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特許7578932ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤、及びＧＭ１ガングリオシドーシス予防用又は治療用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-29
(45)【発行日】2024-11-07
(54)【発明の名称】ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤、及びＧＭ１ガングリオシドーシス予防用又は治療用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/454 20060101AFI20241030BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20241030BHJP
【ＦＩ】
A61K31/454
A61P3/00
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2023128123
(22)【出願日】2023-08-04
(62)【分割の表示】P 2019562499の分割
【原出願日】2018-12-28
(65)【公開番号】P2023133620
(43)【公開日】2023-09-22
【審査請求日】2023-08-21
(31)【優先権主張番号】P 2017254888
(32)【優先日】2017-12-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504159235
【氏名又は名称】国立大学法人 熊本大学
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100152272
【弁理士】
【氏名又は名称】川越 雄一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(72)【発明者】
【氏名】江良 択実
(72)【発明者】
【氏名】梶原 隆太郎
【審査官】石井 裕美子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１２／１５４９４４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】ChemMedChem，2012年，Vol.7，pp.1925-1934
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Sertindole（セルチンドール）、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤。
【請求項2】
請求項１に記載のＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤及び薬学的に許容される担体を含有する、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防用又は治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤、及びＧＭ１ガングリオシドーシス予防用又は治療用組成物に関する。
本願は、２０１７年１２月２８日に、日本に出願された特願２０１７－２５４８８８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１７年１２月２８日に、日本に出願された特願２０１７－２５４８８８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
ＧＭ１ガングリオシドは、糖脂質の一種であり、細胞のシグナル伝達などに関与する分子である。このＧＭ１が関与する疾患として、ＧＭ１ガングリオシドーシスが知られている。
【0003】
ＧＭ１ガングリオシドーシスはライソゾーム病の１つであり、ＧＭ１ガングリオシドの加水分解に関与する酵素の欠損・異常によって、ＧＭ１が特に神経系（脳）に蓄積してしまう先天性代謝異常症である。
ＧＭ１ガングリオシドーシスは、発症時期と臨床経過により、乳児型、若年型、成人型に分類される。特に乳児型は生後３～６ヶ月までに発達の遅れが見られ、生後１年を過ぎるまでにほとんどの患児が、除脳硬直など重度の神経障害を示すようになり、通常３～４歳までに死亡する。
ＧＭ１ガングリオシドーシスは、発症時期と臨床経過により、乳児型、若年型、成人型に分類される。特に乳児型は生後３～６ヶ月までに発達の遅れが見られ、生後１年を過ぎるまでにほとんどの患児が、除脳硬直など重度の神経障害を示すようになり、通常３～４歳までに死亡する。
【0004】
ＧＭ１ガングリオシドーシスに対する治療剤開発において、例えば、非特許文献１では、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤として、カスパーゼ阻害剤であるＺ－ＹＶＡＤ－ＦＭＫが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特表２０１６－５３３７７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
ＧＭ１ガングリオシドーシスに対する治療剤は、現在のところ見つかっておらず、新規治療剤の開発が望まれている。
【0007】
そこで本発明は、新たなＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤、及びＧＭ１ガングリオシドーシス予防用又は治療用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
発明者らは、ＧＭ１ガングリオシド（以下、「ＧＭ１」ともいう。）患者由来ｉＰＳ細胞から分化させた神経幹細胞を用いたスクリーニング系により化合物を見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］Amodiaquine（アモジアキン）、Acacetin（アカセチン）、Sulfamerazine（スルファメラジン）、Ungerine（ウンゲリン）、Amiodarone（アミオダロン）、Sertindole（セルチンドール）、Delcorine（デルコリン）、Perphenazine（ペルフェナジン）、Althiazide（アルチアジド）、Diethylstilbestrol（ジエチルスチルベストロール）、Thiethylperazine（チエチルペラジン）、Harmol（ハルモール）、Skimmianine（スキムミアニン）、Succinylsulfathiazole（スクシニルサルファチアゾール）、Fillalbin（フィラルビン）、Canavanine（カナバニン）、Harmaline（ハルマリン）、Trihexyphenidyl（トリヘキシフェニジル）、Fluoxetine（フルオキセチン）、Lovastatin（ロバスタチン）、Haloperidol（ハロペリドール）、Prenylamine lactate（プレニルアミン乳酸）、Bromperidol（ブロムペリドール）、Convolamine（コンボルバミン）、及びMiglustat（ミグルスタット）、並びに、これらの薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とするＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤。
［２］下記一般式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］Amodiaquine（アモジアキン）、Acacetin（アカセチン）、Sulfamerazine（スルファメラジン）、Ungerine（ウンゲリン）、Amiodarone（アミオダロン）、Sertindole（セルチンドール）、Delcorine（デルコリン）、Perphenazine（ペルフェナジン）、Althiazide（アルチアジド）、Diethylstilbestrol（ジエチルスチルベストロール）、Thiethylperazine（チエチルペラジン）、Harmol（ハルモール）、Skimmianine（スキムミアニン）、Succinylsulfathiazole（スクシニルサルファチアゾール）、Fillalbin（フィラルビン）、Canavanine（カナバニン）、Harmaline（ハルマリン）、Trihexyphenidyl（トリヘキシフェニジル）、Fluoxetine（フルオキセチン）、Lovastatin（ロバスタチン）、Haloperidol（ハロペリドール）、Prenylamine lactate（プレニルアミン乳酸）、Bromperidol（ブロムペリドール）、Convolamine（コンボルバミン）、及びMiglustat（ミグルスタット）、並びに、これらの薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とするＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤。
［２］下記一般式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤。
【0009】
【化1】
【0010】
［一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、アリール基、アラルキル基、又はシクロアルキル基を表す。Ｘは、単結合、又は２価の連結基を表す。ｎは、０、１、又は２を表す。Ｒ３は、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。Ｒ４は、水素原子、又は炭素数１～５のアルキル基を表す。Ｒ５は、水素原子、水酸基、炭素数１～５のアルキル基、又は炭素数１～５のアルコキシ基を表す。Ｒ６は、水素原子、水酸基、シアノ基、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。］
［３］下記一般式（２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤。
［３］下記一般式（２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤。
【0011】
【化2】
【0012】
［一般式（２）中、Ｒ１０は、単結合又は２価の連結基を表す。Ｒ１１は、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。ｎ１０及びｎ１１は、それぞれ独立して、０～４の整数を表す。Ｒ１２及びＲ１３が、それぞれ複数存在する場合、互いに同じでも異なってもよい。Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、又は炭素数１～５のアルコキシ基を表す。
ｎ１２は、０～４の整数を表す。Ｒ１４が、複数存在する場合、互いに同じでも異なってもよい。］
［４］下記一般式（３）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤。
ｎ１２は、０～４の整数を表す。Ｒ１４が、複数存在する場合、互いに同じでも異なってもよい。］
［４］下記一般式（３）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤。
【0013】
【化3】
【0014】
［一般式（３）中、Ｒ２０は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。Ｒ２１及びＲ２４は、それぞれ独立して、単結合又は２価の連結基を表す。Ｒ２２及びＲ２３は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のハロアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基を表す。］
［５］下記一般式（４）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤。
［５］下記一般式（４）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤。
【0015】
【化4】
【0016】
［一般式（４）中、Ｒ３０及びＲ３１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、又はアラルキル基を表す。実線と点線の二重線部分は単結合又は二重結合を表す。］
［６］下記一般式（５）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤。
［６］下記一般式（５）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤。
【0017】
【化5】
【0018】
［一般式（５）中、Ｒ４０は、単結合又は２価の連結基を表す。Ｒ４１～Ｒ４３は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、又はアラルキル基を表す。］
［７］［１］～［６］のいずれか一つに記載のＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤及び薬学的に許容される担体を含有する、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防用又は治療用組成物。
［７］［１］～［６］のいずれか一つに記載のＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤及び薬学的に許容される担体を含有する、ＧＭ１ガングリオシドーシス予防用又は治療用組成物。
【発明の効果】
【0019】
本発明により、新たなＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】健常者及びＧＭ１患者由来の神経幹細胞におけるＧＭ１蓄積を比較した図である。
【図2】ＧＭ１抑制化合物を用いた場合のＧＭ１蓄積の様子を示した図である。
【図3】ＧＭ１抑制化合物を用いた場合のＧＭ１蓄積の様子を示した図である。
【図4】ＧＭ１抑制化合物を腹腔内投与した場合のＧＭ１モデルマウスの脳切片におけるＧＭ１蓄積への影響を調べた図である。
【図5】ＧＭ１抑制化合物を腹腔内投与した場合のＧＭ１モデルマウスの脳におけるＧＭ１ガングリオシド量を比較した結果を示した図である。
【図6】ガングリオシドの合成及び分解過程を示した図である。
【図7】Amodiaquine又はThiethylperanzineを添加した、正常(201B7)及び疾患由来 (A138 #1-3)のiPS細胞から分化して得られた神経幹細胞における各酵素遺伝子の発現量の解析結果である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
［ＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤］
１実施形態において、本発明は、Amodiaquine（アモジアキン）、Acacetin（アカセチン）、Sulfamerazine（スルファメラジン）、Ungerine（ウンゲリン）、Amiodarone（アミオダロン）、Sertindole（セルチンドール）、Delcorine（デルコリン）、Perphenazine（ペルフェナジン）、Althiazide（アルチアジド）、Diethylstilbestrol（ジエチルスチルベストロール）、Thiethylperazine（チエチルペラジン）、Harmol（ハルモール）、Skimmianine（スキムミアニン）、Succinylsulfathiazole（スクシニルサルファチアゾール）、Fillalbin（フィラルビン）、Canavanine（カナバニン）、Harmaline（ハルマリン）、Trihexyphenidyl（トリヘキシフェニジル）、Fluoxetine（フルオキセチン）、Lovastatin（ロバスタチン）、Haloperidol（ハロペリドール）、Prenylamine lactate（プレニルアミン乳酸）、Bromperidol（ブロムペリドール）、Convolamine（コンボルバミン）、及びMiglustat（ミグルスタット）、並びに、これらの薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有するＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤を提供する。
１実施形態において、本発明は、Amodiaquine（アモジアキン）、Acacetin（アカセチン）、Sulfamerazine（スルファメラジン）、Ungerine（ウンゲリン）、Amiodarone（アミオダロン）、Sertindole（セルチンドール）、Delcorine（デルコリン）、Perphenazine（ペルフェナジン）、Althiazide（アルチアジド）、Diethylstilbestrol（ジエチルスチルベストロール）、Thiethylperazine（チエチルペラジン）、Harmol（ハルモール）、Skimmianine（スキムミアニン）、Succinylsulfathiazole（スクシニルサルファチアゾール）、Fillalbin（フィラルビン）、Canavanine（カナバニン）、Harmaline（ハルマリン）、Trihexyphenidyl（トリヘキシフェニジル）、Fluoxetine（フルオキセチン）、Lovastatin（ロバスタチン）、Haloperidol（ハロペリドール）、Prenylamine lactate（プレニルアミン乳酸）、Bromperidol（ブロムペリドール）、Convolamine（コンボルバミン）、及びMiglustat（ミグルスタット）、並びに、これらの薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有するＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤を提供する。
【0022】
また、１実施形態において、本発明は、下記一般式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有するＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤を提供する。
【0023】
【化6】
【0024】
［一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、アリール基、アラルキル基、又はシクロアルキル基を表す。Ｘは、単結合、又は２価の連結基を表す。ｎは、０、１、又は２を表す。Ｒ３は、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。Ｒ４は、水素原子、又は炭素数１～５のアルキル基を表す。Ｒ５は、水素原子、水酸基、炭素数１～５のアルキル基、又は炭素数１～５のアルコキシ基を表す。Ｒ６は、水素原子、水酸基、シアノ基、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。］
【0025】
Ｒ１及びＲ２における、炭素数１～５のアルキル基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基等が挙げられる。
Ｒ１及びＲ２におけるアリール基としては、炭素数６～１８であるものが好ましく、炭素数６～１０であるものがより好ましく、具体的にはフェニル基が特に好ましい。
Ｒ１及びＲ２におけるアラルキル基としては、炭素数１～５のアルキレン基と上記Ｒ１及びＲ２におけるアリール基とが結合したものが好ましい。
Ｒ１及びＲ２におけるシクロアルキル基としては、炭素数３～８のモノシクロアルカンから１個の水素原子を除いた基が好ましく、具体的には、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロオクタン等が挙げられる。
Ｒ１及びＲ２におけるアリール基としては、炭素数６～１８であるものが好ましく、炭素数６～１０であるものがより好ましく、具体的にはフェニル基が特に好ましい。
Ｒ１及びＲ２におけるアラルキル基としては、炭素数１～５のアルキレン基と上記Ｒ１及びＲ２におけるアリール基とが結合したものが好ましい。
Ｒ１及びＲ２におけるシクロアルキル基としては、炭素数３～８のモノシクロアルカンから１個の水素原子を除いた基が好ましく、具体的には、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロオクタン等が挙げられる。
【0026】
Ｘにおける２価の連結基としては、アルキレン基、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＮＨ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【0027】
Ｒ３における炭素数１～５のアルキル基、アラルキル基、アリール基、及びシクロアルキル基としては、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ４における炭素数１～５のアルキル基としては、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ４における炭素数１～５のアルキル基としては、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
【0028】
Ｒ５における炭素数１～５のアルキル基としては、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ５における炭素数１～５のアルコキシ基としては、－ＯＲのＲの部分が、Ｒ１及びＲ２において上述した炭素数１～５のアルキル基と同様のものが挙げられる。
Ｒ５における炭素数１～５のアルコキシ基としては、－ＯＲのＲの部分が、Ｒ１及びＲ２において上述した炭素数１～５のアルキル基と同様のものが挙げられる。
【0029】
Ｒ６における炭素数１～５のアルキル基、アラルキル基、アリール基、シクロアルキル基としては、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ６における炭素数１～５のアルコキシ基としては、Ｒ５において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ６における炭素数１～５のアルコキシ基としては、Ｒ５において上述したものと同様のものが挙げられる。
【0030】
上述した中でも、Ｘとしては、単結合が好ましく、ｎは１が好ましく、Ｒ３～Ｒ５は水素原子が好ましい。
【0031】
本実施形態のＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としては、下記一般式（１－１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することが、好ましい。
【0032】
【化7】
【0033】
［一般式（１－１）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、アリール基、アラルキル基、又はシクロアルキル基を表す。Ｘは、単結合、又は２価の連結基を表す。Ｒ６は、水素原子、水酸基、シアノ基、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。］
【0034】
上述した中でも、Ｒ６としては、水酸基が好ましく、Ｒ１及びＲ２としては、炭素数１～５のアルキル基が好ましい。
【0035】
本実施形態のＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としては、下記式（１－１－１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することが、特に好ましい。
【0036】
【化8】
【0037】
また、１実施形態において、本発明は、下記一般式（２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有するＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤を提供する。
【0038】
【化9】
【0039】
［一般式（２）中、Ｒ１０は、単結合又は２価の連結基を表す。Ｒ１１は、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。ｎ１０及びｎ１１は、それぞれ独立して、０～４の整数を表す。Ｒ１２及びＲ１３が、それぞれ複数存在する場合、互いに同じでも異なってもよい。Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、又は炭素数１～５のアルコキシ基を表す。
ｎ１２は、０～４の整数を表す。Ｒ１４が、複数存在する場合、互いに同じでも異なってもよい。］
ｎ１２は、０～４の整数を表す。Ｒ１４が、複数存在する場合、互いに同じでも異なってもよい。］
【0040】
Ｒ１０における２価の連結基としては、Ｘにおいて上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１１における炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、アラルキル基、アリール基、及びシクロアルキル基としては、Ｒ５において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１１における炭素数１～５のヒドロキシアルキル基としては、アルキル基の部分が、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１２及びＲ１３における炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、及びシクロアルキル基としては、Ｒ１１において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１２及びＲ１３におけるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が挙げられる。
Ｒ１２及びＲ１３における炭素数１～５のチオアルキル基としては、アルキル基の部分が、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１４におけるハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、及び炭素数１～５のアルコキシ基としては、Ｒ１２及びＲ１３において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１１における炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、アラルキル基、アリール基、及びシクロアルキル基としては、Ｒ５において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１１における炭素数１～５のヒドロキシアルキル基としては、アルキル基の部分が、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１２及びＲ１３における炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、及びシクロアルキル基としては、Ｒ１１において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１２及びＲ１３におけるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が挙げられる。
Ｒ１２及びＲ１３における炭素数１～５のチオアルキル基としては、アルキル基の部分が、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１４におけるハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、及び炭素数１～５のアルコキシ基としては、Ｒ１２及びＲ１３において上述したものと同様のものが挙げられる。
【0041】
上述した中でも、Ｒ１３及びＲ１４としては、水素原子が好ましく、ｎ１０は１が好ましい。
【0042】
本実施形態のＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としては、下記一般式（２－１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することが、好ましい。
【0043】
【化10】
【0044】
［一般式（２－１）中、Ｒ１０は、単結合又は２価の連結基を表す。Ｒ１１は、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。Ｒ１２は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。］
【0045】
上述した中でも、Ｒ１０としては、アルキレン基が好ましい。Ｒ１０におけるアルキレン基としては、炭素数１～５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基から１個の水素原子を除いた基が好ましい。炭素数１～５のアルキル基としては、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
【0046】
本実施形態のＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としては、下記一般式（２－１－１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することが、更に好ましい。
【0047】
【化11】
【0048】
［一般式（２－１－１）中、Ｒ１１は、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。Ｒ１２は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。］
【0049】
上述した中でも、Ｒ１１としては、炭素数１～５のアルキル基、又は炭素数１～５のヒドロキシアルキル基が好ましい。Ｒ１２としては、ハロゲン原子、又は炭素数１～５のチオアルキル基が好ましい。
【0050】
本実施形態のＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としては、下記式（２－１－１－１）又は（２－１－１－２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することが、特に好ましい。
【0051】
【化12】
【0052】
また、１実施形態において、本発明は、下記一般式（３）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有するＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤を提供する。
【0053】
【化13】
【0054】
［一般式（３）中、Ｒ２０は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、又はシクロアルキル基を表す。Ｒ２１及びＲ２４は、それぞれ独立して、単結合又は２価の連結基を表す。Ｒ２２及びＲ２３は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のハロアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基を表す。］
【0055】
Ｒ２０における、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、アラルキル基、アリール基、及びシクロアルキル基としては、Ｒ１２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ２１及びＲ２４における２価の連結基としては、Ｘにおいて上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ２２及びＲ２３における、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、及び炭素数１～５のヒドロキシアルキル基としては、Ｒ１２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ２２及びＲ２３における、炭素数１～５のハロアルキル基としては、フッ化アルキル基、塩化アルキル基、臭化アルキル基が挙げられ、Ｒ１及びＲ２において上述したアルキル基から、少なくとも１つの水素原子がハロゲン原子に置き換えられたものが挙げられる。
Ｒ２１及びＲ２４における２価の連結基としては、Ｘにおいて上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ２２及びＲ２３における、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、及び炭素数１～５のヒドロキシアルキル基としては、Ｒ１２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ２２及びＲ２３における、炭素数１～５のハロアルキル基としては、フッ化アルキル基、塩化アルキル基、臭化アルキル基が挙げられ、Ｒ１及びＲ２において上述したアルキル基から、少なくとも１つの水素原子がハロゲン原子に置き換えられたものが挙げられる。
【0056】
上述した中でも、Ｒ２０としては、炭素数１～５のアルキル基、又はアラルキル基が好ましい。Ｒ２０におけるアラルキル基としては、炭素数１～５のアルキレン基とフェニル基とが結合したものが好ましい。
Ｒ２１及びＲ２４としては、単結合又は－Ｏ－が好ましい。
Ｒ２２及びＲ２３としては、水素原子又はトリフルオロメチル基が好ましい。
Ｒ２１及びＲ２４としては、単結合又は－Ｏ－が好ましい。
Ｒ２２及びＲ２３としては、水素原子又はトリフルオロメチル基が好ましい。
【0057】
本実施形態のＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としては、下記式（３－１）又は（３－２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することが、特に好ましい。
【0058】
【化14】
【0059】
また、１実施形態において、本発明は、下記一般式（４）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有するＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤を提供する。
【0060】
【化15】
【0061】
［一般式（４）中、Ｒ３０及びＲ３１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、又はアラルキル基を表す。実線と点線の二重線部分は単結合又は二重結合を表す。］
【0062】
Ｒ３０及びＲ３１において、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、及びアラルキル基としては、Ｒ１２において上述したものと同様のものが挙げられる。
【0063】
上述した中でも、Ｒ３０及びＲ３１としては、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、水酸基が好ましい。
【0064】
本実施形態のＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としては、下記式（４－１）又は（４－２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することが、特に好ましい。
【0065】
【化16】
【0066】
また、１実施形態において、本発明は、下記一般式（５）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有するＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤を提供する。
【0067】
【化17】
【0068】
［一般式（５）中、Ｒ４０は、単結合又は２価の連結基を表す。Ｒ４１～Ｒ４３は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、又はアラルキル基を表す。］
【0069】
Ｒ４０における２価の連結基としては、Ｘにおいて上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ４１～Ｒ４３におけるハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、及びアラルキル基としては、Ｒ１２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ４１～Ｒ４３におけるハロゲン原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のチオアルキル基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基、及びアラルキル基としては、Ｒ１２において上述したものと同様のものが挙げられる。
【0070】
上述した中でも、Ｒ４０としては、アルキレン基が好ましい。Ｒ４０におけるアルキレン基としては、炭素数１～５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基から１個の水素原子を除いた基が好ましい。炭素数１～５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基としては、Ｒ１及びＲ２において上述したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ４１～Ｒ４３としては、水素原子、ハロゲン原子が好ましい。
Ｒ４１～Ｒ４３としては、水素原子、ハロゲン原子が好ましい。
【0071】
本実施形態のＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としては、下記式（５－１）又は（５－２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物を有効成分として含有することが、特に好ましい。
【0072】
【化18】
【0073】
本発明のＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤としては、上記化合物をフリー体の形態で用いてもよく、薬学的に許容される塩の形態で用いてもよい。また、フリー体の溶媒和物の形態で用いてもよく、塩の溶媒和物の形態で用いてもよい。
【0074】
塩としては、薬学的に許容される塩であれば特に制限されず、例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、燐酸塩、硝酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、酢酸塩、プロパン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、グルタル酸塩、アジピン酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩等が挙げられる。溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であれば特に制限されず、例えば、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。
【0075】
［ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防用又は治療用組成物］
１実施形態において、本発明は、上記のＧＭ１ガングリオシドーシスの予防剤又は治療剤、及び薬学的に許容される担体を含有する、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防用又は治療用組成物を提供する。
１実施形態において、本発明は、上記のＧＭ１ガングリオシドーシスの予防剤又は治療剤、及び薬学的に許容される担体を含有する、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防用又は治療用組成物を提供する。
【0076】
本実施形態のＧＭ１ガングリオシドーシスの予防用又は治療用組成物は、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態で非経口的に投与することができる。
【0077】
薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体は、１種を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【0078】
本実施形態のＧＭ１ガングリオシドーシスの予防用又は治療用組成物は、更に添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。
添加剤は、１種を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
添加剤は、１種を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【0079】
（投与方法）
ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防剤又は治療剤、又はＧＭ１ガングリオシドーシスの予防用又は治療用組成物の投与方法は特に限定されず、患者の症状、体重、年齢、性別等に応じて適宜決定すればよい。例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等は経口投与される。また、注射剤は、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて、動脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内投与される。坐剤は直腸内投与される。皮膚外用剤は、患部に塗布、貼付又はスプレーされる。
ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防剤又は治療剤、又はＧＭ１ガングリオシドーシスの予防用又は治療用組成物の投与方法は特に限定されず、患者の症状、体重、年齢、性別等に応じて適宜決定すればよい。例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等は経口投与される。また、注射剤は、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて、動脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内投与される。坐剤は直腸内投与される。皮膚外用剤は、患部に塗布、貼付又はスプレーされる。
【0080】
（投与量）
ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防剤又は治療剤、又はＧＭ１ガングリオシドーシスの予防用又は治療用組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、例えば１日あたり１μｇ～１０ｇ、例えば１日あたり０．０１～２０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、注射剤の場合には、例えば１日あたり０．１μｇ～１ｇ、例えば１日あたり０．００１～２００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、坐剤の場合には、例えば１日あたり１μｇ～１０ｇ、例えば１日あたり０．０１～２０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、皮膚外用剤の場合には、例えば１日あたり１μｇ～１０ｇ、例えば１日あたり０．０１～２０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。
ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防剤又は治療剤、又はＧＭ１ガングリオシドーシスの予防用又は治療用組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、例えば１日あたり１μｇ～１０ｇ、例えば１日あたり０．０１～２０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、注射剤の場合には、例えば１日あたり０．１μｇ～１ｇ、例えば１日あたり０．００１～２００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、坐剤の場合には、例えば１日あたり１μｇ～１０ｇ、例えば１日あたり０．０１～２０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、皮膚外用剤の場合には、例えば１日あたり１μｇ～１０ｇ、例えば１日あたり０．０１～２０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。
【0081】
［その他の実施形態］
一実施形態において、本発明は、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防又は治療のための、Amodiaquine（アモジアキン）、Acacetin（アカセチン）、Sulfamerazine（スルファメラジン）、Ungerine（ウンゲリン）、Amiodarone（アミオダロン）、Sertindole（セルチンドール）、Delcorine（デルコリン）、Perphenazine（ペルフェナジン）、Althiazide（アルチアジド）、Diethylstilbestrol（ジエチルスチルベストロール）、Thiethylperazine（チエチルペラジン）、Harmol（ハルモール）、Skimmianine（スキムミアニン）、Succinylsulfathiazole（スクシニルサルファチアゾール）、Fillalbin（フィラルビン）、Canavanine（カナバニン）、Harmaline（ハルマリン）、Trihexyphenidyl（トリヘキシフェニジル）、Fluoxetine（フルオキセチン）、Lovastatin（ロバスタチン）、Haloperidol（ハロペリドール）、Prenylamine lactate（プレニルアミン乳酸）、Bromperidol（ブロムペリドール）、Convolamine（コンボルバミン）、Miglustat（ミグルスタット）、及び前記一般式（１）～（５）で表される化合物からなる群から選ばれる化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を提供する。
一実施形態において、本発明は、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防又は治療のための、Amodiaquine（アモジアキン）、Acacetin（アカセチン）、Sulfamerazine（スルファメラジン）、Ungerine（ウンゲリン）、Amiodarone（アミオダロン）、Sertindole（セルチンドール）、Delcorine（デルコリン）、Perphenazine（ペルフェナジン）、Althiazide（アルチアジド）、Diethylstilbestrol（ジエチルスチルベストロール）、Thiethylperazine（チエチルペラジン）、Harmol（ハルモール）、Skimmianine（スキムミアニン）、Succinylsulfathiazole（スクシニルサルファチアゾール）、Fillalbin（フィラルビン）、Canavanine（カナバニン）、Harmaline（ハルマリン）、Trihexyphenidyl（トリヘキシフェニジル）、Fluoxetine（フルオキセチン）、Lovastatin（ロバスタチン）、Haloperidol（ハロペリドール）、Prenylamine lactate（プレニルアミン乳酸）、Bromperidol（ブロムペリドール）、Convolamine（コンボルバミン）、Miglustat（ミグルスタット）、及び前記一般式（１）～（５）で表される化合物からなる群から選ばれる化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を提供する。
【0082】
一実施形態において、本発明は、Amodiaquine（アモジアキン）、Acacetin（アカセチン）、Sulfamerazine（スルファメラジン）、Ungerine（ウンゲリン）、Amiodarone（アミオダロン）、Sertindole（セルチンドール）、Delcorine（デルコリン）、Perphenazine（ペルフェナジン）、Althiazide（アルチアジド）、Diethylstilbestrol（ジエチルスチルベストロール）、Thiethylperazine（チエチルペラジン）、Harmol（ハルモール）、Skimmianine（スキムミアニン）、Succinylsulfathiazole（スクシニルサルファチアゾール）、Fillalbin（フィラルビン）、Canavanine（カナバニン）、Harmaline（ハルマリン）、Trihexyphenidyl（トリヘキシフェニジル）、Fluoxetine（フルオキセチン）、Lovastatin（ロバスタチン）、Haloperidol（ハロペリドール）、Prenylamine lactate（プレニルアミン乳酸）、Bromperidol（ブロムペリドール）、Convolamine（コンボルバミン）、Miglustat（ミグルスタット）、及び前記一般式（１）～（５）で表される化合物からなる群から選ばれる化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物の有効量を、予防又は治療を必要とする患者に投与することを含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防又は治療方法を提供する。
【0083】
一実施形態において、本発明は、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防剤又は治療剤、又はＧＭ１ガングリオシドーシスの予防用又は治療用組成物を製造するためのAmodiaquine（アモジアキン）、Acacetin（アカセチン）、Sulfamerazine（スルファメラジン）、Ungerine（ウンゲリン）、Amiodarone（アミオダロン）、Sertindole（セルチンドール）、Delcorine（デルコリン）、Perphenazine（ペルフェナジン）、Althiazide（アルチアジド）、Diethylstilbestrol（ジエチルスチルベストロール）、Thiethylperazine（チエチルペラジン）、Harmol（ハルモール）、Skimmianine（スキムミアニン）、Succinylsulfathiazole（スクシニルサルファチアゾール）、Fillalbin（フィラルビン）、Canavanine（カナバニン）、Harmaline（ハルマリン）、Trihexyphenidyl（トリヘキシフェニジル）、Fluoxetine（フルオキセチン）、Lovastatin（ロバスタチン）、Haloperidol（ハロペリドール）、Prenylamine lactate（プレニルアミン乳酸）、Bromperidol（ブロムペリドール）、Convolamine（コンボルバミン）、Miglustat（ミグルスタット）、及び前記一般式（１）～（５）で表される化合物からなる群から選ばれる化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物の使用を提供する。
【実施例】
【0084】
以下、実験例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
【0085】
［実験例１］
［皮膚由来線維芽細胞の樹立］
倫理委員会に承認されたプロトコールにより、インフォームドコンセントの下、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者及び健常者の皮膚生検の外植片から線維芽細胞を樹立した。
患者及び健常者からの皮膚試料を細かく刻み、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ培地で培養した。線維芽細胞が出現したことを確認した後、初期化遺伝子を導入するために線維芽細胞を増殖させた。
［皮膚由来線維芽細胞の樹立］
倫理委員会に承認されたプロトコールにより、インフォームドコンセントの下、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者及び健常者の皮膚生検の外植片から線維芽細胞を樹立した。
患者及び健常者からの皮膚試料を細かく刻み、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ培地で培養した。線維芽細胞が出現したことを確認した後、初期化遺伝子を導入するために線維芽細胞を増殖させた。
【0086】
［iPS細胞の樹立及び維持］
N. Fusaki, H. Ban, A. Nishiyama, K. Saeki, M. Hasegawa, Proc. Jpn. Acad. Ser., B. Phys. Biol. Eci., 85, 348 (2009)に記載される方法により、樹立したヒト由来線維芽細胞からｉＰＳ細胞を樹立した。
具体的には、感染１日前に、６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たり５×１０５個のヒト線維芽細胞を播種し、その後、Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、K1f4遺伝子、及びc-Myc遺伝子を含むセンダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターを、ＭＯＩ(multiplicity of infection)３にて、細胞に感染させた。Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、K1f4遺伝子、及びc-Myc遺伝子を含むＳｅＶベクターについては、N. Fusaki, H. Ban, A. Nishiyama, K. Saeki, M. Hasegawa, Proc. Jpn. Acad. Ser., B. Phys. Biol. Eci., 85, 348 (2009)に記載される方法に従い作製した。感染７日後、感染させた線維芽細胞を、トリプシンを用いて回収し、６０ｍｍのシャーレ当たり５．４×１０４個の細胞、又は１００ｍｍのシャーレ当たり１～２×１０５個の細胞をＭＭＣ処理したＭＥＦフィーダー細胞上に播種した。翌日、ヒトｉＰＳ細胞培地に置き換え、感染３０日後まで培養を継続し、コロニーを回収した。
N. Fusaki, H. Ban, A. Nishiyama, K. Saeki, M. Hasegawa, Proc. Jpn. Acad. Ser., B. Phys. Biol. Eci., 85, 348 (2009)に記載される方法により、樹立したヒト由来線維芽細胞からｉＰＳ細胞を樹立した。
具体的には、感染１日前に、６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たり５×１０５個のヒト線維芽細胞を播種し、その後、Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、K1f4遺伝子、及びc-Myc遺伝子を含むセンダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターを、ＭＯＩ(multiplicity of infection)３にて、細胞に感染させた。Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、K1f4遺伝子、及びc-Myc遺伝子を含むＳｅＶベクターについては、N. Fusaki, H. Ban, A. Nishiyama, K. Saeki, M. Hasegawa, Proc. Jpn. Acad. Ser., B. Phys. Biol. Eci., 85, 348 (2009)に記載される方法に従い作製した。感染７日後、感染させた線維芽細胞を、トリプシンを用いて回収し、６０ｍｍのシャーレ当たり５．４×１０４個の細胞、又は１００ｍｍのシャーレ当たり１～２×１０５個の細胞をＭＭＣ処理したＭＥＦフィーダー細胞上に播種した。翌日、ヒトｉＰＳ細胞培地に置き換え、感染３０日後まで培養を継続し、コロニーを回収した。
【0087】
２０％のＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清置換物（ＫＳＲ，インビトロゲン）、２ｍＭのＬ-グルタミン、１×１０－４Ｍの非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ，シグマ）、１×１０－４Ｍの２－メルカプトエタノール（シグマ）、０．５％のペニシリンとストレプトマイシン（日本，ナカライテスク）、及び５ｎｇ／ｍＬの基本線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ，和光，日本）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（シグマ）を含有するヒトｉＰＳ培地を用いて、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）処理したＭＥＦフィーダー細胞上で、ヒトｉＰＳ細胞を維持した。
【0088】
［神経幹細胞（Neural Stem Cell:NSC）への分化］
分化誘導開始の前日に、Geltrex(Thermo Fisher Scientific)をコーティングした６穴プレートに、ヒトｉＰＳ細胞を２．５×１０５～３×１０５個/ウェルの密度で播種し、ヒトｉＰＳ培地で培養した。翌日（誘導開始日：Day 0）、ヒトｉＰＳ培地を除去して、PSC Neural Induction Medium(Thermo Fisher Scientific）に入れ替えた。引き続き、２日に１回の頻度で、PSC Neural Induction Mediumにて培地交換を行いながら、培養開始後７日目(Day 7)まで培養を行い、ＮＳＣを誘導した。誘導されたＮＳＣは、培地を除き、StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent(Thermo Fisher Scientific）を用いて細胞をはがし、Neural Expansion Medium(Thermo Fisher Scientific)に細胞を懸濁後、Geltrexにてコーティングした100mm細胞培養用シャーレへ播種した。この時点の細胞をP0NSC（継代数ゼロのNSC）とし、以後、適宜この培地にてNSCを増やし、実験に使用した。
分化誘導開始の前日に、Geltrex(Thermo Fisher Scientific)をコーティングした６穴プレートに、ヒトｉＰＳ細胞を２．５×１０５～３×１０５個/ウェルの密度で播種し、ヒトｉＰＳ培地で培養した。翌日（誘導開始日：Day 0）、ヒトｉＰＳ培地を除去して、PSC Neural Induction Medium(Thermo Fisher Scientific）に入れ替えた。引き続き、２日に１回の頻度で、PSC Neural Induction Mediumにて培地交換を行いながら、培養開始後７日目(Day 7)まで培養を行い、ＮＳＣを誘導した。誘導されたＮＳＣは、培地を除き、StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent(Thermo Fisher Scientific）を用いて細胞をはがし、Neural Expansion Medium(Thermo Fisher Scientific)に細胞を懸濁後、Geltrexにてコーティングした100mm細胞培養用シャーレへ播種した。この時点の細胞をP0NSC（継代数ゼロのNSC）とし、以後、適宜この培地にてNSCを増やし、実験に使用した。
【0089】
［実験例２］
＜FITC-CTBを用いたＧＭ１蓄積の可視化＞
健常者およびＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来ｉＰＳ細胞から誘導した神経幹細胞を、４％パラホルムアルデヒドにて固定後、０．１％ TritonX-100/PBSにて透過処理し、１％ ＢＳＡ溶液にてブロッキングを行った。その後、FITC-CTB（ＧＭ１ガングリオシドを特異的に染色する試薬）と抗Nestin抗体（神経幹細胞に特異的に発現している分子：神経幹細胞のマーカー）を用いて、多重染色を行った。図１に結果を示す。
Nestin染色においては、健常者、ＧＭ患者、いずれのNSCにおいても強い染色が認められ、神経幹細胞への分化が確認された（図１，下段）。一方、FITC-CTBにおいては，健常者ではほとんど染色が認められなかったが、ＧＭ１患者においては，強い染色が認められた（図１，上段）。
これらの結果から、ＧＭ１患者由来神経幹細胞では、ＧＭ１が蓄積していることが確認された。
＜FITC-CTBを用いたＧＭ１蓄積の可視化＞
健常者およびＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来ｉＰＳ細胞から誘導した神経幹細胞を、４％パラホルムアルデヒドにて固定後、０．１％ TritonX-100/PBSにて透過処理し、１％ ＢＳＡ溶液にてブロッキングを行った。その後、FITC-CTB（ＧＭ１ガングリオシドを特異的に染色する試薬）と抗Nestin抗体（神経幹細胞に特異的に発現している分子：神経幹細胞のマーカー）を用いて、多重染色を行った。図１に結果を示す。
Nestin染色においては、健常者、ＧＭ患者、いずれのNSCにおいても強い染色が認められ、神経幹細胞への分化が確認された（図１，下段）。一方、FITC-CTBにおいては，健常者ではほとんど染色が認められなかったが、ＧＭ１患者においては，強い染色が認められた（図１，上段）。
これらの結果から、ＧＭ１患者由来神経幹細胞では、ＧＭ１が蓄積していることが確認された。
【0090】
［実験例３］
＜イメージングサイトメーターを用いた薬剤スクリーニングによる化合物の評価＞
以下の要領で、ＧＭ１ガングリオシドーシス治療剤のスクリーニングを行った。
９６ウェルプレートをＧｅｌｔｒｅｘにてコーティング後、Ｎｅｕｒａｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁した、健常者およびＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来ｉＰＳ細胞から誘導した神経幹細胞を、５×１０４／ウェルの密度で播種した。その後、既知薬剤ライブラリーの化合物を、各々のウェルに最終濃度５μＭになるように添加し、72時間培養を行った。その後、４％パラホルムアルデヒドにて固定、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳにて透過処理、１％ ＢＳＡ溶液にてブロッキングを行い、ＦＩＴＣ－ＣＴＢ（ＧＭ１ガングリオシドを特異的に染色する試薬）、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（細胞の核を染色する試薬）、ＣｅｌｌＭａｓｋ（細胞膜を染色する試薬）を使い、蛍光染色した。
各ウェルの蛍光強度を、イメージングサイトメーター（IN Cell Analyzer 6000）を用いて画像を取得し、IN Cell Developer Toolbox プロトコールを用いて、細胞当たりのGM1ガングリオシド量を算出した。
表１に検討を行った化合物の結果を示す。
＜イメージングサイトメーターを用いた薬剤スクリーニングによる化合物の評価＞
以下の要領で、ＧＭ１ガングリオシドーシス治療剤のスクリーニングを行った。
９６ウェルプレートをＧｅｌｔｒｅｘにてコーティング後、Ｎｅｕｒａｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁した、健常者およびＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来ｉＰＳ細胞から誘導した神経幹細胞を、５×１０４／ウェルの密度で播種した。その後、既知薬剤ライブラリーの化合物を、各々のウェルに最終濃度５μＭになるように添加し、72時間培養を行った。その後、４％パラホルムアルデヒドにて固定、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳにて透過処理、１％ ＢＳＡ溶液にてブロッキングを行い、ＦＩＴＣ－ＣＴＢ（ＧＭ１ガングリオシドを特異的に染色する試薬）、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（細胞の核を染色する試薬）、ＣｅｌｌＭａｓｋ（細胞膜を染色する試薬）を使い、蛍光染色した。
各ウェルの蛍光強度を、イメージングサイトメーター（IN Cell Analyzer 6000）を用いて画像を取得し、IN Cell Developer Toolbox プロトコールを用いて、細胞当たりのGM1ガングリオシド量を算出した。
表１に検討を行った化合物の結果を示す。
【0091】
【表1】
【0092】
検討を行った化合物のうち、ＧＭ１抑制化合物としてヒットしたいくつかの化合物における薬剤処理後の神経幹細胞の染色像を、図２、図３に示す。
ヒットした化合物においては，薬剤を添加していない例（図２ｂ・下段，図３ｅ・下段）と比較して、ＣＴＢの蛍光が低下しており、ＧＭ１の蓄積が抑制されていることが確認された（図２ｃならびにｄ，図３ｆからｇ、いずれも下段）。
ヒットした化合物においては，薬剤を添加していない例（図２ｂ・下段，図３ｅ・下段）と比較して、ＣＴＢの蛍光が低下しており、ＧＭ１の蓄積が抑制されていることが確認された（図２ｃならびにｄ，図３ｆからｇ、いずれも下段）。
【0093】
［実験例４］
＜ＧＭ１抑制化合物投与後のＧＭ１ガングリオシドーシスモデルマウスの脳における、ＧＭ１ガングリオシド量の変化＞
ＧＭ１ガングリオシドーシスモデルマウス（ＢＫＯマウス：β-Galactosidaseの完全欠損マウス, β－Ｇａｌ（－／－）へ、出生後P9からP15の6日間、Amodiaquine (40mg/kg)、Thiethylperanzine (6mg/kg)を、１日２回、腹腔内に投与した。なお、陽性対象として、薬液にＰＢＳを用い、同様の操作を行った。また、陰性対象として、薬液にＰＢＳ、マウスとしてβ－Ｇａｌ（＋/－）のものを用いて、同様の操作を行った。その後、マウス脳をOCTコンパウンドにて包埋し、５μｍの厚さで切片を作製した。切片は４％パラホルムアルデヒドにて固定後、１％ ＢＳＡ溶液にてブロッキングを行い、Alexa Fluor488-CTB、Hoechst 33342にて蛍光染色を行った。また、マウス脳を、Svennerholm and Fredmanの抽出法に基づいてスフィンゴ脂質を分画・精製し、試料とし、これらの試料をAgilent6460 Triple Quadrupole LC/MSにて解析し、脳内ＧＭ１を定量した。蛍光染色の結果を図４に示す。
＜ＧＭ１抑制化合物投与後のＧＭ１ガングリオシドーシスモデルマウスの脳における、ＧＭ１ガングリオシド量の変化＞
ＧＭ１ガングリオシドーシスモデルマウス（ＢＫＯマウス：β-Galactosidaseの完全欠損マウス, β－Ｇａｌ（－／－）へ、出生後P9からP15の6日間、Amodiaquine (40mg/kg)、Thiethylperanzine (6mg/kg)を、１日２回、腹腔内に投与した。なお、陽性対象として、薬液にＰＢＳを用い、同様の操作を行った。また、陰性対象として、薬液にＰＢＳ、マウスとしてβ－Ｇａｌ（＋/－）のものを用いて、同様の操作を行った。その後、マウス脳をOCTコンパウンドにて包埋し、５μｍの厚さで切片を作製した。切片は４％パラホルムアルデヒドにて固定後、１％ ＢＳＡ溶液にてブロッキングを行い、Alexa Fluor488-CTB、Hoechst 33342にて蛍光染色を行った。また、マウス脳を、Svennerholm and Fredmanの抽出法に基づいてスフィンゴ脂質を分画・精製し、試料とし、これらの試料をAgilent6460 Triple Quadrupole LC/MSにて解析し、脳内ＧＭ１を定量した。蛍光染色の結果を図４に示す。
【0094】
陰性対象では、CTBの蛍光がほとんど見られなかった（図４ａ・上段）。一方、陽性対象では、CTBの蛍光が強く、GM1の蓄積が確認された（図４ｂ・上段）。一方で、ＧＭ１抑制化合物による処理を行ったいずれにおいても、CTBの蛍光は強く抑制されており、ＧＭ１の蓄積が抑制されていることが確認された（図４c，d，いずれも上段）。ＧＭ１の定量結果を図５に示す。
【0095】
陰性対象と比較して、陽性対象では、ＧＭ１ガングリオシド量の増加が確認された。一方，薬液処理したいずれにおいても、陽性対象と比べて、ＧＭ１ガングリオシド量が低下していることが確認された。
【0096】
［実験例５］
＜ＧＭ１抑制化合物添加によるオートファジーへの影響＞
ガングリオシドの合成及び分解過程を図６に示す。GM1、GM2、GM3の各ガングリオシドは、単糖及びN-アセチルノイラミン酸の連続的付加により生成される。また、ガングリオシドの分解は、ライソゾーム中のグリコシダーゼが段階的に作用することにより行われる。図６における（１）～（７）は、各反応において作用する酵素を示している。
図７は、NEU1 及びβ-GLUの発現が候補化合物による処理により増加することを示している。正常(201B7)及び疾患由来 (A138 #1-3)のiPS細胞から分化して得られた神経幹細胞をウェルに播種し、 Amodiaquine又はThiethylperanzineを5μMになるようにそれぞれ添加し、72時間培養を行った。培養後、RNAを単離し、各酵素遺伝子の発現量の解析を行った。図７中、－は、無添加サンプルを示し、amoは、Amodiaquine添加サンプルを示し、thieは、Thiethylperanzine添加サンプルを示す。
本結果により、ＧＭ１抑制化合物の作用により、ライソゾーム中におけるガングリオシドの分解を促進し、オートファジーを活性化させることが示唆された。
＜ＧＭ１抑制化合物添加によるオートファジーへの影響＞
ガングリオシドの合成及び分解過程を図６に示す。GM1、GM2、GM3の各ガングリオシドは、単糖及びN-アセチルノイラミン酸の連続的付加により生成される。また、ガングリオシドの分解は、ライソゾーム中のグリコシダーゼが段階的に作用することにより行われる。図６における（１）～（７）は、各反応において作用する酵素を示している。
図７は、NEU1 及びβ-GLUの発現が候補化合物による処理により増加することを示している。正常(201B7)及び疾患由来 (A138 #1-3)のiPS細胞から分化して得られた神経幹細胞をウェルに播種し、 Amodiaquine又はThiethylperanzineを5μMになるようにそれぞれ添加し、72時間培養を行った。培養後、RNAを単離し、各酵素遺伝子の発現量の解析を行った。図７中、－は、無添加サンプルを示し、amoは、Amodiaquine添加サンプルを示し、thieは、Thiethylperanzine添加サンプルを示す。
本結果により、ＧＭ１抑制化合物の作用により、ライソゾーム中におけるガングリオシドの分解を促進し、オートファジーを活性化させることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【0097】
本発明により、新たなＧＭ１ガングリオシドーシス予防剤又は治療剤を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】