知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-24
(45)【発行日】2024-11-01
(54)【発明の名称】アルツハイマー病を治療する方法及び薬剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/48 20060101AFI20241025BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20241025BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20241025BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241025BHJP
C07K 14/745 20060101ALN20241025BHJP
【ＦＩ】
A61K38/48 100
A61P25/28
A61K45/00
A61P43/00 121
C07K14/745 ZNA
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2022557662
(86)(22)【出願日】2021-03-24
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-01
(86)【国際出願番号】 CN2021082701
(87)【国際公開番号】W WO2021190558
(87)【国際公開日】2021-09-30
【審査請求日】2022-11-18
(31)【優先権主張番号】202010213462.7
(32)【優先日】2020-03-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】518217305
【氏名又は名称】タレンゲン インターナショナル リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＴＡＬＥＮＧＥＮ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】110003007
【氏名又は名称】弁理士法人謝国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】李季男
【審査官】堂畑 厚志
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００１／０５８４７６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／２３３６０４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００６／０１０４９６９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／２３４８６１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０２１５４２５３（ＣＮ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／００４４７９６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】MELCHOR, Jerry P. et al.，The Tissue Plasminogen Activator-Plasminogen Proteolytic Cascade Accelerates Amyloid-β (Aβ) Degradation and Inhibits Aβ-Induced Neurodegeneration，Journal of Neuroscience，2003年，23 (26) ，8867-8871
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ ２５／
ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
Ｐｕｂｍｅｄ
ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ／ＵｎｉＰｒｏｔ／ＰＤＢ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アルツハイマー病を予防及び治療するためのプラスミノーゲンを含む医薬組成物。
【請求項2】
前記プラスミノーゲンが、アルツハイマー病の被験者に対して、脳組織におけるアミロイドＡβ４０またはＡβ４２の分解を促進する活性、記憶機能を改善する活性、認知能力を改善する活性、地理的位置認識を改善する活性、不安または抑うつ症状を緩和する活性、脳組織におけるＡβ４２沈着を減少させる活性、脳組織におけるＴａｕタンパク質の分解を促進する活性、脳組織におけるＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断による成熟ＢＤＮＦの形成を促進する活性、脳組織におけるＢＤＮＦの発現を促進する活性、脳組織におけるＰｒｏ－ＮＧＦの切断による成熟ＮＧＦの形成を促進する活性、及び脳組織の海馬の損傷を改善する活性から選択される１つまたは複数の活性を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記プラスミノーゲンが、ヒト全長プラスミノーゲンまたはその保存的置換変異体である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記プラスミノーゲンが、配列番号２と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記プラスミノーゲンが、配列番号１４と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ依然としてプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を有するタンパク質を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記プラスミノーゲンが、Ｇｌｕ－プラスミノーゲンおよびＬｙｓ－プラスミノーゲンから選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
１つまたは複数の他の治療方法または薬剤と組み合わせて使用される、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記他の治療方法が、細胞療法、支持療法、及び物理的療法を含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記プラスミノーゲンが、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、点眼薬、点耳薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内、または筋肉内に投与される、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、臨床症状及び徴候を改善するために、被験者に有効量のプラスミノーゲン活性化経路の成分または関連化合物、例えば、プラスミノーゲン、を投与することを含む、アルツハイマー病を予防または治療する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＤ）は、潜行性に発症する進行性の神経変性疾患である。臨床的には、記憶障害、失語症、失行症、失認症、視空間能力の障害、実行機能障害、及び人格や行動の変化などの全身性認知症を特徴としているが、その原因はまだ分かっていない。主な症状は、認知機能の低下、精神症状や行動障害、日常生活能力の漸進的な低下である。認知能力や身体機能の低下の程度によって３つの時期に分けられる。第１の段階は通常１～３年であり、軽度の認知症である。記憶喪失、最近の出来事の顕著な忘却；判断能力の低下、出来事の分析、思考、判断ができず、複雑な問題に対処することが困難であり；仕事や家事が不注意であり、自分で買い物や経済問題などをすることができず、社交が困難であり；まだいくつかの慣れ親しんだ日常の仕事をすることができるが、ぼんやりして新しいことに理解できず、感情的に無関心で、時々怒りっぽくて、しばしば疑わしいであり；時間的方向性障害が発生し、場所と人を方向付けることができるが、その場所の地理的な位置を把握するのが難しく、複雑な構造の視空間能力が低く；言語語彙が少なく、ネーミングが難しいこととして現れる。第２の段階は通常２～１０年であり、中等度の認知症である。それは、遠くと近くの記憶の重度の障害、単純な構造の視空間能力の低下、時間及び場所の方向性障害が発生し；問題に対処し、物事の類似点と相違点を区別することにおける重度の障害；室外活動を独立して行うことができず、着替え、身の回りの衛生、外見の維持に介助が必要であり；計算不能；失語症、失行症、失認など、さまざまな神経学的症状が現れ；感情は無関心から過敏性に変化し、しばしば絶え間ない歩行、尿失禁が発生することとして現れる。第３段階は通常８～１２年であり、重度の認知症の段階である。患者は介護者に完全に依存し、重度の記憶喪失があり、断片的な記憶しか持たない；日常生活で自分の世話をすることができず、失禁、無言症、四肢の硬直、身体検査では、強く握る、手探り、吸うなどの原始反射を伴う陽性の錐体路徴候が明らかになる。最終的には昏睡状態に陥り、通常は感染症などの合併症で死亡する。
【0003】
現在の治療法は、主にアルツハイマー病に関連する精神病理学的症状を制御するための対症療法である。例えば、不安、動揺、不眠の症状がある場合は抗不安薬を投与し、抑うつ症状がある場合は抗うつ薬を投与し、患者の行動障害をコントロールするために抗精神病薬を投与する。また、認知機能を改善し、病気の進行を遅らせるために、神経伝達物質に作用する薬、脳血管拡張薬、脳の代謝を促進する薬などの向知性薬や認知機能を改善する薬を投与する。アルツハイマー病の治療には、他の治療法や薬剤を見つける必要がある。
【発明の概要】
【0004】
本発明は研究によって、プラスミノーゲンがアルツハイマー病患者の記憶機能の回復を促進し、認知能力を改善し、アルツハイマー病の様々な臨床症状及び徴候を有意に軽減及び緩和し、アルツハイマー病を予防及び治療できることを発見した。
【0005】
具体的には、本発明は下記のことに係る。
【0006】
１、一態様では、本願は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の拮抗剤から選択される１つ以上の治療有効量の化合物をアルツハイマー病の被験者に投与することを含む、アルツハイマー病を予防及び治療する方法に関する。
【0007】
一態様では、本願は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つ以上の化合物の、アルツハイマー病を治療する薬剤の調製における使用に関する。
【0008】
一態様では、本願は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つ以上の化合物を含む、アルツハイマー病を治療する薬剤または医薬組成物に関する。
【0009】
２、前記プラスミノーゲン活性化経路の成分が、プラスミノーゲン、組換えヒトプラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンとプラスミンの１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びプロテアーゼドメインを含むプラスミノーゲン及びプラスミン変異体並びに類縁体、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、マイクロプラスミン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）、プラスミノーゲン活性化剤、ｔＰＡ、及びｕＰＡから選択されるものである、項１に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0010】
３、前記線維素溶解阻害剤の拮抗剤が、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの阻害剤、例えば、抗体である、項１に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0011】
４、前記化合物が、アルツハイマー病の被験者に対して、脳組織におけるアミロイドＡβ４０またはＡβ４２の分解を促進する活性、記憶機能を改善する活性、認知能力を改善する活性、地理的位置認識を改善する活性、不安または抑うつ症状を緩和する活性、脳組織におけるＡβ４２沈着を減少させる活性、脳組織におけるＴａｕタンパク質の分解を促進する活性、脳組織におけるＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断による成熟ＢＤＮＦの形成を促進する活性、脳組織におけるＢＤＮＦの発現を促進する活性、脳組織におけるＰｒｏ－ＮＧＦの切断による成熟ＮＧＦの形成を促進する活性、及び脳組織の海馬の損傷を改善する活性から選択される１つまたは複数の活性を有する、項１～３のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0012】
５、前記化合物がプラスミノーゲンである、項１～４のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0013】
６、前記プラスミノーゲンが、ヒト全長プラスミノーゲンまたはその保存的置換変異体である、項１～５のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0014】
７、前記プラスミノーゲンが、配列２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲンのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有する、項１～５のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0015】
８、前記プラスミノーゲンが、配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ依然としてプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を有する、項１～５のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0016】
９、前記プラスミノーゲンがＧｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲンまたはそれらの、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を保持した変異体から選択されるものである、項１～５のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0017】
１０、前記プラスミノーゲンが、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列の保存的置換変異体を含む、項１～５のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0018】
１１、前記化合物が、１つまたは複数の他の治療方法または薬剤と組み合わせて使用される、項１～１０のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0019】
１２、前記他の治療方法が、細胞療法（幹細胞療法を含む）、支持療法、及び物理的療法を含む、項１１に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0020】
１３、前記他の薬剤が、アルツハイマー病の治療のための他の薬剤である、項１１に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0021】
１４、前記化合物が、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、点眼薬、点耳薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内（例えば頸動脈を介して）、及び筋肉内に投与される、項１～１３のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0022】
本願の上記いずれか１つの実施形態において、前記プラスミノゲンが配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有し得る。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を追加、削除、及び／または置換され、かつ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有するタンパク質である。
【0023】
一部の実施形態において、プラスミノーゲンはプラスミノーゲンフラグメントを含み、且つ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、タンパク質加水分解活性を有するタンパク質である。一部の実施形態において、プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ－プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性、例えば、タンパク質加水分解活性を保持した変異体である。上記実施形態において、前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、または依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンのアミノ酸は配列２、６、８、１０または１２に示される。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンである。
【0024】
一部の実施形態において、前記被験者はヒトである。一部の実施形態において、前記被験者はプラスミノーゲンが不足、または欠乏している。一部の実施形態において、前記不足または欠乏は、先天的、継発的及び／または局所的である。
【0025】
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体と、前述の方法で使用するプラスミノーゲンとを含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、（ｉ）前述の方法で使用するプラスミノーゲン、及び（ｉｉ）前記プラスミノーゲンを前記被験者に送達するための部材（ｍｅａｎｓ）を含む、予防または治療キットであり得る。いくつかの実施形態では、前記部材は注射器またはバイアルである。いくつかの実施形態では、前記キットは、前述の方法のいずれかを実施するために前記プラスミノーゲンを前記被験者に投与することを指示するためのラベルまたはプロトコルをさらに含む。
【0026】
いくつかの実施形態では、前記製品は、ラベルを含む容器と、（ｉ）前述の方法で使用するためのプラスミノーゲンまたはプラスミノーゲンを含む医薬組成物とを含み、前記ラベルは、前述の方法のいずれかを実施するために前記プラスミノーゲンまたは組成物を前記被験者に投与することを指示する。
【0027】
いくつかの実施形態では、前記キットまたは製品は、他の薬剤を含む１つまたは複数の追加の部材または容器をさらに含む。
【0028】
前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは全身または局所にて投与され、好ましくは、静脈内、筋肉内、皮下投与によってプラスミノーゲンを投与することで治療する。前記方法のいくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンは、適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与される。前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１～２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１～８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～６００ｍｇ／ｋｇ、０．１～４００ｍｇ／ｋｇ、１～２００ｍｇ／ｋｇ、１～１００ｍｇ／ｋｇ、１０～１００ｍｇ／ｋｇ（体重１キロあたりで計算）または０．０００１～２０００ｍｇ／ｃｍ２、０．００１～８００ｍｇ／ｃｍ２、０．０１～６００ｍｇ／ｃｍ２、０．１～４００ｍｇ／ｃｍ２、１～２００ｍｇ／ｃｍ２、１～１００ｍｇ／ｃｍ２、１０～１００ｍｇ／ｃｍ２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量で投与し、好ましくは一回以上繰り返し、好ましくは少なくとも毎日投与する。
【0029】
本発明は、本発明の実施形態に属する技術的特徴のすべての組み合わせを明確にカバーし、これらの組み合わせ後の技術構成は、上記の技術構成が別個に明確に開示されたのと同様に、本出願において明確に開示された。さらに、本発明はまた、各実施形態とそれらの要素との間の組み合わせを明確にカバーし、組み合わせ後の技術構成は、本明細書に明確に開示されている。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】図１Ａ～Ｂは、ＰＢＳ緩衝系におけるアミロイドＡβ４０を溶解するプラスミノーゲンのＴｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ電気泳動の結果を示す図である。ＡはＴｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥであり、ＢはインビトロでのＡβ４０溶解の定量的スキャン分析の結果である。その結果、溶媒対照群のＡβ４０量を１００％として定義し、変化がなく、プラスミノーゲン群では、プラスミノーゲンのみを添加した場合にＡβ４０が部分的に分解され、プラスミノーゲン＋ｔＰＡ群では、プラスミノーゲンとｔＰＡを添加した場合、Ａβ４０のインビトロ分解は明らかであり、溶媒対照群と比較して有意な差があった（＊＊はＰ＜０．０１を表す）。これは、プラスミノーゲンがＡβ４０の分解を促進できることを示している。
【図2】図２Ａ～Ｂは、ウサギ脳脊髄液中のアミロイドＡβ４０を溶解するプラスミノーゲンのＴｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ電気泳動の結果を示す図であり、レーン１とレーン４はブランク対照群であり、レーン２は溶媒群であり、レーン３はプラスミノーゲン群である。ＡはＴｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＢはＡβ４０溶解の定量的スキャン分析の結果である。その結果、溶媒対照群のＡβ４０の量を１００％と定義し、変化がなく、プラスミノーゲン群では、プラスミノーゲンのみを添加した場合にＡβ４０が部分的に分解され、７４．８１％に分解された。これは、プラスミノーゲンがＡβ４０の分解を促進できることを示している。
【図3】図３Ａ～Ｂは、ウサギ脳脊髄液中のヒトアミロイドＡβ４０に対するプラスミノーゲンの効果の結果を示す図である。ＡはＴｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の図であり、ＢはＡβ４０溶解の定量的スキャン分析の結果である。その結果、溶媒対照群のＡβ４０の量を１００％と定義し、変化がなく、プラスミノーゲン群では、プラスミノーゲンのみを添加した場合にＡβ４０が部分的に分解され、７４．８１％に分解された。これは、プラスミノーゲンがウサギの脳脊髄液中のヒトアミロイドＡβ４０の分解を促進できることを示している。
【図4】図４Ａ～Ｂは、アルツハイマー病モデル及び正常マウス脳ホモジネートにおけるヒトアミロイドＡβ４０に対するプラスミノーゲンの効果の結果を示す図である。ＡはＴｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の図であり、ＢはインビトロでのＡβ４０溶解の定量的スキャン分析の結果である。その結果、ＦＡＤマウスの脳ホモジネートでは、投与群のアミロイドＡβ４０の量が溶媒対照群よりも有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を示す）；正常マウス脳ホモジネートにおいて、投与群のヒトアミロイドＡβ４０の量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった（Ｐ＝０．００１）。これは、アルツハイマー病モデル及び正常マウス脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲンがヒトアミロイドＡβ４０の分解を効果的に促進できることを示している。
【図5】図５は、プラスミノーゲン投与５日後のアルツハイマー病モデルマウスにおける自発的交替行動率（％）の統計結果を示す図である。その結果、正常な対照マウスと比較して、溶媒群のマウスの自発的交替行動率が有意に増加し、投与群のマウスの自発的交替行動率は、溶媒対照群よりも有意に低く、その統計的差は有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、且つ正常な対照マウスにより近かった。
【図6】図６は、プラスミノーゲン投与５日後のアルツハイマー病モデルマウスの総アーム進入回数の統計結果を示す図である。その結果、正常な対照マウスと比較して、溶媒群のマウスの総アーム進入回数は有意に減少し、プラスミノーゲン投与群のマウスの総アーム進入回数は、溶媒群のマウスよりも有意に多く、統計的差は有意であり（＊はＰ＜０．０５を示す）、正常な対照マウスにより近かった。
【図7】図７は、プラスミノーゲン投与５日後のアルツハイマー病モデルマウスの総移動距離の統計結果を示す図である。その結果、正常な対照マウスと比較して、溶媒群のマウスの総運動距離は有意に減少し、プラスミノーゲン群のマウスの総運動距離は溶媒対照群のマウスよりも有意に長く、統計的差は有意であり（＊はＰ＜０．０５を示す）、正常な対照マウスにより近かった。
【図8】図８Ａ～Ｃは、アルツハイマー病モデルマウスにプラスミノーゲンを２８日間投与した後の大脳皮質におけるＡβ４２染色の定量分析結果を示す図である。Ａは溶媒群であり、Ｂは投与群であり、Ｃは平均光学密度の定量分析結果である。その結果、溶媒群のマウスの大脳皮質におけるＡβ４２の沈着レベルは、投与群よりも有意に高く、光学密度の定量分析結果の統計的差は有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの大脳皮質におけるＡβ４２の沈着を減少させることができることを示唆している。
【図9】図９Ａ～Ｂは、プラスミノーゲンを８日間投与した後のアルツハイマー病モデルマウスの脳組織ホモジネートにおけるＡβ４２のウエスタンブロットの結果を示す図である。Ａはウエスタンブロットの代表的な画像であり、Ｂは光学密度の定量分析の結果である。その結果、ブランク対照群のマウスの脳ホモジネートには一定レベルのＡβ４２タンパク質が存在し、溶媒群のマウスの脳組織におけるＡβ４２のレベルは、投与群のマウスよりも有意に高く、統計Ｐ値は０．０９であった。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデルマウスの脳組織におけるＡβ４２のレベルを低下させることができることを示している。
【図10】図１０Ａ～Ｂは、正常なマウスの脳ホモジネートにおけるＴａｕタンパク質に対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。Ａはウエスタンブロット画像であり、ＢはＴａｕタンパク質バンドの光学密度の定量分析結果である。その結果、正常なマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のＴａｕタンパク質の量が溶媒対照群よりも有意に低く、その差は有意であった（＊はＰ＜００５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、正常なマウスの脳ホモジネートにおけるＴａｕタンパク質の分解を促進できることを示唆している。
【図11】図１１Ａ～Ｂは、アルツハイマー病マウスの脳ホモジネートにおけるＴａｕタンパク質に対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。Ａはウエスタンブロット画像であり、ＢはＴａｕタンパク質バンドの光学密度の定量分析結果である。その結果、アルツハイマーマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のＴａｕタンパク質の量が溶媒対照群よりも有意に低く、その差は統計的に有意であった（＊はＰ＜００５、＊＊はＰ＜０．０１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病マウスの脳ホモジネートのＴａｕタンパク質の分解を促進できることを示唆している。
【図12】図１２は、プラスミノーゲンを２８日間投与したアルツハイマー病マウスの脳組織における異なる分子量のＴａｕタンパク質のウエスタンブロット検出結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの脳ホモジネートに一定のレベルの異なる分子量のＴａｕタンパク質があり、投与群のマウスの脳組織における各分子量のＴａｕタンパク質及び総Ｔａｕタンパク質のレベルは媒体群のマウスよりも有意に低く、２つの群の３５ｋｄ、３５～４０ｋｄ、４０ｋｄ、５４ｋｄの分子量Ｔａｕタンパク質レベル及び総Ｔａｕタンパク質レベルの統計分析Ｐ値は、０．１７４、０．０４０６、０．０５２、０．０６７、及び０．０５５であった。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマーモデルマウスの脳組織においてＴａｕタンパク質の分解を促進できることを示している。
【図13】図１３Ａ～Ｂは、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおける組換えヒトＰｒｏ－ＢＤＮＦに対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。ＡはＳＤＳ－ＰＡＧＥの画像であり、ＢはＳＤＳ－ＰＡＧＥにおけるＰｒｏ－ＢＤＮＦバンドの定量解析結果である。その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＢＤＮＦ量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった（＊はＰ＜０．０５、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいてＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断を促進できることを示唆している。
【図14】図１４Ａ～Ｃは、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおける組換えヒトＰｒｏ－ＢＤＮＦに対するプラスミノーゲンの効果を示す図であり、Ａはウエスタンブロットの画像であり、ＢはウエスタンブロットにおけるＰｒｏ－ＢＤＮＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果であり、ＣはウェスタンブロットにおけるＢＤＮＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果である。その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＢＤＮＦ量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１を表す）；プラスミノーゲン投与群のＢＤＮＦ量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は極めて有意であった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、Ｐｒｏ－ＢＤＮＦの切断及び成熟ＢＤＮＦの形成を促進できることを示唆している。
【図15】図１５Ａ～Ｄは、プラスミノーゲンを２８日間投与したアルツハイマー病モデルマウスの海馬におけるＢＤＮＦの免疫組織化学染色の結果を示す図である。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒群であり、Ｃは投与群であり、Ｄは平均光学密度の定量分析結果である。その結果、ブランク対照群のマウスの海馬が一定レベルのＢＤＮＦを発現し（矢印でマーク）、溶媒群のマウスの海馬におけるＢＤＮＦの発現は、ブランク対照群よりも有意に低く、投与群のマウスの海馬におけるＢＤＮＦの発現は溶媒群よりも有意に高く、統計的差は有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデルマウスの海馬でＢＤＮＦの発現を促進できることを示している。
【図16】図１６Ａ～Ｃは、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおける組換えヒトＰｒｏ－ＮＧＦに対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。Ａはウェスタンブロットの画像であり、ＢはウェスタンブロットにおけるＰｒｏ－ＮＧＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果であり、ＣはウエスタンブロットにおけるＮＧＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果である。その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートでは、溶媒対照群に比べてプラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＮＧＦ量が有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）；プラスミノーゲン投与群のＮＧＦ量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は有意であった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、組換えヒトＰｒｏ－ＮＧＦの切断及び成熟ＮＧＦの形成を促進できることを示唆している。
【図17】図１７は、プラスミノーゲン投与２８＋７日後のアルツハイマー病モデルマウスのオープンフィールド試験の境界ゾーンにおける移動距離の割合（％）の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群は境界ゾーンで一定の割合の移動距離を持っており、溶媒群マウスの境界ゾーンの移動距離の割合がブランク対照群より有意に多く、投与群マウスの境界ゾーン移動距離の割合が溶媒群より有意に小さく、しかも統計的差は有意に近かった（Ｐ＝０．０８）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
【図18】図１８は、プラスミノーゲン投与２８＋７日後のアルツハイマー病モデルマウスのオープンフィールド試験の中心ゾーンにおける移動距離の割合（％）の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群は中心ゾーンで一定の割合の移動距離を持っており、溶媒群マウスの中心ゾーンの移動距離の割合がブランク対照群より有意に小さく、投与群マウスの中心ゾーン移動距離の割合が溶媒群より有意に大きく、しかも統計的差は有意に近かった（Ｐ＝０．０８）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
【図19】図１９は、プラスミノーゲン投与２８＋７日後のアルツハイマー病モデルマウスの高架式十字迷路試験における総移動距離の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群は一定の総移動距離を持っており、溶媒群の移動距離はブランク対照群よりも有意に大きく、投与群の総移動距離は溶媒群よりも有意に小さく、その統計的差は極めて有意であり（＊はＰ＜０.０５、＊＊はＰ＜０．０１を表す）、しかもブランク対照群のマウスの総移動距離により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
【図20】図２０は、プラスミノーゲン投与２８＋９日後のアルツハイマー病モデルマウスの高架式十字迷路試験におけるクローズアーム移動距離の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム移動距離を持っており、溶媒群のクローズアーム移動距離はブランク対照群よりも有意に大きく、投与群のクローズアーム移動距離は溶媒群よりも有意に小さく、２つの群の間の統計的差は有意であり（＊はＰ＜０.０５、＊＊はＰ＜０．０１を表す）、しかも投与群のクローズアーム移動距離はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
【図21】図２１は、プラスミノーゲン投与２８＋９日後のアルツハイマー病モデルマウスの高架式十字迷路試験におけるクローズアーム移動距離の割合の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム移動距離の割合を持っており、溶媒群のクローズアーム移動距離の割合はブランク対照群よりも有意に大きく、投与群のクローズアーム移動距離の割合は溶媒群よりも有意に小さく、２つの群の間の統計的差は有意であり（＊はＰ＜０.０５を表す）、しかも投与群のクローズアーム移動距離の割合はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
【図22】図２２は、プラスミノーゲン投与２８＋９日後のアルツハイマー病モデルマウスの高架式十字迷路試験におけるクローズアームエントリ回数の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアームエントリ回数を持っており、溶媒群のクローズアームエントリ回数はブランク対照群マウスよりも有意に多く、投与群マウスのクローズアームエントリ回数は溶媒群よりも有意に少なく、２つの群の間の統計的差は極めて有意であり（＊はＰ＜０.０５、＊＊はＰ＜０.０１を表す）、しかも投与群のクローズアームエントリ回数はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
【図23】図２３は、プラスミノーゲン投与２８＋９日後のアルツハイマー病モデルマウスの高架式十字迷路試験におけるクローズアーム時間の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム時間を持っており、溶媒群マウスのクローズアームの滞在時間はブランク対照群マウスよりも有意に短く、投与群マウスのクローズアーム時間は溶媒群よりも有意に長く、２つの群の間の統計的差は有意であり（＊はＰ＜０.０５、＊＊はＰ＜０.０１を表す）、しかも投与群のクローズアームの滞在時間はブランク対照群により近かった。
【図24】図２４は、プラスミノーゲン投与２８＋９日後のアルツハイマー病モデルマウスの高架式十字迷路試験におけるクローズアーム時間の割合の統計結果を示す図である。クローズアーム時間の割合とは、マウスがクローズアームに滞在した時間と記録された合計時間との比率を指す。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム時間の割合を持っており、溶媒群マウスのクローズアーム時間の割合はブランク対照群マウスよりも有意に低く、投与群マウスのクローズアーム時間の割合は溶媒群よりも有意に高く、２つの群の間の統計的差は有意であり（＊はＰ＜０.０５、＊＊はＰ＜０.０１を表す）、しかも投与群のクローズアーム時間の割合はブランク対照群により近かった。
【図25】図２５は、プラスミノーゲン投与２８＋９日後のアルツハイマー病モデルマウスの高架式十字迷路試験におけるクローズアームでの平均移動速度の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアームでの平均移動速度を持っており、溶媒群のクローズアームでの平均移動速度はブランク対照群マウスよりも有意に大きく、投与群マウスのクローズアームでの平均移動速度は溶媒群よりも有意に小さく、２つの群の間の統計的差は極めて有意であり（＊＊はＰ＜０.０１を表す）、しかも投与群のクローズアームでの平均移動速度はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
【図26】図２６は、プラスミノーゲン投与２８＋９日後のアルツハイマー病モデルマウスのＹ迷路における自発的交替行動率の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照マウスと比較して、溶媒群のマウスの自発的交替行動率が有意に低下し、投与群のマウスの自発的交替行動率は、溶媒群よりも有意に高く、２つの群の間の統計的差は有意であり（＊はＰ＜０.０５を表す）、しかもブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの記憶機能の回復を促進できることを示唆している。
【図27】図２７は、プラスミノーゲン投与１８日後のアルツハイマー病モデルマウスの高架式十字迷路試験におけるクローズアームの移動距離の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム時の移動距離を持っており、溶媒群のクローズアームの移動距離はブランク対照群マウスよりも有意に小さく、投与群マウスのクローズアームの移動距離は溶媒群よりも有意に大きく、２つの群の間の統計的差は有意であり（＊＊はＰ＜０.０１、＊＊＊はＰ＜０.００１を表す）、しかも投与群のクローズアームの移動距離はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
【発明の詳細な説明】
【0031】
線維素溶解系（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）は、線溶系とも呼ばれ、線維素溶解（線溶）の過程に関与する一連の化学物質からなる系であり、主にプラスミノーゲン（ＰＬＧ）、プラスミン、プラスミノーゲン活性化因子、及び線維素溶解阻害剤を含む。プラスミノーゲン活性化因子には、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）、及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ－ＰＡ）が含まれる。ｔ－ＰＡはセリンプロテアーゼであり、血管内皮細胞によって合成される。ｔ－ＰＡはプラスミノーゲンを活性化し、このプロセスは主にフィブリンで行われる。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ－ＰＡ）は、尿細管上皮細胞と血管内皮細胞によって産生され、補因子としてフィブリンを必要とすることなくプラスミノーゲンを直接活性化することができる。プラスミノーゲン（ＰＬＧ）は肝臓で合成される。血液が凝固すると、ＰＬＧはフィブリンネットに大量に吸着され、ｔ－ＰＡまたはｕ－ＰＡの作用によりプラスミンに活性化されて線維素溶解を促進する。プラスミナーゼ（ＰＬ）はセリンプロテアーゼであり、フィブリンとフィブリノーゲンを分解し、様々な凝固因子Ｖ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＶＩＩ、ＸＩ、ＩＩなどを加水分解し、プラスミノーゲンをプラスミンに変換し、補体を加水分解するなどの作用がある。線維素溶解阻害剤には、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ）、及びα２－抗チプラスミン（α２－ＡＰ）が含まれる。ＰＡＩには主にＰＡＩ－１とＰＡＩ－２の２つの形態があり、ｔ－ＰＡに１：１の比率で特異的に結合することによってｔ－ＰＡを不活性化すると同時にＰＬＧを活性化することができる。α２－ＡＰは肝臓で合成され、ＰＬと１：１の比率で結合して複合体を形成し、それによってＰＬ活性を阻害する。ＦＸＩＩＩはα２－ＡＰをフィブリンと共有結合させ、それによってＰＬに対するフィブリンの感受性を弱める。インビボでの線維素溶解系の活性を阻害する物質としては、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミン、及びα２－マクログロブリンが挙げられる。
【0032】
本明細書で使用される「プラスミノーゲン活性化経路の成分」という用語は、
１、プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、それらの変異体または類縁体；
２、プラスミン及びそれらの変異体または類縁体;及び
３、プラスミノーゲン活性化剤、例えば、ｔＰＡ及びｕＰＡ、ならびにｔＰＡまたはｕＰＡの１つ以上のドメイン（１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメインなど）を含むｔＰＡまたはｕＰＡ変異体及び類縁体をカバーする。
１、プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、それらの変異体または類縁体；
２、プラスミン及びそれらの変異体または類縁体;及び
３、プラスミノーゲン活性化剤、例えば、ｔＰＡ及びｕＰＡ、ならびにｔＰＡまたはｕＰＡの１つ以上のドメイン（１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメインなど）を含むｔＰＡまたはｕＰＡ変異体及び類縁体をカバーする。
【0033】
上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「変異体」は、すべての天然に存在するヒトの遺伝的変異体及びこれらのタンパク質の他の哺乳動物型、並びに、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を追加、削除、及び／または置換されてかつ依然としてプラスミノーゲン活性、プラスミン活性、ｔＰＡまたはｕＰＡ活性を有するタンパク質を含む。例えば、プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの「変異体」は、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個の保存的アミノ酸によって置換されて得られるこれらのタンパク質の突然変異体を含む。
【0034】
本発明の「プラスミノゲン変異体」は、配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有するタンパク質をカバーする。例えば、本発明の「プラスミノーゲン変異体」は、配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を追加、削除、及び／または置換し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有するタンパク質であり得る。具体的には、本発明のプラスミノーゲン変異体は、すべての天然に存在するヒトの遺伝的変異体及びこれらのタンパク質の他の哺乳動物型、並びに、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を保存的置換によって得られるこれらのタンパク質の突然変異体を含む。
【0035】
本発明のプラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を保持した変異体、例えば、配列２、６、８、１０または１２に示されるプラスミノーゲン、例えば、配列２に示されるヒト天然プラスミノーゲンであり得る。
【0036】
上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「類縁体」はそれぞれ、プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡと実質的に同様の効果を与える化合物を含む。
【0037】
上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「変異体」及び「類縁体」は、１つ以上のドメイン（例えば、１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメイン）を含むプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「変異体」及び「類縁体」をカバーする。例えば、プラスミノーゲンの「変異体」及び「類縁体」は、１つ以上のプラスミノーゲンドメイン（例えば、１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメイン）を含むプラスミノーゲン変異体及び類縁体、例えば、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）をカバーする。プラスミンの「変異体」及び「類縁体」は、１つ以上のプラスミンドメイン（例えば、１つまたは複数のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメイン）を含むミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）やδ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）などのプラスミンの「変異体」及び「類縁体」をカバーする。
【0038】
上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの「変異体」または「類縁体」がそれぞれプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの活性を有するかどうか、またはそれらがプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡと実質的に同様の効果をそれぞれ与えるかどうかは、当技術分野で知られている方法、例えば、ザイモグラフィー（ｅｎｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）及びＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング法）を使用して、活性化されたプラスミン活性のレベルによって測定できる。例えば、次の文献に記載されている方法を参照して測定することができる。Ｎｙ，Ａ．，Ｌｅｏｎａｒｄｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｈａｇｇｌｕｎｄ，Ａ．Ｃ，Ｈａｇｇｌｏｆ，Ｐ．，Ｐｌｏｐｌｉｓ，Ｖ．Ａ．，Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ． ａｎｄ Ｎｙ，Ｔ． （１９９９）． Ｏｖｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０，５０３０－５０３５；Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ ＲＬ， Ｌｅｕｎｇ ＬＬ， Ｈａｒｐｅｌ ＰＣ， Ｎａｃｈｍａｎ ＲＬ （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９８４）． “Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ． Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｉｓｓｕｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ”． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７４ （５）： １６２５-３３；Ｇｒａｖａｎｉｓ Ｉ， Ｔｓｉｒｋａ ＳＥ （Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００８）． “Ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｓｔｒｏｋｅ”． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ． １２ （２）： １５９-７０；Ｇｅｉｇｅｒ Ｍ， Ｈｕｂｅｒ Ｋ， Ｗｏｊｔａ Ｊ， Ｓｔｉｎｇｌ Ｌ， Ｅｓｐａｎａ Ｆ， Ｇｒｉｆｆｉｎ ＪＨ， Ｂｉｎｄｅｒ ＢＲ （Ａｕｇ １９８９）． “Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ”． Ｂｌｏｏｄ． ７４ （２）： ７２２-８。
【0039】
本発明の一部の実施形態において、本発明の「プラスミノーゲン活性化経路の成分」はプラスミノーゲンである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはヒト全長プラスミノーゲン、またはそのプラスミノーゲン活性（例えば、そのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性）を保持した保存的突然変異体である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ－プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性（例えば、そのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性）を保持した変異体である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、または依然としてプラスミノーゲン活性（例えば、そのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性）を保持した保存的突然変異体若しくはそのフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲン活性を保持した保存的突然変異体若しくはそのフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に示されるようなアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列の保存的置換配列を含む。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンのアミノ酸は配列２、６、８、１０または１２に示される。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に示されるプラスミノーゲンの保存的置換変異体である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンまたはその保存的変異体である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは配列２に示されるヒト天然プラスミノーゲンまたはその保存的変異体である。
【0040】
「プラスミノーゲンを直接活性化できる、若しくはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによってプラスミノーゲンを間接に活性化できる化合物」とは、プラスミノーゲンを直接活性化できる、若しくはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによってプラスミノーゲンを間接に活性化できる任意の化合物を指し、例えば、ｔＰＡ、ｕＰＡ、ストレプトキナーゼ、サルプラーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、アニストレプラーゼ、モンテプラーゼ、ラノテプラーゼ、パミテプラーゼ、及びスタフィロキナーゼが挙げられる。
【0041】
本発明の「線維素溶解阻害剤の拮抗薬」は、線維素溶解阻害剤の作用に拮抗し、その作用を弱め、遮断し、阻止する化合物である。前記線維素溶解阻害剤は、例えば、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミン、及びα２－マクログロブリンである。前記拮抗剤は、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの抗体、または、例えばＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの発現を遮断またはダウンレギュレートするアンチセンスＲＮＡもしくはミニＲＮＡ、または、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンまたはα２－マクログロブリンの結合部位を占めるが、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンまたはα２－マクログロブリンの機能を持たない化合物、または、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの結合ドメイン及び／または活性ドメインをブロックする化合物である。
【0042】
プラスミンはプラスミノゲン活性化系（ＰＡ系）の重要な成分である。それは広スペクトルのプロテアーゼであり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の幾つかの成分を加水分解することができ、これらの成分はフィブリン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン及びプロテオグリカンを含む。また、プラスミンは一部のプロマトリックスメタロプロテアーゼ（ｐｒｏ－ＭＭＰｓ）を活性化させて活性のあるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）にすることができる。そのためプラスミンは細胞外タンパク加水分解作用の一つの重要な上流調節因子である。プラスミンはプラスミノゲンが二種類の生理性のＰＡ：組織型プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）またはウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤（ｕＰＡ）をタンパク質加水分解することで形成されるものである。プラスミノゲンは血漿及び他の体液中において、相対的レベルが比較的高く、従来的にはＰＡ系の調節は主にＰＡｓの合成及び活性レベルよって実現されると考えられている。ＰＡ系成分の合成は異なる要素によって厳格な調節を受け、例えばホルモン、成長因子及びサイトカインである。また、この他に、プラスミンとＰＡｓの特定の生理的阻害剤が存在する。プラスミンの主な阻害剤はα２－抗プラスミン（α２－ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ）である。ＰＡｓの活性は、ｕＰＡとｔＰＡのプラスミノーゲン活性化剤阻害剤－１（ＰＡＩ－１）に同時に阻害され、ｕＰＡを主に阻害するプラスミノーゲン活性化剤阻害剤－２（ＰＡＩ－２）によって調節される。一部の細胞表面には直接加水分解する活性のあるｕＰＡ特異性細胞表面受容体（ｕＰＡＲ）がある。
【0043】
プラスミノゲンは単一鎖の糖タンパクであり、７９１個のアミノ酸からなり、分子量は約９２ｋＤａである。プラスミノゲンは主に肝臓で合成され、大量に細胞外液に存在している。血漿中に含まれるプラスミノゲンの含有量は約２μＭである。そのためプラスミノゲンは組織及び体液中のタンパク質加水分解活性の大きな潜在的な由来である。プラスミノゲンには二種類の分子の形が存在する：グルタミン酸－プラスミノゲン（Ｇｌｕ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）及びリジン－プラスミノゲン（Ｌｙｓ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）である。天然的に分泌され及び分解していない形のプラスミノゲンは一つのアミノ基末端（Ｎ－末端）グルタミン酸を有し、そのためグルタミン酸－プラスミノゲンと称される。しかし、プラスミンが存在する場合、グルタミン酸－プラスミノゲンはＬｙｓ７６－Ｌｙｓ７７においてリジン－プラスミノゲンに加水分解される。グルタミン酸－プラスミノゲンと比較して、リジン－プラスミノゲンはフィブリンとより高い親和力を有し、さらにより高い速度でＰＡsによって活性化されることができる。この二種類の形のプラスミノゲンのＡｒｇ５６０－Ｖａｌ５６１ペプチド結合はｕＰＡまたはｔＰＡによって切断され、これによりジスルフィド結合によって連結された二重鎖プロテアーゼプラスミンの形成をもたらす。プラスミノゲンのアミノ基末端部分は五つの相同三環を含み、即ちいわゆるｋｒｉｎｇｌｅｓであり、カルボキシル基末端部分はプロテアーゼドメインを含む。一部のＫｒｉｎｇｌｅｓはプラスミノゲンとフィブリン及びその阻害剤α２－ＡＰの特異的相互作用を介在するリジン結合部位を含む。最も新しく発見されたプラスミノゲンは３８ｋＤａのフラグメントであり、ｋｒｉｎｇｌｅｌ－４を含み、血管生成の有効的な阻害剤である。このフラグメントはアンギオスタチン(Angiostatin)と命名され、幾つかのプロテアーゼ加水分解プラスミノゲンから生成される。
【0044】
プラスミンの主な基質はフィブリンであり、フィブリンの溶解は病理性血栓の形成を予防するキーポイントである。プラスミンはさらにＥＣＭの幾つかの成分に対する基質特異性を有し、これらの成分はラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びゼラチンを含み、これはプラスミンがＥＣＭ再建において重要な作用を有することを示している。間接的に、プラスミンはさらにＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９を含むいくつかのプロテアーゼ前駆体を活性プロテアーゼに変換することによりＥＣＭのその他の成分を分解する。そのため、プラスミンは細胞外タンパク加水分解の重要な上流調節因子であることを提唱することがある。また、プラスミンはいくつかの潜在的な形の成長因子を活性化させる能力を有する。インビトロで、プラスミンはさらに補体系の成分を加水分解させて走化性の補体フラグメントを放出することができる。
【0045】
「プラスミン」は血液中に存在する非常に重要な酵素であり、フィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ－二量体に加水分解する。
【0046】
「プラスミノーゲン」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ中の配列に基づいて、シグナルペプチドを含む天然ヒト由来プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列４）として計算すれば８１０個のアミノ酸からなり、分子量は約９０ｋＤであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列３に示される通りである。フルサイズのプラスミノーゲンは七つのドメインを含む：Ｃ末端に位置するセリンプロテアーゼドメイン、Ｎ末端に位置するＰａｎ Ａｐｐｌｅ（ＰＡｐ）ドメイン及び５つのＫｒｉｎｇｌｅドメイン（Ｋｒｉｎｇｌｅ１－５）を含む。ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Ｍｅｔ１－Ｇｌｙ１９を含み、ＰＡｐは残基Ｇｌｕ２０－Ｖａｌ９８を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ１は残基Ｃｙｓ１０３－Ｃｙｓ１８１を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ２は残基Ｇｌｕ１８４－Ｃｙｓ２６２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ３は残基Ｃｙｓ２７５－Ｃｙｓ３５２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ４は残基Ｃｙｓ３７７－Ｃｙｓ４５４を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ５は残基Ｃｙｓ４８１－Ｃｙｓ５６０を含む。ＮＣＢＩデータによれば、セリンプロテアーゼドメインは残基Ｖａｌ５８１－Ａｒｇ８０４を含む。
【0047】
Ｇｌｕ－プラスミノーゲンは天然のフルサイズのヒトプラスミノーゲンであり、７９１個のアミノ酸からなる（１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない）。該配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列２に示される通りである。生体内において、さらにＧｌｕ－プラスミノーゲンの７６－７７番目のアミノ酸の位置で加水分解することにより形成されたＬｙｓ－プラスミノーゲンが存在し、例えば配列６に示されるものであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列５が示す通りである。Ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン（δ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はフルサイズのプラスミノーゲンにＫｒｉｎｇｌｅ２－Ｋｒｉｎｇｌｅ５構造の欠損が生じているフラグメントであり、Ｋｒｉｎｇｌｅ１及びセリンプロテアーゼドメインしか含有せず（プロテアーゼドメイン（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ、ＰＤ）とも呼ばれる）、δ－プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列８）を報告している文献があり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は例えば配列７である。ミニプラスミノーゲン（Ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はＫｒｉｎｇｌｅ５及びセリンプロテアーゼドメインからなり、残基Ｖａｌ４４３－Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）について文献が報告しており、そのアミノ酸配列は配列１０に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列９が示す通りである。しかしマイクロプラスミノーゲン（Ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はセリンプロテアーゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ａｌａ５４３－Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基は開始アミノ酸である）と文献が報告し、特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａはそれが残基Ｌｙｓ５３１－Ａｓｎ７９１を含むと開示し（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）、本特許出願において、マイクロプラスミノーゲンの配列は特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａを参照でき、そのアミノ酸配列は配列１２に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１１に示される通りである。
【0048】
全長プラスミノーゲンの構造は、Ａｉｓｉｎａらの論文にも記載されている（Ａｉｓｉｎａ Ｒ Ｂ，Ｍｕｋｈａｍｅｔｏｖａ Ｌ Ｉ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ／ｐｌａｓｍｉｎ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｒｕｓｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，４０（６）：５９０－６０５）。Ａｉｓｉｎａらの前記文章によれば、プラスミノーゲンにはＫｒｉｎｇｌｅ １、２、３、４、５ドメインとセリンプロテアーゼドメイン（プロテアーゼドメイン（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ、ＰＤ）とも呼ばれる）が含まれ、Ｋｒｉｎｇｌｅｓは、プラスミノーゲンが低分子量及び高分子量のリガンドに結合する役割（すなわち、リジン結合活性）を担っており、その結果、プラスミノーゲンがよりオープンな構成に変換され、より活性化しやすくなり、プロテアーゼドメイン（ＰＤ）は、残基Ｖａｌ５６２－Ａｓｎ７９１であり、ｔＰＡとＵＰＡはプラスミノーゲンのＡｒｇ５６１－Ｖａｌ５６２位活性化結合を特異的に切断し、それによってプラスミノーゲンがプラスミンを形成できる。したがって、プロテアーゼドメイン（ＰＤ）は、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を付与する領域である。
【0049】
本発明の「プラスミン」と「フィブリンプラスミン」、「繊維タンパクプラスミン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。「プラスミノーゲン」と「フィブリンプラスミノーゲン」、「繊維タンパクプラスミノーゲン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。
【0050】
本願において、前記プラスミノーゲンの「不足」とは、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より低く、被験者の正常な生理学的機能に影響を及ぼすのに十分に低いことをいう。プラスミノーゲンの「欠乏」の意味は、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より明らかに低く、活性または発現が極微量であり、外部供給によってのみ正常な生理学的機能を維持できることである。
【0051】
当業者は以下のように理解できる。本発明のプラスミノーゲンのすべての技術構成はプラスミンに適用でき、そのため、本発明に記載の技術構成はプラスミノーゲン及びプラスミンをカバーするものである。循環プロセスにおいて、プラスミノーゲンは閉鎖した非活性コンフォメーションをとるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノーゲン活性化剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）の介在下において、開放性のコンフォメーションを有する活性プラスミンとなる。活性を有するプラスミンはさらにフィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ－二量体に加水分解させ、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノーゲンのＰＡｐドメインはプラスミノーゲンを非活性閉鎖コンフォメーションに維持する重要なエピトープを含み、しかしＫＲドメインは受容体及び基質上のリジン残基と結合できるものである。プラスミノーゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ）、カリクレイン及び凝結因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）などを含む。
【0052】
「プラスミノーゲン活性フラグメント」とは、基質のターゲット配列中のリジンに結合する活性（リジン結合活性）フラグメント、またはタンパク質加水分解機能を発揮する活性（タンパク質加水分解活性）フラグメント、またはタンパク質加水分解活性とリジン結合活性との両方を有するフラグメントを指す。本発明のプラスミノーゲンに関する技術構成は、プラスミノーゲンをプラスミノーゲン活性フラグメントに置き換える技術構成を包含する。いくつかの実施形態では、本発明に係るプラスミノーゲン活性フラグメントは、プラスミノーゲンのセリンプロテアーゼドメインを含むか、またはプラスミノーゲンのセリンプロテアーゼドメインからなる。一部の実施形態では、本発明のプラスミノーゲン活性フラグメントは、配列１４を含むか、または配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。一部の実施形態において、本発明のプラスミノーゲン活性フラグメントは、Ｋｒｉｎｇｌｅ １、Ｋｒｉｎｇｌｅ ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ ３、Ｋｒｉｎｇｌｅ ４、及びＫｒｉｎｇｌｅ ５から選択される１つ以上のドメインもしくはその保存的置換変異体を含むか、またはＫｒｉｎｇｌｅ １、Ｋｒｉｎｇｌｅ ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ ３、Ｋｒｉｎｇｌｅ ４、及びＫｒｉｎｇｌｅ ５から選択される１つ以上のドメインまたはその保存的置換変異体からなる。いくつかの実施形態では、本発明に係るプラスミノーゲンは、上記のプラスミノーゲンの活性フラグメントを含むタンパク質を含む。
【0053】
現在、血液中のプラスミノーゲン及びその活性測定方法は組織プラスミノーゲン活性化剤の活性に対する測定（ｔ－ＰＡＡ）、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤抗原に対する測定（ｔ－ＰＡＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性に対する測定（ｐｌｇＡ）、血漿組織プラスミノーゲン抗原に対する測定（ｐｌｇＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害物活性に対する測定、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿プラスミン－抗プラスミン複合物に対する測定（ＰＡＰ）を含む。最もよく見られる測定方法は発色基質法である：測定対象(被験者)の血漿中にストレプトキナーゼ（ＳＫ）と発光基質を添加し、測定対象の血漿中のＰＬＧはＳＫの作用下においてＰＬＭとなり、後者は発光基質に作用し、それから分光光度計で測定し、吸光度の増加はプラスミノーゲンの活性と正比例の関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のプラスミノーゲン活性に対して測定を行うことができる。
【0054】
「オーソログまたはオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは異なる種どうしのホモログであり、タンパク質の相同物もＤＮＡの相同物も含み、直系遺伝子ともいう。それは具体的に異なる種どうしの同じ祖先の遺伝子から進化して得られるタンパク質または遺伝子を言う。本発明のプラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンを含み、さらには異なる種に由来する、プラスミノーゲン活性を有するプラスミノーゲンのオーソログまたはオルソログを含む。
【0055】
「保存的置換バリアント」とはそのうちの一つの所定のアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメーション及び機能を変えないものであり、これは類似の特性（例えば酸性、アルカリ性、疎水性など）のアミノ酸で親タンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性のアルカリ性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいて７０％～９９％の類似性（同一性）を有する。「保存的置換バリアント」はさらにＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムに基づいて６０％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素を含み、７５％以上に達すればさらによく、最も好ましくは８５％以上に達し、さらには９０％以上に達するのが最も好ましく、さらに天然または親タンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。
【0056】
「分離された」プラスミノーゲンとは天然環境から分離及び／または回収されたプラスミノーゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記プラスミノーゲンは（１）９０％を超える、９５％を超える、または９８％を超える純度（重量で計算した場合）になるまで精製し、例えばＬｏｗｒｙ法によって決まるもので、例えば９９％（重量で計算した場合）を超えるまで精製する、（２）少なくともスピニングカップ配列分析装置によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基が得られる程度になるまで精製する、または（３）同質性になるまで精製する。該同質性はクマシーブリリアントブルーまたは銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミノゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって決まるものである。分離されたプラスミノーゲンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造され、さらに少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノーゲンを含む。
【0057】
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書において互いに置き換えて使用でき、いかなる長さのアミノ酸の重合体を指し、遺伝的にコードされた及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されまたは派生したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む。該用語は融合タンパク質を含み、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれに限られず、異種性と同種性由来のリーダー配列（Ｎ端メチオニン残基を有するあるいは有しない）を含む融合物；等々である。
【0058】
参照ペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ（％）」の定義は、必要に応じてギャップを導入することで最大のパーセンテージ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセンテージのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的としたアライメントは本分野の技術範囲における複数種類の方式によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアによって実現できる。当業者は配列をアライメントするための適切なパラメータを決めることができ、該パラメータが比較対象の配列のフルサイズに対して最大比較の要求を実現するための如何なるアルゴリズムも含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセンテージは配列比較コンピュータソフトウエアＡＬＩＧＮ－２により得られるものである。
【0059】
ＡＬＩＧＮ－２を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、所定のアミノ酸配列Ａの所定のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（または所定のアミノ酸配列Ｂに対して、と、またはについてのある％のアミノ酸配列同一性を有する又は含む所定のアミノ酸配列Ａともいう）は以下のように計算される：
分数Ｘ／Ｙ×１００
分数Ｘ／Ｙ×１００
【0060】
ここで、Ｘは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ－２において該プログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである：アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列の同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なる。特に断りのない限り、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値％は前記の段落に記載の通りであり、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムによって得られるものである。
【0061】
本文において使用されているように、用語の「治療」は期待される薬理及び／または生理的効果が得られることを言う。前記効果は疾患またはその症状の発生、発症を完全または一部予防すること、あるいは疾患及び／またはその症状を一部または完全軽減すること、及び／または疾患及び／またはその症状を一部または完全に治癒するものとすることができる。さらに以下を含む：（ａ）疾患が被験者の体内で発生することを予防し、前記被験者は疾患の要因を持っているが、該疾患を有すると診断されていない状況であること；（ｂ）疾患を抑制し、その形成を阻害すること；及び（ｃ）疾患及び／またはその症状を減軽し、即ち疾患及び／またはその症状の減退または消失を引き起こすこと。
【0062】
用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限られない。
【0063】
「治療上有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与して疾患の治療に用いられる際に疾患の前記予防及び／または治療を実現できるプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）の量である。「治療上有効量」は使用するプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）、治療しようとする被験者の疾患及び／または症状の重症度及び年齢、体重などに従って変化するものである。
【0064】
本発明のプラスミノーゲンの調製
プラスミノーゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３－２８４ページ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９－２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ Ａ．２００６Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．６：３－１０及びＣａｍａｒｅｒｏ ＪＡら ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．１２：７２３－８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより小さい不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンとＮ保護を受けている単一のアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と連結する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、その後それを切除する。
プラスミノーゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３－２８４ページ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９－２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ Ａ．２００６Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．６：３－１０及びＣａｍａｒｅｒｏ ＪＡら ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．１２：７２３－８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより小さい不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンとＮ保護を受けている単一のアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と連結する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、その後それを切除する。
【0065】
標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノーゲンを生産する。例えば、プラスミノーゲンをコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、それと発現ベクター中の制御配列を操作可能に連結させる。発現制御配列はプロモーター（例えば天然に関連されているプロモーター、または異種由来のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクター中の真核プロモーターシステムとすることができ、前記ベクターは真核宿主細胞（例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクションさせる。一旦ベクターを適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノーゲンの収集及び精製に適した条件下において宿主を維持する。
【0066】
適切な発現ベクターは通常宿主体内において遊離体または宿主染色体ＤＮＡの組み込む部分として複製される。通常、発現ベクターは選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、インビトロで所望のＤＮＡ配列によって形質転換されたそれらの細胞に対して測定を行うことに有用である。
【0067】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は目的抗体をコードするポリヌクレオチドをクローンするための原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿菌を含み、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と相容する発現制御配列（例えば複製開始点）を含むものである。また、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、β－ラクタマーゼプロモーターシステム、またはファージλ由来のプロモーターシステムである。プロモーターは一般的に発現を制御し、必要に応じて遺伝子配列を制御する場合に、転写及び翻訳を起動するために、さらにリボソームの結合位置配列などを有してもよい。
【0068】
その他の微生物、例えば酵母も発現に用いることができる。酵母（例えばサッカロミセス（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）が適した酵母宿主細胞の例であり、そのうちの適切な担体は必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終止配列など含む。典型的なプロモーターは３－ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘導型酵母プロモーターには特にアルコール脱水素酵素、イソチトクロムＣ、及びマルトースとガラクトースの利用のための酵素由来のプロモーターを含む。
【0069】
微生物以外に、哺乳動物細胞（例えばインビトロ細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞）も本発明の抗－Ｔａｕ抗体（例えばかかる目的抗－Ｔａｕ抗体をコードするポリヌクレオチド）の発現及び生成に用いることができる。例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）参照。適した哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞系、各種Ｃｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマを含む。これらの細胞に用いられる発現ベクターは発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、及び必要とされる加工情報サイト、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなど由来のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照すること。
【0070】
一旦（化学または組み換え的に）合成されれば、本分野の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテイカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動などにより本発明に記載のプラスミノーゲンを精製することができる。該プラスミノーゲンは基本的に純粋なものであり、例えば少なくとも約８０％から８５％の純度で、少なくとも約８５％～９０％の純度で、少なくとも約９０％～９５％の純度で、または９８％～９９％の純度またはさらに純度が高いものであり、例えば汚染物を含まず、前記汚染物は例えば細胞砕片、目的生成物以外の大分子などである。
【0071】
薬物配合剤
所望の純度のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）と必要に応じた薬用担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；ｍ－クレゾール）；低分子量ポリペプチド（約１０個より少ない残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛－タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましい凍結乾燥された抗ＶＥＧＦ抗体製剤は、ＷＯ９７／０４８０１に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
所望の純度のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）と必要に応じた薬用担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；ｍ－クレゾール）；低分子量ポリペプチド（約１０個より少ない残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛－タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましい凍結乾燥された抗ＶＥＧＦ抗体製剤は、ＷＯ９７／０４８０１に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【0072】
本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状の必要とする一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。
【0073】
本発明のプラスミノーゲンは例えば凝集技術または界面重合によって作られるマイクロカプセル中に内包ことができ、例えば、膠質薬物輸送系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル）中に入れまたは粗エマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロースまたはゲルーマイクロカプセル及びポリ―（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【0074】
体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）は必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌濾過膜で濾過することで容易に実現できる。
【0075】
本発明のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）は徐放製剤を調製できる。徐放製剤の適切な実例は一定の形状を有し且つ糖タンパクを含む固体の疎水性重合体の半透過マトリックスを含み、例えば膜またはマイクロカプセルである。徐放性マトリックスの実例はポリエステル、水性ゲル（例えばポリ（２－ヒドロキシエチル－メタアクリル酸エステル）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７－２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８－１０５（１９８２））またはポリ（ビニールアルコール）、ポリラクチド（米国特許３７７３９１９，ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ－グルタミン酸とエチル－Ｌ－グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ，ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７（１９８３）），分解できないエチレン－ビニルアセテート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｖｉｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）（Ｌａｎｇｅｒ，ら，出所は前記と同じ）、または分解可能な乳酸－ヒドロキシ酢酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸－ヒドロキシ酢酸共重合体及びリュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸エステルからなる注射可能なミクロスフェア体）、及びポリＤ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸を含む。重合体、例えばエチレン－酢酸エチル及び乳酸－ヒドロキシ酢酸は、持続的に分子を１００日間以上放出することができ、しかしいくつかの水性ゲルがタンパク質を放出する時間は比較的短い。関連のメカニズムに応じてタンパク質を安定化させる合理的なストラテジーにより設計できる。例えば、凝集のメカニズムが硫化ジスルフィド結合の交換によって分子間Ｓ－Ｓ結合を形成することであれば、メルカプト基残基を修飾することにより、酸性溶液中から凍結乾燥させ、湿度を制御し、適切な添加剤を用いて、及び特定の重合体基質組成物を開発することで安定化を実現できる。
【0076】
投与及び使用量
異なる方式、例えば鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬や点眼薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内（例えば、頸動脈を介して）、筋肉内、及び直腸内投与により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。
異なる方式、例えば鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬や点眼薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内（例えば、頸動脈を介して）、筋肉内、及び直腸内投与により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。
【0077】
胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、食塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガ―デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、または固定油である。静脈内媒介物は液体及び栄養補充物、電気分解補充物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在してもよい。
【0078】
医療関係者は各種臨床的要素により用量案を決めることができる。例えば医学分野で公知のように、任意の患者の用量は複数の要素によって決められ、これらの要素は患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数及び経路、全体の健康度、及び同時に投与するその他の薬物を含む。本発明が含有するプラスミノーゲンの薬物組成物の用量の範囲は例えば被験者体重に対して毎日約０．０００１～２０００ｍｇ／ｋｇであり、または約０．００１～５００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇ，０．７５ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，５０ｍｇ／ｋｇなど）とすることができる。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または５０ｍｇ／ｋｇ体重または１－５０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバーされ、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュール表に従ってに従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量のスケジュール表は連続数日０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ投与することである。本発明の薬物の投与過程において治療効果及び安全性をリアルタイムに評価する必要がある。
【0079】
製品または薬物キット
本発明の一つの実施形態は、プラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）を含む製品または薬物キットに係るものである。前記製品は好ましくひとつの容器、ラベルまたはプロトコールを含む。適切な容器はボトル、バイアル、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）である。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の病症の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びグルコース溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これには例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）の組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示することを含む。
本発明の一つの実施形態は、プラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）を含む製品または薬物キットに係るものである。前記製品は好ましくひとつの容器、ラベルまたはプロトコールを含む。適切な容器はボトル、バイアル、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）である。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の病症の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びグルコース溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これには例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）の組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示することを含む。
【実施例】
【0080】
以下の実施例で使用されるプラスミノーゲン（単にＰＬＧという）は、ヒトドナーの血漿に由来し、以下の文書：ＫｅｎｎｅｔｈＣ Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｌｏｕｉｓ Ｓｕｍｍａｒｉａ，Ｄａｖｉｄ Ｅｌｗｙｎ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｒｔｈｅｒ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６５，２４０（１）：５４１－５５０；Ｓｕｍｍａｒｉａ Ｌ，Ｓｐｉｔｚ Ｆ，Ａｒｚａｄｏｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｇｌｕ－ ａｎｄ Ｌｙｓ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｎｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９７６ Ｊｕｎ ２５；２５１（１２）：３６９３－９；ＨＡＧＡＮ ＪＪ，ＡＢＬＯＮＤＩ ＦＢ，ＤＥ ＲＥＮＺＯ ＥＣ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９６０ Ａｐｒ；２３５：１００５－１０に記載された方法に基づき、プロセスを最適化し、ヒトドナー血漿から精製して得られた。ここでプラスミノーゲン単体は９８％を上回った。
【実施例1】
【0081】
実施例１は、プラスミノーゲンがＰＢＳ緩衝系中でアミロイド（Ａβ）の分解を促進することができることに関するものである。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク対照群、（２）溶媒対照群、（３）プラスミノーゲン群、（４）プラスミノーゲン＋ｔＰＡ群で、各群に４つのチューブを設定した。ブランク対照群には、４３．３μＬの生理食塩水、１６μＬのプラスミノーゲン溶液（０．５７５ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬの超純水、３０．７μＬのＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１００１０－０３１）を添加した；溶媒対照群に４３．３μＬＡβ４０（上海強耀生物科技有限公司（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，）、０４０１００１１５２１、１．０ｍｇ／ｍＬ）、１６μＬ溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、１０μＬ超純水、３０．７μＬＰＢＳ緩衝液を添加した；プラスミノーゲン群に４３．３μＬ Ａβ４０（１．０ｍｇ／ｍＬ）、１６μＬプラスミノーゲン溶液（０．５７５ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬ超純水、３０．７μＬ ＰＢＳ緩衝液を添加した；プラスミノーゲン＋ｔＰＡ群に、４３．３μＬ Ａβ４０（１．０ｍｇ／ｍＬ）、８μＬプラスミノーゲン溶液（１．１５ｍｇ／ｍＬ）、８μＬ ｔＰＡ溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬリジン溶液（０．１ｍＭ）、３０．７μＬ ＰＢＳ緩衝液を添加した。その後、３７℃で３時間インキュベートした後、１００μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１３２０）の説明書に従って、２０％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して１分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで１時間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、１‰のクーマシーブリリアントブルー染色液（１ｇのクーマシーブリリアントブルーＲ２５０を、エタノール：氷酢酸：精製水の体積比が５：２：１３の混合液１０００ｍｌに溶解したもの）に置いて３０分間染色した後、脱色液（精製水：氷酢酸：無水エタノール＝１７：２：１の体積比で混合）を用いてきれいに脱色した。ゲルをイメージングデンシトメーターで定量的にスキャンし、写真を撮った。
アミロイド（Ａβ）の蓄積は、アルツハイマー病の形成における重要な要因であり、そのうち４０及び４２残基を含むＡβ４０及びＡβ４２は、脳の海馬及び線条体に沈着して老人斑を形成し、これがアルツハイマー病の主な原因である［１］。脳脊髄液中のＡβ４０及びＡβ４２の含量検出は、徐々に臨床的アルツハイマー病の生理学的指標になりつつある。
その結果、溶媒対照群のＡβ４０量を１００％として定義し、変化がなく、プラスミノーゲン群では、プラスミノーゲンのみを添加した場合にＡβ４０が部分的に分解され、プラスミノーゲン＋ｔＰＡ群では、プラスミノーゲンとｔＰＡを添加した場合、Ａβ４０のインビトロ分解は明らかであり、溶媒対照群と比較して有意な差があった（＊＊はＰ＜０．０１を表す）（図１）。これは、プラスミノーゲンがＰＢＳ緩衝系中でＡβ４０の分解を促進できることを示している。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク対照群、（２）溶媒対照群、（３）プラスミノーゲン群、（４）プラスミノーゲン＋ｔＰＡ群で、各群に４つのチューブを設定した。ブランク対照群には、４３．３μＬの生理食塩水、１６μＬのプラスミノーゲン溶液（０．５７５ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬの超純水、３０．７μＬのＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１００１０－０３１）を添加した；溶媒対照群に４３．３μＬＡβ４０（上海強耀生物科技有限公司（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，）、０４０１００１１５２１、１．０ｍｇ／ｍＬ）、１６μＬ溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、１０μＬ超純水、３０．７μＬＰＢＳ緩衝液を添加した；プラスミノーゲン群に４３．３μＬ Ａβ４０（１．０ｍｇ／ｍＬ）、１６μＬプラスミノーゲン溶液（０．５７５ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬ超純水、３０．７μＬ ＰＢＳ緩衝液を添加した；プラスミノーゲン＋ｔＰＡ群に、４３．３μＬ Ａβ４０（１．０ｍｇ／ｍＬ）、８μＬプラスミノーゲン溶液（１．１５ｍｇ／ｍＬ）、８μＬ ｔＰＡ溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬリジン溶液（０．１ｍＭ）、３０．７μＬ ＰＢＳ緩衝液を添加した。その後、３７℃で３時間インキュベートした後、１００μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１３２０）の説明書に従って、２０％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して１分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで１時間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、１‰のクーマシーブリリアントブルー染色液（１ｇのクーマシーブリリアントブルーＲ２５０を、エタノール：氷酢酸：精製水の体積比が５：２：１３の混合液１０００ｍｌに溶解したもの）に置いて３０分間染色した後、脱色液（精製水：氷酢酸：無水エタノール＝１７：２：１の体積比で混合）を用いてきれいに脱色した。ゲルをイメージングデンシトメーターで定量的にスキャンし、写真を撮った。
アミロイド（Ａβ）の蓄積は、アルツハイマー病の形成における重要な要因であり、そのうち４０及び４２残基を含むＡβ４０及びＡβ４２は、脳の海馬及び線条体に沈着して老人斑を形成し、これがアルツハイマー病の主な原因である［１］。脳脊髄液中のＡβ４０及びＡβ４２の含量検出は、徐々に臨床的アルツハイマー病の生理学的指標になりつつある。
その結果、溶媒対照群のＡβ４０量を１００％として定義し、変化がなく、プラスミノーゲン群では、プラスミノーゲンのみを添加した場合にＡβ４０が部分的に分解され、プラスミノーゲン＋ｔＰＡ群では、プラスミノーゲンとｔＰＡを添加した場合、Ａβ４０のインビトロ分解は明らかであり、溶媒対照群と比較して有意な差があった（＊＊はＰ＜０．０１を表す）（図１）。これは、プラスミノーゲンがＰＢＳ緩衝系中でＡβ４０の分解を促進できることを示している。
【実施例2】
【0082】
実施例２は、プラスミノーゲンがウサギ脳脊髄液中のアミロイド（Ａβ）分解を促進できることに関するものである。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク対照群、（２）溶媒対照群、（３）プラスミノーゲン群で、各群に４つのチューブを設定した。ブランク対照群には、４３．３μＬの生理食塩水、１６μＬのプラスミノーゲン溶液（０．５７５ｍｇ／ｍＬ）、４０.７μＬのウサギ脳脊髄液を添加した；溶媒対照群に４３．３μＬ Ａβ４０（上海強耀生物科技有限公司（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，）、０４０１００１１５２１、１．０ｍｇ／ｍＬ）、１６μＬ溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、４０.７μＬのウサギ脳脊髄液を添加した；プラスミノーゲン群に４３．３μＬ Ａβ４０（１．０ｍｇ／ｍＬ）、１６μＬプラスミノーゲン溶液（０．５７５ｍｇ／ｍＬ）、４０.７μＬのウサギ脳脊髄液を添加した。その後、３７℃で３時間インキュベートした後、１００μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１３２０）の説明書に従って、２０％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して１分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで１時間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、１‰のクーマシーブリリアントブルー染色液（１ｇのクーマシーブリリアントブルーＲ２５０を、エタノール：氷酢酸：精製水の体積比が５：２：１３の混合液１０００ｍｌに溶解した）に置いて３０分間染色した後、脱色液（精製水：氷酢酸：無水エタノール＝１７：２：１の体積比で混合）を用いてきれいに脱色した。ゲルをイメージングデンシトメーターで定量的にスキャンし、写真を撮った。
その結果、溶媒対照群のＡβ４０の量を１００％と定義し、変化がなく、プラスミノーゲン群では、プラスミノーゲンのみを添加した場合にＡβ４０が部分的に分解され、７４．８１％に分解された（図２）。これは、プラスミノーゲンがウサギの脳脊髄液中のＡβ４０の分解を促進できることを示している。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク対照群、（２）溶媒対照群、（３）プラスミノーゲン群で、各群に４つのチューブを設定した。ブランク対照群には、４３．３μＬの生理食塩水、１６μＬのプラスミノーゲン溶液（０．５７５ｍｇ／ｍＬ）、４０.７μＬのウサギ脳脊髄液を添加した；溶媒対照群に４３．３μＬ Ａβ４０（上海強耀生物科技有限公司（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，）、０４０１００１１５２１、１．０ｍｇ／ｍＬ）、１６μＬ溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、４０.７μＬのウサギ脳脊髄液を添加した；プラスミノーゲン群に４３．３μＬ Ａβ４０（１．０ｍｇ／ｍＬ）、１６μＬプラスミノーゲン溶液（０．５７５ｍｇ／ｍＬ）、４０.７μＬのウサギ脳脊髄液を添加した。その後、３７℃で３時間インキュベートした後、１００μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１３２０）の説明書に従って、２０％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して１分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで１時間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、１‰のクーマシーブリリアントブルー染色液（１ｇのクーマシーブリリアントブルーＲ２５０を、エタノール：氷酢酸：精製水の体積比が５：２：１３の混合液１０００ｍｌに溶解した）に置いて３０分間染色した後、脱色液（精製水：氷酢酸：無水エタノール＝１７：２：１の体積比で混合）を用いてきれいに脱色した。ゲルをイメージングデンシトメーターで定量的にスキャンし、写真を撮った。
その結果、溶媒対照群のＡβ４０の量を１００％と定義し、変化がなく、プラスミノーゲン群では、プラスミノーゲンのみを添加した場合にＡβ４０が部分的に分解され、７４．８１％に分解された（図２）。これは、プラスミノーゲンがウサギの脳脊髄液中のＡβ４０の分解を促進できることを示している。
【実施例3】
【0083】
実施例３は、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデル及び正常マウスの脳ホモジネートにおいて、ヒトアミロイドＡβ４０の分解を促進することに関するものである。
１１週齢のＢ６ＳＪＬＴｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ、ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（ＦＡＤ）（ストック番号：０３４８４０）（ＦＡＤと略称）及びＣ５７ＢＬ／６（正常）マウス４匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってからＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブに置いて、１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｐＨ７．４；１００１０－０３１）を１５０ｍｇ組織／ｍＬ ＰＢＳで加え、４℃でホモジナイズし（１分／回、３～４回）、ホモジナイズ後、４℃（１２０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）で遠心分離し、上清の脳ホモジネートを新しいＥＰチューブに移した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク対照群、（２）溶媒対照群、（３）プラスミノーゲン群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ａβ４０（上海強耀生物科技有限公司（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，）、０４０１００１１５２１、１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬ溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン群に２１.５ｍＬ Ａβ４０（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１３２０）の説明書に従って、２０％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して１分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで１時間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、１‰のクーマシーブリリアントブルー染色液（１ｇのクーマシーブリリアントブルーＲ２５０を、エタノール：氷酢酸：精製水の体積比が５：２：１３の混合液１０００ｍｌに溶解した）に置いて３０分間染色した後、脱色液（精製水：氷酢酸：無水エタノール＝１７：２：１の体積比で混合）を用いてきれいに脱色した。ゲルを生体分子イメージャーで写真を撮って定量的にスキャンした。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のヒトアミロイドＡβ４０量は溶媒対照群に比べて有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１＝を表す）；正常なマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のアミロイドＡβ４０の量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は極めて有意であった（Ｐ＝０．００１）（図３）。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデル及び正常マウスの脳ホモジネートにおいて、ヒトアミロイドＡβ４０の分解を効果的に促進できることを示している。
１１週齢のＢ６ＳＪＬＴｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ、ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（ＦＡＤ）（ストック番号：０３４８４０）（ＦＡＤと略称）及びＣ５７ＢＬ／６（正常）マウス４匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってからＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブに置いて、１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｐＨ７．４；１００１０－０３１）を１５０ｍｇ組織／ｍＬ ＰＢＳで加え、４℃でホモジナイズし（１分／回、３～４回）、ホモジナイズ後、４℃（１２０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）で遠心分離し、上清の脳ホモジネートを新しいＥＰチューブに移した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク対照群、（２）溶媒対照群、（３）プラスミノーゲン群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ａβ４０（上海強耀生物科技有限公司（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，）、０４０１００１１５２１、１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬ溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン群に２１.５ｍＬ Ａβ４０（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１３２０）の説明書に従って、２０％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して１分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで１時間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、１‰のクーマシーブリリアントブルー染色液（１ｇのクーマシーブリリアントブルーＲ２５０を、エタノール：氷酢酸：精製水の体積比が５：２：１３の混合液１０００ｍｌに溶解した）に置いて３０分間染色した後、脱色液（精製水：氷酢酸：無水エタノール＝１７：２：１の体積比で混合）を用いてきれいに脱色した。ゲルを生体分子イメージャーで写真を撮って定量的にスキャンした。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のヒトアミロイドＡβ４０量は溶媒対照群に比べて有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１＝を表す）；正常なマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のアミロイドＡβ４０の量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は極めて有意であった（Ｐ＝０．００１）（図３）。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデル及び正常マウスの脳ホモジネートにおいて、ヒトアミロイドＡβ４０の分解を効果的に促進できることを示している。
【実施例4】
【0084】
実施例４は、アルツハイマー病モデル及び正常マウス脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲンがヒトアミロイドＡβ４２の分解を促進することに関するものである。
１１週齢のＢ６ＳＪＬＴｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ、ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（ＦＡＤ）（在庫番号：０３４８４０）（ＦＡＤと略称）及びＣ５７ＢＬ／６（正常）マウス４匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってからＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブに置いて、１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｐＨ７．４；１００１０－０３１）を１５０ｍｇ組織／ｍＬ ＰＢＳで加え、４℃でホモジナイズし（１分／回、３～４回）、ホモジナイズ後、４℃（１２０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）で遠心分離し、上清の脳ホモジネートを新しいＥＰチューブに移した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク対照群、（２）溶媒対照群、（３）プラスミノーゲン群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ａβ４２（上海強耀生物科技有限公司（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，）、０４０１００１１５２６、１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬ溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン群に２１.５ｍＬ Ａβ４２（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１３２０）の説明書に従って、２０％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して１分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで１時間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、１‰のクーマシーブリリアントブルー染色液（１ｇのクーマシーブリリアントブルーＲ２５０を、エタノール：氷酢酸：精製水の体積比が５：２：１３の混合液１０００ｍｌに溶解した）に置いて３０分間染色した後、脱色液（精製水：氷酢酸：無水エタノール＝１７：２：１の体積比で混合）を用いてきれいに脱色した。ゲルを生体分子イメージャーで写真を撮って定量的にスキャンした。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のアミロイドＡβ４２の量が溶媒対照群よりも低く、重合体ａ、ｂ、ｃの量はいずれも溶媒群より有意に低く、その差は極めて有意であった（＊はＰ＜０.０５を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１＝を表す）；正常なマウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン群のアミロイドＡβ４２の量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であり（＊＊＊はＰ＜０．００１＝を表す）、重合体ａ、ｂ、ｃの量はいずれも溶媒群より低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１＝を表す（図４））。これは、プラスミノーゲンが、ＦＡＤ及び正常なマウスの脳ホモジネートにおいて、ヒトアミロイドＡβ４２及びその重合体の分解を効果的に促進できることを示している。
１１週齢のＢ６ＳＪＬＴｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ、ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（ＦＡＤ）（在庫番号：０３４８４０）（ＦＡＤと略称）及びＣ５７ＢＬ／６（正常）マウス４匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってからＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブに置いて、１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｐＨ７．４；１００１０－０３１）を１５０ｍｇ組織／ｍＬ ＰＢＳで加え、４℃でホモジナイズし（１分／回、３～４回）、ホモジナイズ後、４℃（１２０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）で遠心分離し、上清の脳ホモジネートを新しいＥＰチューブに移した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク対照群、（２）溶媒対照群、（３）プラスミノーゲン群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ａβ４２（上海強耀生物科技有限公司（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，）、０４０１００１１５２６、１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬ溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン群に２１.５ｍＬ Ａβ４２（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１３２０）の説明書に従って、２０％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して１分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで１時間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、１‰のクーマシーブリリアントブルー染色液（１ｇのクーマシーブリリアントブルーＲ２５０を、エタノール：氷酢酸：精製水の体積比が５：２：１３の混合液１０００ｍｌに溶解した）に置いて３０分間染色した後、脱色液（精製水：氷酢酸：無水エタノール＝１７：２：１の体積比で混合）を用いてきれいに脱色した。ゲルを生体分子イメージャーで写真を撮って定量的にスキャンした。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のアミロイドＡβ４２の量が溶媒対照群よりも低く、重合体ａ、ｂ、ｃの量はいずれも溶媒群より有意に低く、その差は極めて有意であった（＊はＰ＜０.０５を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１＝を表す）；正常なマウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン群のアミロイドＡβ４２の量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であり（＊＊＊はＰ＜０．００１＝を表す）、重合体ａ、ｂ、ｃの量はいずれも溶媒群より低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１＝を表す（図４））。これは、プラスミノーゲンが、ＦＡＤ及び正常なマウスの脳ホモジネートにおいて、ヒトアミロイドＡβ４２及びその重合体の分解を効果的に促進できることを示している。
【実施例5】
【0085】
実施例５は、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデルマウスの記憶機能の回復を促進することに関するものである。
Ｂ６ＳＪＬ－Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊ Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（ＦＡＤと略称）（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂから購入、カタログ番号：０３４８４０）マウスは、アルツハイマー病の研究に一般的に使用されるトランスジェニックモデルマウスである。１２週齢のＦＡＤメスマウス１２匹を取り、体重の結果により溶媒群と投与群の２群にランダムに分け、各群で６匹とし、ＳＪＬＢ６（在庫番号：１００１２）メスマウス６匹を正常な対照群として選択した。投与群のマウスに１ｍｌ／０.１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群のマウスには同量の溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を静脈注射により投与し、５日間連続投与した。正常対照群のマウスには投与をしなかった。投与開始日を１日目とし、６日目にＹ迷路自発交替行動実験を行った。Ｙ迷路は、３つの同じのアームで構成されている。各アームの端には餌供給装置があり、動物の餌獲得戦略、すなわち、各アームに入る回数、時間、正しい回数、間違った回数、ルートなどのパラメーターを分析することで、実験動物の空間記憶能力が反映され、これは現在では学習及び記憶機能の評価に一般的に使用されている。この実験は齧歯類の新しい環境の探索特性を利用する。動物は前の記憶に頼って正しいアームエントリを選択しなければならない。これは、動物の空間作業記憶能力を効果的に評価することができる。実験中、動物を片方のアームの末端に置き、数分間自由に探索させ、一定期間後、正式なテストのために動物を再び迷路に入れた。動物が各アームに入った順序及び合計回数を記録し、異なるアーム（例えば、１，２，３または１，３，２）に連続して入った場合、それは１回の正しい交替（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）行動として記録した。動物を一方のアームの端に置き、動物が各アームに入る順序を８分間記録した。
最大交替回数は、アームエントリ回数の合計－２であり、割合＝実交替回数／最大交替回数×１００％を計算し、最終的に与えられる値には、実交替回数、最大交替回数、両者の割合、動物の移動総距離及び総アーム進入回数が含まれる［２］。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知障害、神経変性、β－アミロイド沈着、神経原線維変化、及び神経炎症を特徴とする、潜行性に発症する進行性の神経変性疾患である［３］。ＦＡＤトランスジェニックマウスは、ＡＤ治療薬の開発に一般的に使用されるモデル動物である。
自発的交替行動率
自発的交替行動率は、実交替と最大交替×１００％との比である。その結果、正常な対照マウスと比較して、溶媒群のマウスの自発的交替行動率が有意に増加し、投与群マウスの自発的交替行動率が溶媒対照群よりも有意に低く、統計的差は有意であり（＊はＰ＜０．０５を示す）、正常な対照マウスに近かった（図５）。
アームエントリの総回数
アームエントリの総回数とは、指定時間内にマウスがアームに進入した回数の合計である。その結果、正常対照群のマウスと比較して、溶媒群のマウスの総アーム進入回数は有意に減少し、投与群のマウスの総アーム進入回数は、溶媒対照群のマウスより有意に多く、統計的差は有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、正常対照マウスに近かった（図６）。
総運動距離
総移動距離は、指定された時間内のマウスの移動軌跡の合計の長さを指す。その結果、正常対照マウスと比較して、溶媒群のマウスの総移動距離は有意に減少し、投与群のマウスの総移動距離は溶媒対照群のマウスよりも有意に長く、統計的差異は有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、正常対照マウスにより近かった（図７）。
上記の結果は、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデルマウスにおける自発交替行動の回復及び記憶の回復を促進できることを示している。
Ｂ６ＳＪＬ－Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊ Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（ＦＡＤと略称）（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂから購入、カタログ番号：０３４８４０）マウスは、アルツハイマー病の研究に一般的に使用されるトランスジェニックモデルマウスである。１２週齢のＦＡＤメスマウス１２匹を取り、体重の結果により溶媒群と投与群の２群にランダムに分け、各群で６匹とし、ＳＪＬＢ６（在庫番号：１００１２）メスマウス６匹を正常な対照群として選択した。投与群のマウスに１ｍｌ／０.１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群のマウスには同量の溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を静脈注射により投与し、５日間連続投与した。正常対照群のマウスには投与をしなかった。投与開始日を１日目とし、６日目にＹ迷路自発交替行動実験を行った。Ｙ迷路は、３つの同じのアームで構成されている。各アームの端には餌供給装置があり、動物の餌獲得戦略、すなわち、各アームに入る回数、時間、正しい回数、間違った回数、ルートなどのパラメーターを分析することで、実験動物の空間記憶能力が反映され、これは現在では学習及び記憶機能の評価に一般的に使用されている。この実験は齧歯類の新しい環境の探索特性を利用する。動物は前の記憶に頼って正しいアームエントリを選択しなければならない。これは、動物の空間作業記憶能力を効果的に評価することができる。実験中、動物を片方のアームの末端に置き、数分間自由に探索させ、一定期間後、正式なテストのために動物を再び迷路に入れた。動物が各アームに入った順序及び合計回数を記録し、異なるアーム（例えば、１，２，３または１，３，２）に連続して入った場合、それは１回の正しい交替（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）行動として記録した。動物を一方のアームの端に置き、動物が各アームに入る順序を８分間記録した。
最大交替回数は、アームエントリ回数の合計－２であり、割合＝実交替回数／最大交替回数×１００％を計算し、最終的に与えられる値には、実交替回数、最大交替回数、両者の割合、動物の移動総距離及び総アーム進入回数が含まれる［２］。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知障害、神経変性、β－アミロイド沈着、神経原線維変化、及び神経炎症を特徴とする、潜行性に発症する進行性の神経変性疾患である［３］。ＦＡＤトランスジェニックマウスは、ＡＤ治療薬の開発に一般的に使用されるモデル動物である。
自発的交替行動率
自発的交替行動率は、実交替と最大交替×１００％との比である。その結果、正常な対照マウスと比較して、溶媒群のマウスの自発的交替行動率が有意に増加し、投与群マウスの自発的交替行動率が溶媒対照群よりも有意に低く、統計的差は有意であり（＊はＰ＜０．０５を示す）、正常な対照マウスに近かった（図５）。
アームエントリの総回数
アームエントリの総回数とは、指定時間内にマウスがアームに進入した回数の合計である。その結果、正常対照群のマウスと比較して、溶媒群のマウスの総アーム進入回数は有意に減少し、投与群のマウスの総アーム進入回数は、溶媒対照群のマウスより有意に多く、統計的差は有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、正常対照マウスに近かった（図６）。
総運動距離
総移動距離は、指定された時間内のマウスの移動軌跡の合計の長さを指す。その結果、正常対照マウスと比較して、溶媒群のマウスの総移動距離は有意に減少し、投与群のマウスの総移動距離は溶媒対照群のマウスよりも有意に長く、統計的差異は有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、正常対照マウスにより近かった（図７）。
上記の結果は、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデルマウスにおける自発交替行動の回復及び記憶の回復を促進できることを示している。
【実施例6】
【0086】
実施例６は、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの大脳皮質におけるＡβ４２沈着を減少させることに関するものである。
８週齢のＣ５７オスマウス２０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重によって異常なマウスを除外した後、すべてのマウスを溶媒群と投与群の２つの群にランダムに分け、各群１０匹とした。すべてのマウスを麻酔し、マウスの定位アトラスに従って海馬の顆粒球層に位置付けし（前ハロゲンポイントの座標に従って位置付け：ＡＰ－２．０ｍｍ、ＭＬ±１．５ｍｍ、ＤＶ２．０ｍｍ）、各マウスの両側にゆっくりと微量注入し、注入速度は０．５μＬ／分、注入量は３μＬで、アルツハイマーモデル［３］を構築するために、モデル群のマウスにＡβ１－４２オリゴマー溶液を注入し、モデル対照群のマウスにＰＢＳ溶液を注入した。Ａβ１－４２オリゴマー溶液（１０μＭ）の調製：β－アミロイド（１－４２）（上海強耀生物科技有限公司（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，）、０４０１００１１５２１）を取り、冷ヘキサフルオロイソプロパノールを加え、濃度を１ｍｇ／ｍｌにし、室温で３日間置いた後、４５μＬ／チューブ、すなわち１０ｎｍｏｌ／ｍＬに分注し、ドラフト内に一晩置き、２５℃の乾燥オーブンに１時間乾燥してから－８０℃で保存した。使用時は各チューブにジメチルスルホキシド溶液１０μｌを加えて溶解し、注入時は滅菌ＰＢＳ溶液９９０μＬを加え、４℃で２４時間静置してから使用した。脳局在注射２１日後、溶媒群及び投与群のマウスに投与を開始し、これを１日目とし、投与群のマウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群のマウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を尾静脈注射により投与し、２８日間連続して投与した。２９日目にマウスを殺処分し、脳を採取して１０％ホルムアルデヒドで２４～４８時間固定した。固定された脳組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。黒質を位置付けし、切片の厚さは４μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスＡβ４２抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２０１０６０）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
β－アミロイド（アミロイドβタンパク質、Ａβ）の神経毒性効果は、アルツハイマー病の進行において主要な役割を果たす［４］。
その結果、溶媒群（図８Ａ）のマウスの大脳皮質におけるＡβ４２の沈着レベルは、投与群よりも有意に高く（図８Ｂ）、光学密度の定量分析結果の統計的差は有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図８Ｃ）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの大脳皮質におけるＡβ４２の沈着を減少させることができることを示唆している。
８週齢のＣ５７オスマウス２０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重によって異常なマウスを除外した後、すべてのマウスを溶媒群と投与群の２つの群にランダムに分け、各群１０匹とした。すべてのマウスを麻酔し、マウスの定位アトラスに従って海馬の顆粒球層に位置付けし（前ハロゲンポイントの座標に従って位置付け：ＡＰ－２．０ｍｍ、ＭＬ±１．５ｍｍ、ＤＶ２．０ｍｍ）、各マウスの両側にゆっくりと微量注入し、注入速度は０．５μＬ／分、注入量は３μＬで、アルツハイマーモデル［３］を構築するために、モデル群のマウスにＡβ１－４２オリゴマー溶液を注入し、モデル対照群のマウスにＰＢＳ溶液を注入した。Ａβ１－４２オリゴマー溶液（１０μＭ）の調製：β－アミロイド（１－４２）（上海強耀生物科技有限公司（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，）、０４０１００１１５２１）を取り、冷ヘキサフルオロイソプロパノールを加え、濃度を１ｍｇ／ｍｌにし、室温で３日間置いた後、４５μＬ／チューブ、すなわち１０ｎｍｏｌ／ｍＬに分注し、ドラフト内に一晩置き、２５℃の乾燥オーブンに１時間乾燥してから－８０℃で保存した。使用時は各チューブにジメチルスルホキシド溶液１０μｌを加えて溶解し、注入時は滅菌ＰＢＳ溶液９９０μＬを加え、４℃で２４時間静置してから使用した。脳局在注射２１日後、溶媒群及び投与群のマウスに投与を開始し、これを１日目とし、投与群のマウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群のマウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を尾静脈注射により投与し、２８日間連続して投与した。２９日目にマウスを殺処分し、脳を採取して１０％ホルムアルデヒドで２４～４８時間固定した。固定された脳組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。黒質を位置付けし、切片の厚さは４μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスＡβ４２抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２０１０６０）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
β－アミロイド（アミロイドβタンパク質、Ａβ）の神経毒性効果は、アルツハイマー病の進行において主要な役割を果たす［４］。
その結果、溶媒群（図８Ａ）のマウスの大脳皮質におけるＡβ４２の沈着レベルは、投与群よりも有意に高く（図８Ｂ）、光学密度の定量分析結果の統計的差は有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図８Ｃ）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの大脳皮質におけるＡβ４２の沈着を減少させることができることを示唆している。
【実施例7】
【0087】
実施例７は、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデルマウスの脳組織のＡβ４２レベルを低下させることに関するものである。
Ｂ６ＳＪＬ－Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘマウス（カタログ番号：０３４８４０、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）とＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを一回戻し交配させて子孫（Ｂ６－Ｆ１－ＦＡＤと呼ぶ）を繁殖させた。１６～１７週齢のメスＢ６－Ｆ１－ＦＡＤマウス１８匹及び９週齢のメスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス９匹を取った。Ｂ６－Ｆ１－ＦＡＤは、体重及びＹ迷路試験の結果に応じて、溶媒群と投与群の２つの群にランダムに分け、各群９匹とした。９匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊをブランク対照群として使用した。群分けが完了した後、ブランク対照群のマウスと溶媒群のマウスに溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を尾静脈注射により投与し、各マウスの注射量は５ｍｌ／ｋｇであった。投与群のマウスにはプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、各マウスに５０ｍｇ／ｋｇの用量で８日間連続して注射した。投与後の５日後、ブランク群、溶媒群、投与群からそれぞれ７匹、７匹、６匹のマウスをランダムに選んで殺処分し、脳組織を採取し、４℃でホモジナイズし、上清であるホモジネートを取ってＢＣＡ法による総タンパク質濃度の検出及びウェスタンブロット検出を行った。
Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１３２０）の説明書に従って、１６.５％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で均一に混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、１００μｇの総タンパク質を採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで１.５時間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ抗マウスＡβ４２抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０１０６０）を加えて室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊで定量的に分析した。
その結果、ブランク対照群のマウスの脳ホモジネートには一定レベルのＡβ４２タンパク質が存在し、溶媒群のマウスの脳組織におけるＡβ４２のレベルは、投与群のマウスよりも有意に高く、統計Ｐ値は０．０９であった（図９）。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデルマウスの脳組織におけるＡβ４２のレベルを低下させることができることを示している。
Ｂ６ＳＪＬ－Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘマウス（カタログ番号：０３４８４０、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）とＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを一回戻し交配させて子孫（Ｂ６－Ｆ１－ＦＡＤと呼ぶ）を繁殖させた。１６～１７週齢のメスＢ６－Ｆ１－ＦＡＤマウス１８匹及び９週齢のメスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス９匹を取った。Ｂ６－Ｆ１－ＦＡＤは、体重及びＹ迷路試験の結果に応じて、溶媒群と投与群の２つの群にランダムに分け、各群９匹とした。９匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊをブランク対照群として使用した。群分けが完了した後、ブランク対照群のマウスと溶媒群のマウスに溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を尾静脈注射により投与し、各マウスの注射量は５ｍｌ／ｋｇであった。投与群のマウスにはプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、各マウスに５０ｍｇ／ｋｇの用量で８日間連続して注射した。投与後の５日後、ブランク群、溶媒群、投与群からそれぞれ７匹、７匹、６匹のマウスをランダムに選んで殺処分し、脳組織を採取し、４℃でホモジナイズし、上清であるホモジネートを取ってＢＣＡ法による総タンパク質濃度の検出及びウェスタンブロット検出を行った。
Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１３２０）の説明書に従って、１６.５％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で均一に混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、１００μｇの総タンパク質を採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで１.５時間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ抗マウスＡβ４２抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０１０６０）を加えて室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊで定量的に分析した。
その結果、ブランク対照群のマウスの脳ホモジネートには一定レベルのＡβ４２タンパク質が存在し、溶媒群のマウスの脳組織におけるＡβ４２のレベルは、投与群のマウスよりも有意に高く、統計Ｐ値は０．０９であった（図９）。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデルマウスの脳組織におけるＡβ４２のレベルを低下させることができることを示している。
【実施例8】
【0088】
実施例８は、プラスミノーゲンが、正常なマウスの脳ホモジネートにおいてＴａｕタンパク質の分解を促進することに関するものである。
１１～１２週齢の１８～２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス４匹を選択し、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｐＨ７．４；１００１０－０３１）を１５０ｍｇ組織／ｍＬ ＰＢＳで加え、４℃でホモジナイズし（１分／回、３～４回）、ホモジナイズ後、４℃（１２０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）で遠心分離し、上清の脳ホモジネートを新しいＥＰチューブに移した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク群、（２）ブランク対照群、（３）溶媒対照群、（４）プラスミノーゲン群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬの溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（０.５ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ｔａｕタンパク質溶液（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１０６３６－８，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４．６μＬの溶媒溶液、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン群に２１.５μＬのＴａｕタンパク質溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（０.５ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キットの説明書に従って、１０％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで４５分間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ由来Ｔａｕタンパク質抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５１５５９）を加えて室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊで定量的に分析した。
Ｔａｕタンパク質は、最も豊富な微小管関連タンパク質である。Ｔａｕタンパク質はリン酸基含有タンパク質であり、正常な成熟脳のＴａｕタンパク質分子には２～３個のリン酸基が含まれている。アルツハイマー病（老年性認知症）患者の脳内のＴａｕタンパク質は異常に過剰リン酸化されており、Ｔａｕタンパク質の各分子は５～９個のリン酸基を含み得、正常な生物学的機能を失う可能性がある［５］。
その結果、正常なマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のＴａｕタンパク質の量が溶媒対照群よりも有意に低く、その差は有意であった（＊はＰ＜００５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）（図１０）。これは、プラスミノーゲンが、正常なマウスの脳ホモジネートにおけるＴａｕタンパク質の分解を促進できることを示唆している。
１１～１２週齢の１８～２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス４匹を選択し、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｐＨ７．４；１００１０－０３１）を１５０ｍｇ組織／ｍＬ ＰＢＳで加え、４℃でホモジナイズし（１分／回、３～４回）、ホモジナイズ後、４℃（１２０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）で遠心分離し、上清の脳ホモジネートを新しいＥＰチューブに移した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク群、（２）ブランク対照群、（３）溶媒対照群、（４）プラスミノーゲン群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬの溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（０.５ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ｔａｕタンパク質溶液（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１０６３６－８，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４．６μＬの溶媒溶液、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン群に２１.５μＬのＴａｕタンパク質溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（０.５ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キットの説明書に従って、１０％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで４５分間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ由来Ｔａｕタンパク質抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５１５５９）を加えて室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊで定量的に分析した。
Ｔａｕタンパク質は、最も豊富な微小管関連タンパク質である。Ｔａｕタンパク質はリン酸基含有タンパク質であり、正常な成熟脳のＴａｕタンパク質分子には２～３個のリン酸基が含まれている。アルツハイマー病（老年性認知症）患者の脳内のＴａｕタンパク質は異常に過剰リン酸化されており、Ｔａｕタンパク質の各分子は５～９個のリン酸基を含み得、正常な生物学的機能を失う可能性がある［５］。
その結果、正常なマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のＴａｕタンパク質の量が溶媒対照群よりも有意に低く、その差は有意であった（＊はＰ＜００５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）（図１０）。これは、プラスミノーゲンが、正常なマウスの脳ホモジネートにおけるＴａｕタンパク質の分解を促進できることを示唆している。
【実施例9】
【0089】
実施例９は、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病マウスの脳ホモジネートにおいてＴａｕタンパク質の分解を促進することに関するものである。
１１週齢のＢ６ＳＪＬＴｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（ＦＡＤ）（在庫番号：０３４８４０）（ＦＡＤと略称）マウス４匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから実施例８のように脳ホモジネートを調製してＥＰチューブに置いた。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク群、（２）ブランク対照群、（３）溶媒対照群、（４）プラスミノーゲン群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬの溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（０.５ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ｔａｕ（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１０６３６－８，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４．６μＬの溶媒溶液、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン群に２１.５μＬのＴａｕ（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（０.５ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キットの説明書に従って、１０％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで４５分間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ由来Ｔａｕタンパク質抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５１５５９）を加えて室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊで定量的に分析した。
その結果、アルツハイマー病マウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のＴａｕタンパク質の量が溶媒対照群よりも有意に低く、その差は統計的に有意であった（＊はＰ＜００５、＊＊はＰ＜０．０１を表す）（図１１）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病マウスの脳ホモジネートのＴａｕタンパク質の分解を促進できることを示唆している。
１１週齢のＢ６ＳＪＬＴｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（ＦＡＤ）（在庫番号：０３４８４０）（ＦＡＤと略称）マウス４匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから実施例８のように脳ホモジネートを調製してＥＰチューブに置いた。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク群、（２）ブランク対照群、（３）溶媒対照群、（４）プラスミノーゲン群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬの溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（０.５ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ｔａｕ（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１０６３６－８，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４．６μＬの溶媒溶液、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン群に２１.５μＬのＴａｕ（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（０.５ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キットの説明書に従って、１０％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで４５分間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ由来Ｔａｕタンパク質抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５１５５９）を加えて室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊで定量的に分析した。
その結果、アルツハイマー病マウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のＴａｕタンパク質の量が溶媒対照群よりも有意に低く、その差は統計的に有意であった（＊はＰ＜００５、＊＊はＰ＜０．０１を表す）（図１１）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病マウスの脳ホモジネートのＴａｕタンパク質の分解を促進できることを示唆している。
【実施例10】
【0090】
実施例１０は、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデルマウスの脳組織のＴａｕタンパク質レベルを低下させることに関するものである。
Ｂ６ＳＪＬ－Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘマウス（カタログ番号：０３４８４０、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）とＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを３回戻し交配させて子孫（Ｂ６－Ｆ３－ＦＡＤと呼ぶ）を繁殖させた。２０～２５週齢のメスＢ６－Ｆ３－ＦＡＤマウス１８匹及び９週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊメスマウス９匹を取った。Ｂ６－Ｆ３－ＦＡＤは、体重及びＹ迷路試験の結果に応じて、溶媒群と投与群の２つの群にランダムに分け、各群９匹とした。９匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊをブランク対照群として使用した。群分けが完了した後、ブランク対照群のマウスと溶媒群のマウスに溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を尾静脈注射により投与し、各マウスの注射量は５ｍｌ／ｋｇであった。投与群のマウスにはプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、各マウスに５０ｍｇ／ｋｇの用量で２８日間連続して注射した。投与後の７日後、各群からマウスをランダムに選んで殺処分し、脳組織を採取し、４℃でホモジナイズし、上清であるホモジネートを取ってＢＣＡ法による総タンパク質濃度の検出及びウェスタンブロット検出を行った。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１３２０）の説明書に従って、１０％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で均一に混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、１００μｇの総タンパク質を採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで１.５時間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ抗マウスＴａｕ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５１５５９）を加えて室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊで定量的に分析した。
その結果、ブランク対照群のマウスの脳ホモジネートに一定のレベルの異なる分子量のＴａｕタンパク質があり、投与群のマウスの脳組織における各分子量のＴａｕタンパク質及び総Ｔａｕタンパク質のレベルは媒体群のマウスよりも有意に低く、２つの群の３５ｋｄ、３５～４０ｋｄ、４０ｋｄ、５４ｋｄの分子量Ｔａｕタンパク質レベル及び総Ｔａｕタンパク質レベルの統計分析Ｐ値はそれぞれ、０．１７４、０．０４０６、０．０５２、０．０６７、及び０．０５５であった（図１２）。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマーモデルマウスの脳組織においてＴａｕタンパク質の分解を促進できることを示している。
Ｂ６ＳＪＬ－Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘマウス（カタログ番号：０３４８４０、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）とＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを３回戻し交配させて子孫（Ｂ６－Ｆ３－ＦＡＤと呼ぶ）を繁殖させた。２０～２５週齢のメスＢ６－Ｆ３－ＦＡＤマウス１８匹及び９週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊメスマウス９匹を取った。Ｂ６－Ｆ３－ＦＡＤは、体重及びＹ迷路試験の結果に応じて、溶媒群と投与群の２つの群にランダムに分け、各群９匹とした。９匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊをブランク対照群として使用した。群分けが完了した後、ブランク対照群のマウスと溶媒群のマウスに溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を尾静脈注射により投与し、各マウスの注射量は５ｍｌ／ｋｇであった。投与群のマウスにはプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、各マウスに５０ｍｇ／ｋｇの用量で２８日間連続して注射した。投与後の７日後、各群からマウスをランダムに選んで殺処分し、脳組織を採取し、４℃でホモジナイズし、上清であるホモジネートを取ってＢＣＡ法による総タンパク質濃度の検出及びウェスタンブロット検出を行った。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１３２０）の説明書に従って、１０％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で均一に混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、１００μｇの総タンパク質を採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで１.５時間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ抗マウスＴａｕ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５１５５９）を加えて室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊで定量的に分析した。
その結果、ブランク対照群のマウスの脳ホモジネートに一定のレベルの異なる分子量のＴａｕタンパク質があり、投与群のマウスの脳組織における各分子量のＴａｕタンパク質及び総Ｔａｕタンパク質のレベルは媒体群のマウスよりも有意に低く、２つの群の３５ｋｄ、３５～４０ｋｄ、４０ｋｄ、５４ｋｄの分子量Ｔａｕタンパク質レベル及び総Ｔａｕタンパク質レベルの統計分析Ｐ値はそれぞれ、０．１７４、０．０４０６、０．０５２、０．０６７、及び０．０５５であった（図１２）。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマーモデルマウスの脳組織においてＴａｕタンパク質の分解を促進できることを示している。
【実施例11】
【0091】
実施例１１は、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいてＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断を促進することに関するものである。
１１週齢のＢ６ＳＪＬＴｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（ＦＡＤ）（在庫番号：０３４８４０）（ＦＡＤと略称）マウス４匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、上記のように脳ホモジネートを調製してＥＰチューブに置いた。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク群、（２）ブランク対照群、（３）溶媒対照群、（４）投与群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬの溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ｐｒｏ－ＢＤＮＦ（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２３５６０，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４．６μＬの溶媒溶液（クエン酸－クエン酸ナトリウム溶液）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン群に２１.５ｍＬのＰｒｏ－ＢＤＮＦ（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キットの説明書に従って、１２％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで４５分間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、１‰のクーマシーブリリアントブルー染色液（１ｇのクーマシーブリリアントブルーＲ２５０を、エタノール：氷酢酸：精製水の体積比が５：２：１３の混合液１０００ｍｌに溶解した）に置いて３０分間染色した後、脱色液（精製水：氷酢酸：無水エタノール＝１７：２：１の体積比で混合）を用いてきれいに脱色した。ゲルを生体分子イメージャーで写真を撮って定量的にスキャン・分析した。
脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）は、分子量１２．３ｋＤの塩基性タンパク質であり、１１９個のアミノ酸残基からなり、３対のジスルフィド結合を含み、生体内で二量体化した形で存在し、ＢＤＮＦ前駆体の形で合成し、ＢＤＮＦ前駆体（Ｐｒｏ－ＢＤＮＦ）は、酵素加水分解によって切断され、成熟したＢＤＮＦを形成することができる。Ｐｒｏ－ＢＤＮＦは、切断されて形成した成熟ＢＤＮＦと相反の効果を有することが文献で報告されている。Ｐｒｏ－ＢＤＮＦはニューロンのアポトーシスを促進し、シナプス可塑性を低下させる［６］。成熟したＢＤＮＦ及びその受容体は、中枢神経系に広く分布しており、中枢神経系の発達中のニューロンの生存、分化、成長、発達に重要な役割を果たし、ニューロンが損傷を受けて死滅することを防ぎ、ニューロンの病理学的状態を改善し、損傷したニューロンの再生や分化などの生物学的効果を促進することができ、成熟した中枢神経系及び末梢神経系におけるニューロンの生存と正常な生理学的機能に必要である［７］。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＢＤＮＦ量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった（＊はＰ＜０．０５、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）（図１３）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいてＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断を促進できることを示唆している。
１１週齢のＢ６ＳＪＬＴｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（ＦＡＤ）（在庫番号：０３４８４０）（ＦＡＤと略称）マウス４匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、上記のように脳ホモジネートを調製してＥＰチューブに置いた。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク群、（２）ブランク対照群、（３）溶媒対照群、（４）投与群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬの溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ｐｒｏ－ＢＤＮＦ（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２３５６０，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４．６μＬの溶媒溶液（クエン酸－クエン酸ナトリウム溶液）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン群に２１.５ｍＬのＰｒｏ－ＢＤＮＦ（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キットの説明書に従って、１２％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで４５分間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、１‰のクーマシーブリリアントブルー染色液（１ｇのクーマシーブリリアントブルーＲ２５０を、エタノール：氷酢酸：精製水の体積比が５：２：１３の混合液１０００ｍｌに溶解した）に置いて３０分間染色した後、脱色液（精製水：氷酢酸：無水エタノール＝１７：２：１の体積比で混合）を用いてきれいに脱色した。ゲルを生体分子イメージャーで写真を撮って定量的にスキャン・分析した。
脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）は、分子量１２．３ｋＤの塩基性タンパク質であり、１１９個のアミノ酸残基からなり、３対のジスルフィド結合を含み、生体内で二量体化した形で存在し、ＢＤＮＦ前駆体の形で合成し、ＢＤＮＦ前駆体（Ｐｒｏ－ＢＤＮＦ）は、酵素加水分解によって切断され、成熟したＢＤＮＦを形成することができる。Ｐｒｏ－ＢＤＮＦは、切断されて形成した成熟ＢＤＮＦと相反の効果を有することが文献で報告されている。Ｐｒｏ－ＢＤＮＦはニューロンのアポトーシスを促進し、シナプス可塑性を低下させる［６］。成熟したＢＤＮＦ及びその受容体は、中枢神経系に広く分布しており、中枢神経系の発達中のニューロンの生存、分化、成長、発達に重要な役割を果たし、ニューロンが損傷を受けて死滅することを防ぎ、ニューロンの病理学的状態を改善し、損傷したニューロンの再生や分化などの生物学的効果を促進することができ、成熟した中枢神経系及び末梢神経系におけるニューロンの生存と正常な生理学的機能に必要である［７］。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＢＤＮＦ量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった（＊はＰ＜０．０５、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）（図１３）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいてＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断を促進できることを示唆している。
【実施例12】
【0092】
実施例１２は、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいてＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断及び成熟ＢＤＮＦの形成を促進することに関するものである。
１１週齢のＢ６ＳＪＬＴｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（ＦＡＤ）（在庫番号：０３４８４０）（ＦＡＤと略称）マウス４匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、上記のように脳ホモジネートを調製してＥＰチューブに置いた。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク群、（２）ブランク対照群、（３）溶媒対照群、（４）投与群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬの溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ｐｒｏ－ＢＤＮＦ（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２３５６０，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４．６μＬの溶媒溶液（クエン酸－クエン酸ナトリウム溶液）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン群に２１.５ｍＬのＰｒｏ－ＢＤＮＦ（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キットの説明書に従って、１２％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで４５分間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ抗ヒトＢＤＮＦ抗体（Ｂｏｓｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＰＢ９０７５）を加えて室温で３時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、バンド光学密度をＩｍａｇｅ Ｊで定量的に分析した。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＢＤＮＦ量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１を表す）；プラスミノーゲン投与群のＢＤＮＦ量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は極めて有意であった（図１４）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、Ｐｒｏ－ＢＤＮＦの切断及び成熟ＢＤＮＦの形成を促進できることを示唆している。
１１週齢のＢ６ＳＪＬＴｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（ＦＡＤ）（在庫番号：０３４８４０）（ＦＡＤと略称）マウス４匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、上記のように脳ホモジネートを調製してＥＰチューブに置いた。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク群、（２）ブランク対照群、（３）溶媒対照群、（４）投与群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬの溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ｐｒｏ－ＢＤＮＦ（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２３５６０，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４．６μＬの溶媒溶液（クエン酸－クエン酸ナトリウム溶液）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン群に２１.５ｍＬのＰｒｏ－ＢＤＮＦ（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キットの説明書に従って、１２％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで４５分間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ抗ヒトＢＤＮＦ抗体（Ｂｏｓｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＰＢ９０７５）を加えて室温で３時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、バンド光学密度をＩｍａｇｅ Ｊで定量的に分析した。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＢＤＮＦ量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１を表す）；プラスミノーゲン投与群のＢＤＮＦ量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は極めて有意であった（図１４）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、Ｐｒｏ－ＢＤＮＦの切断及び成熟ＢＤＮＦの形成を促進できることを示唆している。
【実施例13】
【0093】
実施例１３は、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデルマウスの海馬でＢＤＮＦの発現を促進することに関する。
２４週齢のＣ５７オスマウス２３匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重によって異常なマウスを除外した後、すべてのマウスを２つの群にランダムに分け、ブランク対照群で７匹、モデル群で１６匹とした。すべてのマウスを麻酔し、実施例６のようにアルツハイマーモデル［３］を構築した。脳局在注射２８日後、すべてのマウスに対して体重及びＹ迷路試験を行い、試験の結果に応じて、ブランク対照群及びモデル群の異常なマウスを排除し、モデル群マウスを２つの群にランダムに分け、溶媒群で６匹とし、投与群で７匹とし、ブランク対照群で６匹とした。溶媒群及び投与群のマウスに投与を開始し、これを１日目とし、投与群のマウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群のマウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を尾静脈注射により投与し、２８日間連続して投与した。ブランク対照群マウスには投与しなかった。２９日目にマウスを殺処分し、脳を採取して１０％ホルムアルデヒドで２４～４８時間固定した。固定された脳組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。黒質を位置付けし、切片の厚さは４μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスＢＤＮＦ抗体（ＢｏｓｔｅｒＢｉｏ，ＰＢ９０７５）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群（図１５Ａ）のマウスの海馬が一定レベルのＢＤＮＦを発現し（矢印でマーク）、溶媒群（図１５Ｂ）のマウスの海馬におけるＢＤＮＦの発現は、ブランク対照群よりも有意に低く、投与群（図１５Ｃ）のマウスの海馬におけるＢＤＮＦの発現は溶媒群よりも有意に高く、統計的差は有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図１５Ｄ）。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデルマウスの海馬でＢＤＮＦの発現を促進できることを示している。
２４週齢のＣ５７オスマウス２３匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重によって異常なマウスを除外した後、すべてのマウスを２つの群にランダムに分け、ブランク対照群で７匹、モデル群で１６匹とした。すべてのマウスを麻酔し、実施例６のようにアルツハイマーモデル［３］を構築した。脳局在注射２８日後、すべてのマウスに対して体重及びＹ迷路試験を行い、試験の結果に応じて、ブランク対照群及びモデル群の異常なマウスを排除し、モデル群マウスを２つの群にランダムに分け、溶媒群で６匹とし、投与群で７匹とし、ブランク対照群で６匹とした。溶媒群及び投与群のマウスに投与を開始し、これを１日目とし、投与群のマウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群のマウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を尾静脈注射により投与し、２８日間連続して投与した。ブランク対照群マウスには投与しなかった。２９日目にマウスを殺処分し、脳を採取して１０％ホルムアルデヒドで２４～４８時間固定した。固定された脳組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。黒質を位置付けし、切片の厚さは４μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスＢＤＮＦ抗体（ＢｏｓｔｅｒＢｉｏ，ＰＢ９０７５）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群（図１５Ａ）のマウスの海馬が一定レベルのＢＤＮＦを発現し（矢印でマーク）、溶媒群（図１５Ｂ）のマウスの海馬におけるＢＤＮＦの発現は、ブランク対照群よりも有意に低く、投与群（図１５Ｃ）のマウスの海馬におけるＢＤＮＦの発現は溶媒群よりも有意に高く、統計的差は有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図１５Ｄ）。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデルマウスの海馬でＢＤＮＦの発現を促進できることを示している。
【実施例14】
【0094】
実施例１４は、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいてＮＧＦの切断及び成熟ＮＧＦの形成を促進することに関するものである。
１１週齢のＢ６ＳＪＬＴｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（ＦＡＤ）（在庫番号：０３４８４０）（ＦＡＤと略称）マウス４匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、上記のように脳ホモジネートを調製してＥＰチューブに置いた。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク対照群、（２）ブランク群、（３）溶媒対照群、（４）プラスミノーゲン群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬの溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；ブランク群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ｐｒｏ－ＮＧＦ（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｐｒｏ－ＮＧＦ，配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１３８に由来，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４．６μＬの溶媒溶液、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン群に２１.μＬのＰｒｏ－ＮＧＦ溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キットの説明書に従って、１５％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで３０分間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ抗ヒトＮＧＦ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ５２９１８）を加えて室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、バンド光学密度をＩｍａｇｅ Ｊで定量的に分析した。
神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）は、神経栄養因子ファミリーの重要なメンバーである。シグナルペプチド、リーダーペプチド、及び成熟ペプチドを含む前駆体の形でインビボで合成される。研究では、神経成長因子ＮＧＦの前駆体（Ｐｒｏ－ＮＧＦ）が、切断されて形成するＮＧＦと相反の役割を果たしていることが報告されている。Ｐｒｏ－ＮＧＦはニューロンのアポトーシスを促進することができる。成熟したＮＧＦは、ニューロンの成長、発達、分化、生存、損傷後の修復などのプロセスの調節に関与しており、中枢及び末梢ニューロンの機能発現の調節にも重要な役割を果たしている［８］。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートでは、溶媒対照群に比べてプラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＮＧＦ量が有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）；プラスミノーゲン投与群のＮＧＦ量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は有意であった（図１６）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、Ｐｒｏ－ＮＧＦの切断及び成熟ＮＧＦの形成を促進できることを示唆している。
１１週齢のＢ６ＳＪＬＴｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（ＦＡＤ）（在庫番号：０３４８４０）（ＦＡＤと略称）マウス４匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、上記のように脳ホモジネートを調製してＥＰチューブに置いた。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク対照群、（２）ブランク群、（３）溶媒対照群、（４）プラスミノーゲン群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬの溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；ブランク群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ｐｒｏ－ＮＧＦ（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｐｒｏ－ＮＧＦ，配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１３８に由来，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４．６μＬの溶媒溶液、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン群に２１.μＬのＰｒｏ－ＮＧＦ溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キットの説明書に従って、１５％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで３０分間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ抗ヒトＮＧＦ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ５２９１８）を加えて室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、バンド光学密度をＩｍａｇｅ Ｊで定量的に分析した。
神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）は、神経栄養因子ファミリーの重要なメンバーである。シグナルペプチド、リーダーペプチド、及び成熟ペプチドを含む前駆体の形でインビボで合成される。研究では、神経成長因子ＮＧＦの前駆体（Ｐｒｏ－ＮＧＦ）が、切断されて形成するＮＧＦと相反の役割を果たしていることが報告されている。Ｐｒｏ－ＮＧＦはニューロンのアポトーシスを促進することができる。成熟したＮＧＦは、ニューロンの成長、発達、分化、生存、損傷後の修復などのプロセスの調節に関与しており、中枢及び末梢ニューロンの機能発現の調節にも重要な役割を果たしている［８］。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートでは、溶媒対照群に比べてプラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＮＧＦ量が有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）；プラスミノーゲン投与群のＮＧＦ量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は有意であった（図１６）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、Ｐｒｏ－ＮＧＦの切断及び成熟ＮＧＦの形成を促進できることを示唆している。
【実施例15】
【0095】
実施例１５は、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進することに関する。
Ｃ５７オスマウス２８匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重によって異常なマウスを除外した後、すべてのマウスを２つの群にランダムに分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２０匹とした。群分けが終わった後、実施例６のようにアルツハイマーモデル［３］を構築した。脳局在注射６５日後、すべてのマウスに対して水迷路試験を行い、モデル対照群はすなわちブランク対照群マウスであり、試験の結果に応じて、ブランク対照群及びモデル群の異常なマウスを排除し、モデル群マウスを２つの群にランダムに分け、溶媒群で１０匹とし、投与群で１０匹とし、ブランク対照群で８匹とした。群分けの後、溶媒群及び投与群のマウスに第１期の投与を開始し、投与群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群及びブランク対照群のマウスに５ｍｌ／ｋｇ／匹／日で溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を尾静脈注射により投与し、２８日間連続して投与した。第１期の投与終了５０日後から第２期投与を開始し、投与方法は第１期と同様にして７日間連続して投与した。第２期の投与の８日目にオープンフィールド実験を行った。
オープンフィールド実験
実験時、オープンフィールド（４０×４０×４０ｃｍ）の底面中央にマウスを置き、撮影と計時を同時に行い、持続して５分間観察し、各マウスは３回の実験を行った。Ｓｍａｒｔ Ｓｙｓｔｅｍは、実験動物の行動を評価するための完全な使いやすいビデオ追跡システムである。軌跡、アクティビティ、特定の動作（回転、ストレッチ、摂食など）及びイベントを記録し、さまざまな分析パラメーターの計算を実行できる。この実験では、Ｓｍａｒｔ３．０システムを使用して、マウスの動きを記録及び分析した。パラメーターは、境界ゾーンの総移動距離と中央ゾーンの移動距離を含む。各実験では、匂いの好みを防ぐために７０％のアルコールを使用してボックスを拭いた［１］。
オープンフィールド実験の設計原理は、マウスの回避に基づいている。これは、マウスが開けた場所、未知の場所、潜在的に危険な場所を恐れているため、「壁に張り付く」性質を持っていることを指す。総距離と平均速度は、マウスの自発活動を反映する主なデータと見なされ、回避は、フィールドの周辺領域(４つのコーナーと４つの側面)でのマウスの活動によって評価された。回避を反映した周囲での活動時間から判断すると、時間が短縮することは、マウスがより「冒険的」な傾向にあることを示し、中央ゾーンでの活動時間が大幅に長くなることは、回避と不安(うつ病)のレベルが低いことを示す。
境界ゾーンの移動距離の割合
境界ゾーンの移動距離の割合は、指定された時間内に境界ゾーンでのマウスの移動軌跡長さと総移動軌跡の長さとの比率である。その結果、ブランク対照群は境界ゾーンで一定の割合の移動距離を持っており、溶媒群マウスの境界ゾーンの移動距離の割合がブランク対照群より有意に多く、投与群マウスの境界ゾーン移動距離の割合が溶媒群より有意に小さく、しかも統計的差は有意に近かった（Ｐ＝０．０８）（図１７）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
中心ゾーンの移動距離の割合
中心ゾーンの移動距離の割合は、指定された時間内に中心ゾーンでのマウスの移動軌跡長さと総移動軌跡の長さとの比率である。その結果、ブランク対照群は中心ゾーンで一定の割合の移動距離を持っており、溶媒群マウスの中心ゾーンの移動距離の割合がブランク対照群より有意に小さく、投与群マウスの中心ゾーン移動距離の割合が溶媒群より有意に大きく、しかも統計的差は有意に近かった（Ｐ＝０．０８）（図１８）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
Ｃ５７オスマウス２８匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重によって異常なマウスを除外した後、すべてのマウスを２つの群にランダムに分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２０匹とした。群分けが終わった後、実施例６のようにアルツハイマーモデル［３］を構築した。脳局在注射６５日後、すべてのマウスに対して水迷路試験を行い、モデル対照群はすなわちブランク対照群マウスであり、試験の結果に応じて、ブランク対照群及びモデル群の異常なマウスを排除し、モデル群マウスを２つの群にランダムに分け、溶媒群で１０匹とし、投与群で１０匹とし、ブランク対照群で８匹とした。群分けの後、溶媒群及び投与群のマウスに第１期の投与を開始し、投与群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群及びブランク対照群のマウスに５ｍｌ／ｋｇ／匹／日で溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を尾静脈注射により投与し、２８日間連続して投与した。第１期の投与終了５０日後から第２期投与を開始し、投与方法は第１期と同様にして７日間連続して投与した。第２期の投与の８日目にオープンフィールド実験を行った。
オープンフィールド実験
実験時、オープンフィールド（４０×４０×４０ｃｍ）の底面中央にマウスを置き、撮影と計時を同時に行い、持続して５分間観察し、各マウスは３回の実験を行った。Ｓｍａｒｔ Ｓｙｓｔｅｍは、実験動物の行動を評価するための完全な使いやすいビデオ追跡システムである。軌跡、アクティビティ、特定の動作（回転、ストレッチ、摂食など）及びイベントを記録し、さまざまな分析パラメーターの計算を実行できる。この実験では、Ｓｍａｒｔ３．０システムを使用して、マウスの動きを記録及び分析した。パラメーターは、境界ゾーンの総移動距離と中央ゾーンの移動距離を含む。各実験では、匂いの好みを防ぐために７０％のアルコールを使用してボックスを拭いた［１］。
オープンフィールド実験の設計原理は、マウスの回避に基づいている。これは、マウスが開けた場所、未知の場所、潜在的に危険な場所を恐れているため、「壁に張り付く」性質を持っていることを指す。総距離と平均速度は、マウスの自発活動を反映する主なデータと見なされ、回避は、フィールドの周辺領域(４つのコーナーと４つの側面)でのマウスの活動によって評価された。回避を反映した周囲での活動時間から判断すると、時間が短縮することは、マウスがより「冒険的」な傾向にあることを示し、中央ゾーンでの活動時間が大幅に長くなることは、回避と不安(うつ病)のレベルが低いことを示す。
境界ゾーンの移動距離の割合
境界ゾーンの移動距離の割合は、指定された時間内に境界ゾーンでのマウスの移動軌跡長さと総移動軌跡の長さとの比率である。その結果、ブランク対照群は境界ゾーンで一定の割合の移動距離を持っており、溶媒群マウスの境界ゾーンの移動距離の割合がブランク対照群より有意に多く、投与群マウスの境界ゾーン移動距離の割合が溶媒群より有意に小さく、しかも統計的差は有意に近かった（Ｐ＝０．０８）（図１７）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
中心ゾーンの移動距離の割合
中心ゾーンの移動距離の割合は、指定された時間内に中心ゾーンでのマウスの移動軌跡長さと総移動軌跡の長さとの比率である。その結果、ブランク対照群は中心ゾーンで一定の割合の移動距離を持っており、溶媒群マウスの中心ゾーンの移動距離の割合がブランク対照群より有意に小さく、投与群マウスの中心ゾーン移動距離の割合が溶媒群より有意に大きく、しかも統計的差は有意に近かった（Ｐ＝０．０８）（図１８）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
【実施例16】
【0096】
実施例１６は、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進することに関する。
Ｃ５７オスマウス２８匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重によって異常なマウスを除外した後、すべてのマウスを２つの群にランダムに分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２０匹とした。群分けが終わった後、実施例６のようにアルツハイマーモデル［３］を構築した。脳局在注射６５日後、すべてのマウスに対して水迷路試験を行い、モデル対照群はすなわちブランク対照群マウスであり、試験の結果に応じて、ブランク対照群及びモデル群の異常なマウスを排除し、モデル群マウスを２つの群にランダムに分け、溶媒群で１０匹とし、投与群で１０匹とし、ブランク対照群で８匹とした。群分けの後、溶媒群及び投与群のマウスに第１期の投与を開始し、投与群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群及びブランク対照群のマウスに５ｍｌ／ｋｇ／匹／日で溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を尾静脈注射により投与し、２８日間連続して投与した。第１期の投与終了５０日後から第２期投与を開始し、投与方法は第１期と同様にして９日間連続して投与した。第２期の投与終了２日後に高架式十字迷路行動実験を行った。
高架式十字迷路は、動物の新しい異なる環境の探索特性及び高くぶら下げるオープンアームへの恐怖を利用して相反する行動を形成し、動物の不安状態を調べる。高架十字迷路には１対のオープンアームと１対のクローズアームがある。齧歯類は暗所嗜好のためクローズアームで移動する傾向があるが、好奇心と探索のためにオープンアームで移動し、新しい刺激に直面すると、動物は探索する衝動と恐怖を同時に感じる。これは、探索と回避の相反する行動を引き起こし、結果として不安が生じる。抗不安薬は、オープンアームに入る回数と時間を大幅に増やすことができる。十字迷路は地面から高く、崖の上に立っているのと同じであるため、被験者に恐怖と不安を感じさせる。高架式十字迷路は、新薬の開発／スクリーニング／評価、薬理学、毒物学、予防医学、神経生物学、動物心理学、行動生物学などの複数の分野における科学研究及びコンピューター支援教育の分野で広く使用されており、医学部や科学研究機関での行動研究、特に不安やうつ病の研究における古典的な実験である。
実験の開始時に、マウスをクローズアームに向かって中央のグリッドから迷路に入れ、５分間の活動を記録した。観察指標は、オープンアームエントリの回数(２つの前足がアームに入る必要がある)、オープンアームの滞留時間、クローズアームエントリの回数、及びクローズアームの滞留時間を含む。オープンアームの滞留時間の割合、オープンアームエントリ回数の割合、及び高架式十字迷路のエントリの総数を計算した。実験が終わった後、マウスを取り出し、両腕をきれいにし、アルコールをスプレーして臭いを取り除いた。最後に、動物行動学ソフトウェアを使用してデータ分析を行った。
総移動距離
総移動距離とは、指定された記録時間内のマウスの総移動軌跡の長さを指す。その結果、ブランク対照群は一定の総移動距離を持っており、溶媒群の移動距離はブランク対照群よりも有意に大きく、投与群の総移動距離は溶媒群よりも有意に小さく、その統計的差は極めて有意であり（＊はＰ＜０.０５、＊＊はＰ＜０．０１を表す）（図１９）、しかもブランク対照群のマウスの総移動距離により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
クローズアーム移動距離
クローズアームの移動距離とは、指定された時間内のクローズアームの移動軌跡の長さを指す。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム移動距離を持っており、溶媒群のクローズアーム移動距離はブランク対照群よりも有意に大きく、投与群のクローズアーム移動距離は溶媒群よりも有意に小さく、２つの群の間の統計的差は有意であり（＊はＰ＜０.０５、＊＊はＰ＜０．０１を表す）（図２０）、しかも投与群のクローズアーム移動距離はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
クローズアームの移動距離の割合
クローズアームの移動距離の割合とは、指定された時間内のクローズアームの移動軌跡の長さと総移動軌跡の長さとの比率を指す。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム移動距離の割合を持っており、溶媒群のクローズアーム移動距離の割合はブランク対照群よりも有意に大きく、投与群のクローズアーム移動距離の割合は溶媒群よりも有意に小さく、２つの群の間の統計的差は有意であり（＊はＰ＜０.０５を表す）（図２１）、しかも投与群のクローズアーム移動距離の割合はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
クローズアームエントリ回数
その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアームエントリ回数を持っており、溶媒群のクローズアームエントリ回数はブランク対照群マウスよりも有意に多く、投与群マウスのクローズアームエントリ回数は溶媒群よりも有意に少なく、２つの群の間の統計的差は極めて有意であり（＊はＰ＜０.０５、＊＊はＰ＜０.０１を表す）（図２２）、しかも投与群のクローズアームエントリ回数はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
クローズアーム時間
クローズアーム時間とは、指定された時間内でマウスがクローズアームに滞在する時間のことである。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム時間を持っており、溶媒群マウスのクローズアームの滞在時間はブランク対照群マウスよりも有意に短く、投与群マウスのクローズアーム時間は溶媒群よりも有意に長く、２つの群の間の統計的差は有意であり（＊はＰ＜０.０５、＊＊はＰ＜０.０１を表す）（図２３）、しかも投与群のクローズアームの滞在時間はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
クローズアーム時間の割合
クローズアーム時間の割合とは、マウスがクローズアームに滞在した時間と記録された合計時間との比率を指す。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム時間の割合を持っており、溶媒群マウスのクローズアーム時間の割合はブランク対照群マウスよりも有意に低く、投与群マウスのクローズアーム時間の割合は溶媒群よりも有意に高く、２つの群の間の統計的差は有意であり（＊はＰ＜０.０５、＊＊はＰ＜０.０１を表す）（図２４）、しかも投与群のクローズアーム時間の割合はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
クローズアームでの平均速度
クローズアームでの平均速度とは、クローズアームの移動距離とクローズアーム時間との比率を指す。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアームでの平均移動速度を持っており、溶媒群のクローズアームでの平均移動速度はブランク対照群マウスよりも有意に大きく、投与群マウスのクローズアームでの平均移動速度は溶媒群よりも有意に小さく、２つの群の間の統計的差は極めて有意であり（＊＊はＰ＜０.０１を表す）（図２５）、しかも投与群のクローズアームでの平均移動速度はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
Ｃ５７オスマウス２８匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重によって異常なマウスを除外した後、すべてのマウスを２つの群にランダムに分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２０匹とした。群分けが終わった後、実施例６のようにアルツハイマーモデル［３］を構築した。脳局在注射６５日後、すべてのマウスに対して水迷路試験を行い、モデル対照群はすなわちブランク対照群マウスであり、試験の結果に応じて、ブランク対照群及びモデル群の異常なマウスを排除し、モデル群マウスを２つの群にランダムに分け、溶媒群で１０匹とし、投与群で１０匹とし、ブランク対照群で８匹とした。群分けの後、溶媒群及び投与群のマウスに第１期の投与を開始し、投与群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群及びブランク対照群のマウスに５ｍｌ／ｋｇ／匹／日で溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を尾静脈注射により投与し、２８日間連続して投与した。第１期の投与終了５０日後から第２期投与を開始し、投与方法は第１期と同様にして９日間連続して投与した。第２期の投与終了２日後に高架式十字迷路行動実験を行った。
高架式十字迷路は、動物の新しい異なる環境の探索特性及び高くぶら下げるオープンアームへの恐怖を利用して相反する行動を形成し、動物の不安状態を調べる。高架十字迷路には１対のオープンアームと１対のクローズアームがある。齧歯類は暗所嗜好のためクローズアームで移動する傾向があるが、好奇心と探索のためにオープンアームで移動し、新しい刺激に直面すると、動物は探索する衝動と恐怖を同時に感じる。これは、探索と回避の相反する行動を引き起こし、結果として不安が生じる。抗不安薬は、オープンアームに入る回数と時間を大幅に増やすことができる。十字迷路は地面から高く、崖の上に立っているのと同じであるため、被験者に恐怖と不安を感じさせる。高架式十字迷路は、新薬の開発／スクリーニング／評価、薬理学、毒物学、予防医学、神経生物学、動物心理学、行動生物学などの複数の分野における科学研究及びコンピューター支援教育の分野で広く使用されており、医学部や科学研究機関での行動研究、特に不安やうつ病の研究における古典的な実験である。
実験の開始時に、マウスをクローズアームに向かって中央のグリッドから迷路に入れ、５分間の活動を記録した。観察指標は、オープンアームエントリの回数(２つの前足がアームに入る必要がある)、オープンアームの滞留時間、クローズアームエントリの回数、及びクローズアームの滞留時間を含む。オープンアームの滞留時間の割合、オープンアームエントリ回数の割合、及び高架式十字迷路のエントリの総数を計算した。実験が終わった後、マウスを取り出し、両腕をきれいにし、アルコールをスプレーして臭いを取り除いた。最後に、動物行動学ソフトウェアを使用してデータ分析を行った。
総移動距離
総移動距離とは、指定された記録時間内のマウスの総移動軌跡の長さを指す。その結果、ブランク対照群は一定の総移動距離を持っており、溶媒群の移動距離はブランク対照群よりも有意に大きく、投与群の総移動距離は溶媒群よりも有意に小さく、その統計的差は極めて有意であり（＊はＰ＜０.０５、＊＊はＰ＜０．０１を表す）（図１９）、しかもブランク対照群のマウスの総移動距離により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
クローズアーム移動距離
クローズアームの移動距離とは、指定された時間内のクローズアームの移動軌跡の長さを指す。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム移動距離を持っており、溶媒群のクローズアーム移動距離はブランク対照群よりも有意に大きく、投与群のクローズアーム移動距離は溶媒群よりも有意に小さく、２つの群の間の統計的差は有意であり（＊はＰ＜０.０５、＊＊はＰ＜０．０１を表す）（図２０）、しかも投与群のクローズアーム移動距離はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
クローズアームの移動距離の割合
クローズアームの移動距離の割合とは、指定された時間内のクローズアームの移動軌跡の長さと総移動軌跡の長さとの比率を指す。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム移動距離の割合を持っており、溶媒群のクローズアーム移動距離の割合はブランク対照群よりも有意に大きく、投与群のクローズアーム移動距離の割合は溶媒群よりも有意に小さく、２つの群の間の統計的差は有意であり（＊はＰ＜０.０５を表す）（図２１）、しかも投与群のクローズアーム移動距離の割合はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
クローズアームエントリ回数
その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアームエントリ回数を持っており、溶媒群のクローズアームエントリ回数はブランク対照群マウスよりも有意に多く、投与群マウスのクローズアームエントリ回数は溶媒群よりも有意に少なく、２つの群の間の統計的差は極めて有意であり（＊はＰ＜０.０５、＊＊はＰ＜０.０１を表す）（図２２）、しかも投与群のクローズアームエントリ回数はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
クローズアーム時間
クローズアーム時間とは、指定された時間内でマウスがクローズアームに滞在する時間のことである。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム時間を持っており、溶媒群マウスのクローズアームの滞在時間はブランク対照群マウスよりも有意に短く、投与群マウスのクローズアーム時間は溶媒群よりも有意に長く、２つの群の間の統計的差は有意であり（＊はＰ＜０.０５、＊＊はＰ＜０.０１を表す）（図２３）、しかも投与群のクローズアームの滞在時間はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
クローズアーム時間の割合
クローズアーム時間の割合とは、マウスがクローズアームに滞在した時間と記録された合計時間との比率を指す。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム時間の割合を持っており、溶媒群マウスのクローズアーム時間の割合はブランク対照群マウスよりも有意に低く、投与群マウスのクローズアーム時間の割合は溶媒群よりも有意に高く、２つの群の間の統計的差は有意であり（＊はＰ＜０.０５、＊＊はＰ＜０.０１を表す）（図２４）、しかも投与群のクローズアーム時間の割合はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
クローズアームでの平均速度
クローズアームでの平均速度とは、クローズアームの移動距離とクローズアーム時間との比率を指す。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアームでの平均移動速度を持っており、溶媒群のクローズアームでの平均移動速度はブランク対照群マウスよりも有意に大きく、投与群マウスのクローズアームでの平均移動速度は溶媒群よりも有意に小さく、２つの群の間の統計的差は極めて有意であり（＊＊はＰ＜０.０１を表す）（図２５）、しかも投与群のクローズアームでの平均移動速度はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
【実施例17】
【0097】
実施例１７は、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの記憶機能の回復を促進することに関する。
Ｃ５７オスマウス２８匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重によって異常なマウスを除外した後、すべてのマウスを２つの群にランダムに分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２０匹とした。群分けが終わった後、実施例６のようにアルツハイマーモデル［３］を構築した。脳局在注射６５日後、すべてのマウスに対して水迷路試験を行い、モデル対照群はすなわちブランク対照群マウスであり、試験の結果に応じて、ブランク対照群及びモデル群の異常なマウスを排除し、モデル群マウスを２つの群にランダムに分け、溶媒群で１０匹とし、投与群で１０匹とし、ブランク対照群で８匹とした。群分けの後、溶媒群及び投与群のマウスに第１期の投与を開始し、投与群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群及びブランク対照群のマウスに５ｍｌ／ｋｇ／匹／日で溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を尾静脈注射により投与し、２８日間連続して投与した。第１期の投与終了５０日後から第２期投与を開始し、投与方法は第１期と同様にして９日間連続して投与した。第２期の投与終了２日後にＹ迷路行動実験を行った。
その結果、ブランク対照マウスと比較して、溶媒群のマウスの自発的交替行動率が有意に低下し、投与群のマウスの自発的交替行動率は、溶媒群よりも有意に高く、２つの群の間の統計的差は有意であり（＊はＰ＜０.０５を表す）、しかもブランク対照群により近かった（図２６）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの記憶機能の回復を促進できることを示唆している。
Ｃ５７オスマウス２８匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重によって異常なマウスを除外した後、すべてのマウスを２つの群にランダムに分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２０匹とした。群分けが終わった後、実施例６のようにアルツハイマーモデル［３］を構築した。脳局在注射６５日後、すべてのマウスに対して水迷路試験を行い、モデル対照群はすなわちブランク対照群マウスであり、試験の結果に応じて、ブランク対照群及びモデル群の異常なマウスを排除し、モデル群マウスを２つの群にランダムに分け、溶媒群で１０匹とし、投与群で１０匹とし、ブランク対照群で８匹とした。群分けの後、溶媒群及び投与群のマウスに第１期の投与を開始し、投与群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群及びブランク対照群のマウスに５ｍｌ／ｋｇ／匹／日で溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を尾静脈注射により投与し、２８日間連続して投与した。第１期の投与終了５０日後から第２期投与を開始し、投与方法は第１期と同様にして９日間連続して投与した。第２期の投与終了２日後にＹ迷路行動実験を行った。
その結果、ブランク対照マウスと比較して、溶媒群のマウスの自発的交替行動率が有意に低下し、投与群のマウスの自発的交替行動率は、溶媒群よりも有意に高く、２つの群の間の統計的差は有意であり（＊はＰ＜０.０５を表す）、しかもブランク対照群により近かった（図２６）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの記憶機能の回復を促進できることを示唆している。
【実施例18】
【0098】
実施例１８は、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進することに関する。
２０～２５週齢のＢ６ＳＪＬ－Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ、ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂから購入、カタログ番号：０３４８４０）のメスマウス１８を取り、体重及びＹ迷路試験の結果に従って２つの群にランダムに分け、媒体群で９匹、投与群で９匹とし、同週齢のＣ５７メスマウス９匹をブランク対照群とした。群分けの後、ブランク対照群及び溶媒群のマウスに５ｍｌ／ｋｇで溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を尾静脈注射により投与し、投与群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇでプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、１８日間連続して投与した。１９日目に架式十字迷路行動実験を行った。
その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム時の移動距離を持っており、溶媒群のクローズアームの移動距離はブランク対照群マウスよりも有意に小さく、投与群マウスのクローズアームの移動距離は溶媒群よりも有意に大きく、２つの群の間の統計的差は有意であり（＊＊はＰ＜０.０１、＊＊＊はＰ＜０.００１を表す）（図２７）、しかも投与群のクローズアームの移動距離はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
２０～２５週齢のＢ６ＳＪＬ－Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ、ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂから購入、カタログ番号：０３４８４０）のメスマウス１８を取り、体重及びＹ迷路試験の結果に従って２つの群にランダムに分け、媒体群で９匹、投与群で９匹とし、同週齢のＣ５７メスマウス９匹をブランク対照群とした。群分けの後、ブランク対照群及び溶媒群のマウスに５ｍｌ／ｋｇで溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を尾静脈注射により投与し、投与群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇでプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、１８日間連続して投与した。１９日目に架式十字迷路行動実験を行った。
その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム時の移動距離を持っており、溶媒群のクローズアームの移動距離はブランク対照群マウスよりも有意に小さく、投与群マウスのクローズアームの移動距離は溶媒群よりも有意に大きく、２つの群の間の統計的差は有意であり（＊＊はＰ＜０.０１、＊＊＊はＰ＜０.００１を表す）（図２７）、しかも投与群のクローズアームの移動距離はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
【実施例19】
【0099】
実施例１９は、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの海馬損傷を改善することに関するものである。
Ｂ６ＳＪＬ－Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘマウス（カタログ番号：０３４８４０、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）とＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを一回戻し交配させて子孫（Ｂ６－Ｆ１－ＦＡＤと呼ぶ）を繁殖させた。１６～１７週齢のメスＢ６－Ｆ１－ＦＡＤマウス１８匹及び９週齢のメスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス９匹を取った。Ｂ６－Ｆ１－ＦＡＤは、体重及びＹ迷路試験の結果に応じて、溶媒群と投与群の２つの群にランダムに分け、各群９匹とした。９匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊをブランク対照群として使用した。群分けが完了した後、ブランク対照群のマウスと溶媒群のマウスに溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を尾静脈注射により投与し、各マウスの注射量は５ｍｌ／ｋｇであった。投与群のマウスにはプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、各マウスに５０ｍｇ／ｋｇの用量で８日間連続して注射した。投与後の５日後、マウスを殺処分し、脳組織を採取して１０％中性ホルムアルデヒド溶液で２４～４８時間固定した。固定された脳組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗い、ヘマトキシリン及びエオジンで染色し（ＨＥ染色）、１％塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコール勾配で脱水させて封入させ、海馬を観察するために、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群（図２８Ａ）のマウスの海馬の組織形態が正常であり、溶媒群（図２８Ｂ）と比較して、投与群（図２８Ｃ）の海馬の組織損傷形態が有意に改善された。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの海馬損傷を改善できることを示している。
Ｂ６ＳＪＬ－Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘマウス（カタログ番号：０３４８４０、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）とＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを一回戻し交配させて子孫（Ｂ６－Ｆ１－ＦＡＤと呼ぶ）を繁殖させた。１６～１７週齢のメスＢ６－Ｆ１－ＦＡＤマウス１８匹及び９週齢のメスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス９匹を取った。Ｂ６－Ｆ１－ＦＡＤは、体重及びＹ迷路試験の結果に応じて、溶媒群と投与群の２つの群にランダムに分け、各群９匹とした。９匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊをブランク対照群として使用した。群分けが完了した後、ブランク対照群のマウスと溶媒群のマウスに溶媒（４％アルギニン＋２％グリシン溶液）を尾静脈注射により投与し、各マウスの注射量は５ｍｌ／ｋｇであった。投与群のマウスにはプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、各マウスに５０ｍｇ／ｋｇの用量で８日間連続して注射した。投与後の５日後、マウスを殺処分し、脳組織を採取して１０％中性ホルムアルデヒド溶液で２４～４８時間固定した。固定された脳組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗い、ヘマトキシリン及びエオジンで染色し（ＨＥ染色）、１％塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコール勾配で脱水させて封入させ、海馬を観察するために、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群（図２８Ａ）のマウスの海馬の組織形態が正常であり、溶媒群（図２８Ｂ）と比較して、投与群（図２８Ｃ）の海馬の組織損傷形態が有意に改善された。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの海馬損傷を改善できることを示している。
【実施例20】
【0100】
実施例２０は、プラスミノーゲン療法を自発的に受けたアルツハイマー病患者における治療効果に関するものである。
以下の患者は自発的に薬を服用するためのインフォームドコンセントフォームに署名し、病院倫理委員会の承認を得た。
以下の患者は自発的に薬を服用するためのインフォームドコンセントフォームに署名し、病院倫理委員会の承認を得た。
【0101】
患者１、男性、７６歳、半年前に記憶障害が起き、性格が頑固になり、記憶力及び新しいことを学ぶ能力が低下し、臨床的にアルツハイマー病と診断された。投薬計画：最初に５０ｍｇを静脈内注射し、毎日１０ｍｇを追加し、３日目から１０ｍｇを噴霧吸入した。１日１回、１３日間投与を続けた。
治療効果：家族は、投薬プロセス中に患者の精神状態が徐々に改善され、応答感度が徐々に且つ有意に改善され、投薬後の患者の新しいことを学ぶ能力及び記憶能力が改善され、記憶力も改善されたと述べた。１３日間の投薬後、体の全体的な感覚は約５０％改善し、記憶力は約５０％改善したそうである。
これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病患者の記憶力、学習能力、及び精神状態を改善できることを示している。
治療効果：家族は、投薬プロセス中に患者の精神状態が徐々に改善され、応答感度が徐々に且つ有意に改善され、投薬後の患者の新しいことを学ぶ能力及び記憶能力が改善され、記憶力も改善されたと述べた。１３日間の投薬後、体の全体的な感覚は約５０％改善し、記憶力は約５０％改善したそうである。
これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病患者の記憶力、学習能力、及び精神状態を改善できることを示している。
【0102】
患者２、女性、９６歳である。病歴：高血圧２０年以上、心臓病や糖尿病の既往なし、半年ほど前から記憶障害が起き、学習能力が低下し、思考能力及びコミュニケーション能力が低下し、怒りっぽくて無関心になり、ミニメンタルステート検査スケール（ＭＭＳＥ）で１０点を取った。
投薬計画：噴霧と静脈内注射との併用であった。１日目に噴霧吸入３回、毎回５ｍｇ、２日目から噴霧は前と同じ、３０ｍｇから開始し、静脈内注射は、毎日１０ｍｇを追加し、７日間連続投与した。
ミニメンタルステート検査スケール（Ｍｉｎｉ－Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ Ｓｃａｌｅ、ＭＭＳＥ）は、被験者の精神状態と認知障害の程度を包括的、正確かつ迅速に反映することができる。このスケールはシンプルで実施が容易であり、国内外で広く使用されており、認知症スクリーニングに好まれるスケールである。採点基準：スコア２７～３０、正常；スコア＜２７、認知障害；スコア２１～２６、軽度；スコア１０～２０、中程度；スコア０～９、重度。
治療効果：１．精神が向上した；２．老年性認知症の症状が改善され、記憶力が向上した；３．高齢者の不安が軽減された；４.ＭＭＳＥスコアは１４点であり、主に他人の指示に協力して行動する能力に反映された。投与前後のＭＭＳＥスコアを表１に示す。
これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病患者のＭＭＳＥスコアを改善し、患者の記憶力、思考能力、不安、及び精神状態を改善できることを示している。
表１ 投与前後のＭＭＳＥスコア
投薬計画：噴霧と静脈内注射との併用であった。１日目に噴霧吸入３回、毎回５ｍｇ、２日目から噴霧は前と同じ、３０ｍｇから開始し、静脈内注射は、毎日１０ｍｇを追加し、７日間連続投与した。
ミニメンタルステート検査スケール（Ｍｉｎｉ－Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ Ｓｃａｌｅ、ＭＭＳＥ）は、被験者の精神状態と認知障害の程度を包括的、正確かつ迅速に反映することができる。このスケールはシンプルで実施が容易であり、国内外で広く使用されており、認知症スクリーニングに好まれるスケールである。採点基準：スコア２７～３０、正常；スコア＜２７、認知障害；スコア２１～２６、軽度；スコア１０～２０、中程度；スコア０～９、重度。
治療効果：１．精神が向上した；２．老年性認知症の症状が改善され、記憶力が向上した；３．高齢者の不安が軽減された；４.ＭＭＳＥスコアは１４点であり、主に他人の指示に協力して行動する能力に反映された。投与前後のＭＭＳＥスコアを表１に示す。
これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病患者のＭＭＳＥスコアを改善し、患者の記憶力、思考能力、不安、及び精神状態を改善できることを示している。
表１ 投与前後のＭＭＳＥスコア
【0103】
患者３、女性、８７歳であり、記憶力と理解力が乏しく、検査のために入院し、医師は脳梗塞と診断し、記憶力と理解力に影響があり、老年性認知症の現象が現れ、軽度の意識錯乱及び亜精神錯乱状態を示し、周囲の環境を正しく識別できず、時間と場所を混乱させ、人とのコミュニケーションに困難があり、全体的な状態スコアは１０点であった。（全体的な状態スコアとして、初日に投薬を受けていない場合を１０、投薬後の昨日の状態を最も重度として１０、最も軽い状態を１、正常を０とする）。
投薬計画：１５０～２５０ｍｇの静脈内注射による投与に加えて、１回１０ｍｇの噴霧吸入により投与し、４時間ごとに１回、１日３回、１４日間投与を続けた。休薬１週間後、１週間投与を継続し、方法は前と同様であり、噴霧吸入量は１回１５ｍｇ、４時間ごとに１回、１日３回であった。休薬１週間後、また２週間投与を継続し、隔日投与し、２５０ｍｇ静脈内注射により投与し、噴霧は１回１５ｍｇ、４時間ごとに１回、１日３回投与した。その後、週に２回、４００ｍｇ静脈内注射による投与に加えて、１回１０ｍｇの噴霧により投与し、１日２回、２週間投与に変更した。現在は、週に１回、５００ｍｇを静脈内注射による投与に加えて、１回１０ｍｇ、１日２回、週に２日噴霧している。
治療の過程では、上記の症状は徐々に改善され、１４日間の投薬後、患者の気分は改善され、他者とのコミュニケーションは基本的にバリアなく、記憶が回復し、時間の概念が徐々に明確になり、全体的な状態スコアは４点であった。人とのコミュニケーションの７０％～８０％は正しく理解でき、正確に答えることができる。人の名前を間違えることが多いが、人を特定するには問題はない。
これは、プラスミノーゲンが、患者の記憶力、コミュニケーション能力、認知能力、及び見当識能力の改善など、アルツハイマー病を改善できることを示している。
投薬計画：１５０～２５０ｍｇの静脈内注射による投与に加えて、１回１０ｍｇの噴霧吸入により投与し、４時間ごとに１回、１日３回、１４日間投与を続けた。休薬１週間後、１週間投与を継続し、方法は前と同様であり、噴霧吸入量は１回１５ｍｇ、４時間ごとに１回、１日３回であった。休薬１週間後、また２週間投与を継続し、隔日投与し、２５０ｍｇ静脈内注射により投与し、噴霧は１回１５ｍｇ、４時間ごとに１回、１日３回投与した。その後、週に２回、４００ｍｇ静脈内注射による投与に加えて、１回１０ｍｇの噴霧により投与し、１日２回、２週間投与に変更した。現在は、週に１回、５００ｍｇを静脈内注射による投与に加えて、１回１０ｍｇ、１日２回、週に２日噴霧している。
治療の過程では、上記の症状は徐々に改善され、１４日間の投薬後、患者の気分は改善され、他者とのコミュニケーションは基本的にバリアなく、記憶が回復し、時間の概念が徐々に明確になり、全体的な状態スコアは４点であった。人とのコミュニケーションの７０％～８０％は正しく理解でき、正確に答えることができる。人の名前を間違えることが多いが、人を特定するには問題はない。
これは、プラスミノーゲンが、患者の記憶力、コミュニケーション能力、認知能力、及び見当識能力の改善など、アルツハイマー病を改善できることを示している。
【0104】
患者４、女性、９１歳であり、軽度の脳萎縮と軽度の認知障害と診断された。患者の記憶スコアは投薬前に１０点であり、計算能力スコアは１０点であり、見当識スコアは１０点であった（（全体的な状態スコアとして、初日に投薬を受けていない場合を１０、投薬後の昨日の状態を最も重度として１０、最も軽い状態を１、正常を０とする）。
投薬計画として、５０～１００ｍｇを静脈内注射により、１日１回、さらに噴霧吸入で１０ｍｇ／回、１日２～３回投与した。上記のように２日に１回、１３日間連続して投与した。
治療の１３日後、患者は自己記憶で９点、計算能力で９点、見当識で９点を獲得した。
これは、プラスミノーゲンが、患者の認知障害、記憶能力、計算能力、見当識能力を改善できることを示している。
投薬計画として、５０～１００ｍｇを静脈内注射により、１日１回、さらに噴霧吸入で１０ｍｇ／回、１日２～３回投与した。上記のように２日に１回、１３日間連続して投与した。
治療の１３日後、患者は自己記憶で９点、計算能力で９点、見当識で９点を獲得した。
これは、プラスミノーゲンが、患者の認知障害、記憶能力、計算能力、見当識能力を改善できることを示している。
【0105】
患者５、女性、７９歳であり、４年前から記憶力の低下、機嫌の悪さなどの症状が出現し、徐々に悪化した。現在、患者は比較的静かであり、集中力が２分を超えず、言語表現が損なわれ、短期記憶が失われている。時間や場所の区別がつかず、悲しみやすく、セルフケア能力が喪失した。ＭＭＳＥスコアで３点を取った。
投薬計画：最初に５０ｍｇの静脈内注射により投与し、２日ごとに５０ｍｇを追加し、１４日間連続して投与し、その後は週に２回、毎回４００ｍｇで、合計３０日間投与した。
投薬の４日目から、集中力と理解力がわずかに改善し、投薬７日目には理解力と注意力がさらに向上し、質問を理解して一生懸命答えようとするようになり、投薬１０日目にはより多くのものや親戚を認識し、思い出すことができた。投薬１４日目に、注意力は７～８分間集中することができ、起こったばかりのことについて、状態が良好であれば、記憶は６～７分間持続できた。投薬２１日目に、３０分間以上集中できた。投薬２４日後、たった今起こったことの記憶が約１時間持続し、言語表現も豊かになり、ＭＭＳＥスコアは９点であった。投薬３０日後にＭＭＳＥスコアは９点であった。休薬１か月後、計算能力は改善し、ＭＭＳＥスコアは８点であった。投与前後のＭＭＳＥスコアを表２に示す。
これは、プラスミノーゲンがアルツハイマー病患者のＭＭＳＥスコアを改善し、患者の記憶能力、認知能力、注意力、理解力、言語表現能力、及び計算能力を改善できることを示している。
表２ 投与前後のＭＭＳＥスコア
参考文献：
[1]Selkoe D J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy[J]. Physiol. Rev, 2001, 81 (2): 741-766.
[2]Oakley H, Cole S L, Logan S, et al. Intraneuronal β-Amyloid Aggregates, Neurodegeneration, and Neuron Loss in Transgenic Mice with Five Familial Alzheimer's Disease Mutations: Potential Factors in Amyloid Plaque Formation[J]. Journal of Neuroscience, 2006, 26(40):10129-10140.
[3]Moon M , Choi J G , Kim S Y , et al. Bombycis Excrementum Reduces Amyloid-β Oligomer-Induced Memory Impairments, Neurodegeneration, and Neuroinflammation in Mice[J]. Journal of Alzheimer's disease: JAD, 2014, 41(2).
[4]Park S W , Kim J H , Mook-Jung I , et al. Intracellular amyloid beta alters he tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice[J]. Neurobiology of Aging, 2014, 35(9):2013-2020.
[5]Naseri NN, Wang H, Guo J, Sharma M, Luo W. The complexity of tau in Alzheimer's disease. Neurosci Lett. 2019 Jul 13;705:183-194.
[6]Gray K, Ellis V . Activation of pro-BDNF by the pericellular serine protease plasmin [J]. Febs Letters, 2008, 582(6):907-910.
[7]Kowianski, Przemys?aw, Lietzau G , Czuba E , et al. BDNF: A Key Factor with Multipotent Impact on Brain Signaling and Synaptic Plasticity[J]. Cellular & Molecular Neurobiology, 2017
[8]Aloe L, Rocco M L , Bianchi P , et al. Nerve growth factor: from the early discoveries to the potential clinical use[J]. Journal of Translational Medicine, 2012, 10(1).
投薬計画：最初に５０ｍｇの静脈内注射により投与し、２日ごとに５０ｍｇを追加し、１４日間連続して投与し、その後は週に２回、毎回４００ｍｇで、合計３０日間投与した。
投薬の４日目から、集中力と理解力がわずかに改善し、投薬７日目には理解力と注意力がさらに向上し、質問を理解して一生懸命答えようとするようになり、投薬１０日目にはより多くのものや親戚を認識し、思い出すことができた。投薬１４日目に、注意力は７～８分間集中することができ、起こったばかりのことについて、状態が良好であれば、記憶は６～７分間持続できた。投薬２１日目に、３０分間以上集中できた。投薬２４日後、たった今起こったことの記憶が約１時間持続し、言語表現も豊かになり、ＭＭＳＥスコアは９点であった。投薬３０日後にＭＭＳＥスコアは９点であった。休薬１か月後、計算能力は改善し、ＭＭＳＥスコアは８点であった。投与前後のＭＭＳＥスコアを表２に示す。
これは、プラスミノーゲンがアルツハイマー病患者のＭＭＳＥスコアを改善し、患者の記憶能力、認知能力、注意力、理解力、言語表現能力、及び計算能力を改善できることを示している。
表２ 投与前後のＭＭＳＥスコア
[1]Selkoe D J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy[J]. Physiol. Rev, 2001, 81 (2): 741-766.
[2]Oakley H, Cole S L, Logan S, et al. Intraneuronal β-Amyloid Aggregates, Neurodegeneration, and Neuron Loss in Transgenic Mice with Five Familial Alzheimer's Disease Mutations: Potential Factors in Amyloid Plaque Formation[J]. Journal of Neuroscience, 2006, 26(40):10129-10140.
[3]Moon M , Choi J G , Kim S Y , et al. Bombycis Excrementum Reduces Amyloid-β Oligomer-Induced Memory Impairments, Neurodegeneration, and Neuroinflammation in Mice[J]. Journal of Alzheimer's disease: JAD, 2014, 41(2).
[4]Park S W , Kim J H , Mook-Jung I , et al. Intracellular amyloid beta alters he tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice[J]. Neurobiology of Aging, 2014, 35(9):2013-2020.
[5]Naseri NN, Wang H, Guo J, Sharma M, Luo W. The complexity of tau in Alzheimer's disease. Neurosci Lett. 2019 Jul 13;705:183-194.
[6]Gray K, Ellis V . Activation of pro-BDNF by the pericellular serine protease plasmin [J]. Febs Letters, 2008, 582(6):907-910.
[7]Kowianski, Przemys?aw, Lietzau G , Czuba E , et al. BDNF: A Key Factor with Multipotent Impact on Brain Signaling and Synaptic Plasticity[J]. Cellular & Molecular Neurobiology, 2017
[8]Aloe L, Rocco M L , Bianchi P , et al. Nerve growth factor: from the early discoveries to the potential clinical use[J]. Journal of Translational Medicine, 2012, 10(1).
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【配列表】