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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-29
(45)【発行日】2024-11-07
(54)【発明の名称】組織再生能が高い軟骨細胞培養物
(51)【国際特許分類】
C12N 5/077 20100101AFI20241030BHJP
A61K 35/32 20150101ALI20241030BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20241030BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20241030BHJP
C12N 5/074 20100101ALN20241030BHJP
C12N 5/0775 20100101ALN20241030BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20241030BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20241030BHJP
【ＦＩ】
C12N5/077 ZNA
A61K35/32
A61L27/38 112
A61L27/38 300
A61P19/02
C12N5/074
C12N5/0775
C12N15/11 Z
C12N15/12
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2021513690
(86)(22)【出願日】2020-04-08
(86)【国際出願番号】 JP2020015896
(87)【国際公開番号】W WO2020209316
(87)【国際公開日】2020-10-15
【審査請求日】2023-03-30
(31)【優先権主張番号】P 2019073783
(32)【優先日】2019-04-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】512083551
【氏名又は名称】有限会社ジーエヌコーポレーション
(73)【特許権者】
【識別番号】518332181
【氏名又は名称】株式会社ＪＢＭ
(74)【代理人】
【識別番号】100102842
【弁理士】
【氏名又は名称】葛和 清司
(72)【発明者】
【氏名】加藤 正二郎
(72)【発明者】
【氏名】アブラハム サミュエル ジェイケー
(72)【発明者】
【氏名】窪田 倭
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】特表２００９－５０８５９６（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／０７７
Ａ６１Ｋ ３５／３２
Ａ６１Ｌ ２７／３８
Ａ６１Ｐ １９／０２
Ｃ１２Ｎ ５／０７４
Ｃ１２Ｎ ５／０７７５
Ｃ１２Ｎ １５／１１
Ｃ１２Ｎ １５／１２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＯＸ９、ＣＯＬ２Ａ１、ｍｉＲ１４０およびｍｉＲ２１－５ｐから選択される１以上の遺伝子の発現能が高められた軟骨細胞培養物を製造する方法であって、軟骨組織から分離された細胞集団を、熱可逆性ポリマーを含む培地で培養するステップを含み、
熱可逆性ポリマーが、曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなるものであり、
曇点を有するブロックが、ポリプロピレンオキサイド、プロピレンオキサイドと他のアルキレンオキサイドとの共重合体、ポリＮ－置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ－置換メタアクリルアミド誘導体、Ｎ－置換アクリルアミド誘導体とＮ－置換メタアクリルアミド誘導体との共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコ一ル部分酢化物からなる群より選ばれ、
親水性のブロックが、メチルセルロース、デキストラン、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリＮ－ビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリＮ－メチルアクリルアミド、ポリヒドロキシメチルアクリレー卜、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸およびそれらの塩、ポリＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレー卜、ポリＮ，Ｎ－ジエチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩からなる群から選択され、
熱可逆性ポリマーの分子量は、３万以上３，０００万以下であり、
培地における熱可逆性ポリマーの濃度が、１０％～２０％であり、
製造された軟骨細胞培養物が、前記熱可逆性ポリマーを含む培地で培養するステップを含まない方法により培養された軟骨細胞培養物と比べて、ＳＯＸ９、ＣＯＬ２Ａ１、ｍｉＲ１４０およびｍｉＲ２１－５ｐから選択される１以上の遺伝子の発現能が高められている、
前記方法。
【請求項2】
製造された軟骨細胞培養物が、熱可逆性ポリマーを含む培地で培養するステップを含まない方法により培養された軟骨細胞培養物と比べて、ｍｉＲＮＡが軟骨細胞培養物中に保持されている、製造された軟骨細胞培養物が、熱可逆性ポリマーを含む培地で培養するステップを含まない方法により培養された軟骨細胞培養物と比べて、軟骨細胞培養物中の幹細胞の含有量が維持または増殖されている、および／または
製造された軟骨細胞培養物が、熱可逆性ポリマーを含む培地で培養するステップを含まない方法により培養された軟骨細胞培養物と比べて、軟骨細胞培養物中のヒアルロン酸の分泌能が増大されている、
請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ１４０である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
幹細胞が、（ｉ）多能性幹細胞、または
（ｉｉ）分化誘導状態に置かれた場合に、別種の細胞に変化することができる能力を有する軟骨前駆細胞または間葉系幹細胞
である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項5】
幹細胞の含有量が、軟骨細胞培養物中の１－２フコースまたはα２－６シアル酸の含有量を測定することにより定量される、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
軟骨組織が、５０歳以上の変形性関節症の対象に由来する、請求項１～５に記載の方法。
【請求項7】
熱可逆性ポリマーを含む培地が、血清以外の成長因子が添加されていない、請求項１～６に記載の方法。
【請求項8】
請求項１～７に記載の方法によって製造された、ＳＯＸ９、ＣＯＬ２Ａ１、ｍｉＲ１４０およびｍｉＲ２１－５ｐから選択される１以上の遺伝子の発現能が高められた軟骨細胞培養物。
【請求項9】
請求項８に記載の軟骨細胞培養物を含む、医薬組成物。
【請求項10】
変形性関節症の治療に用いられるための、請求項９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、軟骨細胞培養物を製造する方法、当該方法によって製造された軟骨細胞培養物、軟骨細胞培養物を使用した治療方法に関する。
【背景技術】
【0002】
変形性関節症は、関節組織の進行性の軟骨損傷を特徴とし、加齢、関節損傷、肥満を含む様々な因子により引き起こされ、特に高齢者における関節能力の喪失や硬化の原因となる。
【0003】
関節軟骨組織は、骨端の関節面に存在する薄い硝子軟骨からなる。硝子軟骨は、ヒアルロン酸-アグリカンネットワークおよびＩＩ型コラーゲン線維等との相互作用により高次構造を形成した軟骨細胞外マトリックス（ＥＣＭ）により軟骨細胞の細胞間隙が充填された組織構造を持つ。ＯＡにおける軟骨組織の損傷過程には、かかるＥＣＭの分解が大きく関与する。
【0004】
軟骨組織が損傷するとＥＣＭ中のＩＩ型コラーゲン線維が破壊され、これによりヒアルロン酸やアグリカンの遊出を引き起こす。遊出したヒアルロン酸やアグリカンは、軟骨細胞のアポトーシスや、炎症性サイトカインであるインターロイキン－１の産生を引き起こし、これによりＭＭＰ、ＡＤＡＭＴＳおよびＨＹＢＩＤといったＥＣＭ分解酵素の産生および分泌が促され、さらに軟骨組織中のＥＣＭの分解が加速する。
【0005】
このようにＥＣＭが分解された軟骨組織の弾性は、著しく低下し脆くなるため軽い負荷でも容易に損傷するという悪循環をきたす。また関節組織は、通常の組織と異なり、血液供給がなく拡散によって軟骨組織内外と物質交換をしており、細胞の流入もないことから、変形性関節症のように組織の恒常性が一旦破壊されると、その変性状態が維持されるため修復困難となる（非特許文献１、２）。
【0006】
このような変形性関節症の治療として、関節軟骨の非荷重部から採取された健全な軟骨組織に由来する軟骨細胞を利用した自家培養軟骨細胞移植(Autologous Chondrocyte Implantation;ＡＣＩ)や、マトリックス誘導性自家培養軟骨細胞移植(Matrix-Induced Autologous Chondrocyte Implantation;ＭＡＣＩ)が行なわれてきた。かかる移植は、外傷性膝軟骨損傷のように移植部位の周囲に健全な軟骨組織が存在していれば有効であるが、変形性関節症のように軟骨組織の恒常性が破壊された変性部位に施しても、一時的な改善は見られるものの、すぐに移植片中の軟骨細胞がアポトーシスによって死滅したり、繊維軟骨が形成され、十分な治療効果は得られていない（非特許文献３）。
このように変形性関節症の治療において、軟骨組織の変性状態を正常化し、長期間修復、維持可能な治療が求められている。
このように変形性関節症の治療において、軟骨組織の変性状態を正常化し、長期間修復、維持可能な治療が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【文献】Chen et al.,Bone Res. 2017 Jan 17;5:16044. doi: 10.1038/boneres.2016.44. eCollection 2017.
【文献】Zhang et al., Bone Research volume4, Article number: 15040,2016
【文献】Niemeyera.et al. The Knee, Volume 23, Issue 3, June 2016, Pages 426-435
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
組織再生能が高い軟骨細胞培養物を製造する方法、当該方法によって製造された軟骨細胞培養物、軟骨細胞培養物を使用した治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
すなわち、本発明に下記に掲げるものに関する：
［１］ 組織再生能が高い軟骨細胞培養物を製造する方法であって、軟骨組織から分離された細胞集団を熱可逆性ポリマーで培養するステップを含む、前記方法。
［２］ 組織再生能が、軟骨細胞培養物のＳＯＸ９、ＣＯＬ２Ａ１、ｍｉＲ１４０およびｍｉＲ２１から選択される１以上の遺伝子の発現能、ｍｉＲＮＡの保持能力、幹細胞の含有量、またはヒアルロン酸の分泌能である、［１］に記載の方法。
［３］ ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ１４０である、［２］に記載の方法。
［４］ 幹細胞が、多能性幹細胞または分化ポテンシャルが高い体性幹細胞である、［２］または［３］に記載の方法。
［５］ 幹細胞の含有量が、軟骨細胞培養物中の１－２フコースまたはα２－６シアル酸の含有量である、［２］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］ 軟骨組織が、５０歳以上の変形性関節症の対象に由来する、［１］～［５］に記載の方法。
［７］ 熱可逆性ポリマーが、血清以外の成長因子が添加されていない熱可逆性ポリマーである、［１］～［６］に記載の方法。
［８］ ［１］～［７］に記載の方法によって製造された軟骨細胞培養物。
［９］ ［８］に記載の軟骨細胞培養物の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む、対象における疾患を治療する方法。
［１０］ 疾患が、変形性関節症である［９］に記載の治療方法。
［１］ 組織再生能が高い軟骨細胞培養物を製造する方法であって、軟骨組織から分離された細胞集団を熱可逆性ポリマーで培養するステップを含む、前記方法。
［２］ 組織再生能が、軟骨細胞培養物のＳＯＸ９、ＣＯＬ２Ａ１、ｍｉＲ１４０およびｍｉＲ２１から選択される１以上の遺伝子の発現能、ｍｉＲＮＡの保持能力、幹細胞の含有量、またはヒアルロン酸の分泌能である、［１］に記載の方法。
［３］ ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ１４０である、［２］に記載の方法。
［４］ 幹細胞が、多能性幹細胞または分化ポテンシャルが高い体性幹細胞である、［２］または［３］に記載の方法。
［５］ 幹細胞の含有量が、軟骨細胞培養物中の１－２フコースまたはα２－６シアル酸の含有量である、［２］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］ 軟骨組織が、５０歳以上の変形性関節症の対象に由来する、［１］～［５］に記載の方法。
［７］ 熱可逆性ポリマーが、血清以外の成長因子が添加されていない熱可逆性ポリマーである、［１］～［６］に記載の方法。
［８］ ［１］～［７］に記載の方法によって製造された軟骨細胞培養物。
［９］ ［８］に記載の軟骨細胞培養物の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む、対象における疾患を治療する方法。
［１０］ 疾患が、変形性関節症である［９］に記載の治療方法。
【0010】
［１］ 損傷した軟骨組織を修復するためのＴＧＰ含有組成物。
［２］ 損傷した軟骨組織が、変形性関節症により損傷した軟骨組織である、［１］に記載の組成物。
［３］ 修復が、損傷した軟骨組織の変性状態の正常化である、［１］または［２］に記載の組成物。
［４］ 修復が、軟骨細胞の増殖、ヒアルロン産の分泌促進または保持、ｍｉＲ１４０の分泌促進、ＣＤ４４陽性細胞の増加、および、間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）の増殖からなる群から選択される１以上の指標により表わされる、［１］～［３］のいずれか一項に記載の組成物。
［５］ 修復が、in vitroまたはin vivoで行なわれる、［１］～［４］のいずれか一項に記載の組成物。
［６］ 軟骨細胞、軟骨前駆細胞またはＭＳＣｓ、軟骨細胞培養物および軟骨組織からなる群から選択される１以上の組織または細胞を含む、［１］～［５］のいずれか一項に記載の組成物。
［７］ 軟骨細胞または軟骨組織が、自家細胞または自家組織である、［１］～［６］のいずれか一項に記載の組成物。
［８］ 高齢者の軟骨組織に由来する細胞をＴＧＰ含有組成物中で培養するステップを含む、軟骨細胞培養物および培養分泌物の製造方法。
［９］
軟骨組織が、変形性膝軟骨関節症により損傷した軟骨組織である、［８］に記載の方法。
［１０］ さらに軟骨細胞培養物と培養分泌物とを分離するステップを含む、［８］または［９］に記載の方法。
［２］ 損傷した軟骨組織が、変形性関節症により損傷した軟骨組織である、［１］に記載の組成物。
［３］ 修復が、損傷した軟骨組織の変性状態の正常化である、［１］または［２］に記載の組成物。
［４］ 修復が、軟骨細胞の増殖、ヒアルロン産の分泌促進または保持、ｍｉＲ１４０の分泌促進、ＣＤ４４陽性細胞の増加、および、間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）の増殖からなる群から選択される１以上の指標により表わされる、［１］～［３］のいずれか一項に記載の組成物。
［５］ 修復が、in vitroまたはin vivoで行なわれる、［１］～［４］のいずれか一項に記載の組成物。
［６］ 軟骨細胞、軟骨前駆細胞またはＭＳＣｓ、軟骨細胞培養物および軟骨組織からなる群から選択される１以上の組織または細胞を含む、［１］～［５］のいずれか一項に記載の組成物。
［７］ 軟骨細胞または軟骨組織が、自家細胞または自家組織である、［１］～［６］のいずれか一項に記載の組成物。
［８］ 高齢者の軟骨組織に由来する細胞をＴＧＰ含有組成物中で培養するステップを含む、軟骨細胞培養物および培養分泌物の製造方法。
［９］
軟骨組織が、変形性膝軟骨関節症により損傷した軟骨組織である、［８］に記載の方法。
［１０］ さらに軟骨細胞培養物と培養分泌物とを分離するステップを含む、［８］または［９］に記載の方法。
【0011】
［１１］ 未分化細胞を増殖または維持させる方法であって、
軟骨組織から得られた細胞を含む細胞をＴＧＰ含有組成物で培養するステップを含む、前記方法。
［１２］ 未分化細胞が、軟骨細胞培養物中で増殖または維持される、［１１］に記載の方法。
［１３］ さらに未分化細胞を添加するステップを含む、［１１］または［１２］に記載の方法。
［１４］ 未分化細胞がＭＳＣである、［１１］～［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］ 軟骨組織が、変形性関節症により損傷した軟骨組織である、［１１］～［１４］のいずれか一項に記載の方法。
軟骨組織から得られた細胞を含む細胞をＴＧＰ含有組成物で培養するステップを含む、前記方法。
［１２］ 未分化細胞が、軟骨細胞培養物中で増殖または維持される、［１１］に記載の方法。
［１３］ さらに未分化細胞を添加するステップを含む、［１１］または［１２］に記載の方法。
［１４］ 未分化細胞がＭＳＣである、［１１］～［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］ 軟骨組織が、変形性関節症により損傷した軟骨組織である、［１１］～［１４］のいずれか一項に記載の方法。
【0012】
［１６］ ［１１］～［１５］のいずれか一項に記載の方法により製造された未分化細胞。
［１７］ 細胞から分泌された高分子成分の分解を防ぐためのＴＧＰ含有組成物。
［１８］ 細胞から分泌された高分子成分の製造方法であって、細胞をＴＧＰ含有組成物中で培養するステップを含む、前記方法。
［１９］ 細胞から分泌された高分子成分がヒアルロン酸である、［１７］または［１８］に記載の組成物または方法。
［２０］ 細胞が、ヒト細胞であり、ヒト細胞が、ヒト平滑筋細胞、ヒト軟骨細胞、ヒト繊維芽細胞、ヒト脂肪細胞、ヒト滑膜細胞からなる群から選択される1以上の細胞である、［１７］～［１９］のいずれか一項に記載の組成物または方法。
［１７］ 細胞から分泌された高分子成分の分解を防ぐためのＴＧＰ含有組成物。
［１８］ 細胞から分泌された高分子成分の製造方法であって、細胞をＴＧＰ含有組成物中で培養するステップを含む、前記方法。
［１９］ 細胞から分泌された高分子成分がヒアルロン酸である、［１７］または［１８］に記載の組成物または方法。
［２０］ 細胞が、ヒト細胞であり、ヒト細胞が、ヒト平滑筋細胞、ヒト軟骨細胞、ヒト繊維芽細胞、ヒト脂肪細胞、ヒト滑膜細胞からなる群から選択される1以上の細胞である、［１７］～［１９］のいずれか一項に記載の組成物または方法。
【発明の効果】
【0013】
本発明の方法によって製造された軟骨細胞培養物は、ＥＣＭに富むため生着性が高く、健全な軟骨の機能および組織構造を有するだけでなく、炎症、ＥＣＭの分解等を特徴とする軟骨組織の変性状態を正常化することが出来る。さらに、軟骨細胞培養物には軟骨再生に寄与する幹細胞が多く含まれている。したがって、変形性関節症のような変性状態の軟骨組織を長期わたって修復、維持する効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする
【0016】
本発明は、組織再生能が高い軟骨細胞培養物を製造する方法であって、軟骨組織から分離された細胞集団を熱可逆性ポリマーで培養するステップを含む。本開示における「軟骨組織」は、軟骨由来の組織を指す。軟骨は、限定されずに関節軟骨、骨端板、肋軟骨、気管軟骨、喉頭軟骨、仙腸関節、顎関節、胸鎖関節、椎間円板、恥骨結合、関節半月、関節円板、外耳道、耳管、耳介軟骨及び喉頭蓋軟骨等を含む。軟骨組織は、任意の生物に由来し得る。ヒトの損傷した軟骨へ骨組織培養物を移植した際に拒絶反応が少ないことからヒトの軟骨組織が好ましい。自家組織であっても他家組織であってもよいが、対象に適用した際に拒絶反応が少ないことから自家組織が好ましい。
【0017】
本発明に使用する軟骨組織は、軟骨組織が由来する対象の状態に関わらず、健全な軟骨組織と同様の組織構造を持つ軟骨細胞培養物を形成できる。したがって、いかなる状態の対象に由来する軟骨組織であってもよく、例えば、変形性関節症を有する対象から採取した関節軟骨であってもよい。かかる関節軟骨の採取部位は、体重の荷重部または非荷重部であってもよく、変形性関節症によって損傷した荷重部から採取した軟骨組織であってもよい。
【0018】
本発明によって製造される軟骨細胞培養物は、長期培養しても石灰化などの異常が生じないため、例えばグレード１の対象から採取し、グレード３以降に進行するまでの間培養し、製造された軟骨細胞培養物を対象へ移植することも可能である。したがって、採取する対象のＯＡグレードは、１～４のいずれでもよい。
【0019】
軟骨組織を採取する対象の年齢は、特に限定されない。本発明によって製造される軟骨細胞培養物は再生能が高いため、例えば０～３９歳、４０歳以上であっても、５０歳以上、６０歳以上、７０歳以上、８０歳以上、９０歳以上の対象に由来する軟骨組織であってもよい。
軟骨組織の採取方法は、当該技術分野において生体組織を採取する際に用いられる通常の方法であってよく、限定されずに、メス、ピンセット、バイオプシーパンチなどを用いて軟骨から採取することができる。
軟骨組織の採取方法は、当該技術分野において生体組織を採取する際に用いられる通常の方法であってよく、限定されずに、メス、ピンセット、バイオプシーパンチなどを用いて軟骨から採取することができる。
【0020】
本発明の方法における「軟骨組織から分離された細胞集団」は、軟骨組織の分離処理（例えば酵素処理、細切処理）によって得られた同一または異なる種類の細胞から構成される細胞集団を意味する。当該細胞集団は、軟骨組織に含まれている細胞集団であれば限定されずに、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）および多能性幹細胞などを含む。
【0021】
軟骨組織の分離処理としては、当該技術分野で生体組織の分離処理として通常に用いられている方法、例えば酵素的方法または物理的方法を用いることができる。酵素的方法としては、これに限定されないが、１種または２種以上の酵素を使用して軟骨組織を構成する細胞が生存可能な温度（例えば３７℃）でインキュベートすることである。酵素的な方法による分離処理は、軟骨組織から細胞を分離する際に当該技術分野において通常に用いられる酵素をそれに応じた温度、濃度および時間の処理条件で使用できる。
【0022】
酵素としては、軟骨組織が分離できれば限定されずに、ディスパーゼＩまたはＩＩ、コラゲナーゼＩまたはＩＩ、メタロプロテアーゼ、トリプシン、ヒアルロニダーゼ、ペプシン、アミノペプチダーゼ、リパーゼ、アミラーゼなどを用いることができる。軟骨組織を短時間に、かつ低侵襲で分解し得る観点から、好ましくは、酵素として、ディスパーゼＩまたはＩＩ、コラゲナーゼ、メタロプロテアーゼ、アクターゼまたはトリプシンのいずれかを単独で使用しても、２種以上組み合わせて使用してもよい。
【0023】
トリプシンを使用する場合、限定されずに、トリプシン－ＥＤＴＡの形態で０．０５％～２．５％、０．１％～１％、０．１５％～０．３％であってよく、低侵襲で分離できる観点から０．２～０．２５％が好ましい。トリプシン－ＥＤＴＡによる分離処理時間は、限定されず、１分～２時間、３分～１時間、１０分～４０分であってよく、幹細胞を損傷しない観点から、好ましくは３０分である。
コラゲナーゼＩＩを使用する場合、限定されずに、０．１～３０ｍｇ／ｍｌ、０．５～１０ｍｇ／ｍｌ、０．７５～５ｍｇ／ｍｌが好ましく、低侵襲で分離できる観点から０．８～２ｍｇ／ｍｌが特に好ましい。分離処理時間は、生細胞が死滅しない限りは限定されず、例えば１～２４時間、３～２０時間、７～１８時間、１０～１６時間であってよく、幹細胞を低侵襲で分離する観点から１２～１６時間が好ましい。
コラゲナーゼＩＩを使用する場合、限定されずに、０．１～３０ｍｇ／ｍｌ、０．５～１０ｍｇ／ｍｌ、０．７５～５ｍｇ／ｍｌが好ましく、低侵襲で分離できる観点から０．８～２ｍｇ／ｍｌが特に好ましい。分離処理時間は、生細胞が死滅しない限りは限定されず、例えば１～２４時間、３～２０時間、７～１８時間、１０～１６時間であってよく、幹細胞を低侵襲で分離する観点から１２～１６時間が好ましい。
【0024】
トリプシンとコラゲナーゼIIを組み合わせて使用する場合、限定されず、各濃度および処理時間を任意に組み合わせることができる。軟骨細胞の形質を維持しながら、幹細胞を低侵襲で分離する観点からトリプシン－ＥＤＴＡ（０．２５％溶液）で３７℃、３０分間の処理およびコラゲナーゼII液（１ｍｇ／ｍｌ）にて３７Ｃ°で１２～１６時間の組み合わせが好ましい。
【0025】
物理的方法としては、これに限定されないが、メス、超音波、ホモジナイザーあるいは濾し器等を使用して軟骨組織を細切または破砕する方法が挙げられる。物理的方法は上で詳述した酵素的方法と任意に組み合わせることができる。
分離された細胞は、フィルター、セルストレーナなど公知の任意の方法を使って、分離処理によって分離された細胞と、分離しきらない組織片またはマトリクス等とを分別してもよい。分別することにより、サイズまたは機能が統一された細胞集団が得られる。
分離された細胞は、フィルター、セルストレーナなど公知の任意の方法を使って、分離処理によって分離された細胞と、分離しきらない組織片またはマトリクス等とを分別してもよい。分別することにより、サイズまたは機能が統一された細胞集団が得られる。
【0026】
本発明の方法における、熱可逆性ポリマーは、（Thermoreversible Gelation Polymer：本明細書において「ＴＧＰ」ともいう）とは、架橋構造ないし網目構造を熱可逆的に生成し、該構造に基づき、その内部に水等の分離液体を保持するハイドロゲルを熱可逆的に形成可能な性質を有する高分子をいう。またハイドロゲルとは高分子からなる架橋ないし網目構造と該構造中に支持ないし保持された水を含むゲルをいう。本発明において、熱可逆性ポリマーは、熱可逆性ポリマー特有の架橋構造ないし網目構造によって、生体中の軟骨組織と類似した環境が形成されるため、熱可逆性ポリマーであればいかなるポリマーであっても、本発明の方法に用いることができる。
【0027】
（ゾル－ゲル転移温度）
本発明において「ゾル状態」、「ゲル状態」および「ゾル－ゲル転移温度の定義および測定は、文献（H. Yoshioka ら、Journal of Macromolecular Science, A31(1), 113 (19 94)）に記載された定義および方法に基づく。即ち、観測周波数１Ｈｚにおける試料の動的弾性率を低温側から高温側へ徐々に温度を変化（１℃／１分）させて測定し、該試料の貯蔵弾性率（Ｇ’、弾性項）が損失弾性率（Ｇ”、粘性項）を上回る点の温度をゾル－ゲル転移温度とする。一般に、Ｇ”＞Ｇ’の状態がゾルであり、Ｇ”＜Ｇ’の状態がゲルであると定義される。このゾル－ゲル転移温度の測定に際しては、下記の測定条件が好適に使用可能である。
本発明において「ゾル状態」、「ゲル状態」および「ゾル－ゲル転移温度の定義および測定は、文献（H. Yoshioka ら、Journal of Macromolecular Science, A31(1), 113 (19 94)）に記載された定義および方法に基づく。即ち、観測周波数１Ｈｚにおける試料の動的弾性率を低温側から高温側へ徐々に温度を変化（１℃／１分）させて測定し、該試料の貯蔵弾性率（Ｇ’、弾性項）が損失弾性率（Ｇ”、粘性項）を上回る点の温度をゾル－ゲル転移温度とする。一般に、Ｇ”＞Ｇ’の状態がゾルであり、Ｇ”＜Ｇ’の状態がゲルであると定義される。このゾル－ゲル転移温度の測定に際しては、下記の測定条件が好適に使用可能である。
【0028】
＜動的・損失弾性率の測定条件＞
測定機器（商品名）：ストレス制御式レオメーター ＡＲ５００、ＴＡインスツルメント社製
試料溶液（ないし分離液）の濃度（ただし「ゾル－ゲル転移温度を有するハイドロゲル形成性高分子」の濃度として）：１０（重量）％
試料溶液の量：約０．８ｇ
測定用セルの形状・寸法：アクリル製平行円盤（直径４．０ｃｍ）、ギャップ６００μｍ
測定周波数：１Ｈｚ
適用ストレス：線形領域内
測定機器（商品名）：ストレス制御式レオメーター ＡＲ５００、ＴＡインスツルメント社製
試料溶液（ないし分離液）の濃度（ただし「ゾル－ゲル転移温度を有するハイドロゲル形成性高分子」の濃度として）：１０（重量）％
試料溶液の量：約０．８ｇ
測定用セルの形状・寸法：アクリル製平行円盤（直径４．０ｃｍ）、ギャップ６００μｍ
測定周波数：１Ｈｚ
適用ストレス：線形領域内
【0029】
本発明においては、上記ゾル－ゲル転移温度は０℃より高く、３７℃以下であることが好ましく、更には、５℃より高く３５℃以下（特に１０℃以上３３℃以下である）ことが好ましい。このような好適なゾル－ゲル転移温度を有するＴＧＰは、後述するような具体的な化合物の中から、上記したスクリーニング方法（ゾル－ゲル転移温度測定法）に従って容易に選択することができる。
【0030】
上述したような熱可逆的なゾル－ゲル転移を示す（すなわち、ゾル－ゲル転移温度を有する）限り、本発明のＴＧＰは特に制限されない。その水溶液がゾル－ゲル転移温度を有し、該転移温度より低い温度で可逆的にゾル状態を示す高分子の具体例としては、例えば、ポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体等に代表されるポリアルキレンオキサイドブロック共重合体；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のエーテル化セルロース；キトサン誘導体（K.R.Holme.et al. Macromolecules,24,3828(1991)）等が知られている。
【0031】
（好適なハイドロゲル形成性高分子）
本発明のＴＧＰとして好適に使用可能な、架橋形成に疎水結合を利用したハイドロゲル形成性高分子は、ＴＧＰと媒体が分離せずに細胞集団の周囲を安定的に維持できる観点から、曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなることが好ましい。
該親水性のブロックは、ゾル－ゲル転移温度より低い温度で該ハイドロゲルが水溶性になるために存在することが好ましく、また曇点を有する複数のブロックは、ハイドロゲルがゾル－ゲル転移温度より高い温度でゲル状態に変化するために存在することが好ましい。
本発明のＴＧＰとして好適に使用可能な、架橋形成に疎水結合を利用したハイドロゲル形成性高分子は、ＴＧＰと媒体が分離せずに細胞集団の周囲を安定的に維持できる観点から、曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなることが好ましい。
該親水性のブロックは、ゾル－ゲル転移温度より低い温度で該ハイドロゲルが水溶性になるために存在することが好ましく、また曇点を有する複数のブロックは、ハイドロゲルがゾル－ゲル転移温度より高い温度でゲル状態に変化するために存在することが好ましい。
【0032】
換言すれば、曇点を有するブロックは該曇点より低い温度では水に溶解し、該曇点より高い温度では水に不溶性に変化するために、曇点より高い温度で、該ブロックはゲルを形成するための疎水結合からなる架橋点としての役割を果たす。すなわち、疎水性結合に由来する曇点が、上記ハイドロゲルのゾル－ゲル転移温度に対応する。
ただし、該曇点とゾル－ゲル転移温度とは必ずしも一致しなくてもよい。これは、上記した「曇点を有するブロック」の曇点は、一般に、該ブロックと親水性ブロックとの結合によって影響を受けるためである。
ただし、該曇点とゾル－ゲル転移温度とは必ずしも一致しなくてもよい。これは、上記した「曇点を有するブロック」の曇点は、一般に、該ブロックと親水性ブロックとの結合によって影響を受けるためである。
【0033】
本発明に用いるハイドロゲルは、疎水性結合が温度の上昇と共に強くなるのみならず、その変化が温度に対して可逆的であるという性質を利用したものである。１分子内に複数個の架橋点が形成され、安定性に優れたゲルが形成され、可逆的な温度変化に対して軟骨細胞培養物が安定に増殖し得る点からは、ＴＧＰが「曇点を有するブロック」を複数個有することが好ましい。
一方、上記ＴＧＰ中の親水性ブロックは、前述したように、該ＴＧＰがゾル－ゲル転移温度よりも低い温度で水溶性に変化させる機能を有し、上記転移温度より高い温度で疎水性結合力が増大しすぎて上記ハイドロゲルが凝集沈澱してしまうことを防止しつつ、含水ゲルの状態を形成させる機能を有する。
一方、上記ＴＧＰ中の親水性ブロックは、前述したように、該ＴＧＰがゾル－ゲル転移温度よりも低い温度で水溶性に変化させる機能を有し、上記転移温度より高い温度で疎水性結合力が増大しすぎて上記ハイドロゲルが凝集沈澱してしまうことを防止しつつ、含水ゲルの状態を形成させる機能を有する。
【0034】
さらに本発明に用いるＴＧＰは、本発明の軟骨細胞培養物を細胞治療で使用する観点から生体内で分解、吸収されるものであることが望ましい。すなわち、本発明のＴＧＰが生体内で加水分解反応や酵素反応により分解されて、生体に無害な低分子量体となって吸収、排泄されることが好ましい。
本発明のＴＧＰが曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなるものである場合には、曇点を有するブロックと親水性のブロックの少なくともいずれか、好ましくは両方が生体内で分解、吸収されるものであることが好ましい。
本発明のＴＧＰが曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなるものである場合には、曇点を有するブロックと親水性のブロックの少なくともいずれか、好ましくは両方が生体内で分解、吸収されるものであることが好ましい。
【0035】
（曇点を有する複数のブロック）
曇点を有するブロックとしては、水に対する溶解度－温度係数が負を示す高分子のブロックであることが好ましく、より具体的には、ポリプロピレンオキサイド、プロピレンオキサイドと他のアルキレンオキサイドとの共重合体、ポリＮ－置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ－置換メタアクリルアミド誘導体、Ｎ－置換アクリルアミド誘導体とＮ－置換メタアクリルアミド誘導体との共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物からなる群より選ばれる高分子が好ましく使用可能である。本発明の細胞集団または軟骨細胞培養物を安定して培養できる観点から、ポリＮ－置換アクリルアミド誘導体が好ましい。
曇点を有するブロックとしては、水に対する溶解度－温度係数が負を示す高分子のブロックであることが好ましく、より具体的には、ポリプロピレンオキサイド、プロピレンオキサイドと他のアルキレンオキサイドとの共重合体、ポリＮ－置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ－置換メタアクリルアミド誘導体、Ｎ－置換アクリルアミド誘導体とＮ－置換メタアクリルアミド誘導体との共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物からなる群より選ばれる高分子が好ましく使用可能である。本発明の細胞集団または軟骨細胞培養物を安定して培養できる観点から、ポリＮ－置換アクリルアミド誘導体が好ましい。
【0036】
曇点を有するブロックを生体内で分解、吸収されるものとするには、曇点を有するブロックを疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸から成るポリペプチドとすることが有効である。あるいはポリ乳酸やポリグリコール酸などのポリエステル型生分解性ポリマーを生体内で分解、吸収される曇点を有するブロックとして利用することもできる。
【0037】
上記の高分子（曇点を有するブロック）の曇点が４℃より高く４０℃以下であることが、本発明に用いる高分子（曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合した化合物）のゾル－ゲル転移温度を０℃より高く３７℃以下とする点から好ましい。
ここで曇点の測定は、例えば、上記の高分子（曇点を有するブロック）の約１質量％の水溶液を冷却して透明な均一溶液とした後、除々に昇温（昇温速度約１℃／ｍｉｎ）して、該溶液がはじめて白濁する点を曇点とすることによって行うことが可能である。
ここで曇点の測定は、例えば、上記の高分子（曇点を有するブロック）の約１質量％の水溶液を冷却して透明な均一溶液とした後、除々に昇温（昇温速度約１℃／ｍｉｎ）して、該溶液がはじめて白濁する点を曇点とすることによって行うことが可能である。
【0038】
本発明に使用可能なポリＮ－置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ－置換メタアクリルアミド誘導体の具体的な例を以下に列挙する。ポリ－Ｎ－アクロイルピペリジン；ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルメタアクリルアミド；ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド；ポリ－Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド；ポリ－Ｎ－イソプロピルメタアクリルアミド；ポリ－Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド；ポリ－Ｎ－アクリロイルピロリジン；ポリ－Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド；ポリ－Ｎ－シクロプロピルメタアクリルアミド；ポリ－Ｎ－エチルアクリルアミド。本発明の細胞集団または軟骨細胞培養物を安定的に培養できる観点からポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミドが好ましい。
【0039】
上記の高分子は単独重合体（ホモポリマー）であっても、上記重合体を構成する単量体と他の単量体との共重合体であってもよい。このような共重合体を構成する他の単量体としては、親水性単量体、疎水性単量体のいずれも用いることができる。一般的には、親水性単量体と共重合すると生成物の曇点は上昇し、疎水性単量体と共重合すると生成物の曇点は下降する。したがって、これらの共重合すべき単量体を選択することによっても、所望の曇点（例えば４℃より高く４０℃以下の曇点）を有する高分子を得ることができる。
【0040】
（親水性単量体）
上記親水性単量体としては、Ｎ－ビニルピロリドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアクリルアミド、Ｎ－メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルメタアクリレート、ヒドロキシメチルアクリレート、酸性基を有するアクリル酸、メタアクリル酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸等、並びに塩基性基を有するＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチルメタクリート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
上記親水性単量体としては、Ｎ－ビニルピロリドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアクリルアミド、Ｎ－メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルメタアクリレート、ヒドロキシメチルアクリレート、酸性基を有するアクリル酸、メタアクリル酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸等、並びに塩基性基を有するＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチルメタクリート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0041】
（疎水性単量体）
一方、上記疎水性単量体としては、エチルアクリレート、メチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート等のアクリレート誘導体およびメタクリレート誘導体、Ｎ－ｎ－ブチルメタアクリルアミド等のＮ－置換アルキルメタアクリルアミド誘導体、塩化ビニル、アクリロニトリル、スチレン、酢酸ビニル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一方、上記疎水性単量体としては、エチルアクリレート、メチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート等のアクリレート誘導体およびメタクリレート誘導体、Ｎ－ｎ－ブチルメタアクリルアミド等のＮ－置換アルキルメタアクリルアミド誘導体、塩化ビニル、アクリロニトリル、スチレン、酢酸ビニル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0042】
（親水性のブロック）
一方、上記した曇点を有するブロックと結合すべき親水性のブロックとしては、具体的には、メチルセルロース、デキストラン、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリＮ－ビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリＮ－メチルアクリルアミド、ポリヒドロキシメチルアクリレート、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸およびそれらの塩；ポリＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ－ジエチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩等が挙げられる。本発明の一態様において、熱可逆性ゲルの曇点を有する複数のブロックとしてポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミドを用いる場合、軟骨組織の生体内環境と類似の環境が形成されることで細胞集団の増殖能が高くなることから、該アクリルアミドに結合する親水性のブロックとしてポリエチレンオキサイドが好ましい。
一方、上記した曇点を有するブロックと結合すべき親水性のブロックとしては、具体的には、メチルセルロース、デキストラン、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリＮ－ビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリＮ－メチルアクリルアミド、ポリヒドロキシメチルアクリレート、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸およびそれらの塩；ポリＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ－ジエチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩等が挙げられる。本発明の一態様において、熱可逆性ゲルの曇点を有する複数のブロックとしてポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミドを用いる場合、軟骨組織の生体内環境と類似の環境が形成されることで細胞集団の増殖能が高くなることから、該アクリルアミドに結合する親水性のブロックとしてポリエチレンオキサイドが好ましい。
【0043】
また親水性のブロックは生体内で分解、代謝、排泄されることが望ましく、アルブミン、ゼラチンなどのたんぱく質、ヒアルロン酸、ヘパリン、キチン、キトサンなどの多糖類などの親水性生体高分子が好ましく用いられる。
【0044】
曇点を有するブロックと上記の親水性のブロックとを結合する方法は特に制限されないが、例えば、上記いずれかのブロック中に重合性官能基（例えばアクリロイル基）を導入し、他方のブロックを与える単量体を共重合させることによって行うことができる。また、曇点を有するブロックと上記の親水性のブロックとの結合物は、曇点を有するブロックを与える単量体と、親水性のブロックを与える単量体とのブロック共重合によって得ることも可能である。また、曇点を有するブロックと親水性のブロックとの結合は、予め両者に反応活性な官能基（例えば水酸基、アミノ基、カルボキシル基、イソシアネート基等）を導入し、両者を化学反応により結合させることによって行うこともできる。
【0045】
この際、親水性のブロック中には通常、反応活性な官能基を複数導入する。また、曇点を有するポリプロピレンオキサイドと親水性のブロックとの結合は、例えば、アニオン重合またはカチオン重合で、プロピレンオキサイドと「他の親水性ブロック」を構成するモノマー（例えばエチレンオキサイド）とを繰り返し逐次重合させることで、ポリプロピレンオキサイドと「親水性ブロック」（例えばポリエチレンオキサイド）が結合したブロック共重合体を得ることができる。
【0046】
このようなブロック共重合体は、ポリプロピレンオキサイドの末端に重合性基（例えばアクリロイル基）を導入後、親水性のブロックを構成するモノマーを共重合させることによっても得ることができる。更には、親水性のブロック中に、ポリプロピレンオキサイド末端の官能基（例えば水酸基）と結合反応し得る官能基を導入し、両者を反応させることによっても、本発明に用いる高分子を得ることができる。また、ポリプロピレングリコールの両端にポリエチレングリコールが結合した、プルロニック（登録商標）Ｆ－１２７（商品名、旭電化工業（株）製）等の材料を連結させることによっても、本発明に用いるＴＧＰを得ることができる。
【0047】
この曇点を有するブロックを含む態様における本発明の高分子は、曇点より低い温度においては、分子内に存在する上記「曇点を有するブロック」が親水性のブロックとともに水溶性であるので、完全に水に溶解し、ゾル状態を示す。しかし、この高分子の水溶液の温度を上記曇点より高い温度に加温すると、分子内に存在する「曇点を有するブロック」が疎水性となり、疎水的相互作用によって、別個の分子間で会合する。
【0048】
一方、親水性のブロックは、この時（曇点より高い温度に加温された際）でも水溶性であるので、本発明の高分子は水中において、曇点を有するブロック間の疎水性会合部を架橋点とした三次元網目構造を持つハイドロゲルを生成する。このハイドロゲルの温度を再び、分子内に存在する「曇点を有するブロック」の曇点より低い温度に冷却すると、該曇点を有するブロックが水溶性となり、疎水性会合による架橋点が解放され、ハイドロゲル構造が消失して、本発明のＴＧＰは、再び完全な水溶液となる。
【0049】
このように、好適な態様における本発明の高分子のゾル－ゲル転移は、分子内に存在する曇点を有するブロックの該曇点における可逆的な親水性、疎水性の変化に基づくものであるので、温度変化に対応して、完全な可逆性を有する。本発明者らの検討によれば、上記したＴＧＰの水中における微妙な親水性－疎水性のバランスが、細胞を水中で低温保存する際の細胞の安定性に寄与しているものと考えられる。
【0050】
（ゲルの溶解性）
上述したように水溶液中でゾル－ゲル転移温度を有する高分子を少なくとも含む本発明のハイドロゲル形成性の高分子は、該ゾル－ゲル転移温度より高い温度（ｄ℃）で実質的に水不溶性を示し、ゾル－ゲル転移温度より低い温度（ｅ℃）で可逆的に水可溶性を示す。
上述したように水溶液中でゾル－ゲル転移温度を有する高分子を少なくとも含む本発明のハイドロゲル形成性の高分子は、該ゾル－ゲル転移温度より高い温度（ｄ℃）で実質的に水不溶性を示し、ゾル－ゲル転移温度より低い温度（ｅ℃）で可逆的に水可溶性を示す。
【0051】
上記した高い温度（ｄ℃）は、ゾル－ゲル転移温度より１℃以上高い温度であることが好ましく、２℃以上（特に５℃以上）高い温度であることが更に好ましい。また、上記「実質的に水不溶性」とは、上記温度（ｄ℃）において、水１００ｍｌ（リットル）に溶解する上記高分子の量が、５．０ｇ以下（更には０．５ｇ以下、特に０．１ｇ以下）であることが好ましい。
【0052】
一方、上記した低い温度（ｅ℃）は、ゾル－ゲル転移温度より（絶対値で）１℃以上低い温度であることが好ましく、２℃以上（特に５℃以上）低い温度であることが更に好ましい。また、上記「水可溶性」とは、上記温度（ｅ℃）において、水１００ｍｌ（リットル）に溶解する上記高分子の量が、０．５ｇ以上（更には１．０ｇ以上）であることが好ましい。更に「可逆的に水可溶性を示す」とは、上記ＴＧＰの水溶液が、一旦（ゾル－ゲル転移温度より高い温度において）ゲル化された後においても、ゾル－ゲル転移温度より低い温度においては、上記した水可溶性を示すことをいう。
【0053】
上記高分子は、その１０％水溶液が５℃で、１０～３，０００センチポイズ（更には５０～１，０００センチポイズ）の粘度を示すことが好ましい。このような粘度は、例えば以下のような測定条件下で測定することが好ましい。
粘度計：ストレス制御式レオメーター（機種名：AR500、TAインスツルメンツ社製）
ローター直径：６０ｍｍ
ローター形状：平行平板
粘度計：ストレス制御式レオメーター（機種名：AR500、TAインスツルメンツ社製）
ローター直径：６０ｍｍ
ローター形状：平行平板
【0054】
本発明のＴＧＰの水溶液は、上記ゾル－ゲル転移温度より高い温度でゲル化させた後、多量の水中に浸漬しても、該ゲルは実質的に溶解しない。上記ＴＧＰが形成するハイドロゲルの上記特性は、例えば、以下のようにして確認することが可能である。
すなわち、ＴＧＰ０．１５ｇを、上記ゾル－ゲル転移温度より低い温度（例えば氷冷下）で、蒸留水１．３５ｇに溶解して１０ｗｔ％の水溶液を作製し、該水溶液を径が３５ｍｍのプラスチックシャーレ中に注入し、３７℃に加温することによって、厚さ約１．５ｍｍのゲルを該シャーレ中に形成させた後、該ゲルを含むシャーレ全体の重量（ｆグラム）を測定する。次いで、該ゲルを含むシャーレ全体を２５０ｍｌ（リットル）中の水中に３７℃で１０時間静置した後、該ゲルを含むシャーレ全体の重量（ｇグラム）を測定して、ゲル表面からの該ゲルの溶解の有無を評価する。この際、本発明のハイドロゲル形成性の高分子においては、上記ゲルの重量減少率、すなわち（ｆ－ｇ）／ｆが、５．０％以下であることが好ましく、更には１．０％以下（特に０．１％以下）であることが好ましい。
すなわち、ＴＧＰ０．１５ｇを、上記ゾル－ゲル転移温度より低い温度（例えば氷冷下）で、蒸留水１．３５ｇに溶解して１０ｗｔ％の水溶液を作製し、該水溶液を径が３５ｍｍのプラスチックシャーレ中に注入し、３７℃に加温することによって、厚さ約１．５ｍｍのゲルを該シャーレ中に形成させた後、該ゲルを含むシャーレ全体の重量（ｆグラム）を測定する。次いで、該ゲルを含むシャーレ全体を２５０ｍｌ（リットル）中の水中に３７℃で１０時間静置した後、該ゲルを含むシャーレ全体の重量（ｇグラム）を測定して、ゲル表面からの該ゲルの溶解の有無を評価する。この際、本発明のハイドロゲル形成性の高分子においては、上記ゲルの重量減少率、すなわち（ｆ－ｇ）／ｆが、５．０％以下であることが好ましく、更には１．０％以下（特に０．１％以下）であることが好ましい。
【0055】
本発明のＴＧＰの水溶液は、上記ゾル－ゲル転移温度より高い温度でゲル化させた後、多量（体積比で、ゲルの０．１～１００倍程度）の水中に浸漬しても、長期間に亘って該ゲルは溶解することがない。このような本発明に用いる高分子の性質は、例えば、該高分子内に曇点を有するブロックが２個以上（複数個）存在することによって達成される。
これに対して、ポリプロピレンオキサイドの両端にポリエチレンオキサイドが結合してなる前述のプルロニック（登録商標）Ｆ－１２７を用いて同様のゲルを作成した場合には、数時間の静置で該ゲルは完全に水に溶解することを、本発明者らは見出している。
これに対して、ポリプロピレンオキサイドの両端にポリエチレンオキサイドが結合してなる前述のプルロニック（登録商標）Ｆ－１２７を用いて同様のゲルを作成した場合には、数時間の静置で該ゲルは完全に水に溶解することを、本発明者らは見出している。
【0056】
非ゲル化時の細胞毒性をできる限り低いレベルに抑える点からは、水に対する濃度、すなわち｛（高分子）／（高分子＋水）ｘ１００（％）で、２０％以下（更には１５％以下、特に１０％以下）の濃度でゲル化が可能なＴＧＰを用いることが好ましい。
本発明に用いられるＴＧＰの分子量は３万以上３，０００万以下が好ましく、より好ましくは１０万以上１，０００万以下、さらに好ましくは５０万以上５００万以下である。
本発明に用いられるＴＧＰの分子量は３万以上３，０００万以下が好ましく、より好ましくは１０万以上１，０００万以下、さらに好ましくは５０万以上５００万以下である。
【0057】
本発明の方法における、熱可逆性ポリマー（ＴＧＰ）で細胞集団を培養するステップは、軟骨組織から分離された細胞集団を既知の方法で、熱可逆性ポリマーに混合し培養すればよい。典型的には、軟骨組織から分離された細胞集団をゾル－ゲル転移温度より低い低温でＴＧＰ溶液に分散し、ゾル－ゲル転移温度より高い温度でＴＧＰをゲル化させた後、培養液などの媒体を添加して培養する方法を用いることができる。ゲル化したＴＧＰに媒体を添加することで、かかる媒体だけを定期的に交換することで、ゲル中の細胞集団に安定した栄養供給をすることができる。
【0058】
本発明における培養は、当該技術分野で通常なされている条件で行うことができる。例えば、典型的な培養条件としては、３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。また、培養は通常の気圧（大気圧）で行うことができる。本発明の方法は、細胞集団を長期培養しても石灰化等の異常な軟骨細胞培養物が生じることがないため、培養期間は、特に限定されない。例えば、４日以上、８日以上、１６日以上、２１日以上、３２日以上、４８日以上、６４日以上、７２日以上、９０日以上、１０２日以上、１１４日以上、１２６日以上、１４０日以上、１６０日以上、１８０日以上、２５０日以上であってよく、十分なＥＣＭが形成される観点から２１日以上が好ましく、より好ましくは３２日以上、さらに好ましくは７２日以上である。
【0059】
培養は、任意の大きさおよび形状の容器で行うことができる。ＴＧＰを溶解する媒体およびゲル化したＴＧＰに添加する媒体（本明細書で「液体培地」と言うこともある）は、細胞の生存を維持できるものであれば特に限定されないが、典型的には、アミノ酸、ビタミン類、電解質を主成分としたものが利用できる。本発明において、ＴＧＰを溶解する媒体およびゲル化したＴＧＰに添加する媒体は、共通のものであっても異なるものであってもよい。
【0060】
本発明の一態様において、ＴＧＰを溶解する媒体およびゲル化したＴＧＰに添加する媒体は、細胞培養用の基礎培地をベースにしたものである。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７、ＣｎＴ－ＰＲなどが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。したがって、本発明に用いる基礎培地は、公知の組成のものに限定されず、１または２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものを含む。
【0061】
媒体は、上記のほか、血清、成長因子（例えばＦＧＦ－２、ＴＧＦ－ｂ１など）、ステロイド剤成分、セレン成分などの１種または２種以上の添加物を含んでもよい。血清としては、異種血清でも同種血清でもよい。同種血清が好ましく、同種血清のなかでも自己血清がさらに好ましい。また、媒体は、自己血清に含まれる成長因子以外の成長因子を媒体中に含まない。このような媒体によって溶解されたＴＧＰを使用して培養する場合、自己血清以外の成長因子が添加されていないＴＧＰで細胞集団を培養することになる。血清の濃度は特に限定されず、ＴＧＰに添加する媒体中に３％、５％、１０％、２０％含んでよい。好ましくは１０％である。本発明の一態様において、ＴＧＰを溶解する媒体とゲル化したＴＧＰに添加する媒体は共通の成分からなってもよい。
【0062】
本発明の方法により製造される「軟骨細胞培養物」とは、軟骨組織から分離された細胞集団を培養することにより得られた軟骨細胞を含む細胞集団を指す。
一態様において、本発明の方法により製造される軟骨細胞培養物は、ＥＣＭにより細胞集団の細胞間隙が充填された軟骨組織様の組織構造を持っていてよい。
一態様において、本発明の方法により製造される軟骨細胞培養物は、ＥＣＭにより細胞集団の細胞間隙が充填された軟骨組織様の組織構造を持っていてよい。
【0063】
本発明の方法により得られる軟骨細胞培養物は、熱可逆性ポリマーで細胞集団を培養するステップを含まない方法により培養された軟骨細胞培養物（本明細書において「対照培養物」という）よりも組織再生能が高い。
組織再生能は、細胞集団が適用された軟骨組織の組織再生能を意味する。
一態様において、組織再生能は、軟骨細胞培養物を対象の軟骨組織に適用（移植）し、所定時間経過後に、適用部位（移植先）の組織の状態、例えば、組織のサイズ、組織の微細構造、損傷組織と正常組織との割合、組織の機能などを観察し、これらをスコア化することなどにより定量化できる。
組織再生能は、細胞集団が適用された軟骨組織の組織再生能を意味する。
一態様において、組織再生能は、軟骨細胞培養物を対象の軟骨組織に適用（移植）し、所定時間経過後に、適用部位（移植先）の組織の状態、例えば、組織のサイズ、組織の微細構造、損傷組織と正常組織との割合、組織の機能などを観察し、これらをスコア化することなどにより定量化できる。
【0064】
一態様において組織再生能は、ＳＯＸ９、ＣＯＬ２Ａ１、ｍｉＲ１４０およびｍｉＲ２１から選択される１以上の遺伝子の発現能であってよい。本発明の方法によって製造された軟骨細胞培養物は、対照培養物よりもＳＯＸ９、ＣＯＬ２Ａ１、ｍｉＲ１４０およびｍｉＲ２１から選択される１以上の遺伝子の発現が高い。したがって、本発明は、軟骨組織から分離された細胞集団のＳＯＸ９、ＣＯＬ２Ａ１、ｍｉＲ１４０およびｍｉＲ２１から選択される１以上の遺伝子の発現能を高めるための方法であってもよい。
【0065】
ＳＯＸ９またはＣＯＬ２Ａ１は、正常な軟骨の組織形成時に発現する遺伝子として知られている。また、ｍｉＲ１４０またはｍｉＲ２１に由来する、ｍｉＲ１４０－３ｐもしくは－５ｐ、または、ｍｉＲ２１―５ｐは、変形性関節症で発生する軟骨組織中の炎症、ＥＣＭの分解等を特徴とする軟骨組織の変性状態の正常化に有効である（Karlsen et al., Mol Ther Nucleic Acids. 2016 Oct 11;5(10)、Miyaki et al., Arthritis Rheum. 2009 Sep;60(9):2723-30、Si et al., Osteoarthritis Cartilage. 2017 Oct;25(10):1698-1707、Miyaki et al., Genes Dev. 2010 Jun 1;24(11):1173-85、Hai et al,. J Orthop Surg Res. 2019; 14: 118など参照）。
【0066】
具体的には、軟骨組織においてｍｉＲ１４０が高発現すると、ｍｉＲ１４０－３ｐまたは５ｐが軟骨組織中で増加する結果、限定されずに、ＭＭＰ－１３およびＡＤＡＭＴＳ－５などのＥＣＭ分解酵素の発現または分泌の低下、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ６およびＩＬ８などの炎症メディエーターの発現または分泌の低下、ＳＯＸ９、ＡＣＡＮおよびコンドロイチン硫酸Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１（ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１）などＥＣＭ合成に関与するタンパク等の発現の増加を介して軟骨組織の変性状態を正常化する。したがって、本発明の軟骨細胞培養物を対象、特に変形性関節症を有する対象の軟骨組織に適用すると、適用箇所に正常な軟骨組織を補完し得るだけでなく、適用箇所の周囲の軟骨組織の変性状態を正常化することができるため、長期にわたって、治療効果を維持することが出来る。
【0067】
また、軟骨組織においてｍｉＲ２１が高発現すると、ｍｉ２１－５ｐが軟骨組織中で増加する結果、限定されずに、ＭＭＰ－１３およびＡＤＡＭＴＳ－５などのＥＣＭ分解酵素の発現または分泌の低下、ＣＯＬ２Ａ１などＥＣＭ合成に関与するタンパク等の発現の増加を介して軟骨組織の変性状態を正常化する。したがって、ｍｉＲ１４０と同じく長期にわたって、治療効果を維持することが出来る。
【0068】
ここで遺伝子の発現が高いとは、対照培養物を基準として、限定されずに、１０１％以上、１０５％以上、１１０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上または２００％以上、所定の遺伝子の発現量が高いことを意味する。
【0069】
遺伝子の発現量を測定する手法は、当該技術分野において周知であり、タンパク質の発現レベルを測定する手法としては、限定されずに、例えば、上で詳述したモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティング法、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫組織化 学法、免疫細胞化学法、フローサイトメータ、質量分析法などが、遺伝子の発現レベルを 測定する手法としては、限定されずに、例えば、ノーザンブロッティング法、サザンブロ ッティング法、ＤＮＡマイクロアレイ解析、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＲＴＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）等のＰＣＲ法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法などが、それぞれ挙げられる。
【0070】
本開示においてＳＯＸ９（ＣＭＤ１、ＣＭＰＤ１、ＳＲＡ１、ＳＲＸＸ２、ＳＲＸＹ１０とも称する）は、SRY-box transcription factor 9をコーする遺伝子であり、ヒトＳＯＸ９の遺伝子配列は、accession番号NM_000346等として登録されており、その配列は配列番号１に示すとおりである。
本開示においてＣＯＬ２Ａ１（ＡＮＦＨ、ＡＯＭ、ＣＯＬ１１Ａ３、ＳＥＤＣ、ＳＴＬ１とも称する）は、collagen type II alpha 1 chainをコーする遺伝子であり、ヒトＣＯＬ２Ａ１の遺伝子配列は、accession番号NM_001844.5、等として登録されており、その配列は配列番号２に示すとおりである。
本開示においてＣＯＬ２Ａ１（ＡＮＦＨ、ＡＯＭ、ＣＯＬ１１Ａ３、ＳＥＤＣ、ＳＴＬ１とも称する）は、collagen type II alpha 1 chainをコーする遺伝子であり、ヒトＣＯＬ２Ａ１の遺伝子配列は、accession番号NM_001844.5、等として登録されており、その配列は配列番号２に示すとおりである。
【0071】
本明細書において「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」は、ヘアピン様構造のＲＮＡ前駆体として転写され、ＲＮａｓｅＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素により切断され、ＲＩＳＣと称するタンパク質複合体に取り込まれ、ｍＲＮＡの翻訳抑制に関与する１０～２５塩基のＲＮＡを意図して用いられる。また「ｍｉＲＮＡ」は、「ｍｉＲＮＡ」および「ｍｉＲＮＡ」の前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）を含み、これらによってコードされるｍｉＲＮＡと生物学的機能が同等であるｍｉＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」も含む。かかる前駆体、同族体、変異体又は誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」としては、ｍｉＲＢａｓｅ（http://www.mirbase.org/）により同定することができ、ストリンジェントな条件下で、特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「ｍｉＲＮＡ」が挙げられる。
【0072】
本開示において、ヒトｍｉｒ－１４０は、miRbase ID: Stem-loop sequence hsa-mir-140、miRbase accession番号．MI0000456として登録されており、配列番号３に示すとおりである。
本開示において、ヒトｍｉＲ１４０－３ｐは、miRbase ID: Mature sequence hsa-miR-140-3p、miRbase accession番号．MIMAT0004597として登録されており、配列番号４に示されるＲＮＡ配列「uaccacaggguagaaccacgg」に示すとおりである。
本開示においてヒトｍｉＲ１４０－５ｐは、miRbase ID: Mature sequence hsa-miR-140-5p、miRbase accession番号．MIMAT0000431として登録されており、配列番号５に示されるＲＮＡ配「cagugguuuuacccuaugguag」に示すとおりである。
本開示において、ヒトｍｉＲ１４０－３ｐは、miRbase ID: Mature sequence hsa-miR-140-3p、miRbase accession番号．MIMAT0004597として登録されており、配列番号４に示されるＲＮＡ配列「uaccacaggguagaaccacgg」に示すとおりである。
本開示においてヒトｍｉＲ１４０－５ｐは、miRbase ID: Mature sequence hsa-miR-140-5p、miRbase accession番号．MIMAT0000431として登録されており、配列番号５に示されるＲＮＡ配「cagugguuuuacccuaugguag」に示すとおりである。
【0073】
本開示において、ヒトｍｉｒ－２１は、miRbase ID:Stem-loop sequence hsa-mir-21、miRbase accession番号．MI0000077として登録されており、配列番号６に示すとおりである。
本開示において、ヒトｍｉＲ２１－３ｐは、miRbase ID: Mature sequence hsa-miR-21-3p、miRbase accession番号．MIMAT0004494として登録されており、配列番号７に示されるＲＮＡ配列「caacaccagucgaugggcugu」に示すとおりである。
本開示においてヒトｍｉＲ２１－５ｐは、miRbase ID: Mature sequence hsa-miR-21-5p、miRbase accession番号．MIMAT0000076として登録されており、配列番号８に示されるＲＮＡ配列「uagcuuaucagacugauguuga」に示すとおりである。
本開示において、ヒトｍｉＲ２１－３ｐは、miRbase ID: Mature sequence hsa-miR-21-3p、miRbase accession番号．MIMAT0004494として登録されており、配列番号７に示されるＲＮＡ配列「caacaccagucgaugggcugu」に示すとおりである。
本開示においてヒトｍｉＲ２１－５ｐは、miRbase ID: Mature sequence hsa-miR-21-5p、miRbase accession番号．MIMAT0000076として登録されており、配列番号８に示されるＲＮＡ配列「uagcuuaucagacugauguuga」に示すとおりである。
【0074】
一態様において組織再生能は、軟骨細胞培養物のｍｉＲＮＡの保持能力である。保持能力とは、軟骨細胞培養物がｍｉＲＮＡを軟骨細胞培養物中に保持する能力である。ｍｉＲＮＡを軟骨細胞培養物中に保持する能力とは、ｍｉＲＮＡを培養時に分泌せずに、軟骨細胞培養物中に保持する能力であってよい。ｍｉＲＮＡが培養時に軟骨細胞培養物中に保持されることで、当該軟骨細胞培養物を対象に適用した場合、適用箇所および適用箇所周囲にｍｉＲＮＡを高濃度で分泌し得る軟骨細胞培養物を得ることができる。
【0075】
ｍｉＲＮＡとしては、限定されずに、ｍｉＲ１４０、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ－１２５ｂ、Ｈａｓ－ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－３０ａ、ｍｉＲ－１９９ａ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２６ｂ、ｍｉＲ－３７３、ｍｉＲ－１２７－５ｐ、ｍｉＲ－３２０、ｍｉＲ－９、ｍｉＲ－６３４、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－３７０ｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－１３０Ａ、ｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－５６２－５ｐなど軟骨組織の変性状態を正常化し得るｍｉＲＮＡを含み（Zhang.et al.J Arthritis. 2017 Apr;6(2). pii: 239. doi: 10.4172/2167-7921.1000239参照）、好ましくはｍｉＲ１４０（ｍｉＲ１４０－３ｐおよび－５ｐを含む）、ｍｉＲ２１（ｍｉＲ２１－３ｐおよび－５ｐを含む）、特に好ましくはｍｉＲ１４０（ｍｉＲ１４０－３ｐおよび－５ｐを含む）である。
【0076】
ｍｉＲＮＡの保持能力が高いとは、培養時の対照培養物を基準として、限定されずに、１０１％以上、１０５％以上、１１０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上または２００％以上高い濃度で培養時の軟骨細胞培養物中にｍｉＲＮＡが存在することを言う。一態様において、ｍｉＲＮＡの保持能力が高いとは、培養時の対照培養物の媒体（液体培地）を基準として、限定されずに、９９％以下、９５％以下、９７％％以下、９５％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下低い濃度で培養時の軟骨細胞培養物の液体培地中にｍｉＲＮＡが存在することを言う。一態様において、ｍｉＲＮＡの保持能力が高いとは、培養時の対照培養物を基準として、培養時の軟骨細胞培養物中に高い濃度でｍｉＲＮＡが存在し、および、対照培養物の液体培地を基準として、培養時の軟骨細胞培養物の媒体中に低い濃度でｍｉＲＮＡが存在することを言う。
【0077】
一態様において組織再生能は、軟骨細胞培養物中の幹細胞の含有量であってよい。本発明の方法によって製造された軟骨細胞培養物は、対照培養物よりも幹細胞の含有量が高い。したがって、本発明は、軟骨組織から分離された細胞集団中の幹細胞を維持また増殖するための方法であってもよい。一態様において、幹細胞の含有量とは限定されずに、細胞培養物に占める幹細胞の量または割合であってよい。幹細胞は、軟骨細胞に分化し得る能力を有する細胞あれば限定されずに、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞などの体性幹細胞、またはＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞などの多能性幹細胞などが含まれる。
【0078】
幹細胞の含有量は、当該技術分野で既知の幹細胞の測定方法により測定することができ、限定されずに、軟骨細胞培養物に含まれる細胞の細胞膜に存在するＵＥＡ－１などのレクチンに反応するα１－２フコース、もしくはＳＮＡ、ＳＳＡ、ＴＪＡ－Ｉなどのレクチンに反応するα２－６シアル酸の量を測定すること、または、前記α１－２フコース酸もしくは前記α２－６シアル酸の量の変化と相関する他の細胞表面マーカーまたは遺伝子発現などを測定することで定量できる。軟骨細胞培養物に含まれる細胞の細胞膜に存在する前記α１－２フコースのレベルが高ければ、多能性幹細胞が多く存在し、前記α２－６シアル酸レベルが高ければ、分化ポテンシャルが高い体性幹細胞が多く存在することを意味する。（Wang et al, Cell Res. 2011 Nov;21(11):1551-63、Tateno et al, Glycobiology. 2016 Dec;26(12):1328-1337,WO2016006712A1を参照）。
【0079】
「分化ポテンシャル」とは、ある細胞が適切な分化誘導状態に置かれた場合に、前駆細胞、体細胞などの別種の細胞に変化することができる能力を有していることをいう。一般的に、体性幹細胞を長期培養すると、増殖能と共に分化ポテンシャルが低下する傾向がある。分化ポテンシャルが低下した体性幹細胞は体性幹細胞マーカーを細胞表面に持ちながらも前駆細胞、体細胞などの別種の細胞に変化することができないため、このような体性幹細胞は、組織再生能を持たない。
【0080】
本発明の方法によって製造された軟骨細胞培養物は、分化ポテンシャルが高い体性幹細胞の含有量が高い。分化ポテンシャルが高い体性幹細胞の含有量とは、限定されずに、単位量当たり細胞培養物に占める分化ポテンシャルが高い体性幹細胞の量または割合であってよい。ある態様において、本発明は、軟骨組織から分離された細胞集団中の体性幹細胞の分化ポテンシャルを維持または増加させる方法であってもよい。別の態様において、本発明は、軟骨組織から分離された細胞集団中の分化ポテンシャルが高い体性幹細胞を維持または増殖する方法であってもよい。体性幹細胞は、軟骨細胞に分化し得る体性幹細胞であれば限定されずに、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞などであってよい。
【0081】
このような幹細胞または分化ポテンシャルが高い体性幹細胞が多く含まれる軟骨細胞培養物を対象の軟骨組織に適用すると、適用箇所に分化ポテンシャルが高い細胞から分化した軟骨細胞が恒常的に供給し得るため、長期にわたり正常な軟骨組織を修復し、維持することができる。また、幹細胞または分化ポテンシャルが高い体性幹細胞が、間葉系幹細胞であれば、軟骨細胞のアポトーシス保護用、軟骨組織の抗炎症用、抗繊維化用など、損傷した軟骨組織を正常化する能力、損傷に対する回復能力などが高いため、長期にわたって、治療効果を維持することができる。
【0082】
軟骨細胞培養物に含まれる細胞の細胞膜に存在するＵＥＡ－１などのレクチンに反応するα１－２フコース、もしくはＳＮＡ、ＳＳＡ、ＴＪＡ－Ｉなどのレクチンに反応するα２－６シアル酸の量は、限定されずに、前記レクチンまたは前記レクチンが反応するα１－２フコースもしくはα２－６シアル酸に特異的に反応する抗体を使用したフローサイトメトリー、ウエスタンブロット、免疫染色、または抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイ等を用いて測定することができる。前記α１－２フコース酸またはα２－６シアル酸の量の変化と相関する他の細胞表面マーカーまたは遺伝子発現などを測定する方法は、当該技術分野において細胞表面マーカーまたは遺伝子発現を測定する常法を用いることができる。
【0083】
本発明の方法によって製造された軟骨細胞培養物は、対照培養物よりも幹細胞、または分化ポテンシャルが高い体性幹細胞を多く含む。幹細胞または分化ポテンシャルが高い体性幹細胞を多く含むとは、対照培養物を基準として、限定されずに、１０１％以上、１０５％以上、１１０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上または２００％以上、α１－２フコース酸もしくはα２－６シアル酸を有する細胞の含有量、またはこれらと相関する細胞表面マーカーまたは遺伝子発現が高いことを意味する。
【0084】
一態様において組織再生能は、軟骨細胞培養物のヒアルロン酸の分泌能であってよい。本発明の方法によって製造された軟骨細胞培養物は、対照培養物よりもヒアルロン酸の分泌能が高い。したがって、本発明は、軟骨組織から分離された細胞集団中の分泌能を高める方法であってよい。ヒアルロン酸は、ＥＣＭ分解系酵素の発現に対して抑制的に作用し、軟骨から遊出したマトリクスや抗炎症因子の緩和、炎症関連因子の発現を制御することが知られている（Ohtsuki.et al.J Orthop Res. 2018 Aug 17. doi: 10.1002/jor.24126）。
【0085】
したがって、本発明の方法によって製造された軟骨細胞培養物を対象の軟骨組織に適用すると、適用箇所に正常な軟骨組織を補完し得るだけでなく、適用箇所周囲のＥＣＭ分解または炎症が抑制されるため、適用箇所の周囲の軟骨組織の変性状態を正常化することができ、長期にわたって、正常な軟骨組織を修復し維持することができる。
【0086】
ヒアルロン酸の分泌能の測定方法は、媒体（液体培地）またはＴＧＰ中のヒアルロン酸を経時的に定量すればよい。ヒアルロン酸は、限定されずに、質量分析、液体クロマトグラフィー、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦなどの他、市販のキットによって定量し得る。
ヒアルロン酸の分泌能が高いとは、対照培養物を基準として、限定されずに、１０１％以上、１０５％以上、１１０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上または２００％以上ヒアルロン酸の分泌能が高いことを意味する。
ヒアルロン酸の分泌能が高いとは、対照培養物を基準として、限定されずに、１０１％以上、１０５％以上、１１０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上または２００％以上ヒアルロン酸の分泌能が高いことを意味する。
【0087】
さらに本発明の方法により製造された軟骨細胞培養物は、ＥＣＭに富むため損傷部位に生着し易い。したがって、本発明の方法により製造された軟骨細胞培養物は移植用に用いることができる。また、ｍｉＲ１４０およびｍｉＲ２１の発現量が高く、幹細胞を多く含み、ヒアルロン酸の分泌量が高いためグレード２以上または高齢者の変形性関節症の治療用に好ましく用いられる。
【0088】
本発明は、さらに本発明の方法により製造された軟骨細胞培養物を含む。本発明の軟骨細胞培養物は上述した通りである。
本発明は、本発明の軟骨細胞培養物の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む、対象における疾患を治療する方法を含む。疾患は、軟骨に関連する疾患であれば限定されずに、変形性関節症、関節リウマチ、骨肉腫、大腿骨頭壊死症、臼蓋形成不全、半月板損傷、外傷性関節炎、スポーツや事故等による物理的な軟骨の欠損または損傷を含む。
対象への適用（投与）方法は、軟骨細胞培養物の移植であってよい。軟骨細胞培養物の移植は、限定されずに、軟骨組織への注射、または関節鏡視下手術および切開等により、患部に軟骨細胞培養物を送達し、フィブリンゲル等の任意の組織接着剤を使用するか、または吻合することにより患部に固定し得る。
本発明の治療方法において、種々の追加成分、例えば、薬学的に許容し得る担体、生着性などを高める成分、さらなる有効成分などを含有させて適用することができる。かかる追加成分としては、既知の任意のものを使用することができ、当業者はこれらの追加成分について精通している。
以下に本発明の具体的な態様を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
本発明は、本発明の軟骨細胞培養物の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む、対象における疾患を治療する方法を含む。疾患は、軟骨に関連する疾患であれば限定されずに、変形性関節症、関節リウマチ、骨肉腫、大腿骨頭壊死症、臼蓋形成不全、半月板損傷、外傷性関節炎、スポーツや事故等による物理的な軟骨の欠損または損傷を含む。
対象への適用（投与）方法は、軟骨細胞培養物の移植であってよい。軟骨細胞培養物の移植は、限定されずに、軟骨組織への注射、または関節鏡視下手術および切開等により、患部に軟骨細胞培養物を送達し、フィブリンゲル等の任意の組織接着剤を使用するか、または吻合することにより患部に固定し得る。
本発明の治療方法において、種々の追加成分、例えば、薬学的に許容し得る担体、生着性などを高める成分、さらなる有効成分などを含有させて適用することができる。かかる追加成分としては、既知の任意のものを使用することができ、当業者はこれらの追加成分について精通している。
以下に本発明の具体的な態様を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
【実施例】
【0089】
[製造例１]
Ｎ－イソプロピルアクリルアミド４２．０ｇおよびｎ－ブチルメタクリレート４．０ｇ をエタノール５９２ｇに溶解した。これにポリエチレングリコールジメタクリレート（PD E6000、日本油脂（株）製）１１．５ｇを水６５．１ｇに溶解した水溶液を加え、窒素気 流下７０℃に加温した。窒素気流下７０℃を保ちながら、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメ チルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）０．４ｍＬと１０％過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ） 水溶液４ｍＬを加え３０分間攪拌反応させた。さらにＴＥＭＥＤ０．４ｍＬと１０％ＡＰ Ｓ水溶液４ｍＬを３０分間隔で４回加えて重合反応を完結させた。反応液を５℃以下に冷 却後、５℃の冷却蒸留水５Ｌを加えて希釈し、分画分子量１０万の限外ろ過膜を用いて５℃で２Ｌまで濃縮した。
Ｎ－イソプロピルアクリルアミド４２．０ｇおよびｎ－ブチルメタクリレート４．０ｇ をエタノール５９２ｇに溶解した。これにポリエチレングリコールジメタクリレート（PD E6000、日本油脂（株）製）１１．５ｇを水６５．１ｇに溶解した水溶液を加え、窒素気 流下７０℃に加温した。窒素気流下７０℃を保ちながら、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメ チルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）０．４ｍＬと１０％過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ） 水溶液４ｍＬを加え３０分間攪拌反応させた。さらにＴＥＭＥＤ０．４ｍＬと１０％ＡＰ Ｓ水溶液４ｍＬを３０分間隔で４回加えて重合反応を完結させた。反応液を５℃以下に冷 却後、５℃の冷却蒸留水５Ｌを加えて希釈し、分画分子量１０万の限外ろ過膜を用いて５℃で２Ｌまで濃縮した。
【0090】
該濃縮液に冷却蒸留水４Ｌを加えて希釈し、上記限外ろ過濃縮操作を再度行った。上記 の希釈、限外ろ過濃縮操作を更に５回繰り返し、分子量１０万以下のものを除去した。こ の限外ろ過によりろ過されなかったもの（限外ろ過膜内に残留したもの）を回収して凍結 乾燥し、分子量１０万以上の本発明のTGP４０ｇを得た。上記により得た本発明のTGP１ｇを、９ｇの蒸留水に氷冷下で溶解し１０ｗｔ％ の水溶液を得た。この水溶液の貯蔵弾性率をストレス制御式レオメーター（AR500、TAイ ンスツルメント社製）を用い、適用周波数１Ｈｚで測定したところ、１０℃で４３Ｐａ、 ２５℃で６８０Ｐａ、３７℃で１３１０Ｐａであった。この温度依存性貯蔵弾性率変化は 、可逆的に繰り返し観測された。
【0091】
１．軟骨組織から分離された細胞集団の培養
＜サンプルの回収＞
変形性関節症グレードＩＩＩまたはＩＶの患者６名から人工関節置換術により切除したＯＡ患者６名の膝関節の損傷部における軟骨組織（約１０×５ｍｍ、厚さ３ｍｍ）を一部採取し、抗生物質（gentamicin(50μg/ml), amphotericin(0.25μg/ml), penicillin(100 Units/ml)/streptomycin(100 μg/ml)含有PBSに3０分間浸漬した。各患者の年齢および性別を以下に記す。
＜サンプルの回収＞
変形性関節症グレードＩＩＩまたはＩＶの患者６名から人工関節置換術により切除したＯＡ患者６名の膝関節の損傷部における軟骨組織（約１０×５ｍｍ、厚さ３ｍｍ）を一部採取し、抗生物質（gentamicin(50μg/ml), amphotericin(0.25μg/ml), penicillin(100 Units/ml)/streptomycin(100 μg/ml)含有PBSに3０分間浸漬した。各患者の年齢および性別を以下に記す。
【表1】
【0092】
＜軟骨組織の分離＞
各組織片をメスにて１ｍｍ２以下に細切した。この細切片をＴｒｉｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ液（０．２５％）にて３７Ｃ°、３０分間処理し、次いでコラゲナーゼII液（１ｍｇ／ｍｌ）にて３７Ｃ°で１２～１６時間酵素処理した。ＤＭＥＭ液にて洗浄した後フィルター（１００μｍ）にてろ過し、遠心分離（１８００ｒｐｍ、１０分間）した。このようにして得られた細胞集団を細胞算定盤で計数した。細胞数は、１×１０４～４×１０４cells/mlであった。
各組織片をメスにて１ｍｍ２以下に細切した。この細切片をＴｒｉｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ液（０．２５％）にて３７Ｃ°、３０分間処理し、次いでコラゲナーゼII液（１ｍｇ／ｍｌ）にて３７Ｃ°で１２～１６時間酵素処理した。ＤＭＥＭ液にて洗浄した後フィルター（１００μｍ）にてろ過し、遠心分離（１８００ｒｐｍ、１０分間）した。このようにして得られた細胞集団を細胞算定盤で計数した。細胞数は、１×１０４～４×１０４cells/mlであった。
【0093】
［比較例１］
１０％自己血清含有ＤＭＥＭ液に抗生物質（gentamicin(50μg/ml), amphotericin(0.25μg/ml), penicillin(100 Units/ml)/streptomycin(100 μg/ml)を含有した培地に各サンプルの軟骨組織由来の細胞を分注し、３７℃、５％炭酸ガスインキュベータにて培養した。培養液は1週間ごとに交換して4～７週間培養した。
１０％自己血清含有ＤＭＥＭ液に抗生物質（gentamicin(50μg/ml), amphotericin(0.25μg/ml), penicillin(100 Units/ml)/streptomycin(100 μg/ml)を含有した培地に各サンプルの軟骨組織由来の細胞を分注し、３７℃、５％炭酸ガスインキュベータにて培養した。培養液は1週間ごとに交換して4～７週間培養した。
【0094】
［実施例１］
＜ＴＧＰゲルでの培養＞
製造例１で作製したＴＧＰ１ｇを４℃でＤＭＥＭ９ｍＬに溶解して１０％ＴＧＰ溶液を作成し、次、次いで軟骨組織由来の細胞を分散し、６ｗｅｌｌプレートに分注した。室温に放置してゲル状にした後、１０％自己血清含有ＤＭＥＭ液に抗生物質（gentamicin(50μg/ml)、amphotericin(0.25μg/ml), penicillin(100 Units/ml)/streptomycin(100μg/ml)及びL-Ascorbic acid(5mg/ml)含有した培地７～８ｍｌを加えて５％炭酸ガス培養器（ESPEC BNA-111）にて培養した。培養液は１週間ごとに交換して２０週間培養した。
＜ＴＧＰゲルでの培養＞
製造例１で作製したＴＧＰ１ｇを４℃でＤＭＥＭ９ｍＬに溶解して１０％ＴＧＰ溶液を作成し、次、次いで軟骨組織由来の細胞を分散し、６ｗｅｌｌプレートに分注した。室温に放置してゲル状にした後、１０％自己血清含有ＤＭＥＭ液に抗生物質（gentamicin(50μg/ml)、amphotericin(0.25μg/ml), penicillin(100 Units/ml)/streptomycin(100μg/ml)及びL-Ascorbic acid(5mg/ml)含有した培地７～８ｍｌを加えて５％炭酸ガス培養器（ESPEC BNA-111）にて培養した。培養液は１週間ごとに交換して２０週間培養した。
【0095】
＜培養された軟骨組織の観察＞
（１）位相差顕微鏡観察
比較例１では、培養を開始した当初は球形の正常な軟骨細胞が確認されたが、培養経過に伴って徐々に細長い線維芽細胞様の細胞が出現し始め、１２日目頃から２０日目頃までに徐々に変性または死滅を開始し、培養開始から約４週間で完全に変性または死滅した。例えば、サンプル１０５９は２８日目に、１０６６は２３日目、１０６８は１８日目に死滅した。
（１）位相差顕微鏡観察
比較例１では、培養を開始した当初は球形の正常な軟骨細胞が確認されたが、培養経過に伴って徐々に細長い線維芽細胞様の細胞が出現し始め、１２日目頃から２０日目頃までに徐々に変性または死滅を開始し、培養開始から約４週間で完全に変性または死滅した。例えば、サンプル１０５９は２８日目に、１０６６は２３日目、１０６８は１８日目に死滅した。
【0096】
実施例１では、培養開始から３～５日目には大きさ２００～３００μｍの軟骨細胞培養物が確認され、２１日後には直径０．５～１．０ｍｍの大きさにまで成長し、全てのサンプルで２０週間の培養期間、成長が維持された。実施例１では、線維芽細胞様の細胞の増殖は認められなかった。
【0097】
（２）ＨＥ染色
比較例１のサンプル（１０５９）の一部を培養開始から２５日目に、および、実施例１のＴＧＰゲル培養のサンプルの一部（１０５９）を培養開始から４９日目に採取し、ホルマリンで固定し、パラフィンで固めて組織のブロックを作製した後１０μｍに切断して、組織切片を作成した。光学顕微鏡（×２００）で観察したこれらの像を図１に示す。
比較例１のサンプルにおいてＥＣＭは確認されなかった。一方、実施例１のサンプルでは一般的な健常な軟骨組織と同様、軟骨細胞がＥＣＭに取り囲まれてお健常な硝子軟骨の組織と同様の組織構造を持つことが分かった。
比較例１のサンプル（１０５９）の一部を培養開始から２５日目に、および、実施例１のＴＧＰゲル培養のサンプルの一部（１０５９）を培養開始から４９日目に採取し、ホルマリンで固定し、パラフィンで固めて組織のブロックを作製した後１０μｍに切断して、組織切片を作成した。光学顕微鏡（×２００）で観察したこれらの像を図１に示す。
比較例１のサンプルにおいてＥＣＭは確認されなかった。一方、実施例１のサンプルでは一般的な健常な軟骨組織と同様、軟骨細胞がＥＣＭに取り囲まれてお健常な硝子軟骨の組織と同様の組織構造を持つことが分かった。
【0098】
（３）ＣＤ４４免疫染色
健常な軟骨組織、比較例１のサンプル、および、実施例１のサンプルから得られた組織切片を、ホルマリンで固定し、パラフィンで固めて組織のブロックを作製した後５μｍで切断して、組織切片を作成した。脱パラフィンン後、一次抗体ウサギモノクローナル抗ＣＤ４４抗体ＳＰ３７（Ventana Medical Systems Inc. USA）を室温で32分間反応させた。次いでiView DAB detection kit(Ventana Medical Systems Inc. USA）で発色させた。結果を図２に示す。
軟骨細胞培養物では、ＣＤ４４陽性である軟骨細胞とＥＣＭが散在していた。比較例１の平面培養サンプルでは、ＥＣＭが存在せず、ＣＤ４４陽性細胞のみが存在していた。
健常な軟骨組織、比較例１のサンプル、および、実施例１のサンプルから得られた組織切片を、ホルマリンで固定し、パラフィンで固めて組織のブロックを作製した後５μｍで切断して、組織切片を作成した。脱パラフィンン後、一次抗体ウサギモノクローナル抗ＣＤ４４抗体ＳＰ３７（Ventana Medical Systems Inc. USA）を室温で32分間反応させた。次いでiView DAB detection kit(Ventana Medical Systems Inc. USA）で発色させた。結果を図２に示す。
軟骨細胞培養物では、ＣＤ４４陽性である軟骨細胞とＥＣＭが散在していた。比較例１の平面培養サンプルでは、ＥＣＭが存在せず、ＣＤ４４陽性細胞のみが存在していた。
【0099】
（４）各サンプルにおける遺伝子発現の測定
比較例１のサンプル１０５９、１０６６および１０６８の一部を培養開始から１４、１７および２６日目に回収した。また、実施例１のサンプル１０５９、１０６６および１０６８の一部を培養開始から４２日目に回収した。なお、比較例１と実施例１のサンプルでは回収日に違いがあるが、これは比較例１のいずれのサンプルも４２日目には軟骨細胞が完全に死滅しており、これらのサンプル中で軟骨細胞が生存していた期間に回収できた最後のタイミングのものを使用した。
比較例１のサンプル１０５９、１０６６および１０６８の一部を培養開始から１４、１７および２６日目に回収した。また、実施例１のサンプル１０５９、１０６６および１０６８の一部を培養開始から４２日目に回収した。なお、比較例１と実施例１のサンプルでは回収日に違いがあるが、これは比較例１のいずれのサンプルも４２日目には軟骨細胞が完全に死滅しており、これらのサンプル中で軟骨細胞が生存していた期間に回収できた最後のタイミングのものを使用した。
【0100】
回収したサンプルをRNAlater（登録商標） Stabilization Solution（Invitrogen、CatNo.AM7020）-２０℃で保存した。これらのサンプルの一部をNucleoSpin（登録商標）miRNAキット（TaKaRa、U0971）を用いてスモールＲＮＡ（２００塩基以下のＲＮＡ）を精製し、配列番号９～１２のプライマーとmRQ 3'Primer、U6 Forward PrimerとU6 Reverse Primer（Mir-X（商標）miRNA qRT-PCR TB Green Kit (TaKaRa、Z8314N)を使用しThermal Cycler Dice（登録商標） Real Time System Lite (TP700、TaKaRa)によりＵ６、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－１４０－３ｐおよびｍｉＲ－１４０－５ｐのｑＰＣＲを行った。Ｕ６の発現量を１として、各ｍｉＲＮＡの定量値をノーマライズした。
【0101】
同じようにmiRNAeasy Mini Kit ( QIAGEN、217004)を使用してtotal ＲＮＡを精製した。Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen、18080044)を用いて逆転写によりcDNAを合成し、配列番号１３～１６のプライマーとTB Green Premix Ex Taq II（Takara,Cat No. RR820S/A/B）を用いて、Thermal Cycler Dice（登録商標） Real Time System LiteによりＧＡＰＤＨ、ＳＯＸ９およびＣＯＬ２Ａ１のｑＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨの発現量を１として、各遺伝子の定量値をノーマライズした。使用したプライマーを表２に、結果を表３～５に示す。
【0102】
【表2】
【0103】
【表3】
【0104】
【表4】
【0105】
【表5】
【0106】
１０５９、１０６６および１０６８のいずれのサンプルでも、ＴＧＰゲル中で培養した実施例１が、比較例１のサンプルと比較してｍｉＲ―２１およびｍｉＲ－１４０の発現量が増加して、ｍｉＲ２１－５ｐ、ｍｉＲ－１４０－３ｐおよびｍｉＲ－１４０－５ｐが大幅に増加することが分かった。
また、ＳＯＸ９の発現量を測定した１０５９および１０６８のいずれのサンプルでも、実施例１のサンプルで、比較例１のサンプルと比較して、ＳＯＸ９の発現量が大幅に増加することが分かった。またＣＯＬ２Ａ１を測定した１０６８でも実施例１で、比較例１のサンプルと比較して発現量が増加することが分かった。ｍｉＲ２１、ｍｉＲ－１４０、ＳＯＸ９およびＣＯＬ２Ａ１は、いずれも健全な軟骨組織の形成時に発現が上昇することが知られていることから、実施例１で製造された軟骨細胞培養物は健全な機能を有する軟骨組織であることが分かった。なかでもｍｉＲ－１４０およびｍｉＲ２１は、変形性関節症の微小環境を改善することが知られているため、実施例１で製造された軟骨細胞培養物は移植した部分の軟骨組織の再生を促すだけでなく、移植された周囲の変性状態を改善し得る。
また、ＳＯＸ９の発現量を測定した１０５９および１０６８のいずれのサンプルでも、実施例１のサンプルで、比較例１のサンプルと比較して、ＳＯＸ９の発現量が大幅に増加することが分かった。またＣＯＬ２Ａ１を測定した１０６８でも実施例１で、比較例１のサンプルと比較して発現量が増加することが分かった。ｍｉＲ２１、ｍｉＲ－１４０、ＳＯＸ９およびＣＯＬ２Ａ１は、いずれも健全な軟骨組織の形成時に発現が上昇することが知られていることから、実施例１で製造された軟骨細胞培養物は健全な機能を有する軟骨組織であることが分かった。なかでもｍｉＲ－１４０およびｍｉＲ２１は、変形性関節症の微小環境を改善することが知られているため、実施例１で製造された軟骨細胞培養物は移植した部分の軟骨組織の再生を促すだけでなく、移植された周囲の変性状態を改善し得る。
【0107】
（５）液体培地中のｍｉＲ１４０の定量
比較例１および実施例１で培養したサンプル１０６７および１０６８の液体培地を培養開始から７または８日目に２．０ｍずつ採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣａｔＮｏ．ＡＭ７０２０）中で－２０℃で保存した。これらのサンプルの一部をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡキット（ＴａＫａＲａ、Ｕ０９７１）を用いてスモールＲＮＡ（２００塩基以下のＲＮＡ）を精製し、配列番号３のプライマーとｍＲＱ ３’Ｐｒｉｍｅｒ（Ｍｉｒ－Ｘ（商標）ｍｉＲＮＡ ｑＲＴ－ＰＣＲ ＴＢ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ、Ｚ８３１４Ｎ））を使用しＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌｉｔｅ（ＴＰ７００、ＴａＫａＲａ）によりｍｉＲ－１４０－３ｐのｑＰＣＲを行った。結果を表６に示す。平均Ｃｔ値は、予め定めたＴｈｒｅｓｈｏｌｄに達するまでのサイクル数であり、平均Ｃｔ値が低いほどｍｉＲ－１４０－３ｐが液体培地中に多く存在することを示すものである。表中の「ＳＮＰ」は、採取した後、遠心分離およびフィルタレーションした後に保存したものであり、「ＳＮＦ」は、かかる処理せずに保存したものである。
比較例１および実施例１で培養したサンプル１０６７および１０６８の液体培地を培養開始から７または８日目に２．０ｍずつ採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣａｔＮｏ．ＡＭ７０２０）中で－２０℃で保存した。これらのサンプルの一部をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡキット（ＴａＫａＲａ、Ｕ０９７１）を用いてスモールＲＮＡ（２００塩基以下のＲＮＡ）を精製し、配列番号３のプライマーとｍＲＱ ３’Ｐｒｉｍｅｒ（Ｍｉｒ－Ｘ（商標）ｍｉＲＮＡ ｑＲＴ－ＰＣＲ ＴＢ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ、Ｚ８３１４Ｎ））を使用しＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌｉｔｅ（ＴＰ７００、ＴａＫａＲａ）によりｍｉＲ－１４０－３ｐのｑＰＣＲを行った。結果を表６に示す。平均Ｃｔ値は、予め定めたＴｈｒｅｓｈｏｌｄに達するまでのサイクル数であり、平均Ｃｔ値が低いほどｍｉＲ－１４０－３ｐが液体培地中に多く存在することを示すものである。表中の「ＳＮＰ」は、採取した後、遠心分離およびフィルタレーションした後に保存したものであり、「ＳＮＦ」は、かかる処理せずに保存したものである。
【0108】
【表6】
【0109】
表６より、いずれのサンプルでも実施例１と比較して、比較例１の液体培地中にｍｉＲ－１４０－３ｐが多く存在していることが分かった。（４）の遺伝子発現において、比較例１と比較して、実施例１の軟骨細胞培養物でｍｉＲ－１４０－３ｐを高く発現していたことに照らすと、実施例１の軟骨細胞培養物で発現したｍｉＲ－１４０－３ｐの殆どが液体培地中に分泌されず、軟骨細胞培養物中に保持されることが分かった。したがって、ＴＧＰゲル中で組織培養するとｍｉＲＮＡの含有量が高い組織培養物が得られることが明らかとなった。
【0110】
（６）ヒアルロン酸の測定
実施例１のＴＧＰゲル培養において培養開始から0日、３２日および１１３日に液体培地を２．０ｍｌずつ採取し、これらをそれぞれ－２０℃で凍結した。各サンプルに存在するヒアルロン酸をヒアルロン酸測定キット(PGリサーチHA-Kit. Lot. 18H４８４)により測定した。結果を表７に示す。
培養当初は存在しなかったヒアルロン酸が、３２日目には８２２．８ｎｇ／ｍｌ、１１３日後には６７０．１ｎｇ／ｍｌ存在した。このことから軟骨細胞培養物からヒアルロン酸が安定的に分泌されていることが分かった。したがって、ＴＧＰゲルで培養された軟骨細胞培養物は、健全な状態を示す軟骨組織であることが確認された。
実施例１のＴＧＰゲル培養において培養開始から0日、３２日および１１３日に液体培地を２．０ｍｌずつ採取し、これらをそれぞれ－２０℃で凍結した。各サンプルに存在するヒアルロン酸をヒアルロン酸測定キット(PGリサーチHA-Kit. Lot. 18H４８４)により測定した。結果を表７に示す。
培養当初は存在しなかったヒアルロン酸が、３２日目には８２２．８ｎｇ／ｍｌ、１１３日後には６７０．１ｎｇ／ｍｌ存在した。このことから軟骨細胞培養物からヒアルロン酸が安定的に分泌されていることが分かった。したがって、ＴＧＰゲルで培養された軟骨細胞培養物は、健全な状態を示す軟骨組織であることが確認された。
【表7】
【0111】
（７）培養された軟骨細胞培養物を構成する細胞の細胞表面のグリカン解析
実施例１において培養した軟骨細胞培養物を、培養開始から１４～１２６日の間に採取し、それぞれのＴＧＰゲルを４°Ｃに冷却して水溶液状にして回収した。当該サンプルをＴｒｉｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（０．２５％）液にて細胞に分散し、細胞を回収した。次いでＤＭＥＭにて４℃で３回遠心洗浄し（１８００ｒｐｍ、１５分）、それぞれのサンプルを凍結保存した。当該サンプルをＧｌｙｃｏＴｅｃｈｎｉｃａ ＬｔｄによるＧｌｙｃａｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｒｖｉｃｅによって委託解析した。具体的には、融解したサンプルから細胞膜タンパク質を抽出し、タンパク質をＢＣＡ法（ＴａＫａＲａ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）により、当該膜タンパク質濃度を測定した。測定したタンパク質濃度をもとにＰＢＳＴｘを加えてタンパク質濃度が１０μｇ／ｍＬになるように希釈した。１００μｇのＣｙ３ Ｍｏｎｏ－ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｄｙｅ Ｐａｃｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号：ＰＡ２３０１１）を含むチューブに１００μＬのサンプル（１０μｇ／ｍＬの濃度）を加え、ピペットで混和しスピンダウンした。チューブを遮光袋に入れて、室温（２５℃）で１時間インキュベートした。
次いで、Ｄｅｓａｌｔ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（商標）０．５ｍｌ（２５カラム）（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：８９８８２）スピンカラムを２ｍＬチューブに入れ、１５００×ｇ、４℃で１分間遠心し、遊離のＣｙ３を除去した。３００μＬのＴＢＳをカラムに添加し、１５００×ｇ、４℃で１分間遠心し、このプロセスを３回繰り返した。カラムを新しい１．５ｍＬチューブに入れ、ラベル付きサンプル（１００μＬ）をカラムに加え１５００×ｇ、４℃で２分間遠心した。
実施例１において培養した軟骨細胞培養物を、培養開始から１４～１２６日の間に採取し、それぞれのＴＧＰゲルを４°Ｃに冷却して水溶液状にして回収した。当該サンプルをＴｒｉｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（０．２５％）液にて細胞に分散し、細胞を回収した。次いでＤＭＥＭにて４℃で３回遠心洗浄し（１８００ｒｐｍ、１５分）、それぞれのサンプルを凍結保存した。当該サンプルをＧｌｙｃｏＴｅｃｈｎｉｃａ ＬｔｄによるＧｌｙｃａｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｒｖｉｃｅによって委託解析した。具体的には、融解したサンプルから細胞膜タンパク質を抽出し、タンパク質をＢＣＡ法（ＴａＫａＲａ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）により、当該膜タンパク質濃度を測定した。測定したタンパク質濃度をもとにＰＢＳＴｘを加えてタンパク質濃度が１０μｇ／ｍＬになるように希釈した。１００μｇのＣｙ３ Ｍｏｎｏ－ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｄｙｅ Ｐａｃｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号：ＰＡ２３０１１）を含むチューブに１００μＬのサンプル（１０μｇ／ｍＬの濃度）を加え、ピペットで混和しスピンダウンした。チューブを遮光袋に入れて、室温（２５℃）で１時間インキュベートした。
次いで、Ｄｅｓａｌｔ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（商標）０．５ｍｌ（２５カラム）（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：８９８８２）スピンカラムを２ｍＬチューブに入れ、１５００×ｇ、４℃で１分間遠心し、遊離のＣｙ３を除去した。３００μＬのＴＢＳをカラムに添加し、１５００×ｇ、４℃で１分間遠心し、このプロセスを３回繰り返した。カラムを新しい１．５ｍＬチューブに入れ、ラベル付きサンプル（１００μＬ）をカラムに加え１５００×ｇ、４℃で２分間遠心した。
【0112】
サンプルを回収し、２μｇ／ｍＬの濃度で５００μＬのサンプル量を得るために４０５μＬのProbing Solution（Glyco Technica）を加えた。すべてのサンプルは、Probing Solutionを使用して２μｇ／ｍＬから１５．６２５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度に希釈した。その後、LecChip Ver.1.0（商標、Glyco technica）をProbing Solutionで３回洗浄した後、サンプルをLecChip に６０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。LecChip上のサンプルを２０℃で約１３時間反応させた。GlycoLite2200（（商標）、Glyco technica）によりLecChipTMの蛍光パターンを累積４回、露光時間、１９９６、２９９５、３９９３、４９９２、６９８８、９９８４（ミリ秒）、カメラゲインを固定値で測定した。得られた４５レクチンのシグナルをGlycoStaion（登録商標） ToolsPro Suite 1.5（GlycoStaion（商標）ToolsPro Suite 1.5.）によって計測し、A. Kuno et al., J. of Proteomics & Bioinformatics, Vol.1, May 2008, p.68.に基づいて４５レクチンの平均強度で除した値に、１００を乗じて平均正規化した。以上の方法で得られた軟骨細胞培養物中を構成する細胞の細胞表面のＳＮＡ、ＳＳＡおよびＴＪＡ－Ｉ、ＵＥＡ－１に対するシグナル強度の結果を表８および図３～図６に示す。表中の最上段に記載の１４～１２６の数字は、回収したサンプルの培養日数を示す。
【0113】
【表8】
【0114】
表８および図３～図６から、実施例１において、ＳＮＡ、ＳＳＡおよびＴＪＡ－Ｉなどのα２－６シアル酸結合レクチン、およびＵＥＡ－１などのα１－２フコース結合レクチンのシグナルが、培養日数に応じて増強することが分かる。ＳＮＡ、ＳＳＡおよびＴＪＡ－Ｉに反応するα２－６シアル酸は、分化ポテンシャルが高い間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）または軟骨前駆細胞などの体性幹細胞のマーカーであり（ＷＯ２０１６／００６７１２Ａ１）、ＵＥＡ－１などのα１－２フコース結合レクチンは、多能性幹細胞のマーカーであることが知られている（Wang et al., Cell Res. 2011 Nov;21(11):1551-63. doi: 10.1038/cr.2011.148. Epub 2011 Sep 6.）。実施例１で作製された軟骨細胞培養物では、培養日数に伴ってＳＮＡ、ＳＳＡ、ＴＪＡ－ＩおよびＵＥＡ－１に反応するα２－６シアル酸およびα１－２フコースの増加が確認されたことから、当該組織培養物は、分化ポテンシャルが高い体性幹細胞および多能性幹細胞を多く含むことが分かった。したがって、実施例１の軟骨細胞培養物は高い組織再生力を有する組織培養物であることが明らかとなった。
【0115】
２．ＴＧＰゲルのヒアルロン酸の保持試験
［実施例２］
ヒアルロン酸（帝人ファーマ(株）５ｍｇをＤＭＥＭに抗生物質（gentamicin(50μg/ml), amphotericin(0.25μg/ml), penicillin(100 Units/ml)/streptomycin(100 μg/ml)及びL-Ascorbic acid(5mg/ml)含有した溶液２．５ｍｌに溶解し、これを液体組成１および２とした。
製造例１で作製したＴＧＰ１ｇを℃でＤＭＥＭ９ｍｌに溶解して１０％ＴＧＰ溶液を作成し、ここに液体組成１および２と同じヒアルロン酸濃度になるようにヒアルロン酸を添加し、ＴＧＰ溶液中のヒアルロン酸が均一になるように振盪した。ＴＧＰ溶液を３７℃でゲル化し、次いで、液体培地（ＤＭＥＭ）１．０ｍｌ添加し、これをＴＧＰ組成１およびＴＧＰ組成２とした。
［実施例２］
ヒアルロン酸（帝人ファーマ(株）５ｍｇをＤＭＥＭに抗生物質（gentamicin(50μg/ml), amphotericin(0.25μg/ml), penicillin(100 Units/ml)/streptomycin(100 μg/ml)及びL-Ascorbic acid(5mg/ml)含有した溶液２．５ｍｌに溶解し、これを液体組成１および２とした。
製造例１で作製したＴＧＰ１ｇを℃でＤＭＥＭ９ｍｌに溶解して１０％ＴＧＰ溶液を作成し、ここに液体組成１および２と同じヒアルロン酸濃度になるようにヒアルロン酸を添加し、ＴＧＰ溶液中のヒアルロン酸が均一になるように振盪した。ＴＧＰ溶液を３７℃でゲル化し、次いで、液体培地（ＤＭＥＭ）１．０ｍｌ添加し、これをＴＧＰ組成１およびＴＧＰ組成２とした。
【0116】
作成したヒアルロン酸含有の液体組成およびＴＧＰ組成を、３７℃、５％炭酸ガスインキュベータに入れ、各液体培地部分に含まれるヒアルロン酸濃度を上述の＜ヒアルロン酸の測定＞と同じ方法にて計測した。結果を表９に示す。
【表9】
【0117】
液体組成1および２では、７日目にヒアルロン酸が、約１３０００ｎｇ／ｍｌ存在していたが、２１日目には５．６ｎｇ／ｍｌにまで減少した。これに対して、ＴＧＰ組成１および２では、７日目の時点で６．１および１１．４ｎｇ／ｍｌであり、これは液体組成１および２に対して約１／１０００の低い濃度に当たることから、ＴＧＰゲル内部にヒアルロン酸の殆どが保持されていたことが認められる。さらに２１目においても１０．３および１１．５ｎｇ／ｍｌであり、その濃度が殆ど変化しなかったことから、ＴＧＰゲルはヒアルロン酸が分解されずに長期安定して保持する能力を有することが明らかとなった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】