特許 7577650 ジスルフィド結合により安定したポリペプチド組成物及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-25

(45)【発行日】2024-11-05

(54)【発明の名称】ジスルフィド結合により安定したポリペプチド組成物及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/85 20060101AFI20241028BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20241028BHJP

   C12N 9/40 20060101ALI20241028BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20241028BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241028BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241028BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20241028BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241028BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241028BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20241028BHJP

   C12N 15/56 20060101ALN20241028BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20241028BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20241028BHJP

【ＦＩ】

C12N15/85 Z ZNA

C12N15/864 100Z

C12N9/40

C12N9/16

A61K48/00

A61K45/00

A61P25/00

A61P43/00 105

A61P35/00

A61P3/00

C12N15/56

C12N15/55

C12N15/12

【請求項の数】 26

(21)【出願番号】P 2021520223

(86)(22)【出願日】2019-10-10

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(86)【国際出願番号】 US2019055679

(87)【国際公開番号】W WO2020077114

(87)【国際公開日】2020-04-16

【審査請求日】2022-09-12

(31)【優先権主張番号】62/744,069

(32)【優先日】2018-10-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507170099

【氏名又は名称】アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ドゥ， ハング

(72)【発明者】

【氏名】リウ， ツェー フェン

【審査官】鳥居 敬司

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１７／００５１２６７（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ ９／００－９／９９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

α－ガラクトシダーゼＡ（α－ＧＡＬ）タンパク質の安定した形態、またはパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）の安定した形態をコードする核酸を含む核酸構築体を含む遺伝子治療ベクターであって、
前記α－ガラクトシダーゼＡ（α－ＧＡＬ）タンパク質の安定した形態は、配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ヒトα－ＧＡＬタンパク質に対して（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択される１つ以上の外来システイン残基を含み、
前記パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）の安定した形態は、配列番号１３のアミノ酸配列からなる野生型ヒトＰＰＴ１タンパク質に対して外来システイン残基Ａ１７１Ｃ及びＡ１８３Ｃを含む、遺伝子治療ベクター。

【請求項2】

前記安定した形態のタンパク質が、（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択される１つ以上の外来システイン残基を含む安定した形態のα－ガラクトシダーゼＡ（α－ＧＡＬ）タンパク質を含む、請求項１に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項3】

前記安定した形態のタンパク質が、外来システイン残基Ａ１７１Ｃ及びＡ１８３Ｃを含む安定した形態のＰＰＴ１タンパク質を含む、請求項１に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項4】

前記安定した形態のタンパク質は、前記外来システイン残基のない対応するタンパク質と比較して、ｐＨ７．４での半減期がより長い、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項5】

前記安定した形態のタンパク質は、遺伝性障害において不在の、又は欠損するタンパク質を補充することができる、請求項１に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項6】

前記安定した形態のタンパク質は、遺伝性障害と関連する１つ以上の病徴を和らげることができ、又は減速することができる、請求項１に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項7】

前記安定した形態のタンパク質は、不安定な形態のタンパク質と比較して、遺伝性障害の１つ以上の病徴を和らげ、又は減速する点で、より効果的である、請求項１に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項8】

前記遺伝性障害は、神経障害である、請求項５～７のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項9】

前記遺伝性障害は、リソソーム蓄積障害である、請求項５～８のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項10】

前記遺伝性障害は、ファブリー病、並びにニューロンセロイドリポフスチン沈着症の乳児形態、若年形態、及び成人形態からなる群から選択される、請求項５～９のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項11】

前記遺伝子治療ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである、請求項１に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項12】

前記核酸構築体は、ウイルスベクターゲノム内に含まれる、請求項１に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項13】

前記ウイルスベクターゲノムは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む、請求項１２に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項14】

前記ｒＡＡＶゲノムは、自己相補的なゲノムを含む、請求項１３に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項15】

前記ｒＡＡＶゲノムは、一本鎖ゲノムを含む、請求項１３に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項16】

前記ｒＡＡＶゲノムは、第１の逆位末端反復及び第２の逆位末端反復を含む、請求項１３に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項17】

ｒＡＡＶの逆位末端反復は、ＡＡＶ２逆位末端反復である、請求項１６に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項18】

ｒＡＡＶゲノムはさらに、ＳＶ４０イントロンを含む、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項19】

ｒＡＡＶゲノムはさらに、ポリアデニル化配列を含む、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項20】

前記核酸構築体はさらに、α－ＧＡＬタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号８～１２の１つの配列を含む、請求項１２に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項21】

前記核酸構築体はさらに、ＰＰＴ１タンパク質をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号１６の配列を含む、請求項１２に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項22】

前記核酸構築体はさらに、プロモータ配列を含む、請求項１２に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項23】

前記プロモータは、構成的プロモータである、請求項２２に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項24】

前記プロモータは、組織特異的プロモータである、請求項２２に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項25】

前記核酸構築体はさらに：コザック配列、ＣｒＰＶ ＩＲＥＳ、リンカーをコードする核酸配列、シグナル配列をコードする核酸配列、及びＩＧＦ２ペプチドをコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、請求項１２に記載の遺伝子治療ベクター。

【請求項26】

前記核酸構築体は、ウイルスカプシド内にパッケージングされている、請求項１に記載の遺伝子治療ベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０１８年１０月１０日出願の米国仮特許出願第６２／７４４，０６９号明細書の利益を主張する。この出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

背景
遺伝性疾患は、組換えポリペプチドを用いる酵素補充治療、又は組換えタンパク質をコードする核酸を用いる遺伝子治療で処置することができる。例えば、ファブリー病は、組換えアルファ－ガラクトシダーゼＡ又は小分子シャペロン、例えば１－デオキシガラクトノジリマイシン（ミガラスタット）を用いて処置することができる。しかしながら、組換え野生型ポリペプチドは、多くの場合、中性のｐＨにて安定性が不十分であり、血清中で急速に分解する。このことが、治療酵素の半減期を実質的に制限している。というのも、静注によって送達されるためである。

【発明の概要】

【0003】

特定の態様において、提供されるのは：遺伝性障害を処置するタンパク質の安定した形態をコードする核酸を含む核酸構築体を含む遺伝子治療ベクターである。一部の実施形態において、安定した形態は、タンパク質内の外来（ｎｏｎ－ｎａｔｉｖｅ）システイン間に、又はタンパク質の２つのモノマーの外来システイン間にジスルフィド架橋を形成する１つ以上の外来システイン残基を含む。一部の実施形態において、タンパク質は、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、β－グルコセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、グリコサミノグリカンアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、イズロン酸－２－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼ、グリコサミノグリカンＮ－アセチルガラクトサミン４－スルファターゼ、アルファ－グルコシダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ（ＰＰＴ）、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ（ｃｅｒｏｉｄ ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｅｓ ｎｅｕｒｏｎａｌ）１、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ２、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ３、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ４、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ５、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ６、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ７、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ８、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ９、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１０、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１１、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１２、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１３、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１４、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１５、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１６、及びサイクリン依存性キナーゼ様５（ｃｙｃｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ｌｉｋｅ ５）からなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質は、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、β－グルコセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、グリコサミノグリカンアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、イズロン酸－２－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼ、グリコサミノグリカンＮ－アセチルガラクトサミン４－スルファターゼ、アルファ－グルコシダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ（ＰＰＴ）、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ４、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１０（カテプシンＤ）、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１１（プログラニュリン）、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１３（カテプシンＦ）、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１４（ＫＣＴＤ７）、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１５（ＴＢＣＫ）、及びサイクリン依存性キナーゼ様５からなる群から選択される。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、リソソーム酵素を含む。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、安定したα－ガラクトシダーゼ（α－ＧＡＬ）タンパク質を含む。一部の実施形態において、安定したα－ガラクトシダーゼＡ（α－ＧＡＬ）タンパク質は：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択される１つ以上の外来システイン残基を含む。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、安定したパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）を含む。一部の実施形態において、安定したＰＰＴ１タンパク質は、外来システイン残基Ａ１７１Ｃ及びＡ１８３Ｃを含む。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、外来システインのない対応するタンパク質と比較して、ｐＨ７．４での半減期がより長い。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、遺伝性障害において不在の、又は欠損するタンパク質を補充することができる。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、遺伝性障害と関連する１つ以上の病徴を和らげることができ、又は減速することができる。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、不安定なタンパク質と比較して、遺伝性障害の１つ以上の病徴を和らげ、又は減速する点で、より効果的である。一部の実施形態において、遺伝性障害は、神経障害である。一部の実施形態において、遺伝性障害は、リソソーム蓄積障害である。一部の実施形態において、遺伝性障害は、アスパルチルグルコサミン尿症、バッテン病、シスチン症、ファブリー病、ゴーシェ病Ｉ型、ゴーシェ病ＩＩ型、ゴーシェ病ＩＩＩ型、ポンペ病、テイ・サックス病、サンドホフ病、異染性白質萎縮症、ムコ脂質症Ｉ型、ムコ脂質症ＩＩ型、ムコ脂質症ＩＩＩ型、ムコ脂質症ＩＶ型、ハーラー病、ハンター病、サンフィリッポ病Ａ型、サンフィリッポ病Ｂ型、サンフィリッポ病Ｃ型、サンフィリッポ病Ｄ型、モルキオ病Ａ型、モルキオ病Ｂ型、マロトー・ラミー病、スライ病、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ１型、ニーマン・ピック病Ｃ２型、シンドラー病Ｉ型、シンドラー病ＩＩ型、アデノシンデアミナーゼ重症複合型免疫不全（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、ニューロンセロイドリポフスチン沈着症の乳児形態、若年形態、及び成人形態、並びにＣＤＫＬ５欠乏症からなる群から選択される。一部の実施形態において、遺伝子治療ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである。一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルスは：ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ－Ｂ１、及びＡＡＶ－ｈｕ６８からなる群から選択される血清型である。一部の実施形態において、核酸構築体は、ウイルスベクターゲノム内に含まれる。一部の実施形態において、ウイルスベクターゲノムは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、自己相補的なゲノムを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、一本鎖ゲノムを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、第１の逆位末端反復及び第２の逆位末端反復を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ逆位末端反復は、ＡＡＶ２逆位末端反復である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムはさらに、ＳＶ４０イントロンを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムはさらに、ポリアデニル化配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、α－ＧＡＬタンパク質をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号７～１２の１つに対して少なくとも８５％同一である。一部の実施形態において、構築体はさらに、α－ＧＡＬタンパク質をコードする核酸配列を含み、α－ＧＡＬタンパク質は、配列番号１～６の１つに対して少なくとも８５％同一である配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、α－ＧＡＬタンパク質をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号８～１２の１つの配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、α－ＧＡＬタンパク質をコードする核酸配列を含み、α－ＧＡＬタンパク質は、配列番号２～６の１つの配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、ＰＰＴ１タンパク質をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１５～１６の１つに対して少なくとも８５％同一である。一部の実施形態において、構築体はさらに、ＰＰＴ１タンパク質をコードする核酸配列を含み、ＰＰＴ１タンパク質は、配列番号１３～１４の１つに対して少なくとも８５％同一である配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、ＰＰＴ１タンパク質をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１６の配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、ＰＰＴ１タンパク質をコードする核酸配列を含み、ＰＰＴ１タンパク質は、配列番号１４の配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、プロモータ配列を含む。一部の実施形態において、プロモータは、構成的プロモータである。一部の実施形態において、プロモータは、組織特異的プロモータである。一部の実施形態において、構築体はさらに：コザック配列、ＣｒＰＶ ＩＲＥＳ、リンカーをコードする核酸配列、シグナル配列をコードする核酸配列、及びＩＧＦ２ペプチドをコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。一部の実施形態において、シグナルペプチド配列は、結合免疫グロブリンタンパク質（Ｂｉｐ）シグナル配列を含む。一部の実施形態において、シグナルペプチド配列は、配列番号２９～３３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＢｉｐシグナル配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、内部リボソームエントリ配列（ＩＲＥＳ）を含む。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、クリケット麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）ＩＲＥＳを含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、異型ＩＧＦ２（ｖＩＧＦ２）ペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態において、ｖＩＧＦ２ペプチドは、配列番号１７～２７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ｖＩＧＦ２ペプチドをコードする核酸配列は、タンパク質の安定した形態をコードする５’～核酸配列（５’ｔｏ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）である。一部の実施形態において、ｖＩＧＦ２ペプチドをコードする核酸配列は、タンパク質の安定した形態をコードする３’～核酸配列である。一部の実施形態において、構築体は、ウイルスカプシド内にパッケージングされている。

【0004】

更なる態様において、提供されるのは：遺伝性障害を処置するタンパク質の安定した形態をコードする核酸を含む核酸構築体を含む遺伝子治療ベクター、及び薬学的に許容される賦形剤、キャリア、又は希釈剤を含む医薬組成物である。一部の実施形態において、安定した形態は、タンパク質内の外来システイン間に、又はタンパク質の２つのモノマーの外来システイン間にジスルフィド架橋を形成する１つ以上の外来システイン残基を含む。一部の実施形態において、タンパク質は、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、β－グルコセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、グリコサミノグリカンアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、イズロン酸－２－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼ、グリコサミノグリカンＮ－アセチルガラクトサミン４－スルファターゼ、アルファ－グルコシダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ（ＰＰＴ）、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ２、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ３、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ４、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ５、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ６、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ７、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ８、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ９、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１０、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１１、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１２、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１３、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１４、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１５、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１６、及びサイクリン依存性キナーゼ様５からなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質は、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、β－グルコセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、グリコサミノグリカンアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、イズロン酸－２－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼ、グリコサミノグリカンＮ－アセチルガラクトサミン４－スルファターゼ、アルファ－グルコシダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ（ＰＰＴ）、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ４、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１０（カテプシンＤ）、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１１（プログラニュリン）、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１３（カテプシンＦ）、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１４（ＫＣＴＤ７）、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１５（ＴＢＣＫ）、及びサイクリン依存性キナーゼ様５からなる群から選択される。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、リソソーム酵素を含む。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、安定したα－ガラクトシダーゼ（α－ＧＡＬ）タンパク質を含む。一部の実施形態において、安定したα－ガラクトシダーゼＡ（α－ＧＡＬ）タンパク質は：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択される１つ以上の外来システイン残基を含む。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、安定したパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）を含む。一部の実施形態において、安定したＰＰＴ１タンパク質は、外来システイン残基Ａ１７１Ｃ及びＡ１８３Ｃを含む。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、外来システインのない対応するタンパク質と比較して、ｐＨ７．４での半減期がより長い。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、遺伝性障害において不在の、又は欠損するタンパク質を補充することができる。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、遺伝性障害と関連する１つ以上の病徴を和らげることができ、又は減速することができる。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、不安定なタンパク質と比較して、遺伝性障害の１つ以上の病徴を和らげ、又は減速する点で、より効果的である。一部の実施形態において、遺伝性障害は、神経障害である。一部の実施形態において、遺伝性障害は、リソソーム蓄積障害である。一部の実施形態において、遺伝性障害は、アスパルチルグルコサミン尿症、バッテン病、シスチン症、ファブリー病、ゴーシェ病Ｉ型、ゴーシェ病ＩＩ型、ゴーシェ病ＩＩＩ型、ポンペ病、テイ・サックス病、サンドホフ病、異染性白質萎縮症、ムコ脂質症Ｉ型、ムコ脂質症ＩＩ型、ムコ脂質症ＩＩＩ型、ムコ脂質症ＩＶ型、ハーラー病、ハンター病、サンフィリッポ病Ａ型、サンフィリッポ病Ｂ型、サンフィリッポ病Ｃ型、サンフィリッポ病Ｄ型、モルキオ病Ａ型、モルキオ病Ｂ型、マロトー・ラミー病、スライ病、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ１型、ニーマン・ピック病Ｃ２型、シンドラー病Ｉ型、シンドラー病ＩＩ型、アデノシンデアミナーゼ重症複合型免疫不全（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、ニューロンセロイドリポフスチン沈着症の乳児形態、若年形態、及び成人形態、並びにＣＤＫＬ５欠乏症からなる群から選択される。一部の実施形態において、遺伝子治療ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである。一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルスは：ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ－Ｂ１、及びＡＡＶ－ｈｕ６８からなる群から選択される血清型である。一部の実施形態において、核酸構築体は、ウイルスベクターゲノム内に含まれる。一部の実施形態において、ウイルスベクターゲノムは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、自己相補的なゲノムを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、一本鎖ゲノムを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、第１の逆位末端反復及び第２の逆位末端反復を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ逆位末端反復は、ＡＡＶ２逆位末端反復である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムはさらに、ＳＶ４０イントロンを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムはさらに、ポリアデニル化配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、α－ＧＡＬタンパク質をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号７～１２の１つに対して少なくとも８５％同一である。一部の実施形態において、構築体はさらに、α－ＧＡＬタンパク質をコードする核酸配列を含み、α－ＧＡＬタンパク質は、配列番号１～６の１つに対して少なくとも８５％同一である配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、α－ＧＡＬタンパク質をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号８～１２の１つの配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、α－ＧＡＬタンパク質をコードする核酸配列を含み、α－ＧＡＬタンパク質は、配列番号２～６の１つの配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、ＰＰＴ１タンパク質をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１５～１６の１つに対して少なくとも８５％同一である。一部の実施形態において、構築体はさらに、ＰＰＴ１タンパク質をコードする核酸配列を含み、ＰＰＴ１タンパク質は、配列番号１３～１４の１つに対して少なくとも８５％同一である配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、ＰＰＴ１タンパク質をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１６の配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、ＰＰＴ１タンパク質をコードする核酸配列を含み、ＰＰＴ１タンパク質は、配列番号１４の配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、プロモータ配列を含む。一部の実施形態において、プロモータは、構成的プロモータである。一部の実施形態において、プロモータは、組織特異的プロモータである。一部の実施形態において、構築体はさらに：コザック配列、ＣｒＰＶ ＩＲＥＳ、リンカーをコードする核酸配列、シグナル配列をコードする核酸配列、及びＩＧＦ２ペプチドをコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。一部の実施形態において、シグナルペプチド配列は、結合免疫グロブリンタンパク質（Ｂｉｐ）シグナル配列を含む。一部の実施形態において、シグナルペプチド配列は、配列番号２９～３３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＢｉｐシグナル配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、内部リボソームエントリ配列（ＩＲＥＳ）を含む。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、クリケット麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）ＩＲＥＳを含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、異型ＩＧＦ２（ｖＩＧＦ２）ペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態において、ｖＩＧＦ２ペプチドは、配列番号１７～２７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ｖＩＧＦ２ペプチドをコードする核酸配列は、タンパク質の安定した形態をコードする５’～核酸配列である。一部の実施形態において、ｖＩＧＦ２ペプチドをコードする核酸配列は、タンパク質の安定した形態をコードする３’～核酸配列である。一部の実施形態において、構築体は、ウイルスカプシド内にパッケージングされている。一部の実施形態において、賦形剤は、生理食塩水、マレイン酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、酢酸、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、グリシン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛、水、デキストロース、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、及び界面活性剤ポリオキシエチレン－ソルビタンモノオレアートからなる群から選択される。

【0005】

更なる態様において、提供されるのは、対象において遺伝性障害を処置する方法であって、当該対象に：遺伝性障害を処置するタンパク質の安定した形態をコードする核酸を含む核酸構築体を含む遺伝子治療ベクター、又はその医薬組成物の治療的に有効な量を投与することを含む方法である。一部の実施形態において、安定した形態は、タンパク質内の外来システイン間に、又はタンパク質の２つのモノマーの外来システイン間にジスルフィド架橋を形成する１つ以上の外来システイン残基を含む。一部の実施形態において、タンパク質は、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、β－グルコセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、グリコサミノグリカンアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、イズロン酸－２－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼ、グリコサミノグリカンＮ－アセチルガラクトサミン４－スルファターゼ、アルファ－グルコシダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ（ＰＰＴ）、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ２、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ３、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ４、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ５、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ６、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ７、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ８、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ９、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１０、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１１、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１２、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１３、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１４、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１５、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１６、及びサイクリン依存性キナーゼ様５からなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質は、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、β－グルコセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、グリコサミノグリカンアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、イズロン酸－２－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼ、グリコサミノグリカンＮ－アセチルガラクトサミン４－スルファターゼ、アルファ－グルコシダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ（ＰＰＴ）、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ４、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１０（カテプシンＤ）、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１１（プログラニュリン）、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１３（カテプシンＦ）、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１４（ＫＣＴＤ７）、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１５（ＴＢＣＫ）、及びサイクリン依存性キナーゼ様５からなる群から選択される。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、リソソーム酵素を含む。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、安定したα－ガラクトシダーゼ（α－ＧＡＬ）タンパク質を含む。一部の実施形態において、安定したα－ガラクトシダーゼＡ（α－ＧＡＬ）タンパク質は、１つ以上の外来システイン残基Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃを含む。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、安定したパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）を含む。一部の実施形態において、安定したＰＰＴ１タンパク質は、外来システイン残基Ａ１７１Ｃ及びＡ１８３Ｃを含む。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、外来システインのない対応するタンパク質と比較して、ｐＨ７．４での半減期がより長い。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、遺伝性障害において不在の、又は欠損するタンパク質を補充することができる。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、遺伝性障害と関連する１つ以上の病徴を和らげることができ、又は減速することができる。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、不安定なタンパク質と比較して、遺伝性障害の１つ以上の病徴を和らげ、又は減速する点で、より効果的である。一部の実施形態において、遺伝性障害は、神経障害である。一部の実施形態において、遺伝性障害は、リソソーム蓄積障害である。一部の実施形態において、遺伝性障害は、アスパルチルグルコサミン尿症、バッテン病、シスチン症、ファブリー病、ゴーシェ病Ｉ型、ゴーシェ病ＩＩ型、ゴーシェ病ＩＩＩ型、ポンペ病、テイ・サックス病、サンドホフ病、異染性白質萎縮症、ムコ脂質症Ｉ型、ムコ脂質症ＩＩ型、ムコ脂質症ＩＩＩ型、ムコ脂質症ＩＶ型、ハーラー病、ハンター病、サンフィリッポ病Ａ型、サンフィリッポ病Ｂ型、サンフィリッポ病Ｃ型、サンフィリッポ病Ｄ型、モルキオ病Ａ型、モルキオ病Ｂ型、マロトー・ラミー病、スライ病、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ１型、ニーマン・ピック病Ｃ２型、シンドラー病Ｉ型、シンドラー病ＩＩ型、アデノシンデアミナーゼ重症複合型免疫不全（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、ニューロンセロイドリポフスチン沈着症の乳児形態、若年形態、及び成人形態、並びにＣＤＫＬ５欠乏症からなる群から選択される。一部の実施形態において、遺伝子治療ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである。一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルスは：ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ－Ｂ１、及びＡＡＶ－ｈｕ６８からなる群から選択される血清型である。一部の実施形態において、核酸構築体は、ウイルスベクターゲノム内に含まれる。一部の実施形態において、ウイルスベクターゲノムは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、自己相補的なゲノムを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、一本鎖ゲノムを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、第１の逆位末端反復及び第２の逆位末端反復を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ逆位末端反復は、ＡＡＶ２逆位末端反復である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムはさらに、ＳＶ４０イントロンを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムはさらに、ポリアデニル化配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、α－ＧＡＬタンパク質をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号７～１２の１つに対して少なくとも８５％同一である。一部の実施形態において、構築体はさらに、α－ＧＡＬタンパク質をコードする核酸配列を含み、α－ＧＡＬタンパク質は、配列番号１～６の１つに対して少なくとも８５％同一である配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、α－ＧＡＬタンパク質をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号８～１２の１つの配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、α－ＧＡＬタンパク質をコードする核酸配列を含み、α－ＧＡＬタンパク質は、配列番号２～６の１つの配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、ＰＰＴ１タンパク質をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１５～１６の１つに対して少なくとも８５％同一である。一部の実施形態において、構築体はさらに、ＰＰＴ１タンパク質をコードする核酸配列を含み、ＰＰＴ１タンパク質は、配列番号１３～１４の１つに対して少なくとも８５％同一である配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、ＰＰＴ１タンパク質をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１６の配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、ＰＰＴ１タンパク質をコードする核酸配列を含み、ＰＰＴ１タンパク質は、配列番号１４の配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、プロモータ配列を含む。一部の実施形態において、プロモータは、構成的プロモータである。一部の実施形態において、プロモータは、組織特異的プロモータである。一部の実施形態において、構築体はさらに：コザック配列、ＣｒＰＶ ＩＲＥＳ、リンカーをコードする核酸配列、シグナル配列をコードする核酸配列、及びＩＧＦ２ペプチドをコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。一部の実施形態において、シグナルペプチド配列は、結合免疫グロブリンタンパク質（Ｂｉｐ）シグナル配列を含む。一部の実施形態において、シグナルペプチド配列は、配列番号２９～３３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＢｉｐシグナル配列を含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、内部リボソームエントリ配列（ＩＲＥＳ）を含む。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、クリケット麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）ＩＲＥＳを含む。一部の実施形態において、構築体はさらに、異型ＩＧＦ２（ｖＩＧＦ２）ペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態において、ｖＩＧＦ２ペプチドは、配列番号１７～２７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ｖＩＧＦ２ペプチドをコードする核酸配列は、タンパク質の安定した形態をコードする５’～核酸配列である。一部の実施形態において、ｖＩＧＦ２ペプチドをコードする核酸配列は、タンパク質の安定した形態をコードする３’～核酸配列である。一部の実施形態において、構築体は、ウイルスカプシド内にパッケージングされている。一部の実施形態において、遺伝子治療ベクター又は医薬組成物は、クモ膜下腔内注射、脳室内注射、実質内注射、若しくは静脈内注射、又はそれらの組合せによって送達される。一部の実施形態において、遺伝子治療ベクター又は医薬組成物は、対象における遺伝性障害の１つ以上の病徴を和らげ、又は減速する。一部の実施形態において、遺伝性障害は、リソソーム蓄積障害である。一部の実施形態において、遺伝性障害は、アスパルチルグルコサミン尿症、バッテン病、シスチン症、ファブリー病、ゴーシェ病Ｉ型、ゴーシェ病ＩＩ型、ゴーシェ病ＩＩＩ型、ポンペ病、テイ・サックス病、サンドホフ病、異染性白質萎縮症、ムコ脂質症Ｉ型、ムコ脂質症ＩＩ型、ムコ脂質症ＩＩＩ型、ムコ脂質症ＩＶ型、ハーラー病、ハンター病、サンフィリッポ病Ａ型、サンフィリッポ病Ｂ型、サンフィリッポ病Ｃ型、サンフィリッポ病Ｄ型、モルキオ病Ａ型、モルキオ病Ｂ型、マロトー・ラミー病、スライ病、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ１型、ニーマン・ピック病Ｃ２型、シンドラー病Ｉ型、シンドラー病ＩＩ型、アデノシンデアミナーゼ重症複合型免疫不全（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、ニューロンセロイドリポフスチン沈着症、及びＣＤＫＬ５欠乏症からなる群から選択される。

【0006】

更なる態様において、提供されるのは、安定したヒトα－ガラクトシダーゼＡ（α－ＧＡＬ）ダイマーである。一部の実施形態において、安定したα－ＧＡＬダイマーは、１つ以上の外来システイン残基を含み、１つ以上の外来システイン残基は、α－ＧＡＬダイマーの第１のサブユニットと第２のサブユニットを連結する少なくとも１つの分子間ジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態において、１つ以上の外来システイン残基は：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択される。一部の実施形態において、１つ以上の外来システイン残基は、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃを含む。一部の実施形態において、１つ以上の外来システイン残基は、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃを含む。一部の実施形態において、１つ以上の外来システイン残基は、ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃを含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１～６の１つに対して少なくとも９０％同一である配列を有する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号７～１２の１つに対して少なくとも８５％同一である核酸によってコードされている。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、ポリペプチドはさらに、異型ＩＧＦ２（ｖＩＧＦ２）ペプチドを含む。

【0007】

更なる態様において、提供されるのは、安定したヒトα－ＧＡＬダイマー、及び薬学的に許容される賦形剤、キャリア、又は希釈剤を含む医薬組成物である。一部の実施形態において、安定したα－ＧＡＬダイマーは、１つ以上の外来システイン残基を含み、１つ以上の外来システイン残基は、α－ＧＡＬダイマーの第１のサブユニットと第２のサブユニットを連結する少なくとも１つの分子間ジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態において、１つ以上の外来システイン残基は：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択される。一部の実施形態において、１つ以上の外来システイン残基は、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃを含む。一部の実施形態において、１つ以上の外来システイン残基は、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃを含む。一部の実施形態において、１つ以上の外来システイン残基は、ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃを含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１～６の１つに対して少なくとも９０％同一である配列を有する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号７～１２の１つに対して少なくとも８５％同一である核酸によってコードされている。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、ポリペプチドはさらに、異型ＩＧＦ２（ｖＩＧＦ２）ペプチドを含む。一部の実施形態において、賦形剤は、生理食塩水、マレイン酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、酢酸、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、グリシン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛、水、デキストロース、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、及び界面活性剤ポリオキシエチレン－ソルビタンモノオレアートからなる群から選択される。

【0008】

更なる態様において、提供されるのは、対象においてファブリー病を処置する方法であって、当該対象に、安定したヒトα－ＧＡＬダイマー又はその医薬組成物の治療的に有効な量を、ファブリー病を処置することを必要とする対象に投与することを含む方法である。一部の実施形態において、安定したα－ＧＡＬダイマーは、１つ以上の外来システイン残基を含み、１つ以上の外来システイン残基は、α－ＧＡＬダイマーの第１のサブユニットと第２のサブユニットを連結する少なくとも１つの分子間ジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態において、１つ以上の外来システイン残基は：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択される。一部の実施形態において、１つ以上の外来システイン残基は、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃを含む。一部の実施形態において、１つ以上の外来システイン残基は、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃを含む。一部の実施形態において、１つ以上の外来システイン残基は、ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃを含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１～６の１つに対して少なくとも９０％同一である配列を有する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号７～１２の１つに対して少なくとも８５％同一である核酸によってコードされている。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、ポリペプチドはさらに、異型ＩＧＦ２（ｖＩＧＦ２）ペプチドを含む。一部の実施形態において、賦形剤は、生理食塩水、マレイン酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、酢酸、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、グリシン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛、水、デキストロース、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、及び界面活性剤ポリオキシエチレン－ソルビタンモノオレアートからなる群から選択される。一部の実施形態において、安定したヒトα－ＧＡＬダイマー又は医薬組成物は、クモ膜下腔内注射、脳室内注射、実質内注射、皮下注射、筋肉内注射、眼注射、静脈内注射、又はそれらの組合せによって送達される。一部の実施形態において、安定したヒトα－ＧＡＬダイマー又は医薬組成物は、対象におけるファブリー病の１つ以上の病徴を和らげ、又は減速する。

【0009】

更なる態様において、提供されるのは、安定したヒトパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）分子である。一部の実施形態において、安定したＰＰＴ１分子は、１つ以上の外来システイン残基を含み、１つ以上の外来システイン残基は、ＰＰＴ１分子内の少なくとも１つの分子間ジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態において、安定したＰＰＴ１は、外来システイン残基Ａ１７１Ｃ及びＡ１８３Ｃを含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１３～１４の１つに対して少なくとも９０％同一である配列を有する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１５～１６の１つに対して少なくとも８５％同一である核酸によってコードされている。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型ＰＰＴ１ポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、ポリペプチドはさらに、異型ＩＧＦ２（ｖＩＧＦ２）ペプチドを含む。

【0010】

更なる態様において、提供されるのは、安定したＰＰＴ１、及び薬学的に許容される賦形剤、キャリア、又は希釈剤を含む医薬組成物である。一部の実施形態において、安定したＰＰＴ１分子は、１つ以上の外来システイン残基を含み、１つ以上の外来システイン残基は、ＰＰＴ１分子内の少なくとも１つの分子間ジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態において、安定したＰＰＴ１は、外来システイン残基Ａ１７１Ｃ及びＡ１８３Ｃを含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１３～１４の１つに対して少なくとも９０％同一である配列を有する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１５～１６の１つに対して少なくとも８５％同一である核酸によってコードされている。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型ＰＰＴ１ポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、ポリペプチドはさらに、異型ＩＧＦ２（ｖＩＧＦ２）ペプチドを含む。一部の実施形態において、賦形剤は、生理食塩水、マレイン酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、酢酸、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、グリシン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛、水、デキストロース、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、及び界面活性剤ポリオキシエチレン－ソルビタンモノオレアートからなる群から選択される。

【0011】

更なる態様において、提供されるのは、対象においてＣＬＮ１病を処置する方法であって、当該対象に、安定したＰＰＴ１又はその医薬組成物の治療的に有効な量を、ＣＬＮ１病を処置することを必要とする対象に投与することを含む方法である。一部の実施形態において、安定したＰＰＴ１分子は、１つ以上の外来システイン残基を含み、１つ以上の外来システイン残基は、ＰＰＴ１分子内の少なくとも１つの分子間ジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態において、安定したＰＰＴ１は、外来システイン残基Ａ１７１Ｃ及びＡ１８３Ｃを含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１３～１４の１つに対して少なくとも９０％同一である配列を有する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１５～１６の１つに対して少なくとも８５％同一である核酸によってコードされている。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型ＰＰＴ１ポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、ポリペプチドはさらに、異型ＩＧＦ２（ｖＩＧＦ２）ペプチドを含む。一部の実施形態において、賦形剤は、生理食塩水、マレイン酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、酢酸、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、グリシン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛、水、デキストロース、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、及び界面活性剤ポリオキシエチレン－ソルビタンモノオレアートからなる群から選択される。一部の実施形態において、修飾ＰＰＴ１又は医薬組成物は、クモ膜下腔内注射、脳室内注射、実質内注射、皮下注射、筋肉内注射、眼注射、静脈内注射、又はそれらの組合せによって送達される。

【0012】

更なる態様において、提供されるのは：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ガラクトシダーゼＡ（α－ＧＡＬ）ポリペプチド配列のシステイン置換を含む修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドである。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。

【0013】

更なる態様において、提供されるのは、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドをコードする核酸を含む核酸分子である。一部の実施形態において、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。

【0014】

更なる態様において、提供されるのは、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドをコードする核酸を含む核酸分子を含む遺伝子治療ベクターである。一部の実施形態において、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。

【0015】

更なる態様において、提供されるのは、α－ガラクトシダーゼＡ（α－ＧＡＬ）ポリペプチド配列のシステイン置換を含む修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドであり、システイン置換は、２つのα－ＧＡＬポリペプチド間のジスルフィド結合形成を促進して、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ポリペプチドは：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。

【0016】

更なる態様において、提供されるのは、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドをコードする核酸を含む核酸分子である。一部の実施形態において、修飾ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（α－ＧＡＬ）ポリペプチドは、α－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含み、システイン置換は、２つのα－ＧＡＬポリペプチド間のジスルフィド結合形成を促進して、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ポリペプチドは：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。

【0017】

更なる態様において、提供されるのは、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドをコードする核酸を含む遺伝子治療ベクターである。一部の実施形態において、修飾ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（α－ＧＡＬ）ポリペプチドは、α－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含み、システイン置換は、２つのα－ＧＡＬポリペプチド間のジスルフィド結合形成を促進して、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ポリペプチドは：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。

【0018】

更なる態様において、提供されるのは、２つの修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドを含むホモダイマーであり、各修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、各修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、各修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、野生型α－ＧＡＬホモダイマーと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。

【0019】

更なる態様において、提供されるのは、２つの修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドを含むホモダイマーであり、各修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは、α－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含み、システイン置換は、２つのα－ＧＡＬポリペプチド間のジスルフィド結合形成を促進して、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ポリペプチドは：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、各修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、各修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、野生型α－ＧＡＬホモダイマーと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。

【0020】

更なる態様において、提供されるのは、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドをコードする核酸を含む核酸分子であり、核酸は：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、ポリペプチドは、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、核酸は、遺伝子治療構築体である。一部の実施形態において、核酸はさらに、プロモータを含む。一部の実施形態において、プロモータは、構成的プロモータである。一部の実施形態において、プロモータは、組織特異的プロモータである。一部の実施形態において、核酸は、ウイルス核酸配列の少なくとも一部を含む。一部の実施形態において、ウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、又はヘルペスウイルスを含む。

【0021】

更なる態様において、提供されるのは、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドをコードする核酸を含む核酸分子であり、核酸は、α－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含むポリペプチドをコードしており、システイン置換は、２つのα－ＧＡＬポリペプチド間のジスルフィド結合形成を促進して、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ポリペプチドは：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、核酸は、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、ポリペプチドは、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、核酸は、遺伝子治療構築体である。一部の実施形態において、核酸はさらに、プロモータを含む。一部の実施形態において、プロモータは、構成的プロモータである。一部の実施形態において、プロモータは、組織特異的プロモータである。一部の実施形態において、核酸は、ウイルス核酸配列の少なくとも一部を含む。一部の実施形態において、ウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、又はヘルペスウイルスを含む。

【0022】

更なる態様において、提供されるのは、少なくとも１つのプロモータ、及び修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドをコードする核酸を含む核酸構築体であり、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、核酸は、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、プロモータは、構成的プロモータである。一部の実施形態において、プロモータは、組織特異的プロモータである。一部の実施形態において、核酸構築体は：ＣｒＰＶ ＩＲＥＳ、コザック配列、リンカーをコードする核酸、リーダー配列をコードする核酸配列、及びＩＧＦ２ペプチドをコードする核酸からなる群由来の１つ以上の核酸を含む。一部の実施形態において、核酸構築体は、ウイルス核酸配列の少なくとも一部を含む。一部の実施形態において、ウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、又はヘルペスウイルスを含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、核酸は、ウイルスカプシドタンパク質内にパッケージングされている。一部の実施形態において、核酸構築体は、遺伝子治療に適している。

【0023】

更なる態様において、提供されるのは、少なくとも１つのプロモータ、及び修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドをコードする核酸を含む核酸構築体であり、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは、α－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含み、システイン置換は、２つのα－ＧＡＬポリペプチド間のジスルフィド結合形成を促進して、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ポリペプチドは：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、核酸は、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、プロモータは、構成的プロモータである。一部の実施形態において、プロモータは、組織特異的プロモータである。一部の実施形態において、核酸構築体は：ＣｒＰＶ ＩＲＥＳ、コザック配列、リンカーをコードする核酸、リーダー配列をコードする核酸配列、及びＩＧＦ２ペプチドをコードする核酸からなる群由来の１つ以上の核酸を含む。一部の実施形態において、核酸構築体は、ウイルス核酸配列の少なくとも一部を含む。一部の実施形態において、ウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、又はヘルペスウイルスを含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、核酸は、ウイルスカプシドタンパク質内にパッケージングされている。一部の実施形態において、核酸構築体は、遺伝子治療に適している。

【0024】

更なる態様において、提供されるのは、（ａ）修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドであって：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドと、（ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物である。一部の実施形態において、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、賦形剤は、生理食塩水、マレイン酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、酢酸、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、グリシン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛、水、デキストロース、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、及び界面活性剤ポリオキシエチレン－ソルビタンモノオレアートからなる群から選択される。一部の実施形態において、組成物は、酵素補充治療に適している。

【0025】

更なる態様において、提供されるのは、ファブリー病の少なくとも１つの病徴を寛解させることを必要とする対象において、ファブリー病の少なくとも１つの病徴を寛解させる方法であって、少なくとも１つのプロモータ、及び修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドをコードする核酸を含む遺伝子治療核酸構築体を含む組成物の少なくとも１回の用量を投与することを含み、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む、方法である。一部の実施形態において、核酸は、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、ホモダイマーを形成するポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、核酸は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期が長い修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、プロモータは、構成的プロモータである。一部の実施形態において、プロモータは、組織特異的プロモータである。一部の実施形態において、核酸は、ウイルスの少なくとも一部を含む。一部の実施形態において、ウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、又はヘルペスウイルスを含む。一部の実施形態において、核酸は、ウイルスカプシドタンパク質内にパッケージングされている。一部の実施形態において、少なくとも１つの病徴は、痛み、皮膚の変色、発汗不能、眼の混濁、消化管機能不全、耳鳴り、聴力損失、僧帽弁逸脱、心臓病、関節の痛み、腎不全（ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ）、及び腎機能不全（ｋｉｄｎｅｙ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、少なくとも１つの病徴が、遺伝子治療核酸構築体の単回投与により和らげられる。一部の実施形態において、方法はさらに、処置の後に対象から得られる組織内のα－ＧＡＬ活性を測定することを含む。

【0026】

更なる態様において、提供されるのは、ファブリー病の少なくとも１つの病徴を寛解させることを必要とする対象において、ファブリー病の少なくとも１つの病徴を寛解させる方法であって、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドを含む組成物の少なくとも１回の用量を投与することを含み、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む、方法である。一部の実施形態において、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、修飾ヒトα－ＧＡＬポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、少なくとも１つの病徴は、痛み、皮膚の変色、発汗不能、眼の混濁、消化管機能不全、耳鳴り、聴力損失、僧帽弁逸脱、心臓病、関節の痛み、腎不全、及び腎機能不全の１つ以上から選択される

【0027】

文献の援用
本明細書中で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、又は特許出願がそれぞれ具体的に、且つ個々に、参照によって組み込まれると示されているが如く、参照によって本明細書に組み込まれる。

【0028】

本発明の特徴及び利点の理解は、実例となる実施形態を示す以下の詳細な説明（本発明の原理が利用されている）、及び添付の図面の参照によって得られるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】図１Ａ及び図１Ｂは、α－ガラクトシダーゼＡ（α－ＧＡＬ）の構造、及びアミノ酸置換の候補部位を示す。

【図2A】図２Ａは、修飾α－ＧＡＬダイマー形成を示す。

【図2B】図２Ｂは、修飾α－ＧＡＬ酵素活性を示す。

【図3A】図３Ａは、２４時間にわたるｐＨ４．６及びｐＨ７．４でのα－ＧＡＬの安定性を示す。

【図3B】図３Ｂは、７日にわたるｐＨ４．６及びｐＨ７．４でのα－ＧＡＬの安定性を示す。

【図4A】図４Ａは、ファブリー患者線維芽細胞の、修飾α－ＧＡＬの吸収及び酵素活性を示す。

【図4B】図４Ｂは、ファブリー患者線維芽細胞におけるグロボトリアオシルスフィンゴシン（ｌｙｓｏ－Ｇｂ_３）の減少を示す。

【図5】図５は、ファブリー病細胞における２つのα－ＧＡＬジスルフィドダイマーの延長された半減期の活性を示す。

【図6】図６は、修飾α－ＧＡＬ遺伝子治療による処置のある、そして処置のない野生型マウス及びＧＬＡノックアウトマウスにおけるＧＢ３基質組織学を示す。

【図7】図７は、修飾α－ＧＡＬ遺伝子治療による処置のある、そして処置のない野生型マウス及びＧＬＡノックアウトマウスにおけるＧＬＡ酵素活性を示す。

【図8】図８は、修飾α－ＧＡＬ遺伝子治療による処置のある、そして処置のない野生型マウス及びＧＬＡノックアウトマウスにおける腎臓組織溶解液中で測定されたＧＢ３基質を示す。

【図9】図９は、経時的なパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ－１）野生型対構築体ＰＰＴ－１変異体の酵素活性のウィンノンリン分析を示す。

【発明を実施するための形態】

【0030】

詳細な説明
本明細書中で提供されるのは、治療薬用のポリペプチドの変異体であって、ダイマーを形成するための、分子内のジスルフィド結合の形成に、又はポリペプチド中の２つのサブユニット間のジスルフィド結合形成に起因して安定化を可能にするシステイン置換を有する遺伝子治療用の構築体を含むポリペプチドの変異体である。当該ジスルフィド結合は、血液のｐＨ等の中性のｐＨにて、より安定した組換え酵素を生じさせる。したがって、半減期がより長い、より安定したポリペプチドが提供され、これは、変異に由来する疾患（α－ＧＡＬの変異に由来する疾患、例えばファブリー病；又はＰＰＴ－１の変異に由来する疾患、例えばＣＬＮ１病が挙げられる）の処置に有用である。本明細書中のポリペプチド変異体（「修飾ポリペプチド」とも称される）として、以下に限定されないが、α－ＧＡＬ及びＰＰＴ－１の変異体が挙げられる。

【0031】

修飾α－ＧＡＬポリペプチド
本明細書中で提供されるのは、α－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む修飾α－ＧＡＬポリペプチドである。本明細書中で提供される意図される置換として：（ｉ）Ｒ４９Ｃ及びＧ３６１Ｃ；（ｉｉ）Ｒ４９Ｃ及びＧ３６０Ｃ；（ｉｉｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；（ｉｖ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃ；並びに（ｖ）Ｓ２７６Ｃが挙げられる。一部の実施形態において、ポリペプチドは：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、少なくとも１つ、より好ましくは２つの分子間ジスルフィド結合によって安定するホモダイマーを形成することができる。修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。

【0032】

野生型の、そして例示的な修飾α－ＧＡＬ配列を、表１に示す。

【0033】

【0034】

また、本明細書中で提供されるのは、位置５１及び３６０にシステイン残基を含有し、且つ配列番号４として示される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む修飾α－ＧＡＬポリペプチドである。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、位置５１及び３６０にシステイン残基を含有し、且つ配列番号４として示される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、位置５１及び３６０にシステイン残基を含有し、且つ配列番号４として示される配列に対して少なくとも９６％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、位置５１及び３６０にシステイン残基を含有し、且つ配列番号４として示される配列に対して少なくとも９７％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、位置５１及び３６０にシステイン残基を含有し、且つ配列番号４として示される配列に対して少なくとも９８％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、位置５１及び３６０にシステイン残基を含有し、且つ配列番号４として示される配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、位置５１及び３６０にシステイン残基を含有し、且つ配列番号４として示される配列に対して９９％超の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、配列番号４として示される配列を有するポリペプチドを含む。

【0035】

また、本明細書中で提供されるのは、位置２３３及び３５９にシステイン残基を含有し、且つ配列番号５として示される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む修飾α－ＧＡＬポリペプチドである。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、位置２３３及び３５９にシステイン残基を含有し、且つ配列番号５として示される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、位置２３３及び３５９にシステイン残基を含有し、且つ配列番号５として示される配列に対して少なくとも９６％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、位置２３３及び３５９にシステイン残基を含有し、且つ配列番号５として示される配列に対して少なくとも９７％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、位置２３３及び３５９にシステイン残基を含有し、且つ配列番号５として示される配列に対して少なくとも９８％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、位置２３３及び３５９にシステイン残基を含有し、且つ配列番号５として示される配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、位置２３３及び３５９にシステイン残基を含有し、且つ配列番号５として示される配列に対して９９％超の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、配列番号５として示される配列を有するポリペプチドを含む。

【0036】

また、本明細書中で提供されるのは、２つの修飾α－ＧＡＬポリペプチドを含むホモダイマーであり、各修飾α－ＧＡＬポリペプチドは：（ｉ）Ｒ４９Ｃ及びＧ３６１Ｃ；（ｉｉ）Ｒ４９Ｃ及びＧ３６０Ｃ；（ｉｉｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；（ｉｖ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃ；並びに（ｖ）Ｓ２７６Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、各修飾α－ＧＡＬポリペプチドは：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、各修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、各修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、野生型α－ＧＡＬホモダイマーと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。

【0037】

一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、ｐＨ４．６での半減期が長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも１５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも２００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも２５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも３００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも３５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも４００％長い。

【0038】

一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬダイマーは、ｐＨ４．６での半減期が、野生型α－ＧＡＬのｐＨ４．６での半減期と比較して、少なくとも約２、２．５、３、３．５、４、４．５、又は５の倍率で長い。より好ましくは、修飾α－ＧＡＬダイマーは、ｐＨ４．６での半減期が、野生型α－ＧＡＬポリペプチドのｐＨ４．６での半減期と比較して、少なくとも約３、３．５、又は４の倍率で長い。

【0039】

一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬダイマーは、細胞内半減期が、野生型ヒトα－ＧＡＬの細胞内半減期と比較して、少なくとも約２、２．５、３、３．５、４、４．５、又は５の倍率で長い。より好ましくは、修飾α－ＧＡＬダイマーは、細胞内半減期が、野生型α－ＧＡＬポリペプチドの細胞内半減期と比較して、少なくとも約３、３．５、４、４．５、又は５の倍率で長い。

【0040】

修飾α－ＧＡＬダイマーは、野生型ヒトα－ＧＡＬと比較して、ｐＨ７．４での半減期が実質的に長い。

【0041】

修飾α－ＧＡＬポリペプチドをコードする核酸
また、本明細書中で提供されるのは、修飾α－ＧＡＬポリペプチドをコードする核酸を含む核酸分子である。意図される核酸として：（ｉ）Ｒ４９Ｃ及びＧ３６１Ｃ；（ｉｉ）Ｒ４９Ｃ及びＧ３６０Ｃ；（ｉｉｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；（ｉｖ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃ；並びに（ｖ）Ｓ２７６Ｃを含むα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含むポリペプチドをコードするものが挙げられる。一部の実施形態において、核酸は：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、ポリペプチドは、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、核酸は、遺伝子治療構築体である。一部の実施形態において、核酸はさらに、プロモータを含む。一部の実施形態において、プロモータは、構成的プロモータである。一部の実施形態において、プロモータは、組織特異的プロモータである。一部の実施形態において、核酸は、ウイルス核酸配列の少なくとも一部を含む。一部の実施形態において、ウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、又はヘルペスウイルスを含む。

【0042】

また、本明細書中で提供されるのは、少なくとも１つのプロモータ及び修飾α－ＧＡＬポリペプチドをコードする核酸を含む核酸構築体である。修飾α－ＧＡＬポリペプチドは：（ｉ）Ｒ４９Ｃ及びＧ３６１Ｃ；（ｉｉ）Ｒ４９Ｃ及びＧ３６０Ｃ；（ｉｉｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；（ｉｖ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃ；（ｖ）並びにＳ２７６Ｃを含むα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含むことが意図される。一部の実施形態において、核酸は：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、プロモータは、構成的プロモータである。一部の実施形態において、プロモータは、組織特異的プロモータである。一部の実施形態において、核酸構築体は、ウイルス核酸配列の少なくとも一部を含む。一部の実施形態において、ウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、又はヘルペスウイルスを含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、核酸は、ウイルスカプシドタンパク質内にパッケージングされている。一部の実施形態において、核酸構築体は、遺伝子治療に適している。

【0043】

【0044】

【0045】

【0046】

一部の実施形態において、本明細書中の修飾α－ＧＡＬポリペプチドをコードする核酸は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、半減期が長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも５０％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも１５０％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも２００％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも２５０％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも３００％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも３５０％長い。

【0047】

修飾ＰＰＴ－１ポリペプチド
本明細書中で提供されるのは、ＰＰＴ－１ポリペプチド配列のシステイン置換を含む修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドである。本明細書中で提供される、意図される置換として、Ａ１７１Ｃ及びＡ１８３Ｃが挙げられる。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Ａ１７１Ｃ及びＡ１８３ＣのＰＰＴ－１ポリペプチド配列のシステイン置換を含む。修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、少なくとも１つ、より好ましくは２つの分子内ジスルフィド結合によって安定する。修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。

【0048】

野生型の、そして例示的な修飾ＰＰＴ－１を、表３に示す。

【0049】

【0050】

また、本明細書中で提供されるのは、位置１７１及び１８３にシステイン残基を含有し、且つ配列番号１４として示される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドである。一部の実施形態において、修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、位置１７１及び１８３にシステイン残基を含有し、且つ配列番号１４として示される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、位置１７１及び１８３にシステイン残基を含有し、且つ配列番号１４として示される配列に対して少なくとも９６％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、位置１７１及び１８３にシステイン残基を含有し、且つ配列番号１４として示される配列に対して少なくとも９７％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、位置１７１及び１８３にシステイン残基を含有し、且つ配列番号１４として示される配列に対して少なくとも９８％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、位置１７１及び１８３にシステイン残基を含有し、且つ配列番号１４として示される配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、位置１７１及び１８３にシステイン残基を含有し、且つ配列番号１４として示される配列に対して９９％超の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、配列番号１４として示される配列を有するポリペプチドを含む。

【0051】

一部の実施形態において、修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、ｐＨ４．６での半減期が長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６の半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６の半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも１５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６の半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも２００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６の半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも２５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６の半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも３００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６の半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも３５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６の半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも４００％長い。

【0052】

一部の実施形態において、修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、ｐＨ４．６での半減期が、ｐＨ４．６での野生型ＰＰＴ－１の半減期と比較して、少なくとも約２、２．５、３、３．５、４、４．５、又は５の倍率で長い。より好ましくは、修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、ｐＨ４．６での半減期が、ｐＨ４．６での野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドの半減期と比較して、少なくとも約３、３．５、又は４の倍率で長い。

【0053】

一部の実施形態において、修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、細胞内半減期が、野生型ヒトα－ＧＡＬの細胞内半減期と比較して、少なくとも約２、２．５、３、３．５、４、４．５、又は５の倍率で長い。より好ましくは、修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、細胞内半減期が、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドの細胞内半減期と比較して、少なくとも約３、３．５、４、４．５、又は５の倍率で長い。

【0054】

修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、野生型ヒトα－ＧＡＬと比較して、ｐＨ７．４での半減期が実質的に長い。

【0055】

修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドをコードする核酸
また、本明細書中で提供されるのは、修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドをコードする核酸を含む核酸分子である。意図される核酸として：Ａ１７１Ｃ及びＡ１８３Ｃを含むＰＰＴ－１ポリペプチド配列のシステイン置換を含むポリペプチドをコードするものが挙げられる。一部の実施形態において、核酸は、Ａ１７１Ｃ及びＡ１８３Ｃのシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、ポリペプチドは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、核酸は、遺伝子治療構築体である。一部の実施形態において、核酸はさらに、プロモータを含む。一部の実施形態において、プロモータは、構成的プロモータである。一部の実施形態において、プロモータは、組織特異的プロモータである。一部の実施形態において、核酸は、ウイルス核酸配列の少なくとも一部を含む。一部の実施形態において、ウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、又はヘルペスウイルスを含む。

【0056】

【0057】

【0058】

一部の実施形態において、本明細書中の修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドをコードする核酸は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドと比較して、半減期が長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも５０％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも１５０％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも２００％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも２５０％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも３００％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも３５０％長い。

【0059】

ＩＧＦ２ペプチド
場合によっては、本明細書中の修飾ポリペプチド、例えば本明細書中の修飾α－ＧＡＬ又は修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、必要であれば、修飾ポリペプチドをリソソームに向けるためのインシュリン様成長因子２（ＩＧＦ２）ペプチドに融合される。ＩＧＦ２ペプチド配列内の異型が、ＩＧＦ２／ＣＩ－ＭＰＲへの高い親和性結合を維持し、且つＩＧＦ１、インスリン受容体、及びＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）への結合を消失させる。異型ＩＧＦ２ペプチドは、実質的に、従来のＩＧＦ２融合タンパク質と比較して、より選択的であり、且つ安全性リスクが低い。本明細書中のＩＧＦ２ペプチドとして、

のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。更なるＩＧＦ２ペプチドは、標的化の向上のために最適化された異型アミノ酸配列を有する。異型ＩＧＦ２ペプチドは、野生型ＩＧＦ２配列の位置２６、２７、４３、４８、４９、５０、５４、５５、又は６５にて異型アミノ酸を含む。これらは、配列番号１７のＦ２６、Ｙ２７、Ｖ４３、Ｆ４８、Ｒ４９、Ｓ５０、Ａ５４、Ｌ５５、又はＫ６５にて置換を含む。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｆ２６Ｓ、Ｙ２７Ｌ、Ｖ４３Ｌ、Ｆ４８Ｔ、Ｒ４９Ｓ、Ｓ５０Ｉ、Ａ５４Ｒ、Ｌ５５Ｒ、及びＫ６５Ｒからなる群由来の１つ以上の置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｆ２６Ｓの置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｙ２７Ｌの置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｖ４３Ｌの置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｆ４８Ｔの置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｒ４９Ｓの置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｓ５０Ｉの置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ａ５４Ｒの置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｌ５５Ｒの置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｋ６５Ｒの置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｆ２６Ｓ、Ｙ２７Ｌ、Ｖ４３Ｌ、Ｆ４８Ｔ、Ｒ４９Ｓ、Ｓ５０Ｉ、Ａ５４Ｒ、及びＬ５５Ｒの置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｎ末端欠失を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、１つのアミノ酸のＮ末端欠失を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、２つのアミノ酸のＮ末端欠失を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、３つのアミノ酸のＮ末端欠失を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、３つのアミノ酸のＮ末端欠失を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、４つのアミノ酸のＮ末端欠失を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、５つのアミノ酸のＮ末端欠失を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、６つのアミノ酸のＮ末端欠失を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、７つのアミノ酸のＮ末端欠失を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、７つのアミノ酸のＮ末端欠失、並びにＹ２７Ｌ及びＫ６５Ｒの置換を有する。

【0060】

不安定性を引き下げる一方、ＣＩ－ＭＰＲ結合親和性を維持するための更なる置換が意図される。当該置換は、本明細書中に記載される他のあらゆる置換と組み合わされることが意図される。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｌ１７Ｎの置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｐ３１Ｇの置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｒ３８Ｇの置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｅ４５Ｗの置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｓ５０Ｇの置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｒ３８Ｇ及びＥ４５Ｗの置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｒ３８Ｇ、Ｅ４５Ｗ、及びＳ５０Ｇの置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｐ３１Ｇ、Ｒ３８Ｇ、Ｅ４５Ｗ、及びＳ５０Ｇの置換を有する配列を有する。一部の実施形態において、ＩＧＦ２ペプチドは、Ｌ１７Ｎ、Ｐ３１Ｇ、Ｒ３８Ｇ、Ｅ４５Ｗ、及びＳ５０Ｇの置換を有する配列を有する。例示的なペプチド配列が、配列番号１７～２７によって表される。

【0061】

【0062】

内部リボソームエントリ配列
本明細書中の修飾ポリペプチドをコードする核酸、例えば修飾α－ＧＡＬ及びＰＰ－１ポリペプチドをコードする核酸は、一部の実施形態において、翻訳開始のボトルネックを迂回することによって遺伝子発現を増大させるための内部リボソームエントリ配列（ＩＲＥＳ）をさらに含む。遺伝子治療のために発現を最適化するのに適した内部リボソームエントリ配列として、以下に限定されないが、クリケット麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）ＩＲＥＳ、ピコルナウイルスＩＲＥＳ、アフトウイルスＩＲＥＳ、カポージ肉腫関連ヘルペスウイルスＩＲＥＳ、Ａ型肝炎ＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ＩＲＥＳ、ペスチウイルスＩＲＥＳ、クリパウイルスＩＲＥＳ、ムギクビレアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉ）ウイルスＩＲＥＳ、マレック病ウイルスＩＲＥＳ、及び他の適したＩＲＥＳ配列が挙げられる。一部の実施形態において、遺伝子治療構築体は、ＣｒＰＶ ＩＲＥＳを含む。一部の実施形態において、ＣｒＰＶ ＩＲＥＳは、

の核酸配列を有する。

【0063】

シグナル配列
本明細書中で提供されるのは、修飾ポリペプチド、例えば修飾α－ＧＡＬポリペプチド又は修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドをコードする核酸を含む核酸分子であり、当該核酸分子はさらに、シグナルペプチドを含み、これは、遺伝子治療構築体が形質導入された細胞からの治療用タンパク質の分泌を向上させる。シグナルペプチドは、一部の実施形態において、治療用タンパク質のタンパク質プロセシングを向上させて、発生期のポリペプチド－リボソーム複合体の、ＥＲへの移動を促進して、適切な翻訳時修飾及び翻訳後修飾を確実にする。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、（ｉ）シグナル翻訳開始配列の上流位置に、（ｉｉ）翻訳開始配列と治療用タンパク質との間に、又は（ｉｉｉ）治療用タンパク質の下流位置に位置決めされる。遺伝子治療構築体に有用なシグナルペプチドとして、以下に限定されないが、ＨＳＰ７０タンパク質のファミリーに由来する結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）シグナルペプチド（例えば、ＨＳＰＡ５、ヒートショックタンパク質ファミリーＡメンバー５）、及びその変異体が挙げられる。当該シグナルペプチドは、シグナル認識粒子に対する親和性が極めて高い。ＢｉＰアミノ酸配列の例を、以下の表６に示す。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号２９～３３からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号２９～３３からなる群から選択される配列と、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下、又は１つのアミノ酸だけ異なる。

【0064】

【0065】

コザック配列
本明細書中で提供されるのは、修飾ポリペプチド、例えば、修飾α－ＧＡＬポリペプチド又は修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドをコードする核酸を含む核酸分子であり、当該核酸分子はさらに、ｍＲＮＡの翻訳の開始を補助するコザック配列を有する核酸を含む。本明細書中で意図されるコザック配列は、ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ（配列番号３４）のコンセンサス配列を有する（小文字は、その位置にて最も共通の塩基を示し、当該塩基は変異する。大文字は、稀にしか変異しない非常に保存された塩基を示す）。Ｒは、プリン（アデニン又はグアニン）が、その位置にて常に観察されることを示す。括弧内の配列（ｇｃｃ）は、重要性が不明である。

【0066】

治療用タンパク質
本明細書中で提供される遺伝子治療構築体は、遺伝性障害を処置するためのタンパク質の安定した形態をコードする核酸を含む。遺伝子治療構築体から発現される治療用タンパク質は、不在タンパク質又は欠損タンパク質を補充する。したがって、治療用タンパク質は、個体において処置が必要な遺伝的欠損に基づいて選択される。本明細書中の安定した形態は、１つ以上の外来システイン残基を含み、これは、タンパク質内の外来システイン間に、又はタンパク質の２つのモノマーの外来システイン間にジスルフィド架橋を形成する。

【0067】

一部の実施形態において、本明細書中の遺伝子治療構築体は、酵素、例えばリソソーム蓄積障害の個体において遺伝的欠陥がある酵素をコードする。一部の実施形態において、本明細書中で提供される遺伝子治療構築体によってコードされる酵素として、以下に限定されないが、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、β－グルコセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、グリコサミノグリカンアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、イズロン酸－２－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼ、グリコサミノグリカンＮ－アセチルガラクトサミン４－スルファターゼ、アルファ－グルコシダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ２、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ３、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ４、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ５、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ６、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ７、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ８、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ９、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１０、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１１、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１２、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１３、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１４、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１５、ニューロンセロイドリポフスチノーゼ１６、及びサイクリン依存性キナーゼ様５が挙げられる。

【0068】

遺伝子治療ベクター及び組成物
本明細書中で提供されるのは：神経障害又は遺伝性障害を処置するためのタンパク質の安定した形態をコードする核酸を含む核酸構築体を含む遺伝子治療ベクターであり、安定した形態は、タンパク質内の外来システイン間で、又はタンパク質の２つのモノマーの外来システイン間でジスルフィド架橋を形成する１つ以上の外来システイン残基を含む。一部の実施形態において、安定した形態は、修飾α－ＧＡＬポリペプチド又は修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドを含む。

【0069】

一部の実施形態において、修飾ポリペプチドをコードする核酸は、いくつかのベクター型にクローニングされる。例えば、一部の実施形態において、核酸は、以下に限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドが挙げられるベクターにクローニングされる。特に注目するベクターとして、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター（ｐｒｏｂｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）、及び配列決定ベクターが挙げられる。

【0070】

さらに、修飾ポリペプチドをコードする発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供される。ウイルスベクター技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅｓ １－４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）中に、そして他のウイルス学及び分子生物学のマニュアル中に記載されている。ベクターとして有用なウイルスとして、以下に限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられる。一般に、適切なベクターは、少なくとも１種の生物において機能的な複製起点、プロモータ配列、都合の良い制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択マーカーを含有する（例えば、国際公開第０１／９６５８４号パンフレット；国際公開第０１／２９０５８号パンフレット；及び米国特許第６，３２６，１９３号明細書）。

【0071】

また、本明細書中で提供されるのは、遺伝子移入のための組成物及び系である。哺乳動物の細胞中への遺伝子移入用のいくつかのウイルスベースの系が開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系にとって都合の良いプラットフォームを提供する。選択された遺伝子が、一部の実施形態において、適切な技術を用いて、ベクター中に挿入されて、レトロウイルスの粒子内にパッケージングされる。続いて、組換えウイルスが単離されて、対象の細胞にインビボ送達又はエクスビボ送達される。いくつかのレトロウイルス系が、遺伝子治療に適している。一部の実施形態において、アデノウイルスベクターが用いられる。いくつかのアデノウイルスベクターが、遺伝子治療に適している。一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルスベクターが用いられる。いくつかのアデノ随伴ウイルスが、遺伝子治療に適している。一実施形態において、レンチウイルスベクターが用いられる。

【0072】

本明細書中で提供される遺伝子治療構築体は、注目する遺伝子がクローニングされる、又は注目する遺伝子を含むベクター（又は遺伝子治療発現ベクター）を、ベクターのヌクレオチド配列が、注目する遺伝子の発現（構成的である、又は何らかの方法で調節される）を可能にするように含む。本明細書中で提供されるベクター構築体は、注目する組織に送達することができ、且つ注目する遺伝子の発現を、注目する選択組織において実現することとなる、適切なあらゆる遺伝子発現ベクターを含む。

【0073】

一部の実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。これは、ＡＡＶベクターの、血液脳関門を越える能力、及びニューロン組織の形質導入のためである。本明細書中で提供される方法において、あらゆる血清型のＡＡＶが用いられることが意図される。特定の実施形態において用いられるウイルスベクターの血清型は、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶｒｈＳベクター、ＡＡＶｒｈ１０ベクター、ＡＡＶｒｈ３３ベクター、ＡＡＶｒｈ３４ベクター、ＡＡＶｒｈ７４ベクター、ＡＡＶ Ａｎｃ８０ベクター、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂベクター、ＡＡＶｈｕ６８ベクター、ＡＡＶ－ＤＪベクター、及び遺伝子治療に適した他のものからなる群から選択される。

【0074】

ＡＡＶベクターは、哺乳動物にとって非病原性であるＤＮＡパルボウイルスである。手短に言うと、ＡＡＶベースのベクターは、ウイルスゲノムの９６％を占めるｒｅｐウイルス遺伝子及びｃａｐウイルス遺伝子が、ウイルスＤＮＡの複製、パッケージング、及び統合を開始するのに用いられる、側面に位置する２つの１４５塩基対の逆位末端反復（ＩＴＲ）を残して、取り出されている。

【0075】

更なる実施形態は、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶｒｈＳベクター、ＡＡＶｒｈ１０ベクター、ＡＡＶｒｈ３３ベクター、ＡＡＶｒｈ３４ベクター、ＡＡＶｒｈ７４ベクター、ＡＡＶ Ａｎｃ８０ベクター、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂベクター、ＡＡＶ－ＤＪベクター、及び遺伝子治療に適した他のものを作成するための、他の血清型カプシドの使用を含む。場合によっては、ＡＡＶウイルスカプシドは、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈＳ、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＡｎｃ８０、又はＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂである。

【0076】

更なるプロモータ要素、例えばエンハンサーが、転写開始の頻度を調節する。典型的には、プロモータ要素は、開始部位の上流３０～１１０ｂｐの領域内に位置決めされるが、いくつかのプロモータは、機能的要素を開始部位の下流側にも含有することが示されてきた。高頻度になされるプロモータ要素間の間隔空け（ｓｐａｃｉｎｇ）は、フレキシブルであるので、要素同士が互いに対して逆にされ、又は移動される場合に、プロモータ機能が保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモータにおいて、プロモータ要素間の間隔空けは、多くの場合、５０ｂｐまで離されてから、活性が落ち始める。プロモータに応じて、個々の要素は、転写を活性化するように協働的に、又は独立して機能するようである。

【0077】

安定したタンパク質、例えば、修飾α－ＧＡＬポリペプチド又は修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドトランスジーンを哺乳動物Ｔ細胞内で発現することができるプロモータの例として、ＥＦ１ａプロモータがある。天然のＥＦ１ａプロモータは、リボソームへのアミノアシルｔＲＮＡの酵素的送達を担う伸長因子－１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモータは、哺乳動物発現プラスミドに広く用いられており、レンチウイルスベクターにクローニングされた導入遺伝子からの発現を駆動するのに効果的であることが示されてきた（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）参照）。プロモータの別の例として、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列がある。このプロモータ配列は、これに作動的に連結されたあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強い構成的プロモータ配列である。しかしながら、他の構成的プロモータ配列もまた時折用いられ、以下に限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモータ、ＭｏＭｕＬＶプロモータ、トリ白血病ウイルスプロモータ、エプスタイン－バーウイルス前初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ、並びにヒト遺伝子プロモータ、例えば、以下に限定されないが、アクチンプロモータ、ミオシンプロモータ、伸長因子－１ａプロモータ、ヘモグロビンプロモータ、及びクレアチンキナーゼプロモータが挙げられる。さらに、遺伝子治療ベクターは、構成的プロモータの使用に限定されることは意図されない。誘導性プロモータもまた本明細書で意図される。誘導性プロモータの使用は、分子スイッチを提供し、これは、作動的に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現が所望される場合にオンにすることができ、又は当該発現を、発現が所望されない場合にオフにすることができる。誘導性プロモータの例として、以下に限定されないが、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモータ、グルココルチコイドプロモータ、プロゲステロンプロモータ、及びテトラサイクリン調節プロモータが挙げられる。一部の実施形態において、プロモータは、α－ＧＡＬプロモータである。

【0078】

修飾ポリペプチドの発現を評価するために、細胞中に導入されることとなる発現ベクターは、多くの場合、選択マーカー遺伝子若しくはリポーター遺伝子のいずれか、又は双方を含有して、ウイルスベクターを介して形質移入又は感染されることが求められる細胞の集団からの発現細胞の同定及び選択を促進する。他の態様において、選択マーカーは、多くの場合、ＤＮＡの別個のピース上に載せられて、同時形質移入手順に用いられる。選択マーカー及びリポーター遺伝子は双方とも、時折、宿主細胞内での発現を可能にする適切な調節配列が側面に位置する。有用な選択マーカーの例として、抗生物質耐性遺伝子、例えばｎｅｏが挙げられる。

【0079】

細胞中に遺伝子を導入して発現させる方法が、本明細書中の方法に適している。発現ベクターの文脈で、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫細胞中に、当該技術におけるあらゆる方法によって容易に導入される。例えば、発現ベクターは、宿主細胞中に、物理的、化学的、又は生物学的手段によって移される。

【0080】

宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入する物理的方法として、リン酸カルシウム析出、リポフェクション、粒子砲撃、マイクロインジェクション、遺伝子ガン、及びエレクトロポレーションが挙げられる。ベクター及び／又は外来核酸を含む細胞を生成する方法が、本明細書中の方法に適している（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅｓ １－４、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ参照）。宿主細胞中へのポリヌクレオチドの一導入方法が、リン酸カルシウム形質移入である。

【0081】

宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入する化学的手段として、コロイド分散系、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、及び脂質ベース系（水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームが挙げられる）が挙げられる。インビトロで、そしてインビボで送達ビヒクルとして用いられる例示的なコロイド系として、リポソーム（例えば人工膜小胞）がある。最新技術の核酸標的送達の他の方法、例えば、標的ナノ粒子又は他の適したサブミクロンサイズの送達系によるポリヌクレオチドの送達が利用可能である。

【0082】

非ウイルス送達系が利用される場合には、例示的な送達ビヒクルは、リポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞中への核酸の（インビトロ、エクスビボ、又はインビボでの）導入に意図される。別の態様において、核酸は、脂質と会合される。脂質と会合された核酸は、一部の実施形態において、リポソームの水性内部にカプセル化され、リポソームの脂質二重層内に散在し、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの双方と会合される連結分子を介してリポソームに付着され、リポソーム内にトラップされ、リポソームと複合体形成され、脂質を含有する溶液中に分散され、脂質と混合され、脂質と組み合わされ、脂質中に懸濁液として含有され、ミセルにより含有され、若しくはミセルと複合体形成され、又は脂質と会合される。脂質、脂質／ＤＮＡ、又は脂質／発現ベクター会合組成物は、溶液での特定のいかなる構造にも限定されない。例えば、一部の実施形態において、リポソームは、二重層構造で、ミセルとして、又は「崩壊した」構造で存在する。これ以外にも、リポソームは単純に、溶液中に散在しており、おそらく、サイズ又は形状が均一でない凝集体を形成している。脂質は、一部の実施形態において、天然に存在する脂質又は合成脂質である脂肪物質である。例えば、脂質として、細胞質内に天然に存在する脂肪小滴、並びに長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドを含有する化合物のクラスが挙げられる。

【0083】

使用に適した脂質は、市販の源から得られる。例えば、一部の実施形態において、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．から得られ；一部の実施形態において、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ ＆ Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）から得られ；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、一部の実施形態において、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから得られ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、多くの場合、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａ．）から得られる。脂質のクロロホルム又はクロロホルム／メタノール貯蔵液は、多くの場合、約－２０℃にて保存される。クロロホルムは、メタノールよりも容易に蒸発するため、唯一の溶媒として用いられる。「リポソーム」は、閉じた脂質二重層又は凝集体の生成によって形成される種々の単脂質ビヒクル及び多層脂質ビヒクルを包含する総称語である。リポソームは、多くの場合、リン脂質二重層膜及び内部水性媒体により多孔質構造を有すると特徴付けられる。多重膜リポソームは、水性媒体によって隔てられた複数の脂質層を有する。多重膜リポソームは、過剰の水性溶液中にリン脂質が懸濁されると、自発的に形成される。脂質成分は、閉じた構造の形成前に自己再配置を経験し、そして水及び溶解した溶質を脂質二重層間にトラップする（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５０５－１０）。しかしながら、標準的な多孔質構造とは溶液の構造が異なる組成物も包含される。例えば、脂質は、一部の実施形態において、ミセル構造をとり、又は単に、脂質分子の不均一な凝集体としてしか存在しない。また、意図されるのは、リポフェクタミン－核酸複合体である。

【0084】

宿主細胞中に外来核酸を導入して、又は細胞を修飾α－ＧＡＬポリペプチドに曝して、宿主細胞内での組換えＤＮＡ配列の存在を確認するのに用いられる方法に関係なく、種々のアッセイが実行されることが意図される。そのようなアッセイとして、例えば、本明細書中の方法に適した「分子生物学的」アッセイ、例えばサザンブロッティング及びノザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲ；例えば、特定のペプチドの有無を、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）によって、又は本明細書中の範囲に入る剤を識別するための本明細書中に記載されるアッセイによって検出する「生化学」アッセイが挙げられる。

【0085】

本開示はさらに、修飾ポリペプチドコーディング核酸分子を含むベクターを提供する。一態様において、治療用融合タンパク質ベクターは、細胞に直接形質導入することができる。一態様において、ベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、例えばベクターであり、以下に限定されないが、１つ以上のプラスミド（例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体）、レトロウイルスベクター構築体、及びレンチウイルスベクター構築体が挙げられる。一態様において、ベクターは、哺乳動物細胞内で修飾ポリペプチド構築体を発現することができる。一態様において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。

【0086】

医薬組成物
本明細書中で提供されるのは、遺伝性障害を処置するタンパク質の安定した形態であって、タンパク質内の外来システイン間に、又はタンパク質の２つのモノマーの外来システイン間にジスルフィド架橋を形成する１つ以上の外来システイン残基を含む安定した形態である修飾ポリペプチド、及び（ｉｉ）薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。一部の実施形態において、修飾ポリペプチドは、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、修飾ポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。

【0087】

加えて、本明細書中で提供されるのは、（ｉ）修飾α－ＧＡＬポリペプチドであって、α－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む修飾α－ＧＡＬポリペプチド、及び（ｉｉ）薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。意図される置換として：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃが挙げられる。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、組成物は、シャペロンを含む。一部の実施形態において、シャペロンは、ミガラスタットを含む。

【0088】

さらに、本明細書中で提供されるのは、（ｉ）修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドであって、ＰＰＴ－１ポリペプチド配列のシステイン置換を含む修飾ＰＰＴ－１ポリペプチド、及び（ｉｉ）薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。意図される置換として、Ａ１７１Ｃ及びＡ１８３Ｃが挙げられる。一部の実施形態において、修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、組成物は、シャペロンを含む。

【0089】

本明細書中の医薬組成物に適した賦形剤として、以下に限定されないが、生理食塩水、マレイン酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、酢酸、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、グリシン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛、水、デキストロース、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、及び界面活性剤ポリオキシエチレン－ソルビタンモノオレアートが挙げられる。

【0090】

一部の実施形態において、本明細書中の医薬組成物は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ４．６での半減期が長い本明細書中の修飾α－ＧＡＬポリペプチドを含む。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも１５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも２００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも２５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも３００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも３５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも４００％長い。

【0091】

一部の実施形態において、本明細書中の医薬組成物は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドと比較して、ｐＨ４．６での半減期が長い本明細書中の修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドを含む。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも１５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも２００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも２５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも３００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも３５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ４．６での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも４００％長い。

【0092】

一部の実施形態において、本明細書中の医薬組成物は、ｐＨ７．４での半減期が長い修飾α－ＧＡＬポリペプチドを含む。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも１５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも２００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも２５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも３００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも３５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも４００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも５００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも６００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも７００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも８００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも９００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも１０００％長い。

【0093】

一部の実施形態において、本明細書中の医薬組成物は、ｐＨ７．４での半減期が長い修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドを含む。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも１５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも２００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも２５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも３００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも３５０％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも４００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも５００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも６００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも７００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも８００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも９００％長い。一部の実施形態において、ｐＨ７．４での半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも１０００％長い。

【0094】

処置の方法
遺伝子治療方法
また、本明細書中で提供されるのは、遺伝的疾患の少なくとも１つの病徴を寛解させることを必要とする対象において、遺伝的疾患の少なくとも１つの病徴を寛解させる方法である。一部のそのような方法は、遺伝性障害を処置するためのタンパク質の安定した形態をコードする遺伝子治療核酸を含む組成物の少なくとも１回の用量を投与することを含み、安定した形態は、タンパク質内の外来システイン間に、又はタンパク質の２つのモノマーの外来システイン間にジスルフィド架橋を形成する１つ以上の外来システイン残基を含む。一部の実施形態において、核酸は、ホモダイマーを形成するポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、核酸は、野生型ポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期が長いポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、プロモータは、構成的プロモータである。一部の実施形態において、プロモータは、組織特異的プロモータである。一部の実施形態において、核酸は、ウイルスの少なくとも一部を含む。一部の実施形態において、ウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、又はヘルペスウイルスを含む。一部の実施形態において、核酸は、ウイルスカプシドタンパク質内にパッケージングされている。一部の実施形態において、少なくとも１つの病徴は、痛み、皮膚の変色、発汗不能、眼の混濁、消化管機能不全、耳鳴り、聴力損失、僧帽弁逸脱、心臓病、関節の痛み、腎不全、及び腎機能不全の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、少なくとも１つの病徴が、遺伝子治療核酸構築体の単回投与により和らげられる。一部の実施形態において、方法はさらに、処置の後に対象から得られる組織内の活性を測定することを含む。

【0095】

一部の実施形態において、遺伝子治療ベクター又は医薬組成物は、脳脊髄液に投与される。一部の実施形態において、遺伝子治療ベクター又は医薬組成物は、クモ膜下腔内注射、脳室内注射、実質内注射、静脈内注射、又はそれらの組合せによって送達される。一部の実施形態において、遺伝子治療ベクター又は医薬組成物は、クモ膜下腔内注射によって投与される。一部の実施形態において、遺伝子治療ベクター又は医薬組成物は、静脈内注射を介して投与される。

【0096】

一部の実施形態において、遺伝性障害は、神経障害である。一部の実施形態において、遺伝性障害は、リソソーム蓄積障害である。一部の実施形態において、遺伝性障害は、アスパルチルグルコサミン尿症、バッテン病、シスチン症、ファブリー病、ゴーシェ病Ｉ型、ゴーシェ病ＩＩ型、ゴーシェ病ＩＩＩ型、ポンペ病、テイ・サックス病、サンドホフ病、異染性白質萎縮症、ムコ脂質症Ｉ型、ムコ脂質症ＩＩ型、ムコ脂質症ＩＩＩ型、ムコ脂質症ＩＶ型、ハーラー病、ハンター病、サンフィリッポ病Ａ型、サンフィリッポ病Ｂ型、サンフィリッポ病Ｃ型、サンフィリッポ病Ｄ型、モルキオ病Ａ型、モルキオ病Ｂ型、マロトー・ラミー病、スライ病、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ１型、ニーマン・ピック病Ｃ２型、シンドラー病Ｉ型、シンドラー病ＩＩ型、アデノシンデアミナーゼ重症複合型免疫不全（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、ニューロンセロイドリポフスチン沈着症の乳児形態、若年形態、及び成人形態、並びにＣＤＫＬ５欠乏症からなる群から選択される。

【0097】

また、本明細書中で提供されるのは、ファブリー病の少なくとも１つの病徴を寛解させることを必要とする対象において、ファブリー病の少なくとも１つの病徴を寛解させる方法である。一部のそのような方法は、少なくとも１つのプロモータ、及びα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む修飾α－ＧＡＬポリペプチドをコードする核酸を含む遺伝子治療核酸構築体を含む組成物の少なくとも１回の用量を投与することを含む。修飾α－ＧＡＬポリペプチドは：（ｉ）Ｒ４９Ｃ及びＧ３６１Ｃ；（ｉｉ）Ｒ４９Ｃ及びＧ３６０Ｃ；（ｉｉｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；（ｉｖ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃ；並びに（ｖ）Ｓ２７６Ｃが挙げられるシステイン置換を含むことが意図される。一部の実施形態において、核酸は：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃからなる群から選択されるα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃのα－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、ホモダイマーを形成するポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、核酸は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期が長い修飾α－ＧＡＬポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、プロモータは、構成的プロモータである。一部の実施形態において、プロモータは、組織特異的プロモータである。一部の実施形態において、核酸は、ウイルスの少なくとも一部を含む。一部の実施形態において、ウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、又はヘルペスウイルスを含む。一部の実施形態において、核酸は、ウイルスカプシドタンパク質内にパッケージングされている。一部の実施形態において、少なくとも１つの病徴は、痛み、皮膚の変色、発汗不能、眼の混濁、消化管機能不全、耳鳴り、聴力損失、僧帽弁逸脱、心臓病、関節の痛み、腎不全、及び腎機能不全の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、少なくとも１つの病徴が、遺伝子治療核酸構築体の単回投与により和らげられる。一部の実施形態において、方法はさらに、処置の後に対象から得られる組織内のα－ＧＡＬ活性を測定することを含む。一部の実施形態において、方法はさらに、シャペロンを投与することを含む。一部の実施形態において、シャペロンは、ミガラスタットを含む。

【0098】

また、本明細書中で提供されるのは、ＣＬＮ１病の少なくとも１つの病徴を寛解させることを必要とする対象において、ＣＬＮ１病の少なくとも１つの病徴を寛解させる方法である。一部のそのような方法は、少なくとも１つのプロモータ、及びＰＰＴ－１ポリペプチド配列のシステイン置換を含む修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドをコードする核酸を含む遺伝子治療核酸構築体を含む組成物の少なくとも１回の用量を投与することを含む。修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、Ａ１７１Ｃ及びＡ１８３Ｃが挙げられるシステイン置換を含むことが意図される。一部の実施形態において、核酸は、ホモダイマーを形成するポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、核酸は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期が長い修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、プロモータは、構成的プロモータである。一部の実施形態において、プロモータは、組織特異的プロモータである。一部の実施形態において、核酸は、ウイルスの少なくとも一部を含む。一部の実施形態において、ウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、又はヘルペスウイルスを含む。一部の実施形態において、核酸は、ウイルスカプシドタンパク質内にパッケージングされている。一部の実施形態において、少なくとも１つの病徴は、痛み、皮膚の変色、発汗不能、眼の混濁、消化管機能不全、耳鳴り、聴力損失、僧帽弁逸脱、心臓病、関節の痛み、腎不全、及び腎機能不全の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、少なくとも１つの病徴が、遺伝子治療核酸構築体の単回投与により和らげられる。一部の実施形態において、方法はさらに、処置の後に対象から得られる組織内のＰＰＴ－１活性を測定することを含む。一部の実施形態において、方法はさらに、シャペロンを投与することを含む。一部の実施形態において、シャペロンは、ミガラスタットを含む。

【0099】

一部の実施形態において、本明細書中に記載される方法による処置は、治療用タンパク質をコードする遺伝子を、治療用タンパク質を必要とする細胞に送達する。一部の実施形態において、処置は、個体において遺伝子を全ての体細胞に送達する。一部の実施形態において、処置は、標的細胞内で欠陥遺伝子を補充する。一部の実施形態において、治療用タンパク質を発現するようにエクスビボ処理された細胞が、個体に送達される。

【0100】

一部の実施形態において、本明細書中の遺伝子治療処置は、細胞内半減期が、野生型ヒトα－ＧＡＬの半減期と比較して、少なくとも約２、２．５、３、３．５、４、４．５、又は５の倍率で長い本明細書中の修飾α－ＧＡＬポリペプチドをコードする核酸を投与することを含む

【0101】

酵素補充治療方法
また、提供されるのは、遺伝性疾患の少なくとも１つの病徴を寛解させることを必要とする対象において、遺伝性疾患の少なくとも１つの病徴を寛解させる方法であり、当該方法は、遺伝性障害を処置するためのタンパク質の安定した形態を含む組成物の少なくとも１回の用量を投与することを含み、安定した形態は、タンパク質内の外来システイン間で、又はタンパク質の２つのモノマーの外来システイン間でジスルフィド架橋を形成する１つ以上の外来システイン残基を含む。一部の実施形態において、修飾ポリペプチドは、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、修飾ポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、少なくとも１つ病徴は、精神的欠陥、発作、言語障害、及び動作失調の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、方法はさらに、シャペロンを投与することを含む。一部の実施形態において、シャペロンは、ミガラスタットを含む。

【0102】

一部の実施形態において、組成物は、クモ膜下腔内注射、脳室内注射、実質内注射、皮下注射、筋肉内注射、眼注射、静脈内注射、又はそれらの組合せを介して送達される。

【0103】

一部の実施形態において、遺伝性障害は、神経障害である。一部の実施形態において、遺伝性障害は、リソソーム蓄積障害である。一部の実施形態において、遺伝性障害は、アスパルチルグルコサミン尿症、バッテン病、シスチン症、ファブリー病、ゴーシェ病Ｉ型、ゴーシェ病ＩＩ型、ゴーシェ病ＩＩＩ型、ポンペ病、テイ・サックス病、サンドホフ病、異染性白質萎縮症、ムコ脂質症Ｉ型、ムコ脂質症ＩＩ型、ムコ脂質症ＩＩＩ型、ムコ脂質症ＩＶ型、ハーラー病、ハンター病、サンフィリッポ病Ａ型、サンフィリッポ病Ｂ型、サンフィリッポ病Ｃ型、サンフィリッポ病Ｄ型、モルキオ病Ａ型、モルキオ病Ｂ型、マロトー・ラミー病、スライ病、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ１型、ニーマン・ピック病Ｃ２型、シンドラー病Ｉ型、シンドラー病ＩＩ型、アデノシンデアミナーゼ重症複合型免疫不全（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、ニューロンセロイドリポフスチン沈着症の乳児形態、若年形態、及び成人形態、並びにＣＤＫＬ５欠乏症からなる群から選択される。

【0104】

また、提供されるのは、ファブリー病の少なくとも１つの病徴を寛解させることを必要とする対象において、ファブリー病の少なくとも１つの病徴を寛解させる方法であり、当該方法は、修飾α－ＧＡＬポリペプチドを含む組成物の少なくとも１回の用量を投与することを含み、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、α－ＧＡＬポリペプチド配列のシステイン置換を含む。意図されるシステイン置換として：（ｉ）Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃ；並びに（ｉｉ）Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃが挙げられる。一部の実施形態において、α－ＧＡＬポリペプチド配列の修飾α－ＧＡＬポリペプチドシステイン置換は、Ｄ２３３Ｃ及びＩ３５９Ｃである。一部の実施形態において、α－ＧＡＬポリペプチド配列の修飾α－ＧＡＬポリペプチドシステイン置換は、Ｍ５１Ｃ及びＧ３６０Ｃである。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、修飾α－ＧＡＬポリペプチドは、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、少なくとも１つの病徴は、痛み、皮膚の変色、発汗不能、眼の混濁、消化管機能不全、耳鳴り、聴力損失、僧帽弁逸脱、心臓病、関節の痛み、腎不全、及び腎機能不全の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、方法はさらに、シャペロンを投与することを含む。一部の実施形態において、シャペロンは、ミガラスタットを含む。

【0105】

また、提供されるのは、ＣＬＮ－１病の少なくとも１つの病徴を寛解させることを必要とする対象において、ＣＬＮ－１病の少なくとも１つの病徴を寛解させる方法であり、当該方法は、修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドを含む組成物の少なくとも１回の用量を投与することを含み、ＰＰＴ－１ポリペプチドは、タンパク質内の外来システイン間で、又はタンパク質の２つのモノマーの外来システイン間でジスルフィド架橋を形成する１つ以上の外来システイン残基を含む。意図されるシステイン置換として：Ａ１７１Ｃ及びＡ１８３Ｃが挙げられる。一部の実施形態において、修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、ホモダイマーを形成する。一部の実施形態において、ホモダイマーは、ジスルフィド結合によって安定する。一部の実施形態において、修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドは、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドと比較して、ｐＨ７．４での半減期の延長を示す。一部の実施形態において、少なくとも１つ病徴は、精神的欠陥、発作、言語障害、及び動作失調の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、方法はさらに、シャペロンを投与することを含む。一部の実施形態において、シャペロンは、ミガラスタットを含む。

【0106】

一部の実施形態において、本明細書中の方法は、野生型ポリペプチドと比較して半減期が長い本明細書中の修飾ポリペプチドを投与することを含む。一部の実施形態において、半減期は、野生型ポリペプチドよりも少なくとも５０％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型ポリペプチドよりも少なくとも１５０％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型ポリペプチドよりも少なくとも２００％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型ポリペプチドよりも少なくとも２５０％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型ポリペプチドよりも少なくとも３００％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型ポリペプチドよりも少なくとも３５０％長い。

【0107】

一部の実施形態において、本明細書中の方法は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドと比較して半減期が長い本明細書中の修飾α－ＧＡＬポリペプチドを投与することを含む。一部の実施形態において、半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも５０％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも１５０％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも２００％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも２５０％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも３００％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型α－ＧＡＬポリペプチドよりも少なくとも３５０％長い。

【0108】

一部の実施形態において、本明細書中の方法は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドと比較して半減期が長い本明細書中の修飾ＰＰＴ－１ポリペプチドを投与することを含む。一部の実施形態において、半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドより少なくとも５０％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも１５０％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも２００％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも２５０％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも３００％長い。一部の実施形態において、半減期は、野生型ＰＰＴ－１ポリペプチドよりも少なくとも３５０％長い。

【0109】

定義
タンパク質に関して本明細書中で用いられる「安定した」は、修飾タンパク質（例えば、外来システイン残基を含有するように修飾されている）が、修飾なしの対応するタンパク質よりも長い期間、その生物活性の１つ以上を維持することを指す。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、生物活性を、修飾のない対応するタンパク質よりも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、又は５００％長い時間維持する。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、生物活性を、修飾のない対応するタンパク質よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、又は少なくとも５００％長い時間維持する。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、外来システインのない対応するタンパク質と比較して、半減期がより長い。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、外来システインのない対応するタンパク質と比較して、ｐＨ４．０～ｐＨ８．０、ｐＨ４．０～６．０、又はｐＨ６．０～８．０での半減期がより長い。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、外来システインのない対応するタンパク質と比較して、ｐＨ４．５～５．０、又は７．０～７．５での半減期がより長い。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、外来システインのない対応するタンパク質と比較して、ｐＨ７．４での半減期がより長い。一部の実施形態において、安定したタンパク質は、外来システインのない対応するタンパク質と比較して、ｐＨ４．６での半減期がより長い。

【0110】

本明細書中で用いられる「エクスビボ遺伝子治療」は、患者の細胞が、例えば治療遺伝子を発現するように、対象の外側で遺伝的に修飾される方法を指す。新しい遺伝情報を備えた細胞は、続いて、当該細胞が由来した対象に戻される。

【0111】

本明細書中で用いられる「インビボ遺伝子治療」は、治療遺伝子を有するベクターが対象に直接投与される方法を指す。

【0112】

本明細書中で用いられる「融合タンパク質」及び「治療用融合タンパク質」は、本明細書中で互換的に用いられており、少なくとも１つの追加のタンパク質、ペプチド、又はポリペプチドが結合した治療用タンパク質を指す。ある場合には、融合タンパク質は、２つ以上のタンパク質又はそのフラグメント（それぞれのペプチド鎖内で、化学リンカーなしに、ペプチド結合を介して共有結合されている）を含有する単一のタンパク質分子である。一部の実施形態において、融合タンパク質は、治療用タンパク質、及びシグナルペプチド、融合タンパク質のエンドサイトーシスを増大させるペプチド、又は双方を含む。一部の実施形態において、エンドサイトーシスを増大させるペプチドは、ＣＩ－ＭＰＲに結合するペプチドである。

【0113】

本明細書中で用いられる「プラスミド」は、染色体ＤＮＡと独立して細胞内で複製する、ＤＮＡの環状二本鎖ユニットを指す。

【0114】

本明細書中で用いられる「プロモータ」は、酵素ＲＮＡポリメラーゼが結合して、ＤＮＡの、ＲＮＡへの転写を開始する、ＤＮＡ上の部位を指す。

【0115】

本明細書中で用いられる「体細胞療法」は、患者を矯正するが、次世代には遺伝しない、細胞内での遺伝子発現の操作方法を指す。体細胞として、ヒト体内の全ての非生殖細胞が挙げられる。

【0116】

本明細書中で用いられる「体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ）」は、生殖細胞以外の体細胞（ｂｏｄｙ ｃｅｌｌ）全てを指す。

【0117】

本明細書中で用いられる「指向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）」は、特定の細胞型又は組織型についてのウイルス等のベクターの選択（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を指す。種々の因子が、特定の細胞に感染するベクターの能力を決定する。ウイルスは、例えば、細胞に入るために、特定の細胞表面受容体に結合しなければならない。ウイルスは典型的に、細胞が必須の受容体を発現しなければ、細胞に感染することができない。

【0118】

本明細書中で用いられる「ベクター」又は「遺伝子治療ベクター」（本明細書中で互換的に用いられる）は、細胞に治療遺伝子を送達する遺伝子治療送達ビヒクル又はキャリアを指す。遺伝子治療ベクターは、遺伝子治療に用いるのに適したあらゆるベクター、例えば、患者の標的細胞（例えば知覚ニューロン）中への核酸ポリマー（ポリペプチド又はその変異体をコードする）の治療的送達に適したあらゆるベクターである。一部の実施形態において、遺伝子治療ベクターは、治療用タンパク質又は治療用融合タンパク質をコードする核酸を細胞に送達し、そこで治療用タンパク質又は融合タンパク質が発現されて、当該細胞から分泌される。ベクターは、いかなるタイプのものであってもよく、例えば、プラスミドベクターであってもミニサークルＤＮＡであってもよい。典型的には、ベクターは、ウイルスベクターである。これらとして、遺伝的に無能にされたウイルス、例えばアデノウイルス、及び非ウイルスベクター、例えばリポソームの双方が挙げられる。ウイルスベクターは、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、又はアデノウイルスに由来してもよい。ＡＡＶは、ベクターを誘導した。ベクターは、ＡＡＶゲノム又はその誘導体を含んでもよい。

【0119】

本明細書中で用いられる「構築体」は、治療用タンパク質又は融合タンパク質をコードし、そして場合によっては、追加の配列、例えば翻訳開始配列又はＩＲＥＳ配列を含む核酸分子又は配列を指す。

【0120】

用語「形質導入」は、治療用タンパク質をコードする核酸の、標的細胞への、本開示の複製欠損ｒＡＡＶを介したインビボでの、又はインビトロでの投与／送達（レシピエント細胞による機能的ポリペプチドの発現をもたらす）に言及するのに用いられる。本開示のｒＡＡＶ等の遺伝子治療ベクターによる細胞の形質導入は、ｒＡＡＶによってコードされるポリペプチド又はＲＮＡの発現の持続をもたらす。ゆえに、本開示は、治療用タンパク質をコードするｒＡＡＶ等の遺伝子治療ベクターを、クモ膜下腔内経路、網膜内経路、眼内経路、硝子体内経路、脳室内経路、実質内経路、若しくは静脈内経路、又はそれらのあらゆる組合せによって対象に投与／送達する方法を提供する。「クモ膜下腔内」送達は、脳又は脊髄のクモ膜下の空間中への送達を指す。一部の実施形態において、クモ膜下腔内投与は、嚢内投与を介する。

【0121】

用語「レシピエント」、「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」は、本明細書中で互換的に用いられており、そして場合によっては、診断、処置、又は治療が所望されるあらゆる哺乳動物対象、特にヒトを指す。処置を目的とする「哺乳動物」は、哺乳動物として分類されるあらゆる動物を指し、ヒト、家畜、及びラボ、動物園、スポーツ、又はペットの動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルが挙げられる。一部の実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。

【0122】

本明細書中で用いられる用語「処置」、「処置すること」、「病徴を寛解させること」等は、場合によっては、治療効果を得る目的で、剤を投与すること、又は手技を実行することを指し、障害の少なくとも１つの態様又はマーカーを、統計学的に有意に、又は臨床的に著しく、阻害し、減弱させ、引き下げ、予防し、又は改変することが挙げられる。用語「寛解させる」又は「処置する」は、根本の症状についての治療を述べておらず、且つ包含しない。本明細書中で用いられる「処置」又は「寛解させること」（等）は、哺乳動物、特にヒトを処置することを含み得、そして：（ａ）障害又は障害の病徴が、障害に罹りやすい素因を持ち得るが、まだ罹っていると診断されていない対象において生じるのを予防すること（例えば、一次的障害に付随し得る、又はそれによって引き起こされ得る障害を含む）；（ｂ）障害を阻害すること、すなわち進行を抑制すること；（ｃ）障害を軽減すること、すなわち障害の緩解を引き起こすこと；及び（ｄ）障害の少なくとも１つの病徴を改善することを含む。処置することは、障害の処置、改善、又は予防の成功のあらゆるきざしに言及し得、あらゆる客観的又は主観的なパラメータ、例えば減退；寛解；病徴の減弱、若しくは障害症状を、患者に対してより耐容にすること；変性又は低下の減速；又は衰退の最終点をあまり弱体化させないことが挙げられる。病徴の処置又は改善は、１つ以上の客観的又は主観的なパラメータに基づく；医師による試験の結果が挙げられる。したがって、用語「処置すること」は、障害に付随する病徴又は症状の進行を予防し、若しくは遅延させるための、緩和するための、又は抑制若しくは阻害するための、本発明の化合物又は剤の投与を含む。用語「治療効果」は、対象における障害、障害の病徴、又は障害の副作用の引下げ、排除、又は予防を指す。

【0123】

用語「親和性」は、分子と、その結合パートナー又は受容体との間の結合の強度を指す。

【0124】

本明細書中で用いられるフレーズ「高親和性」は、例えば、ＣＩ－ＭＰＲへの親和性が、ペプチドのない治療用タンパク質の親和性よりも約１００～１０００倍、又は５００～１０００倍高い、ＣＩ－ＭＰＲに結合するペプチドを含有する治療的融合を指す。一部の実施形態において、親和性は、ペプチドなしよりも少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、又は少なくとも１０００倍高い。例えば、治療用タンパク質及びＣＩ－ＭＰＲが比較的等しい濃度で組み合わされる場合、高親和性のペプチドは、利用可能なＣＩ－ＭＰＲに結合して、結果として生じる複合体の高い濃度に向かって平衡をシフトすることとなる。

【0125】

本明細書中で用いられる「分泌」は、細胞からの、例えば、注目する組織、又は治療用タンパク質の作用部位に運ばれることとなる血流中へのタンパク質の放出を指す。遺伝子治療生成物が、器官の間質空間中に分泌される場合、分泌は、隣接する細胞の交差矯正（ｃｒｏｓｓ－ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を可能にし得る。

【0126】

本明細書中で用いられる「送達」は、薬物送達を意味する。一部の実施形態において、送達のプロセスは、原薬（例えば、遺伝子治療ベクターから産生される治療用タンパク質又は融合タンパク質）の治療活性のために、細胞の外側（例えば、血液、組織、又は間質空間）から標的細胞中に原薬を運搬することを意味する。

【0127】

本明細書中で用いられる「操作」又は「タンパク質操作」は、所望される特性をもたらすようにタンパク質をコードする適切な核酸配列、又は特定の構造を有するタンパク質の合成の実現による、タンパク質の構造の操作を指す。

【0128】

「治療的に有効な量」は、場合によっては、疾患を処置するために対象に投与される場合に、当該疾患の処置を達成するのに十分な量を意味する。

【0129】

本明細書中で用いられる数字の用語「約」は、当該数字よりも１０％小さい数字から１０％多い数字にまたがる範囲であって、当該範囲内の値、例えばその数字それ自体を含む範囲を指す。

【0130】

本明細書中で用いられる用語、特許請求の範囲の要素を「含む」は、当該要素に言及するが、更なる要素の包含を排除しない。

【実施例】

【0131】

以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を具体的に説明する目的で与えられており、本発明をいかなる形であれ限定することにはならない。本実施例は、本明細書中に記載される方法と共に、現在、好ましい実施形態の典型であり、例示であり、本発明の範囲の限定として意図されていない。特許請求の範囲によって定義される本発明の精神に包含される変形及び他の用途が、当業者であれば思い浮かぶであろう。

【0132】

実施例１：野生型α－ＧＡＬのシステイン置換のためのアミノ酸残基の識別
安定性の増強のための更なるジスルフィド結合を生成する、システイン残基における置換のための潜在的部位について、二量体化したα－ＧＡＬ（ＰＤＢ ＩＤ ３ＨＧ３）の結晶構造を調査した（図１Ａ）。ＣＨＡＲＭＭフォースフィールドによるＮＡＭＤを分析に用いた。分析に基づいて、表８に示すシステイン変異体を、定方向変異誘発の標準的な方法を用いて調製した。

【0133】

【0134】

また、図１Ｂ参照。アミノ酸配列を、表１に示す。

【0135】

実施例２：修飾α－ＧＡＬの二量体化及び酵素活性
修飾α－ＧＡＬのジスルフィド結合ダイマーの形成を、細胞溶解液及び培地中で調査した（図２Ａ）。各α－ＧＡＬ構築体のクローンが、２９３ＨＥＫ細胞内で一過的に発現された。細胞溶解液及び培地を、４～１２％の勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で走らせて、ニトロセルロースに転写した。α－ＧＡＬを、ウサギモノクローナル抗α－ＧＡＬ １：２０００（ａｂｃａｍ ａｂ１６８３４１）によるウェスタンブロッティングによって検出した。

【0136】

還元サンプル又は非還元サンプルを、電気泳動及びウェスタンブロッティングにかけた。図２にみられるように、α－ＧＡＬのＭ５１Ｃ－Ｇ３６０Ｃバージョン及びＤ２３３Ｃ－Ｉ３５９Ｃバージョンは、容易にジスルフィド結合α－ＧＡＬダイマーを形成した。

【0137】

サンプルを調製するために、１×１０^６個の細胞を、α－ＧＡＬ構築体の一過性発現により収集した。細胞を、５００μｌの２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファｐＨ６．５、０．２５％ＴＸ－１００中に溶解した。細胞溶解液を、１０，０００ｇにて２分間遠心分離して、上清を新しいチューブに移した。４０μｌの細胞溶解液又は培地を新しいチューブに移して、１６μｌのＬＤＳ ４×サンプルバッファを、６μｌの１０×還元剤（還元条件用）と共に加えた。以下のように調製したサンプルミックスを、９５℃にて５分間加熱した。１×ＭＯＰ ＳＤＳランニングバッファを、電気泳動に用いた。

【0138】

酵素活性を試験するために、溶解液又は培地を、４－メチルウンベリフェロン－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（４－ＭＵＧ）基質と共に１時間インキュベートした。続いて、酵素反応を止めて、α－ＧＡＬ酵素活性を、励起３６０ｎｍでの蛍光及び４５０ｎｍでの放射によって測定した。図２Ｂに示すように、Ｍ５１Ｃ－Ｇ３６０Ｃ及びＤ２３３Ｃ－Ｉ３５９Ｃのジスルフィドα－ＧＡＬ変異体は双方とも、酵素的に活性であった。各サンプル内のα－ＧＡＬの特異的活性及び量を定量化しなかったので、図２Ｂは、α－ＧＡＬの野生型バージョンと変異型バージョン間での活性の定量的比較を示していない。

【0139】

実施例３：酸性環境内での修飾α－ＧＡＬの経時的な安定性分析
２４時間にわたってｐＨ安定性を試験するために、一過的に発現された変異型α－ＧＡＬ及び野生型α－ＧＡＬを、標準的な方法に従うコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）アガロースプルダウンを用いて捕獲した。ＣｏｎＡ溶出液を、ｐＨ４．６バッファ又はｐＨ７．４バッファ中に希釈した。サンプルを、０、０．５、１、２、４、５、及び２４時間目に、ｐＨ４．６又は７．４にてプレインキュベートした。

【0140】

酵素活性を測定するために、ｐＨ４．６のバッファを各サンプルに加えて、４－ＭＵＧ基質上で活性を試験した。反応混合液を、３７℃にて１時間インキュベートした。反応を、１２５μＬの停止バッファ（０．４Ｍグリシン－ＮａＯＨ、ｐＨ１０．８）を加えることによって終了した。蛍光を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダー：Ｅｘ：３６０ｎｍ、Ｅｍ：４５０ｎｍで読んだ。結果を図３Ａに示す。

【0141】

長期安定性試験のために、一過的に発現された修飾α－ＧＡＬ及び野生型α－ＧＡＬを、先に述べたように、培地から単離して、富化して、ＣｏｎＡアガロースビーズを用いて精製した。溶出したα－ＧＡＬを、経時変化安定性実験のために、ｐＨ４．６又はｐＨ７．４にてインキュベートした。時点は、０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、５時間、２４時間、２日、５日、６日、及び７日を含んだ。図３Ｂは、Ｍ５１Ｃ－Ｇ３６０Ｃ α－ＧＡＬが、ｐＨ４．６にて７日にわたって野生型対照よりも安定していることを示している。修飾α－ＧＡＬは双方とも、７日にわたって、ｐＨ７．４の野生型対照よりも実質的に安定していた。

【0142】

実施例４：ファブリー患者線維芽細胞によるα－ＧＡＬ吸収及び酵素アッセイ
細胞吸収プロトコル
吸収アッセイを行うために、１日目に、３００，０００個のファブリー患者線維芽細胞（Ｒ３０１Ｑ）を、６ウェルプレート内のウェル毎に播種した。２日目に、培地を、１．８ｍＬ吸収培地と交換して、５％ＣＯ２により３７℃にて１時間インキュベートした。吸収培地中に調製した２５０ｎＭ酵素（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ、Ｍ５１Ｃ－Ｇ３６０Ｃ、Ｄ２３３Ｃ－Ｉ３５９Ｃ、及びＷＴ）の２００μＬ用量を、工程２において１６～１８時間調製した６ウェル中の細胞に与えた。３日目に、３００μＬの１Ｍトリスを加えて、室温にて３０分間インキュベートした。４００μＬの１Ｍ ＮａＨ_２ＳＯ_４を加えて、混合した。細胞プレートを、１ｍｌ ＤＰＢＳで２回洗浄した。５００μＬの水を各ウェル中に加えて、細胞をプレートから収集した。Ｍａｔｒｉｃ－ｇｒｅｅｎを加えてから、アッセイまで－８０℃フリーザーにて凍結した。プレートをスピンしてから、酵素及びタンパク質をアッセイした。

【0143】

１３０μＬの水中に２０μＬの細胞溶解液を加えることによって、タンパク質アッセイを行った。１５０μＬ ＢＣＡワーキング試薬を加えて、３７℃にて２時間インキュベートした。続いて、プレートを、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘで読んだ。

【0144】

５μＬの細胞溶解液を１５μＬアッセイバッファ中に加えてから、５０μＬ ４－ＭＵＧ基質を加えることによって、酵素アッセイを行った。これを、３７℃にて１時間インキュベートした。１２５μＬの停止バッファを加えて、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘで読んだ。

【0145】

対照として、凍結した細胞溶解液を室温にて解凍して、５分間超音波処理した。５０μＬを、１３ｍＬのシラン処理したガラス管中に移した。２５μＬのグルコサイコシン（ＩＳ）（濃度１２５ｎｇ／ｍＬ）を加えた。１ｍＬのメタノールを加えて、混合液をおおよそ１０分間超音波処理した。５００μＬの１Ｎ ＨＣｌを加えて、ボルテックスしてからおおよそ１０分間超音波処理した。続いて、混合物を室温にておおよそ３０分間振盪した。サンプルを、４，０００ｒｐｍで室温にて１０分間遠心分離した。上清を、予めコンディショニングしたＳＰＥカートリッジ上に移した。

【0146】

１ｍｌのメタノール及び１ｍｌのミリポア水でＳＰＥカートリッジをコンディショニングすることによって、固体サンプルを調製した。サンプルを、ＳＰＥカートリッジ上にロードした。カートリッジを、２ｍＬの０．１Ｎ ＨＣｌに続いて２ｍＬのＭＥＯＨで洗浄した。サンプルを、２ｍＬのメタノール中５％水酸化アンモニウムで、シラン処理したクリーンガラス中に溶出した。サンプルを、窒素下で蒸発させて、４０℃にて乾燥させた。２５μＬのＤＭＳＯを各抽出液に加えて、ボルテックスした。１２５μＬ（１７５μＬをラン０３に用いた）の移動相Ｂを加えて、ボルテックスした。サンプルを、ガラスバイアル中に移した。１０μｌを、分析カラム上に注入した。

【0147】

ファブリー病患者由来の線維芽細胞を培養して、６－ウェルプレート内に播種した。野生型α－ＧＡＬで処理した細胞を、吸収及び以降の酵素研究について、陽性対照として用いた。線維芽細胞を、野生型α－ＧＡＬ、Ｍ５１Ｃ－Ｇ３６０Ｃ α－ＧＡＬ、又はＤ２３３Ｃ－Ｉ３５９Ｃ α－ＧＡＬと共に１６～１８時間インキュベートした。続いて、細胞を、蛍光放出によって判定するα－ＧＡＬ酵素アッセイ用に溶解した。図４Ａは、Ｍ５１Ｃ－Ｇ３６０Ｃ α－ＧＡＬ及びＤ２３３Ｃ－Ｉ３５９Ｃ α－ＧＡＬが双方とも、少なくとも野生型α－ＧＡＬと同様にα－ＧＡＬ酵素活性を回復することができたことを示している。図４Ｂ参照。グロボトリアオシルスフィンゴシン（ｌｙｓｏ－Ｇｂ３）は、ファブリー病用のバイオマーカーである。ファブリー病の処置が成功すると、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって判定したように、ｌｙｓｏ－Ｇｂ３が顕著に引き下げられる。

【0148】

実施例５：ＦＢ－１４（Ｒ３０１Ｑ）ファブリー患者線維芽細胞における異型ホモダイマー吸収
ファブリー患者線維芽細胞を、ファブラザイム及びα－ＧＡＬ細胞吸収研究のために、６－ウェルプレート内に播種した。細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータにて、７ｎＭのファブラザイム、野生型α－ＧＡＬ、Ｍ５１Ｃ－Ｇ３６０Ｃ α－ＧＡＬ、又はＤ２３３Ｃ－Ｉ３５９Ｃ α－ＧＡＬを含有する吸収培地内で１６時間インキュベートした。１日目に、細胞を洗浄して、さらに通常の増殖培地中でもう５日間維持した。細胞を、図５に示す時点にて収集した。細胞溶解液を、酵素活性を判定するのに用いた。α－ＧＡＬ酵素活性を、ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質／ｈｒとして、細胞溶解液タンパク質濃度で判定して標準化した。異型ホモダイマーは、細胞吸収後の細胞の内側での半減期が、野生型よりも２～３倍長く、そしてファブラザイムよりも３～４倍長いと判定された（図５）。

【0149】

実施例６：マウスモデルにおけるファブリー病遺伝子治療
ＡＡＶベクターを、滅菌ＰＢＳ中に希釈した。ＡＡＶベクターは：ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＧＬＡｎａｔｕｒａｌ．ｒＢＧ、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＧＬＡｃｏ．ｒＢＧ、及びＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＧＬＡ－Ｍ５１Ｃ－Ｇ３６０Ｃｃｏ．ｒＢＧを含んだ。

【0150】

ベクター生成
参照ＧＬＡ配列、並びに位置５１でのメチオニンからシステイン、及び位置３６０でのグリシンからシステインの変異体を逆翻訳して、ヌクレオチド配列を、ＣＢ７プロモータ下に発現カセットを有するＡＡＶ生成用のシスプラスミドを生成するようにコドン最適化した。また、天然のｈＧＬＡ（参照配列）ｃＤＮＡをオーダーし、そして同ＡＡＶシス骨格中にクローニングして、コドン最適化配列と比較した。ＡＡＶｈｕ６８ベクターを生成して、以前に記載されるように滴定した（Ｌｏｃｋ，Ａｌｖｉｒａ ｅｔ ａｌ．２０１０，“Ｒａｐｉｄ，ｓｉｍｐｌｅ，ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ ｓｃａｌｅ．”Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２１（１０）：１２５９－１２７１）。手短に言うと、ＨＥＫ２９３細胞を３回形質移入して、培養液の上清を収集して、濃縮して、イオジキサノール勾配で精製した。精製したベクターを、以前に記載される、ウサギベータ－グロビンポリＡ配列を標的化するプライマーを用いるドロップレットデジタルＰＣＲで滴定した（Ｌｏｃｋ Ｍ，Ｒ．Ａｌｖｉｒａ，Ｓ．Ｊ．Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，“Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ａｎｄ ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｔｉｔｅｒｓ ｂｙ ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ．”Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５（２）：１１５－１２５（２０１４））。

【0151】

動物
ファブリーマウス（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９バックグラウンド創始者におけるＧｌａノックアウト）であるハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓで購入した（系統＃００３５３５、「α－Ｇａｌ Ａ ＫＯマウス」としても知られている）。繁殖コロニーを、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｇｒａｍ ＡＡＡＬＡＣ公認バリアマウス施設にて維持し、ヘテロ接合体交配にヘテロ接合体を用いて、同腹仔内にｎｕｌｌ対照及びＷＴ対照を生み出した。Ｇｌａノックアウトマウスは、ファブリー病について広く使用されているモデルである。

【0152】

マウスは、臨床的に正常に見えるが、血漿中でのＧＬＡ基質グロボトリアオシルスフィンゴシン（ｌｙｓｏ－ＧＢ３としても知られている）の、そして肝臓、心臓、腎臓、皮膚、小腸及び大腸、並びに中枢神経系中でのグロボトリアオシルセラミド（ＧＬ３、ＧＢ３としても知られている）の進行性蓄積を示す。サイズが小さいこと、表現型に再現性があること、そして繁殖が効率的であることで、前臨床候補インビボスクリーニングにとって最適である迅速な研究が可能となる。

【0153】

動物飼育部屋を、６４～７９°Ｆ（１８～２６℃）の温度範囲、３０～７０％の湿度範囲にて維持した。動物を、離乳まで両親及び同腹仔と収容し、そして次に、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＴＲＬ）ＧＴＰ飼育器内のケージあたり２～５頭の標準的な檻に入れた。ケージ、水ボトル、及び寝具材をオートクレーブ処理して、バリア施設に入れた。自動制御される１２時間の明／暗サイクルを維持した。各暗期間を、１９００時間（±３０分）から始めた。食物を不断給餌した（Ｐｕｒｉｎａ、ＬａｂＤｉｅｔ（登録商標）、５０５３、Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ、ＰｉｃｏＬａｂ（登録商標）、Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ ２０、２５ｌｂ）。水は、各収容ケージ内の個々に置いた水ボトルを介して、全動物が自由に入手可能であった。

【0154】

インビボ研究及び組織学
マウスは、０．１ｍＬ中５×１０^１１ＧＣ（おおよそ２．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＧＬＡ（種々のｈＧＬＡ構築体）を、外側尾静脈を介して受け、ベクター投与後の７日目及び２１日目に、血清単離のために採血し、そして最終的に（血漿単離のために）採血して、注射の２８日後に放血によって安楽死させた。組織を、脳から始めて速やかに収集した。

【0155】

組織学用の組織を、標準的な方法を用いてホルマリン固定して、パラフィン包埋した。ＤＲＧを有する脊髄（骨中）を、ＺＦ中で固定して、ＥＤＴＡ中で脱灰して、ＧＴＰ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅの標準的な手順に従って処理した。亜鉛－ホルマリンを用いて、良好な組織保存を得、そしてＧｂ３蓄積をＩＨＣによって形態学用に染色した（Ｈ＆Ｅ）。

【0156】

ＧＬ３についての免疫染色を、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルに実行した。切片を脱パラフィンして、ＰＢＳ中１％ロバ血清＋０．２％トリトンで１５分間ブロックしてから、一次抗体（Ａｍｓｂｉｏ ＡＭＳ．Ａ２５０６、抗Ｇｂ３モノクローナル抗体）及びビオチン化二次抗体（ブロッキングバッファ中に希釈）で順次インキュベートした；ＨＲＰベースの比色反応を用いて、シグナルを検出した。委員会認定の獣医学的病理医がスライドを盲検化してレビューした。

【0157】

ファブリー－／－マウスビヒクルＰＢＳ対照は、著しいＧＬ３（ＩＨＣ染色切片上の暗染色）蓄積を示す。ＷＴマウス及び全ベクター処置マウスは、ＧＬ３蓄積のクリアランスがほぼ完全～完全である（図６）。

【0158】

ＧＬＡ活性
ホモジナイズした組織の血漿又は上清を、６ｍＭ ４－ＭＵ－α－ガラクトピラノシドｐＨ４．６、９０ｍＭ ＧａｌＮＡｃと混合して、３７℃にて３時間インキュベートした。反応を、０．４ＭグリシンｐＨ１０．８で停止した。相対蛍光単位ＲＦＵを、Ｖｉｃｔｏｒ３蛍光計、ｅｘ ３５５ｎｍ、４６０ｎｍでの放射を用いて測定した。単位ｎｍｏｌ／ｍＬ／ｈｒの活性を、４－ＭＵの標準曲線から、補間法によって算出した。個々の組織サンプル中の活性レベルを、ホモジェネート上清中の総タンパク質含量について標準化した。同等の容量を、血漿サンプルに用いる。

【0159】

ファブリー－／－マウスは、α－Ｇａｌ Ａ活性の完全な欠如を示した。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＧＬＡ－Ｍ５１Ｃ－Ｇ３６０Ｃｃｏ．ｒＢＧ ＧＴｘベクターによるファブリーマウスの処置は、腎臓において、野生型よりも＞７倍高いＧＬＡ活性をもたらした（図７）。

【0160】

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるグロボトリアオシルセラミド（ＧＬ３、ＧＢ３としても知られている）の定量化
組織ホモジェネート中のＧＬＡ基質、ＧＬ３を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイによって定量化した。手短に言うと、内部標準をホモジェネートサンプル（５０μＬ）に加えて、サンプルを、Ｃ１８ベースの固相抽出（ＳＰＥ）を用いて処理した。標準曲線を、１２個のセラミド形態を含有するストック由来の既知濃度のＧＬ３（８．８３ｎＭ～４．４１μＭ）に対して作成した。１２個全てのアイソフォーム由来の監視した応答を合計して、比率を、本アッセイにおける内部標準に対して生成した。続いて、研究サンプルの結果として生じた比率を、ＧＬ３定量化用に作成した曲線と比較した。

【0161】

ファブリー－／－マウスは、ＧＬＡ基質グロボトリアオシルセラミド（ＧＬ３）の＞１０倍の蓄積を示した。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＧＬＡ－Ｍ５１Ｃ－Ｇ３６０Ｃｃｏ．ｒＢＧ ＧＴｘベクターによるファブリーマウスの処置は、腎臓において、野生型レベルに対して、ＧＬ３の完全な引下げをもたらした（図８）。

【0162】

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるグロボトリアオシルスフィンゴシン（ｌｙｓｏ－ＧＢ３としても知られている）の定量化
血漿中のＧＬＡ基質、ｌｙｓｏ－ＧＢ３を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイによって定量化した。手短に言うと、安定したＣ１３標識内部標準を、血漿サンプル（５０μＬ）に加えて、サンプルを、Ｃ１８／陽イオン交換混在モード固相抽出（ＳＰＥ）を用いて処理する。標準曲線を、既知濃度のｌｙｓｏ－ＧＢ３（０．２５４ｎＭ～２５４ｎＭ）に対して作成してから、研究サンプルのｌｙｓｏ－ＧＢ３応答を、ｌｙｓｏ－ＧＢ３定量化用に作成した曲線と比較した。

【0163】

ＬＣ／ＭＳによるＧＬＡシグネチャーペプチド
血漿を、１００％メタノール中に析出させて、遠心分離する。上清は破棄する。ペレットを、内部標準としてのｈＧＬＡに特有の安定した同位体標識ペプチドでスパイクして、トリプシンと共に再懸濁して、３７℃にて２時間インキュベートする。消化を、１０％ギ酸で停止する。ペプチドを、Ｃ－１８逆相クロマトグラフィによって分離して、ＥＳＩ－質量分光法によって同定及び定量化する。血漿中の総ＧＬＡ濃度を、シグネチャーペプチド濃度から算出する。

【0164】

細胞表面受容体結合アッセイ
９６ウェルプレートを受容体でコーティングして、洗浄して、ＢＳＡでブロックする。ＣＨＯ培養条件培地、又は活性が等しいｒｈＧＬＡ若しくは操作ＧＬＡを含有する血漿を、３倍に連続希釈して、９つの一連の減少濃度を得、そして共結合（ｃｏ－ｃｏｕｐｌｅｄ）受容体と共にインキュベートする。インキュベーションの後、プレートを洗浄して、あらゆる非結合ＧＬＡを除去して、４－ＭＵ－α－ガラクトピラノシドを３７℃にて１時間加える。反応を、１．０Ｍグリシン、ｐＨ１０．５で停止して、ＲＦＵを、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ蛍光計；ｅｘ ３７０、放射４６０によって読んだ。サンプル毎のＲＦＵを、４－ＭＵの標準曲線から、補間法によって、ｎｍｏｌ／ｍＬ／ｈｒの活性に変換する。非線形回帰を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて行う。

【0165】

実施例７：安定したＰＰＴ－１構築体
安定したＰＰＴ－１構築体を、結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ ３ＧＲＯ）に基づいて操作した。２つのシステインが、構造を安定させるジスルフィド結合を形成すると予測される。ジスルフィド結合は、酵素機能の半減期を延ばすことが見出された（以下のデータを参照）。ＨＥＧ ２９３におけるこの構築体の発現レベルは、野生型ＰＰＴ－１のレベルに近いことが見出された。

【0166】

ＰＰＴ－１酵素の安定性及び半減期の向上
分子内ジスルフィド架橋を、酵素を安定させる（活性酵素の半減期を測定することによって判定する）ように、ＰＰＴ－１に操作した。突然変異した残基、Ａ１７１Ｃ／Ａ１８３Ｃを選択した。なぜなら、相同タンパク質、ＰＰＴ－２内の等価の残基が、ジスルフィド架橋を形成するからである。相同タンパク質内のこの自然変異を用いて、ＰＰＴ－１における操作努力を通知した。

【0167】

構築体ＰＰＴ－１の安定性試験
構築体ＰＰＴ－１を、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞内で一過的に発現させて、条件培地を、形質移入の５日後に収集した。同じことを、野生型ＰＰＴ１に行った。酵素活性アッセイを、４８時間又は７２時間にわたって、条件培地の双方のセットに実行した。経時的に保持される酵素活性の量を求めて、システイン二重変異体をＷＴと比較した（図９）。

【0168】

アルファ相及びベータ相を表す２方向において半減期を推定した。というのも、活性が二相消失であると思われるからである（以下のＰＫ表に隣接する対数プロットを参照）。アルファ半減期を、初期の終末又は分布相の間に推定し、ベータ半減期を、終末の消失相の間に推定した。ＡＴＢ２００総ＧＡＡタンパク質分析について、多くの場合、アルファ相が報告される。というのも、血中に存在する一方、組織中に分布する間の、ＡＴＢ２００の結合及び安定化に及ぼすＡＴ２２２１の効果を実証することにより意味があるからである。

【0169】

Ｃ_０及びＡＵＣを含む構築体ＰＰＴ－１の薬物動態を報告する。ＡＵＣ_{ｉｎｆｉｎｉｔｙ}は、ベータ半減期を推定するのに用いたのと同じ消失速度定数に由来した。

【0170】

【0171】

本発明の好ましい実施形態を、本明細書中に示して説明してきたが、当業者であれば、そのような実施形態が、一例としてのみ提供されていることが明らかであろう。当業者であれば、多数の変形、変化、及び代用が、本発明を逸脱しない範囲で思い浮かぶであろう。本明細書中に記載される実施形態に対して種々の代替物が使用されてもよいことが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が、本発明の範囲を定義すること、そして特許請求の範囲内の方法及び構造、並びにそれらの均等物が、特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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