ホーム > 特許ランキング > 国立大学法人 東京大学
7578988温度応答性を有する薬物－ポリマー結合体および該結合体の薬物デリバリーへの応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-29
(45)【発行日】2024-11-07
(54)【発明の名称】温度応答性を有する薬物－ポリマー結合体および該結合体の薬物デリバリーへの応用
(51)【国際特許分類】
A61K 47/59 20170101AFI20241030BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20241030BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241030BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20241030BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241030BHJP
B82Y 5/00 20110101ALI20241030BHJP
【ＦＩ】
A61K47/59
A61K9/107
A61K31/7088
A61K31/7105
A61K48/00 ZNA
B82Y5/00
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2021535327
(86)(22)【出願日】2020-07-27
(86)【国際出願番号】 JP2020028698
(87)【国際公開番号】W WO2021020342
(87)【国際公開日】2021-02-04
【審査請求日】2023-06-16
(31)【優先権主張番号】62/878,970
(32)【優先日】2019-07-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２５年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、研究成果展開事業 センター・オブ・イノベーション（ＣＯＩ）プログラム、ＣＯＩ拠点「スマートライフケア社会への変革を先導するものづくりオープンイノベーション拠点」、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100122471
【弁理士】
【氏名又は名称】籾井 孝文
(74)【代理人】
【識別番号】100150212
【弁理士】
【氏名又は名称】上野山 温子
(72)【発明者】
【氏名】宮田 完二郎
(72)【発明者】
【氏名】キム，ボブス
(72)【発明者】
【氏名】大澤 重仁
(72)【発明者】
【氏名】内藤 瑞
(72)【発明者】
【氏名】茶谷 洋行
【審査官】榎本 佳予子
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１９－０３８７８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】TANG Zhonglan et al.，Non-Cross-Linking Aggregation of DNA-Carrying Polymer Micelles Triggered by Duplex Formation，Langmuir，2018年12月31日，Vol.34, No.49，p.14899-14910
【文献】位高 啓史ほか，機能性と炎症制御を両立させたナノキャリアによる肺への遺伝子導入，第３３回 日本バイオマテリアル学会大会 予稿集，2011年12月31日，p.215
【文献】中山 正道、岡野 光夫，インテリジェントバイオマテリアルとＤＤＳ，医学のあゆみ，2004年08月28日，Vol.210, No.9，p.721-725
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２
Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ｂ８２Ｙ ５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
温度応答性ポリマーセグメントと、該温度応答性ポリマーセグメントの端部に結合した薬物と、を含み、温度応答性を有する薬物－ポリマー結合体を含む凝集体であって、該温度応答性ポリマーセグメントが、
（ａ）下記式（Ｉ）で表されるオキサゾリン系繰り返し単位（式（Ｉ）中、Ｒ １ は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基またはｎ－ブチル基である）、
（ｂ）下記式（ＩＩ）で表されるＮ－アルキルアクリルアミド系繰り返し単位（式（ＩＩ）中、Ｒ ２ は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基またはｔ－ブチル基である）、
（ｃ）下記式（ＩＩＩ）で表されるＮ－ビニルアルキルアミド系繰り返し単位（式（ＩＩＩ）中、Ｒ ３ は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基またはｔ－ブチル基である）、および
（ｄ）下記式（ＩＶ）で表されるビニルアルキルエーテル系繰り返し単位（式（ＩＶ）中、Ｒ ４ は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基またはイソプロピル基である）、
から選択される少なくとも１種の繰り返し単位を含み、
【化1】
該薬物が、核酸であり、
流体力学的直径が４０ｎｍ～３００ｎｍであり、
該温度応答性ポリマーセグメントが内側に配置され、該薬物が外側に配置された、ミセル状凝集体。
【請求項2】
前記温度応答性ポリマーセグメントが、前記式（Ｉ）で表されるオキサゾリン系繰り返し単位および／または式（ＩＩ）で表されるＮ－アルキルアクリルアミド系繰り返し単位を含む、請求項１に記載のミセル状凝集体。
【請求項3】
前記温度応答性ポリマーセグメントの分子量が、１．０×１０
４
以上である、請求項１または２に記載のミセル状凝集体。
【請求項4】
前記下限臨界溶解温度が、０℃～３５℃の範囲内である、請求項１から３のいずれかに記載のミセル状凝集体。
【請求項5】
前記薬物が、アンチセンスオリゴ核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ヘテロ核酸、ＣｐＧオリゴ、核酸アプタマーおよびデコイ核酸から選択される少なくとも１種の核酸である、請求項１から４のいずれかに記載のミセル状凝集体。
【請求項6】
請求項１から５のいずれかに記載のミセル状凝集体を含む、医薬組成物。
【請求項7】
吸入剤である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
経鼻投与または気管内投与用である、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記薬物－ポリマー結合体を、前記下限臨界溶解温度以下の温度で水性媒体に溶解して、薬物－ポリマー結合体溶液を得ること、および、該薬物－ポリマー結合体溶液を、前記下限臨界溶解温度を超える温度に加温して、該薬物－ポリマー結合体を凝集させること、を含む、請求項１から５のいずれかに記載のミセル状凝集体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、温度応答性を有する薬物－ポリマー結合体および該結合体の薬物デリバリーへの応用に関する。より具体的には、本発明は、温度応答性を有する薬物－ポリマー結合体ならびに該薬物－ポリマー結合体を含むミセル状凝集体およびその使用または製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ホスホロチオエート結合および架橋型核酸（ＬＮＡまたはＢＮＡ）を含む化学修飾アンチセンスオリゴ核酸（ＡＳＯ）は、酵素分解に対する高い耐性および遺伝子ノックダウンを可能とする標的ＲＮＡへの高い親和性を有することから、がん等の様々な難治性疾患の有望な治療薬候補の１つである。
【0003】
また、気管内投与は、他の組織または器官に分散させることなく、薬物を肺に送達および濃縮する方法として有望である。
【0004】
しかしながら、単体の化学修飾アンチセンスオリゴ核酸（ｎａｋｅｄ ＡＳＯ）を、気管を介してマウスに吸入させても、肝臓および腎臓に集積してしまい、肺において有意な遺伝子ノックダウンを示すことができないことが報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１２，２１６３－２１６８，Ｄｅｃ．２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その主たる目的は、肺に効率的に薬物を送達する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の１つの局面によれば、温度応答性を有する薬物－ポリマー結合体であって、温度応答性ポリマーセグメントと、該温度応答性ポリマーセグメントの端部に結合した薬物と、を含み、下限臨界溶解温度を有する、薬物－ポリマー結合体が提供される。
１つの実施形態において、上記温度応答性ポリマーセグメントの分子量が、１．０×１０４以上である。
１つの実施形態において、上記下限臨界溶解温度が、０℃～３５℃の範囲内である。
１つの実施形態において、上記薬物が、核酸およびペプチドから選択される少なくとも１種である。
１つの実施形態において、上記薬物が、アンチセンスオリゴ核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ヘテロ核酸、ＣｐＧオリゴ、核酸アプタマーおよびデコイ核酸から選択される少なくとも１種の核酸である。
本発明の別の局面によれば、上記薬物－ポリマー結合体の凝集体であって、上記温度応答性ポリマーセグメントが内側に配置され、上記薬物が外側に配置された、ミセル状凝集体が提供される。
１つの実施形態において、上記ミセル状凝集体の流体力学的直径が１０ｎｍ～３００ｎｍである。
本発明のさらに別の局面によれば、上記薬物－ポリマー結合体または上記ミセル状凝集体を含む、医薬組成物が提供される。
１つの実施形態において、上記医薬組成物は、吸入剤である。
本発明のさらに別の局面によれば、上記医薬組成物を、処置を必要とする個体に経鼻投与または気管内投与することを含む、上記医薬組成物の肺への送達方法が提供される。
本発明のさらに別の局面によれば、上記薬物－ポリマー結合体を、上記下限臨界溶解温度以下の温度で水性媒体に溶解して、薬物－ポリマー結合体溶液を得ること、および、該薬物－ポリマー結合体溶液を、上記下限臨界溶解温度を超える温度に加温して、該薬物－ポリマー結合体を凝集させること、を含む、上記ミセル状凝集体の製造方法が提供される。
１つの実施形態において、上記温度応答性ポリマーセグメントの分子量が、１．０×１０４以上である。
１つの実施形態において、上記下限臨界溶解温度が、０℃～３５℃の範囲内である。
１つの実施形態において、上記薬物が、核酸およびペプチドから選択される少なくとも１種である。
１つの実施形態において、上記薬物が、アンチセンスオリゴ核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ヘテロ核酸、ＣｐＧオリゴ、核酸アプタマーおよびデコイ核酸から選択される少なくとも１種の核酸である。
本発明の別の局面によれば、上記薬物－ポリマー結合体の凝集体であって、上記温度応答性ポリマーセグメントが内側に配置され、上記薬物が外側に配置された、ミセル状凝集体が提供される。
１つの実施形態において、上記ミセル状凝集体の流体力学的直径が１０ｎｍ～３００ｎｍである。
本発明のさらに別の局面によれば、上記薬物－ポリマー結合体または上記ミセル状凝集体を含む、医薬組成物が提供される。
１つの実施形態において、上記医薬組成物は、吸入剤である。
本発明のさらに別の局面によれば、上記医薬組成物を、処置を必要とする個体に経鼻投与または気管内投与することを含む、上記医薬組成物の肺への送達方法が提供される。
本発明のさらに別の局面によれば、上記薬物－ポリマー結合体を、上記下限臨界溶解温度以下の温度で水性媒体に溶解して、薬物－ポリマー結合体溶液を得ること、および、該薬物－ポリマー結合体溶液を、上記下限臨界溶解温度を超える温度に加温して、該薬物－ポリマー結合体を凝集させること、を含む、上記ミセル状凝集体の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【0008】
本発明においては、温度応答性を有する薬物－ポリマー結合体を用いることにより、水性媒体中で温度依存的に当該結合体の凝集体を形成させることができる。当該凝集体は、経鼻投与または気管内投与によって経肺的に吸収され、肺組織に好適に滞留し得ることから、肺への効率的な薬物の送達が実現され得る。また、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー等のカチオン性物質を用いた従来の薬物送達システムでは、細胞膜およびミトコンドリア膜との相互作用やタンパク質との非特異的な吸着等に起因する細胞毒性の可能性が懸念されるが、本発明の薬物－ポリマー結合体によれば、カチオン性材料を用いることなく、ミセル状凝集体を形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1A】本発明の１つの実施形態の概要を説明する概略図である。
【図1B】薬物－ポリマー結合体の変形例を説明する概略図である。
【図2】ＡＳＯに対するＰＯＸのモル比（ＰＯＸ／ＡＳＯ）を種々に変化させて調製したＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯのアガロースゲル電気泳動のゲル写真である。ＰＯＸ／ＡＳＯ＝０、１、２、３、５または１０におけるコンジュゲーション率はそれぞれ、０％、２７．４％、６６．８％、８５．２％、９３．５％または９８．８％であった。
【図3】（ａ）波長２８０ｎｍで検出した精製前のｎａｋｅｄ ＡＳＯ（ＤＢＣＯ－ＡＳＯ）とＰＯＸ－ＡＳＯ（ＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯ）のＳＥＣチャートである。（ｂ）波長２１５ｎｍで検出した精製前および精製後のＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯ（ＰＯＸ／ＡＳＯ＝１０）のＳＥＣチャートである。
【図4】１０μＭ ＡＳＯ濃度で温度を変化させながら行った静的光散乱測定で決定した相対散乱光強度を示すグラフである。結果は平均値±標準偏差で表す（ｎ＝３）。
【図5】３７℃および１０μＭ ＡＳＯ濃度のＤＬＳ測定で決定した、ＡＳＯボールのサイズ分布ヒストグラムである。
【図6】（ａ）３７℃および１μＭ ＡＳＯ濃度で調製したＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯボールのＴＥＭ画像である。（ｂ）４℃および１μＭ ＡＳＯ濃度で調製したＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯのＴＥＭ画像である。図中、スケールバーは１００ｎｍを表す。
【図7】ＦＣＳ分析によって決定した、ＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯの流体力学的直径の濃度依存的変化を示すグラフである。結果は平均値±標準偏差で表す（サンプリング時間：１０秒および繰り返し回数：２０）。
【図8】Ａ５４９－Ｌｕｃ細胞に関して、ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイから決定した、非コンジュゲートａｓＴＵＧ１またはａｓＴＵＧ１ボールを用いたトランスフェクション後４８時間におけるＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。結果は平均値±標準偏差で表す（ｎ＝４；＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図9】Ｐａｎｃ１細胞に関して、ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイから決定した、非コンジュゲートａｓＴＵＧ１またはａｓＴＵＧ１ボールを用いたトランスフェクション後４８時間におけるＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。結果は平均値±標準偏差で表す（ｎ＝４；＊ｐ＜０．０５）。
【図10】Ａ５４９－Ｌｕｃ細胞に関して、蛍光強度から決定した、非コンジュゲートＡＳＯ－ＡＦ６またはＡＳＯ－ＡＦ６ボールを用いたトランスフェクション後６時間における細胞取り込み効率を示すグラフである。結果は平均値±標準偏差で表す（ｎ＝４；＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図11】Ａ５４９－Ｌｕｃ細胞に関して、ａｓＣＴＲＬボールを用いたトランスフェクション後４８時間における細胞生存率を示すグラフである。結果は平均値±標準偏差で表す（ｎ＝４）。
【図12】切除した器官および組織のＩＶＩＳによるｅｘ ｖｉｖｏ画像である。
【図13】マイクロプレートリーダー測定によるホモジナイズした器官（肝臓、脾臓、腎臓、心臓および肺）および腫瘍の投与後２４時間における蛍光強度を示すグラフである。結果は平均値±標準偏差で表す（ｎ＝４；＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図14】ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイで求めた、投与後７２時間の腫瘍におけるＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。結果は平均値±標準偏差で表す（ｎ＝４；＊＊ｐ＜０．０１）。
【図15】３７℃および５μＭ ＡＳＯ濃度のＤＬＳ測定で決定した、ＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯから調製されたＡＳＯボールおよびＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯへのＰＯＸ（３０ｋ）添加後に調製されたＡＳＯボールのサイズ分布ヒストグラムである。
【図16】マイクロプレートリーダー測定によるホモジナイズした器官（肝臓、脾臓、腎臓、心臓および肺）の気管内投与後２４時間における蛍光強度を示すグラフである。結果は平均値±標準偏差で表す（ｎ＝３；＊ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下、本発明の好ましい実施形態について説明するが、本発明はこれらの実施形態には限定されない。また、各実施形態は、適宜組み合わせることができる。
【0011】
図１Ａは、本発明の１つの実施形態の概要を説明する概略図である。図１Ａに例示される温度応答性を有する薬物－ポリマー結合体（薬物－ポリマーコンジュゲート）１０は、温度応答性ポリマーセグメント１２と温度応答性ポリマーセグメント１２の一方の端部に結合した薬物１４とを含み、下限臨界溶液温度（Ｌｏｗｅｒ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、以下「ＬＣＳＴ」）を有する。具体的には、温度応答性を有する薬物－ポリマー結合体１０は、ＬＣＳＴ以下の温度条件下では水和して水に可溶化する一方で、ＬＣＳＴを超える温度条件下では脱水和して水に不溶化（難溶化）するという可逆的な相転移を示す。よって、薬物－ポリマー結合体１０は、水性媒体中において、ＬＣＳＴ以下の温度では水和して溶解した状態であるが、ＬＣＳＴを超える温度では、脱水和して分子間および／または分子内の疎水性相互作用によって凝集し、温度応答性ポリマーセグメント１２部分が内側に、薬物１４部分が外側になるように配置されたミセル状凝集体２０を形成することができる。ミセル状凝集体２０は効率的に経肺吸収され得、また、薬物１４を単体で投与した場合に比べて経肺吸収後の血中への移行が抑制されて、肺組織に良好に滞留し得ることから、肺への効率的な薬物の送達が実現され得る。
【0012】
Ａ．薬物－ポリマー結合体
本発明の実施形態による薬物－ポリマー結合体（コンジュゲート）は、温度応答性ポリマーセグメントと、当該温度応答性ポリマーセグメントの端部に結合した薬物と、を含み、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を有する、温度応答性の薬物－ポリマー結合体である。
本発明の実施形態による薬物－ポリマー結合体（コンジュゲート）は、温度応答性ポリマーセグメントと、当該温度応答性ポリマーセグメントの端部に結合した薬物と、を含み、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を有する、温度応答性の薬物－ポリマー結合体である。
【0013】
図１Ａに示される薬物－ポリマー結合体１０は、温度応答性ポリマーセグメント１２と、当該温度応答性ポリマーセグメント１２の一方の端部に結合した薬物１４と、を含む。本実施形態の薬物－ポリマー結合体１０は、式：Ａ－Ｂで表され得る（式中、Ａは温度応答性ポリマーセグメントを表し、Ｂは薬物を表す）。上記の通り、本実施形態の薬物－ポリマー結合体１０は、ＬＣＳＴを超える温度の水性媒体中で、温度応答性ポリマーセグメント１２を内側に向け、薬物１４を外側に向けて凝集したミセル状凝集体２０を形成し得る。
【0014】
本発明の実施形態による薬物－ポリマー結合体は、ＬＣＳＴを有し、かつ、ＬＣＳＴを超える温度の水性媒体中で、温度応答性ポリマーセグメント部分が内側に、薬物部分が外側になるように配置されたミセル状凝集体を形成し得る限りにおいて、図１Ａに示される構成に限定されない。
【0015】
例えば、本発明の実施形態による薬物－ポリマー結合体の変形例を図１Ｂに示す。図１Ｂに示される薬物－ポリマー結合体１０’は、温度応答性ポリマーセグメント１２と、当該温度応答性ポリマーセグメントの一方の端部に結合した第１の薬物１４ａと、他方の端部に結合した第２の薬物１４ｂとを含む。本実施形態の薬物－ポリマー結合体１０’は、式：Ｂ１－Ａ－Ｂ２で表され得る（式中、Ａは温度応答性ポリマーセグメントを表し、Ｂ１は第１の薬物を表し、Ｂ２は第２の薬物を表す）。第１の薬物と第２の薬物は、本発明の効果が得られる限りにおいて、同じであってもよく、異なっていてもよい。
【0016】
また、図１Ｂに示される薬物－ポリマー結合体１０’’は、薬物１４と、当該薬物１４の一方の端部に結合した第１の温度応答性ポリマーセグメント１２ａと、他方の端部に結合した第２の温度応答性ポリマーセグメント１２ｂとを含む。本実施形態の薬物－ポリマー結合体１０’’は、式：Ａ１－Ｂ－Ａ２で表され得る（式中、Ａ１は第１の温度応答性ポリマーセグメントを表し、Ａ２は第２の温度応答性ポリマーセグメントを表し、Ｂは薬物を表す）。第１の温度応答性ポリマーセグメントと第２の温度応答性ポリマーセグメントは、本発明の効果が得られる限りにおいて、同じ構成であってもよく、異なる構成であってもよい。
【0017】
本発明の実施形態による薬物－ポリマー結合体によれば、ＬＣＳＴを超える温度の水性媒体中で、ポリマーセグメント部分が内側に、薬物部分が外側になるように配置されたミセル凝集体が自己集合的に形成され得る。したがって、ＬＣＳＴ以下の温度で薬物－ポリマー結合体を水性媒体に溶解して薬物－ポリマー結合体溶液を調製および必要に応じて保存し、使用の際に、当該薬物－ポリマー結合体溶液をＬＣＳＴを超える温度に加温することによって、容易に、かつ、アルコール、エステル、ケトン等の有機溶媒を用いることなく完全に水系で、ミセル状凝集体を調製することができる。
【0018】
１つの実施形態において、薬物－ポリマー結合体は、例えば０℃～４０℃、好ましくは０℃～３５℃、より好ましくは０℃～３０℃（例えば、０℃～２５℃、０℃～２０℃、０℃～１５℃）の範囲内にＬＣＳＴを有する。本実施形態によれば、ＬＣＳＴを超える温度でミセル状凝集体を調製し、得られたミセル状凝集体を個体に投与することができる。なお、ＬＣＳＴは、一般に、凝集体形成に十分な濃度（例えば臨界会合濃度以上）で調製されたサンプル溶液の濁度あるいは散乱光強度測定によって求めることができる。すなわち、薬物－ポリマー結合体のＬＣＳＴを求める場合、低温で調製した薬物－ポリマー結合体溶液を昇温しながら濁度あるいは散乱光強度を測定することで、濁度あるいは散乱光強度が急激に上昇し始める温度をＬＣＳＴとして決定することができる。
【0019】
１つの実施形態において薬物－ポリマー結合体は、投与対象の個体の体温－５℃～投与対象の個体の体温の範囲内にＬＣＳＴを有する。本実施形態によれば、薬物－ポリマー結合体溶液を個体に投与し、個体の体内でミセル状凝集体を形成させることができる。
【0020】
１つの実施形態において、薬物－ポリマー結合体は、４℃以下または１０℃以下の水中では水和状態であり、水に可溶である一方で、２０℃以上、２５℃以上または３０℃以上の水中では脱水和状態であり、当該水温での臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）以上の濃度においてミセル状に凝集し得る。
【0021】
薬物－ポリマー結合体のＬＣＳＴは、温度応答性ポリマーセグメントを構成する温度応答性ポリマーのＬＣＳＴに対応し得ることから、当該温度応答性ポリマーのＬＣＳＴを調整することによって、所望のＬＣＳＴを有する薬物－ポリマー結合体が得られ得る。
【0022】
Ａ－１．温度応答性ポリマーセグメント
温度応答性ポリマーセグメントを構成する温度応答性ポリマーとしては、薬物－ポリマー結合体に所望のＬＣＳＴを付与し得る限りにおいて、任意の適切な温度応答性ポリマーが用いられ得る。１つの実施形態において、当該温度応答性ポリマーは、例えば０℃～４０℃、好ましくは０℃～３５℃、より好ましくは０℃～３０℃（例えば、０℃～２５℃、０℃～２０℃、０℃～１５℃）の範囲内にＬＣＳＴを有する。このような範囲内にＬＣＳＴを有する温度応答性ポリマーを用いることにより、上記所望の範囲内にＬＣＳＴを有する薬物－ポリマー結合体が好適に得られ得る。
温度応答性ポリマーセグメントを構成する温度応答性ポリマーとしては、薬物－ポリマー結合体に所望のＬＣＳＴを付与し得る限りにおいて、任意の適切な温度応答性ポリマーが用いられ得る。１つの実施形態において、当該温度応答性ポリマーは、例えば０℃～４０℃、好ましくは０℃～３５℃、より好ましくは０℃～３０℃（例えば、０℃～２５℃、０℃～２０℃、０℃～１５℃）の範囲内にＬＣＳＴを有する。このような範囲内にＬＣＳＴを有する温度応答性ポリマーを用いることにより、上記所望の範囲内にＬＣＳＴを有する薬物－ポリマー結合体が好適に得られ得る。
【0023】
温度応答性ポリマーの具体例としては、
（ａ）下記式（Ｉ）で表されるオキサゾリン系繰り返し単位（式（Ｉ）中、Ｒ１は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基またはｎ－ブチル基であり、好ましくはｎ－プロピル基、イソプロピル基またはｎ－ブチル基である）、
（ｂ）下記式（ＩＩ）で表されるＮ－アルキルアクリルアミド系繰り返し単位（式（ＩＩ）中、Ｒ２は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基またはｔ－ブチル基であり、好ましくはｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基またはｔ－ブチル基である）、
（ｃ）下記式（ＩＩＩ）で表されるＮ－ビニルアルキルアミド系繰り返し単位（式（ＩＩＩ）中、Ｒ３は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基またはｔ－ブチル基であり、好ましくはｎ－プロピル基またはイソプロピル基である）、および
（ｄ）下記式（ＩＶ）で表されるビニルアルキルエーテル系繰り返し単位（式（ＩＶ）中、Ｒ４は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基またはイソプロピル基であり、好ましくはメチル基またはエチル基である）、
から選択される少なくとも１種の繰り返し単位を含む温度応答性ポリマーが挙げられる。温度応答性ポリマーは、下記式（Ｉ）～（ＩＶ）で表される繰り返し単位を１種のみ含んでいてもよく、２種以上含んでいてもよい。また、本発明の効果が得られる範囲において、式（Ｉ）～（ＩＶ）で表される繰り返し単位以外の繰り返し単位を含んでいてもよい。
（ａ）下記式（Ｉ）で表されるオキサゾリン系繰り返し単位（式（Ｉ）中、Ｒ１は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基またはｎ－ブチル基であり、好ましくはｎ－プロピル基、イソプロピル基またはｎ－ブチル基である）、
（ｂ）下記式（ＩＩ）で表されるＮ－アルキルアクリルアミド系繰り返し単位（式（ＩＩ）中、Ｒ２は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基またはｔ－ブチル基であり、好ましくはｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基またはｔ－ブチル基である）、
（ｃ）下記式（ＩＩＩ）で表されるＮ－ビニルアルキルアミド系繰り返し単位（式（ＩＩＩ）中、Ｒ３は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基またはｔ－ブチル基であり、好ましくはｎ－プロピル基またはイソプロピル基である）、および
（ｄ）下記式（ＩＶ）で表されるビニルアルキルエーテル系繰り返し単位（式（ＩＶ）中、Ｒ４は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基またはイソプロピル基であり、好ましくはメチル基またはエチル基である）、
から選択される少なくとも１種の繰り返し単位を含む温度応答性ポリマーが挙げられる。温度応答性ポリマーは、下記式（Ｉ）～（ＩＶ）で表される繰り返し単位を１種のみ含んでいてもよく、２種以上含んでいてもよい。また、本発明の効果が得られる範囲において、式（Ｉ）～（ＩＶ）で表される繰り返し単位以外の繰り返し単位を含んでいてもよい。
【化1】
【0024】
重合度を制御しやすく、また、単分散性の高いポリマーが得られ易いことから、オキサゾリン系繰り返し単位を含むポリ（オキサゾリン）系温度応答性ポリマーが好ましい。ポリ（オキサゾリン）系温度応答性ポリマーの具体例としては、ポリ（２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン）、ポリ（２－イソプロピル－２－オキサゾリン）およびポリ（２－ｎ－ブチル－２－オキサゾリン）が好ましく例示できる。
【0025】
温度応答性ポリマーのＬＣＳＴは、重合度が同じである場合、繰り返し単位中のＲ１～Ｒ４の炭素鎖が長いほど低温側にシフトする傾向にある。また、温度応答性ポリマーのＬＣＳＴは、ポリマーに含まれる繰り返し単位の種類および比率が同じである場合、重合度が大きいほど、低温側にシフトする傾向にある。よって、繰り返し単位の種類、比率および重合度を調整することにより、所望のＬＣＳＴを有する温度応答性ポリマーを得ることができる。
【0026】
温度応答性ポリマーの分子量（換言すれば、質量（Ｄａ））は、好ましくは１．０×１０４以上、より好ましくは２．０×１０４以上、さらに好ましくは３．０×１０４以上である。温度応答性ポリマーの分子量の上限は、特に制限されるものではないが、例えば２．０×１０5、また例えば１．０×１０5であり得る。温度応答性ポリマーの分子量が当該範囲内であれば、不溶化した際に十分な疎水的相互作用が得られることから、ミセル状凝集体の形成に有利である。また、分子量が当該範囲内であれば、上記所望の範囲内にＬＣＳＴを有する温度応答性ポリマー（結果として、上記所望の範囲内にＬＣＳＴを有する薬物－ポリマー結合体）が得られ易い。
【0027】
必要に応じて、温度応答性ポリマーセグメントの薬物が結合していない方の末端には、疎水性基が導入されていてもよい。このような疎水性基としては、炭素数１～８のアルキル基またはアルコキシ基、炭素数６～１２のアリール基、アラルキル基、アリールオキシ基またはアラルキルオキシ基等が挙げられる。
【0028】
Ａ－２．薬物
上記薬物としては、水性媒体中で脱水和した温度応答性ポリマーセグメントよりも高い親水性を示す薬物が好ましく用いられる。このような薬物を用いることにより、ＬＣＳＴを超える温度の水性媒体中で、温度応答性ポリマーセグメントが内側に配置されて疎水性コアを形成し、薬物が外側に配置されたミセル状凝集体が容易に得られ得る。また、薬物が中性あるいはアニオン性である場合には、ミセル状凝集体の表面が中性あるいは負に帯電することから、二次的な凝集が抑制されるとともに、正に帯電している場合における生体膜やタンパク質等との所望されない相互作用を防止することができる。
上記薬物としては、水性媒体中で脱水和した温度応答性ポリマーセグメントよりも高い親水性を示す薬物が好ましく用いられる。このような薬物を用いることにより、ＬＣＳＴを超える温度の水性媒体中で、温度応答性ポリマーセグメントが内側に配置されて疎水性コアを形成し、薬物が外側に配置されたミセル状凝集体が容易に得られ得る。また、薬物が中性あるいはアニオン性である場合には、ミセル状凝集体の表面が中性あるいは負に帯電することから、二次的な凝集が抑制されるとともに、正に帯電している場合における生体膜やタンパク質等との所望されない相互作用を防止することができる。
【0029】
上記薬物の分子量（換言すれば、質量（Ｄａ））は、好ましくは１．０×１０３以上、より好ましくは２．０×１０３以上、さらに好ましくは３．０×１０３以上である。薬物の分子量（換言すれば、質量（Ｄａ））の上限は、特に制限されるものではないが、例えば１．０×１０５、また例えば５．０×１０４であり得る。薬物として親水性高分子を用いることにより、親水性高分子で表面が被覆されたミセル状凝集体が得られることから、炎症性の低減および肺への良好な吸収が期待される。
【0030】
１つの実施形態において、上記薬物は、核酸である。核酸としては、プリンまたはピリミジン塩基、ペントース、リン酸からなるヌクレオチドを基本単位とするポリもしくはオリゴヌクレオチドを意味し、オリゴもしくはポリ二本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ二本鎖ＤＮＡ、オリゴもしくはポリ一本鎖ＤＮＡおよびオリゴもしくはポリ一本鎖ＲＮＡを挙げることができる。また、同一の鎖にＲＮＡとＤＮＡが混在したオリゴもしくはポリ２本鎖核酸、オリゴもしくはポリ１本鎖核酸も含まれる。当該核酸に含有されるヌクレオチドは天然型であっても、化学修飾された非天然型のものであっても良く、またアミノ基、チオール基、蛍光化合物などの分子が付加されたものであっても良い。
【0031】
上記核酸の塩基長は、例えば５～１５０、好ましくは１０～１００、さらに好ましくは１２～５０であり得る。
【0032】
上記核酸としては、その機能または作用を考慮すると、アンチセンスオリゴ核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ヘテロ２本鎖核酸、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、核酸アプタマーおよびデコイ核酸等が挙げられる。
【0033】
１つの実施形態において、上記薬物は、ペプチドである。ペプチドとしては、薬物としての生理活性を有する限りにおいて制限はなく、目的に応じて適切に選択され得る。ペプチドは、天然型アミノ酸のみを含むものであってもよく、非天然型アミノ酸を含むものであってもよい。
【0034】
上記ペプチドの分子量（換言すれば、質量（Ｄａ））は、例えば１．０×１０３～１．０×１０４、好ましくは１．０×１０３～５．０×１０３であり得る。
【0035】
Ａ－３．製造方法
上記薬物－ポリマー結合体は、代表的には、温度応答性ポリマーの端部に薬物を結合させることによって得られる。例えば、上記式：Ａ－Ｂで表される薬物－ポリマー結合体は、重合反応により温度応答性ポリマーを合成すること、温度応答性ポリマーの一方の端部に第１の官能基を導入して片末端官能基化温度応答性ポリマーを得ること、第１の官能基と反応し得る第２の官能基を有する薬物を準備すること、および、第１の官能基と第２の官能基とを反応させて、片末端官能基化温度応答性ポリマーと薬物とを結合させること、を含む方法によって得られ得る。
上記薬物－ポリマー結合体は、代表的には、温度応答性ポリマーの端部に薬物を結合させることによって得られる。例えば、上記式：Ａ－Ｂで表される薬物－ポリマー結合体は、重合反応により温度応答性ポリマーを合成すること、温度応答性ポリマーの一方の端部に第１の官能基を導入して片末端官能基化温度応答性ポリマーを得ること、第１の官能基と反応し得る第２の官能基を有する薬物を準備すること、および、第１の官能基と第２の官能基とを反応させて、片末端官能基化温度応答性ポリマーと薬物とを結合させること、を含む方法によって得られ得る。
【0036】
上記第１の官能基と第２の官能基との組合せとしては、これらの官能基の反応によって形成される結合が生体内で開裂可能なものであってもよく、開裂が困難なものであってもよい。当該組み合わせの具体例としては、アジド基とアルキン、チオール基と（メタ）アクリロイル基、チオール基とマレイミド基、チオール基とチオール基、チオール基とカルボキシル基、（メタ）アクリロイル基とヒドロキシル基、（メタ）アクリロイル基とアミノ基、カルボキシル基とアミノ基、カルボキシル基とヒドロキシル基、アミノ基とヒドロキシル基等が挙げられる（言うまでもないが、これらの組合せ中、前者および後者のいずれが第１の官能基であってもよい）。なお、第２の官能基は、薬物に本来内在するものであってもよく、人工的に導入されたものであってもよい。
【0037】
Ｂ．ミセル状凝集体
本発明の実施形態によるミセル状凝集体は、Ａ項に記載の薬物－ポリマー結合体を含む。当該ミセル状凝集体においては、上記温度応答性ポリマーセグメントが内側に配置され、薬物が外側に配置されている。
本発明の実施形態によるミセル状凝集体は、Ａ項に記載の薬物－ポリマー結合体を含む。当該ミセル状凝集体においては、上記温度応答性ポリマーセグメントが内側に配置され、薬物が外側に配置されている。
【0038】
ミセル状凝集体は、Ａ項に記載の薬物－ポリマー結合体に加えて、温度応答性ポリマーをさらに含んでいてもよい。温度応答性ポリマーをさらに含むことにより、凝集体を形成する際の内側部分（コア部分）の体積が増加し、得られるミセル状凝集体の粒子径を増大することができる。このとき、温度応答性ポリマーとしては、粒子径の調整の容易さの観点から、薬物－ポリマー結合体を構成する温度応答性ポリマー（セグメント）と同じ構成を有する温度応答性ポリマーを用いることが好ましい。
【0039】
ミセル状凝集体の粒子径（流体力学的直径、ＤＨ）は、目的に応じて適切に設定され得る。経肺吸収後に肺から体循環に移行することを抑制する観点から、当該粒子径（ＤＨ）は、好ましくは１０ｎｍ～３００ｎｍ、より好ましくは２０ｎｍ～２５０ｎｍ、さらに好ましくは３０ｎｍ～２００ｎｍ、さらにより好ましくは４０ｎｍ～１５０ｎｍである。このような粒子径を有する凝集体によれば、肺において良好な細胞取り込みが行われる一方で、その後の体循環への移行が抑制されることから、効率的かつ局所的に薬物を肺に送達することができる。
【0040】
ミセル状凝集体の多分散指数（ＰＤＩ）は、例えば０．６以下、好ましくは０．４以下、より好ましくは０．２以下、さらに好ましくは０．１５以下である。
【0041】
ミセル状凝集体のゼータ電位は、代表的には５ｍＶ以下であり、好ましくは３ｍＶ以下であり、より好ましくは０ｍＶ以下である。ゼータ電位がこのような範囲内であれば、安定性に優れたミセル状凝集体が得られると共に、生体膜やタンパク質等との所望されない相互作用を防止することができる。
【0042】
ミセル状凝集体は、例えば、ＬＣＳＴ以下の温度、例えばＬＣＳＴよりも１０℃以上低い温度で、Ａ項に記載の薬物－ポリマー結合体（および任意成分としての温度応答性ポリマー）を水性媒体に溶解し、得られた薬物－ポリマー結合体溶液を、ＬＣＳＴを超える温度、好ましくはＬＣＳＴよりも１０℃以上高い温度に加温することによって自己集合的に形成される。水性媒体は、必要に応じて緩衝化されていてもよく、例えばＨＥＰＥＳ緩衝液、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ緩衝液等が用いられ得る。
【0043】
薬物－ポリマー結合体溶液中における薬物－ポリマー結合体の濃度は、ミセル状凝集体が形成される限りにおいて制限されず、通常、凝集体を形成させる際の水温における臨界ミセル濃度以上の濃度であればよい。当該薬物－ポリマー結合体濃度は、例えば１０ｎＭ以上、好ましくは２０ｎＭ以上、より好ましくは４０ｎＭ以上であり得る。
【0044】
Ｃ．医薬組成物
本実施形態による医薬組成物は、Ａ項に記載の薬物－ポリマー結合体またはＢ項に記載のミセル状凝集体を含む。当該医薬組成物は、好ましくはがん、胸膜腫瘍、肺炎、肺結核、胸膜炎、気管支喘息、嚢胞性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患等の肺疾患および、上気道・下気道等を病巣とする微生物（細菌、ウイルス等）の感染症並びにそれに伴う呼吸器不全症候群等の合併症の治療または予防を目的とする。また、本実施形態による医薬組成物は、好ましくは経鼻投与または気管内投与を介して、上気道(鼻腔、咽頭、喉頭)、下気道（気管、気管支、肺）に送達（経肺吸収）される。なお、上記治療または予防の対象となるがんには、肺を原発巣とする肺がんのみならず、他の臓器から肺に転移したがんも含まれる。
本実施形態による医薬組成物は、Ａ項に記載の薬物－ポリマー結合体またはＢ項に記載のミセル状凝集体を含む。当該医薬組成物は、好ましくはがん、胸膜腫瘍、肺炎、肺結核、胸膜炎、気管支喘息、嚢胞性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患等の肺疾患および、上気道・下気道等を病巣とする微生物（細菌、ウイルス等）の感染症並びにそれに伴う呼吸器不全症候群等の合併症の治療または予防を目的とする。また、本実施形態による医薬組成物は、好ましくは経鼻投与または気管内投与を介して、上気道(鼻腔、咽頭、喉頭)、下気道（気管、気管支、肺）に送達（経肺吸収）される。なお、上記治療または予防の対象となるがんには、肺を原発巣とする肺がんのみならず、他の臓器から肺に転移したがんも含まれる。
【0045】
医薬組成物は、投与方法に応じて任意の適切な剤形に調製される。経鼻投与または気管内投与の観点からは、吸入剤であることが好ましく、具体例としては、吸入液剤、吸入エアゾール剤および吸入粉末剤が挙げられる。
【0046】
医薬組成物は、目的に応じて、薬物－ポリマー結合体中の薬物以外の薬物をさらに含んでいてもよい。また、所望の剤形に応じて、任意の適切な添加剤を用いることができる。添加剤は、薬学的に許容され得るものであればよく、例えば賦形剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤等を例示できる。
【0047】
医薬組成物の用量（具体的には、薬物換算の用量）および投与間隔は、肺疾患の種類や病期、処置対象の個体の状態等に応じて適切に設定され得る。
【0048】
Ｄ．送達方法
本発明の別の局面によれば、Ｃ項に記載の医薬組成物を、処置を必要とする個体に経鼻投与または気管内投与することを含む、当該医薬組成物（より具体的には、Ａ項に記載の薬物－ポリマー結合体またはＢ項に記載のミセル状凝集体）の肺への送達方法が提供される。具体的には、上記医薬組成物は、処置が必要な個体に対して、ネブライザー、気管内チューブ、マイクロスプレー等の任意の適切な投与器具を用いて常法に従って経鼻的にまたは気管内に投与されることにより、当該個体の肺に送達され得る。
本発明の別の局面によれば、Ｃ項に記載の医薬組成物を、処置を必要とする個体に経鼻投与または気管内投与することを含む、当該医薬組成物（より具体的には、Ａ項に記載の薬物－ポリマー結合体またはＢ項に記載のミセル状凝集体）の肺への送達方法が提供される。具体的には、上記医薬組成物は、処置が必要な個体に対して、ネブライザー、気管内チューブ、マイクロスプレー等の任意の適切な投与器具を用いて常法に従って経鼻的にまたは気管内に投与されることにより、当該個体の肺に送達され得る。
【0049】
上記処置が必要な個体は、代表的には、ヒト又は非ヒト哺乳類である。
【実施例】
【0050】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【0051】
［試薬・細胞・実験動物等］
（１）アンチセンスオリゴ核酸（ＡＳＯ）として、ホスホロチオエート骨格を有するＡＳＯを用いた（Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ社から購入）。
ＡＳＯの配列は以下の通りである（大文字は架橋型核酸（ＬＮＡ）（ＣはＬＮＡメチルシトシン）を表し、小文字はＤＮＡを表す）。
タウリンアップレギュレート遺伝子１ （ＴＵＧ１）のｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ （ｌｎｃＲＮＡ）を標的とするＡＳＯ（ａｓＴＵＧ１）：５´－ＴＧＡＡｔｔｔｃａａｔｃａｔｔｔｇａＧＡＴ－３´（配列番号：１）
ＧＬ３ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを標的とし、コントロールとして用いられるＡＳＯ（ａｓＣＴＲＬ）：５´－ＴＣＧＡａｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔａａＧＴＴ－３´（配列番号：２）
なお、ａｓＣＴＲＬの５’末端にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）６４７色素を付加したものをＡＳＯ－ＡＦ６と表記する。また、コンジュゲーションの為に、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）を、ａｓＴＵＧ１、ａｓＣＴＲＬまたはＡＳＯ－ＡＦ６の３’末端に付加した。
（２）ルシフェラーゼ発現ヒト肺がん細胞株Ａ５４９－Ｌｕｃは、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入し、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ－１６４０中で培養した。
（３）ヒトすい臓がん細胞株Ｐａｎｃ１はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入し、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシン添加ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。
（４）ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雌性、６週齢）はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｊａｐａｎ （Ｋａｎａｇａｗａ，Ｊａｐａｎ）から購入し、動物実験はすべて東京大学における実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従って行った。
（１）アンチセンスオリゴ核酸（ＡＳＯ）として、ホスホロチオエート骨格を有するＡＳＯを用いた（Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ社から購入）。
ＡＳＯの配列は以下の通りである（大文字は架橋型核酸（ＬＮＡ）（ＣはＬＮＡメチルシトシン）を表し、小文字はＤＮＡを表す）。
タウリンアップレギュレート遺伝子１ （ＴＵＧ１）のｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ （ｌｎｃＲＮＡ）を標的とするＡＳＯ（ａｓＴＵＧ１）：５´－ＴＧＡＡｔｔｔｃａａｔｃａｔｔｔｇａＧＡＴ－３´（配列番号：１）
ＧＬ３ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを標的とし、コントロールとして用いられるＡＳＯ（ａｓＣＴＲＬ）：５´－ＴＣＧＡａｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔａａＧＴＴ－３´（配列番号：２）
なお、ａｓＣＴＲＬの５’末端にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）６４７色素を付加したものをＡＳＯ－ＡＦ６と表記する。また、コンジュゲーションの為に、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）を、ａｓＴＵＧ１、ａｓＣＴＲＬまたはＡＳＯ－ＡＦ６の３’末端に付加した。
（２）ルシフェラーゼ発現ヒト肺がん細胞株Ａ５４９－Ｌｕｃは、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入し、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ－１６４０中で培養した。
（３）ヒトすい臓がん細胞株Ｐａｎｃ１はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入し、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシン添加ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。
（４）ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雌性、６週齢）はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｊａｐａｎ （Ｋａｎａｇａｗａ，Ｊａｐａｎ）から購入し、動物実験はすべて東京大学における実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従って行った。
【0052】
［アジド末端ポリ（２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン）の合成］
以下に示す反応スキームで、アジド末端ポリ（２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン）を合成した。
以下に示す反応スキームで、アジド末端ポリ（２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン）を合成した。
【化2】
【0053】
具体的には、以下の通りである。
まず、４つの異なる分子量、すなわち、分子量がそれぞれ約５ｋ、１０ｋ、２０ｋまたは３０ｋであるポリ（２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン）（ＰＯＸ）を、２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリンのリビングカチオン開環重合によって合成した。
５ｋまたは１０ｋのＰＯＸの合成に関しては、開始剤としてｐ－トルエンスルホン酸メチル（６１．６ｍｇ，０．３３２ｍｍｏｌ）をそれぞれ、５ｍＬまたは１０ｍＬのＣＨ３ＣＮに溶解し、続いて、２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン（１．８３ｇ，１６．２ｍｍｏｌまたは３．６６ｇ，３２．４ｍｍｏｌ）を添加した。
２０ｋまたは３０ｋのＰＯＸの合成に関しては、ｐ－トルエンスルホン酸メチル（６１．６ｍｇ，０．３３２ｍｍｏｌ）を２０ｍＬまたは３０ｍＬのＣＨ３ＣＮとクロロベンゼンとの１：１混合液（体積比）に溶解し、続いて、２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン（７．３２ｇ，６４．８ｍｍｏｌまたは１１．０ｇ，９７．２ｍｍｏｌ）を添加した。
得られた混合液をアルゴン雰囲気下４２℃で、４、７、１２、または１６日間撹拌して、それぞれ約５ｋ、１０ｋ、２０ｋまたは３０ｋの分子量を有するＰＯＸを調製した。
ＮａＮ３（４３２ｍｇ，６．６４ｍｍｏｌ）を混合液に添加し、７０℃で３時間撹拌して反応を終了させた。次いで、混合液をメタノールに対して３回および脱イオン水に対して３回透析し、凍結乾燥によって生成物を白色粉末として回収した。
ｔｒａｎｓ－２－［３－（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）－２－メチル－２－プロペニリデン］マロノニトリルをマトリクスとして用い、トリフルオロ酢酸カリウムをカチオン種として用いたＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ；Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって生成物の特徴づけを行った。得られたＭｗおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
まず、４つの異なる分子量、すなわち、分子量がそれぞれ約５ｋ、１０ｋ、２０ｋまたは３０ｋであるポリ（２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン）（ＰＯＸ）を、２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリンのリビングカチオン開環重合によって合成した。
５ｋまたは１０ｋのＰＯＸの合成に関しては、開始剤としてｐ－トルエンスルホン酸メチル（６１．６ｍｇ，０．３３２ｍｍｏｌ）をそれぞれ、５ｍＬまたは１０ｍＬのＣＨ３ＣＮに溶解し、続いて、２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン（１．８３ｇ，１６．２ｍｍｏｌまたは３．６６ｇ，３２．４ｍｍｏｌ）を添加した。
２０ｋまたは３０ｋのＰＯＸの合成に関しては、ｐ－トルエンスルホン酸メチル（６１．６ｍｇ，０．３３２ｍｍｏｌ）を２０ｍＬまたは３０ｍＬのＣＨ３ＣＮとクロロベンゼンとの１：１混合液（体積比）に溶解し、続いて、２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン（７．３２ｇ，６４．８ｍｍｏｌまたは１１．０ｇ，９７．２ｍｍｏｌ）を添加した。
得られた混合液をアルゴン雰囲気下４２℃で、４、７、１２、または１６日間撹拌して、それぞれ約５ｋ、１０ｋ、２０ｋまたは３０ｋの分子量を有するＰＯＸを調製した。
ＮａＮ３（４３２ｍｇ，６．６４ｍｍｏｌ）を混合液に添加し、７０℃で３時間撹拌して反応を終了させた。次いで、混合液をメタノールに対して３回および脱イオン水に対して３回透析し、凍結乾燥によって生成物を白色粉末として回収した。
ｔｒａｎｓ－２－［３－（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）－２－メチル－２－プロペニリデン］マロノニトリルをマトリクスとして用い、トリフルオロ酢酸カリウムをカチオン種として用いたＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ；Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって生成物の特徴づけを行った。得られたＭｗおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
【0054】
【表1】
【0055】
［Ｎ３－ＰＯＸとＤＢＣＯ－ＡＳＯとの結合体（ＰＯＸ－ＡＳＯ）の調製およびゲル電気泳動］
凍結融解法を用いた銅フリーのクリックケミストリーを利用して、Ｎ３－ＰＯＸとＤＢＣＯ－ＡＳＯとを反応させて結合体（コンジュゲート）を得た。反応スキームを以下に示す。
凍結融解法を用いた銅フリーのクリックケミストリーを利用して、Ｎ３－ＰＯＸとＤＢＣＯ－ＡＳＯとを反応させて結合体（コンジュゲート）を得た。反応スキームを以下に示す。
【化3】
【0056】
ＰＯＸ－ＡＳＯの調製の具体例として、ＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯの調製方法を以下に説明する。
Ｎ３－ＰＯＸ（３０ｋ）を２０ｍｇ／ｍＬの濃度で冷１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３；ＶＷＲ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）に溶解し、次いで、ａｓＴＵＧ１溶液（１ｍｇ／ｍＬ ｉｎ １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）と種々のモル比（［ＡＳＯに含まれるＤＢＣＯのモル濃度］に対する［ＰＯＸに含まれるＮ３のモル濃度］：（ＰＯＸ／ＡＳＯ））で混合した。混合液を－２０℃で一晩冷凍し、４℃で２時間解凍した。これにより、Ｎ３－ＰＯＸ（３０ｋ）とＤＢＣＯ－ＡＳＯとの結合体（ＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯ）を得た。
Ｎ３－ＰＯＸ（３０ｋ）を２０ｍｇ／ｍＬの濃度で冷１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３；ＶＷＲ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）に溶解し、次いで、ａｓＴＵＧ１溶液（１ｍｇ／ｍＬ ｉｎ １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）と種々のモル比（［ＡＳＯに含まれるＤＢＣＯのモル濃度］に対する［ＰＯＸに含まれるＮ３のモル濃度］：（ＰＯＸ／ＡＳＯ））で混合した。混合液を－２０℃で一晩冷凍し、４℃で２時間解凍した。これにより、Ｎ３－ＰＯＸ（３０ｋ）とＤＢＣＯ－ＡＳＯとの結合体（ＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯ）を得た。
【0057】
［ＰＯＸ－ＡＳＯのゲル電気泳動］
４μｇ／ｍＬエチジウムブロマイド含有ＴＡＥバッファー（ｐＨ７．４）にアガロース（１ｗｔ％）を溶解してアガロースゲルを調製した。非コンジュゲートＡＳＯおよびＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯサンプルをゲルにロードし、ＴＡＥバッファー中で電気泳動（１００Ｖ，２０ｍｉｎ）を行った。電気泳動後のゲルをＰｈａｒｏｓＦＸ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で可視化した。結果を図２に示す。
４μｇ／ｍＬエチジウムブロマイド含有ＴＡＥバッファー（ｐＨ７．４）にアガロース（１ｗｔ％）を溶解してアガロースゲルを調製した。非コンジュゲートＡＳＯおよびＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯサンプルをゲルにロードし、ＴＡＥバッファー中で電気泳動（１００Ｖ，２０ｍｉｎ）を行った。電気泳動後のゲルをＰｈａｒｏｓＦＸ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で可視化した。結果を図２に示す。
【0058】
図２に示されるとおり、ＰＯＸ／ＡＳＯの増大に従って遊離のＡＳＯが減少し、結合体化したＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯが増加した。また、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてＡＳＯ由来のバンドを定量化し、ＤＢＣＯ－ＡＳＯのコンジュゲーション率を求めたところ、コンジュゲートされたＡＳＯ量（換言すれば、ＰＯＸ－ＡＳＯ量）は、ＰＯＸ／ＡＳＯの増大に従って増大しており、ＰＯＸ／ＡＳＯ＝１０においては、ほとんど全てのＡＳＯがＰＯＸ（３０ｋ）と結合していた（コンジュゲーション率：９８．８％）。
【0059】
［ＰＯＸ－ＡＳＯの精製およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）］
ＰＯＸ／ＡＳＯ＝１０で調製したＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯサンプルを凍結乾燥し、アセトン中に分散させて過剰なＰＯＸを除去した後、遠心分離によって沈殿物としてＰＯＸ－ＡＳＯを得た。未反応のＰＯＸを含む上清をデカントし、沈殿物を再度アセトン中に分散させ、同じ手順を４回繰り返した。次いで、沈殿物を脱イオン水に溶解し、凍結乾燥した。４℃の１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）を用いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬ ｃｏｌｕｍｎを装着したＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いたＳＥＣに最終生成物を供した。結合体化の前後において波長２８０ｎｍのＵＶでＡＳＯを検出した結果を図３ａに示す。また、精製の前後において波長２１５ｎｍのＵＶでＰＯＸを検出した。結果を図３ｂに示す。
ＰＯＸ／ＡＳＯ＝１０で調製したＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯサンプルを凍結乾燥し、アセトン中に分散させて過剰なＰＯＸを除去した後、遠心分離によって沈殿物としてＰＯＸ－ＡＳＯを得た。未反応のＰＯＸを含む上清をデカントし、沈殿物を再度アセトン中に分散させ、同じ手順を４回繰り返した。次いで、沈殿物を脱イオン水に溶解し、凍結乾燥した。４℃の１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）を用いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬ ｃｏｌｕｍｎを装着したＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いたＳＥＣに最終生成物を供した。結合体化の前後において波長２８０ｎｍのＵＶでＡＳＯを検出した結果を図３ａに示す。また、精製の前後において波長２１５ｎｍのＵＶでＰＯＸを検出した。結果を図３ｂに示す。
【0060】
図３ａに示されるとおり、ＰＯＸ／ＡＳＯ＝１０で調製されたＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯサンプルは、波長２８０ｎｍの吸収に関して、ＤＢＣＯ－ＡＳＯのピークからシフトした単峰性ピークを示した。また、図３ｂに示されるとおり、精製後のＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯサンプルは、波長２１５ｎｍの吸収に関して、明確な単峰性ピークを示した。これらの結果から、Ｎ３－ＰＯＸ（３０ｋ）とＤＢＣＯ－ＡＳＯとのクリックコンジュゲーションおよびＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯの精製が目的通りに進行したことがわかる。
【0061】
［ＰＯＸ－ＡＳＯのミセル状凝集体（ＡＳＯボール）の調製］
精製したＰＯＸ－ＡＳＯコンジュゲートを４℃の１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒに溶解し、同バッファーで目的の濃度（ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究に関しては１０μＭ ＡＳＯ、ｉｎ ｖｉｖｏ研究に関しては４０μＭ ＡＳＯ）まで希釈した。サンプル溶液を４℃で２０分インキュベート後、３７℃で２０分さらにインキュベートして、ＡＳＯボールを調製した。
精製したＰＯＸ－ＡＳＯコンジュゲートを４℃の１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒに溶解し、同バッファーで目的の濃度（ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究に関しては１０μＭ ＡＳＯ、ｉｎ ｖｉｖｏ研究に関しては４０μＭ ＡＳＯ）まで希釈した。サンプル溶液を４℃で２０分インキュベート後、３７℃で２０分さらにインキュベートして、ＡＳＯボールを調製した。
【0062】
［ＡＳＯボールの光散乱分析］
１０μＭのａｓＴＵＧ１を含む、種々のＰＯＸ－ＡＳＯ溶液を低容量石英キュベット（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に添加し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて昇温しながら静的光散乱測定によって散乱光強度を得た。温度は１℃／ｍｉｎで次の設定温度まで上昇させ、２分間平衡化した。散乱光強度を連続的に測定し、各サンプルの初期値（すなわち、４℃での散乱光強度）を基準に規格化した。結果を図４に示す。また、３７℃で、ＡＳＯボールの流体力学直径（ＤＨ）および多分散指数（ＰＤＩ）を動的光散乱（ＤＬＳ）測定によって求め、ゼータ電位を電気泳動光散乱（ＥＬＳ）によって求めた。結果を表２に示す。また、ＤＬＳのヒストグラムを図５に示す。
１０μＭのａｓＴＵＧ１を含む、種々のＰＯＸ－ＡＳＯ溶液を低容量石英キュベット（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に添加し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて昇温しながら静的光散乱測定によって散乱光強度を得た。温度は１℃／ｍｉｎで次の設定温度まで上昇させ、２分間平衡化した。散乱光強度を連続的に測定し、各サンプルの初期値（すなわち、４℃での散乱光強度）を基準に規格化した。結果を図４に示す。また、３７℃で、ＡＳＯボールの流体力学直径（ＤＨ）および多分散指数（ＰＤＩ）を動的光散乱（ＤＬＳ）測定によって求め、ゼータ電位を電気泳動光散乱（ＥＬＳ）によって求めた。結果を表２に示す。また、ＤＬＳのヒストグラムを図５に示す。
【0063】
【表2】
【0064】
図４に示されるとおり、すべてのＰＯＸ－ＡＳＯのサンプル溶液において、約２０℃～４０℃の温度範囲内で相対散乱光強度値の増大が見られた。このことから、これらのＰＯＸ－ＡＳＯはすべて約２０℃～４０℃の温度範囲内にＬＣＳＴを有し、当該ＬＣＳＴにおけるＰＯＸセグメントの親水性から疎水性への転移に起因して凝集体（ＡＳＯボール）が形成されたことがわかる（各ＰＯＸ－ＡＳＯのＬＳＣＴ：５ｋ＝約３０℃、１０ｋ＝約３０℃、２０ｋ＝約２２℃、３０ｋ＝約２０℃）。また、温度の上昇に伴う相対散乱光強度値の増大は、長鎖のＰＯＸセグメントを有するＰＯＸ－ＡＳＯにおいて顕著であった。さらに相対散乱光強度値が徐々に増大し始める温度は、ＰＯＸセグメントの分子量が増大するにつれて低下した。これらの結果から、ＰＯＸセグメントの分子量がＰＯＸ－ＡＳＯの自己集合挙動に影響することが示唆され、これは、おそらく、各ＰＯＸセグメントの疎水性凝集力が分子量に依存して異なることに起因するためと考えられる。
【0065】
また、表２に示されるとおり、比較的短いＰＯＸセグメントを有するＰＯＸ（５ｋ）－ＡＳＯおよびＰＯＸ（１０ｋ）－ＡＳＯから形成されたＡＳＯボールが０．３を超える多分散指数を示した一方で、ＰＯＸ（２０ｋ）－ＡＳＯおよびＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯから形成されたＡＳＯボールは、図５中の単峰性ピークに示されるとおり、０．２未満の低い多分散指数を示し、均一な凝集体が形成されたことがわかる。特に、ＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯから形成されたＡＳＯボールは、０．０８という顕著に低い多分散指数を示した。また、ＡＳＯボールが負のゼータ電位を示すことは、疎水性ＰＯＸセグメントによって形成されたコアと負に帯電したＡＳＯ殻とを有するミセル状凝集体が形成されたことを示す。なお、１００ｎｍを超えるナノ粒子は肺胞マクロファージの食細胞クリアランスの対象となり得ることから、以下の実験は、ＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯから形成された約５０ｎｍサイズのＡＳＯボールを用いて行った。
【0066】
［透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察］
以下のようにして、ＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯから調製されたＡＳＯボールをＴＥＭ観察した。
３７℃または４℃の脱イオン水に溶解した１０μＭのａｓＴＵＧ１濃度であるＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯサンプルの液滴を、炭素被覆コロジオンを備えた銅グリッドメッシュ上に配置し、２ｗｔ％酢酸ウラニル含有５０％メタノールで染色した。ＪＥＭ－１４００（ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用い、１２０ｋＶでＴＥＭ画像（図６ａおよび６ｂ）を得た。
以下のようにして、ＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯから調製されたＡＳＯボールをＴＥＭ観察した。
３７℃または４℃の脱イオン水に溶解した１０μＭのａｓＴＵＧ１濃度であるＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯサンプルの液滴を、炭素被覆コロジオンを備えた銅グリッドメッシュ上に配置し、２ｗｔ％酢酸ウラニル含有５０％メタノールで染色した。ＪＥＭ－１４００（ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用い、１２０ｋＶでＴＥＭ画像（図６ａおよび６ｂ）を得た。
【0067】
図６ａに示されるとおり、３７℃でインキュベートされたＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯサンプル中においては、約５０ｎｍサイズの球状構造体が明確に確認できた。対照的に、４℃でインキュベートされたＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯサンプル中においては、構造体を認識することができなかった（図６ｂ）。これらの観察結果は、光散乱解析から得られた結果と一致する。
【0068】
［蛍光相関分光法（ＦＣＳ）分析］
ＦＣＳ分析によって、ＡＳＯボールの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）およびＡＳＯボール１個あたりのＰＯＸ－ＡＳＯ会合数を求めた。
ＦＣＳ分析は、ＣｏｎｆｏＣｏｒ３モジュールおよびＣ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ４０×水浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０ （Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。
ＡＳＯボールのＣＭＣに関して、１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒに４０μＭ ＡＳＯ濃度で溶解したＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯ－ＡＦ６溶液を、３７℃に静置することでＡＳＯボールサンプルを調製した。各濃度に連続的に希釈したサンプルを８－ウェル Ｌａｂ－Ｔｅｋ ｃｈａｍｂｅｒ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）に移し、励起用の５６１ｎｍ ＤＰＳＳレーザーと発光用の５８８－６９１ｎｍ帯域通過フィルタを用いて蛍光検出を行った。１０秒のサンプリング時間および２０回の繰り返し回数で、拡散時間を得た。Ｃｙ５マレイミド（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）を基準として、得られた拡散時間から拡散係数（ＤＣ）を算出した。Ｓｔｒｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎ式：ＤＨ＝ｋＢＴ／３πηＤＣ （ｋＢ：ボルツマン定数、Ｔ：絶対温度、η：動粘度）に基づいて、ＤＣから流体力学的径（ＤＨ）を算出した。結果を図７に示す。
ＦＣＳ分析によって、ＡＳＯボールの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）およびＡＳＯボール１個あたりのＰＯＸ－ＡＳＯ会合数を求めた。
ＦＣＳ分析は、ＣｏｎｆｏＣｏｒ３モジュールおよびＣ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ４０×水浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０ （Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。
ＡＳＯボールのＣＭＣに関して、１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒに４０μＭ ＡＳＯ濃度で溶解したＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯ－ＡＦ６溶液を、３７℃に静置することでＡＳＯボールサンプルを調製した。各濃度に連続的に希釈したサンプルを８－ウェル Ｌａｂ－Ｔｅｋ ｃｈａｍｂｅｒ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）に移し、励起用の５６１ｎｍ ＤＰＳＳレーザーと発光用の５８８－６９１ｎｍ帯域通過フィルタを用いて蛍光検出を行った。１０秒のサンプリング時間および２０回の繰り返し回数で、拡散時間を得た。Ｃｙ５マレイミド（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）を基準として、得られた拡散時間から拡散係数（ＤＣ）を算出した。Ｓｔｒｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎ式：ＤＨ＝ｋＢＴ／３πηＤＣ （ｋＢ：ボルツマン定数、Ｔ：絶対温度、η：動粘度）に基づいて、ＤＣから流体力学的径（ＤＨ）を算出した。結果を図７に示す。
【0069】
非コンジュゲートＡＳＯ１分子あたりまたはＡＳＯボール１個あたりの蛍光強度（ＣＰＭ）は、非コンジュゲートＡＳＯ－ＡＦ６サンプルまたは９０％ＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯと１０％ＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯ－ＡＦ６との混合物から調製したＡＳＯボールサンプルに対するＦＣＳ分析からそれぞれ決定した。ＡＳＯボール１個あたりのＰＯＸ－ＡＳＯ会合数（ＡＮＰＯＸ－ＡＳＯ）は、得られたＣＰＭを用いた式：ＡＮＰＯＸ－ＡＳＯ＝ＣＰＭＡＳＯｂａｌｌ／ＣＰＭＡＳＯ×１０から算出した。結果を表３に示す。
【0070】
【表3】
【0071】
図７に示されるとおり、ＡＳＯボールは、約１０ｎＭ以上から少なくとも４０μＭのＡＳＯ濃度（換言すると、約１０ｎＭ（約０．８μｇ／ｍＬ）以上のＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯ濃度）において３０ｎｍ～６０ｎｍの流体力学的直径を維持していた。対照的に、１０ｎＭ未満のＡＳＯ濃度ではＡＳＯボールのサイズは大きく減少し、最終的に約１ｎＭのＡＳＯ濃度で約５ｎｍのサイズに達した。なお、５ｎｍのサイズは、遊離のＰＯＸ－ＡＳＯに対応し得る。一般に、気管内投与用の医薬組成物は、高容量化の観点からしばしば濃縮が行われ、当該濃縮プロセスによって二次凝集が誘導されやすいが、上記の結果から、ＡＳＯボールは４０μＭの濃度でも二次凝集することなく、安定性に優れることがわかる。なお、サイズ測定のためのＦＣＳ解析においては、高度に希釈した条件下では、ＤＬＳに比べてシグナル／ノイズ比が高かった。
【0072】
また、表３に示されるとおり、ＡＳＯボールサンプルから得られたＣＰＭは、ＡＳＯ濃度に関わらず、非コンジュゲートＡＳＯ－ＡＦ６よりも約３０倍高く、このことは、ＡＳＯボール１個に含まれるＰＯＸ－ＡＳＯの数が約３００であることを示す。なお、ＰＯＸ（２０ｋ）－ＡＳＯから調製されたＡＳＯボールについて同様の分析を行ったところ、１．２５μＭおよび２．５μＭ ＡＳＯ濃度におけるＡＮＰＯＸ－ＡＳＯは約７００であり、ＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯから調製されたＡＳＯボールよりも会合数が多かったが、この結果は、ＤＬＳヒストグラムにおける関係と見た目上一致する。
【0073】
［Ｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子ノックダウンアッセイ］
培養ヒト肺がん細胞であるＡ５４９－Ｌｕｃ細胞を用いてＡＳＯボールの遺伝子ノックダウン効率を調べた。ここで、ＡＳＯとしては、ａｓＴＵＧ１を用いた。ａｓＴＵＧ１が標的とするＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡは、肺がんを含む様々なタイプのがんにおいて頻繁に過剰発現しており、Ａ５４９細胞の増殖およびアポトーシスを制御していることが知られている。
３７℃の１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ中１０μＭのａｓＴＵＧ１ （またはａｓＣＴＲＬ）濃度でＡＳＯボールサンプルを調製した。１００ｎＭおよび２００ｎＭのＡＳＯ濃度で非コンジュゲートＡＳＯまたはＡＳＯボールを用いてＡ５４９－Ｌｕｃ培養細胞にトランスフェクションした。４８時間インキュベーション後、細胞をＰＢＳでリンスし、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＲＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡを除去し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてｑＲＴ－ＰＣＲを行った。内因性ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを適用して、ＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡの相対発現レベルを求めた。結果を図８に平均値および標準偏差として表す（ｎ＝４、＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
さらに、Ｐａｎｃ１細胞に対するａｓＴＵＧ１ボールのノックダウン効率をｑＲＴ－ＰＣＲによって求めた。この細胞株へのＡＳＯトランスフェクション、ｍＲＮＡ精製および逆転写は、Ａ５４９－Ｌｕｃ細胞に関して記載した通りに行った。結果を図９に平均値および標準偏差として表す（ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５）。
培養ヒト肺がん細胞であるＡ５４９－Ｌｕｃ細胞を用いてＡＳＯボールの遺伝子ノックダウン効率を調べた。ここで、ＡＳＯとしては、ａｓＴＵＧ１を用いた。ａｓＴＵＧ１が標的とするＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡは、肺がんを含む様々なタイプのがんにおいて頻繁に過剰発現しており、Ａ５４９細胞の増殖およびアポトーシスを制御していることが知られている。
３７℃の１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ中１０μＭのａｓＴＵＧ１ （またはａｓＣＴＲＬ）濃度でＡＳＯボールサンプルを調製した。１００ｎＭおよび２００ｎＭのＡＳＯ濃度で非コンジュゲートＡＳＯまたはＡＳＯボールを用いてＡ５４９－Ｌｕｃ培養細胞にトランスフェクションした。４８時間インキュベーション後、細胞をＰＢＳでリンスし、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＲＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡを除去し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてｑＲＴ－ＰＣＲを行った。内因性ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを適用して、ＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡの相対発現レベルを求めた。結果を図８に平均値および標準偏差として表す（ｎ＝４、＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
さらに、Ｐａｎｃ１細胞に対するａｓＴＵＧ１ボールのノックダウン効率をｑＲＴ－ＰＣＲによって求めた。この細胞株へのＡＳＯトランスフェクション、ｍＲＮＡ精製および逆転写は、Ａ５４９－Ｌｕｃ細胞に関して記載した通りに行った。結果を図９に平均値および標準偏差として表す（ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５）。
【0074】
なお、ｑＲＴ－ＰＣＲに用いたプライマー配列は以下の通りである。
＜ＧＡＰＤＨ用プライマー配列＞
ｆｏｒｗａｒｄ ５´－ＣＣＡ ＣＣＣ ＡＴＧ ＧＣＡ ＡＡＴ ＴＣＣ－３´（配列番号：３）
ｒｅｖｅｒｓｅ ５´－ＣＡＧ ＧＡＧ ＧＣＡ ＴＴＧ ＣＴＧ ＡＴＧ ＡＴ－３´（配列番号：４）
＜ＴＵＧ１用プライマー配列＞
ｆｏｒｗａｒｄ ５´－ＡＧＧ ＴＡＧ ＡＡＣ ＣＴＣ ＴＡＴ ＧＣＡ ＴＴＴ ＴＧＴ Ｇ－３´（配列番号：５）
ｒｅｖｅｒｓｅ ５´－ＡＣＴ ＣＴＴ ＧＣＴ ＴＣＡ ＣＴＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＣＡ Ｇ－３´（配列番号：６）
＜ＧＡＰＤＨ用プライマー配列＞
ｆｏｒｗａｒｄ ５´－ＣＣＡ ＣＣＣ ＡＴＧ ＧＣＡ ＡＡＴ ＴＣＣ－３´（配列番号：３）
ｒｅｖｅｒｓｅ ５´－ＣＡＧ ＧＡＧ ＧＣＡ ＴＴＧ ＣＴＧ ＡＴＧ ＡＴ－３´（配列番号：４）
＜ＴＵＧ１用プライマー配列＞
ｆｏｒｗａｒｄ ５´－ＡＧＧ ＴＡＧ ＡＡＣ ＣＴＣ ＴＡＴ ＧＣＡ ＴＴＴ ＴＧＴ Ｇ－３´（配列番号：５）
ｒｅｖｅｒｓｅ ５´－ＡＣＴ ＣＴＴ ＧＣＴ ＴＣＡ ＣＴＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＣＡ Ｇ－３´（配列番号：６）
【0075】
図８に示されるとおり、非コンジュゲートＴＵＧ１標的ＡＳＯ（ａｓＴＵＧ１）は、濃度依存的に若干の遺伝子ノックダウンを誘導した。ａｓＴＵＧ１の遺伝子ノックダウン能は、ヌクレアーゼに対する耐性および標的ＲＮＡへの結合親和性を増強するＰＳ骨格および両末端ＬＮＡに起因すると考えられる。対照的に、ａｓＴＵＧ１搭載ＡＳＯボール（ａｓＴＵＧ１ボール）は、非コンジュゲートａｓＴＵＧ１と比較して有意に大きいＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡのノックダウンを生じさせた。その一方で、ａｓＣＴＲＬ搭載ＡＳＯボール（ａｓＣＴＲＬボール）で処理した細胞ではＴＵＧ１発現レベルの低減は観察されなかった。これらの結果は、ＡＳＯボールが配列特異的な遺伝子ノックダウン能を有することを示す。
【0076】
また、図９に示されるとおり、ＡＳＯボールの遺伝子ノックダウン能をＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡを過剰発現するヒトすい臓がんＰａｎｃ１に対して評価したところ、ＡＳＯボールは、培養Ｐａｎｃ１細胞におけるＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡの発現レベルの有意な低減を生じさせた。このことから、ＡＳＯボールの遺伝子ノックダウン能は特定の細胞株に限定されるものではないことがわかる。
【0077】
上記遺伝子ノックダウンアッセイに用いたＰＯＸ－ＡＳＯはＰＯＸセグメントとＡＳＯとの間に特定の開裂可能なリンカーを含まないことを考慮すると、ＡＳＯボールの有意な遺伝子ノックダウン活性は、ＡＳＯボールおよび／または解離したＰＯＸ－ＡＳＯが標的ｌｎｃＲＮＡに効率的に結合することを示す。２１ｍｅｒのＡＳＯおよび疎水性状態のＰＯＸ（３０）のサイズはそれぞれ、約３．５ｎｍおよび約２．５ｎｍと推定される。ＡＳＯボールが標的細胞内で濃度の低下を介して解離した場合、ＡＳＯの３’末端にコンジュゲートした約２．５ｎｍサイズのＰＯＸは、ＡＳＯと標的ｌｎｃＲＮＡとのハイブリダイゼーションを実質的に阻害しないと考えられる。
【0078】
［細胞取り込み評価］
培養Ａ５４９－Ｌｕｃ細胞において、ＡＳＯ－ＡＦ６を用いた細胞取り込み評価を行った。
３７℃の１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ中、１０μＭのＡＳＯ－ＡＦ６からＡＳＯボールサンプルを調製した。１００ｎＭおよび２００ｎＭのＡＳＯ濃度で非コンジュゲートＡＳＯまたはＡＳＯボールを用いてＡ５４９－Ｌｕｃ培養細胞にトランスフェクションした。６時間培養した後、細胞をＰＢＳで２回リンスし、新鮮なＰＢＳを加えた。マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ（Ｒ） Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてＡＳＯ－ＡＦ６の蛍光強度を測定し、得られた蛍光値から非処理コントロールウェルのパーセンテージとして相対蛍光強度を算出した。結果を図１０に平均および標準偏差として表す（ｎ＝４、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
培養Ａ５４９－Ｌｕｃ細胞において、ＡＳＯ－ＡＦ６を用いた細胞取り込み評価を行った。
３７℃の１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ中、１０μＭのＡＳＯ－ＡＦ６からＡＳＯボールサンプルを調製した。１００ｎＭおよび２００ｎＭのＡＳＯ濃度で非コンジュゲートＡＳＯまたはＡＳＯボールを用いてＡ５４９－Ｌｕｃ培養細胞にトランスフェクションした。６時間培養した後、細胞をＰＢＳで２回リンスし、新鮮なＰＢＳを加えた。マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ（Ｒ） Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてＡＳＯ－ＡＦ６の蛍光強度を測定し、得られた蛍光値から非処理コントロールウェルのパーセンテージとして相対蛍光強度を算出した。結果を図１０に平均および標準偏差として表す（ｎ＝４、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【0079】
図１０に示されるとおり、ＡＳＯボールは、非コンジュゲートＡＳＯに比べて顕著に高い細胞取り込み効率を示した。この結果は、ＡＳＯボールの非コンジュゲートＡＳＯよりも高い遺伝子ノックダウン活性と一致する。
【0080】
［細胞生存アッセイ］
３７℃の１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ中、１０μＭのａｓＣＴＲＬからＡＳＯボールサンプルを調製した。１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭおよび１６００ｎＭのＡＳＯ濃度で非コンジュゲートＡＳＯまたはＡＳＯボールを用いてＡ５４９－Ｌｕｃ培養細胞にトランスフェクションした。４８時間培養した後、培地を交換し、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて細胞生存率を評価した。４５０ｎｍにおける吸収をＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ（Ｒ）を用いて測定し、得られた吸収値から非処理コントロールウェルのパーセンテージとして相対吸光度を算出した。結果を図１１に平均および標準偏差として表す（ｎ＝４）。
３７℃の１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ中、１０μＭのａｓＣＴＲＬからＡＳＯボールサンプルを調製した。１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭおよび１６００ｎＭのＡＳＯ濃度で非コンジュゲートＡＳＯまたはＡＳＯボールを用いてＡ５４９－Ｌｕｃ培養細胞にトランスフェクションした。４８時間培養した後、培地を交換し、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて細胞生存率を評価した。４５０ｎｍにおける吸収をＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ（Ｒ）を用いて測定し、得られた吸収値から非処理コントロールウェルのパーセンテージとして相対吸光度を算出した。結果を図１１に平均および標準偏差として表す（ｎ＝４）。
【0081】
図１１に示される通り、ＡＳＯボールは１．６μＭ ＡＳＯ濃度までほとんど細胞毒性を示さなかった。
【0082】
［同所性異種移植腫瘍モデルにおけるＡＳＯボールの生体内分布］
気管内投与を介したＡＳＯボールによるＡＳＯ送達を調べるために、同所性肺がんモデルマウスにおける生体内分布を調べた。
１．同所性異種移植腫瘍モデルの作製
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雌性、６週齢）をイソフルランで麻酔し、既報の研究に多少の改変を加えた方法で腫瘍移植を行った。すなわち、マウスの左肺を覆う背部皮膚を５ｍｍ切開し、次いで、３０Ｇのニードル（３２６６６８；ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて、４０μＬ ＰＢＳ／マトリゲル（１：１，ｖ／ｖ）に懸濁した３×１０６ Ａ５４９－Ｌｕｃ細胞を肺実質内に３ｍｍの深さで直接接種した。創部を手術用クリップで閉じ、麻酔から覚めるまでマウスを温熱パッド上で寝かせた。肺がんの着床およびがんの増殖をＩｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）によってモニターし、Ｄ－ルシフェリンの腹腔内注射から１０分後に生物発光画像を得た。腫瘍の生物発光シグナル強度が腫瘍あたり１０７～１０８ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓに到達したときに、気管内投与を行った。
気管内投与を介したＡＳＯボールによるＡＳＯ送達を調べるために、同所性肺がんモデルマウスにおける生体内分布を調べた。
１．同所性異種移植腫瘍モデルの作製
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雌性、６週齢）をイソフルランで麻酔し、既報の研究に多少の改変を加えた方法で腫瘍移植を行った。すなわち、マウスの左肺を覆う背部皮膚を５ｍｍ切開し、次いで、３０Ｇのニードル（３２６６６８；ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて、４０μＬ ＰＢＳ／マトリゲル（１：１，ｖ／ｖ）に懸濁した３×１０６ Ａ５４９－Ｌｕｃ細胞を肺実質内に３ｍｍの深さで直接接種した。創部を手術用クリップで閉じ、麻酔から覚めるまでマウスを温熱パッド上で寝かせた。肺がんの着床およびがんの増殖をＩｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）によってモニターし、Ｄ－ルシフェリンの腹腔内注射から１０分後に生物発光画像を得た。腫瘍の生物発光シグナル強度が腫瘍あたり１０７～１０８ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓに到達したときに、気管内投与を行った。
【0083】
２．気管内投与
イソフルランを用いた麻酔下で、Ａ５４９－Ｌｕｃ腫瘍を担持させたマウスの気管を外科的に露出させ、気管を小さく切開した。ＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒ（Ｒ）Ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｒ（ＭＳＡ－２５０－Ｍ；Ｐｅｎｎ－Ｃｅｎｔｕｒｙ，Ｉｎｃ．，Ｗｙｎｄｍｏｏｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いてサンプルを気管内に注入した。切開を縫合して閉じ、麻酔から覚めるまでマウスを温熱パッド上に寝かせた。なお、ＡＳＯボールが投与プロセス中にＰＯＸ－ＡＳＯ単体へと解離することを防ぐために、サンプル溶液中のＡＳＯ濃度を４０μＭ（この濃度はＡＳＯボールのＣＭＣよりも十分に高い濃度である）に調節した。また、ヒートプレートを用いてサンプル溶液またはＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒ（Ｒ）Ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｒの温度を投与直前まで３７℃に維持し、サンプル溶液を３分以内に素早く投与した。ＡＳＯボールは２５℃で少なくとも１５分は安定であることが確認されていることから、上記投与方法によれば、投与プロセスの間、ＡＳＯボールのミセル状構造が維持され得る。
イソフルランを用いた麻酔下で、Ａ５４９－Ｌｕｃ腫瘍を担持させたマウスの気管を外科的に露出させ、気管を小さく切開した。ＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒ（Ｒ）Ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｒ（ＭＳＡ－２５０－Ｍ；Ｐｅｎｎ－Ｃｅｎｔｕｒｙ，Ｉｎｃ．，Ｗｙｎｄｍｏｏｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いてサンプルを気管内に注入した。切開を縫合して閉じ、麻酔から覚めるまでマウスを温熱パッド上に寝かせた。なお、ＡＳＯボールが投与プロセス中にＰＯＸ－ＡＳＯ単体へと解離することを防ぐために、サンプル溶液中のＡＳＯ濃度を４０μＭ（この濃度はＡＳＯボールのＣＭＣよりも十分に高い濃度である）に調節した。また、ヒートプレートを用いてサンプル溶液またはＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒ（Ｒ）Ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｒの温度を投与直前まで３７℃に維持し、サンプル溶液を３分以内に素早く投与した。ＡＳＯボールは２５℃で少なくとも１５分は安定であることが確認されていることから、上記投与方法によれば、投与プロセスの間、ＡＳＯボールのミセル状構造が維持され得る。
【0084】
３．生体内分布評価
３７℃の１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ中、４０μＭのＡＳＯ－ＡＦ６からＡＳＯボールサンプルを調製した。同所性異種移植マウスへの非コンジュゲートＡＳＯ－ＡＦ６およびＡＳＯボールの気管内投与（５０μＬ、約１７μｇ ＡＳＯ／ｍｏｕｓｅ、ｎ＝４）を上記の通りに行った。投与後２４時間において、マウスを殺処分し、肝臓、脾臓、腎臓、心臓および肺を含む個々の器官を切除した。各マウスの肺から腫瘍を分離した。組織におけるＡＳＯ－ＡＦ６の蛍光シグナルをＩＶＩＳで観察した（図１２）。次に、各組織を秤量およびホモジナイズし、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ（Ｒ）を用いて蛍光強度を検出した。結果を図１３に平均および標準偏差として表す（ｎ＝４、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
３７℃の１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ中、４０μＭのＡＳＯ－ＡＦ６からＡＳＯボールサンプルを調製した。同所性異種移植マウスへの非コンジュゲートＡＳＯ－ＡＦ６およびＡＳＯボールの気管内投与（５０μＬ、約１７μｇ ＡＳＯ／ｍｏｕｓｅ、ｎ＝４）を上記の通りに行った。投与後２４時間において、マウスを殺処分し、肝臓、脾臓、腎臓、心臓および肺を含む個々の器官を切除した。各マウスの肺から腫瘍を分離した。組織におけるＡＳＯ－ＡＦ６の蛍光シグナルをＩＶＩＳで観察した（図１２）。次に、各組織を秤量およびホモジナイズし、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ（Ｒ）を用いて蛍光強度を検出した。結果を図１３に平均および標準偏差として表す（ｎ＝４、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【0085】
図１３に示される通り、非コンジュゲートＡＳＯおよびＡＳＯボールは共に、肺および腫瘍においてかなり高い蛍光強度を示したが、ＡＳＯボールの蛍光強度（肺および腫瘍においてそれぞれ、４４±７％および２６±６％ｄｏｓｅ ｇ－１ ｔｉｓｓｕｅ）は、非コンジュゲートＡＳＯの蛍光発光（肺および腫瘍においてそれぞれ、２２±６％および８±２％ｄｏｓｅ ｇ－１ ｔｉｓｓｕｅ）よりも有意に高かった。
【0086】
また、非コンジュゲートＡＳＯは、肝臓、脾臓および腎臓に集積（肝臓、脾臓および腎臓にそれぞれ、４．３±０．７％、１．２±０．３％および１．０±０．２％ｄｏｓｅ ｇ－１ ｔｉｓｓｕｅ）が見られたのに対し、ＡＳＯボールでは、これらの器官への集積がほとんど検出されなかった（＜０．３％ｄｏｓｅ ｇ－１ ｔｉｓｓｕｅ）。これらの結果は、かなりの量の非コンジュゲートＡＳＯが肺から体循環に抜けだし、その後、他の器官に集積したことを示す。対照的に、ＡＳＯボールは、５０ｎｍという大きいサイズに起因して、体循環へのクリアランスが抑制され、結果として、肺および肺腫瘍におけるＡＳＯ集積量が有意に増大したと推測される。
【0087】
［Ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子ノックダウンアッセイ］
同所性肺腫瘍におけるＡＳＯボールのＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏノックダウンをｑＲＴ－ＰＣＲアッセイによって測定した。
３７℃の１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ中、４０μＭのａｓＴＵＧ１またはａｓＣＴＲＬからＡＳＯボールサンプルを調製した。同所性異種移植マウスへの非コンジュゲートａｓＴＵＧ１およびＡＳＯボールの気管支内投与（５０μＬ、約１５μｇ ＡＳＯ／ｍｏｕｓｅ、ｎ＝４）を上記と同様に行った。投与後７２時間において、マウスを殺処分し、肺を切除した。腫瘍を各マウスの肺から分離し、ホモジナイズした。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出し、上記と同様にして、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対するＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡの相対発現量をｑＲＴ－ＰＣＲによって定量した。結果を図１４に平均および標準偏差として表す（ｎ＝４、＊＊ｐ＜０．０１）。なお、本実験に用いたａｓＴＵＧ１はヒトＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡを標的として設計されていることから、得られた結果は、ヒト由来がん細胞における遺伝子ノックダウン効果のみを反映するものであり、宿主マウス細胞における遺伝子ノックダウン効果を示すものではない。
同所性肺腫瘍におけるＡＳＯボールのＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏノックダウンをｑＲＴ－ＰＣＲアッセイによって測定した。
３７℃の１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ中、４０μＭのａｓＴＵＧ１またはａｓＣＴＲＬからＡＳＯボールサンプルを調製した。同所性異種移植マウスへの非コンジュゲートａｓＴＵＧ１およびＡＳＯボールの気管支内投与（５０μＬ、約１５μｇ ＡＳＯ／ｍｏｕｓｅ、ｎ＝４）を上記と同様に行った。投与後７２時間において、マウスを殺処分し、肺を切除した。腫瘍を各マウスの肺から分離し、ホモジナイズした。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出し、上記と同様にして、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対するＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡの相対発現量をｑＲＴ－ＰＣＲによって定量した。結果を図１４に平均および標準偏差として表す（ｎ＝４、＊＊ｐ＜０．０１）。なお、本実験に用いたａｓＴＵＧ１はヒトＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡを標的として設計されていることから、得られた結果は、ヒト由来がん細胞における遺伝子ノックダウン効果のみを反映するものであり、宿主マウス細胞における遺伝子ノックダウン効果を示すものではない。
【0088】
図１４に示される通り、投与後７２時間において、気管内投与されたａｓＴＵＧ１ボール（１５μｇ ＡＳＯ／マウス）が腫瘍におけるＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡの発現レベルを約５５％有意に低減させた一方で、ａｓＣＴＲＬボール投与群では、ＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡの発現レベルの低減が見られなかった。これらの結果は、気管内投与されたＡＳＯボールが肺腫瘍において配列特異的遺伝子ノックダウン能を発揮することを示す。
【0089】
一方、非コンジュゲートａｓＴＵＧ１は、腫瘍において有意な遺伝子ノックダウン効果を生じさせなかった。このような遺伝子ノックダウン能の違いは、原因を特定するものではないが、ＡＳＯボールが非コンジュゲートＡＳＯよりも細胞取り込み効率に優れ、また、細胞内プロセスが促進されたことに起因する可能性がある。
【0090】
とりわけ、ＡＳＯボールが１５μｇ ＡＳＯ／マウスの用量で５５％の遺伝子ノックダウンを示した一方で、既報では、ＡＳＯ単体（ｎａｋｅｄ ＡＳＯ）を用いて５０％または６５％の遺伝子ノックダウンを行うためには、４０μｇ ＡＳＯ／マウスまたは１００μｇ ＡＳＯ／マウスの用量がそれぞれ必要であることが報告されている（Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，２０１７，１２，ｅ０１８７２８６）。よって、ＡＳＯボールを形成して気管内投与することにより、肺または肺腫瘍における遺伝子ノックダウンのためのＡＳＯ用量の低減が期待できる。
【0091】
［ＰＯＸ添加によるＡＳＯボールのサイズ調整］
ＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯコンジュゲートを４℃の１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒに溶解し、同バッファーで１０μＭ ＡＳＯまで希釈した。得られたＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯ溶液を、同バッファーで１０μＭとなるように調製された同体積のＰＯＸ（３０ｋ）溶液と混和し、４℃で２０分静置した。その後、３７℃で２０分さらに静置して、ＡＳＯボールを調製した。
ＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯコンジュゲートを４℃の１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒに溶解し、同バッファーで１０μＭ ＡＳＯまで希釈した。得られたＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯ溶液を、同バッファーで１０μＭとなるように調製された同体積のＰＯＸ（３０ｋ）溶液と混和し、４℃で２０分静置した。その後、３７℃で２０分さらに静置して、ＡＳＯボールを調製した。
【0092】
上記ＡＳＯボール溶液およびＰＯＸ（３０ｋ）溶液の代わりに１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒと混和したこと（結果として、ＰＯＸ（３０ｋ）を添加しなかったこと）以外は同様に調製したＡＳＯボール溶液を低容量石英キュベット（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に添加し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、３７℃でＤＬＳ分析を行った。得られたＤＬＳのヒストグラムを図１５に示す。
【0093】
図１５に示されるとおり、ＰＯＸ（３０ｋ）の添加により、単峰性ピークを維持した状態でＡＳＯボールのサイズが増加したことがわかる。また、ＰＯＸ（３０ｋ）を添加した場合としていない場合のＡＳＯボールのＤＨ／ＰＤＩは、それぞれ１０９ｎｍ／０．１１および５０ｎｍ／０．０６であった。これらの結果より、ＡＳＯが結合していないＰＯＸをＰＯＸ－ＡＳＯに添加することで、ＡＳＯボールのサイズ調整が可能であることが確認される。
【0094】
［サイズの異なるＡＳＯボールの気管投与後の生体内分布］
３７℃の１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ中、２０μＭのＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯ（うち１０μＭがＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯ－ＡＦ６）サンプルから、あるいは２０μＭのＰＯＸ（３０ｋ）を追加で含むサンプルから、それぞれＡＳＯボールを調製した。ＢＡＬＢ／ｃマウスへのＡＳＯボールの気管内投与（５０μＬ、約８μｇ ＡＳＯ／ｍｏｕｓｅ、ｎ＝３）を上記の通りに行った。投与後２４時間において、マウスを殺処分し、肝臓、脾臓、腎臓、心臓および肺を含む個々の器官を切除した。各組織を秤量およびホモジナイズし、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ（Ｒ）を用いて蛍光強度を検出した。結果を図１６に平均および標準偏差として表す（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。
３７℃の１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ中、２０μＭのＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯ（うち１０μＭがＰＯＸ（３０ｋ）－ＡＳＯ－ＡＦ６）サンプルから、あるいは２０μＭのＰＯＸ（３０ｋ）を追加で含むサンプルから、それぞれＡＳＯボールを調製した。ＢＡＬＢ／ｃマウスへのＡＳＯボールの気管内投与（５０μＬ、約８μｇ ＡＳＯ／ｍｏｕｓｅ、ｎ＝３）を上記の通りに行った。投与後２４時間において、マウスを殺処分し、肝臓、脾臓、腎臓、心臓および肺を含む個々の器官を切除した。各組織を秤量およびホモジナイズし、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ（Ｒ）を用いて蛍光強度を検出した。結果を図１６に平均および標準偏差として表す（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。
【0095】
図１６に示される通り、サイズの異なる２種類のＡＳＯボールは共に、他の臓器への集積量（＜０．２％ｄｏｓｅ ｇ－１ ｔｉｓｓｕｅ）に比べ、肺において顕著に高い蛍光強度を示した。ＰＯＸ（３０ｋ）の添加ありとなしで調製されたＡＳＯボールの肺への集積量は、それぞれ７９±２３％および３８±１０％ｄｏｓｅ ｇ－１ ｔｉｓｓｕｅであり、サイズの大きいＡＳＯボールの方が有意に高い肺集積性を示した。これは、ＡＳＯボールのサイズの増加に伴い、血流中への移行がより効果的に抑制されたためと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【0096】
本発明の薬物－ポリマー結合体およびそのミセル状凝集体は、ＤＤＳの分野で好適に用いられ得る。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】