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特許7577054血漿サンプル中のマイクロサテライトの安定性およびゲノム変化を検出する次世代シークエンシングに基く方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-24
(45)【発行日】2024-11-01
(54)【発明の名称】血漿サンプル中のマイクロサテライトの安定性およびゲノム変化を検出する次世代シークエンシングに基く方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20241025BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20241025BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C12Q1/6869 Z
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2021517643
(86)(22)【出願日】2019-09-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-12
(86)【国際出願番号】 CN2019109036
(87)【国際公開番号】W WO2020063964
(87)【国際公開日】2020-04-02
【審査請求日】2022-09-26
(31)【優先権主張番号】201811149015.9
(32)【優先日】2018-09-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201811149011.0
(32)【優先日】2018-09-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】519271584
【氏名又は名称】▲広▼州燃石医学▲検▼▲験▼所有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＧＵＡＮＧＺＨＯＵ ＢＵＲＮＩＮＧ ＲＯＣＫ ＤＸ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100162684
【弁理士】
【氏名又は名称】呉 英燦
(74)【代理人】
【識別番号】100221523
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 渉
(74)【代理人】
【識別番号】100126778
【弁理士】
【氏名又は名称】品川 永敏
(72)【発明者】
【氏名】漢 雨生
(72)【発明者】
【氏名】劉 成林
(72)【発明者】
【氏名】張 之宏
(72)【発明者】
【氏名】張 周
(72)【発明者】
【氏名】段 飛蝶
【審査官】山内 達人
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０７５１３５６５（ＣＮ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ１２Ｍ
Ｃ１２Ｑ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
血漿サンプル中のマイクロサテライトの安定性を検出するためのキットであって、前記キットが、ｂＭＳ－ＢＲ３、ｂＭＳ－ＢＲ４、ｂＭＳ－ＢＲ７、ｂＭＳ－ＢＲ１、ｂＭＳ－ＢＲ５、ｂＭＳ－ＢＲ２、ｂＭＳ－ＢＲ６、およびｂＭＳ－ＢＲ８を含むバイオマーカーパネルのための検出試薬を含み、前記検出試薬が、次世代ハイスループットシークエンシング（ＮＧＳ）を実施するための試薬であり、
前記キットが、癌の非侵襲的診断、予後評価、治療法の選択または遺伝学的スクリーニングで使用され、
前記血漿サンプルが、癌血漿サンプルであり、
前記検出試薬が、プローブであることを特徴とする、キット。
【請求項2】
前記キットが、結腸直腸癌、胃癌または子宮内膜癌の非侵襲的診断、予後評価、治療法の選択または遺伝学的スクリーニングで使用される、請求項１に記載のキット。
【請求項3】
前記キットが、腸癌の非侵襲的診断、予後評価、治療法の選択または遺伝学的スクリーニングで使用される、請求項１に記載のキット。
【請求項4】
前記血漿サンプルが、結腸直腸癌血漿サンプル、胃癌血漿サンプルまたは子宮内膜癌血漿サンプルである、請求項１に記載のキット。
【請求項5】
前記血漿サンプルが、腸癌血漿サンプルである、請求項１に記載のキット。
【請求項6】
前記検出試薬が、以下の４１個の遺伝子：ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＡＴＭ、ＢＬＭ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＨ１、ＣＨＥＫ２、ＣＹＰ２Ｄ６、ＤＰＹＤ、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ２、ＧＡＬＮＴ１２、ＧＲＥＭ１、ＨＲＡＳ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＯＬＤ１、ＰＯＬＥ、ＰＴＣＨ１、ＰＴＥＮ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＳＭＡＤ４、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、およびＵＧＴ１Ａ１のうちのいずれか１つ以上のエクソンおよびイントロン領域を捕捉するためのビオチン標識プローブセットを含む、請求項１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
＜関連出願への相互参照＞
本出願は、２０１８年０９月２９日に出願された、出願番号がＣＮ２０１８１１１４９０１１．０、発明名称が「血漿からマイクロサテライトの安定性およびゲノム変化を検出する次世代シークエンシングに基く方法」である特許出願、および２０１８年０９月２９日に出願された、出願番号がＣＮ２０１８１１１４９０１５．９、発明名称が「マイクロサテライトバイオマーカーパネル、検出キットおよびその使用」である特許出願の優先権を主張する。
本出願は、２０１８年０９月２９日に出願された、出願番号がＣＮ２０１８１１１４９０１１．０、発明名称が「血漿からマイクロサテライトの安定性およびゲノム変化を検出する次世代シークエンシングに基く方法」である特許出願、および２０１８年０９月２９日に出願された、出願番号がＣＮ２０１８１１１４９０１５．９、発明名称が「マイクロサテライトバイオマーカーパネル、検出キットおよびその使用」である特許出願の優先権を主張する。
【0002】
＜技術分野＞
本発明は、バイオマーカーパネル、それを検出するキット、それを用いた血漿サンプル中のマイクロサテライトの安定性を検出する方法、および癌（好ましくは結腸直腸癌（例えば腸癌）、胃癌または子宮内膜癌）の非侵襲的診断、予後評価、治療法の選択、または遺伝学的スクリーニングにおけるその使用に関する。
本発明は、バイオマーカーパネル、それを検出するキット、それを用いた血漿サンプル中のマイクロサテライトの安定性を検出する方法、および癌（好ましくは結腸直腸癌（例えば腸癌）、胃癌または子宮内膜癌）の非侵襲的診断、予後評価、治療法の選択、または遺伝学的スクリーニングにおけるその使用に関する。
【背景技術】
【0003】
マイクロサテライトは、ゲノムにおける反復ＤＮＡ短配列または単一ヌクレオチド領域である。腫瘍細胞において、ＤＮＡメチル化または遺伝子突然変異によってミスマッチ修復遺伝子が機能しなくなると、マイクロサテライト反復配列ミスマッチ（マイクロサテライト変異）が引き起こし、その配列が短縮しったり延長しったりして、それによってマイクロサテライト不安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＭＳＩ）が生じる。ＭＳＩの不安定性の程度に応じて、高頻度マイクロサテライト不安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ－ｈｉｇｈ，ＭＳＩ－Ｈ）、低頻度マイクロサテライト不安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ－ｌｏｗ，ＭＳＩ－Ｌ）およびマイクロサテライト安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｓｔａｂｌｅ，ＭＳＳ）のタイプに分類される。
【0004】
ＭＳＩは悪性腫瘍の発症に関与しており、結腸直腸癌（例えば腸癌）、胃癌および子宮内膜癌と密接に関連していることが多数の研究により示されている。例えば、結腸直腸癌患者の約１５％がＭＳＩ－Ｈ現象を示し、そのなかの典型的な遺伝性非ポリポーシス性結腸直腸癌（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｎｏｎｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ，ＨＮＰＣＣ）患者の９０％以上がＭＳＩ－Ｈを示し、これは、ＭＳＩ－ＨがＨＮＰＣＣ患者を検出する際の重要なマーカーとして使用できることを表す。ＭＳＳ（即ち、マイクロサテライト安定性）の結腸直腸癌と比較して、ＭＳＩ－Ｈを有する結腸直腸癌患者は、予後がより良好であり、また、両者の薬物応答性も異なり、これはＭＳＩ－Ｈが結腸直腸癌の予後の独立した予測因子として使用できることを示唆する。したがって、ＭＳＩ検査は結腸直腸癌患者にとって非常に重要である。
【0005】
２０１６年最新版の全米総合癌情報ネットワーク（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ、ＮＣＣＮ、２０１６ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２）の結腸直腸癌治療ガイドラインは、はじめて「結腸直腸癌の既往歴のあるすべての患者は、ＭＭＲ（ミスマッチ修復）またはＭＳＩの検査を受けるべきである」と明確に述べている。それは、ＭＳＩ－Ｈ（即ち、高マイクロサテライト不安定性）のＩＩ期結腸直腸癌の予後は良好（単純手術５ｙ－ＯＳ率が８０％）であり、且つ５ＦＵ補助化学療法の恩恵を受けることができない（逆に有害である）ためである。また、ガイドラインは、はじめてＰＤ－１モノクローナル抗体ＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂおよびＮｉｖｏｌｕｍａｂを、ｄＭＭＲ／ＭＳＩ－Ｈ分子表現型を有するｍＣＲＣ末期治療に応用することを推奨し、末期結腸直腸癌におけるＭＭＲおよびＭＳＩの検出の重要性を十分に実証している。同時に、遺伝性結腸直腸癌に関連する遺伝子の数が多いため、２０１６年最新のＮＣＣＮ結腸直腸癌遺伝的リスク評価ガイドラインには、明らかな家族歴を有する患者およびその家族は、多遺伝子パネル（ｐａｎｅｌ）シークエンシングを使用し最初の検出を実施することを推奨している。
【0006】
２０１７年、メルク社のＰＤ－１モノクローナル抗体Ｋｅｙｔｒｕｄａは、ＭＳＩ－Ｈまたはミスマッチ修復の欠損（ｄＭＭＲ）を伴う固形腫瘍患者の治療薬として米国のＦＤＡによって承認された。これは、ＭＳＩ－Ｈが腫瘍の部位に依存しない汎癌の腫瘍マーカーとして使用できることを改めて証明した。したがって、ＭＳＩによる癌の検出は非常に重要である。
【0007】
現在、ＭＳＩの検出方法は組織の検出に限定される。例えば、中国の病院で実施されているＭＭＲ遺伝子検査は、通常、ＭＬＨ１とＭＳＨ２のみを含み、その一部にはＭＳＨ６とＰＭＳ２も同時に含むが、その陽性結果とＭＳＩ検査結果との一致率が低い。少数の病院のみはキャピラリー電気泳動法と組み合わせたＰＣＲ法によるＭＳＩ状態検出を実施しており、それらのほとんどは外部委託検出である。この方法では、通常、長さが約２５ｂｐである５～１１個の単一ヌクレオチド反復部位を選択し、ＰＣＲ増幅した後、キャピラリー電気泳動によってその長さ分布間隔を測定して、サンプルのマイクロサテライト不安定性を判定する。この方法は、現在のゴールドスタンダード検出方法である。最近、次世代シークエンシングに基づく組織におけるＭＳＩの検出方法は、ＰＣＲ－ＭＳＩと非常に高い一致率を示すことが証明されており、ＭＳＩの状態を判断しながらゲノムマップを作成して、癌の診断により多くの情報を提供できるようになっている。しかし、これらの方法はいずれも、十分の腫瘍細胞の割合を必要する。血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は極めて少ないため、組織に基づく方法は血漿中では実現できない。
【0008】
腫瘍の血液検査は、組織検査にはない非侵襲性、リアルタイム性、非組織特異性などの特徴があり、臨床的にも重要な意義を持つ。したがって、当技術分野では、血漿に基くＭＳＩ検出方法、特に癌、好ましくは結腸直腸癌（例えば腸癌）、胃癌または子宮内膜癌の非侵襲的診断、予後評価、治療法の選択、または遺伝学的スクリーニングにおいて、腫瘍の血液検査でＭＳＩを検出する方法が切望されている。
【発明の概要】
【0009】
本発明は、初めて血漿ＭＳＩの検出方法を提出し、組織ＭＳＩの検出と比較して、本発明の血漿ＭＳＩの検出は、非侵襲性、リアルタイム性、非組織特異性、複数の病変を早期に検出できることなどの特徴がある。同時に、本発明の方法は、ｃｔＤＮＡ含有量が非常に低い血漿サンプル中のマイクロサテライト状態の検出を実現することができ、血漿サンプルによるマイクロサテライト状態の検出のギャップを埋めた。また、本発明の方法は、検出速度が速く、白血球サンプルのマッチングに依存せず、価格が低く、検出が便利で、サンプルのマイクロサテライトの安定性（ＭＳ）の状態を高精度、高感度、高特異性で判定することができる。
【0010】
さらに、本発明の検出方法は、癌、好ましくは結腸直腸癌（例えば腸癌）、胃癌または子宮内膜癌の患者への非侵襲的診断、予後評価、または治療法の選択に使用することができる。
【0011】
具体的には、本発明は以下の態様に関するものである。
【0012】
一側面では、本発明は、表１に示される８つのマイクロサテライト遺伝子座のうちの１つ以上を含むバイオマーカーパネルを提供する。
【0013】
別の一側面では、本発明は、マイクロサテライト遺伝子座と１つ以上の遺伝子との組み合わせを含むバイオマーカーパネルを提供し、ここで、マイクロサテライト遺伝子座は、請求項１に示される８つのマイクロサテライト遺伝子座、またはそれらのいずれか、又はそれらのいくつかの組み合わせを含み、１つ以上の遺伝子は、以下の４１種の遺伝子：ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＡＴＭ、ＢＬＭ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＨ１、ＣＨＥＫ２、ＣＹＰ２Ｄ６、ＤＰＹＤ、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ２、ＧＡＬＮＴ１２、ＧＲＥＭ１、ＨＲＡＳ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＯＬＤ１、ＰＯＬＥ、ＰＴＣＨ１、ＰＴＥＮ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＳＭＡＤ４、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、ＵＧＴ１Ａ１のいずれか１つ以上である。
【0014】
別の一側面では、本発明は、血漿サンプル中のマイクロサテライトの安定性を検出するためのキットであって、本発明のバイオマーカーパネルに使用するための検出試薬を含むことを特徴とするキットを提供する。
【0015】
別の一側面では、本発明は、癌、好ましくは結腸直腸癌（例えば腸癌）、胃癌または子宮内膜癌の非侵襲的診断、予後評価、治療法の選択または遺伝学的スクリーニングに使用するためのキットであって、本発明のバイオマーカーパネルに使用するための検出試薬を含むことを特徴とするキットを提供する。
【0016】
好ましくは、本発明によって提供されるキットにおいて、前記の血漿サンプルは、癌血漿サンプル、好ましくは、腸癌血漿サンプルのような結腸直腸癌血漿サンプル、胃癌血漿サンプル、子宮内膜癌血漿サンプルである。より好ましくは、前記のマイクロサテライトの安定性は、高頻度マイクロサテライト不安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ－ｈｉｇｈ，ＭＳＩ－Ｈ）、低頻度マイクロサテライト不安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ－ｌｏｗ，ＭＳＩ－Ｌ）、およびマイクロサテライト安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｓｔａｂｌｅ，ＭＳＳ）のタイプを含む。
【0017】
一実施形態では、本発明によって提供されるキットにおいて、前記の検出試薬は、ハイスループット次世代シークエンシング（Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）を実行するための試薬である。
【0018】
さらに、本発明は、血漿サンプル中のマイクロサテライトの安定性の検出における、バイオマーカーパネルの使用に関する。好ましくは、前記の血漿サンプルは、癌血漿サンプル、好ましくは腸癌血漿サンプルのような結腸直腸癌血漿サンプル、胃癌血漿サンプル、子宮内膜癌血漿サンプルである。より好ましくは、前記のマイクロサテライトの安定性は、高頻度マイクロサテライト不安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ－ｈｉｇｈ，ＭＳＩ－Ｈ）、低頻度マイクロサテライト不安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ－ｌｏｗ，ＭＳＩ－Ｌ）、およびマイクロサテライト安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｓｔａｂｌｅ，ＭＳＳ）のタイプを含む。
【0019】
また、本発明は、癌、好ましくは結腸直腸癌（例えば腸癌）、胃癌または子宮内膜癌の非侵襲的診断、予後評価、治療法の選択または遺伝学的スクリーニングにおける、バイオマーカーパネルの使用に関する。
【0020】
一側面では、本発明は、以下の工程を含む、血漿サンプル中のマイクロサテライトの安定性の状態の検出に使用することができるマイクロサテライトマーカー遺伝子座を判定する方法を提供する。
１）サンプルにおけるシークエンシング領域のマイクロサテライト遺伝子座を検出する工程；
２）マイクロサテライト遺伝子座ｉのいずれか１つについて、ＮＧＳデータ統計によってカウントされた異なる反復配列の長さタイプのリード（リード（ｒｅａｄｓ）とは、単一のＤＮＡ断片のすべてまたは一部に対応する塩基対（または塩基対確率）の推定された配列）の数をカウントする工程；および
３）マイクロサテライト遺伝子座のいずれか１つについて、マイクロサテライト安定性タイプ（ＭＳＳ）での遺伝子座の反復配列の長さ特性、および高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）での遺伝子座の反復配列の長さ特性を判定し；ここで、ＭＳＳの長さ特性は、ＭＳＳサンプル中の対応するリードの数が、その遺伝子座でサポートされるリードの総数の７５％を超えるような、連続した長さの最小範囲であり；ＭＳＩ－Ｈの長さ特性は、ＭＳＳサンプルとＭＳＩ－Ｈサンプルにおいて高度に区別される連続した長さの範囲であり、ここで、ａ）この範囲でサポートされるリードの総数が、ＭＳＳサンプルにおける該遺伝子座のリードの総数の０．２％未満であり、且つｂ）ＭＳＩ－Ｈサンプルにおける該遺伝子座のリードの総数の５０％以上を占め、上記の特徴を有するマイクロサテライト遺伝子座を、マイクロサテライト遺伝子座の検出マーカーとする工程。
１）サンプルにおけるシークエンシング領域のマイクロサテライト遺伝子座を検出する工程；
２）マイクロサテライト遺伝子座ｉのいずれか１つについて、ＮＧＳデータ統計によってカウントされた異なる反復配列の長さタイプのリード（リード（ｒｅａｄｓ）とは、単一のＤＮＡ断片のすべてまたは一部に対応する塩基対（または塩基対確率）の推定された配列）の数をカウントする工程；および
３）マイクロサテライト遺伝子座のいずれか１つについて、マイクロサテライト安定性タイプ（ＭＳＳ）での遺伝子座の反復配列の長さ特性、および高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）での遺伝子座の反復配列の長さ特性を判定し；ここで、ＭＳＳの長さ特性は、ＭＳＳサンプル中の対応するリードの数が、その遺伝子座でサポートされるリードの総数の７５％を超えるような、連続した長さの最小範囲であり；ＭＳＩ－Ｈの長さ特性は、ＭＳＳサンプルとＭＳＩ－Ｈサンプルにおいて高度に区別される連続した長さの範囲であり、ここで、ａ）この範囲でサポートされるリードの総数が、ＭＳＳサンプルにおける該遺伝子座のリードの総数の０．２％未満であり、且つｂ）ＭＳＩ－Ｈサンプルにおける該遺伝子座のリードの総数の５０％以上を占め、上記の特徴を有するマイクロサテライト遺伝子座を、マイクロサテライト遺伝子座の検出マーカーとする工程。
【0021】
一実施形態では、マイクロサテライトマーカー遺伝子座の判定方法において、前記のサンプルは、正常な白血球および癌患者の組織に由来するサンプルを含み、ここで、前記の癌が、好ましくは結腸直腸癌（例えば腸癌）、胃癌または子宮内膜癌である。好ましくは、本発明のマイクロサテライトマーカー遺伝子座の判定方法で判定されるマイクロサテライト遺伝子座は、表１に示される８つのマイクロサテライト遺伝子座のうちの１つ以上を含む。
【0022】
より好ましくは、マイクロサテライトマーカー遺伝子座の判定方法において、前記のマイクロサテライトの安定性の状態の検出は、癌、好ましくは結腸直腸癌（例えば腸癌）、胃癌または子宮内膜癌の非侵襲的診断、予後評価、治療法の選択または遺伝学的スクリーニングに用いられる。
【0023】
一側面では、本発明は、以下の工程を含む、次世代ハイスループットシークエンシング法に基づいて癌患者の血漿サンプルによってマイクロサテライト遺伝子座の安定性を判定する方法を提供する。
１）次世代シークエンシング法に基づいて、血漿サンプルおよび参照サンプルとしてのＭＳＳ血漿サンプルにおける複数のマイクロサテライト遺伝子座の反復配列の長さ特性を測定し、ここで、前記の複数のマイクロサテライト遺伝子座が、表１に示される８つのマイクロサテライト遺伝子座から選択される１つ以上のマイクロサテライト遺伝子座を含む工程；
２）１）に記載のマイクロサテライト遺伝子座のいずれか１つについて、その対応するエンリッチメント指数（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｉｎｄｅｘ）Ｚｓｃｏｒｅを算出する工程；
３）すべてのマイクロサテライト遺伝子座のエンリッチメント指数Ｚｓｃｏｒｅを合計して、サンプルのマイクロサテライトの状態を判断する指数ＭＳｓｃｏｒｅを算出する工程；
４）参照サンプルとしてのＭＳＳ血漿サンプルのＭＳｓｃｏｒｅの平均値（ｍｅａｎ）および標準偏差ＳＤを算出し、そのｍｅａｎ＋３ＳＤを閾値ｃｕｔｏｆｆとする工程；
５）癌患者に由来する血漿サンプルについて、そのＭＳｓｃｏｒｅ＞ｃｕｔｏｆｆの場合は該サンプルをＭＳＩ－Ｈと判定し、ＭＳｓｃｏｒｅ≦ｃｕｔｏｆｆの場合は該サンプルをＭＳＳと判定する工程。
１）次世代シークエンシング法に基づいて、血漿サンプルおよび参照サンプルとしてのＭＳＳ血漿サンプルにおける複数のマイクロサテライト遺伝子座の反復配列の長さ特性を測定し、ここで、前記の複数のマイクロサテライト遺伝子座が、表１に示される８つのマイクロサテライト遺伝子座から選択される１つ以上のマイクロサテライト遺伝子座を含む工程；
２）１）に記載のマイクロサテライト遺伝子座のいずれか１つについて、その対応するエンリッチメント指数（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｉｎｄｅｘ）Ｚｓｃｏｒｅを算出する工程；
３）すべてのマイクロサテライト遺伝子座のエンリッチメント指数Ｚｓｃｏｒｅを合計して、サンプルのマイクロサテライトの状態を判断する指数ＭＳｓｃｏｒｅを算出する工程；
４）参照サンプルとしてのＭＳＳ血漿サンプルのＭＳｓｃｏｒｅの平均値（ｍｅａｎ）および標準偏差ＳＤを算出し、そのｍｅａｎ＋３ＳＤを閾値ｃｕｔｏｆｆとする工程；
５）癌患者に由来する血漿サンプルについて、そのＭＳｓｃｏｒｅ＞ｃｕｔｏｆｆの場合は該サンプルをＭＳＩ－Ｈと判定し、ＭＳｓｃｏｒｅ≦ｃｕｔｏｆｆの場合は該サンプルをＭＳＳと判定する工程。
【0024】
一実施形態では、次世代ハイスループットシークエンシング法に基づいて癌患者の血漿サンプルによってマイクロサテライト遺伝子座の安定性の状態を判定する方法において、前記のＺｓｃｏｒｅは、ＨＳによって評価される。
式中、ＮはＭＳＩ－Ｈ状態およびＭＳＳ状態の反復配列の長さのセットのｒｅａｄｓの総数であり、ＫはＭＳＩ－Ｈ状態の反復配列の長さのセットのリードの総数であり、Ｎ－ＫはＭＳＳ状態の反復配列の長さのセットのリードの総数であり、これらに対応して、ｎおよびｋはそれぞれ、測定サンプルにおける対応するリードの数である。
【数1】
【数2】
【0025】
一実施形態では、次世代ハイスループットシークエンシング法に基づいて癌患者の血漿サンプルによってマイクロサテライト遺伝子座の安定性の状態を判定する方法において、ＭＳｓｃｏｒｅは、以下の式に基づいて算出する。
【数3】
【0026】
好ましくは、前記の癌は、結腸直腸癌（例えば腸癌）、胃癌または子宮内膜癌である。
【0027】
さらに、別の側面において、本発明は、以下の工程を含む、次世代ハイスループットシークエンシング法に基づいて患者におけるマイクロサテライトの安定性の状態および疾患関連遺伝子変異を検出することで、該患者またはその家族のリスク管理、治療および／または予後に関する臨床的ガイダンスを提供する方法を提供する。
（１）請求項１５に記載の複数のマイクロサテライト遺伝子座を同時に検出する工程；
（２）請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法に従って、前記のサンプル中のマイクロサテライト遺伝子座の安定性の状態を判定する工程；
（３）シークエンシングの結果に従って、１つ以上の前記の疾患関連遺伝子の検出結果を取得する工程；
（４）上記の工程（２）、（３）の結果を組み合わせることにより、該患者またはその家族のリスク管理、治療および／または予後に関する臨床的ガイダンスを提供する工程。
（１）請求項１５に記載の複数のマイクロサテライト遺伝子座を同時に検出する工程；
（２）請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法に従って、前記のサンプル中のマイクロサテライト遺伝子座の安定性の状態を判定する工程；
（３）シークエンシングの結果に従って、１つ以上の前記の疾患関連遺伝子の検出結果を取得する工程；
（４）上記の工程（２）、（３）の結果を組み合わせることにより、該患者またはその家族のリスク管理、治療および／または予後に関する臨床的ガイダンスを提供する工程。
【0028】
好ましくは、本発明によって提供される、次世代ハイスループットシークエンシングに基づいて患者におけるマイクロサテライトの安定性の状態および疾患関連遺伝子変異を検出することで、該患者またはその家族のリスク管理、治療および／または予後に関する臨床的ガイダンスを提供する方法において、前記の疾患は癌、好ましくは結腸直腸癌（例えば腸癌）、胃癌または子宮内膜癌である。
【0029】
さらに、別の側面において、本発明は、前記の複数のマイクロサテライト遺伝子座を検出するための試薬を含む、本発明の様々な方法のうちの１つに用いられるキットに関する。
【0030】
さらに、別の側面において、本発明は、以下のモジュールを含む、血漿サンプル中のマイクロサテライトの安定性の状態の検出に用いられるマイクロサテライトマーカー遺伝子座を判定するための装置を提供する。
シークエンシング装置で取得して保存したサンプルのシークエンシングデータを読み取るためのシークエンシングデータ読み取りモジュール；
サンプルのシークエンシングデータから、サンプルにおけるシークエンシング領域のすべてのマイクロサテライト遺伝子座を解析して検出するためのマイクロサテライトマーカー遺伝子座検出モジュール；
マイクロサテライト遺伝子座ｉのいずれか１つについて、シークエンシングデータ読み取りモジュールで読み取られたサンプルシーケンスデータによって、異なる反復配列の各長さタイプのリードの数をカウントするための反復配列長さタイプ判定モジュール；および
第１の解析モジュール、第２の解析モジュール、および第３の解析モジュールを含む、マイクロサテライト遺伝子座ｉのいずれか１つがマイクロサテライトマーカー遺伝子座であるかどうかを判定するための判定モジュール；
前記の第１の解析モジュールは、マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）での遺伝子座反復配列の長さ特性を判定し、また、ＭＳＳサンプル中の対応するリードの数が遺伝子座でサポートされるリードの総数の７５％を超えるかどうかを判定するために使用され、ここで、ＭＳＳの長さ特性が連続した長さの最小範囲であり、肯定的な結果が得られた場合では「＋」と記録し、否定的な結果が得られた場合では「－」と記録し、
前記の第２の解析モジュールは、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）での遺伝子座反復配列の長さ特性を判定し、また以下のａ）およびｂ）を判定するために使用され、ここで、ＭＳＩ－Ｈの長さ特性が、ＭＳＳサンプルとＭＳＩ－Ｈサンプルにおいて高度に区別される連続した長さの範囲であり、ａ）前記の連続した長さの範囲内でサポートされるリードの総数が、ＭＳＳサンプルにおける遺伝子座のリードの総数の０．２％未満であるかどうかを判定し、肯定的な結果が得られた場合では「＋」と記録し、否定的な結果が得られた場合では「－」と記録し、
ｂ）前記のリードが、ＭＳＩ－Ｈサンプルにおける該遺伝子座のリードの総数の５０％以上を占めるかどうかを判定し、肯定的な結果が得られた場合では「＋」と記録し、否定的な結果が得られた場合では「－」と記録し、
前記の第３の解析モジュールは、第１の解析モジュールおよび第２の解析モジュールの結果を分析するために使用され、３つの肯定的な結果、即ち３つの「＋」が得られた場合では、前記のマイクロサテライト遺伝子座ｉをマイクロサテライトマーカー遺伝子座として判定する。
シークエンシング装置で取得して保存したサンプルのシークエンシングデータを読み取るためのシークエンシングデータ読み取りモジュール；
サンプルのシークエンシングデータから、サンプルにおけるシークエンシング領域のすべてのマイクロサテライト遺伝子座を解析して検出するためのマイクロサテライトマーカー遺伝子座検出モジュール；
マイクロサテライト遺伝子座ｉのいずれか１つについて、シークエンシングデータ読み取りモジュールで読み取られたサンプルシーケンスデータによって、異なる反復配列の各長さタイプのリードの数をカウントするための反復配列長さタイプ判定モジュール；および
第１の解析モジュール、第２の解析モジュール、および第３の解析モジュールを含む、マイクロサテライト遺伝子座ｉのいずれか１つがマイクロサテライトマーカー遺伝子座であるかどうかを判定するための判定モジュール；
前記の第１の解析モジュールは、マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）での遺伝子座反復配列の長さ特性を判定し、また、ＭＳＳサンプル中の対応するリードの数が遺伝子座でサポートされるリードの総数の７５％を超えるかどうかを判定するために使用され、ここで、ＭＳＳの長さ特性が連続した長さの最小範囲であり、肯定的な結果が得られた場合では「＋」と記録し、否定的な結果が得られた場合では「－」と記録し、
前記の第２の解析モジュールは、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）での遺伝子座反復配列の長さ特性を判定し、また以下のａ）およびｂ）を判定するために使用され、ここで、ＭＳＩ－Ｈの長さ特性が、ＭＳＳサンプルとＭＳＩ－Ｈサンプルにおいて高度に区別される連続した長さの範囲であり、ａ）前記の連続した長さの範囲内でサポートされるリードの総数が、ＭＳＳサンプルにおける遺伝子座のリードの総数の０．２％未満であるかどうかを判定し、肯定的な結果が得られた場合では「＋」と記録し、否定的な結果が得られた場合では「－」と記録し、
ｂ）前記のリードが、ＭＳＩ－Ｈサンプルにおける該遺伝子座のリードの総数の５０％以上を占めるかどうかを判定し、肯定的な結果が得られた場合では「＋」と記録し、否定的な結果が得られた場合では「－」と記録し、
前記の第３の解析モジュールは、第１の解析モジュールおよび第２の解析モジュールの結果を分析するために使用され、３つの肯定的な結果、即ち３つの「＋」が得られた場合では、前記のマイクロサテライト遺伝子座ｉをマイクロサテライトマーカー遺伝子座として判定する。
【0031】
好ましくは、本発明によって提供される血漿サンプル中のマイクロサテライトの安定性の状態の検出に用いられるマイクロサテライトマーカー遺伝子座を判定するための装置において、前記のサンプルは、正常な白血球および癌患者の組織に由来するサンプルを含み、前記の癌症は、好ましくは結腸直腸癌（例えば腸癌）、胃癌または子宮内膜癌である。より好ましくは、上記の装置によって判定されるマイクロサテライト遺伝子座は、表１に示される前記の８つのマイクロサテライト遺伝子座のうちの１つ以上を含む。
【0032】
一実施形態では、本発明によって提供される血漿サンプル中のマイクロサテライトの安定性の状態の検出に用いられるマイクロサテライトマーカー遺伝子座を判定するための装置において、前記のマイクロサテライトの安定性の状態の検出は、癌、好ましくは結腸直腸癌（例えば腸癌）、胃癌または子宮内膜癌の非侵襲的診断、予後評価、治療法の選択または遺伝学的スクリーニングに用いられる。
【0033】
さらに、別の側面において、本発明は、以下のモジュールを含む、次世代ハイスループットシークエンシング法に基づいて癌患者の血漿サンプルによってマイクロサテライト遺伝子座の安定性の状態を判定するための装置を提供する。
シークエンシング装置で取得して保存したサンプルのシークエンシングデータを読み取るためのシークエンシングデータ読み取りモジュール；
サンプルのシークエンシングデータから、血漿サンプルおよび参照サンプルとしてのＭＳＳ血漿サンプルにおける複数のマイクロサテライト遺伝子座の反復配列の長さ特性を解析するための反復配列長さ特性判定モジュール；
ここで、前記の複数のマイクロサテライト遺伝子座が、表１に示される８つのマイクロサテライト遺伝子座から選択される１つ以上のマイクロサテライト遺伝子座を含み；
マイクロサテライト遺伝子座のエンリッチメント指数Ｚｓｃｏｒｅを算出するためのエンリッチメント指数算出モジュール；
すべてのマイクロサテライト遺伝子座のエンリッチメント指数Ｚｓｃｏｒｅを合計して、サンプルのマイクロサテライトの状態を判断することができる指数ＭＳｓｃｏｒｅを算出するためのマイクロサテライト状態指数算出モジュール；
参照サンプルとしてのＭＳＳ血漿サンプルのＭＳｓｃｏｒｅの平均値ｍｅａｎおよび標準偏差ＳＤを算出し、そのｍｅａｎ＋３ＳＤを閾値ｃｕｔｏｆｆとする閾値算出モジュール；および
癌患者に由来する血漿サンプルについて、そのＭＳｓｃｏｒｅ＞ｃｕｔｏｆｆの場合は該サンプルをＭＳＩ－Ｈと判定し、ＭＳｓｃｏｒｅ≦ｃｕｔｏｆｆの場合は該サンプルをＭＳＳと判定するような、指数ＭＳｓｃｏｒｅと閾値ｃｕｔｏｆｆを比較するためのマイクロサテライト遺伝子座安定性状態判定モジュール。
シークエンシング装置で取得して保存したサンプルのシークエンシングデータを読み取るためのシークエンシングデータ読み取りモジュール；
サンプルのシークエンシングデータから、血漿サンプルおよび参照サンプルとしてのＭＳＳ血漿サンプルにおける複数のマイクロサテライト遺伝子座の反復配列の長さ特性を解析するための反復配列長さ特性判定モジュール；
ここで、前記の複数のマイクロサテライト遺伝子座が、表１に示される８つのマイクロサテライト遺伝子座から選択される１つ以上のマイクロサテライト遺伝子座を含み；
マイクロサテライト遺伝子座のエンリッチメント指数Ｚｓｃｏｒｅを算出するためのエンリッチメント指数算出モジュール；
すべてのマイクロサテライト遺伝子座のエンリッチメント指数Ｚｓｃｏｒｅを合計して、サンプルのマイクロサテライトの状態を判断することができる指数ＭＳｓｃｏｒｅを算出するためのマイクロサテライト状態指数算出モジュール；
参照サンプルとしてのＭＳＳ血漿サンプルのＭＳｓｃｏｒｅの平均値ｍｅａｎおよび標準偏差ＳＤを算出し、そのｍｅａｎ＋３ＳＤを閾値ｃｕｔｏｆｆとする閾値算出モジュール；および
癌患者に由来する血漿サンプルについて、そのＭＳｓｃｏｒｅ＞ｃｕｔｏｆｆの場合は該サンプルをＭＳＩ－Ｈと判定し、ＭＳｓｃｏｒｅ≦ｃｕｔｏｆｆの場合は該サンプルをＭＳＳと判定するような、指数ＭＳｓｃｏｒｅと閾値ｃｕｔｏｆｆを比較するためのマイクロサテライト遺伝子座安定性状態判定モジュール。
【0034】
一実施形態では、次世代ハイスループットシークエンシング法に基づいて癌患者の血漿サンプルによってマイクロサテライト遺伝子座の安定性の状態を判定するための装置において、前記のＺｓｃｏｒｅは、ＨＳによって評価される。
式中、ＮはＭＳＩ－Ｈ状態およびＭＳＳ状態の反復配列の長さのセットのｒｅａｄｓの総数であり、ＫはＭＳＩ－Ｈ状態の反復配列の長さのセットのリードの総数であり、Ｎ－ＫはＭＳＳ状態の反復配列の長さのセットのリードの総数であり、これらに対応して、ｎおよびｋはそれぞれ、測定サンプルにおける対応するリードの数である。
【数4】
【数5】
【0035】
好ましくは、上記のマイクロサテライト遺伝子座の安定性の状態を判定するための装置において、ＭＳｓｃｏｒｅは、以下の式に基づいて算出する。
【数6】
【0036】
より好ましくは、上記のマイクロサテライト遺伝子座の安定性の状態を判定するための装置において、前記の疾患は癌、好ましくは結腸直腸癌（例えば腸癌）、胃癌または子宮内膜癌である。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】図１（Ａ）は、完全ＭＳＩ－Ｈ癌細胞および白血球サンプルにおけるマイクロサテライトマーカー遺伝子座ｂＭＳ－ＢＲ１の各反復配列の長さのリードの数の分布を示す。青枠（下の方）は、該遺伝子座のＭＳＳの特性範囲が２２～２５ｂｐであることを示し、赤枠（上の方）は、該遺伝子座のＭＳＩ－Ｈの特性範囲が＜１６ｂｐであることを示す。図１（Ｂ）は、完全ＭＳＩ－Ｈ癌細胞および白血球サンプルにおける非マーカー遺伝子座の各反復配列の長さの断片の分布を示す。該遺伝子座の反復配列の長さは約２ｂｐ短くなったが、この差は、腫瘍のｃｔＤＮＡ含有量が非常に少ない条件下で、白血球自体の捕捉の変動と区別するのに十分ではなく、ＭＳＩ－Ｈサンプルにのみ高頻度で現れる反復配列の長さタイプは存在しない。
【図2】図２は、ｂＭＳＩＳＥＡの検出効果を示す。図２（Ａ）は、１２７例の腸癌血漿サンプルのＭＳｓｃｏｒｅの分布を示す。ここで、ＭＳ状態は、マッチした組織によって判定され、合計４４例のＭＳＩ－Ｈサンプルと８３例のＭＳＳサンプルを含む。ＭＳｓｃｏｒｅがｃｕｔｏｆｆ＝１５より高い場合、血漿サンプルはＭＳＩ－Ｈと判定され、ＭＳｓｃｏｒｅが１５以下の場合、ＭＳＳと判定された。図２（Ｂ）は、４４例のＭＳＩ－ＨサンプルｍａｘＡＦとＭＳｓｃｏｒｅとの相関関係を示す。赤い点（水平線の下）はＭＳｓｃｏｒｅ＞１５であることを示し、該サンプルはＭＳＩ－Ｈと判定され、青い点（水平線の上）はＭＳｓｃｏｒｅが閾値を満たしていなかったことを示し、該サンプルはＭＳＳと判定された。図２（Ｃ）は、シミュレーションサンプルによる検出感度とｍａｘＡＦとの相関関係を示す。結果は、異なるｃｔＤＮＡ含有量勾配を持つ３５０例のシミュレーションサンプルに基づいてたものである。横軸は、ｍａｘＡＦが対応する値より大きいサンプルのみがカウントされるものを示し、縦軸はＭＳＩ－Ｈの検出感度を示す。ｍａｘＡＦ＞０．２％の場合、ＭＳＩ－Ｈ検出の感度は９３％より高く、ｍａｘＡＦ＞０．５％の場合、感度は９８％より高い。
【発明を実施するための形態】
【0038】
本発明は、次世代シークエンシングに基づいて、血漿によってマイクロサテライトの安定性および疾患関連遺伝子を検出する方法を初めて提供する。また、この検出方法に基づいて、癌、好ましくは結腸直腸癌（例えば腸癌）、胃癌または子宮内膜癌を高い感度および特異性で検出するためのＭＳＩ遺伝子座が得られる。
【0039】
さらに、本発明は、血漿サンプルに基づいてマイクロサテライト状態を検出することに使用できるマイクロサテライトマーカー遺伝子座を決定する方法を確立する。さらに、本発明は、サンプル中の複数のマイクロサテライト遺伝子座と複数の疾患関連遺伝子との同時検出を実現し、これにより、検出されたサンプルについて、予後、治療、調査などに関するより総合的な結論および提案を与えることができる。
【0040】
このように、本発明は、初めて血漿ＭＳＩの検出方法を提供し、組織ＭＳＩの検出と比較して、本発明の血漿ＭＳＩの検出は、非侵襲性、リアルタイム性、非組織特異性などの特徴がある。同時に、本発明の方法は、ｃｔＤＮＡ含有量が非常に低い血漿サンプルにおいてマイクロサテライト状態の検出を実現することができ、血漿サンプルによるマイクロサテライト状態の検出のギャップを埋めた。また、本発明の方法は、ｃｔＤＮＡ含有量が０．４％超のサンプルに対して非常に高い正確率を達成することができ、検出速度が速く、白血球サンプルのマッチングに依存せず、価格が低く、検出が便利で、サンプルのマイクロサテライトの安定性（ＭＳ）の状態を高感度、高特異性で判定することができる。
【0041】
さらに、本発明の検出方法は、癌、好ましくは結腸直腸癌（例えば腸癌）、胃癌または子宮内膜癌の患者への非侵襲的診断、予後評価、または治療法の選択に使用することができる。
【0042】
また、本発明は、血漿サンプル中のマイクロサテライトの安定性の状態の検出に用いられるマイクロサテライトマーカー遺伝子座を判定するための装置、および次世代ハイスループットシークエンシング法に基づいて癌患者の血漿サンプルによってマイクロサテライト遺伝子座の安定性の状態を判定するための装置を提供する。
【0043】
本発明者らは、高頻度マイクロサテライト不安定性のサンプルについて、そのマイクロサテライト遺伝子座が、誤ったＤＮＡ重複により、多数の反復配列の拡張または収縮を引き起こすことを見出した。この点に対して、ＭＳＩ－Ｈ組織サンプルと正常な白血球サンプルについて、リードの反復配列の長さタイプを比較することにより、ＭＳＩ－Ｈ組織サンプルでは多数出現し、正常な白血球サンプルではほとんど出現しない反復配列の長さタイプを見出し、ＭＳＩ－Ｈ状態の遺伝子座の反復配列の長さの特徴とする。
【0044】
マーカー遺伝子座を選択する具体的な基準は次の通りである。ａ）ＭＳＳサンプルにおいて該反復配列の長さ範囲内のリードの数は、該遺伝子座のリードの総数の０．２％未満である。ｂ）ＭＳＩ－Ｈサンプルにおいて、該範囲内のリードの数は、遺伝子座でサポートされるリードの総数の５０％以上を占める。なお、該長さ範囲は、ＭＳＩ－Ｈ状態の遺伝子座の反復配列の長さの特性として定義される。上記の２つの条件により、本方法は、ｃｔＤＮＡの含有量が極めて少ない場合でも、ＭＳＩ－Ｈの長さ特性をカバーするリードがほぼ完全に腫瘍ＤＮＡに由来することを確保する。
【0045】
この選択に基づいて、発明者らは、８つのマイクロサテライトマーカー遺伝子座（詳細は表１を参照）をスクリーニングした。
表１ マイクロサテライト検出マーカー遺伝子座の情報
表１ マイクロサテライト検出マーカー遺伝子座の情報
【表1】
【0046】
本発明は、次世代ハイスループットシークエンシングに基づいて癌患者に由来する血漿サンプル中のマイクロサテライト遺伝子座の安定性の状態を判定する方法に基づき、つまり、出願者のｂＭＳＩＳＥＡというマイクロサテライト不安定性血漿検出技術の主な戦略は、まず、組織サンプルに基いて、ＭＳＩ－ＨおよびＭＳＳ状態でのリードのカバレッジが全く異なるマーカー遺伝子座を見出し、両方の状態で遺伝子座によってサポートされるリードの主な長さのタイプを記述し、各マーカー遺伝子座についてＭＳＩ－Ｈ状態でのリードの特性をエンリッチメント解析することにより、不安定性の状態を評価し、サンプルのマイクロサテライトの状態を判定する。
【0047】
本発明の癌患者に由来する血漿サンプル中のマイクロサテライト遺伝子座の安定性の状態を判定する方法は、以下の工程を含む。１）サンプルの準備、シークエンシング領域のマイクロサテライト遺伝子座の検出、および遺伝子座の反復配列の長さタイプに関する統計を含むデータの準備；２）マーカー遺伝子座のスクリーニングおよび遺伝子座特性の記述；３）マイクロサテライト不安定性の特性のエンリッチメント解析；４）各遺伝子座のエンリッチメント指数の平均変動レベルの評価；５）測定血漿サンプルのエンリッチメント指数の相対レベルに基づいてＭＳｓｃｏｒｅを構築し、サンプルのＭＳ状態を判定する。
【0048】
さらに、本明細書は、本発明を理解するために以下の実施例を提供するが、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲に示されている。所定の方法は、本発明の精神から逸脱することなく変更できることを理解すべきである。
【0049】
実施例
１．データの準備：遺伝子パネルの検出は、次世代シークエンシング法に基づいて以下のような手順で実行された。
組織サンプルの採取手順は次の通りである。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ：５６４０４）を使用して腫瘍組織および側癌性（ｐａｒａｃａｎｃｅｒｏｕｓ）正常組織のＤＮＡを抽出した。Ｑｕｂｉｔ３．０蛍光光度計およびｄｓＤＮＡ ＨＳ アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ：Ｑ３２８５４）を使用して正確な定量を行った。ソニケーターＣｏｖａｒｉｓ Ｍ２２０（Ｃｏｖａｒｉｓ：ＰＮ５００２９５）を使用して、物理的にＤＮＡを１８０～２５０ｂｐの断片に断片化し、末端修復、リン酸化させ、３’末端にデオキシアデニンを付加し、リンカーでライゲーションした。次に、増幅リンカーにライゲーションされたＤＮＡを、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ常磁性ビーズで精製し、ＰＣＲポリメラーゼで前増幅を行い、精製された増幅産物を、Ａｇｉｌｅｎｔでカスタマイズされた多重ビオチン標識プローブセットとハイブリダイズさせた（遺伝子パネル（ｐａｎｅｌ）のデザインには、４１遺伝子のエクソンおよび一部のイントロン領域の配列を含む）。ハイブリダイゼーションに成功した断片を特異的に溶出し、ＰＣＲポリメラーゼで増幅した後、定量化および断片長さの分布の測定を行い、ＩｌｌｕｍｉｎａＮｏｖａｓｅｑ ６０００シークエンサー（カタログ番号：２００１２８５０）を使用してシークエンシング深度（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄｅｐｔｈ）１０００Ｘで次世代シークエンシングを実行した。
１．データの準備：遺伝子パネルの検出は、次世代シークエンシング法に基づいて以下のような手順で実行された。
組織サンプルの採取手順は次の通りである。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ：５６４０４）を使用して腫瘍組織および側癌性（ｐａｒａｃａｎｃｅｒｏｕｓ）正常組織のＤＮＡを抽出した。Ｑｕｂｉｔ３．０蛍光光度計およびｄｓＤＮＡ ＨＳ アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ：Ｑ３２８５４）を使用して正確な定量を行った。ソニケーターＣｏｖａｒｉｓ Ｍ２２０（Ｃｏｖａｒｉｓ：ＰＮ５００２９５）を使用して、物理的にＤＮＡを１８０～２５０ｂｐの断片に断片化し、末端修復、リン酸化させ、３’末端にデオキシアデニンを付加し、リンカーでライゲーションした。次に、増幅リンカーにライゲーションされたＤＮＡを、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ常磁性ビーズで精製し、ＰＣＲポリメラーゼで前増幅を行い、精製された増幅産物を、Ａｇｉｌｅｎｔでカスタマイズされた多重ビオチン標識プローブセットとハイブリダイズさせた（遺伝子パネル（ｐａｎｅｌ）のデザインには、４１遺伝子のエクソンおよび一部のイントロン領域の配列を含む）。ハイブリダイゼーションに成功した断片を特異的に溶出し、ＰＣＲポリメラーゼで増幅した後、定量化および断片長さの分布の測定を行い、ＩｌｌｕｍｉｎａＮｏｖａｓｅｑ ６０００シークエンサー（カタログ番号：２００１２８５０）を使用してシークエンシング深度（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄｅｐｔｈ）１０００Ｘで次世代シークエンシングを実行した。
【0050】
血液サンプルの採取手順は次の通りである。まず、核酸抽出試薬で血漿中の遊離ＤＮＡおよびマッチした末梢血白血球のゲノムＤＮＡを抽出し、白血球のゲノムＤＮＡを断片化した。次に、リンカーの付加、ＰＣＲ増幅などの手順を経て、全ゲノムプレライブラリーを作成した。ビオチンで標識された特定の配列のＲＮＡプローブをこのプレライブラリーとハイブリダイズさせて、ヒトゲノムにおける４１遺伝子のエクソンおよびイントロン領域の一部（全コーディング領域、エクソン－イントロン接合領域、ＵＴＲ領域およびプロモーター領域）を特異的に捕捉した。プローブによって捕捉されたＤＮＡ断片を、ストレプトアビジン磁気ビーズで濃縮し、濃縮したＤＮＡ断片を増幅のテンプレートとして使用して、最終的なライブラリーを作成した。最終ライブラリーの定量および品質管理の後、ＩｌｌｕｍｉｎａＮｏｖａＳｅｑ遺伝子シークエンサーを使用して、１５０００Ｘのシークエンシング深度で最終ライブラリーに対してハイスループットシークエンシングを行った。
【0051】
最後に、ＢＷＡバージョン０．７．１０を使用して、測定された配列をヒトゲノム配列（バージョンｈｇ１９）とアライメントし、アライメントの局所的最適化にＧＡＴＫ ３．２を使用し、変異コールにＶａｒＳｃａｎ ２．４．３を使用し、変異アノテーションにＡＮＮＯＶＡＲおよびＳｎｐＥｆｆ４．３を使用した。変異コール（ｃａｌｌｉｎｇ）について、カバレッジの低い遺伝子座はＶａｒＳｃａｎｆｐｆｉｌｔｅｒによって除去され（組織：５０Ｘ未満、血漿：５００Ｘ未満、白血球：２０Ｘ未満）；インデル（ｉｎｄｅｌ）および単一点突然変異について、それぞれ少なくとも５つと８つの変異したリードが必要であった。
【0052】
２．次世代ハイスループットシークエンシング（Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）データに基づくマイクロサテライト遺伝子座の反復配列の長さタイプの統計
マイクロサテライト不安定性検出アルゴリズムｂＭＳＩＳＥＡの検出には、癌血漿サンプルのバイナリシークエンスアラインメント（ＢＡＭ、ｂｉｎａｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）ファイルのみが必要である。ベースライン構築の際には、マッチしたＭＳＩ－Ｈ癌組織および正常組織の十分なサンプル（数が５０を超える）、十分な白血球サンプル（数が１００を超える）、および十分なＭＳＳ血漿サンプル（数が１００を超える）のＢＡＭファイルもさらに必要である。
マイクロサテライト不安定性検出アルゴリズムｂＭＳＩＳＥＡの検出には、癌血漿サンプルのバイナリシークエンスアラインメント（ＢＡＭ、ｂｉｎａｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）ファイルのみが必要である。ベースライン構築の際には、マッチしたＭＳＩ－Ｈ癌組織および正常組織の十分なサンプル（数が５０を超える）、十分な白血球サンプル（数が１００を超える）、および十分なＭＳＳ血漿サンプル（数が１００を超える）のＢＡＭファイルもさらに必要である。
【0053】
この方法では、まず、ＭＳＩｓｅｎｓｏｒ（ｖ０．５）ソフトウェアで、シークエンシングカバレッジ領域において長さが１０を超え、且つ反復配列が１であるマイクロサテライト遺伝子座をすべて取得し、マイクロサテライト遺伝子座の各長さタイプの反復配列によってカバーされるリードの数を算出した。
【0054】
ＭＳＩｓｅｎｓｏｒによって遺伝子座の各長さタイプでカバーされるリードの数をカウントする方法は次の通りである。各マイクロサテライト遺伝子座について、まず、ヒトゲノムでその位置情報および両端の配列を検索し、さらに、両端の配列によって接続された１～Ｌ－１０ｂｐの中間的反復配列の長さを持つすべての配列を、検索辞書として構築し、ここで、Ｌがリードの長さである。例えば、１番染色体上のある１塩基のマイクロサテライト遺伝子座（１４Ｔ、Ｔは繰り返し塩基、１４は繰り返し数）の場合、その両端の配列はそれぞれＡＴＴＣＣとＧＣＴＴＴであり、構築された検索辞書は、ＡＴＴＣＣＴＧＣＴＴＴ（繰り返し長さが１）、ＡＴＴＣＣＴＴＧＣＴＴＴ（繰り返し長さが２）、ＡＴＴＣＣＴＴＴＧＣＴＴＴ（繰り返し長さが３）などを含む。次に、少なくとも片方の端が遺伝子座の２ｋｂ以内に位置するペアのリード（ｐａｉｒｅｄ ｒｅａｄｓ）を、サンプルのＢＡＭファイルから抽出し、該遺伝子座の検索辞書における配列にアラインメントした。検索辞書における異なる長さをカバーするリードの数をカウントし、遺伝子座のすべての長さタイプをカバーするリードの数のヒストグラムを作成した。
【0055】
３．マイクロサテライト不安定性のマーカー遺伝子座のスクリーニング
３．１ ＭＳＳ状態の遺伝子座の反復配列の長さ特性
正常なサンプルのマイクロサテライト遺伝子座について、リードがカバーされる確率が高いのは、サンプルの遺伝子型に対応する１種または２種の反復配列の長さタイプである。このステップでは、白血球サンプルに基づいて、正常状態の各遺伝子座のリードに現れる確率が高い反復配列の長さタイプを、ＭＳＳ状態の遺伝子座の反復配列の長さ特性として記述した。各遺伝子座の各白血球サンプルについて、対応するリードの数が、その遺伝子座によってサポートされるリードの総数の７５％を超えるように、連続した長さの最小範囲を検索し、この連続した長さの範囲は、該サンプルの該遺伝子座におけるピーク（ｐｅａｋ）領域と呼ばれる。各遺伝子座について、白血球サンプルの少なくとも２５％でピーク（ｐｅａｋ）領域として選択された反復配列の長さ範囲を、ＭＳＳ状態の該遺伝子座の反復配列の長さ特性とした。
３．１ ＭＳＳ状態の遺伝子座の反復配列の長さ特性
正常なサンプルのマイクロサテライト遺伝子座について、リードがカバーされる確率が高いのは、サンプルの遺伝子型に対応する１種または２種の反復配列の長さタイプである。このステップでは、白血球サンプルに基づいて、正常状態の各遺伝子座のリードに現れる確率が高い反復配列の長さタイプを、ＭＳＳ状態の遺伝子座の反復配列の長さ特性として記述した。各遺伝子座の各白血球サンプルについて、対応するリードの数が、その遺伝子座によってサポートされるリードの総数の７５％を超えるように、連続した長さの最小範囲を検索し、この連続した長さの範囲は、該サンプルの該遺伝子座におけるピーク（ｐｅａｋ）領域と呼ばれる。各遺伝子座について、白血球サンプルの少なくとも２５％でピーク（ｐｅａｋ）領域として選択された反復配列の長さ範囲を、ＭＳＳ状態の該遺伝子座の反復配列の長さ特性とした。
【0056】
３．２ ＭＳＩ－Ｈ状態の遺伝子座の反復配列の長さ特性およびマーカー遺伝子座の選択
高頻度マイクロサテライト不安定性のサンプルについて、そのマイクロサテライト遺伝子座は、誤ったＤＮＡ重複により、多数の反復配列の拡張または収縮を引き起こす。ここでは、長い反復配列の配列収縮の現象に注目した。このステップでは、マッチしたＭＳＩ－Ｈ癌組織および側癌性正常組織のサンプルに基づいて、ＭＳＩ－Ｈ状態でリードに大量発生する正常状態とは異なる反復配列の長さのタイプを、ＭＳＩ－Ｈ状態の遺伝子座の反復配列の長さ特性として記述した。癌組織のサンプルは癌細胞と正常細胞との混合物であるため、本方法の最初のステップは、サンプル中の腫瘍細胞の割合を推定することである。具体的に、癌組織および側癌性正常組織において、各遺伝子座のＭＳＳ状態に対応する遺伝子座の反復配列の長さタイプのリードの数をカウントし、癌組織のサンプルにおけるＭＳＳ状態のリードが完全に正常細胞から由来すると仮定して、線形モデルを確立し、腫瘍細胞の割合ｕを推定した。次のステップでは、癌組織およびマッチした正常組織のリードの総数を正規化した後、癌組織における各遺伝子座での反復配列のそれぞれの長さのリードの数から、マッチした正常組織の対応するデータのｕ倍を対応して差し引くことにより、完全なＭＳＩ－Ｈ癌細胞の反復配列の長さの統計データを推定した。
高頻度マイクロサテライト不安定性のサンプルについて、そのマイクロサテライト遺伝子座は、誤ったＤＮＡ重複により、多数の反復配列の拡張または収縮を引き起こす。ここでは、長い反復配列の配列収縮の現象に注目した。このステップでは、マッチしたＭＳＩ－Ｈ癌組織および側癌性正常組織のサンプルに基づいて、ＭＳＩ－Ｈ状態でリードに大量発生する正常状態とは異なる反復配列の長さのタイプを、ＭＳＩ－Ｈ状態の遺伝子座の反復配列の長さ特性として記述した。癌組織のサンプルは癌細胞と正常細胞との混合物であるため、本方法の最初のステップは、サンプル中の腫瘍細胞の割合を推定することである。具体的に、癌組織および側癌性正常組織において、各遺伝子座のＭＳＳ状態に対応する遺伝子座の反復配列の長さタイプのリードの数をカウントし、癌組織のサンプルにおけるＭＳＳ状態のリードが完全に正常細胞から由来すると仮定して、線形モデルを確立し、腫瘍細胞の割合ｕを推定した。次のステップでは、癌組織およびマッチした正常組織のリードの総数を正規化した後、癌組織における各遺伝子座での反復配列のそれぞれの長さのリードの数から、マッチした正常組織の対応するデータのｕ倍を対応して差し引くことにより、完全なＭＳＩ－Ｈ癌細胞の反復配列の長さの統計データを推定した。
【0057】
すべてのマイクロサテライト遺伝子座について、完全なＭＳＩ－Ｈ癌細胞の反復配列の長さの統計データに基づいて、ｂＭＳＩＳＥＡのマーカー遺伝子座として、以下の特徴を持つ遺伝子座を選択し、その反復配列の長さ範囲をＭＳＩ－Ｈ状態の遺伝子座での反復配列の長さ特性とした。前記の特徴は、該反復配列の長さ範囲でサポートされるリードの総数が、ＭＳＳサンプルにおいて該遺伝子座のリードの総数の０．２％未満であり、且つＭＳＩ－Ｈサンプルにおいて該遺伝子座のリードの総数の５０％以上を占めることである。上記の２つの条件により、ｃｔＤＮＡの含有量が極めて少ない場合でも、ＭＳＩ－Ｈの長さ特性をカバーするリードは、ほぼ完全に癌ＤＮＡに由来する。
【0058】
上記の方法に従ってスクリーニングされたマイクロサテライト状態検出用の８つのマイクロサテライト検出マーカー遺伝子座を表１に示す。図１（Ａ）は、マーカー遺伝子座ｂＭＳ－ＢＲ１を示す。ここで、ＭＳＳ状態の遺伝子座の反復配列の特徴的な長さ範囲は２２～２５ｂｐであり、ＭＳＩ－Ｈの特徴的な長さ範囲は１～１６ｂｐである。また、図１（Ｂ）は、２種類のサンプルにおける非マーカー遺伝子座のカバレッジ特徴マップを示す。ＭＳＳサンプルと比較して、ＭＳＩ－Ｈ状態の該遺伝子座の反復配列の長さは約２ｂｐ短くなったが、この変動は、ｃｔＤＮＡ含有量が非常に少ない条件下で、白血球自体の捕捉の変動と区別できず、マーカー遺伝子座のスクリーニング条件を満たさないため、サンプルのマイクロサテライト状態の判定には使用できない。
【0059】
４．ＭＳＩ特性のエンリッチメント解析
各マーカー遺伝子座について、正常な白血球サンプルにおけるＭＳＳおよびＭＳＩ－Ｈ状態での長さ特性のセットに対応するリードの数をバックグラウンドとして、血漿サンプルをＭＳＩ－Ｈ特性のエンリッチメント解析にかけた。このステップでは、大量の正常な白血球のサンプルに基づいて、ＭＳＳ状態およびＭＳＩ－Ｈ状態での反復配列の長さセットに対応するリードの総数を算出し、それぞれＫおよびＮ－Ｋと表記した。また、血漿サンプルについては、ＭＳＳ状態およびＭＳＩ－Ｈ状態での反復配列の長さセットに対応するリードの数ｋおよびｎ－ｋを同様に算出した。サンプルの状態がＭＳＳであれば、リードの特性は、白血球のサンプルの状態と一致し、超幾何分布に適合する。
したがって、遺伝子座のエンリッチメント指数は、ＨＳによって評価することができる。
各マーカー遺伝子座について、正常な白血球サンプルにおけるＭＳＳおよびＭＳＩ－Ｈ状態での長さ特性のセットに対応するリードの数をバックグラウンドとして、血漿サンプルをＭＳＩ－Ｈ特性のエンリッチメント解析にかけた。このステップでは、大量の正常な白血球のサンプルに基づいて、ＭＳＳ状態およびＭＳＩ－Ｈ状態での反復配列の長さセットに対応するリードの総数を算出し、それぞれＫおよびＮ－Ｋと表記した。また、血漿サンプルについては、ＭＳＳ状態およびＭＳＩ－Ｈ状態での反復配列の長さセットに対応するリードの数ｋおよびｎ－ｋを同様に算出した。サンプルの状態がＭＳＳであれば、リードの特性は、白血球のサンプルの状態と一致し、超幾何分布に適合する。
【数7】
【数8】
【0060】
さらに、大量のＭＳＳ血漿サンプルに基づいて、各遺伝子座のエンリッチメント指数の変動範囲を求めた。測定血漿サンプルについて、この変動範囲に基づいて、各遺伝子座のエンリッチメント指数Ｚｓｃｏｒｅを算出し、すべてのＺｓｃｏｒｅを合計して、サンプルのマイクロサテライト状態を判定する指数ＭＳｓｃｏｒｅを得た。
【数9】
【0061】
ｂＭＳ－ＢＲ１遺伝子座を例として、１００例のＷＢＣサンプルに基づいて、反復配列の長さ範囲が１～１６ｂｐのリードの総数Ｋは５０４であり、長さ範囲が１～１６ｂｐまたは２２～２５ｂｐのリードの総数Ｎは１９０５８８である。また、測定サンプルについては、１～１６ｂｐの長さ範囲にある該遺伝子座での反復配列のリードの総数ｋは６５であり、１～１６ｂｐまたは２２～２５ｂｐの長さ範囲にあるリードの総数ｎは１３０８である。これにより、ＨＳ＝－ｌｏｇ（ＰＳ（Ｘ＞ｋＳ）＝－ｌｏｇ（ＰＳ（Ｘ＞６５）＝１４０．６である。さらに、ＭＳＳ血漿サンプルに基づいて、ＨＳの変動レベルを評価した。その結果を表１に示す。
によって該遺伝子座のＺｓｃｏｒｅ値は１０８．６である。その他の遺伝子座の計算方法は上記の通りである。最後に、すべてのＺｓｃｏｒｅを合計して、該遺伝子座の最終的なＭＳｓｃｏｒｅは３５５．３である。このサンプルでは、ＭＬＨ１の疑わしい病原性のシステムのフレームシフト変異ｐ．Ｄ２１４ｆｓと、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮを含む病原性／疑わしい病原性の変異と、ＢＲＣＡ２、ＳＴＫ１１、ＰＭＳ１を含む病原性の情報が不明な変異と、キットに含まれる他の遺伝子の良性変異とを同時に検出した。
【0062】
５．癌サンプルにおけるマイクロサテライト状態の判定
血漿サンプルについて、ＭＳＳ血漿サンプルのＭＳｓｃｏｒｅ値に基づいて、その平均値ｍｅａｎおよび標準偏差ＳＤを算出し、ｍｅａｎ＋３ＳＤを閾値ｃｕｔｏｆｆとする。ＭＳｓｃｏｒｅ＞ｃｕｔｏｆｆの場合、サンプルをＭＳＩ－Ｈと判定し、ＭＳｓｃｏｒｅ≦ｃｕｔｏｆｆの場合、サンプルをＭＳＳと判定する。
血漿サンプルについて、ＭＳＳ血漿サンプルのＭＳｓｃｏｒｅ値に基づいて、その平均値ｍｅａｎおよび標準偏差ＳＤを算出し、ｍｅａｎ＋３ＳＤを閾値ｃｕｔｏｆｆとする。ＭＳｓｃｏｒｅ＞ｃｕｔｏｆｆの場合、サンプルをＭＳＩ－Ｈと判定し、ＭＳｓｃｏｒｅ≦ｃｕｔｏｆｆの場合、サンプルをＭＳＳと判定する。
【0063】
６．ｂＭＳＩＳＥＡマイクロサテライト不安定性の血漿の検出結果
ｂＭＳＩＳＥＡマイクロサテライト検出技術を使用し、表１に示される８つのマイクロサテライトマーカー遺伝子座および検出キットに基づいて、１２７例の実際の臨床腸癌の血漿サンプルでに対して、変異およびマイクロサテライトの検出を含むＮＧＳ検出を実行した。サンプルのマイクロサテライト状態は、対応する患者のマッチした組織サンプルに基づいて、ＩＨＣおよびＮＧＳ－ＭＳＩ技術によって二重確認され、最終的に４４例のＭＳＩ－Ｈサンプルと８３例のＭＳＳサンプルで構成された。ここで、組織の検出方法は次の通りである。反復配列の長さの違いに基づいて、ＮＧＳ検出法で２２個のマーカー遺伝子座によってサンプルのマイクロサテライト状態を判定した。本方法では、各マーカー遺伝子座について、ＭＳＳ状態で集合的に現れたリードの反復配列の長さ範囲を評価し、この範囲内のリードの該遺伝子座でのリードの総数に対する変化率を評価した。ｍｅａｎ－３ｓｄを閾値として、測定サンプルにおける該遺伝子座での上記の比率が閾値よりも小さい場合、該遺伝子座は不安定性の遺伝子座であると判断される。不安定性の遺伝子座の総数が遺伝子座の総数の１５％未満であれば、サンプルはＭＳＳと判定され、また、４０％を超えれば、サンプルはＭＳＩ－Ｈと判定され、両方の中間であれば、ＭＳＩ－Ｌとして判定される。この検出方法は、中国特許出願第２０１７１００６１１５２．６号を参照することができる。さらに、組織病理学的切片を通してＩＨＣ評価を行った。ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ２、およびＭＳＨ６タンパク質を含むＭＭＲタンパク質の発現状況は、免疫組織化学法を使用したＩＨＣ法によって検出された。タンパク質の１つが欠失している場合はｄＭＭＲと判定され、タンパク質が欠失していない場合はｐＭＭＲと判定される。ｄＭＭＲの患者は通常、ミスマッチ修復機構の異常なによってＭＳＩ－Ｈになっている。
ｂＭＳＩＳＥＡマイクロサテライト検出技術を使用し、表１に示される８つのマイクロサテライトマーカー遺伝子座および検出キットに基づいて、１２７例の実際の臨床腸癌の血漿サンプルでに対して、変異およびマイクロサテライトの検出を含むＮＧＳ検出を実行した。サンプルのマイクロサテライト状態は、対応する患者のマッチした組織サンプルに基づいて、ＩＨＣおよびＮＧＳ－ＭＳＩ技術によって二重確認され、最終的に４４例のＭＳＩ－Ｈサンプルと８３例のＭＳＳサンプルで構成された。ここで、組織の検出方法は次の通りである。反復配列の長さの違いに基づいて、ＮＧＳ検出法で２２個のマーカー遺伝子座によってサンプルのマイクロサテライト状態を判定した。本方法では、各マーカー遺伝子座について、ＭＳＳ状態で集合的に現れたリードの反復配列の長さ範囲を評価し、この範囲内のリードの該遺伝子座でのリードの総数に対する変化率を評価した。ｍｅａｎ－３ｓｄを閾値として、測定サンプルにおける該遺伝子座での上記の比率が閾値よりも小さい場合、該遺伝子座は不安定性の遺伝子座であると判断される。不安定性の遺伝子座の総数が遺伝子座の総数の１５％未満であれば、サンプルはＭＳＳと判定され、また、４０％を超えれば、サンプルはＭＳＩ－Ｈと判定され、両方の中間であれば、ＭＳＩ－Ｌとして判定される。この検出方法は、中国特許出願第２０１７１００６１１５２．６号を参照することができる。さらに、組織病理学的切片を通してＩＨＣ評価を行った。ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ２、およびＭＳＨ６タンパク質を含むＭＭＲタンパク質の発現状況は、免疫組織化学法を使用したＩＨＣ法によって検出された。タンパク質の１つが欠失している場合はｄＭＭＲと判定され、タンパク質が欠失していない場合はｐＭＭＲと判定される。ｄＭＭＲの患者は通常、ミスマッチ修復機構の異常なによってＭＳＩ－Ｈになっている。
【0064】
該１２７例の血漿サンプルにおけるｂＭＳＩＳＥＡ法による検出結果およびそれらにマッチした組織の検出結果に基づて比較することで、ｂＭＳＩＳＥＡ法の感度および特異性を得た。それぞれ表２に示す。
【0065】
表２． １２７例の腸癌の血漿に基づくｂＭＳＩＳＥＡの検出結果（組織検出結果に基づく）
【表2】
【0066】
ｃｔＤＮＡ（ｍａｘＡＦ＞０．２％）の場合、血漿ＭＳＩの検出の精度は９８．５％に達した。
【表3】
【0067】
＊組織検出によるマイクロサテライトの状態の結果は、ＮＧＳおよびＩＨＣの方法で二重確認された。検出指標のうち、感度：ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ；特異性：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ；ＰＰＶ：陽性予測値（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）；ＮＰＶ：陰性予測値（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）；精度：ａｃｃｕｒａｃｙ。それらの計算方法は以下の通りである。
【数10】
【0068】
ここで、ＴＰ、ＴＮ、ＦＰ、ＦＮはそれぞれ、真陽性（組織と血漿の検出結果が両方ともＭＳＩ－Ｈ）、真陰性（組織と血漿の検出結果が両方ともＭＳＳ）、偽陽性（組織の検出結果がＭＳＳ、血漿の検出結果がＭＳＩ－Ｈ）、偽陰性（組織の検出結果がＭＳＩ－Ｈ、血漿の検出結果がＭＳＳ）であるサンプルの数を表す。
【0069】
表２から、血漿サンプルによるＭＳＩ－Ｈ検出の特異性は１００％であることが分かる。スクリーニングせずにすべてのサンプルを含む場合、ほとんどのサンプルにおけるｃｔＤＮＡ含有量が極めて低いため、全体の検出感度はわずか５２．３％であり、精度は８３．５％である。これに対して、ｍａｘＡＦ＞０．２％（ｃｔＤＮＡ＞０．４％）を満たた血漿サンプルのみをスクリーニングした場合、検出感度は９３．８％、精度は９８．５％である。実際に、このサンプル群の中でｍａｘＡＦ＞０．５％のサンプルのみをスクリーニングした場合、検出精度は１００％である。このように、検出の特異性を確保することを前提として、血漿中に十分な量のｃｔＤＮＡを含む場合、ｂＭＳＩＳＥＡは十分に高い検出感度を有することが分かる。
【0070】
さらに、より詳細な検出結果を図２に示す。図２（Ａ）は、１２７例の腸癌の血漿サンプルのＭＳＩ検出によるＭＳｓｃｏｒｅ分布を示す。ｂＭＳＩＳＥＡ法によると、８３例のＭＳＳサンプルのＭＳｓｃｏｒｅは１５未満であり、特異性は１００％である。２３／４４例のＭＳＩ－ＨサンプルのＭＳｓｃｏｒｅは１５を超え、感度は５２．３％である。サンプル間のｃｔＤＮＡ含有量の違いを考慮して、図２（Ｂ）は、ｍａｘＡＦとＭＳＩ－ＨサンプルのＭＳｓｃｏｒｅとの相関関係を示す。ｍａｘＡＦ＞０．２％のサンプルのみを考慮すると、１５／１６例のＭＳＩ－ＨサンプルのＭＳｓｃｏｒｅは１５を超え、精度は９３．８％である。
【0071】
７．シミュレーション実験における検出感度に対する血漿中のｃｔＤＮＡ含有量の影響の確認
一般に、血漿中のｃｔＤＮＡの含有量は極めて低いため、検出感度はｃｔＤＮＡの含有量に影響される。そこで、本実験では、実際の臨床血漿および白血球サンプルに基づいて、ｃｔＤＮＡ含有量勾配が異なる３５０例のシミュレーションサンプル群を構築し、異なるｃｔＤＮＡ含有量の条件下で、本方法で血漿サンプルによってマイクロサテライト不安定性を検出する感度を評価した。ここで、癌サンプルのｃｔＤＮＡ含有量は、サンプルの最大体細胞遺伝子変異頻度（ｍａｘＡＦ）によって評価することができる。
一般に、血漿中のｃｔＤＮＡの含有量は極めて低いため、検出感度はｃｔＤＮＡの含有量に影響される。そこで、本実験では、実際の臨床血漿および白血球サンプルに基づいて、ｃｔＤＮＡ含有量勾配が異なる３５０例のシミュレーションサンプル群を構築し、異なるｃｔＤＮＡ含有量の条件下で、本方法で血漿サンプルによってマイクロサテライト不安定性を検出する感度を評価した。ここで、癌サンプルのｃｔＤＮＡ含有量は、サンプルの最大体細胞遺伝子変異頻度（ｍａｘＡＦ）によって評価することができる。
【0072】
マッチした血漿と白血球のサンプルの１８ペアを選択し、血漿および白血球のサンプルのｂａｍファイルを、血漿サンプルのｍａｘＡＦによる割合で混合し、元の血漿サンプルに再サンプリングして、ｃｔＤＮＡ含有量勾配が異なる３５０例のサンプルをシミュレートし、異なる含有量のｃｔＤＮＡを含む血漿サンプルの感度レベルを評価した。シミュレーションサンプルでは、実際の臨床サンプルと同様の変異検出プロセスを採用して変異を検出し、ｍａｘＡＦレベルを決定した。図２（Ｃ）に示すように、横軸はｍａｘＡＦが閾値より大きいサンプルのみをカウントしたものであり、縦軸はＭＳＩ－Ｈの検出感度である。ｍａｘＡＦ＞０．２％の場合、ＭＳＩ－Ｈの検出感度は９３％より高く、ｍａｘＡＦ＞０．５％の場合、感度は９８％より高い。ｃｔＤＮＡの含有量が低すぎると、ＭＳＩ－Ｈの検出に限界があるが、ｃｔＤＮＡの含有量が安定した検出範囲（ｍａｘＡＦ＞０．２％）に達すると、ｂＭＳＩＳＥＡ法は、サンプルのマイクロサテライトの安定性（ＭＳ）の状態を高精度と高感度で判定することができ、血漿中のＭＳの状態を非侵襲的に検出する可能性を提供する。
【0073】
したがって、ｍａｘＡＦ＞０．２％（０．４％を超えるｃｔＤＮＡ含有量にほぼ対応）の血漿サンプルに対して、ｂＭＳＩＳＥＡ法により、組織検出に匹敵する感度および極めて高い特異性を得ることができる。組織のＭＳＩ検出と比べて、本発明の血漿のＭＳＩ検出には、非侵襲的診断、非組織特異性、複数の病変の検出などのリキッドバイオプシーの独特の利点がある。ｂＭＳＩＳＥＡ法は、マッチした白血球サンプルに依存せずに、サンプルのマイクロサテライトの状態を判定しながら変異を検出するため、低価格で高速に処理することができる。
【図1】
【図2】
