する抗体であることが好ましい。
【0060】
〈ＩＬ－１７〉
ＩＬ－１７（インターロイキン－１７）は、ＩＬ－１７ファミリーの意味であり、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｂ、ＩＬ－１７Ｃ、ＩＬ－１７Ｄ、ＩＬ－１７Ｅ、およびＩＬ－１７Ｆを包含する。ＩＬ－１７を評価する場合、ＩＬ－１７ファミリーを構成するものの少なくとも一つを評価すればよい。産生量が多く、また測定が容易であることから、ＩＬ－１７は、好ましくはＩＬ－１７Ａである。
ＩＬ－１７（インターロイキン－１７）は、ＩＬ－１７ファミリーの意味であり、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｂ、ＩＬ－１７Ｃ、ＩＬ－１７Ｄ、ＩＬ－１７Ｅ、およびＩＬ－１７Ｆを包含する。ＩＬ－１７を評価する場合、ＩＬ－１７ファミリーを構成するものの少なくとも一つを評価すればよい。産生量が多く、また測定が容易であることから、ＩＬ－１７は、好ましくはＩＬ－１７Ａである。
【0061】
〈ＩＬ－１７産生細胞〉
ＩＬ－１７産生細胞とは、ＩＬ－１７を産生する細胞であれば特に制限されないが、例えばγδＴ細胞、Ｔｈ１７細胞、ＩＬＣ３細胞などである。
ＩＬ－１７産生細胞とは、ＩＬ－１７を産生する細胞であれば特に制限されないが、例えばγδＴ細胞、Ｔｈ１７細胞、ＩＬＣ３細胞などである。
【0062】
γδＴ細胞とは、細胞表面にγ鎖とδ鎖からなるＴ細胞受容体を持つ細胞であり、ＩＬ－１７を産生する。
Ｔｈ１７細胞（１７型ヘルパーＴ細胞）とはヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）のサブセットの一つであり、ＩＬ－１７を産生する細胞である。すなわち、Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ－１７を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞）ということができる。
Ｔｈ１７細胞（１７型ヘルパーＴ細胞）とはヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）のサブセットの一つであり、ＩＬ－１７を産生する細胞である。すなわち、Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ－１７を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞）ということができる。
【0063】
ＩＬＣ３細胞は、転写因子ＲＯＲγｔを必要とし、ＩＬ－１７を産生する、グループ３自然リンパ球（Ｉｎｎａｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌ； ＩＬＣ）である。ＩＬＣ３細胞は、ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｄｕｃｅｒ（ＬＴｉ）およびＩＬ－２２を産生するＩＬＣ２２細胞を含む。
【0064】
ＩＬ－１７産生細胞、特にγδＴ細胞、Ｔｈ１７細胞、およびＩＬＣ３細胞は、ＩＬ－２２も産生し得る。
ＩＬ－１７産生細胞は、疾患または病態への関与が大きいことから、好ましくはγδＴ細胞である。
ＩＬ－１７産生細胞は、疾患または病態への関与が大きいことから、好ましくはγδＴ細胞である。
【0065】
<ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤〉
ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答とは、外来性または内因性の異物を排除するために特異的に応答して行われる反応のうち、ＩＬ－１７産生細胞において起こる反応の意味であり、自然免疫によるものであっても獲得免疫によるものであってもよい。ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答は、例えばサイトカイン産生であり、ＩＬ－１７、ＩＬ－２２、ＴＮＦ、ＩＦＮ－γ等の産生があげられる。
ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答とは、外来性または内因性の異物を排除するために特異的に応答して行われる反応のうち、ＩＬ－１７産生細胞において起こる反応の意味であり、自然免疫によるものであっても獲得免疫によるものであってもよい。ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答は、例えばサイトカイン産生であり、ＩＬ－１７、ＩＬ－２２、ＴＮＦ、ＩＦＮ－γ等の産生があげられる。
【0066】
ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答は、外来性または内因性の異物を排除するために特異的に応答して行われる反応を模した反応により、誘導された免疫反応であってもよい。例えば、異物を認識した細胞によってサイトカインが産生されることが知られている場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏの試験系において該サイトカイン添加により誘導されるＩＬ－１７産生細胞の免疫応答も、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答に含む。ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答を誘導する方法は特に制限されないが、サイトカインによる誘導が好ましく、ＩＬ－２３による誘導がさらに好ましい。
【0067】
ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤は、サイトカイン産生を抑制してもよいが、産生されたサイトカインによって惹起される、ＩＬ－１７産生細胞における様々な免疫応答のうち、いずれかを抑制する作用を有すればよい。
【0068】
ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤は、好ましくはサイトカイン産生抑制剤であり、さらに好ましくはＩＬ－１７産生抑制剤またはＩＬ－２２産生抑制剤である。
ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤の用途は特に制限されないが、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するために用いることが好ましい。ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態としては、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態であれば特に制限されないが、好ましくは乾癬、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、脳梗塞、腎炎、肺傷害、肺線維症または皮膚腫瘍であり、より好ましくは乾癬または多発性硬化症であり、さらに好ましくは乾癬である。
ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤の用途は特に制限されないが、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するために用いることが好ましい。ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態としては、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態であれば特に制限されないが、好ましくは乾癬、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、脳梗塞、腎炎、肺傷害、肺線維症または皮膚腫瘍であり、より好ましくは乾癬または多発性硬化症であり、さらに好ましくは乾癬である。
【0069】
疾病または病態を治療または予防するとは、例えば、疾病または病態の発症を抑制する、疾病または病態の進行を抑制する、および疾病または病態の症状を低減または緩和することを含む。
【0070】
乾癬は、尋常性乾癬（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、関節症性乾癬（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ ａｒｔｈｒｏｐｉｃａ）、膿疱性乾癬（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ ｐｕｓｔｕｌｏｓａ）、滴状乾癬、および乾癬性紅皮症等を含む。乾癬は、通常、厚い銀白色の鱗屑を伴った角化性紅斑が認められ、病理学的にも乾癬様の表皮突起が延長した表皮肥厚と顆粒層を欠失した錯角化、角層下好中球性微小膿瘍が認められることにより診断することができる。
【0071】
多発性硬化症は、再発寛解型、一次進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）、二次進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）、および進行再発型ＭＳ（ＰＲＭＳ）を含む。多発性硬化症は、患者がＣＩＳ（Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）と称される単一の脱髄性症状を発症し、脱髄性症状が時間的または空間的多発性を呈した場合に診断することができる。本発明のＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤は、ＣＩＳから多発性硬化症への進展の予防または抑制に使用するためにも有効であり得る。
【0072】
ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤の投与量（有効量）は特に制限されず、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態の種類や症状の程度、投与対象（年齢、性別、体重等）、投与経路などによって適宜選択すればよい。例えば、ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質が、抗ＣＤ９６抗体である場合、１回の投与において１ｋｇ体重あたり抗ＣＤ９６抗体０．５～５０ｍｇ、好ましくは０．７ｍｇ～１０ｍｇ、より好ましくは１ｍｇ～５ｍｇを含むＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤を１日１回～数回投与すればよい。合計投与回数および投与頻度も特に制限されず、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態の種類や症状の程度、投与対象（年齢、性別、体重等）、投与経路などによって適宜選択すればよいが、１回のみでもよく、毎日連続投与してもよいし、数日の間隔をあけて１～数週間にわたり投与してもよい。
【0073】
ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤は、そのまま生体に投与してもよいが、前記ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤の有効量を薬学的に許容する担体と共に配合した医薬品として投与することが好ましい。投与方法は特に制限されず、経口、または非経口とすることができる。投与方法は、好ましくは非経口であり、より好ましくは腹腔内注射、または静脈内注射である。
【0074】
〈ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品〉
本発明のＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品は、前記ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤を含むものであれば特に制限されず、前記ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤の他に薬学的に許容する担体を含んでもよい。
本発明のＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品は、前記ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤を含むものであれば特に制限されず、前記ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤の他に薬学的に許容する担体を含んでもよい。
【0075】
ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態としては、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態であれば特に制限されないが、好ましくは乾癬、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、脳梗塞、腎炎、肺傷害、肺線維症または皮膚腫瘍であり、より好ましくは乾癬または多発性硬化症であり、さらに好ましくは乾癬である。
【0076】
前記医薬品の形態は特に制限されず、例えば、注射剤、注入剤、経口剤（錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセルも含む）、溶液剤、懸濁液剤）、外用剤（例えば、ローション、乳液剤、貼付剤、軟膏剤）である。前記医薬品は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、調製されてもよい。
【0077】
前記医薬品の投与量は特に制限されず、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態の種類や症状の程度によって適宜選択すればよい。
前記薬学的に許容される担体は、特に制限されないが、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む、抗酸化剤；オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、アルキルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、ｍ－クレゾールなどの保存料；低分子ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、デキストリンなどの糖類；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；金属錯体；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの多価アルコール、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などの非イオン系表面活性剤等があげられる。
前記薬学的に許容される担体は、特に制限されないが、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む、抗酸化剤；オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、アルキルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、ｍ－クレゾールなどの保存料；低分子ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、デキストリンなどの糖類；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；金属錯体；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの多価アルコール、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などの非イオン系表面活性剤等があげられる。
【0078】
前記医薬品の投与対象は特に制限されないが、哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。
【0079】
本発明の一実施形態は、ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質の有効量を、対象に投与することを含むＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制方法である。
また、本発明の一実施形態は、ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質の有効量を、対象に投与することを含む、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態の治療または予防方法である。
さらに、本発明の一実施形態は、ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質の有効量を、対象に投与することを含む、乾癬、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、脳梗塞、腎炎、肺傷害、肺線維症または皮膚腫瘍の治療または予防方法である。
また、本発明の一実施形態は、ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質の有効量を、対象に投与することを含む、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態の治療または予防方法である。
さらに、本発明の一実施形態は、ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質の有効量を、対象に投与することを含む、乾癬、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、脳梗塞、腎炎、肺傷害、肺線維症または皮膚腫瘍の治療または予防方法である。
【0080】
本発明の一実施形態は、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制における使用のための、ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質である。
また、本発明の一実施形態は、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための、ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質である。
さらに、本発明の一実施形態は、乾癬、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、脳梗塞、腎炎、肺傷害、肺線維症または皮膚腫瘍を治療または予防するための、ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質である。
また、本発明の一実施形態は、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための、ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質である。
さらに、本発明の一実施形態は、乾癬、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、脳梗塞、腎炎、肺傷害、肺線維症または皮膚腫瘍を治療または予防するための、ＣＤ９６とＣＤ１５５およびＣＤ１１１から選択される少なくとも一種のタンパク質との結合を阻害する物質である。
【0081】
〈工程（Ａ）を有する方法〉
本発明の第三の態様は工程（Ａ）を有する方法である。本発明において工程（Ａ）は、γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程である。
本発明の第三の態様は工程（Ａ）を有する方法である。本発明において工程（Ａ）は、γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程である。
【0082】
本発明の工程（Ａ）を有する方法は、言い換えると、γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つの処理方法ともいえる。工程（Ａ）を有する方法を行う、目的、用途は特に限定されないが、該方法では、γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体により刺激することで、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞における免疫応答が誘導されるため、例えば、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞における免疫応答機構の解明、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞における免疫応答を阻害、抑制、促進、または増強する効果を有する医薬品のスクリーニング、および評価等に用いることができる。
【0083】
本発明の一実施形態は、γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程（Ａ）を有する細胞の培養方法である。
また、工程（Ａ）により、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の免疫応答を誘導すること、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化すること、およびγδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞のＩＬ－１７産生を誘導することが可能になる。
したがって、工程（Ａ）は、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の免疫応答誘導方法、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化方法、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞のＩＬ－１７産生誘導方法として用いることもできる。
前記γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の免疫応答誘導方法は、例えば、後述するように、ＩＬ－１７、ＩＬ－２２、ＴＮＦ、ＩＦＮ－γ等のサイトカイン産生を指標として免疫応答の誘導の有無を評価することができる。
前記γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化方法は、例えば、後述するように、ＣＤ６９、ＣＤ２５等の活性化マーカーを指標として活性化の有無を評価することができる。
前記γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞のＩＬ－１７産生誘導方法は、例えば、後述するように、ＩＬ－１７産生量、ＩＬ－１７の活性等を指標としてＩＬ－１７産生誘導の有無を評価することができる。
また、工程（Ａ）により、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の免疫応答を誘導すること、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化すること、およびγδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞のＩＬ－１７産生を誘導することが可能になる。
したがって、工程（Ａ）は、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の免疫応答誘導方法、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化方法、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞のＩＬ－１７産生誘導方法として用いることもできる。
前記γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の免疫応答誘導方法は、例えば、後述するように、ＩＬ－１７、ＩＬ－２２、ＴＮＦ、ＩＦＮ－γ等のサイトカイン産生を指標として免疫応答の誘導の有無を評価することができる。
前記γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化方法は、例えば、後述するように、ＣＤ６９、ＣＤ２５等の活性化マーカーを指標として活性化の有無を評価することができる。
前記γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞のＩＬ－１７産生誘導方法は、例えば、後述するように、ＩＬ－１７産生量、ＩＬ－１７の活性等を指標としてＩＬ－１７産生誘導の有無を評価することができる。
【0084】
ＩＬ－２３は、抗原提示細胞によって産生され、γδＴ細胞の免疫応答を誘導することが知られているサイトカインである。また、ＩＬ－２３の受容体としては、ＩＬ－２３ＲおよびＩＬ－１２Ｒβ１が知られている。工程（Ａ）を有する方法において、ＩＬ－２３は、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の免疫応答を誘導するために添加するものである。ＩＬ－２３としては、ＩＬ－２３タンパク質であれば由来は問わず、生体から精製したタンパク質を用いてもよく、大腸菌、酵母、植物細胞、哺乳動物細胞や昆虫細胞由来のリコンビナントタンパク質を用いてもよい。γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の免疫応答を誘導することができれば、ＩＬ－２３の全長でも一部でもよく、翻訳後修飾や糖鎖付加の有無、キャリアの有無等も制限されない。γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の免疫応答を効率的に誘導できることから、ＩＬ－２３は好ましくはリコンビナントタンパク質であり、さらに好ましくは哺乳動物細胞由来または昆虫細胞由来リコンビナントタンパク質である。
【0085】
ＩＬ－２３の培養系中の終濃度は、好ましくは０．００１～２０ｎｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは０．０１～１ｎｇ／ｍｌである。
【0086】
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激するために用いる。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激することができれば特に制限されず、例えば固相化された抗ＣＤ３抗体、アゴニスティック（刺激性）抗ＣＤ３抗体等である。入手が容易であることから、固相化された抗ＣＤ３抗体が好ましい。固相化された抗ＣＤ３抗体を細胞に添加すると、ＣＤ３は、抗体により架橋されるため、ＣＤ３からのシグナルが入り、結果としてＴＣＲによる抗原認識のシグナルと同様のシグナルがＴ細胞内に伝達される。
【0087】
抗ＣＤ３抗体は、固相化することにより、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体になる。したがって、固相化に用いる、抗ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体と特異的に結合することができれば特に制限されず、ＴＯＮＢＯ社製ＮＯ．４０－００３１等の種々の抗ＣＤ３抗体を用いることができる。γδＴ細胞が由来する動物種に応じて、その動物種のＴＣＲ／ＣＤ３複合体と結合する抗ＣＤ３抗体を選択すればよい。
【0088】
固相化に用いる、抗ＣＤ３抗体の濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌである。
【0089】
ＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体は、Ｔ細胞表面のＣＤ９６を刺激するために用いる。ＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体は、Ｔ細胞表面のＣＤ９６を刺激することができれば特に制限されず、例えば固相化された抗ＣＤ９６抗体、アゴニスティック（刺激性）抗ＣＤ９６抗体等である。入手が容易であることから、固相化された抗ＣＤ９６抗体が好ましい。固相化された抗ＣＤ９６抗体を細胞に添加すると、ＣＤ９６は、抗体により架橋されるため、ＣＤ９６からのシグナルが入り、結果としてナチュラルリガンドである細胞表面のＣＤ１５５がＣＤ９６に結合したときと同様のシグナルがＴ細胞内に伝達される。
【0090】
抗ＣＤ９６抗体は、固相化することにより、ＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体になる。したがって、固相化に用いる抗ＣＤ９６抗体は、細胞表面のＣＤ９６と特異的に結合することができれば特に制限されず、種々の抗ＣＤ９６抗体を用いることができる。例えば、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅTMラット抗マウスＣＤ９６抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＮＯ．１６－０９６０－８２）、抗ヒトＣＤ９６抗体（ｃｌｏｎｅ：ＮＫ９２．３９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、ＮＯ．３３８４０２）、ＴＸ１１１．２等があげられる。γδＴ細胞が由来する動物種に応じて、その動物種のＣＤ９６と結合する抗ＣＤ９６抗体を選択すればよい。
【0091】
固相化に用いる抗ＣＤ９６抗体の濃度は、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは１μｇ／ｍｌ～２００μｇ／ｍｌである。
【0092】
抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ９６抗体を固相化する固相は、特に制限されず、例えばプレート、ディッシュ、バッグ、メンブレン、ビーズ等である。固相化が容易であることから、好ましくはプレートであり、さらに好ましくは複数のウェルを備えたプレートである。固相の材質は特に制限されず、ガラス、ポリスチレン等を好適に用いることができる。固相化が効率的に行え、入手が容易であることから、抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ９６抗体を固相化する固相は好ましくはポリスチレン製プレートである。
【0093】
固相表面は、何も処理しなくてもよいし、疎水または親水性になるような処理を施してもよい。また、ＣＨＯＨ基、＞Ｃ＝Ｏ基、－ＣＯＯＨ基、－ＮＨ2基、＞ＮＨ基等の官能基を導入してもよい。
【0094】
抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ９６抗体を固相化する方法は、特に制限されず、公知の種々の方法を用いることができる。例えば静電相互作用、疎水的な相互作用（物理吸着）、水素結合、電荷移動、または共有結合等を用いて、抗体を固相へ固相化させればよいが、操作が簡便であることから、好ましくは疎水的な相互作用である。疎水的な相互作用を利用した固相化は、例えば、抗体溶液をプレートに添加し、一定時間インキュベーションした後、抗体溶液を捨て、洗浄することにより行うことができる。
抗体溶液は、固相表面を覆うのに充分な量を用いればよく、例えば固相が９６ウェルプレートである場合は、５０～２００μｌ／ウェルで添加することが好ましい。
抗体溶液は、固相表面を覆うのに充分な量を用いればよく、例えば固相が９６ウェルプレートである場合は、５０～２００μｌ／ウェルで添加することが好ましい。
【0095】
工程（Ａ）を有する方法は、前記工程（Ａ）を行った後に、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞における免疫応答を評価する工程（Ｄ）を任意で有してもよい。γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞における免疫応答とは、外来性または内因性の異物を排除するために特異的に応答して行われる反応のうち、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞において起こる反応の意味であり、自然免疫によるものであっても獲得免疫によるものであってもよい。γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞における免疫応答は、例えばサイトカイン産生であり、ＩＬ－１７、ＩＬ－２２、ＴＮＦ、ＩＦＮ－γ等の産生があげられるが、ＩＬ－１７産生が好ましい。すなわち、工程（Ａ）を有する方法は、工程（Ａ）を行った後に、ＩＬ－１７を評価する工程（Ｂ）を有することが好ましい。
【0096】
工程（Ａ）を有する方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで行ってもよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行ってもよいが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことが好ましい。
【0097】
〈工程（Ｂ）〉
工程（Ｂ）は、工程（Ａ）の後に行ってもよい任意の工程であり、ＩＬ－１７を評価する工程である。ＩＬ－１７を評価することにより、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の状態、特に免疫応答を評価することができる。
工程（Ｂ）は、工程（Ａ）の後に行ってもよい任意の工程であり、ＩＬ－１７を評価する工程である。ＩＬ－１７を評価することにより、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の状態、特に免疫応答を評価することができる。
【0098】
従って、本発明の実施形態の1つの例は、
工程（Ａ）：γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程、および
工程（Ｂ）：工程（Ａ）を行った、γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つに由来するＩＬ－１７を評価する工程
を有する方法である。
前記方法により、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の免疫応答を評価すること、および、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化を評価することができる。
したがって、前記方法は、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の免疫応答を評価する方法、およびγδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化を評価する方法として用いることができる。
工程（Ａ）：γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程、および
工程（Ｂ）：工程（Ａ）を行った、γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つに由来するＩＬ－１７を評価する工程
を有する方法である。
前記方法により、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の免疫応答を評価すること、および、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化を評価することができる。
したがって、前記方法は、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の免疫応答を評価する方法、およびγδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化を評価する方法として用いることができる。
【0099】
ＩＬ－１７を評価する方法は、ＩＬ－１７を評価できれば方法は特に制限されず、例えば、ＩＬ－１７産生量を測定する方法、ＩＬ－１７の活性を測定する方法等が挙げられる。前記ＩＬ－１７の評価は、工程（Ａ）を行った細胞に由来するＩＬ－１７を評価すればよく、細胞内のＩＬ－１７を評価してもよいし、例えば細胞培養上清中に存在する、細胞外に放出されたＩＬ－１７を評価してもよい。前記ＩＬ－１７を評価する方法は、疾患との関連が多く報告されていることから、好ましくはＩＬ－１７産生量を測定する方法である。ＩＬ－１７産生量の測定は、例えば定量的ＰＣＲによるＩＬ－１７ｍＲＮＡ量測定、ウエスタンブロッティングやＥＬＩＳＡによるＩＬ－１７タンパク量測定、フローサイトメーターによる細胞内ＩＬ－１７タンパク量測定などが挙げられ、ＩＬ－１７産生のより上流での変化をとらえられることから、好ましくは定量的ＰＣＲによるＩＬ－１７ｍＲＮＡ量測定である。定量的ＰＣＲによるＩＬ－１７ｍＲＮＡ量測定のプライマーとしては、Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＴＴＴＡＡＣＴＣＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＡ－３’（配列番号１）、Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＣＴＴＴＣＣＣＴＣＣＧＣＡＴＴＧＡＣＡＣ－３’（配列番号２）を用いることが好ましい。
【0100】
<医薬品の評価方法>
本発明の第四の態様である医薬品（候補物質）の評価方法は、工程（Ａ）の後に工程（Ｂ）を有する方法を含む、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品（候補物質）の評価方法である。本発明の医薬品（候補物質）の評価方法により、医薬品（候補物質）が有する、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答を阻害、抑制、促進、または増強する効果を評価することができる。本発明の医薬品（候補物質）の評価方法は、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞に医薬品（候補物質）を添加する工程（Ｃ）を有する。工程（Ｃ）の順序は、通常、工程（Ａ）の前、工程（Ａ）と同時、または工程（Ａ）の後であり、工程（Ｂ）の前である。
本発明の第四の態様である医薬品（候補物質）の評価方法は、工程（Ａ）の後に工程（Ｂ）を有する方法を含む、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品（候補物質）の評価方法である。本発明の医薬品（候補物質）の評価方法により、医薬品（候補物質）が有する、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答を阻害、抑制、促進、または増強する効果を評価することができる。本発明の医薬品（候補物質）の評価方法は、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞に医薬品（候補物質）を添加する工程（Ｃ）を有する。工程（Ｃ）の順序は、通常、工程（Ａ）の前、工程（Ａ）と同時、または工程（Ａ）の後であり、工程（Ｂ）の前である。
【0101】
したがって、本発明の実施形態の1つの例は、
工程（Ａ）：γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程、
工程（Ｂ）：工程（Ａ）を行った、γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つに由来するＩＬ－１７を評価する工程、および
工程（Ｃ）：工程（Ａ）の前、工程（Ａ）と同時、または工程（Ａ）の後であり、工程（Ｂ）の前に、前記γδＴ細胞または前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞に医薬品候補物質を添加する工程
を有する、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品候補物質の評価方法である。
工程（Ａ）：γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程、
工程（Ｂ）：工程（Ａ）を行った、γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つに由来するＩＬ－１７を評価する工程、および
工程（Ｃ）：工程（Ａ）の前、工程（Ａ）と同時、または工程（Ａ）の後であり、工程（Ｂ）の前に、前記γδＴ細胞または前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞に医薬品候補物質を添加する工程
を有する、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品候補物質の評価方法である。
【0102】
本発明の医薬品の評価方法は、候補物質の存在下および非存在下において工程（Ａ）および工程（Ｂ）を行うことにより、候補物質の存在下におけるＩＬ－１７産生量が候補物質の非存在下におけるＩＬ－１７産生量よりも少ない場合に、該候補物質をＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するために有効であると判断することができる。
【0103】
本発明の医薬品（候補物質）の評価方法は、医薬品（候補物質）のスクリーニング方法であってもよい。
【0104】
したがって、本発明の実施形態の1つの例は、
工程（Ａ）：γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程、
工程（Ｂ）：工程（Ａ）を行った、γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つに由来するＩＬ－１７を評価する工程、および
工程（Ｃ）：工程（Ａ）の前、工程（Ａ）と同時、または工程（Ａ）の後であり、工程（Ｂ）の前に、前記γδＴ細胞または前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞に医薬品候補物質を添加する工程
を有する、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品候補物質のスクリーニング方法である。
工程（Ａ）：γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程、
工程（Ｂ）：工程（Ａ）を行った、γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つに由来するＩＬ－１７を評価する工程、および
工程（Ｃ）：工程（Ａ）の前、工程（Ａ）と同時、または工程（Ａ）の後であり、工程（Ｂ）の前に、前記γδＴ細胞または前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞に医薬品候補物質を添加する工程
を有する、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品候補物質のスクリーニング方法である。
【0105】
本発明の医薬品（候補物質）のスクリーニング方法は、医薬品（候補物質）の存在下および非存在下において工程（Ａ）および工程（Ｂ）を行うことにより、医薬品（候補物質）の存在下におけるＩＬ－１７産生量が、医薬品（候補物質）の非存在下におけるＩＬ－１７産生量よりも少ない場合に、該医薬品（候補物質）をＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品の候補として選択することができる。例えば、医薬品（候補物質）の存在下におけるＩＬ－１７産生量が、医薬品（候補物質）の非存在下におけるＩＬ－１７産生量の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％以下である場合に、該医薬品（候補物質）をＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品の候補として選択することができる。医薬品（候補物質）の存在下におけるＩＬ－１７産生量が、医薬品（候補物質）の非存在下におけるＩＬ－１７産生量の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以下である場合に、該医薬品（候補物質）をＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品の候補として選択することが好ましい。
【0106】
医薬品（候補物質）としては、低分子化合物、タンパク質、ポリペプチド、多糖類、核酸等があげられるが、特に制限されない。医薬品（候補物質）は、新規な物質でも公知の物質でもよい。
【0107】
前記ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態は、好ましくは乾癬、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、脳梗塞、腎炎、肺傷害、肺線維症または皮膚腫瘍であり、より好ましくは乾癬である。
【0108】
<ＩＬ－１７産生方法>
本発明の第五の態様であるＩＬ－１７産生方法は、γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程（Ａ）を有する。γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞をＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体により刺激することで、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるＩＬ－１７産生が誘導される。
本発明の第五の態様であるＩＬ－１７産生方法は、γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程（Ａ）を有する、ＩＬ－１７の製造方法ということもできる。
本発明の第五の態様であるＩＬ－１７産生方法は、γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程（Ａ）を有する。γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞をＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体により刺激することで、γδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるＩＬ－１７産生が誘導される。
本発明の第五の態様であるＩＬ－１７産生方法は、γδＴ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも１つをＩＬ－２３、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激可能な抗ＣＤ３抗体およびＣＤ９６を刺激可能な抗ＣＤ９６抗体と共に培養する工程（Ａ）を有する、ＩＬ－１７の製造方法ということもできる。
【0109】
前記ＩＬ－１７産生方法で得られたＩＬ－１７の用途は特に制限されず、アフィニティークロマトグラフィーや免疫沈降等により単離した後に用いてもよい。また、ＩＬ－１７が産生されたγδＴ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞として、ＩＬ－１７産生を阻害、抑制、促進、または増強する効果を有する医薬品のスクリーニング、および評価等に用いてもよい。
【0110】
前記ＩＬ－１７産生方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで行ってもよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行ってもよいが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことが好ましい。
【実施例】
【0111】
次に本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
〔実施例１〕
≪方法≫
〈イミキモド誘発乾癬モデル〉
このモデルは、剃毛したマウス背中の皮膚にイミキモド（ＩＭＱ）を３－６日間連続塗布することにより炎症を誘発させるものであり、乾癬の病態モデルとして汎用されている。表皮の肥厚、不全角化、真皮への好中球と単核球の浸潤等、乾癬に特徴的な病態が観察され、そのメカニズムは、以下の通りだと報告されている。ＩＭＱがＴＬＲ７を介して樹状細胞を活性化し、ＩＬ－２３が産生される。ＩＬ－２３は、γδＴ細胞上のＩＬ－２３Ｒ／ＩＬ－１２Ｒβ１を介してγδＴ細胞を活性化し、ＩＬ－１７およびＩＬ－２２が産生される。ＩＬ－１７およびＩＬ－２２は、好中球の患部への遊走を促進し、紅斑、鱗屑、および皮膚の肥厚を誘導する。
〔実施例１〕
≪方法≫
〈イミキモド誘発乾癬モデル〉
このモデルは、剃毛したマウス背中の皮膚にイミキモド（ＩＭＱ）を３－６日間連続塗布することにより炎症を誘発させるものであり、乾癬の病態モデルとして汎用されている。表皮の肥厚、不全角化、真皮への好中球と単核球の浸潤等、乾癬に特徴的な病態が観察され、そのメカニズムは、以下の通りだと報告されている。ＩＭＱがＴＬＲ７を介して樹状細胞を活性化し、ＩＬ－２３が産生される。ＩＬ－２３は、γδＴ細胞上のＩＬ－２３Ｒ／ＩＬ－１２Ｒβ１を介してγδＴ細胞を活性化し、ＩＬ－１７およびＩＬ－２２が産生される。ＩＬ－１７およびＩＬ－２２は、好中球の患部への遊走を促進し、紅斑、鱗屑、および皮膚の肥厚を誘導する。
【0112】
マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（野生型マウス）およびＣＤ９６欠損マウスの６～８週齢のオスを用い、イミキモド群（ＩＭＱ）、ｎａｉｖｅ群用に４匹ずつ分けた。ＣＤ９６欠損マウスは、ゲノム編集技術（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）によって作製した。ＡＡＴＡＧＡＧＡＣＡＡＡＴＣＧＧＡＣＴＣＴＧＧ（配列番号３）をターゲット配列とした。マウスの背部を剃毛し、イミキモド群には、５％イミキモドクリーム（ベセルナクリーム、持田製薬株式会社製）を３１．２５ｍｇ／回／匹で一日一回塗布した。ｎａｉｖｅ群には、５％イミキモドクリームの代わりにワセリンを塗布した。イミキモドクリームまたはワセリン塗布開始日を０日とし、０日目、１日目、２日目に塗布し、３日目に解析を行った。
【0113】
（紅斑、鱗屑の評価）
ヒトの乾癬の診断に利用されているＰＡＳＩ （Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ Ａｒｅａ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）に基づき、背部の紅斑および鱗屑をスコア化した。スコアは、それぞれ、０：なし，１：軽度，２：中等度，３：高度，４：きわめて高度の５段階で評価した。
ヒトの乾癬の診断に利用されているＰＡＳＩ （Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ Ａｒｅａ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）に基づき、背部の紅斑および鱗屑をスコア化した。スコアは、それぞれ、０：なし，１：軽度，２：中等度，３：高度，４：きわめて高度の５段階で評価した。
【0114】
（皮膚の厚さの評価）
マウス背部の皮膚を持ち上げ、ダイヤルシクネスゲージＧ型（株式会社尾崎製作所製）を用いて厚さを測定し、測定値を２で除した値を皮膚の厚さ（μｍ）とした。マウス一匹あたり３箇所測定し、平均値を算出した。マウス毎の値を用いて誤差を算出し、その後、各群で有意差検定を行なった。
マウス背部の皮膚を持ち上げ、ダイヤルシクネスゲージＧ型（株式会社尾崎製作所製）を用いて厚さを測定し、測定値を２で除した値を皮膚の厚さ（μｍ）とした。マウス一匹あたり３箇所測定し、平均値を算出した。マウス毎の値を用いて誤差を算出し、その後、各群で有意差検定を行なった。
【0115】
（組織標本の作製、観察）
塗布開始３日目にマウス背部の皮膚を採取し、ホルマリン固定後、パラフィン包埋した。１０μｍ厚の組織切片を作製し、ＨＥ（ヘマトキシリン、エオジン）染色を行ない、組織標本を作製した。組織標本は顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７１０、株式会社キーエンス製）を用いて観察、および写真撮影を行った。画像上の表皮厚を測定し、表皮の厚さ（μｍ）とした。マウス１匹あたり３標本作製し、１標本あたり５点の厚さを測定し、平均値を算出した。マウス毎の値を用いて誤差を算出し、その後、各群で有意差検定を行なった。
塗布開始３日目にマウス背部の皮膚を採取し、ホルマリン固定後、パラフィン包埋した。１０μｍ厚の組織切片を作製し、ＨＥ（ヘマトキシリン、エオジン）染色を行ない、組織標本を作製した。組織標本は顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７１０、株式会社キーエンス製）を用いて観察、および写真撮影を行った。画像上の表皮厚を測定し、表皮の厚さ（μｍ）とした。マウス１匹あたり３標本作製し、１標本あたり５点の厚さを測定し、平均値を算出した。マウス毎の値を用いて誤差を算出し、その後、各群で有意差検定を行なった。
【0116】
（皮膚の好中球数）
塗布開始３日目にマウス背部の皮膚を２ｃｍ2採取し、１ｍｇ／ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて皮膚細胞を分離した。ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて生細胞のカウントを行なった。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１－ラット抗マウスＣＤ４５．２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、ＡＰＣ／Ｃｙ７－ラット抗マウス／ヒトＣＤ１１ｂ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００－ラット抗マウスＬｙ６Ｇ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて皮膚細胞を染色し、３種類全ての抗体で染まった細胞を好中球としてカウントした。解析には、フローサイトメーター（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａTM、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）を用いた。好中球の数を採取した皮膚面積で除して皮膚の好中球数とした。
塗布開始３日目にマウス背部の皮膚を２ｃｍ2採取し、１ｍｇ／ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて皮膚細胞を分離した。ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて生細胞のカウントを行なった。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１－ラット抗マウスＣＤ４５．２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、ＡＰＣ／Ｃｙ７－ラット抗マウス／ヒトＣＤ１１ｂ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００－ラット抗マウスＬｙ６Ｇ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて皮膚細胞を染色し、３種類全ての抗体で染まった細胞を好中球としてカウントした。解析には、フローサイトメーター（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａTM、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）を用いた。好中球の数を採取した皮膚面積で除して皮膚の好中球数とした。
【0117】
（皮膚由来ミエロイド系細胞からのＩＬ－２３の産生量）
塗布開始３日目にマウス背部の皮膚を２ｃｍ2採取し、１ｍｇ／ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて皮膚細胞を分離した。ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて生細胞のカウントを行なった。皮膚細胞をＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１－ラット抗マウスＣＤ４５．２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、およびＡＰＣ／Ｃｙ７－ラット抗マウス／ヒトＣＤ１１ｂ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いて染色し、両方の抗体で染まった細胞をミエロイド系の細胞として、セルソーター（ＦＡＣＳＡｒｉａTM、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）でソートした。
塗布開始３日目にマウス背部の皮膚を２ｃｍ2採取し、１ｍｇ／ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて皮膚細胞を分離した。ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて生細胞のカウントを行なった。皮膚細胞をＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１－ラット抗マウスＣＤ４５．２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、およびＡＰＣ／Ｃｙ７－ラット抗マウス／ヒトＣＤ１１ｂ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いて染色し、両方の抗体で染まった細胞をミエロイド系の細胞として、セルソーター（ＦＡＣＳＡｒｉａTM、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）でソートした。
【0118】
これらの細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて、製品プロトコルに従いｍＲＮＡを抽出した。Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてプロトコルに従いｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。定量的ＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて行い、ＡＢＩ ７５００ ｆａｓｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて解析を行って、ＩＬ－２３の発現量を測定した。用いたＩＬ－２３のプライマーは、Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＣＡＧＣＴＣＴＣＴＣＧＧＡＡＴＣＴＣＴＧＣ－３’（配列番号４）、Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＧＡＣＣＴＴＧＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＧＣ－３’（配列番号５）である。
【0119】
（皮膚由来γδＴ細胞上のＩＬ－２３受容体の発現量）
塗布開始３日目にマウス背部の皮膚を２ｃｍ2採取し、１ｍｇ／ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて皮膚細胞を分離した。ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて生細胞のカウントを行なった。皮膚細胞をＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１－ラット抗マウスＣＤ４５．２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、およびｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅTM ＦＩＴＣ－ハムスター抗マウスＴＣＲ ＧＡＭＭＡ ＤＥＬＴＡ抗体（ＣａｔａｌｏｇＮＯ.１１８１０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いて染色し、両方の抗体で染まった細胞をγδＴ細胞として、セルソーター（ＦＡＣＳＡｒｉａ、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）でソートした。
塗布開始３日目にマウス背部の皮膚を２ｃｍ2採取し、１ｍｇ／ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて皮膚細胞を分離した。ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて生細胞のカウントを行なった。皮膚細胞をＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１－ラット抗マウスＣＤ４５．２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、およびｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅTM ＦＩＴＣ－ハムスター抗マウスＴＣＲ ＧＡＭＭＡ ＤＥＬＴＡ抗体（ＣａｔａｌｏｇＮＯ.１１８１０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いて染色し、両方の抗体で染まった細胞をγδＴ細胞として、セルソーター（ＦＡＣＳＡｒｉａ、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）でソートした。
【0120】
ｍＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、および定量的ＰＣＲは上記と同様にして行い、ＩＬ－２３ＲおよびＩＬ－１２Ｒβ１の産生量を測定した。用いたＩＬ－２３Ｒのプライマーは、Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＧＣＡＡＣＡＴＧＡＣＡＴＧＣＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号６）、Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＧＡＣＡＧＣＴＴＧＧＡＣＣＣＡＴＡＣＣＡ－３’（配列番号７）である。ＩＬ－１２Ｒβ１のプライマーは、Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＧＴＴＧＡＧＡＡ－３’（配列番号８）、Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＡＧＣＡＣＴＣＡＴＡＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡ－３’（配列番号９）を用いた。
【0121】
（マウス皮膚由来γδＴ細胞のＩＬ－１７、ＩＬ－２２産生量）
γδＴ細胞の調整、ｍＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、および定量的ＰＣＲは上記と同様にして行い、ＩＬ－１７およびＩＬ－２２の産生量を測定した。用いたＩＬ－１７のプライマーは、上記と同様である。ＩＬ－２２のプライマーは、Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＴＴＴＣＣＴＧＡＣＣＡＡＡＣＴＣＡＧＣＡ－３’（配列番号１０）、Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＣＴＧＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＴＣＧＴＣＡＣ－３’（配列番号１１）を用いた。
γδＴ細胞の調整、ｍＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、および定量的ＰＣＲは上記と同様にして行い、ＩＬ－１７およびＩＬ－２２の産生量を測定した。用いたＩＬ－１７のプライマーは、上記と同様である。ＩＬ－２２のプライマーは、Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＴＴＴＣＣＴＧＡＣＣＡＡＡＣＴＣＡＧＣＡ－３’（配列番号１０）、Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＣＴＧＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＴＣＧＴＣＡＣ－３’（配列番号１１）を用いた。
【0122】
（マウス皮膚由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７陽性細胞の割合）
塗布開始３日目にマウス背部の皮膚を２ｃｍ2採取し、１ｍｇ／ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて皮膚細胞を分離した。ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて生細胞のカウントを行なった。
塗布開始３日目にマウス背部の皮膚を２ｃｍ2採取し、１ｍｇ／ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて皮膚細胞を分離した。ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて生細胞のカウントを行なった。
【0123】
採取した細胞は、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐTM（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を２０００分の１含有し、５％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ－１６４０メディウム（Ｒ－８７５８，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で３７℃、５％ＣＯ2環境下にて２時間培養した。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１－ラット抗マウスＣＤ４５．２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅTM ＦＩＴＣ－ハムスター抗マウスＴＣＲ ＧＡＭＭＡ ＤＥＬＴＡ抗体（ＣａｔａｌｏｇＮＯ.１１８１０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）で染色した後、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅTM Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ａｎｄ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で固定してから、ＰＥ－ラット抗マウスＩＬ１７Ａ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色する事でγδＴ細胞が産生するＩＬ－１７を染色した。解析は、フローサイトメーター（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａTM、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）を用いて行った。ＰＥ－ラット抗マウスＩＬ１７Ａ抗体で染色された細胞をＩＬ－１７陽性とし、γδＴ細胞数で除して、ＩＬ－１７陽性細胞の割合を算出した。
【0124】
〈ＩＬ－２３とＣＤ９６刺激による、マウス脾臓由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生〉
野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、６～8週齢オス、入手先：日本クレア）の脾臓を採取し、スライドグラスを用いてすりつぶし、細胞を分離した。ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて生細胞のカウントを行なった。脾臓細胞をＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１－ラット抗マウスＣＤ４５．２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、およびｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅTM ＦＩＴＣ－ハムスター抗マウスＴＣＲ ＧＡＭＭＡ ＤＥＬＴＡ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＣａｔａｌｏｇＮＯ.１１－５８１１－８２）を用いて染色し、両方の抗体で染まった細胞をγδＴ細胞として、セルソーター（ＦＡＣＳＡｒｉａ、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）でソートした。
野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、６～8週齢オス、入手先：日本クレア）の脾臓を採取し、スライドグラスを用いてすりつぶし、細胞を分離した。ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて生細胞のカウントを行なった。脾臓細胞をＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１－ラット抗マウスＣＤ４５．２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、およびｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅTM ＦＩＴＣ－ハムスター抗マウスＴＣＲ ＧＡＭＭＡ ＤＥＬＴＡ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＣａｔａｌｏｇＮＯ.１１－５８１１－８２）を用いて染色し、両方の抗体で染まった細胞をγδＴ細胞として、セルソーター（ＦＡＣＳＡｒｉａ、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）でソートした。
【0125】
まず、抗体をプレートに固相化した。具体的には９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、ＮＯ．３５９６）に、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅTMラット抗マウスＣＤ９６抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＮＯ．１６－０９６０－８２、２０μｇ／ｍｌ）、あるいはコントロールとしてラットＩｇＧ２ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＮＯ．５５４６８７、２０μｇ／ｍｌ、ｒＧ２ａともいう）を１００μＬ／ウェルで添加してから、３７℃で２時間インキュベートした後、抗体溶液を捨て、ＰＢＳで１回プレートを洗浄した。
【0126】
このプレートにγδＴ細胞を１５０００ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種し、１０％ＦＢＳ、リコンビナントマウスＩＬ－２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＮＯ．５５０６９、終濃度２ｎｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ－１６４０メディウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｒ－８７５８）にリコンビナントマウスＩＬ－２３（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＮＯ．１８８７－ＭＬ－０１０、終濃度０．１ｎｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ2環境下にて１８時間培養した。
ｍＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、および定量的ＰＣＲは上記と同様にして行い、ＩＬ－１７の産生量を測定した。用いたＩＬ－１７のプライマーは、上記と同様である。
ｍＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、および定量的ＰＣＲは上記と同様にして行い、ＩＬ－１７の産生量を測定した。用いたＩＬ－１７のプライマーは、上記と同様である。
【0127】
〈ＩＬ－２３、ＣＤ９６、およびＣＤ３刺激による、マウス脾臓由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生〉
前述の「ＩＬ－２３とＣＤ９６刺激による、マウス脾臓由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生」と同様の方法で行い、ＣＤ３シグナルを添加する群においては、抗ＣＤ３抗体（ＴＯＮＢＯ社製、ＮＯ．４０－００３１、終濃度０．１μｇ／ｍｌ）をプレートに固相化した。固相化は抗ＣＤ９６抗体と同様にして行った。
前述の「ＩＬ－２３とＣＤ９６刺激による、マウス脾臓由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生」と同様の方法で行い、ＣＤ３シグナルを添加する群においては、抗ＣＤ３抗体（ＴＯＮＢＯ社製、ＮＯ．４０－００３１、終濃度０．１μｇ／ｍｌ）をプレートに固相化した。固相化は抗ＣＤ９６抗体と同様にして行った。
【0128】
（マウス脾臓由来γδＴ細胞の活性化）
前述の「ＩＬ－２３、ＣＤ９６、およびＣＤ３刺激による、脾臓由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生γδＴ細胞の活性化」と同様の方法で行った。γδＴ細胞の活性化は、ＣＤ６９およびＣＤ２５を活性化マーカーとして用いて評価した。γδＴ細胞は、ＡＰＣ－ハムスター抗マウスＣＤ６９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、ＰＥ－ラット抗マウスＣＤ２５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）で染色し、解析には、フローサイトメーター（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａTM、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）を用いた。
前述の「ＩＬ－２３、ＣＤ９６、およびＣＤ３刺激による、脾臓由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生γδＴ細胞の活性化」と同様の方法で行った。γδＴ細胞の活性化は、ＣＤ６９およびＣＤ２５を活性化マーカーとして用いて評価した。γδＴ細胞は、ＡＰＣ－ハムスター抗マウスＣＤ６９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、ＰＥ－ラット抗マウスＣＤ２５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）で染色し、解析には、フローサイトメーター（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａTM、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）を用いた。
【0129】
（ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞）
ヘルシンキ宣言に従い、被験者から試験前に書面によるインフォームドコンセントを得た。また、本試験は筑波大学医の倫理委員会の承認を得て行った。被験者は、ボランティアの健常人とした。被験者から６０ｍｌ採血し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＮＯ.０７８０１）を用いて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて生細胞のカウントを行なった。ＰＢＭＣ中のＶδ２ γδＴ細胞を、ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈＴＣＲγδ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ．１２－９９５９－４２）及び、ＢＶ６０５－ａｎｔｉ－ｈＶδ２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ.７４３７５１）で染色し、セルソーター（ＦＡＣＳＡｒｉａ、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）を用いてソートし、ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞として実験に供した。
ヘルシンキ宣言に従い、被験者から試験前に書面によるインフォームドコンセントを得た。また、本試験は筑波大学医の倫理委員会の承認を得て行った。被験者は、ボランティアの健常人とした。被験者から６０ｍｌ採血し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＮＯ.０７８０１）を用いて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて生細胞のカウントを行なった。ＰＢＭＣ中のＶδ２ γδＴ細胞を、ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈＴＣＲγδ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ．１２－９９５９－４２）及び、ＢＶ６０５－ａｎｔｉ－ｈＶδ２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ.７４３７５１）で染色し、セルソーター（ＦＡＣＳＡｒｉａ、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）を用いてソートし、ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞として実験に供した。
【0130】
（ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞）
ボランティアの健常人から１０ｍｌ採血し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＮＯ.０７８０１）を用いて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて生細胞のカウントを行なった。Ｈｕｍａｎ ＣＤ４ ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ社製、ＮＯ.１３０－０４５－１０１）を用いて単離した細胞をヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞として実験に供した。
ボランティアの健常人から１０ｍｌ採血し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＮＯ.０７８０１）を用いて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて生細胞のカウントを行なった。Ｈｕｍａｎ ＣＤ４ ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ社製、ＮＯ.１３０－０４５－１０１）を用いて単離した細胞をヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞として実験に供した。
【0131】
〈ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ９６の発現〉
ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞に、ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈＣＤ９６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、ＮＯ．３３８４０６）または、ＰＥ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ．５５５７４９）を添加してインキュベーションした後、フローサイトメーターで解析した。ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞でも同様にして実験した。
ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞に、ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈＣＤ９６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、ＮＯ．３３８４０６）または、ＰＥ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ．５５５７４９）を添加してインキュベーションした後、フローサイトメーターで解析した。ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞でも同様にして実験した。
【0132】
〈ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生〉
抗ＣＤ３抗体とＣＤ９６抗体を固相化したプレートにヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞を播種して、４８時間刺激した後、γδＴ細胞によるＩＬ－１７産生を評価した。抗体の固相化は、前述の「ＩＬ－２３とＣＤ９６刺激による、脾臓由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生」に準じて行った。固相化に用いた抗体は、１００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｔｉ－ｈＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ．５５５３３６）および２０μｇ／ｍｌ Ａｎｔｉ－ｈＣＤ９６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、ＮＯ．３３８４０４）である。
γδＴ細胞は２５００００ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種し、１０％ＦＢＳ、ＲＰＭＩ－１６４０メディウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｒ－８７５８）に、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＴＧＦ－ｂｅｔａ １（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＮＯ．２４０－Ｂ、終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１β（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＮＯ．２０１－ＬＢ、終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２３ （Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＮＯ．１２９０－ＩＬ、終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－６（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＮＯ．７２７０－ＩＬ、終濃度５０ ｎｇ／ｍｌ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１２（ＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎTM、ＮＯ．５５４６１３、終濃度１０ ｎｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ2環境下にて４８時間培養した。
細胞培養上清中のＩＬ－１７Ａタンパク質を、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１７Ａ Ｆｌｅｘ ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ．５６０３８３）を用いて測定した。
抗ＣＤ３抗体とＣＤ９６抗体を固相化したプレートにヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞を播種して、４８時間刺激した後、γδＴ細胞によるＩＬ－１７産生を評価した。抗体の固相化は、前述の「ＩＬ－２３とＣＤ９６刺激による、脾臓由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生」に準じて行った。固相化に用いた抗体は、１００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｔｉ－ｈＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ．５５５３３６）および２０μｇ／ｍｌ Ａｎｔｉ－ｈＣＤ９６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、ＮＯ．３３８４０４）である。
γδＴ細胞は２５００００ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種し、１０％ＦＢＳ、ＲＰＭＩ－１６４０メディウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｒ－８７５８）に、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＴＧＦ－ｂｅｔａ １（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＮＯ．２４０－Ｂ、終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１β（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＮＯ．２０１－ＬＢ、終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２３ （Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＮＯ．１２９０－ＩＬ、終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－６（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＮＯ．７２７０－ＩＬ、終濃度５０ ｎｇ／ｍｌ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１２（ＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎTM、ＮＯ．５５４６１３、終濃度１０ ｎｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ2環境下にて４８時間培養した。
細胞培養上清中のＩＬ－１７Ａタンパク質を、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１７Ａ Ｆｌｅｘ ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ．５６０３８３）を用いて測定した。
【0133】
〈ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞およびヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化〉
抗ＣＤ３抗体とＣＤ９６抗体を固相化したプレートに、γδＴ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を含むＴ細胞濃縮画分を播種して、１８時間刺激した後、ＣＤ６９およびＣＤ２５を活性化マーカーとして用いてγδＴ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を評価した。抗体の固相化は、前述の「ＩＬ－２３とＣＤ９６刺激による、脾臓由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生」に準じて行った。固相化に用いた抗体は、１００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｔｉ－ｈＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ．５５５３３６）および２０μｇ／ｍｌ Ａｎｔｉ－ｈＣＤ９６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、ＮＯ．３３８４０４）である。
具体的には、ＰＢＭＣにｂｉｏｔｉｎ－ａｎｔｉ－ｈＣＤ１４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、ＮＯ.３０１８２６）およびｂｉｏｔｉｎ－ａｎｔｉ－ｈＣＤ１９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ.５５５４１１）を結合させ、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ社製、ＮＯ.１３０－０４８－１０２）を用いて、ＣＤ１４とＣＤ１９のいずれも発現していない細胞を選択するネガティブセレクションを行い、Ｔ細胞を濃縮した。このＴ細胞濃縮画分を、５０００００ｃｅｌｌｓ／ウェルで抗ＣＤ３抗体とＣＤ９６抗体を固相化したプレートに播種し、１０％ＦＢＳ、ＲＰＭＩ－１６４０メディウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ＮＯ.Ｒ－８７５８）で３７℃、５％ＣＯ2環境下にて１８時間培養した。
培養後の細胞は、フローサイトメーターで解析した。ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈＴＣＲγδ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ.５５５７１７）でγδＴ細胞を、Ｖ５００－ａｎｔｉ－ｈＣＤ４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ.５６０７６８）でＣＤ４＋Ｔ細胞を染色し、それぞれの細胞で活性化マーカーを検出した。活性化マーカーとしては、ＦＩＴＣ－ａｎｔｉ－ｈＣＤ６９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ．５５５５３０）およびＰＥ－Ｃｙ７－ａｎｔｉ－ｈＣＤ２５（ＴＯＮＢＯ社製、６０－０２５９－Ｔ０２５）を用いた。
抗ＣＤ３抗体とＣＤ９６抗体を固相化したプレートに、γδＴ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を含むＴ細胞濃縮画分を播種して、１８時間刺激した後、ＣＤ６９およびＣＤ２５を活性化マーカーとして用いてγδＴ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を評価した。抗体の固相化は、前述の「ＩＬ－２３とＣＤ９６刺激による、脾臓由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生」に準じて行った。固相化に用いた抗体は、１００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｔｉ－ｈＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ．５５５３３６）および２０μｇ／ｍｌ Ａｎｔｉ－ｈＣＤ９６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、ＮＯ．３３８４０４）である。
具体的には、ＰＢＭＣにｂｉｏｔｉｎ－ａｎｔｉ－ｈＣＤ１４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、ＮＯ.３０１８２６）およびｂｉｏｔｉｎ－ａｎｔｉ－ｈＣＤ１９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ.５５５４１１）を結合させ、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ社製、ＮＯ.１３０－０４８－１０２）を用いて、ＣＤ１４とＣＤ１９のいずれも発現していない細胞を選択するネガティブセレクションを行い、Ｔ細胞を濃縮した。このＴ細胞濃縮画分を、５０００００ｃｅｌｌｓ／ウェルで抗ＣＤ３抗体とＣＤ９６抗体を固相化したプレートに播種し、１０％ＦＢＳ、ＲＰＭＩ－１６４０メディウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ＮＯ.Ｒ－８７５８）で３７℃、５％ＣＯ2環境下にて１８時間培養した。
培養後の細胞は、フローサイトメーターで解析した。ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈＴＣＲγδ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ.５５５７１７）でγδＴ細胞を、Ｖ５００－ａｎｔｉ－ｈＣＤ４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ.５６０７６８）でＣＤ４＋Ｔ細胞を染色し、それぞれの細胞で活性化マーカーを検出した。活性化マーカーとしては、ＦＩＴＣ－ａｎｔｉ－ｈＣＤ６９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ．５５５５３０）およびＰＥ－Ｃｙ７－ａｎｔｉ－ｈＣＤ２５（ＴＯＮＢＯ社製、６０－０２５９－Ｔ０２５）を用いた。
【0134】
〈ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１７産生〉
ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞の代わりにヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて、前述の「ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生」に準じて行った。なお、抗ＣＤ３抗体とＣＤ９６抗体を固相化したプレートにヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞を播種した後の刺激時間は９６時間とした。
ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞の代わりにヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて、前述の「ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生」に準じて行った。なお、抗ＣＤ３抗体とＣＤ９６抗体を固相化したプレートにヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞を播種した後の刺激時間は９６時間とした。
【0135】
〈ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ－１７産生に対する抗ＣＤ９６中和抗体の作用〉
抗ＣＤ３抗体とｈＣＤ１５５－Ｆｃ（ＣＤ９６のナチュラルリガンドであるＣＤ１５５とＦｃとのキメラタンパク質）を固相化したプレートに、抗ＣＤ９６中和抗体をあらかじめ混合しておいたヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞を播種して、６時間刺激した後、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ－１７産生を評価した。
ヒトＣＤ１５５遺伝子全長をｈｕｍａｎ ＩｇＧＦｃ遺伝子のＮ末側に組み込んだｐＭＸプラスミドを２９３ｇｐ細胞にトランスフェクションし、ヒトＣＤ１５５全長をｈｕｍａｎ ＩｇＧＦｃと融合させたキメラタンパク質（ｈＣＤ１５５－Ｆｃ）を得た。ｈＣＤ１５５－Ｆｃはｐｒｏｔｅｉｎ－Ａ ａｇａｒｏｓｅを用いて精製してから以降の実験に供した。
９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、ＮＯ．３５９６）に、ＤＯＴＡＰ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｐｒｏｐａｎｅ，ｍｏｎｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｃａｙｍａｎ社製、ＮＯ．１５１１０）を終濃度１ｍｇ／ｍｌで添加し、１５分間静置した後、溶液を捨て、ＰＢＳでプレートを２回洗浄した。このプレートに、１００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｔｉ－ｈＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ．５５５３３６）および１０μｇ／ｍｌ ｈＣＤ１５５－Ｆｃを１００μＬ／ウェルで添加してから、４℃で一晩インキュベートした後、溶液を捨て、ＰＢＳで１回プレートを洗浄して、抗ＣＤ３抗体およびｈＣＤ１５５－Ｆｃの固相化を行った。ＤＯＴＡＰはカチオン脂質であり、抗体やＦｃタンパク質をしっかりとプレートに立て、効率よく刺激を入れるために用いた。ＣＤ１５５は、効率よくプレートに固相化するためにＦｃとのキメラタンパク質ＣＤ１５５－Ｆｃを用いた。固相化されたｈＣＤ１５５－Ｆｃはｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ９６を刺激することができる。
健常人由来のヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞に、抗ヒトＣＤ９６中和抗体（ｃｌｏｎｅ：ＮＫ９２．３９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、ＮＯ．３３８４０２）を１０μｇ／２×１０5ｃｅｌｌｓとなるように加えて、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ９６に抗ヒトＣＤ９６抗体を結合させた。抗ヒトＣＤ９６中和抗体の代わりにＰＢＳを添加したＣＤ４＋Ｔ細胞をコントロールとした。
抗ＣＤ３抗体とｈＣＤ１５５－Ｆｃとが固相化されたプレートに、抗ヒトＣＤ９６中和抗体と予め混合したＣＤ４＋Ｔ細胞を播種し、前述の「ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生」に準じて細胞を６時間培養した。
細胞培養上清中のＩＬ－１７Ａタンパク質を、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１７Ａ Ｆｌｅｘ ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ．５６０３８３）を用いて測定した。
抗ＣＤ３抗体とｈＣＤ１５５－Ｆｃ（ＣＤ９６のナチュラルリガンドであるＣＤ１５５とＦｃとのキメラタンパク質）を固相化したプレートに、抗ＣＤ９６中和抗体をあらかじめ混合しておいたヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞を播種して、６時間刺激した後、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ－１７産生を評価した。
ヒトＣＤ１５５遺伝子全長をｈｕｍａｎ ＩｇＧＦｃ遺伝子のＮ末側に組み込んだｐＭＸプラスミドを２９３ｇｐ細胞にトランスフェクションし、ヒトＣＤ１５５全長をｈｕｍａｎ ＩｇＧＦｃと融合させたキメラタンパク質（ｈＣＤ１５５－Ｆｃ）を得た。ｈＣＤ１５５－Ｆｃはｐｒｏｔｅｉｎ－Ａ ａｇａｒｏｓｅを用いて精製してから以降の実験に供した。
９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、ＮＯ．３５９６）に、ＤＯＴＡＰ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｐｒｏｐａｎｅ，ｍｏｎｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｃａｙｍａｎ社製、ＮＯ．１５１１０）を終濃度１ｍｇ／ｍｌで添加し、１５分間静置した後、溶液を捨て、ＰＢＳでプレートを２回洗浄した。このプレートに、１００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｔｉ－ｈＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ．５５５３３６）および１０μｇ／ｍｌ ｈＣＤ１５５－Ｆｃを１００μＬ／ウェルで添加してから、４℃で一晩インキュベートした後、溶液を捨て、ＰＢＳで１回プレートを洗浄して、抗ＣＤ３抗体およびｈＣＤ１５５－Ｆｃの固相化を行った。ＤＯＴＡＰはカチオン脂質であり、抗体やＦｃタンパク質をしっかりとプレートに立て、効率よく刺激を入れるために用いた。ＣＤ１５５は、効率よくプレートに固相化するためにＦｃとのキメラタンパク質ＣＤ１５５－Ｆｃを用いた。固相化されたｈＣＤ１５５－Ｆｃはｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ９６を刺激することができる。
健常人由来のヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞に、抗ヒトＣＤ９６中和抗体（ｃｌｏｎｅ：ＮＫ９２．３９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、ＮＯ．３３８４０２）を１０μｇ／２×１０5ｃｅｌｌｓとなるように加えて、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ９６に抗ヒトＣＤ９６抗体を結合させた。抗ヒトＣＤ９６中和抗体の代わりにＰＢＳを添加したＣＤ４＋Ｔ細胞をコントロールとした。
抗ＣＤ３抗体とｈＣＤ１５５－Ｆｃとが固相化されたプレートに、抗ヒトＣＤ９６中和抗体と予め混合したＣＤ４＋Ｔ細胞を播種し、前述の「ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生」に準じて細胞を６時間培養した。
細胞培養上清中のＩＬ－１７Ａタンパク質を、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１７Ａ Ｆｌｅｘ ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ．５６０３８３）を用いて測定した。
【0136】
〈抗ＣＤ９６中和抗体ＴＸ１１１．２の樹立〉
マウスＣＤ９６遺伝子のｃＤＮＡを組み込んだｐＭＸプラスミドをレトロウイルスのエンベロープベクター（ＶＳＶ－Ｇ）と２９３ｇｐ細胞にコトランスフェクションし、組み換えレトロウイルスを得た。このウイルスをマウスリンパ種細胞株ＢＷ５１４７．３（以下、ＢＷ細胞という）に、トランスダクションして、マウスＣＤ９６全長を強発現する、マウスＣＤ９６安定発現細胞株（以下、ＣＤ９６－ＢＷ細胞という）を得た。
マウスＣＤ９６遺伝子をｈｕｍａｎ ＩｇＧＦｃ遺伝子のＮ末側に組み込んだｐＭＸプラスミドを２９３ｇｐ細胞にトランスフェクションし、マウスＣＤ９６タンパク質全長をｈｕｍａｎ ＩｇＧＦｃと融合させたキメラタンパク質（ｍＣＤ９６－ｈｕＩｇＧＦｃ）を得た。ｍＣＤ９６－ｈｕＩｇＧＦｃはｐｒｏｔｅｉｎ－Ａ ａｇａｒｏｓｅを用いて精製してから免疫に用いた。
ＣＤ９６欠損マウスに、免疫開始時にＣＤ９６－ＢＷ細胞懸濁液（５×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬ ｉｎ ＰＢＳ、１×１０7ｃｅｌｌｓ／匹）を１回腹腔内注射した。その１ヶ月後にｍＣＤ９６－ｈｕｍａｎＩｇＧＦｃ（１０μｇ ｉｎ ＰＢＳ）を腹腔内注射した。ｍＣＤ９６－ｈｕｍａｎＩｇＧＦｃの投与は、１ヶ月間隔で合計５回行った。最終免疫から３日後に、免疫したマウスから脾細胞を採取した。脾細胞をポリエチレングリコールを用いてマウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０－Ａｇ１４と細胞融合させ、ハイブリドーマを作製した。
ｍＣＤ９６を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマをＣＤ９６－ＢＷ細胞を用いてＦＡＣＳでスクリーニングした。得られたクローンが産生する抗体をＴＸ１１１とした。
ＴＸ１１１の軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）および重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）の可変領域のＤＮＡ配列をＰＣＲ法により決定した。方法の詳細は、Ｔｈｏｍａｓ Ｔｉｌｌｅｒ ｅｔ．ａｌ．、Ｊｏｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ、３５０、２００９、１８３－１９３に記載の通りである。
ＴＸ１１１の軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）および重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）の可変領域のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）１～３は、ＩｇＢＬＡＳＴを用いて決定した。
ＴＸ１１１を産生するハイブリドーマから、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のｃＤＮＡを合成した。
２つのｃＤＮＡを、Ｆｃ部がＦｃ受容体に結合しないように変異の入ったＦｃがインサートされたｐＣＤＮＡTM３．４－ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にそれぞれクローニングした。上記２つのベクターを２９３Ｆ細胞にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅTM ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｔｈｅｒｍｏｓ ｆｉｓｈｅｒ社製、ＮＯ．Ａ１４５２５）を用いてトランスフェクションした。培養上清からＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＧ（Ｍｅｒｃｋ社製、ＮＯ．ＧＥ１７－０４０４－０１）を用いて精製した抗体をＴＸ１１１．２とした。
マウスＣＤ９６遺伝子のｃＤＮＡを組み込んだｐＭＸプラスミドをレトロウイルスのエンベロープベクター（ＶＳＶ－Ｇ）と２９３ｇｐ細胞にコトランスフェクションし、組み換えレトロウイルスを得た。このウイルスをマウスリンパ種細胞株ＢＷ５１４７．３（以下、ＢＷ細胞という）に、トランスダクションして、マウスＣＤ９６全長を強発現する、マウスＣＤ９６安定発現細胞株（以下、ＣＤ９６－ＢＷ細胞という）を得た。
マウスＣＤ９６遺伝子をｈｕｍａｎ ＩｇＧＦｃ遺伝子のＮ末側に組み込んだｐＭＸプラスミドを２９３ｇｐ細胞にトランスフェクションし、マウスＣＤ９６タンパク質全長をｈｕｍａｎ ＩｇＧＦｃと融合させたキメラタンパク質（ｍＣＤ９６－ｈｕＩｇＧＦｃ）を得た。ｍＣＤ９６－ｈｕＩｇＧＦｃはｐｒｏｔｅｉｎ－Ａ ａｇａｒｏｓｅを用いて精製してから免疫に用いた。
ＣＤ９６欠損マウスに、免疫開始時にＣＤ９６－ＢＷ細胞懸濁液（５×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬ ｉｎ ＰＢＳ、１×１０7ｃｅｌｌｓ／匹）を１回腹腔内注射した。その１ヶ月後にｍＣＤ９６－ｈｕｍａｎＩｇＧＦｃ（１０μｇ ｉｎ ＰＢＳ）を腹腔内注射した。ｍＣＤ９６－ｈｕｍａｎＩｇＧＦｃの投与は、１ヶ月間隔で合計５回行った。最終免疫から３日後に、免疫したマウスから脾細胞を採取した。脾細胞をポリエチレングリコールを用いてマウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０－Ａｇ１４と細胞融合させ、ハイブリドーマを作製した。
ｍＣＤ９６を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマをＣＤ９６－ＢＷ細胞を用いてＦＡＣＳでスクリーニングした。得られたクローンが産生する抗体をＴＸ１１１とした。
ＴＸ１１１の軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）および重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）の可変領域のＤＮＡ配列をＰＣＲ法により決定した。方法の詳細は、Ｔｈｏｍａｓ Ｔｉｌｌｅｒ ｅｔ．ａｌ．、Ｊｏｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ、３５０、２００９、１８３－１９３に記載の通りである。
ＴＸ１１１の軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）および重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）の可変領域のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）１～３は、ＩｇＢＬＡＳＴを用いて決定した。
ＴＸ１１１を産生するハイブリドーマから、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のｃＤＮＡを合成した。
２つのｃＤＮＡを、Ｆｃ部がＦｃ受容体に結合しないように変異の入ったＦｃがインサートされたｐＣＤＮＡTM３．４－ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にそれぞれクローニングした。上記２つのベクターを２９３Ｆ細胞にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅTM ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｔｈｅｒｍｏｓ ｆｉｓｈｅｒ社製、ＮＯ．Ａ１４５２５）を用いてトランスフェクションした。培養上清からＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＧ（Ｍｅｒｃｋ社製、ＮＯ．ＧＥ１７－０４０４－０１）を用いて精製した抗体をＴＸ１１１．２とした。
【0137】
〈抗マウスＣＤ９６中和抗体ＴＸ１１１．２の結合特異性〉
ＣＤ９６－ＢＷ細胞１×１０5ｃｅｌｌｓに、１０ｎｇのＴＸ１１１．２または１０ｎｇのＭｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ ｉｓｏｔｙｐｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ（ＴＯＮＢＯ社製、ＮＯ．７０－４７３２－Ｕ１００）を添加して、ｏｎ ｉｃｅで３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ＡＰＣ－ａｎｔｉ－ｍＩｇＧ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、ＮＯ．４０５３０８）を添加し、ｏｎ ｉｃｅで２０分間インキュベートして染色し、フローサイトメーターで解析した。
〈抗マウスＣＤ９６中和抗体ＴＸ１１１．２とＣＤ１５５との競合阻害〉
マウスＣＤ１５５遺伝子全長をｈｕｍａｎ ＩｇＧＦｃ遺伝子のＮ末側に組み込んだｐＭＸプラスミドを２９３ｇｐ細胞にトランスフェクションし、マウスＣＤ１５５全長をｈｕｍａｎ ＩｇＧＦｃと融合させたキメラタンパク質（ｍＣＤ１５５－ｈｕＩｇＧＦｃ）を得た。ｍＣＤ１５５－ｈｕＩｇＧＦｃはｐｒｏｔｅｉｎ－Ａ ａｇａｒｏｓｅを用いて精製してから以降の実験に供した。
ＣＤ９６－ＢＷ細胞（Ｔ．Ｆ．）１×１０5ｃｅｌｌｓに、１μｇのｍＣＤ１５５－ｈｕＩｇＧＦｃを添加し、ｏｎ ｉｃｅで３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、１０００ｎｇ、１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、または０．１ｎｇのＴＸ１１１．２を添加した。室温で３０分間インキュベートした後、ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕＩｇＧ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、ＮＯ．４１０７０８）を添加して、ｏｎ ｉｃｅで２０分間インキュベートして染色し、フローサイトメーターで解析した。なお、ＣＤ１５５－ｈｕＩｇＧＦｃは、マウスＣＤ１５５と、ヒトＩｇＧのＦｃが融合したキメラタンパク質である。
ＣＤ９６－ＢＷ細胞１×１０5ｃｅｌｌｓに、１０ｎｇのＴＸ１１１．２または１０ｎｇのＭｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ ｉｓｏｔｙｐｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ（ＴＯＮＢＯ社製、ＮＯ．７０－４７３２－Ｕ１００）を添加して、ｏｎ ｉｃｅで３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ＡＰＣ－ａｎｔｉ－ｍＩｇＧ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、ＮＯ．４０５３０８）を添加し、ｏｎ ｉｃｅで２０分間インキュベートして染色し、フローサイトメーターで解析した。
〈抗マウスＣＤ９６中和抗体ＴＸ１１１．２とＣＤ１５５との競合阻害〉
マウスＣＤ１５５遺伝子全長をｈｕｍａｎ ＩｇＧＦｃ遺伝子のＮ末側に組み込んだｐＭＸプラスミドを２９３ｇｐ細胞にトランスフェクションし、マウスＣＤ１５５全長をｈｕｍａｎ ＩｇＧＦｃと融合させたキメラタンパク質（ｍＣＤ１５５－ｈｕＩｇＧＦｃ）を得た。ｍＣＤ１５５－ｈｕＩｇＧＦｃはｐｒｏｔｅｉｎ－Ａ ａｇａｒｏｓｅを用いて精製してから以降の実験に供した。
ＣＤ９６－ＢＷ細胞（Ｔ．Ｆ．）１×１０5ｃｅｌｌｓに、１μｇのｍＣＤ１５５－ｈｕＩｇＧＦｃを添加し、ｏｎ ｉｃｅで３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、１０００ｎｇ、１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、または０．１ｎｇのＴＸ１１１．２を添加した。室温で３０分間インキュベートした後、ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕＩｇＧ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、ＮＯ．４１０７０８）を添加して、ｏｎ ｉｃｅで２０分間インキュベートして染色し、フローサイトメーターで解析した。なお、ＣＤ１５５－ｈｕＩｇＧＦｃは、マウスＣＤ１５５と、ヒトＩｇＧのＦｃが融合したキメラタンパク質である。
【0138】
〈イミキモド誘発乾癬モデルマウスへの抗マウスＣＤ９６中和抗体予防的投与実験〉
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（野生型、８週齢、オス）の背部を剃毛し、５％イミキモドクリーム（ベセルナクリーム、持田製薬株式会社製）を６２．５ｍｇ／回／匹で一日一回塗布した。ｎａｉｖｅ群には、５％イミキモドクリームの代わりにワセリンを塗布した。イミキモドクリーム塗布開始日を０日とし、０日目、１日目、２日目、３日目に塗布し、３日目と４日目に解析を行った。ＴＸ１１１．２投与群（Ｎ＝５）には、イミキモドクリーム塗布開始日の前日（－１日目）に、１００μｇの抗マウスＣＤ９６中和抗体ＴＸ１１１．２を静脈内に注射した。ＴＸ１１１．２の代わりに１００μｇのマウスＩｇＧ（ｃＩｇ）を投与した群をコントロール抗体投与群（Ｎ＝５）とした。マウスＩｇＧは、２９３Ｆ細胞に産生させ、培養上清からＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＧ（Ｍｅｒｃｋ社製、ＮＯ．ＧＥ１７－０４０４－０１）を用いて精製した。
イミキモド塗布３日目にマウス背部の皮膚の写真撮影を行った。また、イミキモド塗布４日目に紅斑、鱗屑および皮膚の厚さの評価を行い、皮膚組織標本を作製した。皮膚組織標本を観察し、表皮の厚さを測定した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（野生型、８週齢、オス）の背部を剃毛し、５％イミキモドクリーム（ベセルナクリーム、持田製薬株式会社製）を６２．５ｍｇ／回／匹で一日一回塗布した。ｎａｉｖｅ群には、５％イミキモドクリームの代わりにワセリンを塗布した。イミキモドクリーム塗布開始日を０日とし、０日目、１日目、２日目、３日目に塗布し、３日目と４日目に解析を行った。ＴＸ１１１．２投与群（Ｎ＝５）には、イミキモドクリーム塗布開始日の前日（－１日目）に、１００μｇの抗マウスＣＤ９６中和抗体ＴＸ１１１．２を静脈内に注射した。ＴＸ１１１．２の代わりに１００μｇのマウスＩｇＧ（ｃＩｇ）を投与した群をコントロール抗体投与群（Ｎ＝５）とした。マウスＩｇＧは、２９３Ｆ細胞に産生させ、培養上清からＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＧ（Ｍｅｒｃｋ社製、ＮＯ．ＧＥ１７－０４０４－０１）を用いて精製した。
イミキモド塗布３日目にマウス背部の皮膚の写真撮影を行った。また、イミキモド塗布４日目に紅斑、鱗屑および皮膚の厚さの評価を行い、皮膚組織標本を作製した。皮膚組織標本を観察し、表皮の厚さを測定した。
【0139】
〈イミキモド誘発乾癬モデルマウスへの抗マウスＣＤ９６中和抗体治療的投与実験〉
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（野生型、８週齢、オス）の背部を剃毛し、５％イミキモドクリーム（ベセルナクリーム、持田製薬株式会社製）を６２．５ｍｇ／回／匹で一日一回塗布した。ｎａｉｖｅ群には、５％イミキモドクリームの代わりにワセリンを塗布した。イミキモドクリーム塗布開始日を０日とし、０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目に塗布し、１日目と６日目に解析を行った。ＴＸ１１１．２投与群（Ｎ＝６）には、イミキモドクリーム塗布開始１日目に、１００μｇの抗マウスＣＤ９６中和抗体ＴＸ１１１．２を腹腔内に注射した。ＴＸ１１１．２の代わりに１００μｇのマウスＩｇＧ（ｃＩｇ）を投与した群をコントロール抗体投与群（Ｎ＝６）とした。
イミキモド塗布６日目にマウス背部の皮膚の写真撮影を行った。また、イミキモド塗布１日目および６日目に紅斑、鱗屑および皮膚の厚さの評価を行った。イミキモド塗布６日目に皮膚組織標本を作製した。皮膚組織標本を観察し、表皮の厚さを測定した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（野生型、８週齢、オス）の背部を剃毛し、５％イミキモドクリーム（ベセルナクリーム、持田製薬株式会社製）を６２．５ｍｇ／回／匹で一日一回塗布した。ｎａｉｖｅ群には、５％イミキモドクリームの代わりにワセリンを塗布した。イミキモドクリーム塗布開始日を０日とし、０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目に塗布し、１日目と６日目に解析を行った。ＴＸ１１１．２投与群（Ｎ＝６）には、イミキモドクリーム塗布開始１日目に、１００μｇの抗マウスＣＤ９６中和抗体ＴＸ１１１．２を腹腔内に注射した。ＴＸ１１１．２の代わりに１００μｇのマウスＩｇＧ（ｃＩｇ）を投与した群をコントロール抗体投与群（Ｎ＝６）とした。
イミキモド塗布６日目にマウス背部の皮膚の写真撮影を行った。また、イミキモド塗布１日目および６日目に紅斑、鱗屑および皮膚の厚さの評価を行った。イミキモド塗布６日目に皮膚組織標本を作製した。皮膚組織標本を観察し、表皮の厚さを測定した。
【0140】
〈ＥＡＥモデル〉
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、中枢神経系の炎症性脱髄疾患である。ＥＡＥは、実験動物に他の動物の中枢神経組織由来のタンパク質またはペプチド等の脳炎惹起性タンパク質（ペプチド）を接種することで、ミエリン蛋白に特異的なＴ細胞を誘導し、自己免疫性の脳脊髄炎を発症させるという自己免疫モデルである。脱髄はフロイントの完全アジュバント等のアジュバントで乳化した脳炎惹起性タンパク質（ペプチド）を接種することで起きる。アジュバントの存在により、これらの脳炎惹起性タンパク質（ペプチド）に対する炎症反応が起きる。多くの実験方法では血液脳関門を破綻させ、免疫細胞を中枢神経系に侵入させるため、脳炎惹起性タンパク質（ペプチド）と同時に百日咳毒素（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｔｏｘｉｎ；ＰＴＸ）の接種を行う。この接種により多発性、散在性の小脱髄領域が脳や脊髄に発生し、一連の症状を呈するようになる。
ＥＡＥは、多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＭＳ）、急性散在性脳脊髄炎などと多くの病態を共有することから、これらの病態研究や治療法研究において汎用されている。また、一般的にＥＡＥはＴ細胞性自己免疫疾患のモデルでもある。
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、中枢神経系の炎症性脱髄疾患である。ＥＡＥは、実験動物に他の動物の中枢神経組織由来のタンパク質またはペプチド等の脳炎惹起性タンパク質（ペプチド）を接種することで、ミエリン蛋白に特異的なＴ細胞を誘導し、自己免疫性の脳脊髄炎を発症させるという自己免疫モデルである。脱髄はフロイントの完全アジュバント等のアジュバントで乳化した脳炎惹起性タンパク質（ペプチド）を接種することで起きる。アジュバントの存在により、これらの脳炎惹起性タンパク質（ペプチド）に対する炎症反応が起きる。多くの実験方法では血液脳関門を破綻させ、免疫細胞を中枢神経系に侵入させるため、脳炎惹起性タンパク質（ペプチド）と同時に百日咳毒素（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｔｏｘｉｎ；ＰＴＸ）の接種を行う。この接種により多発性、散在性の小脱髄領域が脳や脊髄に発生し、一連の症状を呈するようになる。
ＥＡＥは、多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＭＳ）、急性散在性脳脊髄炎などと多くの病態を共有することから、これらの病態研究や治療法研究において汎用されている。また、一般的にＥＡＥはＴ細胞性自己免疫疾患のモデルでもある。
【0141】
〈ＥＡＥモデルマウスへの抗マウスＣＤ９６中和抗体投与実験〉
ＥＡＥモデルは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（野生型、１１週齢、メス）に対して、Ｈｏｏｋｉｅ ｋｉｔ ＭＯＧ35-55／ＣＦＡ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ ＰＴＸ（Ｈｏｏｋｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＥＫ－２１１０）を用い、製品付属のプロトコルに従って、ＥＡＥを誘導して作製した。脳炎惹起性ペプチドとしては、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（Ｍｙｅｌｉｎ Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ；ＭＯＧ）を用いた。ＭＯＧ／ＣＦＡ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ'ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）を０．１ｍＬずつ２か所（合計０．２ｍｌ／匹）に皮下投与した。その後、ＰＴＸを０．１ｍＬ／匹で腹腔内投与した（０日目）。その翌日（１日目）、ＰＴＸを０．１ｍＬ／匹で再度腹腔内投与した。ＴＸ１１１．２投与群（Ｎ＝５）には、ＭＯＧ／ＣＦＡ、ＰＴＸ投与開始の前日（－１日目）に１００μｇの抗マウスＣＤ９６中和抗体ＴＸ１１１．２を腹腔内に注射した。ＭＯＧ／ＣＦＡ、ＰＴＸ投与開始後は、１週間に２回の頻度で合計１０回、１００μｇのＴＸ１１１．２を腹腔内投与した。ＴＸ１１１．２の代わりに１００μｇのマウスＩｇＧ（ｃＩｇ）を投与した群をコントロール抗体投与群（Ｎ＝５）とした。
ＥＡＥモデルは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（野生型、１１週齢、メス）に対して、Ｈｏｏｋｉｅ ｋｉｔ ＭＯＧ35-55／ＣＦＡ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ ＰＴＸ（Ｈｏｏｋｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＥＫ－２１１０）を用い、製品付属のプロトコルに従って、ＥＡＥを誘導して作製した。脳炎惹起性ペプチドとしては、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（Ｍｙｅｌｉｎ Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ；ＭＯＧ）を用いた。ＭＯＧ／ＣＦＡ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ'ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）を０．１ｍＬずつ２か所（合計０．２ｍｌ／匹）に皮下投与した。その後、ＰＴＸを０．１ｍＬ／匹で腹腔内投与した（０日目）。その翌日（１日目）、ＰＴＸを０．１ｍＬ／匹で再度腹腔内投与した。ＴＸ１１１．２投与群（Ｎ＝５）には、ＭＯＧ／ＣＦＡ、ＰＴＸ投与開始の前日（－１日目）に１００μｇの抗マウスＣＤ９６中和抗体ＴＸ１１１．２を腹腔内に注射した。ＭＯＧ／ＣＦＡ、ＰＴＸ投与開始後は、１週間に２回の頻度で合計１０回、１００μｇのＴＸ１１１．２を腹腔内投与した。ＴＸ１１１．２の代わりに１００μｇのマウスＩｇＧ（ｃＩｇ）を投与した群をコントロール抗体投与群（Ｎ＝５）とした。
【0142】
ＥＡＥ病態スコアは、ＥＡＥ誘導した後毎日、製品付属のプロトコルに従い、以下のような０．５単位の０～５のスケールで評価した。０は異常なしであり、数字が大きいほど症状が重篤である。
【0143】
０：免疫されていないマウスと比較して、運動機能に明らかな変化はなし。尾の付け根で持ち上げると、尾に張りがあり、直立する。後肢は通常離れて広がっている。マウスが歩いているときに、歩行や頭の傾きはない。
【0144】
０．５：尾の先端が下垂している。尾の付け根を持ち上げると、尾の先端以外には張りが感じられる。尾が動き続けている間、筋肉の緊張が感じられる。
【0145】
１．０：尾が下垂している。尾の付け根を持ち上げると、直立せず、指の上に尾全体が垂れ下がる。後肢は通常離れて広がっている。尾の動きの兆候が観察されない。
【0146】
１．５：尾と後肢の動きが阻害されている。尾の付け根を持ち上げると、指の上に尾全体が垂れ下がる。マウスをワイヤーラックに落とすと、少なくとも1本の後肢がワイヤーを常に通り抜ける。歩行はごくわずかにぐらつく。
【0147】
２．０：ＡまたはＢ。
Ａ：尾の下垂と、後肢の脱力感。尾の付け根で持ち上げると、足は広げられず、互いに近づく。マウスが歩いているのを観察すると、明らかにぐらついた歩行が見られる。片方の足ではつま先が引きずられる場合があるが、もう一方の足には明らかな動きの阻害はない。
Ｂ：マウスのスコアは０．０のように見えるが、歩行を観察すると、頭が傾いている明らかな兆候が見られる。バランスが悪い。
Ａ：尾の下垂と、後肢の脱力感。尾の付け根で持ち上げると、足は広げられず、互いに近づく。マウスが歩いているのを観察すると、明らかにぐらついた歩行が見られる。片方の足ではつま先が引きずられる場合があるが、もう一方の足には明らかな動きの阻害はない。
Ｂ：マウスのスコアは０．０のように見えるが、歩行を観察すると、頭が傾いている明らかな兆候が見られる。バランスが悪い。
【0148】
２．５：Ａ、ＢまたはＣ。
Ａ：尾の下垂と後肢の引きずり。両方の後肢にはある程度の動きがあるが、両方とも足を引きずっている（後肢でつまずく）。
Ｂ：片方の足に動きがない、または片方の足を完全に引きずるが、もう一方の足には動きがある。
Ｃ：マウスをつかんだときには、ＥＡＥの重症度は軽度に見えるが（スコア０．０－１．５）、強い頭の傾きがあり、マウスがときどき転倒する。
Ａ：尾の下垂と後肢の引きずり。両方の後肢にはある程度の動きがあるが、両方とも足を引きずっている（後肢でつまずく）。
Ｂ：片方の足に動きがない、または片方の足を完全に引きずるが、もう一方の足には動きがある。
Ｃ：マウスをつかんだときには、ＥＡＥの重症度は軽度に見えるが（スコア０．０－１．５）、強い頭の傾きがあり、マウスがときどき転倒する。
【0149】
３．０：Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ。
Ａ：尾の下垂と後肢の完全な麻痺（最も一般的）。
Ｂ：尾が下垂し、後肢がほぼ完全に麻痺している。片方または両方の後肢はバタバタ動かすことができるが、どちらの後肢も股関節より前方に移動することはできない。
Ｃ：尾が下垂し、前1本と後脚1本が麻痺している。
Ｄ：以下のａ～ｄ全てを満たす。
ａ：激しい頭の傾き、ｂ：ケージの端に沿ってのみ歩く、ｃ：ケージの壁を押す、ｄ：尾の付け根で持ち上げると回転する。
Ａ：尾の下垂と後肢の完全な麻痺（最も一般的）。
Ｂ：尾が下垂し、後肢がほぼ完全に麻痺している。片方または両方の後肢はバタバタ動かすことができるが、どちらの後肢も股関節より前方に移動することはできない。
Ｃ：尾が下垂し、前1本と後脚1本が麻痺している。
Ｄ：以下のａ～ｄ全てを満たす。
ａ：激しい頭の傾き、ｂ：ケージの端に沿ってのみ歩く、ｃ：ケージの壁を押す、ｄ：尾の付け根で持ち上げると回転する。
【0150】
３．５：ＡまたはＢ。
Ａ：尾が下垂し、後肢が完全に麻痺している。さらにマウスはケージの中を動き回るが、体の横向きに置くと、元に戻ることができない。後肢は体の片側にある。
Ｂ：マウスはケージの中を動き回るが、体の後四分の一はパンケーキのように平らで、マウスの体の前四分の一はこぶのように見える。
Ａ：尾が下垂し、後肢が完全に麻痺している。さらにマウスはケージの中を動き回るが、体の横向きに置くと、元に戻ることができない。後肢は体の片側にある。
Ｂ：マウスはケージの中を動き回るが、体の後四分の一はパンケーキのように平らで、マウスの体の前四分の一はこぶのように見える。
【0151】
４．０：尾が下垂し、後肢の完全麻痺および前肢の部分的な麻痺。マウスは、ケージの中を最小限に動き回るが、覚醒しているように見え、餌も摂取する、多くの場合、２日間４．０のスコアとなった場合、安楽死が推奨される。ただし、液体を毎日皮下注射すると、ほとんどのＣ５７ＢＬ／６マウスは３．５または３．０に回復する可能性がある。重度の麻痺のためにマウスが安楽死させた場合、残りの実験ではそのマウスのスコアは５．０とする。
【0152】
４．５：後肢の完全麻痺および前肢の部分的な麻痺。ケージの中で動かない。マウスは覚醒していない。マウスの前肢の動きは最小限である。マウスはほとんど接触に反応しない。安楽死を推奨する。重度の麻痺のためにマウスが安楽死させられた場合、残りの実験ではそのマウスのスコアは５．０とする。
【0153】
５．０：Ａ、ＢまたはＣ。
Ａ：マウスはケージ内で自発的に転がってしまう。（安楽死を推奨する）。
Ｂ：マウスは麻痺のために死んでいる状態で発見される。
Ｃ：重度の麻痺のため、安楽死させる。
Ａ：マウスはケージ内で自発的に転がってしまう。（安楽死を推奨する）。
Ｂ：マウスは麻痺のために死んでいる状態で発見される。
Ｃ：重度の麻痺のため、安楽死させる。
【0154】
≪結果≫
〈イミキモド誘発乾癬モデル〉
イミキモド誘発乾癬モデルにおける、野生型マウスおよびＣＤ９６欠損マウスの塗布開始３日目の背部の写真を図１に示す。それぞれの写真において、左のマウスがｎａｉｖｅ（ｎａiｖｅ）群、右のマウスがイミキモド（ＩＭＱ）群である。野生型マウスでは、イミキモド群は、ｎａｉｖｅ群に比べ、皮膚が発赤し、鱗屑が確認された。ＣＤ９６欠損マウスでは、イミキモド群は、ｎａｉｖｅ群に比べ、皮膚が発赤し、鱗屑が確認されたものの、その程度は野生型マウスに比べて減弱していた。
〈イミキモド誘発乾癬モデル〉
イミキモド誘発乾癬モデルにおける、野生型マウスおよびＣＤ９６欠損マウスの塗布開始３日目の背部の写真を図１に示す。それぞれの写真において、左のマウスがｎａｉｖｅ（ｎａiｖｅ）群、右のマウスがイミキモド（ＩＭＱ）群である。野生型マウスでは、イミキモド群は、ｎａｉｖｅ群に比べ、皮膚が発赤し、鱗屑が確認された。ＣＤ９６欠損マウスでは、イミキモド群は、ｎａｉｖｅ群に比べ、皮膚が発赤し、鱗屑が確認されたものの、その程度は野生型マウスに比べて減弱していた。
【0155】
塗布開始３日目の紅斑、鱗屑、および皮膚の厚さを野生型マウスとＣＤ９６欠損マウスで比較したグラフを図２に示す。紅斑と鱗屑のグラフの縦軸は、それぞれ紅斑スコア、鱗屑スコアであり、皮膚の厚さのグラフの縦軸は、皮膚の厚さ（μｍ）である。ｎａｉｖｅ群では、野生型マウス、ＣＤ９６欠損マウス共に紅斑も鱗屑も見られなかった。
【0156】
イミキモド群では、野生型マウス、ＣＤ９６欠損マウス共に、ｎａｉｖｅ群よりも紅斑のスコアが高いが、ＣＤ９６欠損マウスでは、野生型マウスに比べ、紅斑スコアが有意に低かった。
【0157】
イミキモド群では、野生型マウス、ＣＤ９６欠損マウス共に、ｎａｉｖｅ群よりも鱗屑のスコアが高いが、ＣＤ９６欠損マウスでは、野生型マウスに比べ、鱗屑スコアが有意に低かった。
【0158】
イミキモド群では、野生型マウス、ＣＤ９６欠損マウス共に、ｎａｉｖｅ群よりも皮膚が厚いが、ＣＤ９６欠損マウスでは、野生型マウスに比べ、有意に皮膚が薄かった。
これらの結果から、ＣＤ９６欠損により、イミキモドにより誘発される紅斑、鱗屑、皮膚肥厚の病態が減弱したことが示された。
これらの結果から、ＣＤ９６欠損により、イミキモドにより誘発される紅斑、鱗屑、皮膚肥厚の病態が減弱したことが示された。
【0159】
イミキモド塗布開始３日目のマウス背部皮膚の組織標本をＨＥ染色した写真を図３に示す。野生型マウスでは表皮の肥厚、不全角化、真皮への好中球と単核球の浸潤等、乾癬に特徴的な病態が観察されるが、ＣＤ９６欠損マウスではこれらの病態は減弱していた。表皮の厚さをグラフ化したものが図４であり、野生型マウスではイミキモド群はｎａｉｖｅ群に比べ表皮の厚さが約４倍になるが、ＣＤ９６欠損マウスでは約２倍であり、イミキモドによる表皮肥厚が減弱していた。
【0160】
皮膚中の好中球数を図５に示す。野生型マウスではイミキモド群はｎａｉｖｅ群に比べ好中球数が劇的に増えるが、ＣＤ９６欠損マウスではイミキモドによる皮膚中の好中球数増加効果が減弱していた。
【0161】
次に、ミエロイド系細胞でのＩＬ－２３産生量を調べた（図６）。野生型マウス、ＣＤ９６欠損マウスどちらも、イミキモド群はｎａｉｖｅ群に比べＩＬ－２３産生量が劇的に増えるが、野生型マウスとＣＤ９６欠損マウスの間に有意な差は見られなかった。すなわち、ＣＤ９６は、イミキモドによるＩＬ－２３産生促進には関与していないと考えられる。
【0162】
さらにＩＬ－２３の受容体であるＩＬ－２３ＲとＩＬ－１２β１のγδＴ細胞における発現量を調べた（図７）。ＩＬ－２３Ｒ発現量およびＩＬ－１２β１発現量について、野生型マウスとＣＤ９６欠損マウスの間に有意な差は見られなかった。すなわち、ＣＤ９６は、γδＴ細胞におけるＩＬ－２３受容体の発現量調整には関与していないと考えられる。
【0163】
次に、γδＴ細胞におけるＩＬ－１７およびＩＬ－２２の産生量を調べた。野生型マウスではイミキモド群はｎａｉｖｅ群に比べＩＬ－１７産生量が劇的に増えるが、ＣＤ９６欠損マウスではイミキモド群とｎａｉｖｅ群の間にＩＬ－１７産生量の差はなかった（図８左）。すなわち、ＣＤ９６はイミキモドによるγδＴ細胞におけるＩＬ－１７促進に関与すると考えられる。ＩＬ－２２の産生量は、野生型マウス、ＣＤ９６欠損マウス共に、イミキモド群ではｎａｉｖｅ群に比べ増えるが、ＣＤ９６欠損マウスでは野生型マウスに比較して増加が減弱していた（図８右）。すなわち、ＣＤ９６はイミキモドによるγδＴ細胞におけるＩＬ－２２産生促進に関与すると考えられる。
【0164】
γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生細胞の割合、およびＩＬ－１７産生細胞の数を図９に示す。野生型マウスでは、イミキモド群はｎａｉｖｅ群に比べＩＬ－１７産生細胞の割合が増加するが、ＣＤ９６欠損マウスではイミキモドによるＩＬ－１７産生細胞の割合の増加が減弱された。また、ＩＬ－１７産生細胞数も、野生型マウスでは、イミキモド群はｎａｉｖｅ群に比べ増加するが、ＣＤ９６欠損マウスではイミキモドによるＩＬ－１７産生細胞数の増加が減弱された。すなわち、ＣＤ９６は、イミキモドによるγδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生細胞の増加に関与すると考えられる。
【0165】
以上の結果から、イミキモド誘発乾癬モデルにおいて、ＣＤ９６は、乾癬の病態に大きく関与することが示された。また、そのメカニズムとしては、ＣＤ９６は、樹状細胞等のミエロイド系の細胞におけるＩＬ－２３の産生のステップおよびγδＴ細胞におけるＩＬ－２３受容体の産生のステップには関与せず、ＩＬ－２３により活性化されたγδＴ細胞がＩＬ－１７を産生するステップにおいて重要な役割を果たし、ＣＤ９６はＩＬ－１７産生を増加させることが考えられた。したがって、ＣＤ９６のシグナルを阻害すれば、ＩＬ－１７産生を抑制することができ、乾癬を治療または予防することができると推測される。さらに、ＣＤ９６からのシグナルを阻害すれば、乾癬以外の、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態をも治療または予防することができると推測される。
〈マウス脾臓由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生〉
〈マウス脾臓由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生〉
【0166】
次に、ＣＤ９６は、どのようなメカニズムでγδＴ細胞のＩＬ－１７産生を増加させるかを野生型マウス脾臓由来γδＴ細胞を用いて解析した。ＩＬ－２３の添加の有無によるＩＬ－１７産生量を比較したグラフを図１０に示す。ＩＬ－２３により、γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生量が増加することがわかる。プレートに固相化された抗ＣＤ９６抗体（ａ－ＣＤ９６）によりＣＤ９６を刺激したが、コントロール抗体であるラットＩｇＧ２ａ（ｒＧ２ａ）の場合と比べてＩＬ－１７産生量に有意差は見られなかった。すなわち、ＣＤ９６は、ＩＬ－１７産生を増加させるＩＬ－２３シグナルは増強しないことが示された。なお、ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＣＤ９６がターゲット細胞上のＣＤ１５５を認識する事で活性化するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、固相化された抗ＣＤ９６抗体でＣＤ９６を刺激する事ができる。
【0167】
〈γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生メカニズム〉
イミキモド誘発乾癬モデルにおいては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル抑制剤であるＡＸ－０２４を投与すると乾癬病態が減弱することから、乾癬病態の誘導にはＴＣＲシグナルが必要であると報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１６年）。すなわち、乾癬病態の誘導にはサイトカインだけでなく、ＴＣＲを介したＴ細胞活性化が必須であると考えられている。
イミキモド誘発乾癬モデルにおいては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル抑制剤であるＡＸ－０２４を投与すると乾癬病態が減弱することから、乾癬病態の誘導にはＴＣＲシグナルが必要であると報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１６年）。すなわち、乾癬病態の誘導にはサイトカインだけでなく、ＴＣＲを介したＴ細胞活性化が必須であると考えられている。
【0168】
そこで、Ｔ細胞受容体と複合体を形成しているＣＤ３を、固相化された抗ＣＤ３抗体で刺激してγδＴ細胞を活性化させ、それに対するＣＤ９６の影響を調べた。なお、ｉｎ ｖｉｖｏでは、Ｔ細胞受容体が自然免疫系の細胞（特に樹状細胞）から提示される抗原を認識する事でＴ細胞は活性化するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、Ｔ細胞受容体と複合体を形成するＣＤ３を、固相化された抗ＣＤ３抗体で刺激する事でＴ細胞を活性化する事ができる。
【0169】
図１１に示すように、ＣＤ３シグナルだけではＩＬ－１７産生量は変化せず、固相化された抗ＣＤ３抗体（ａ－ＣＤ３）に加え、ＩＬ－２３を添加すると、ＩＬ－１７産生は大きく上昇した。また、固相化された抗ＣＤ９６抗体（ａ－ＣＤ９６）によりＣＤ９６を刺激すると、ＩＬ－１７産生はさらに大きく上昇した。このとき、γδＴ細胞が活性化しているかどうかを調べた結果を図１２に示す。固相化された抗ＣＤ９６抗体（ａ－ＣＤ９６）を用いたＣＤ９６刺激により、Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９およびＣＤ２５の発現量は増加した。すなわち、γδＴ細胞のＩＬ－１７産生は、ＣＤ９６がγδＴ細胞のＴ細胞受容体シグナルを増強させることにより、γδＴ細胞を活性化させたことにより増加すると考えられる。したがって、ＣＤ９６シグナルを阻害すれば、γδＴ細胞のＴ細胞受容体シグナルは増強されず、γδＴ細胞の活性化が抑制され、γδＴ細胞のＩＬ－１７産生が抑制されると推測される。
【0170】
〈ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ９６の発現〉
図１３左より、ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞にはＣＤ９６が発現していることが示された。図１３右より、ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞にもＣＤ９６が発現していることが示された。
図１３左より、ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞にはＣＤ９６が発現していることが示された。図１３右より、ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞にもＣＤ９６が発現していることが示された。
【0171】
〈ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞におけるＩＬ－１７産生〉
図１４に示すように、７人の全ての被験者（Ｈｕｍａｎ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒ；ＨＶ１～７）由来のγδＴ細胞において、固相化された抗ＣＤ９６抗体（ａ／ＣＤ９６）によりＣＤ９６を刺激すると、コントロール（ｍＩｇＧ１）に比べ、ＩＬ－１７産生は大きく上昇した。この結果から、マウス脾臓由来γδＴ細胞と同様に、ＣＤ９６がヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞のＴ細胞受容体シグナルを増強させることにより、ＩＬ－１７産生が増加すると考えられる。
図１４に示すように、７人の全ての被験者（Ｈｕｍａｎ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒ；ＨＶ１～７）由来のγδＴ細胞において、固相化された抗ＣＤ９６抗体（ａ／ＣＤ９６）によりＣＤ９６を刺激すると、コントロール（ｍＩｇＧ１）に比べ、ＩＬ－１７産生は大きく上昇した。この結果から、マウス脾臓由来γδＴ細胞と同様に、ＣＤ９６がヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞のＴ細胞受容体シグナルを増強させることにより、ＩＬ－１７産生が増加すると考えられる。
【0172】
〈ヒトＰＢＭＣ由来γδＴ細胞の活性化〉
図１５に示すように、６人の全ての被験者（ＨＶ１～６）由来のγδＴ細胞において、固相化された抗ＣＤ９６抗体（ａ／ＣＤ９６）によりＣＤ９６を刺激すると、コントロール（ｍＩｇＧ１）に比べ、Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９およびＣＤ２５の発現量は増加した。すなわち、γδＴ細胞のＩＬ－１７産生は、ＣＤ９６がγδＴ細胞のＴ細胞受容体シグナルを増強させることにより、γδＴ細胞を活性化させたことにより増加すると考えられる。
図１５に示すように、６人の全ての被験者（ＨＶ１～６）由来のγδＴ細胞において、固相化された抗ＣＤ９６抗体（ａ／ＣＤ９６）によりＣＤ９６を刺激すると、コントロール（ｍＩｇＧ１）に比べ、Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９およびＣＤ２５の発現量は増加した。すなわち、γδＴ細胞のＩＬ－１７産生は、ＣＤ９６がγδＴ細胞のＴ細胞受容体シグナルを増強させることにより、γδＴ細胞を活性化させたことにより増加すると考えられる。
【0173】
〈ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１７産生〉
図１６に示すように、８人の全ての被験者（ＨＶ１～８）由来のＣＤ４＋Ｔ細胞において、固相化された抗ＣＤ９６抗体（ａ／ＣＤ９６）によりＣＤ９６を刺激すると、コントロール（ｍＩｇＧ１）に比べ、ＩＬ－１７産生は大きく上昇した。この結果から、ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞においても、ＣＤ９６がＴ細胞受容体シグナルを増強させることにより、ＩＬ－１７産生が増加すると考えられる。
図１６に示すように、８人の全ての被験者（ＨＶ１～８）由来のＣＤ４＋Ｔ細胞において、固相化された抗ＣＤ９６抗体（ａ／ＣＤ９６）によりＣＤ９６を刺激すると、コントロール（ｍＩｇＧ１）に比べ、ＩＬ－１７産生は大きく上昇した。この結果から、ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞においても、ＣＤ９６がＴ細胞受容体シグナルを増強させることにより、ＩＬ－１７産生が増加すると考えられる。
【0174】
〈ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化〉
図１７に示すように、６人の全ての被験者（ＨＶ１～６）由来のＣＤ４＋Ｔ細胞において、固相化された抗ＣＤ９６抗体（ａ／ＣＤ９６）によりＣＤ９６を刺激すると、コントロール（ｍＩｇＧ１）に比べ、Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９およびＣＤ２５の発現量は増加した。すなわち、ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ－１７産生は、ＣＤ９６がＴ細胞受容体シグナルを増強させることにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化させたことにより増加すると考えられる。
図１７に示すように、６人の全ての被験者（ＨＶ１～６）由来のＣＤ４＋Ｔ細胞において、固相化された抗ＣＤ９６抗体（ａ／ＣＤ９６）によりＣＤ９６を刺激すると、コントロール（ｍＩｇＧ１）に比べ、Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９およびＣＤ２５の発現量は増加した。すなわち、ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ－１７産生は、ＣＤ９６がＴ細胞受容体シグナルを増強させることにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化させたことにより増加すると考えられる。
【0175】
〈ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ－１７産生に対する抗ＣＤ９６中和抗体の作用〉
図１８中、Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎの行は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激するために固相化に用いたものを示す。また、ｂｌｏｃｋｉｎｇの行は、他の分子のＣＤ９６への結合をブロックするために、ＣＤ４＋Ｔ細胞とあらかじめ混合しておいたものを示す。抗ＣＤ３抗体（ａ／ＣＤ３）に加え、ｈＣＤ１５５－Ｆｃをプレートに固相化してＣＤ９６を刺激すると、固相化された抗ＣＤ３抗体のみで刺激したときよりも、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１７産生は有意に増加した。また、抗ＣＤ９６中和抗体（ｎｅｕｔｒａｌ ａ／ＣＤ９６）をＣＤ４＋Ｔ細胞とあらかじめ混合しておくと、ｈＣＤ１５５－ＦｃのＣＤ９６への結合はブロックされ、ＰＢＳを混合しておいた場合に比べて、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１７産生は有意に抑制された。すなわち、抗ＣＤ９６中和抗体は、ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞の免疫応答の一つであるＩＬ－１７産生を抑制した。この結果から、抗ＣＤ９６中和抗体は、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤として用いることができ、さらには、ＩＬ－１７により炎症が惹起される疾患の予防および治療に有効である可能性が示唆された。
図１８中、Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎの行は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激するために固相化に用いたものを示す。また、ｂｌｏｃｋｉｎｇの行は、他の分子のＣＤ９６への結合をブロックするために、ＣＤ４＋Ｔ細胞とあらかじめ混合しておいたものを示す。抗ＣＤ３抗体（ａ／ＣＤ３）に加え、ｈＣＤ１５５－Ｆｃをプレートに固相化してＣＤ９６を刺激すると、固相化された抗ＣＤ３抗体のみで刺激したときよりも、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１７産生は有意に増加した。また、抗ＣＤ９６中和抗体（ｎｅｕｔｒａｌ ａ／ＣＤ９６）をＣＤ４＋Ｔ細胞とあらかじめ混合しておくと、ｈＣＤ１５５－ＦｃのＣＤ９６への結合はブロックされ、ＰＢＳを混合しておいた場合に比べて、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１７産生は有意に抑制された。すなわち、抗ＣＤ９６中和抗体は、ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞の免疫応答の一つであるＩＬ－１７産生を抑制した。この結果から、抗ＣＤ９６中和抗体は、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤として用いることができ、さらには、ＩＬ－１７により炎症が惹起される疾患の予防および治療に有効である可能性が示唆された。
【0176】
〈ＣＤ９６の機能〉
以上の結果から、ＣＤ９６は、γδＴ細胞やＣＤ４＋Ｔ細胞等のＩＬ－１７産生細胞において、免疫応答の活性化受容体として機能することが示された。さらに、ＩＬ－１７産生細胞におけるＣＤ９６のこの機能は、マウスとヒトにおいて共通していることが示された。
以上の結果から、ＣＤ９６は、γδＴ細胞やＣＤ４＋Ｔ細胞等のＩＬ－１７産生細胞において、免疫応答の活性化受容体として機能することが示された。さらに、ＩＬ－１７産生細胞におけるＣＤ９６のこの機能は、マウスとヒトにおいて共通していることが示された。
【0177】
したがって、マウスにおいてもヒトにおいても、ＣＤ９６シグナルを阻害すれば、γδＴ細胞やＣＤ４＋Ｔ細胞のＴ細胞受容体シグナルは増強されず、γδＴ細胞やＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化が抑制され、ＩＬ－１７産生が抑制されると推測される。
【0178】
ＣＤ９６が免疫制御系において果たす役割は、未だ不明なことが多い。例えば、マウスＮＫ細胞においては、ＣＤ９６は免疫抑制性の受容体として機能することが知られている。そのため、抗ＣＤ９６抗体は、免疫抑制を低減、すなわち免疫応答を活性化する薬剤として使用できる可能性が報告されている。ヒトＮＫ細胞においては、ＣＤ９６は、はじめは、免疫を活性化する受容体として報告された（Ａｎｊａ Ｆｕｃｈｓ ｅｔ．ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００４、１７２、３９９４－３９９８、Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｅｄｇｅ： ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）Ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＮＫ Ｃｅｌｌ－ＴａｒｇｅｔＣｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｂｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＤ１５５））。しかし、現在では、ヒトＮＫ細胞においてＣＤ９６が活性化受容体、抑制性受容体どちらとして機能するか議論されているところである。このため、Ｋ細胞をターゲットとした場合、ヒトでは抗ＣＤ９６抗体は、免疫応答を活性化しない可能性がある。一方で、本発明者らは、ＩＬ－１７産生細胞におけるＣＤ９６は、マウスでもヒトでも、免疫応答の活性化受容体として機能することを見出した。すなわち、ＩＬ－１７産生細胞におけるＣＤ９６の機能は種間を超えて共通であると考えられるから、本発明のＩＬ－１７産生細胞の免疫応答抑制剤は、マウスでもヒトでも同様に、免疫応答を抑制すると予測される。
【0179】
〈抗ＣＤ９６中和抗体ＴＸ１１１．２〉
図１９より、抗ＣＤ９６抗体ＴＸ１１１．２は、ＣＤ９６に対して特異性を有することが示された。図２０より、抗ＣＤ９６抗体ＴＸ１１１．２の濃度依存的に蛍光値が減少しており、抗ＣＤ９６抗体ＴＸ１１１．２は、ＣＤ９６のナチュラルリガンドであるＣＤ１５５と、ＣＤ９６への結合を競合することが示された。すなわち、抗ＣＤ９６抗体ＴＸ１１１．２は、ＣＤ９６とＣＤ１５５の結合を阻害する、抗ＣＤ９６中和抗体であることが示された。
図１９より、抗ＣＤ９６抗体ＴＸ１１１．２は、ＣＤ９６に対して特異性を有することが示された。図２０より、抗ＣＤ９６抗体ＴＸ１１１．２の濃度依存的に蛍光値が減少しており、抗ＣＤ９６抗体ＴＸ１１１．２は、ＣＤ９６のナチュラルリガンドであるＣＤ１５５と、ＣＤ９６への結合を競合することが示された。すなわち、抗ＣＤ９６抗体ＴＸ１１１．２は、ＣＤ９６とＣＤ１５５の結合を阻害する、抗ＣＤ９６中和抗体であることが示された。
【0180】
ＴＸ１１１．２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図２１に示す。図２１中、重鎖可変領域および軽鎖可変領域におけるＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）１～３には、下線を付して示した。
【0181】
〈イミキモド誘発乾癬モデルマウスへの抗マウスＣＤ９６中和抗体予防的投与実験〉
イミキモド誘発乾癬モデルにおける、ＴＸ１１１．２投与群およびｃＩｇ投与群の塗布開始３日目の背部の写真を図２３に示す。ｃＩｇ投与群では、皮膚が発赤し、鱗屑が確認された。ＴＸ１１１．２投与群では、皮膚が発赤し、鱗屑が確認されたものの、その程度はｃＩｇ投与群に比べて減弱していた。
イミキモド誘発乾癬モデルにおける、ＴＸ１１１．２投与群およびｃＩｇ投与群の塗布開始３日目の背部の写真を図２３に示す。ｃＩｇ投与群では、皮膚が発赤し、鱗屑が確認された。ＴＸ１１１．２投与群では、皮膚が発赤し、鱗屑が確認されたものの、その程度はｃＩｇ投与群に比べて減弱していた。
【0182】
塗布開始４日目の紅斑、鱗屑、および皮膚の厚さをＴＸ１１１．２投与群とｃＩｇ投与群とで比較したグラフを図２４に示す。紅斑と鱗屑のグラフの縦軸は、それぞれ紅斑スコア、鱗屑スコアであり、皮膚の厚さのグラフの縦軸は、皮膚の厚さ（μｍ）である。ｎａｉｖｅ群では、ＴＸ１１１．２投与群およびｃＩｇ投与群共に紅斑も鱗屑も見られなかった。
【0183】
イミキモド群（ＩＭＱ）では、ＴＸ１１１．２投与群およびｃＩｇ投与群共に、ｎａｉｖｅ群よりも紅斑のスコアが高いが、ＴＸ１１１．２投与群ではｃＩｇ投与群に比べ、紅斑スコアが有意に低かった。
【0184】
イミキモド群では、ＴＸ１１１．２投与群およびｃＩｇ投与群共に、ｎａｉｖｅ群よりも鱗屑のスコアが高いが、ＴＸ１１１．２投与群ではｃＩｇ投与群に比べ、鱗屑スコアが有意に低かった。
【0185】
イミキモド群では、ＴＸ１１１．２投与群およびｃＩｇ投与群共に、ｎａｉｖｅ群よりも皮膚が厚いが、ＴＸ１１１．２投与群ではｃＩｇ投与群に比べ、有意に皮膚が薄かった。
これらの結果から、ＴＸ１１１．２投与により、イミキモドにより誘発される紅斑、鱗屑、皮膚肥厚の病態が減弱したことが示された。
これらの結果から、ＴＸ１１１．２投与により、イミキモドにより誘発される紅斑、鱗屑、皮膚肥厚の病態が減弱したことが示された。
【0186】
イミキモド塗布開始４日目のマウス背部皮膚の組織標本をＨＥ染色した写真を図２５左に示す。ｃＩｇ投与群では表皮の肥厚、不全角化、真皮への好中球と単核球の浸潤等、乾癬に特徴的な病態が観察されたが、ＴＸ１１１．２投与群ではこれらの病態は減弱していた。表皮の厚さをグラフ化したものが図２５右であり、ｃＩｇ投与群ではイミキモド群はｎａｉｖｅ群に比べ表皮の厚さが約４倍になったが、ＴＸ１１１．２投与群では約２倍であり、イミキモドによる表皮肥厚が減弱していた。
【0187】
これらの結果から、抗マウスＣＤ９６中和抗体ＴＸ１１１．２は、乾癬の予防効果を有することが示された。
【0188】
〈イミキモド誘発乾癬モデルマウスへの抗マウスＣＤ９６中和抗体治療的投与実験〉
イミキモド誘発乾癬モデルにおける、ＴＸ１１１．２投与群およびｃＩｇ投与群の塗布開始６日目の背部の写真を図２７に示す。ｃＩｇ投与群では、皮膚が発赤し、鱗屑が確認された。ＴＸ１１１．２投与群では、皮膚が発赤し、鱗屑が確認されたものの、その程度はｃＩｇ投与群に比べて減弱していた。
イミキモド誘発乾癬モデルにおける、ＴＸ１１１．２投与群およびｃＩｇ投与群の塗布開始６日目の背部の写真を図２７に示す。ｃＩｇ投与群では、皮膚が発赤し、鱗屑が確認された。ＴＸ１１１．２投与群では、皮膚が発赤し、鱗屑が確認されたものの、その程度はｃＩｇ投与群に比べて減弱していた。
【0189】
塗布開始１日目（Ｄ１）および６日目（Ｄ６）の紅斑、鱗屑、および皮膚の厚さをＴＸ１１１．２投与群とｃＩｇ投与群とで比較したグラフを図２８に示す。紅斑と鱗屑のグラフの縦軸は、それぞれ紅斑スコア、鱗屑スコアであり、皮膚の厚さのグラフの縦軸は、皮膚の厚さ（μｍ）である。
【0190】
塗布開始６日目（Ｄ６）には、ＴＸ１１１．２投与群およびｃＩｇ投与群共に、塗布開始１日目（Ｄ１）よりも紅斑のスコアが高いが、ＴＸ１１１．２投与群ではｃＩｇ投与群に比べ、紅斑スコアが低かった。
【0191】
塗布開始６日目（Ｄ６）には、ＴＸ１１１．２投与群およびｃＩｇ投与群共に、塗布開始１日目（Ｄ１）ではゼロであった鱗屑のスコアが高くなるが、ＴＸ１１１．２投与群ではｃＩｇ投与群に比べ、鱗屑スコアが有意に低かった。
【0192】
塗布開始６日目（Ｄ６）には、ＴＸ１１１．２投与群およびｃＩｇ投与群共に、塗布開始１日目（Ｄ１）よりも皮膚が厚いが、ＴＸ１１１．２投与群ではｃＩｇ投与群に比べ、有意に皮膚が薄かった。
これらの結果から、ＴＸ１１１．２投与により、イミキモドにより誘発される紅斑、鱗屑、皮膚肥厚の病態が減弱したことが示された。
これらの結果から、ＴＸ１１１．２投与により、イミキモドにより誘発される紅斑、鱗屑、皮膚肥厚の病態が減弱したことが示された。
【0193】
イミキモド塗布開始６日目のマウス背部皮膚の組織標本をＨＥ染色した写真を図２９左に示す。ｃＩｇ投与群では表皮の肥厚、不全角化、真皮への好中球と単核球の浸潤等、乾癬に特徴的な病態が観察されたが、ＴＸ１１１．２投与群ではこれらの病態は減弱していた。表皮の厚さをグラフ化したものが図２９右であり、ｃＩｇ投与群に比べ、ＴＸ１１１．２投与群では表皮肥厚が有意に減弱していた。
【0194】
これらの結果から、抗マウスＣＤ９６中和抗体ＴＸ１１１．２は、乾癬の治療効果を有することが示された。
【0195】
〈ＥＡＥモデルマウスへの抗マウスＣＤ９６中和抗体投与実験〉
ＥＡＥモデルマウスにおける、ＴＸ１１１．２投与群およびｃＩｇ投与群のＥＡＥ病態スコアの変化を図３１に示す。ｃＩｇ投与群では、ＥＡＥ誘導後９日目からＥＡＥ病態スコアが上昇した。ＴＸ１１１．２投与群では、ＥＡＥ病態スコアが上昇したのは、ＥＡＥ誘導後１２日目であった。ＴＸ１１１．２投与群のＥＡＥ病態スコアはｃＩｇ投与群に比べて、試験期間中、常に低かった。
ＥＡＥモデルマウスにおける、ＴＸ１１１．２投与群およびｃＩｇ投与群のＥＡＥ病態スコアの変化を図３１に示す。ｃＩｇ投与群では、ＥＡＥ誘導後９日目からＥＡＥ病態スコアが上昇した。ＴＸ１１１．２投与群では、ＥＡＥ病態スコアが上昇したのは、ＥＡＥ誘導後１２日目であった。ＴＸ１１１．２投与群のＥＡＥ病態スコアはｃＩｇ投与群に比べて、試験期間中、常に低かった。
【0196】
この結果から、抗マウスＣＤ９６中和抗体ＴＸ１１１．２は、多発性硬化症の予防および治療効果を有することが示された。
【0197】
本発明者らは、ＩＬ－１７を産生するγδＴ細胞においてＣＤ９６が発現していることを新たに見出した。また、γδＴ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＣＤ９６が活性化受容体として機能していること、さらにＣＤ９６シグナルがＩＬ－１７産生を促進することを見出した。そして、抗ＣＤ９６中和抗体が、ＩＬ－１７により炎症が惹起される疾患である乾癬および多発性硬化症の予防および治療に有効であることをモデルマウスを用いて示した。
【0198】
既存の抗ＩＬ－１７Ａ抗体、抗ＩＬ－１７Ａ受容体抗体等のＩＬ－１７阻害薬は、ＩＬ－１７による全身での免疫活性を抑制してしまうので、感染症や好中球減少等の副作用が懸念される。本発明者らは、炎症部位の特定の細胞においてＩＬ－１７が産生される機構を明らかにし、その機構の一部を阻害することによりＩＬ－１７の産生を抑制する免疫抑制剤を見出した。本発明の免疫抑制剤は、炎症の部位特異的に作用するから、副作用の懸念が少ないと期待される。
【産業上の利用の可能性】
【0199】
本発明によれば、乾癬などの病態を引き起こす、ＩＬ－１７産生細胞の免疫応答を抑制するための免疫応答抑制剤、さらにＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品を提供できる。また、γδＴ細胞における免疫応答を誘導するための方法を提供することができる。さらにＩＬ－１７産生細胞の免疫応答が関与する疾病または病態を治療または予防するための医薬品の評価方法を提供することができる。γδＴ細胞における免疫応答を誘導しＩＬ－１７を産生する方法を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【配列表】