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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-28
(45)【発行日】2024-11-06
(54)【発明の名称】Ｎｒｆ２活性化剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/4745 20060101AFI20241029BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20241029BHJP
A61K 8/49 20060101ALI20241029BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20241029BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20241029BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20241029BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20241029BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20241029BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241029BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20241029BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241029BHJP
A61P 39/06 20060101ALI20241029BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241029BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20241029BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20241029BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20241029BHJP
C12Q 1/66 20060101ALN20241029BHJP
【ＦＩ】
A61K31/4745 ZNA
A23L33/105
A61K8/49
A61P9/10
A61P11/00
A61P11/06
A61P17/00
A61P19/02
A61P25/00
A61P25/28
A61P29/00 101
A61P39/06
A61P43/00 111
A61Q19/00
C12Q1/02
C12N15/12
C12Q1/66
【請求項の数】
1
(21)【出願番号】P 2023167752
(22)【出願日】2023-09-28
【審査請求日】2023-09-28
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】397036365
【氏名又は名称】株式会社アイビー化粧品
(74)【代理人】
【識別番号】100098545
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 伸一
(74)【代理人】
【識別番号】100189717
【弁理士】
【氏名又は名称】太田 貴章
(72)【発明者】
【氏名】竹入 雅敏
(72)【発明者】
【氏名】新井 啓子
(72)【発明者】
【氏名】木村 吉秀
【審査官】新留 素子
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１１０６６４８１５（ＣＮ，Ａ）
【文献】国際公開第２００７／１０２４６７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００５／０９９４８５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】PNAS，2023年05月，Vol.120, No.22，e2220148120
【文献】Pharmacogn. J.，2016年，Vol.8, No.5，pp.451-458
【文献】Biocatalysis and Agricultural Biotechnology，2019年，Vol.19，Article 101115
【文献】Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry，2021年，Vol.10, No.6，pp.31-36
【文献】International Journal of Research and Review，2019年，Vol.6, Issue 8，pp.517-524
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
Ａ６１Ｑ
Ａ２３Ｌ ３３／１０５
Ｃ１２Ｑ １／０２
Ｃ１２Ｎ １５／１２
Ｃ１２Ｑ １／６６
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の一般式（１）で表されるビスインドール型アルカロイドまたはその薬学的に許容される塩を有効成分とするＮｒｆ２活性化剤（但し、アルツハイマー病、多発性硬化症の予防・治療のためのものを除き、タベルネモンタナ・ディバリカタ（Ｔａｂｅｒｎａｅｍｏｎｔａｎａ ｄｉｖａｒｉｃａｔａ）またはその葉のエタノール抽出物もしくはメタノール抽出物からなるものを除く）。【化1】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｎｒｆ２活性化剤に関する。
【背景技術】
【0002】
体内における酸化ストレスに対する防御機構の一つとして、転写因子であるＮｒｆ２（ＮＦ－Ｅ２ ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２）が、酸化ストレスを軽減するための遺伝子の発現を増加させるなどすることで細胞を保護する役割を果たしていることが知られている。このため、近年、Ｎｒｆ２を活性化させることによって酸化ストレスが発症や症状の進行に関与する疾患を予防したり治療したりするための成分の探索が精力的に行われており、例えば特許文献１には、クコの果実（クコシ）の抽出物が、Ｎｒｆ２活性化作用を有することが記載されている。しかしながら、Ｎｒｆ２活性化作用を有する成分の探索は、今なお意義深い状況にある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特開２０１２－２１１１０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
そこで本発明は、酸化ストレスが発症や症状の進行に関与する疾患を予防したり治療したりするためのＮｒｆ２活性化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意検討を行った結果、ビスインドール型アルカロイドの１つとして知られている下記の化学構造式で表されるコノフィリンが、Ｎｒｆ２活性化作用を有することを見出した。
【0006】
【化1】
【0007】
上記の知見に基づいてなされた本発明のＮｒｆ２活性化剤は、請求項１記載の通り、下記の一般式（１）で表されるビスインドール型アルカロイドまたはその薬学的に許容される塩を有効成分とする（但し、アルツハイマー病、多発性硬化症の予防・治療のためのものを除き、タベルネモンタナ・ディバリカタ（Ｔａｂｅｒｎａｅｍｏｎｔａｎａ ｄｉｖａｒｉｃａｔａ）またはその葉のエタノール抽出物もしくはメタノール抽出物からなるものを除く）。
【0008】
【化2】
【0009】
［式中、Ｒ１は水酸基またはＲ２と一緒になって－Ｏ－を示す。Ｒ２はＲ１と一緒になって－Ｏ－またはＲ３と一緒になって－Ｏ－を示す。Ｒ３はＲ２と一緒になって－Ｏ－または水素原子を示す。Ｒ４とＲ５はいずれも水酸基または一緒になって－Ｏ－もしくは結合を示す。］
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、酸化ストレスが発症や症状の進行に関与する疾患を予防したり治療したりするためのＮｒｆ２活性化剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】実施例における、コノフィリンのＮｒｆ２活性化作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明のＮｒｆ２活性化剤は、下記の一般式（１）で表されるビスインドール型アルカロイドまたはその薬学的に許容される塩を有効成分とする。
【0013】
【化3】
【0014】
［式中、Ｒ１は水酸基またはＲ２と一緒になって－Ｏ－を示す。Ｒ２はＲ１と一緒になって－Ｏ－またはＲ３と一緒になって－Ｏ－を示す。Ｒ３はＲ２と一緒になって－Ｏ－または水素原子を示す。Ｒ４とＲ５はいずれも水酸基または一緒になって－Ｏ－もしくは結合を示す。］
【0015】
上記の一般式（１）で表されるビスインドール型アルカロイドの薬学的に許容される塩としては、無機酸塩（塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩など）、有機酸塩（酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、シユウ酸塩など）などが挙げられる。
【0016】
上記の一般式（１）で表されるビスインドール型アルカロイドの具体例としては、コノフィリン（Ｒ１が水酸基、Ｒ２とＲ３が一緒になって－Ｏ－、Ｒ４とＲ５が一緒になって－Ｏ－）、コノフィリジン（Ｒ１が水酸基、Ｒ２とＲ３が一緒になって－Ｏ－、Ｒ４とＲ５が一緒になって結合）、コノフォリン（Ｒ１とＲ２が一緒になって－Ｏ－、Ｒ３が水素原子、Ｒ４とＲ５が一緒になって－Ｏ－）、コノフィリニン（Ｒ１が水酸基、Ｒ２とＲ３が一緒になって－Ｏ－、Ｒ４とＲ５がいずれも水酸基）などが挙げられる。これらの化合物は、抗腫瘍作用などを有する植物由来のビスインドール型アルカロイドとして公知であり、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ｅｒｖａｔａｍｉａ ｍｉｃｒｏｐｈｙｌｌａ）やタベルネモンタナ・ディバリカタ（Ｔａｂｅｒｎａｅｍｏｎｔａｎａ ｄｉｖａｒｉｃａｔａ）などのキョウチクトウ科の植物から単離精製することができる（必要であれば例えば特許第４６９６３０３号公報を参照のこと）。しかしながら、本発明のＮｒｆ２活性化剤の有効成分として用いるこれらの化合物は、単離精製されたものに限定されず、これらの化合物を含む溶媒抽出物などの形態であってもよい。また、これらの化合物は、有機化学的手法で合成されたものであってもよく、不斉炭素の存在に基づく立体異性体（エナンチオ異性体やジアステレオ異性体）やラセミ体であってもよい。また、これらの化合物は、２種類以上の化合物の混合物であってもよく、２種類以上の化合物を含む溶媒抽出物などの形態であってもよい。なお、ここで「溶媒抽出物」とは、抽出溶媒としての水や有機溶媒（メタノールやエタノールやイソプロパノールに例示されるモノアルコールや１，３－ブチレングリコールに例示される多価アルコールなどのアルコール、エーテル、ヘキサン、酢酸エチル、アセトニトリルなど。これらは水を含んでもよい）を用いて例えば上記の植物から抽出されるエキスを意味する。
【0017】
本発明におけるＮｒｆ２活性化剤は、各種の製剤形態に製剤化することでそれ自体を医薬品や健康食品などとして服用や摂取することができることに加え、各種の飲食品に配合して摂取することができる。また、本発明におけるＮｒｆ２活性化剤は、軟膏、クリーム、ローションといった外用剤の形態で皮膚に塗布することもできる。その服用量や摂取量や塗布量は、適用対象者の年齢や性別や体重、症状の程度などに基づいて適宜決定することができ、適切量を服用や摂取や塗布することにより、そのＮｒｆ２活性化作用に基づいて、アルツハイマー病、慢性閉塞性肺疾患、喘息、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、関節リウマチ、光による皮膚の障害や老化など、酸化ストレスが発症や症状の進行に関与する疾患の予防効果や治療効果（美肌効果や美白効果を含む）を期待することができる。
【実施例】
【0018】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【0019】
実験例１：コノフィリンのＮｒｆ２活性化作用
（実験方法）
キョウチクトウ科の植物であるエルウァタミア・ミクロフィラから特許第４６９６３０３号公報に記載の方法によって単離精製されたコノフィリン（結晶）のＮｒｆ２活性化作用を、Ｎｒｆ２抗酸化経路のモニタリングシステムとして知られているＡＲＥ（抗酸化応答エレメント：Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ）－ルシフェラーゼレポーターアッセイによって評価した。具体的には、ルシフェラーゼレポーターアッセイ用ベクターであるｐＮＬ２．２［ＮｌｕｃＰ／Ｈｙｇｒｏ］Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のマルチクローニングサイトに、ＡＲＥ配列を２回繰り返した配列からなるポリヌクレオチド（ＴＡＧＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＣＡＡＣＴＴＴＴＡＧＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＣＡＡＣＴＴＴ：配列番号１）を組み込んだプラスミドを、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖ（Ｌｏｎｚａ社）を用いてＨａＣａＴ細胞（ＤＫＦＺ）にエレクトロポレーションによって導入し、２４時間後、終濃度６００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを添加して薬剤耐性細胞セレクションを行うことで、ハイグロマイシン耐性能を有するＡＲＥ－ルシフェラーゼレポーター安定発現ＨａＣａＴ細胞株を樹立した。９６ウェルプレートに、１ウェルあたり約１００００個のＡＲＥ－ルシフェラーゼレポーター安定発現ＨａＣａＴ細胞株を１００μＬの培地（１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）と２００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－グルタミン溶液（×１００）（富士フイルム和光純薬社）を添加した高グルコースＤＭＥＭ （Ｓｉｇｍａ社）、以下同じ）で播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１６～２４時間培養した。その後、コノフィリンを様々な終濃度になるようにＤＭＳＯに溶解して添加した培地（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）に交換し、さらに２４時間培養した。２４時間後、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、プロトコルに従ってルシフェラーゼ活性を測定することで、コノフィリンのＮｒｆ２活性化作用を評価した。
（実験方法）
キョウチクトウ科の植物であるエルウァタミア・ミクロフィラから特許第４６９６３０３号公報に記載の方法によって単離精製されたコノフィリン（結晶）のＮｒｆ２活性化作用を、Ｎｒｆ２抗酸化経路のモニタリングシステムとして知られているＡＲＥ（抗酸化応答エレメント：Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ）－ルシフェラーゼレポーターアッセイによって評価した。具体的には、ルシフェラーゼレポーターアッセイ用ベクターであるｐＮＬ２．２［ＮｌｕｃＰ／Ｈｙｇｒｏ］Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のマルチクローニングサイトに、ＡＲＥ配列を２回繰り返した配列からなるポリヌクレオチド（ＴＡＧＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＣＡＡＣＴＴＴＴＡＧＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＣＡＡＣＴＴＴ：配列番号１）を組み込んだプラスミドを、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖ（Ｌｏｎｚａ社）を用いてＨａＣａＴ細胞（ＤＫＦＺ）にエレクトロポレーションによって導入し、２４時間後、終濃度６００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを添加して薬剤耐性細胞セレクションを行うことで、ハイグロマイシン耐性能を有するＡＲＥ－ルシフェラーゼレポーター安定発現ＨａＣａＴ細胞株を樹立した。９６ウェルプレートに、１ウェルあたり約１００００個のＡＲＥ－ルシフェラーゼレポーター安定発現ＨａＣａＴ細胞株を１００μＬの培地（１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）と２００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－グルタミン溶液（×１００）（富士フイルム和光純薬社）を添加した高グルコースＤＭＥＭ （Ｓｉｇｍａ社）、以下同じ）で播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１６～２４時間培養した。その後、コノフィリンを様々な終濃度になるようにＤＭＳＯに溶解して添加した培地（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）に交換し、さらに２４時間培養した。２４時間後、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、プロトコルに従ってルシフェラーゼ活性を測定することで、コノフィリンのＮｒｆ２活性化作用を評価した。
【0020】
（実験結果）
コントロールとして終濃度０．１％のＤＭＳＯのみを添加した場合のルシフェラーゼ活性を１とした相対値として図１に示す（ＣＮＰはコノフィリンを表す）。図１から明らかなように、コノフィリンは、濃度依存的にルシフェラーゼ活性を高めた。コノフィリンを終濃度１μｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解して添加する際に、あわせてＮｒｆ２阻害剤であるＭＬ－３８５（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を終濃度２０μＭになるようにＤＭＳＯに溶解して添加すると（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）、ルシフェラーゼ活性は大きく低下した。以上の結果から、コノフィリンのＮｒｆ２活性化作用を確認することができた。
コントロールとして終濃度０．１％のＤＭＳＯのみを添加した場合のルシフェラーゼ活性を１とした相対値として図１に示す（ＣＮＰはコノフィリンを表す）。図１から明らかなように、コノフィリンは、濃度依存的にルシフェラーゼ活性を高めた。コノフィリンを終濃度１μｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解して添加する際に、あわせてＮｒｆ２阻害剤であるＭＬ－３８５（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を終濃度２０μＭになるようにＤＭＳＯに溶解して添加すると（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）、ルシフェラーゼ活性は大きく低下した。以上の結果から、コノフィリンのＮｒｆ２活性化作用を確認することができた。
【0021】
製剤例１：錠剤
以下の成分組成からなるＮｒｆ２活性化作用を有する錠剤を自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
コノフィリン １
乳糖 ８０
ステアリン酸マグネシウム １９
以下の成分組成からなるＮｒｆ２活性化作用を有する錠剤を自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
コノフィリン １
乳糖 ８０
ステアリン酸マグネシウム １９
【0022】
製剤例２：ビスケット
以下の成分組成からなるＮｒｆ２活性化作用を有するビスケットを自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
コノフィリン １
薄力粉 ３２
全卵 １６
バター １６
砂糖 ２４
水 １０
ベーキングパウダー １
以下の成分組成からなるＮｒｆ２活性化作用を有するビスケットを自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
コノフィリン １
薄力粉 ３２
全卵 １６
バター １６
砂糖 ２４
水 １０
ベーキングパウダー １
【0023】
製剤例３：ゼリー
以下の成分組成からなるＮｒｆ２活性化作用を有するゼリーを自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
コノフィリン ０．０１
ゲル化剤 １．３
砂糖 ２０
ｐＨ調整剤 ２．５
水 ７６．１９
以下の成分組成からなるＮｒｆ２活性化作用を有するゼリーを自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
コノフィリン ０．０１
ゲル化剤 １．３
砂糖 ２０
ｐＨ調整剤 ２．５
水 ７６．１９
【0024】
製剤例４：軟膏
以下の成分組成からなるＮｒｆ２活性化作用を有する軟膏を自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
コノフィリン ５
白色ワセリン ９５
以下の成分組成からなるＮｒｆ２活性化作用を有する軟膏を自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
コノフィリン ５
白色ワセリン ９５
【0025】
製剤例５：クリーム
以下の成分組成からなるＮｒｆ２活性化作用を有するクリームを自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
コノフィリン ５
白色ワセリン ３０
セタノール １５
ラウリル硫酸ナトリウム １
パラオキシ安息香酸エチル ０．１
パラオキシ安息香酸ブチル ０．１
水 ４８．８
以下の成分組成からなるＮｒｆ２活性化作用を有するクリームを自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
コノフィリン ５
白色ワセリン ３０
セタノール １５
ラウリル硫酸ナトリウム １
パラオキシ安息香酸エチル ０．１
パラオキシ安息香酸ブチル ０．１
水 ４８．８
【0026】
製剤例６：ローション
以下の成分組成からなるＮｒｆ２活性化作用を有するローションを自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
コノフィリン １０
ポリオキシエチレン（４０）硬化ヒマシ油 ０．５
エタノール ５
パラベン ０．２
水 ８４．３
以下の成分組成からなるＮｒｆ２活性化作用を有するローションを自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
コノフィリン １０
ポリオキシエチレン（４０）硬化ヒマシ油 ０．５
エタノール ５
パラベン ０．２
水 ８４．３
【産業上の利用可能性】
【0027】
本発明は、酸化ストレスが発症や症状の進行に関与する疾患を予防したり治療したりするためのＮｒｆ２活性化剤を提供することができる点において、産業上の利用可能性を有する。
【要約】 （修正有）
【課題】酸化ストレスが発症や症状の進行に関与する疾患を予防したり治療したりするためのＮｒｆ２活性化剤を提供すること。
【解決手段】下記構造式の化合物に例示されるビスインドール型アルカロイドまたはその薬学的に許容される塩を有効成分とする。
【選択図】図１
【解決手段】下記構造式の化合物に例示されるビスインドール型アルカロイドまたはその薬学的に許容される塩を有効成分とする。
【選択図】図１
【図1】
【配列表】