特許 7579274 プロドラッグ組成物中の薬物濃度を定量化する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-29

(45)【発行日】2024-11-07

(54)【発明の名称】プロドラッグ組成物中の薬物濃度を定量化する方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/34 20060101AFI20241030BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20241030BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20241030BHJP

   C12Q 1/37 20060101ALI20241030BHJP

   C12Q 1/527 20060101ALI20241030BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20241030BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20241030BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/34

G01N27/62 X ZNA

G01N27/62 V

C07K7/08

C12Q1/37

C12Q1/527

G01N33/15 Z

G01N33/68

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2021565898

(86)(22)【出願日】2020-05-06

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-05

(86)【国際出願番号】 US2020031605

(87)【国際公開番号】W WO2020227364

(87)【国際公開日】2020-11-12

【審査請求日】2023-05-01

(31)【優先権主張番号】62/844,579

(32)【優先日】2019-05-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500034653

【氏名又は名称】ジェンザイム・コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】キム・アルヴィン

(72)【発明者】

【氏名】ビン・ワン

【審査官】▲高▼ 美葉子

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１０－０８５１０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１１－５０１７４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１１－５１１２９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００４／０４６２００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／１００１７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Biomaterials，2011年，32(33)，p.8722-8729

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００－３／００

Ｇ０１Ｎ２７／６２

ＣＡＰＬＵＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

架橋ヒアルロン酸－リンカー－ペプチド（ｘＨＡ－Ｌ－Ｐ）薬物製剤中に存在するペプチド薬物の量を決定する方法であって：
該ｘＨＡ－Ｌ－Ｐ薬物製剤のサンプルを；
ヒアルロノグルコシダーゼと接触させて、オリゴマーのヒアルロン酸－リンカー－ペプチド薬物（ｏＨＡ－Ｌ－Ｐ）を生成する工程；
該ｏＨＡ－Ｌ－Ｐをエンドプロテイナーゼと接触させて、該ペプチド薬物のペプチド消化産物を生成する工程；および
該ペプチド消化産物を検出して、該ｘＨＡ－Ｌ－Ｐ薬物製剤中に存在するペプチド薬物の量を決定する工程
を含み、
ここで、該エンドプロテイナーゼは、Ｇｌｕ－Ｃ、Ａｓｐ－Ｎ、Ｌｙｓ－Ｃ、Ａｒｇ－Ｃ、トリプシンおよびキモトリプシンからなる群から選択される、
前記方法。

【請求項2】

ａ）ペプチド消化産物は、２アミノ酸長～１００アミノ酸長の間である；
ｂ）ペプチド消化産物は、３アミノ酸長～７５アミノ酸長の間である；
ｃ）ペプチド消化産物は、４アミノ酸長～５０アミノ酸長の間である；
ｄ）ペプチド消化産物は、６アミノ酸長～３０アミノ酸長の間である；
ｅ）ペプチド消化産物は、１５アミノ酸長～２０アミノ酸長の間である；または
ｆ）ペプチド消化産物は、１アミノ酸長、２アミノ酸長、３アミノ酸長、１９アミノ酸長もしくはこれらの任意の組合せである、
請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ペプチド消化産物を検出する工程は、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析法（ＬＣ－ＨＲＭＳ）、紫外（ＵＶ）吸光度および蛍光検出法のうち１つまたはこれらの組合せからなる群から選択される方法により実行される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

ヒアルロノグルコシダーゼは、ヒアルロニダーゼ（ＨＡアーゼ）またはヒアルロン酸（ＨＡ）リアーゼＥＣ４．２．２．１である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

ａ）ＨＡアーゼは、ＨＡアーゼ１、ＨＡアーゼ２、ＨＡアーゼ３、ＨＡアーゼ４、ＨＡアーゼ５およびＨＡアーゼ６からなる群から選択される；
ｂ）ＨＡアーゼはＨＡアーゼ１もしくはＨＡアーゼ２である；または
ｃ）ＨＡアーゼはＨＡアーゼ２である、
請求項４に記載の方法。

【請求項6】

エンドプロテイナーゼはＡｓｐ－Ｎである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

内部標準の使用をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

内部標準は、１つまたはそれ以上の重同位体を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

存在するペプチド薬物の量は、検量線を使用して決定される、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

圧力サイクラー中で、ｘＨＡ－Ｌ－Ｐをヒアルロノグルコシダーゼと接触させる、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

圧力サイクラー中の圧力は、大気圧より高い、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

圧力は、５ＫＰＳＩ、１０ＫＰＳＩまたは１５ＫＰＳＩである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

圧力サイクラー中で、ｏＨＡ－Ｌ－Ｐをエンドプロテイナーゼと接触させる、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

圧力サイクラー中の圧力は、大気圧より高い、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

圧力は、３５ＫＰＳＩ、４０ＫＰＳＩまたは４５ＫＰＳＩである、請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本願は、２０１９年５月７日に出願された米国仮特許出願第６２／８４４，５７９号に基づく優先権を主張し、その開示全体を参照によって本明細書に組み入れる。

【0002】

本発明は、プロドラッグ組成物中に存在する薬物の量を定量化する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

この１０年間で、平均すると毎年１７種の新規なペプチドが臨床試験に入り、承認率（第１相から上市まで）は小分子の２倍になっており（非特許文献１；非特許文献２）、１５０種を超えるペプチド薬物候補が、現在開発中である（非特許文献３）。

【0004】

しかし、ペプチド薬物の開発には特有の課題がある。例えば、ペプチド薬物は、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質切断を受け、急速に排除される。一つには生体膜の透過性が低いため、経口送達は依然として困難である。これらの欠点に対処する試みが、環状ペプチド形成（例えば、ラクタム化およびクリック環化による）、炭化水素ステープル化、脂質付加、およびポリマー薬物コンジュゲートの開発のような構造の制約を組み入れることによってなされてきた。

【0005】

ペプチド薬物の一例は、グルカゴン受容体およびＧＬＰ１受容体を標的とする二重受容体アゴニストであるＳＡＲ４２５８９で、これは２型糖尿病患者における血糖管理および体重減少、ならびに健常な志願者における体重減少を促進することができる（非特許文献４）。しかしながら、ＳＡＲ４２５８９９はｉｎ ｖｉｖｏクリアランスが急速であるため、１日１回の投与が必要である。

【0006】

ヒアルロン酸（ＨＡ）は、ヒアルロナンとも呼ばれ、β－１－３およびβ－１－４のグリコシド結合により連結されたｄ－グルクロン酸とＮ－アセチル－ｄ－グルコサミンとの繰り返し二糖単位から構成される天然の非スルフェート直鎖状多糖である（非特許文献５）。ＨＡは皮膚における重要な構造要素であり、複数の細胞表面受容体の相互作用に関与している。ＨＡは免疫抑制および抗血管新生の活性を有し、脳組織、硝子軟骨および滑膜関節液の中に存在する。ＨＡは、その実体積の１０００倍までの大量の水を吸収することができる、強親水性の特徴、および生物組織中で高分子量であることが理由で、身体の中で重要な構造的および機能的役割を果たす。

【0007】

ＨＡは、その生体適合性および生分解性が理由で、生物医学的なおよび薬学的な用途において多くの用途が見出されてきた。しかしながら、ＨＡは溶解性が高く、ｉｎ ｖｉｖｏで急速な分解挙動をする極めて劣った機械的性質を見せることが多い。このため、ＨＡは、化学修飾され、および／または架橋されて、機械的性質、粘度、溶解性、分解、および生物学的性質を含むその性質が改善されてきた。ＨＡ誘導体が作り出され、組織工学用の足場において、声帯体積増大（ｖｏｃａｌ ｆｏｌｄ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）のような軟部組織手術において、薬物送達、ｓｉＲＮＡの細胞内送達、創傷治癒において、および外科的処置におけるデバイスとして、利用されてきた。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【文献】Ｄｈａｒａｎｉｐｒａｇａｄａ（２０１３）Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５（７）：８３１頁

【文献】ＫａｓｐａｒおよびＲｅｉｃｈｅｒｔ（２０１３）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １８：８０７～８１７頁

【文献】ＬａｕおよびＤｕｎｎ（２０１８）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６：２７００～２７０７頁

【文献】Ｔｉｌｌｎｅｒら（２０１９）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ．Ｍｅｔａｂ．２１：１２０，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｄｏｍ．１３４９４、Ｅｐｕｂ ２０１８年９月１６日

【文献】Ｋｈｕｎｍａｎｅｅら（２０１７）Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ 第８巻（ｄｏｉ：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１７７／２０４１７３１４１７７２６４６４）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

架橋ヒアルロン酸（ｘＨＡ）は、水性環境中で数百万ダルトンのヒドロゲルを形成し、薬物（例えば、ペプチド薬物）に連結されて、ｉｎ ｖｉｖｏで薬物を安定化することができる。しかしながら、ヒドロゲル中に負荷された薬物の量を定量化すること、およびヒドロゲルからの薬物の放出速度を定量化することは両方とも困難である。溶解しているペプチドの基本的な定量化に通常適用されるＵＶ簡易測定は、ヒドロゲルに適用することができない。なぜなら、そのような分析には、ヒドロゲル複合体に連結される薬物が十分に溶解している必要があるからである。

【0010】

高温または高ｐＨを使用する、リンカーの加速された加水分解およびペプチド薬物の放出のための代替の方法は、ペプチド薬物の部分分解をもたらし、このため、定量するのが困難な不均質な混合物が産生される。したがって、架橋ＨＡヒドロゲルへのプロドラッグ組成物の薬物負荷を定量化するために分析的定量化方法が必要である。

【課題を解決するための手段】

【0011】

架橋ＨＡ（ｘＨＡ）ヒドロゲルへの薬物負荷量を決定するという分析的な課題に対処するために、例えば、ｘＨＡヒドロゲルのペプチド負荷量決定を可能にするために、薬物負荷（例えば、バイオポリマーのペプチドプロドラッグ負荷）を重量／重量パーセントとして測定する正確な定量化を可能にする新規な方法が発見された。本明細書に記載される方法は、（例えば、タンパク質消化または加水分解などによって）より小さい成分に分解することができる任意の小分子（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドなど）に適用することができる薬物負荷量決定に対して高選択的であり、プロドラッグ、例えば、バイオポリマーを含有するプロドラッグの薬物負荷量決定に広く適用することができる。本明細書に記載される方法は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで薬物の用量送達を管理するのに、および製造中にプロドラッグのバッチ間で薬物負荷の品質管理をするのに有用である。本明細書に記載される方法は、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を長くした薬物、例えばペプチド薬物、例えば、数分から数日へと長くなった半減期を有するペプチド薬物のような薬物の製造を可能にする。

【0012】

本明細書に記載される方法は、当技術分野において公知の、ＮＭＲに基づく方法のような従来の方法に勝る種々の利点をもたらす。例えば、ＮＭＲに基づく方法は、本明細書に記載される方法より時間がかかり、スループットが低い。ＮＭＲに基づく方法は、ミリグラム単位の材料が必要であるが、本明細書に記載される新規な方法は、ナノグラム単位の材料しか必要としない。さらに、ＮＭＲに基づく方法のダイナミックレンジは本明細書に記載される新規な方法のダイナミックレンジより狭い。加えて、ＮＭＲに基づく方法は、本明細書に記載される新規な方法より、混入ペプチドによる干渉の影響を受けやすい。

【0013】

新規な方法は、二重酵素消化の後に消化産物の定量化を使用して、ヒドロゲルへの薬物負荷（例えば、ペプチド薬物負荷）を正確に定量化することができるという発見に基づき、本明細書において提供される。本方法のある特定の実施形態では、架橋ヒアルロン酸－リンカー－ペプチド（ｘＨＡ－Ｌ－Ｐ）を酵素と一緒にインキュベートして架橋ヒアルロン酸を消化する。続いて、タンパク質分解酵素を適用して、結合しているペプチドを消化し、タンパク質分解性消化産物を産生する。続いて、ペプチドに相当するタンパク質分解性消化産物が定量化される。

【0014】

本方法のある特定の例示的な実施形態では、架橋ヒアルロン酸リンカーペプチドコンジュゲート（ｘＨＡ－Ｌ－Ｐ）が秤量され、緩衝液にヒドロゲルとして懸濁される。ヒドロゲルは酵素的に分解されて、可溶性の、オリゴマーのヒアルロン酸－リンカー－ペプチド（ｏＨＡ－Ｌ－Ｐ）になる。得られたｏＨＡ－Ｌ－Ｐのオリゴマーは不均質な混合物として存在し、この混合物は、ペプチド、リンカーおよび長さの異なるオリゴマーのヒアルロン酸からなる。このオリゴマーのヒアルロン酸の不均質性は、質量分析法に基づく定量化には望ましくないが、より特異的でないＵＶまたは蛍光に基づくアッセイには適用することができる。したがって、質量分析法に基づく参照アッセイでは、第２の酵素的（例えば、タンパク質内分解的）消化工程を導入して、ペプチド薬物を消化し、均質なペプチド消化産物（例えば、１９アミノ酸のＣ末端ペプチド消化産物、ＤＦＩＥＷＬＫＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ_２（図３））を産生する。次いで、ペプチド産物は、例えば、液体クロマトグラフィー／高分解能質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）のようなアッセイを使用して、検出し、定量化することができる。

【0015】

一態様において、架橋ヒアルロン酸－リンカー－ペプチド（ｘＨＡ－Ｌ－Ｐ）プロドラッグ製剤中に存在する薬物の量を決定する方法が提供される。この方法は、ｘＨＡ－Ｌ－Ｐプロドラッグ製剤のサンプルを、ヒアルロノグルコシダーゼ、例えば、ヒアルロニダーゼ（ＨＡアーゼ）またはヒアルロン酸（ＨＡ）リアーゼと接触させて、オリゴマーのヒアルロン酸－リンカー－ペプチド薬物（ｏＨＡ－Ｌ－Ｐ）を生成する工程、ｏＨＡ－Ｌ－Ｐを酵素と接触させて、当該薬物のペプチド消化産物を生成する工程、および当該ペプチド消化産物を検出して、当該ｘＨＡ－Ｌ－Ｐプロドラッグ製剤中に存在する薬物の量を決定する工程を含む。

【0016】

ある特定の例示的な実施形態では、ペプチド消化産物は、約２アミノ酸長から約１００アミノ酸長の間、約３アミノ酸長から約７５アミノ酸長の間、約４アミノ酸長から約５０アミノ酸長の間、約６アミノ酸長から約３０アミノ酸長の間、約１５アミノ酸長から約２０アミノ酸長の間であるか、または約１９アミノ酸長である。ある特定の例示的な実施形態では、ペプチド消化産物は、約１アミノ酸長、約２アミノ酸長または約３アミノ酸長である。

【0017】

ある特定の例示的な実施形態では、ペプチド消化産物を検出する工程は、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析法（ＬＣ－ＨＲＭＳ）、紫外（ＵＶ）吸光度および蛍光検出法のうち１つまたはこれらの組合せからなる群から選択される方法により、実行される。

【0018】

ある特定の例示的な実施形態では、ヒアルロノグルコシダーゼは、ＨＡアーゼ１、ＨＡアーゼ２、ＨＡアーゼ３、ＨＡアーゼ４、ＨＡアーゼ５およびＨＡアーゼ６からなる群から選択されるＨＡアーゼである。他の例示的な実施形態では、ヒアルロノグルコシダーゼは、ＨＡアーゼ１またはＨＡアーゼ２である。さらに他の例示的な実施形態では、ヒアルロノグルコシダーゼは、ＨＡアーゼ２である。ある特定の例示的な実施形態では、ヒアルロノグルコシダーゼは、ＨＡリアーゼＥＣ４．２．２．１である。

【0019】

ある特定の例示的な実施形態では、ｏＨＡ－Ｌ－Ｐを、エンドプロテイナーゼ、例えば、Ｇｌｕ－Ｃ、Ａｓｐ－Ｎ、Ｌｙｓ－Ｃ、Ａｒｇ－Ｃ、トリプシンまたはキモトリプシンと接触させる。ある特定の例示的な実施形態では、エンドプロテイナーゼは、Ａｓｐ－Ｎである。

【0020】

ある特定の例示的な実施形態では、本方法は、内部標準の使用をさらに含む。ある特定の例示的な実施形態では、内部標準は、１つまたはそれ以上の重同位体を含む。

【0021】

ある特定の例示的な実施形態では、存在する薬物の量は、検量線を使用して決定される。

【0022】

ある特定の例示的な実施形態では、ｘＨＡ－Ｌ－Ｐを、圧力サイクラー（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｙｃｌｅｒ）中で、ヒアルロノグルコシダーゼと接触させる。ある特定の例示的な実施形態では、圧力サイクラー中の圧力は、大気圧より高い。ある特定の例示的な実施形態では、圧力は、約５ＫＰＳＩ、約１０ＫＰＳＩまたは約１５ＫＰＳＩである。

【0023】

ある特定の例示的な実施形態では、ｏＨＡ－Ｌ－Ｐを、圧力サイクラー中で、第２の酵素と接触させる。ある特定の例示的な実施形態では、圧力サイクラー中の圧力は、大気圧より高い。ある特定の例示的な実施形態では、圧力は、約３５ＫＰＳＩ、約４０ＫＰＳＩまたは約４５ＫＰＳＩである。

【0024】

別の態様において、架橋ヒアルロン酸－リンカー－ペプチド（ｘＨＡ－Ｌ－Ｐ）プロドラッグ製剤中に存在する薬物の量を決定する方法が提供される。この方法は、ｘＨＡ－Ｌ－Ｐプロドラッグ製剤のサンプルを、ヒアルロノグルコシダーゼと接触させて、オリゴマーのヒアルロン酸－リンカー－ペプチド薬物（ｏＨＡ－Ｌ－Ｐ）を生成する工程、ｏＨＡ－Ｌ－Ｐをエンドプロテイナーゼと接触させて、当該薬物のペプチド消化産物を生成する工程、および当該ペプチド消化産物を検出して、当該ｘＨＡ－Ｌ－Ｐプロドラッグ製剤中に存在する薬物の量を決定する工程を含む。

【0025】

ある特定の例示的な実施形態では、ペプチド消化産物を検出する工程は、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ、ＬＣ－ＨＲＭＳ、ＵＶ吸光度および蛍光検出法のうち１つまたはこれらの組合せからなる群から選択される方法により、実行される。

【0026】

ある特定の例示的な実施形態では、ヒアルロノグルコシダーゼは、ＨＡアーゼ１またはＨＡアーゼ２である。ある特定の例示的な実施形態では、ヒアルロノグルコシダーゼは、ＨＡリアーゼＥＣ４．２．２．１である。

【0027】

ある特定の例示的な実施形態では、エンドプロテイナーゼは、Ｇｌｕ－Ｃ、Ａｓｐ－Ｎ、Ｌｙｓ－Ｃ、Ａｒｇ－Ｃ、トリプシンおよびキモトリプシンからなる群から選択される。

【0028】

ある特定の例示的な実施形態では、エンドプロテイナーゼはＡｓｐ－Ｎである。

【0029】

ある特定の例示的な実施形態では、本方法は、内部標準の使用をさらに含む。ある特定の例示的な実施形態では、内部標準は、１つまたはそれ以上の重同位体を含む。

【0030】

ある特定の例示的な実施形態では、存在する薬物の量は、検量線を使用して決定される。

【0031】

ある特定の例示的な実施形態では、ｘＨＡ－Ｌ－Ｐを、圧力サイクラー中で、ヒアルロノグルコシダーゼと接触させる。ある特定の例示的な実施形態では、圧力サイクラー中の圧力は、大気圧より高い。ある特定の例示的な実施形態では、圧力は、約５ＫＰＳＩ、約１０ＫＰＳＩまたは約１５ＫＰＳＩである。

【0032】

ある特定の例示的な実施形態では、ｏＨＡ－Ｌ－Ｐを、圧力サイクラー中で、エンドプロテイナーゼと接触させる。ある特定の例示的な実施形態では、圧力サイクラー中の圧力は、大気圧より高い。ある特定の例示的な実施形態では、圧力は、約３５ＫＰＳＩ、約４０ＫＰＳＩまたは約４５ＫＰＳＩである。

【0033】

別の態様において、架橋ヒアルロン酸－リンカー－ペプチド（ｘＨＡ－Ｌ－Ｐ）プロドラッグ製剤中に存在する薬物の量を決定する方法が提供される。この方法は、ｘＨＡ－Ｌ－Ｐプロドラッグを、ヒアルロニダーゼ２と接触させて、オリゴマーのヒアルロン酸－リンカー－ペプチド薬物（ｏＨＡ－Ｌ－Ｐ）を生成する工程、ｏＨＡ－Ｌ－ＰをＡｓｐ－Ｎと接触させて、当該薬物のペプチド消化産物を生成する工程、および当該ペプチド消化産物を検出して、当該ｘＨＡ－Ｌ－Ｐプロドラッグ製剤中に存在する薬物の量を決定する工程を含む。

【0034】

ある特定の例示的な実施形態では、ペプチド消化産物は、約２アミノ酸長から約１００アミノ酸長の間、約３アミノ酸長から約７５アミノ酸長の間、約４アミノ酸長から約５０アミノ酸長の間、約６アミノ酸長から約３０アミノ酸長の間、約１５アミノ酸長から約２０アミノ酸長の間であるか、または約１９アミノ酸長である。ある特定の例示的な実施形態では、ペプチド消化産物は、約１アミノ酸長、約２アミノ酸長または約３アミノ酸長である。

【0035】

ある特定の例示的な実施形態では、ペプチド消化産物を検出する工程は、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ、ＬＣ－ＨＲＭＳ、ＵＶ吸光度および蛍光検出法のうち１つまたはこれらの組合せからなる群から選択される方法により、実行される。

【0036】

ある特定の例示的な実施形態では、本方法は、内部標準の使用をさらに含む。ある特定の例示的な実施形態では、内部標準は、１つまたはそれ以上の重同位体を含む。

【0037】

ある特定の例示的な実施形態では、存在する薬物の量は、検量線を使用して決定される。

【0038】

ある特定の例示的な実施形態では、ｘＨＡ－Ｌ－Ｐを、圧力サイクラー中で、ヒアルロニダーゼ２と接触させる。ある特定の例示的な実施形態では、圧力サイクラー中の圧力は、大気圧より高い。ある特定の例示的な実施形態では、圧力は、約５ＫＰＳＩ、約１０ＫＰＳＩまたは約１５ＫＰＳＩである。

【0039】

ある特定の例示的な実施形態では、ｏＨＡ－Ｌ－Ｐを、圧力サイクラー中で、Ａｓｐ－Ｎと接触させる。ある特定の例示的な実施形態では、圧力サイクラー中の圧力は、大気圧より高い。ある特定の例示的な実施形態では、圧力は、約３５ＫＰＳＩ、約４０ＫＰＳＩまたは約４５ＫＰＳＩである。

【0040】

別の態様において、架橋ヒアルロン酸－リンカー－ペプチド（ｘＨＡ－Ｌ－Ｐ）プロドラッグ製剤中に存在する薬物の量を決定する方法が提供される。この方法は、ｘＨＡ－Ｌ－ＰプロドラッグをＨＡリアーゼＥＣ４．２．２．１と接触させて、オリゴマーのヒアルロン酸－リンカー－ペプチド薬物（ｏＨＡ－Ｌ－Ｐ）を生成する工程、ｏＨＡ－Ｌ－ＰをＡｓｐ－Ｎと接触させて、当該薬物のペプチド消化産物を生成する工程、および当該ペプチド消化産物を検出して、当該ｘＨＡ－Ｌ－Ｐプロドラッグ製剤中に存在する薬物の量を決定する工程を含む。

【0041】

ある特定の例示的な実施形態では、ペプチド消化産物は、約２アミノ酸長から約１００アミノ酸長の間、約３アミノ酸長から約７５アミノ酸長の間、約４アミノ酸長から約５０アミノ酸長の間、約６アミノ酸長から約３０アミノ酸長の間、約１５アミノ酸長から約２０アミノ酸長の間であるか、または約１９アミノ酸長である。ある特定の例示的な実施形態では、ペプチド消化産物は、約１アミノ酸長、約２アミノ酸長または約３アミノ酸長である。

【0042】

ある特定の例示的な実施形態では、ペプチド消化産物を検出する工程は、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ、ＬＣ－ＨＲＭＳ、ＵＶ吸光度および蛍光検出法のうち１つまたはこれらの組合せからなる群から選択される方法により、実行される。

【0043】

ある特定の例示的な実施形態では、本方法は、内部標準の使用をさらに含む。ある特定の例示的な実施形態では、内部標準は、１つまたはそれ以上の重同位体を含む。

【0044】

ある特定の例示的な実施形態では、存在する薬物の量は、検量線を使用して決定される。

【0045】

ある特定の例示的な実施形態では、ｘＨＡ－Ｌ－Ｐを、圧力サイクラー中で、ＨＡリアーゼＥＣ４．２．２．１と接触させる。ある特定の例示的な実施形態では、圧力サイクラー中の圧力は、大気圧より高い。ある特定の例示的な実施形態では、圧力は、約５ＫＰＳＩ、約１０ＫＰＳＩまたは約１５ＫＰＳＩである。

【0046】

ある特定の例示的な実施形態では、ｏＨＡ－Ｌ－Ｐを、圧力サイクラー中で、Ａｓｐ－Ｎと接触させる。ある特定の例示的な実施形態では、圧力サイクラー中の圧力は、大気圧より高い。ある特定の例示的な実施形態では、圧力は、約３５ＫＰＳＩ、約４０ＫＰＳＩまたは約４５ＫＰＳＩである。

【0047】

本発明の前述のおよび他の特徴ならびに利点は、添付の図面と併せて、以下の実例となる実施形態の詳細な説明からより深く理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0048】

【図1】活性ペプチド薬物（即ち、１日１回のＧＬＰ－１／ＧＣＣ受容体アゴニストであるＳＡＲ４２５８９９）を不活性なプロドラッグ形態からｉｎ ｖｉｖｏでゆっくりと放出するポリマー担体および自己切断型リンカーを表す図である。

【図2】切断可能なリンカーを介して高分子量架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルに結合している、ある特定の例示的な実施形態による週１回のＧＬＰ－１／ＧＣＧアゴニスト（即ち、ＳＡＲ４２５８９９）の複雑性およびサイズを表す図である。Ｄ－セリンは、ＳＡＲ４２５８９９（ＨｄＳＱＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＫ（γＥ－パルミテート）ＥＳＫＡＡＱＤＦＩＥＷＬＫＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ_２）の２位のアミノ酸である。

【図3】ＳＡＲ４２５８９９を、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎを用いて消化して消化産物を産生し、消化産物は定量化に使用するためのＣ末端ペプチドを含むことを概略的に表す図である。Ｄ－セリンは、ＳＡＲ４２５８９９（ＨｄＳＱＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＫ（γＥ－パルミテート）ＥＳＫＡＡＱＤＦＩＥＷＬＫＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ_２）の２位のアミノ酸である。検量線は、タンパク質分解性消化産物に対応する、合成の非標識のＣ末端ペプチドを使用して生成され、重同位体標識したＣ末端ペプチドが、内部標準として適用される。１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム中Ａｓｐ－Ｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）１．２０～０．４μｇ（比１：１００）を用いて、３７℃で終夜、またはＰｒｅｓｓｕｒｅ Ｂｉｏ Ｃｙｃｌｅｒを使用して大気圧から４０ＫＰＳＩの間をサイクル時間１分で交互に繰り返しながら３７℃で１時間、ペプチド２０～４０μｇを消化した。

【図4】ｘＨＡ－Ｌ－Ｐを、ヒアルロノグルコシダーゼ（ヒアルロニダーゼ（ＨＡアーゼ））を使用して消化し、次にＡｓｐＮを用いて消化し、その後、反応停止することを示す図である。加水分解を３７℃で２４時間実行して、結合している任意のインタクトなペプチドを放出させた。ＬＣ／ＭＳ分析の前に内部標準（ＩＳ）を添加した。ＡｓｐＮは、ＨＡ消化産物の存在下で、緩衝液中でＳＡＲ４２５８９９を完全に消化した。放出されたインタクトなペプチドの、Ｃ末端ペプチドに対する比は０．０００６であった。

【図5】ＳＡＲ４２５８９９プロドラッグを、Ａｓｐ－Ｎを用いて消化すると、液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）で検出可能なＣ末端ペプチド消化産物を産生することを示す図である。ＳＡＲ４２５８９９プロドラッグは、ｘＨＡ－リンカー－ＳＡＲ４２５８９９であり；ＳＡＲ４２５８９９は、ＨｄＳＱＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＫ（Ｅ－パルミテート）ＥＳＫＡＡＱＤＦＩＥＷＬＫＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ_２である。Ａｓｐ－Ｎを用いてＨＡ－リンカー－ＳＡＲ４２５８９９を消化した、Ｃ末端ペプチド消化産物は、ＬＣ／ＭＣにより検出することが可能であり、適度な収率を示した。

【図6】ＳＡＲ４２５８９９プロドラッグ切断の定量化を概略的に表す図である。標識ペプチド内部標準（ＩＳ）とは、^１３Ｃ^１５Ｎ－Ｌｙｓで標識したＣ末端ペプチドのことである。１ｍｇ／ｍＬのＨＡ－リンカー－ペプチド２００μＬを、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム中の１００Ｕ／ｍＬのヒアルロン酸リアーゼＥＣ４．２．２．１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）３０μＬを用いて３７℃で２４時間消化した。続いてＡｓｐ－Ｎによる消化を実行した。

【図7A】ＨＡ消化産物は主要なマトリックス効果を生み出さなかったことを示す図である。図７Ａは、ＨＡアーゼ１を用いて消化したＨＡに、Ｃ末端のＡｓｐ－Ｎによる消化産物を添加したものを示す。

【図7B】ＨＡ消化産物は主要なマトリックス効果を生み出さなかったことを示す図である。図７Ｂは、ＨＡアーゼ２を用いて消化したＨＡに、Ｃ末端のＡｓｐ－Ｎによる消化産物を添加したものを示す。

【図7C】ＨＡ消化産物は主要なマトリックス効果を生み出さなかったことを示す図である。図７Ｃは、緩衝液中でＡｓｐ－Ｎを用いて消化したインタクトなＳＡＲ４２５８９９を示す対照である。

【図7D】ＨＡ消化産物は主要なマトリックス効果を生み出さなかったことを示す図である。図７Ｄは、ＨＡアーゼ１を用いて消化したＨＡに、インタクトなＳＡＲ４２５８９９ペプチドを添加したものを示す。次いでＡｓｐ－Ｎによる消化を実行した。

【図7E】ＨＡ消化産物は主要なマトリックス効果を生み出さなかったことを示す図である。図７Ｅは、ＨＡアーゼ２を用いて消化したＨＡに、インタクトなＳＡＲ４２５８９９ペプチドを添加したものを示す。次いでＡｓｐ－Ｎによる消化を実行した。

【図7F】ＨＡ消化産物は主要なマトリックス効果を生み出さなかったことを示す図である。図７Ｆは、緩衝液中でＡｓｐ－Ｎを用いて消化したインタクトなＳＡＲ４２５８９９を示す対照である。Ｃ末端ペプチドを添加した２つのＨＡアーゼ消化物およびその対照について、ならびにＳＡＲ４２５８９９を添加した２つのＨＡアーゼ消化物およびＡｓｐ－Ｎを用いて消化したその対照について、Ｃ末端ペプチドの強度のレベルは同じであることが観察された。

【図8A】ＨＡアーゼ２は、ＨＡアーゼ１と比較して、その後のＡｓｐ－Ｎによる消化を改善したことを示す図である。図８Ａは、ＨＡアーゼ１を用いて消化し、その後Ａｓｐ－Ｎを用いて消化したＨＡ－リンカー－ＳＡＲ４２５８９９を示す。

【図8B】ＨＡアーゼ２は、ＨＡアーゼ１と比較して、その後のＡｓｐ－Ｎによる消化を改善したことを示す図である。図８Ｂは、ＨＡアーゼ２を用いて消化し、その後Ａｓｐ－Ｎを用いて消化したＨＡ－リンカー－ＳＡＲ４２５８９９を示す。Ｃ末端のＡｓｐ－Ｎによる消化産物は、９５６．９９ｍ／ｚでのピークによって示されている。

【図9】図９Ａ～図９Ｂは、消化産物の定量化を示す図である。図９Ａは、１０ｎｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬまでの標準的なＣ末端ペプチド曲線について、許容される線形性が認められたことを示す。図９Ｂは、Ａｓｐ－Ｎによる消化物に由来するＣ末端ペプチドの極めて良好な断片化を示し、このため、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）法に適したものとなる。

【図10】ＨＡアーゼ／Ａｓｐ－Ｎによる消化の完全性の査定を概略的に表す図である。Ｃ末端ペプチドが検出され、プロセスの収率を示す。インタクトなペプチドが検出され、その後の加水分解によるペプチド放出を示す。インタクトなタンパク質はわずか０．０５％しか検出されなかった。これは、１００％に近い、目的とする完全な消化プロセスであることを示している。

【図11】図１１Ａ～図１１Ｂは、マトリックス中でＨＡアーゼを用いて消化した架橋ヒアルロン酸（ｘＨＡ）、および緩衝液中でＨＡアーゼを用いて消化したｘＨＡを示す図である。図１１Ａは生データを示す。図１１Ｂは、マトリックス中の曲線および緩衝液中の曲線のグラフ表示である。優れた線形性が認められた。曲線勾配は互いから３．１％離れていた。したがって、マトリックス効果は重要ではなく、緩衝液曲線は定量的な分析に適用することが可能である。

【図12】図１２Ａ～図１２Ｂは、内部標準の強度がマトリックス効果を示さなかったことを表す図である。緩衝液曲線およびマトリックス曲線において整合的な結果が得られた。

【図13】図１３Ａ～１３Ｂは、ＨＡ－リンカー－ペプチドの三重反復の定量化を示す図である。良好な再現性が認められた（ＣＶは７．４％であった）。希釈係数を適用すると、総ペプチドパーセンテージは１８％であることが分かった。

【図14】ＰがＳＡＲ４２５８９９であるｘＨＡ－Ｌ－Ｐの３バッチのペプチド（Ｐ）負荷を示す図である。優れた線形性が、マトリックス効果なしに認められた。全プロセス反復に良好な再現性が認められた。これらの結果は、直交ＮＭＲ（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ＮＭＲ）によって得られた結果と一致していた。

【図15】穏やかな加水分解条件を使用して得られた結果を表す図である。その結果としては、酵素消化の速度が有意に増加した。ペプチドの加水分解による放出のために対照として意図されたリンカー－ペプチドには、高レベルの合成不純物が認められた。

【発明を実施するための形態】

【0049】

本発明は、ポリマーに負荷された薬物の量を決定する新規な定量化方法の開発に基づいている。ある特定の実施形態では、本方法は、架橋ヒアルロン酸－リンカー－ペプチド薬物（ｘＨＡ－Ｌ－Ｐ）のサンプル中に存在するヒアルロン酸（ＨＡ）を切断して、オリゴマーのヒアルロン酸－リンカー－ペプチド薬物（ｏＨＡ－Ｌ－Ｐ）の不均質な混合物を形成する工程を含む。次いで、ｏＨＡ－Ｌ－Ｐを、タンパク質分解により消化して、例えば、液体クロマトグラフィー、質量分析法、ＵＶ吸収、および蛍光に基づくアッセイなどのような当技術分野において周知の方法を使用して検出および定量化することができる均質なペプチド消化産物を得ることができる。特に例示的な実施形態では、ｘＨＡ－Ｌ－Ｐ（例えば、ＳＡＲ４２５８９９プロドラッグ）を含む組成物が提供され、この場合、「Ｐ」はペプチド薬物ＳＡＲ４２５８９９であり、「Ｌ」は自己切断型クロスリンカーであり、「ｘＨＡ」は架橋ヒアルロン酸である（図２）。

【0050】

本明細書で使用する場合、「プロドラッグ」という用語は、その薬理学的な効果を発揮する前に生体内変換を受ける化合物を指すものとする。したがって、プロドラッグは、親分子中の望ましくない性質を変えるため、または排除するために一過的に使用される特化した無毒性の保護基を含有する、生物学的に活性な部分とみなすことができる。典型的なプロドラッグは、物理化学的または薬物動態学的な性質を改善し、通常、加水分解的切断によりｉｎ ｖｉｖｏで容易に除去し得る一過性担体基と所与の活性物質との一時的な結合を含有する担体連結プロドラッグ、即ち、担体基の切断が、活性化基が露出した後にのみ効果的になるカスケードプロドラッグであり得る。

【0051】

ＳＡＲ４２５８９９のような薬物の物理化学的または薬物動態学的な性質をｉｎ ｖｉｖｏで増強するために、そのような薬物は、担体（例えばｘＨＡ）とコンジュゲートすることができる。薬物が担体および／またはリンカーと一過的に結合している場合、そのような系は、一般に、担体が連結したプロドラッグと指定される。ＩＵＰＡＣに規定されている定義によれば、担体が連結したプロドラッグとは、物理化学的または薬物動態学的な性質を改善し、通常、加水分解的切断により、ｉｎ ｖｉｖｏで容易に除去することができる一過性担体基と所与の活性物質との一時的な結合を含有するプロドラッグである。

【0052】

本明細書に記載される、担体が連結したプロドラッグに使用されるリンカーは、任意の既知の切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカー、例えば、酵素不安定性リンカー（ｅｎｚｙｍｅ ｌａｂｉｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）（例えば、酸切断可能なリンカー、還元性リンカー（例えば、ジスルフィドリンカー）、およびβ－グルクロニドリンカーなど）、光切断可能なリンカー、チオエーテルリンカー、マレイミドカプロイルリンカー、ペプチドリンカー（例えば、ジペプチドリンカー）、およびクロスリンカーなどとすることができる。好適なリンカーは、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、およびＣｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓなどのような種々の供給元から市販されている。

【0053】

ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載される、担体が連結したプロドラッグに使用されるリンカーは、一過性（例えば、自己切断可能）であり、それは、生理学的条件下で、非酵素的、加水分解的に分解性（切断可能）であり、半減期が、例えば、１時間～３カ月の範囲であることを意味する。

【0054】

本明細書で使用する場合、「生理学的条件」とは、薬物が放出されることが意図される身体の特定の環境に関しての、温度およびｐＨなどを指す。例えば、血漿中での放出なら、ｐＨが７．３５～７．４５の間、温度が約３７℃（例えば、約３６℃～約３８℃の間）で起こり、リソソーム中での放出なら、ｐＨが約６．５～約４．５の間、温度が約３７℃で起こることになる。

【0055】

ある特定の例示的な実施形態では、薬物（例えば、ペプチド薬物）は、自己切断型リンカーを介して、ヒドロゲル担体、例えばｘＨＡヒドロゲル担体に一過的に連結される。「ヒドロゲルプロドラッグ」および「ヒドロゲルに連結されたプロドラッグ」という用語は、ヒドロゲルに一過的に連結されている生物学的に活性な薬剤のプロドラッグを指し、同義で使用される。

【0056】

「薬物」「ペプチド薬物」「生物学的に活性な分子」「生物学的に活性な部分」「生物学的に活性な薬剤」および「活性薬剤」などの用語は、ウイルス、細菌、真菌、植物、動物、およびヒトを含むがこれらに限定されない生物の任意の物理的または生化学的性質に影響を及ぼすことができる任意の物質を指す。特に、本明細書で使用する場合、生物学的に活性な分子は、ヒトもしくは他の動物における疾患の、診断、治癒、軽減、治療もしくは予防を目的とする任意の物質、または他には、ヒトもしくは動物の身体的もしくは精神的な健康を増強するための任意の物質を含む。ある特定の例示的な実施形態では、「薬物」「生物学的に活性な分子」「生物学的に活性な部分」「生物学的に活性な薬剤」および「活性薬剤」などの用語は、例えば、ＳＡＲ４２５８９９のようなペプチド薬物を指す。

【0057】

薬物の「遊離型」とは、ヒドロゲルコンジュゲートプロドラッグ（例えば、ＳＡＲ４２５８９９プロドラッグ）から放出された後のような、未修飾の、薬理学的に活性な形態の薬物（例えば、ＳＡＲ４２５８９９）を指す。

【0058】

本明細書で使用する場合、「抗がん治療剤」または「抗がん剤」という用語は、新生細胞もしくは腫瘍細胞もしくはがん細胞の成長および／または増殖に不利益であり、悪性腫瘍を低減、阻害または破壊するように作用し得る分子を指す。

【0059】

本明細書で使用する場合、「細胞増殖阻害剤」という用語は、細胞成長および増殖を阻害する分子を指す。

【0060】

本明細書で使用する場合、「細胞傷害性ヌクレオシド」という用語は、内因性ヌクレオシドを模倣することによって細胞傷害効果を発揮する核酸塩基またはヌクレオシド類似体を指す。

【0061】

本明細書で使用する場合、「チューブリン結合剤」という用語は、チューブリン系に直接結びつく分子を指す。

【0062】

本明細書で使用する場合、「ホルモン」という用語は、多細胞生物において腺によって産生され、循環系によって標的の遠隔器官に輸送されて、生理機能および／または挙動を制御する、シグナル伝達分子のクラスの任意のメンバーを指す。「ホルモン拮抗薬」とは、ホルモン受容体に作用する特定の種類の受容体拮抗薬である。

【0063】

本明細書で使用する場合、「抗血管新生剤」という用語は、血管新生の生理学的プロセス（これにより、既存の血管から新生血管が形成される）を阻害する分子を指す。

【0064】

本明細書で使用する場合、「酵素阻害剤」という用語は、特定の酵素の機能を阻害する分子を指す。

【0065】

本明細書で使用する場合、「遺伝子制御因子」という用語は、遺伝子の転写に、プラスにもマイナスにも影響することができる分子を指す。

【0066】

本明細書で使用する場合、「細胞傷害性治療剤」という用語は、細胞の機能を阻害する、もしくは妨げる、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。「細胞傷害性薬剤」という用語は、化学療法剤、酵素、抗生物質、ならびに低分子毒物、または細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒物およびそれらの断片および／もしくは変異体のような毒物、ならびに以下に開示されている種々の抗腫瘍剤もしくは抗がん剤を含むものとする。一部の実施形態では、細胞傷害性薬剤は、タキソイド、ビンカ類、ＤＭ１もしくはＤＭ４のようなマイタンシノイドまたはマイタンシノイド類似体、小薬物、レプトマイシン誘導体、アウリスタチンまたはドラスタチン類似体、プロドラッグ、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ＤＮＡアルキル化剤、抗チューブリン剤、ＣＣ－１０６５またはＣＣ－１０６５類似体である。

【0067】

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、生理学的に適合性のある、全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、ならびに抗菌剤および抗真菌剤などを指す。好適な担体、希釈剤および／または添加剤の例としては、水、アミノ酸、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液；ヒスチジン、アルギニン、グリシン、プロリン、グリシルグリシンのようなアミノ酸および誘導体；無機塩のＮａＣｌ、塩化カルシウム；デキストロース、グリセリン、エタノール、スクロース、トレハロース、マンニトールのような糖または多価アルコール；およびポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロクサマー１８８のような界面活性剤；などのうち１つまたはそれ以上、ならびにそれらの組合せが挙げられる。多くの場合、糖、多価アルコールまたは塩化ナトリウムのような等張化剤を組成物中に含むのが好適であり、製剤はまた、トリプタミンのような抗酸化剤、およびＴｗｅｅｎ２０のような安定化剤を含有することもできる。

【0068】

本明細書で使用する場合、「ヒアルロン酸」「ＨＡ」および「ヒアルロナン」という用語は、互換的に使用され、β－１－３およびβ－１－４のグリコシド結合により連結されたｄ－グルクロン酸とＮ－アセチル－ｄ－グルコサミンとの繰り返し二糖単位から構成される非スルフェート直鎖状多糖（例えば、→４）－β－ｄ－ＧｌｃｐＡ－（１→３）－β－ｄ－ＧｌｃｐＮＡｃ－（１→）を指す。ＨＡは様々な分子量で生じる。高分子量ＨＡ（ＨＭＷＨＡ）は約１×１０^６Ｄａより大きく、低分子量ＨＡ（ＬＭＷＨＡ）は約０．８～約８×１０^５Ｄａである。オリゴマーのＨＡは、通常、約６×１０^３Ｄａ未満である。

【0069】

ＨＡは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｂｌａｉｒ、ＮＥ）およびＳｔａｎｆｏｒｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＣＡ）のような供給元から市販されている。ＦＤＡの承認を受けたＨＡには、以下に限定されないが、Ｈｙａｌｏｖｅｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ、獣医学的使用として承認）、Ｈｙｌｉｒａ（Ｈａｗｔｈｏｒｎ）、Ｈｙｌａｓｅ（ＥＣＲ）、Ｈｙｌａｒｔｉｎ Ｖ（Ｚｏｅｔｉｓ、獣医学的使用として承認）、Ｈｙｖｉｓｃ（Ａｎｉｋａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、獣医学的使用として承認）、Ｌｅｇｅｎｄ（Ｂａｙｅｒ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、獣医学的使用として承認）、ＮｅｘＨＡ（Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ、獣医学的使用として承認）、Ｏｒｔｈｏｖｉｓｃ（ＤｅＰｕｙ Ｍｉｔｅｋ）、ＰｒｏＶｉｓｃ（Ａｌｃｏｎ）、Ｓｈｅｌｌｇｅｌｌ（Ｃｙｔｏｓｏｌ Ｏｐｔｈａｌｍｉｃｓ）、Ｓｏｌｅｓｔａ（Ｓａｌｉｘ）、Ｓｕｐａｒｔｚ（Ｂｉｏｖｅｎｔｕｓ）、Ｓｙｎａｃｉｄ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ、獣医学的使用として承認）、Ｈｅａｌｏｎ５（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ）、Ｈｅａｌｏｎ ＧＶ（Ａｂｂｏｔｔ）、Ｈｅａｌｏｎ Ｅｎｄｏｃｏａｔ（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ）、Ｈｅａｌｏｎ（Ａｂｂｏｔｔ）、Ｅｕｆｌｅｘｘａ（Ｆｅｒｒｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｅｑｕｒｏｎ（Ｚｏｅｔｉｓ、獣医学的使用として承認）、Ｃｏｅａｓｅ（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ）、Ｂｉｏｎｅｃｔ（Ｃｉｐｈｅｒ）、Ａｍｖｉｓｃ（Ｃｈｉｒｏｎ）、Ｓｙｎｖｉｓｃ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、Ｇｅｌ－Ｏｎｅ（Ｚｉｍｍｅｒ Ｂｉｏｍｅｔ）、およびＨｙａｇｌａｎ（Ｆｉｄｉａ Ｐｈａｒｍａ）が含まれる。

【0070】

ＨＡの機械的性質を改善し、ｉｎ ｖｉｖｏでの持続時間を延長するために、ＨＡポリマー鎖を共有結合的に架橋し三次元網目構造とすることによりヒドロゲルを形成することができる（例えば、Ａｇｅｒｕｐ、ＢｅｒｇおよびＡｋｅｒｍａｒｋ（２００５）ＢｉｏＤｒｕｇｓ １９：２３；Ｅｄｓｍａｎら（２０１１）Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ２：３８４を参照）。架橋ＨＡ（ｘＨＡ）ヒドロゲルの機械的および物理的な性質は、修飾および架橋の程度に依存する（Ｌａ Ｇａｔｔａ、Ｓｃｈｉｒａｌｄｉ、ＰａｐａおよびＤｅ Ｒｏｓａ（２０１１）Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ９６：６０３）。

【0071】

本明細書で使用する場合、「架橋剤」および「クロスリンカー」という用語は、共有結合および／または非共有結合のうち少なくとも１つによってヒアルロン酸と反応し得る化学剤を包含するものとする。非共有結合の非限定的な例としては、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合およびファンデルワールス力（分散引力、双極子－双極子相互作用および双極子誘起相互作用）が挙げられる。

【0072】

「架橋された」という用語は、本明細書で使用する場合、架橋剤を介して共有結合および／または非共有結合しているヒアルロン酸の２つ以上のポリマー鎖を指すものとする。そのような架橋は、単一ポリマー鎖内で、または２つ以上の鎖間で、ラクトン、無水物、またはエステルが形成される、分子間のまたは分子内の脱水とは区別される。とはいえ、分子内架橋もまた、本明細書に記載される組成物中で起こり得ることも企図される。架橋剤は、２つ以上の分子（即ちヒアルロン酸鎖）の間に共有結合および／または非共有結合を作り出す少なくとも２つの官能基を含有する。本開示の一態様において、架橋剤は、架橋が進行することができるように、ヒアルロン酸の官能基に対する相補的官能基を含む。

【0073】

ＨＡの物理的な架橋は、種々のｐＨ、温度、イオン強度条件、および物理化学的相互作用、例えば、疎水性相互作用、水素結合、電荷相互作用、またはステレオコンプレックス形成を使用して実現することができる。特に、温度反応性のヒドロゲルは、様々な用途のために広範に試験されてきた。ＨＡを修飾して熱に感受性のＨＡヒドロゲルを製造するために頻繁に使用される一般的な熱ゲル化ポリマーには、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）、プルロン酸、メチルセルロース、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。

【0074】

ＨＡを架橋してヒドロゲルを形成する方法には、以下に限定されないが、－ＣＯＯＨ基を修飾する方法、－ＯＨ基を修飾する方法、－ＮＨＣＯＣＨ_３基を修飾する方法、ならびにシッフ塩基架橋、ジアルデヒドヒアルロン酸（ＣＨＯ－ＨＡ）、チオール修飾、ディールス・アルダー反応、および酵素媒介性連結を使用する化学的架橋方法が含まれる。

【0075】

ＨＡヒドロゲルを架橋する方法は、Ｋｅｎｎｅら（２０１３）Ｃａｒｂ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ９１：４１０；およびＫｈｕｎｍａｎｅｅ、前掲；Ｈｏａｒｅ ＴＲ、Ｋｏｈａｎｅ ＤＳ、Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｐｏｌｙｍｅｒ ２００８；４９（８）：１９９３～２００７頁；Ｇｕｐｔａ Ｄ、Ｔａｔｏｒ ＣＨ、Ｓｈｏｉｃｈｅｔ ＭＳ、Ｆａｓｔ－ｇｅｌｌｉｎｇ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｂｌｅｎｄ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ，ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｊｕｒｅｄ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００６；２７（１１）：２３７０～２３７９頁；Ｆａｎｇ，Ｊ－Ｙ、Ｃｈｅｎ，Ｊ－Ｐ、Ｌｅｕ，Ｙ－Ｌ、Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ ａｎｄ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ ２００８；６８（３）：６２６～６３６頁；およびＨａ ＤＩ、Ｌｅｅ ＳＢ、Ｃｈｏｎｇ ＭＳら、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ａｎｄ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｐｏｌｙ（Ｎ－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｂｅｈａｖｉｏｒｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒｅｓ．２００６；１４（１）：８７～９３頁に記載されており、これらの各々は、あらゆる目的からその全体を参照によって本明細書に組み入れる。

【0076】

架橋ＨＡは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびＳｔａｎｆｏｒｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＣＡ）のような供給元から市販されている。

【0077】

本明細書で使用する場合、「ヒドロゲル」という用語は、大量の水を吸収することができる、三次元の、親水性または両親媒性のポリマー網目を指すものとする。その網目は、ホモポリマーまたはコポリマーから構成され、共有結合の化学的または物理的（イオン性、疎水性相互作用、絡み合い）架橋が存在するため、不溶性である。その架橋は、網目構造および物理的統合性をもたらす。ヒドロゲルには水との熱力学的相溶性を示し、このため、ヒドロゲルは水性媒体中で膨潤することが可能である。網目の鎖は、孔が存在し、これらの孔のかなりの割合が１ｎｍ～１０００ｎｍの間の大きさになるように結合している。

【0078】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、１つまたはそれ以上の酵素および／または化合物を利用して、ｘＨＡを切断する。例えば、ｘＨＡ－Ｌ－Ｐ中に存在するｘＨＡを切断して、ｏＨＡ－Ｌ－Ｐを形成する。

【0079】

ｘＨＡを切断するのに好適な酵素には、以下に限定されないが、細菌のβ－エンドグリコシダーゼ、細菌のβ－エキソグリコシダーゼ（例えば、β－グルクロニダーゼ、およびβ－Ｎ－アセチル－ヘキソサミニダーゼなど）、真核生物のβ－エンドグリコシダーゼ（例えば、エンド－β－ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼ、およびβ－エンドグルクロニダーゼなど）、真核生物のβ－エキソグリコシダーゼ（例えば、β－エキソグルクロニダーゼ、およびエキソ－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼなど）、ヒアルロニダーゼ、およびヒアルロノグルコシダーゼなどが含まれる。

【0080】

ｘＨＡを切断する非酵素的な方法には、以下に限定されないが、酸加水分解、アルカリ加水分解、超音波分解、熱分解、酸化体（例えば、スーパーオキシドアニオンラジカル、過酸化水素、一重項酸素、ヒドロキシルラジカル、一酸化窒素、ペルオキシ亜硝酸アニオン、次亜塩素酸アニオン、炭酸ラジカルアニオン、およびジクロリドラジカルアニオンなど）による分解、マイクロ波照射、ＵＶ照射、γ－照射、およびＨｇランプ照射などが含まれる。（Ｓｔｅｒｎら（２００７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２５：５３７を参照、これは、あらゆる目的からその全体を参照によって本明細書に組み入れる。）

【0081】

他の実施形態では、本明細書に記載される方法は、１つまたはそれ以上のヒアルロノグルコシダーゼ、例えば、ヒアルロニダーゼ（ＨＡアーゼ）を利用して、ｘＨＡを切断する。例えば、ｘＨＡ－Ｌ－Ｐ中に存在するｘＨＡを切断して、ｏＨＡ－Ｌ－Ｐを形成する。ある特定の例示的な実施形態では、２つ、３つ、４つ、または５つ以上のＨＡアーゼの組合せを使用して、ｘＨＡを切断する。他の実施形態では、単一のＨＡアーゼを使用して、ｘＨＡを切断する。

【0082】

本明細書で使用する場合、「ヒアルロニダーゼ」とは、Ｎ－アセチルグルコサミンとグルクロネートとの間の（１－＞４）－結合（ＥＣ３．２．１．３５）または（１－＞３）－結合（ＥＣ３．２．１．３６）を切断して、ＨＡの分解を触媒するヒアルロノグルコシダーゼを指す。

【0083】

ヒアルロニダーゼには３つの一般的クラスがある：１．哺乳動物タイプのヒアルロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３５）。これは、四糖類および六糖類を主要な最終産物とするエンド－ベータ－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼである。加水分解活性およびトランスグリコシダーゼ活性の両方を有し、ヒアルロナンおよびコンドロイチン硫酸（ＣＳ）、特にＣ４－ＳおよびＣ６－Ｓを分解することができる；２．細菌のヒアルロニダーゼ（ＥＣ４．２．９９．１）。これは、ヒアルロナンを分解し、程度の差はあるが、ＣＳおよびＤＳを分解する。主として二糖最終産物を産生するベータ脱離反応によって機能するエンド－ベータ－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼである；ならびに３．ヒアルロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３６）。これは、ヒル、他の寄生生物、および甲殻類に由来し、ベータ１－３結合の加水分解により、四糖および六糖の最終産物を生成するエンド－ベータ－グルクロニダーゼである。

【0084】

哺乳動物のヒアルロニダーゼは、さらに２つの群：中性活性酵素および酸活性酵素に分類することができる。ヒトゲノムには、６つのヒアルロニダーゼ様遺伝子、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＨＹＡＬ３、ＨＹＡＬ４、ＨＹＡＬＰ１およびＰＨ２０／ＳＰＡＭ１がある。ＨＹＡＬＰ１はで偽遺伝子であり、ＨＹＡＬ３は既知のいずれの基質に対しても酵素活性を有することが示されていない。ＨＹＡＬ４は、コンドロイチナーゼであり、ヒアルロナンに対する活性を欠いている。ＨＹＡＬ１（別名はＬＵＣＡ１、ＭＰＳ９およびＮＡＴ６）は、典型的な酸活性酵素であり、ＰＨ２０は、典型的な中性活性酵素である。ＨＹＡＬ１およびＨＹＡＬ２のような酸活性ヒアルロニダーゼは、中性ｐＨで触媒活性を欠く。例えば、ＨＹＡＬ１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏｐＨ４．５を超えると触媒活性がない（Ｆｒｏｓｔら（１９９７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）。ＨＹＡＬ２は、酸活性酵素であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで比活性が極めて低い。

【0085】

ＨＹＡＬ５は、元来マウスにおいて発見された、血漿、および先体がインタクトな精子の先体膜に位置するＨＡアーゼであり、先体反応の最中に放出される。ＨＹＡＬ６は、やはりマウスにおいて発見されたＨＡアーゼである。

【0086】

化学グレードのＨＡアーゼは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）、およびＣａｌｚｙｍｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐｏ、ＣＡ）のような供給元から市販されている。ＦＤＡの承認を受けたＨＡアーゼには、以下に限定されないが、Ａｍｐｈａｄａｓｅ（ウシのヒアルロニダーゼ；新薬承認申請（ＮＤＡ）Ｎｏ．０２１６６５；Ａｍｐｈａｓｔａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｈｙｄａｓｅ（ウシのヒアルロニダーゼ；ＮＤＡ Ｎｏ．０２１７１６；Ａｋｏｒｎ Ｉｎｃ．）、Ｈｙｌｅｎｅｘ（組換えヒトヒアルロニダーゼ；ＮＤＡ Ｎｏ．０２１８５９；Ｈａｌｏｚｙｍｅ）；Ｖｉｔｒａｓｅ（ヒツジのヒアルロニダーゼ；ＮＤＡ Ｎｏ．０２１６４０；Ｂａｕｓｃｈ ａｎｄ Ｌｏｍｂ）、およびＷｙｄａｓｅ（ウシのヒアルロニダーゼ；ＮＤＡ Ｎｏ．００６３４３；Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が含まれる。

【0087】

本明細書において使用するために好適な追加のＨＡアーゼは：ワールドワイドウェブのサイト：ｂｒｅｎｄａ－ｅｎｚｙｍｅｓ．ｏｒｇ／ｅｎｚｙｍｅ．ｐｈｐ？ｅｃｎｏ＝３．２．１．３５；Ｋａｒｌ ＭｅｙｅｒおよびＭａｕｒｉｃｅ Ｍ．Ｒａｐｐｏｒｔの「Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅｓ」の章、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ－ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｒｅａｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１３巻１９９～２３６頁（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／９７８０４７０１２２５８７．ｃｈ６）；ＳｔｅｒｎおよびＪｅｄｒｚｅｊａｓ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００６、１０６、８１８～８３９頁、Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅｓ：Ｔｈｅｉｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ；ＳｔｅｒｎおよびＪｅｄｒｚｅｊａｓ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００８、１０８、５０６１～５０８５頁；Ｙｏｓｈｉｄａら（２０１３）「ＫＩＡＡ１１９９，Ａ ｄｅａｆｎｅｓｓ ｇｅｎｅ ｏｆ ｕｎｋｎｏｗｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｉｓ ａ ｎｅｗ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１０、５６１２～５６１７頁；Ｎａｇａｏｋａら、２０１５ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ（ＨＡ）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＨＹＢＩＤ、ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１５．６７３５６６、最初に、オンラインで２０１５年１０月３０日に発表；Ｙｏｓｈｉｎｏら、２０１８ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ第５０５巻、第１号、２０１８年１０月２０日；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、２０１９（Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．（２０１９）７８～７９頁、１３９～１４６頁、ＴＭＥＭ２：Ａ ｍｉｓｓｉｎｇ ｌｉｎｋ ｉｎ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ？；に記載されており、これらの各々は、あらゆる目的からその全体を参照によって本明細書に組み入れる。

【0088】

「ヒアルロニダーゼリアーゼ」「ヒアルロン酸リアーゼ」「ＨＡリアーゼ」「ＥＣ４．２．２．１」または「ＨＡリアーゼ４．２．２．１」は、ヒアルロナン鎖をベータ－Ｄ－ＧａｌＮＡｃ－（１－＞４）－ベータ－Ｄ－ＧｌｃＡ結合で切断し、最終的に多糖を消化して３－（４－デオキシ－ベータ－Ｄ－グルカ－４－エヌロノシル）－Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンにするヒアルロノグルコシダーゼ（即ち、細菌の炭素－酸素リアーゼ）を指す。ヒアルロン酸リアーゼは、細菌およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）から単離することができ、Ｎ－アセチル－ベータ－Ｄ－グルコサミン残基とＤ－グルクロン酸残基との間のベータ１，４－グリコシド結合の、加水分解ではなく脱離反応を触媒するため、他の供給源由来のヒアルロニダーゼとは作用様式において異なる。

【0089】

他の実施形態では、本明細書に記載される方法は、１つまたはそれ以上のタンパク質分解酵素、例えば、加水分解によりペプチド結合を切断することによってタンパク質分解を触媒する酵素を利用して、ペプチドを切断する。例えば、ｘＨＡ－Ｌ－Ｐ中に存在するＰを切断して、ｏＨＡ－Ｌ－Ｐを形成する。好適なプロテアーゼには、以下に限定されないが、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびアスパラギンペプチドリアーゼなどが含まれる。プロテアーゼが活性となる最適ｐＨにより分類される、好適なプロテアーゼには、以下に限定されないが、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、および塩基性プロテアーゼが含まれる。ある特定の例示的な実施形態では、２つ、３つ、４つ、または５つ以上のタンパク質分解酵素の組合せを使用してペプチドを切断する。他の実施形態では、単一のタンパク質分解酵素を使用してペプチドを切断する。

【0090】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、１つまたはそれ以上の酵素および／または化合物を利用して、遊離薬物またはプロドラッグとして存在する、例えば、遊離ＳＡＲ４２５８９９として、またはＳＡＲ４２５８９９プロドラッグとして存在するペプチド薬物を切断し、当該薬物またはプロドラッグのペプチド消化産物を生成する。

【0091】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、１つまたはそれ以上のエンドプロテイナーゼを利用して、遊離薬物またはプロドラッグとして存在する、例えば、遊離ＳＡＲ４２５８９９として、またはＳＡＲ４２５８９９プロドラッグとして存在するペプチド薬物を切断し、当該薬物またはプロドラッグのペプチド消化産物を生成する。適切なエンドプロテイナーゼを選ぶために使用する基準は、次のとおりとした：１）高度に特異的な断片の生成が可能な限り少ないこと；２）リシンに連結したグルタメート－パルミテートを含有しないＣ末端の断片を生成すること；および３）一般的な市販の酵素を使用すること。

【0092】

好適なエンドプロテイナーゼには、以下に限定されないが、Ｇｌｕ－Ｃ、Ａｓｐ－Ｎ、Ｌｙｓ－Ｃ、Ａｒｇ－Ｃ、トリプシンおよびキモトリプシンが含まれる。ある特定の例示的な実施形態では、エンドプロテイナーゼであるＡｓｐ－Ｎが、本明細書に記載される方法に使用される。種々の好適なエンドプロテイナーゼは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）、およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ、ＷＩ）のような会社から市販されている。

【0093】

ある特定の実施形態では、圧力サイクラーを使用して、ｘＨＡおよび／またはｏＨＡの消化時間を改善する（例えば、短縮する）ことができる。ある特定の実施形態では、ｘＨＡおよび／またはｏＨＡの消化は、圧力サイクラー中で、約５ＫＰＳＩ～約８０ＫＰＳＩの間の範囲のサイクル圧力下、例えば、約５ＫＰＳＩ、約１０ＫＰＳＩ、約１５ＫＰＳＩ、約２０ＫＰＳＩ、約２５ＫＰＳＩ、約３０ＫＰＳＩ、約３５ＫＰＳＩ、約４０ＫＰＳＩ、約４５ＫＰＳＩ、約５０ＫＰＳＩ、約５５ＫＰＳＩ、約６０ＫＰＳＩ、約６５ＫＰＳＩ、約７０ＫＰＳＩ、約７５ＫＰＳＩまたは約８０ＫＰＳＩで実行することができる。

【0094】

ある特定の実施形態では、圧力サイクラーを１つまたはそれ以上のヒアルロノグルコシダーゼ（例えば、ＨＡアーゼ）と共に使用して、約５０ＫＰＳＩ未満、約４０ＫＰＳＩ未満、約３０ＫＰＳＩ未満、または約２０ＫＰＳＩ未満の圧力で、ｘＨＡを消化する。ある特定の実施形態では、圧力サイクラーを１つまたはそれ以上のヒアルロノグルコシダーゼ（例えば、ＨＡアーゼ）と共に使用して、約５ＫＰＳＩ、約１０ＫＰＳＩまたは約１５ＫＰＳＩの圧力で、ｘＨＡを消化する。ある特定の実施形態では、圧力サイクラーを１つまたはそれ以上のヒアルロノグルコシダーゼ（例えば、ＨＡアーゼ）と共に使用して、約１０ＫＰＳＩの圧力で、ｘＨＡを消化する。

【0095】

ある特定の実施形態では、圧力サイクラーを１つまたはそれ以上の酵素（例えば、エンドプロテイナーゼ、タンパク質分解酵素、Ｇｌｕ－Ｃ、Ａｓｐ－Ｎ、Ｌｙｓ－Ｃ、Ａｒｇ－Ｃ、トリプシン、またはキモトリプシンなど）と共に使用して、約８０ＫＰＳＩ未満、約７０ＫＰＳＩ未満、約６０ＫＰＳＩ未満、または約５００ＫＰＳＩ未満の圧力で、ペプチドを消化する。ある特定の実施形態では、圧力サイクラーを１つまたはそれ以上の酵素（例えば、エンドプロテイナーゼ、タンパク質分解酵素、Ｇｌｕ－Ｃ、Ａｓｐ－Ｎ、Ｌｙｓ－Ｃ、Ａｒｇ－Ｃ、トリプシン、またはキモトリプシンなど）と共に使用して、約３５ＫＰＳＩ、約４０ＫＰＳＩまたは約４５ＫＰＳＩの圧力で、ペプチドを消化する。ある特定の実施形態では、圧力サイクラーを１つまたはそれ以上の酵素（例えば、エンドプロテイナーゼ、タンパク質分解酵素、Ｇｌｕ－Ｃ、Ａｓｐ－Ｎ、Ｌｙｓ－Ｃ、Ａｒｇ－Ｃ、トリプシン、またはキモトリプシンなど）と共に使用して、約４０ＫＰＳＩの圧力でペプチドを消化する。

【0096】

ある特定の実施形態では、圧力サイクラーは、ペプチド、ｘＨＡ、および／またはｏＨＡの消化時間を、非加圧条件下での消化と比較して、少なくとも約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または約２４時間以上短縮する。

【0097】

本明細書で使用する場合、「ペプチド消化産物」とは、酵素により生成されるペプチド薬物（例えば、遊離薬物またはプロドラッグ）の任意の一部または部分を指し、インタクトなペプチド薬物より小さい。ある特定の例示的な実施形態では、ペプチド消化産物は、５０未満のアミノ酸長、例えば、約２～約１００の間のアミノ酸長、約３～約７５の間のアミノ酸長、約２～約５０の間のアミノ酸長、約４～約５０の間のアミノ酸長、約５～約４０の間のアミノ酸長、約６～約３０の間のアミノ酸長、もしくは約１５～約２０の間のアミノ酸長、またはこれらの範囲内の任意の値もしくは部分範囲のアミノ酸長である。ある特定の例示的な実施形態では、ペプチド消化産物は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６１、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００のアミノ酸長である。

【0098】

特定の実施形態では、ペプチド消化産物は、約１９アミノ酸長である。他の特定の実施形態では、ペプチド消化産物は、約１アミノ酸長、約２アミノ酸長または約３アミノ酸長である。さらに他の特定の実施形態では、ペプチド消化産物は、約４～約５０の間のアミノ酸長である。さらに他の特定の実施形態では、ペプチド消化産物は、約１５～約２０の間のアミノ酸長である。

【0099】

ある特定の例示的な実施形態では、ペプチド消化産物は、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析法（ＬＣ－ＨＲＭＳ）、ナノ－ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ、高速液体クロマトグラフィー－タンデムＭＳ（ＨＰＬＣ－ＭＳ－ＭＳ）、ナノＨＰＬＣ－ＭＳ－ＭＳ、超高性能（ｕｌｔｒａ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）液体クロマトグラフィー－タンデムＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＳ－ＭＳ）、ナノＵＰＬＣ－ＭＳ－ＭＳ、超高速液体クロマトグラフィー－タンデムＭＳ（ＵＨＰＬＣ－ＭＳ－ＭＳ）、ナノＵＨＰＬＣ－ＭＳ－ＭＳ、紫外（ＵＶ）分光法または蛍光分光法などのようなペプチド同定法を使用して検出される。

【0100】

ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載される方法は、クロマトグラフィー法、例えば、液体クロマトグラフィーのような分離プロセスを利用する。一実施形態によれば、ペプチド消化産物の検出は：（ｉ）高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、（ｉｉ）陰イオン交換、（ｉｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー；（ｉｖ）陽イオン交換；（ｖ）陽イオン交換クロマトグラフィー；（ｖｉ）イオン対逆相クロマトグラフィー；（ｖｉｉ）クロマトグラフィー；（ｖｉｉｉ）一次元電気泳動；（ｉｘ）多次元電気泳動；（ｘ）サイズ排除；（ｘｉ）親和性；（ｘｉｉ）逆相クロマトグラフィー；（ｘｉｉｉ）キャピラリー電気泳動クロマトグラフィー（「ＣＥＣ」）；（ｘｉｖ）電気泳動；（ｘｖ）イオン移動度分離；（ｘｖｉ）電界非対称イオン移動度分離または分光分析（ｆｉｅｌｄ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｒ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ「ＦＡＩＭＳ」）；（ｘｖｉｉ）キャピラリー電気泳動；および（ｘｖｉｉｉ）超臨界流体クロマトグラフィーによって実行される。

【0101】

ペプチド消化産物の量は、ペプチド前駆体イオン、１つまたはそれ以上の断片イオンおよび保持時間からなる多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジションの測定によって決定することができる。この測定は、例えば、三連四重極型機器で実行される。シグネチャーもまた、保持時間とインタクトなペプチドの正確な高分解能質量分析との組合せによって得ることができる。これらの定量化方法は、通常、標識した内部標準および外部の合成ペプチドの検量線を必要とする。

【0102】

ある特定の例示的な実施形態では、ペプチド薬物に対応する標識ペプチド、例えば、ＳＡＲ４２５８９９のＣ末端のＡｓｐ－Ｎによる消化産物に対応する標識したＣ末端ペプチドを含む内部標準が使用される。内部標準は、通常、既知のペプチド配列を有し、既知量で用意される。一部の実施形態では、標準は、１つまたはそれ以上の重同位体、例えば、^１３Ｃまたは^１５Ｎで標識される。

【0103】

本明細書に記載されるペプチド消化産物のプロファイリング方法は、ヒドロゲルプロドラッグ製剤中に存在する薬物の量を測定するのに有用である。本明細書に記載される方法はまた、バッチ間再現性査定を実行するためにも有用である。

【0104】

本明細書で使用する場合、「サンプル」とは、ペプチド薬物を（例えば、プロドラッグ形態で）含有する任意の組成物を指す。例示的なサンプルには、以下に限定されないが、医薬組成物、および溶出媒体または放出媒体などが含まれる。ある特定の実施形態では、サンプルはヒドロゲルである。他の実施形態では、サンプルは水性である。

【0105】

本明細書に記載される定量化方法において使用されるサンプルは、経口、舌下、粘膜、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、非経口または吸入による投与のための液体製剤のような治療用組成物とすることができる。

【0106】

他の実施形態では、サンプルは、ナノ粒子、カプセル、フィルムもしくは錠剤、またはヒドロゲル（例えば、ｘＨＡヒドロゲル）のようなゲルなどの基剤を含む。本明細書に記載される定量化方法は、例えば、ナノ粒子中もしくはカプセル中、またはフィルム中もしくはヒドロゲル（例えば、ｘＨＡヒドロゲル）中のような基剤中のペプチド薬物の量を定量するのに有用である。放出は、基剤、例えばｘＨＡヒドロゲルの内部から、または基剤の外部（例えば、表面）からとすることができる。一実施形態では、放出プロファイルは、ペプチド薬物の完全放出を実行することによってアッセイし、次いで、ある期間にわたり、または異なる培養条件もしくは溶液条件（例えば、様々な温度またはｐＨなど）などで、制御放出をアッセイする。制御放出アッセイにおいて放出されるペプチド薬物の量は、通常、完全放出条件下で放出されるペプチド薬物の量と比較した際の分率またはパーセンテージとして報告される。

【0107】

本明細書で使用する場合、「溶出媒体」、「溶出媒体（複数）」、「放出媒体」および「放出媒体（複数）」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物放出情報を得るために使用される組成物を指す。溶出媒体または放出媒体は、例えば、サンプル中のペプチド薬物の放出および／または安定性を決定するためのサンプルの品質管理試験に有用である。好適な溶出媒体または放出媒体を選ぶ際に、ペプチド薬物の分析標的プロファイル（例えば、遅延放出、一定放出、および持続放出など）および／またはペプチド薬物の溶解性プロファイルを決定することは有用である。溶出媒体の選択のレビューについては、ＭａｒｔｉｎおよびＧｒａｙ（２０１１年夏）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを参照されたい。

【0108】

本明細書で使用する場合、「放出速度」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ放出試験において、ペプチド薬物がヒドロゲルプロドラッグ製剤から周囲媒体の中へと流れ込む速度を指す。例示的な一実施形態では、最初に、組成物を適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ放出媒体の中に懸濁させることによって、組成物を放出試験用に製造する。これは、一般に、基剤（例えば、ヒドロゲル）を遠心分離して沈殿させた後で緩衝液を交換し、穏やかな条件を使用して基剤を再構成することによって実行される。ある特定の実施形態では、アッセイは、適切な温度制御装置の中で３７℃にてサンプルを懸濁することによって開始される。サンプルは通常、様々な時点で除去される。

【0109】

当業者には容易に理解されるであろうが、本明細書に記載される方法の他の好適な変更および翻案が、好適な均等物を使用して、本明細書に開示されている実施形態の範囲から逸脱することなくなされることがある。ここに、ある特定の実施形態を詳細に説明してきたが、同様のことが、以下の実施例を参照することによってより明確に理解されるであろう。以下の実施例は、説明する目的のみで含まれており、限定を意図するものではない。

【0110】

［実施例Ｉ］
プロドラッグ製剤中に存在するペプチド薬物の定量化
ＳＡＲ４２５８９９は、グルカゴン受容体およびＧＬＰ１受容体を標的とする二重受容体アゴニストである。クリアランスが急速であるため、１日１回の投与が必要である。投与の頻度を低減するために、１日１回のＳＡＲ４２５８９９ペプチド薬物の候補（図１）を、自己切断型リンカーを介してポリマー担体（架橋ヒアルロン酸（ｘＨＡ））に結合させて、活性なペプチド薬物が、不活性なプロドラッグ（図２）から緩効性放出するようにした。ＳＡＲ４２５８９９プロドラッグは、自己切断可能リンカー（Ｌ）を介して、ＳＡＲ４２５８９９リポペプチド（Ｐ）に結合している架橋ヒアルロン酸（ｘＨＡ）を含む。

【0111】

ヒドロゲルのペプチド負荷量の決定は、投与および品質管理のために必要である。架橋ヒアルロン酸は、水性環境中で数百万ダルトンのヒドロゲルを形成する。溶解しているペプチドの基本的な定量化に通常適用されるＵＶ簡易測定は、ヒドロゲルに適用することができない。なぜなら、この分析には、ヒドロゲル－リンカー－ペプチドが十分に溶解している必要があるからである。リンカーは自己切断型であるが、生理学的条件下での完全な切断は、意図的に極めて緩慢であり、したがって、完全放出が達成されたという確実性を必要とする分析的定量化方法には適していない。

【0112】

この分析的な課題に対処し、ペプチド負荷量決定を可能にするために、バイオポリマーのプロドラッグ中のペプチド薬物負荷を重量／重量パーセントとして測定する正確な定量化を可能にする新規な方法が開発された。バイオポリマー－リンカー－ペプチド薬物は、原則として、切断または加水分解することができる任意の小分子（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドなど）薬物に適用することができ、この方法は、バイオポリマーを含有するプロドラッグの薬物負荷量決定に広く適用することができる。

【0113】

この方法は、二重酵素消化の後にペプチドに相当する消化産物を定量化することに基づいている。最初に、架橋ヒアルロン酸－リンカー－ペプチド（ｘＨＡ－Ｌ－Ｐ）を、架橋ヒアルロン酸を消化する酵素で消化する。次に、タンパク質分解酵素を適用して、結合しているペプチドを消化し、タンパク質分解性消化産物を産生する。続いて、このタンパク質分解性消化産物（ペプチドに相当する）を定量化する。

【0114】

ｘＨＡ－Ｌ－Ｐは、秤量され、緩衝液中ヒドロゲルとして部分的に溶解する。ヒドロゲルは酵素的に分解されて、複数の可溶性のオリゴマーのヒアルロン酸－リンカー－ペプチド（ｏＨＡ－Ｌ－Ｐ）になる。得られたｏＨＡ－Ｌ－Ｐのヒアルロン酸オリゴマーは不均質な混合物であり、ペプチド、リンカーおよび長さの異なるオリゴマーのヒアルロン酸からなる。このオリゴマーのヒアルロン酸の不均質性は、定量化には望ましくなく、この理由のため、第２の酵素的（例えば、タンパク質分解の）消化工程を導入し、ペプチド薬物の部分を消化して、均質な１９アミノ酸のＣ末端ペプチド消化産物であるＤＦＩＥ．．．．．ＰＰＰＳ－ＮＨ_２（図３）を産生する。このＣ末端ペプチドを、ＬＣ／ＨＲＭＳを使用して、検出し、定量化する。

【0115】

前もってヒアルロノグルコシダーゼ処置をせずに、Ａｓｐ－Ｎを使用してプロドラッグを消化すると、おそらく架橋ヒアルロン酸によるＡｓｐ－Ｎ活性の立体障害が原因で、Ｃ末端ペプチドの収率は低かった（図５）。リンカーの加水分解は、定量化のためのペプチド放出方法としては実用的でないと判断した。

【0116】

ＨＡの消化方法を開発した（図６）。続くエンドプロテイナーゼ（例えば、Ａｓｐ－Ｎ）による消化に好適な消化条件を使用した。ＨＡを消化することができる複数種の酵素（例えば、ＨＡアーゼ）を試験した。

【0117】

架橋ヒアルロン酸の消化は、遊離ＳＡＲ４２５８９９のＡｓｐ－Ｎによる消化を妨げず（図７Ａ～図７Ｆ）、続くＡｓｐ－Ｎでの消化によるＣ末端ペプチド消化産物の収率を有意に増加させることが示された（図８Ａ～図８Ｂ）。実際、Ａｓｐ－Ｎタンパク質分解酵素は、ＳＡＲ４２５８９９ペプチドに対して１００％に近い消化効率をもたらしたことが判明した。

【0118】

Ａｓｐ－Ｎは、ＳＡＲ４２５８９９を、緩衝液中で、およびＨＡ消化産物の存在下で完全に消化することが示された（図４）。消化は、ＨＡ－リンカー－ペプチドについて、ＨＡアーゼによる消化、次にＡｓｐ－Ｎを用いる消化、および反応停止を三重反復で実行した。その後の加水分解を３７℃で２４時間実行して、任意の結合しているインタクトなペプチドを放出し、ＬＣ／ＭＳ分析の前に内部標準（ＩＳ）を添加した。Ｃ末端ペプチドに対する放出されたインタクトなペプチドの比は０．０００６であった。

【0119】

二重消化は、ＨＡ－リンカー－ペプチドについて、ＨＡアーゼを用いての２×２４時間、次にＡｓｐ－Ｎを用いる消化、および反応停止を三重反復で実行した。その後の３７℃での加水分解を２４時間実行して、任意の結合しているインタクトなペプチドを放出し、ＬＣ／ＭＳ分析の前にＩＳを添加した。インタクトなペプチドは観察されなかった。

【0120】

消化は、ＨＡ－リンカー－ペプチドについて、ＨＡアーゼを用いての１４日間、次にＡｓｐ－Ｎを用いる消化を三重反復で実行した。１日の消化と比較して、Ｃ末端ペプチドの増加は観察されなかったが、Ｃ末端ペプチドの異性体が、通常のＣ末端ペプチドよりわずかに早く溶離しているのが観察された。

【0121】

反応生成物のＬＣ／ＭＳを次のように実行した。観察された吸着問題を防ぐために、サンプルおよび標準を、２５％アセトニトリル（ＡＣＮ）、０．１％ギ酸（ＦＡ）の中で製造した。Ｌｕｎａ ＯｍｅｇａＣ１８カラム１００×２．１ｍｍ、１００Ａ（品番ＯＯＤ－４７４２－ＡＮ）（Ｓ／Ｎ Ｈ１６－１６８８８６）を備えたＡｃｃｅｌａ １２５０ＬＣシステムを５０℃で操作して、分離を実行した。

【0122】

移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液Ｍｏ；移動相Ｂ：ＡＣＮ０．１％ギ酸；流速は４００μＬ／分とした。勾配は７分で５％～５０％Ｂ、９９％Ｂで３０秒間保持、５％Ｂで２．５分間平衡化。２０％Ｂで開始した勾配も適用し、実行可能であった。

【0123】

溶離液を、Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＥＬＩＴＥの中に、標準的なＨＥＳＩ ＥＳＩ源を使用し、陽イオンモードで操作して導入した。６００００＠ｍ／ｚ４００のＯｒｂｉｔｒａｐ分解能を適用した。ｍ／ｚ範囲３５０～１５００。

【0124】

インタクトなペプチドは残留せず、全てのペプチドが消化産物に変換されたことが判明した。

【0125】

【表1】

表１．ｘＨＡを、ＨＡアーゼ－１を用いて消化、Ｃ末端ペプチド（Ａｓｐ－Ｎによる消化産物に対応）を添加、ＬＣ／ＭＳにより分析（実験＃１）；ｘＨＡを、ＨＡアーゼ－１を用いて消化、全長ペプチドを添加、Ａｓｐ－Ｎを用いて消化、ＬＣ／ＭＳにより分析（実験＃２）；ｘＨＡを、ＨＡアーゼ－２を用いて消化、Ａｓｐ－Ｎによる消化物に対応するＣ末端ペプチドを添加、ＬＣ／ＭＳにより分析（実験＃３）；ｘＨＡを、ＨＡアーゼ－２を用いて消化、全長ペプチドを添加、Ａｓｐ－Ｎを用いて消化、ＬＣ／ＭＳにより分析（実験＃４）；対照－全長ペプチドを添加、Ａｓｐ－Ｎを用いて消化、ＬＣ／ＭＳにより分析（実験＃５）；ｘＨＡ－リンカー－ペプチドを、ＨＡアーゼ－１を用いて消化、次いでＡｓｐ－Ｎを用いて消化、ＬＣ／ＭＳにより分析（実験＃６）；ｘＨＡ－リンカー－ペプチドを、ＨＡアーゼ－２を用いて消化、次いでＡｓｐ－Ｎを用いて消化、ＬＣ／ＭＳにより分析（実験＃７）。

【0126】

連続した二重消化の後のＣ末端ペプチドの高収率は、幾つかの方法で示された（図１０）。二重消化を進行させ、その後、全ての酵素活性を煮沸によって反応停止した。続いて、リンカーを介してヒアルロン酸に結合したままである可能性がある任意のインタクトなペプチドの放出を、加水分解を３７℃で進行させることにより、実行した。インタクトなペプチドは、全く観察されない、または極めてわずかな量しか観察されず、二重消化の結果、全てのペプチド薬物分子がほぼ完全に消化されたことを示していた。別の実験において、２週間にわたる加水分解による放出をした後に、Ａｓｐ－Ｎを用いて消化をしても、産生されたＣ末端ペプチドの量は、二重消化手順より多くなかった。方法の適格性評価の一環として、得られたｘＨＡ－Ｌ－Ｐのバッチは１８％のペプチド負荷を有しており、これは幾つかのロットについて２０％前後の負荷を示すとして得られた結果と一致していたことが、分析的に示された（化学的理論に縛られるものではないが、２０％という低めの量は、凍結乾燥した材料の、水の吸収に起因するものであった）。凍結乾燥したヒドロゲルが水を吸収すると、結果的に、秤量された量は、水の追加が原因で、含有するペプチドのパーセンテージがより低くなる。このため、ペプチドのパーセンテージは２０％～１８％になり得る。対策としては、秤量される材料が湿度の高い空気条件に曝露されないように注意を払うことである。

【0127】

ペプチドを含有していなかった架橋ＨＡを消化し、マトリックスとして使用した。この消化産物（マトリックス）に、ＳＡＲ４２５８９９のＣ末端のＡｓｐ－Ｎによるペプチド消化産物に対応する合成の非標識Ｃ末端ペプチドを添加し、希釈系列を生成した。重同位体標識したＣ末端ペプチドを内部標準として適用した。曲線を、２５％ＡＣＮおよび０．１％ギ酸の緩衝液中で作製した同等の曲線と比較した。

【0128】

両曲線をＬＣ／ＭＳ分析により分析して、傾きが互いの１５％以内であるかどうかを判定した。これは緩衝液の検量線を許容するための最低基準である。

【0129】

本明細書に記載される方法を使用するペプチドの定量化には再現性があった。ＨＡ－リンカーペプチドの３つのアリコートを秤量し、ＨＡアーゼおよびＡｓｐ－Ｎを用いて消化した。消化産物を２５％ＡＣＮに調整し、次いで、さらに１００倍に希釈し、その後、重同位体標識した内部標準（Ｈ－ＩＳ）を添加することによってさらに２倍希釈した。２倍希釈工程で、１０μｇ／ｍＬから２０ｎｇ／ｍＬまでの１０ポイントの標準曲線を作製した。Ｈ－ＩＳを１：１ｖｏｌ：ｖｏｌ添加することによって曲線をさらに２倍希釈した。

【0130】

この方法はマトリックスに堅実に適応した（図７Ａ～図７Ｆ）。緩衝液中のＣ末端ペプチドの検量線は、架橋ヒアルロン酸（ｘＨＡ）の消化物によって生成された抽出マトリックス中の検量線と同様の傾きを示した（図９Ａ、９Ｂ、１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ、１２Ｂ、１３Ａおよび１３Ｂ）。ｘＨＡの消化によって生成されたマトリックスは、Ａｓｐ－Ｎの消化効率を妨げなかったことも確認された。

【0131】

複数種の市販のヒアルロニダーゼを試験し、ＨＡアーゼ２が優位であると判定した。さらに、Ｃ末端ペプチドは、気相衝突誘発性断片化（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ：ＣＩＤ）を受けると、ほぼ完全な断片系列を生成したこと、およびこれらの断片は、初期研究に適用した高分解能質量分析に基づく方法（ＬＣ／ＨＲＭＳによる定量化）の代替として、多重反応モニタリング定量化法ＭＲＭ（ＬＣ／ＭＳＭＲＭ）の開発に好適な強度を示したことが実証された。

【0132】

ＵＶまたは蛍光検出法の前提条件は、分析物が可溶性であることである。ｘＨＡ－Ｌ－Ｐは可溶性ではない。一方で、ｏＨＡ－Ｌ－Ｐは水溶性であり、したがって、ＵＶまたは蛍光の分析に利用できる。しかしながら、ｘＨＡ－Ｌ－ＰからｏＨＡ－Ｌ－Ｐを産生するのに必要な消化のためには、ヒアルロノグルコシダーゼ、例えば、ヒアルロニダーゼまたはＨＡリアーゼを、その混合物中に導入する。ヒアルロノグルコシダーゼ、例えば、ヒアルロニダーゼまたはＨＡリアーゼは、それ自体がＵＶを吸収するタンパク質である。したがって、ヒアルロノグルコシダーゼは、最初の消化工程の後で除去され、その後、直接ＵＶ検出を行うことになる。この方法は、制御された分析用の開発／製造環境には、なお一層適しているであろう。

【0133】

ＰがＳＡＲ４２５８９９であるｘＨＡ－Ｌ－Ｐの別々の３バッチのペプチド負荷量を決定した（図１４）。優れた線形性が、マトリックス効果なしに認められた。全プロセス反復に良好な再現性が達成され、その結果は、直交ＮＭＲを使用して得られた結果と一致していた。本明細書に記載される方法は、広く適用可能であり、製剤の最適化を補助するために適用されている。本明細書に記載される方法は、広範囲のポリマーおよびペプチド薬物を使用する、切断可能なリンカーおよび切断不可能なリンカーの両方のケースに適用できる。

【0134】

まとめ
ＨＡ－リンカー－ＳＡＲ４２５８９９、ＳＡＲ４２５８９９、および断片／消化産物の分析のためのＬＣ／ＭＳ法が開発された。ＳＡＲ４２５８９９はＡｓｐ－Ｎによって完全に切断され、定量化のためのＣ末端ペプチド断片が放出されることが実証された。ＨＡ－リンカー－ＳＡＲ４２５８９９はＡｓｐ－Ｎによる初期切断が実証されたが、その消化は、適度なＬＣ／ＭＳ反応に基づくと、不完全である可能性があった。

【0135】

複数種のＨＡアーゼを試験した。ＨＡリアーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）ＥＣ４．２．２．１は、Ａｓｐ－Ｎによる消化産物の収率を有意に増加させたことが示された。同位体標識したＣ末端ペプチドを導入し、付着問題が解決された後に、その線形性の範囲が示された。消化効率を評価する諸実験を行った。マトリックス曲線の試験は、マトリックス効果はなく、傾きがわずか３％の差の良好なマトリックス曲線対緩衝液曲線のアライメントを示した。三重反復の秤量、処理および分析は、７．５％ＣＶの良好な再現性を示した。

【0136】

あるサンプルロット中のペプチドの総パーセンテージは１８％であることが分かった（サンプルの含水量は、特に複数回の凍結融解（室温）サイクル後は不明であった）。

【0137】

［実施例ＩＩ］
プロドラッグ製剤中に存在するペプチド薬物の定量化のための圧力サイクラー
ＳＡＲ４２５８９９プロドラッグ中に負荷された薬物の量を、プロドラッグの水和および変性による新規な圧力サイクラープロセスを使用して決定した。消化反応は、ＡｓｐＮを用いるＳＡＲ４２５８９９の消化を試験した（１００％の反応が１時間で達成された）。圧力サイクラーを使用して２４時間から２時間へのｘＨＡ消化時間の短縮を可能にする条件が確認された。

【0138】

ＨＡアーゼは、極めて高い圧力に感受性があるようであった。したがって、１０ＫＰＳＩの最高圧力を適用し、より高い酵素濃度を使用した。最適条件下、２時間の圧力サイクラーの補助による消化で、より高いｏＨＡ－Ｌ－Ｐ消化物濃度が観察された。

【0139】

１６サンプルを同時にアッセイした（５０～１５０μＬ／サンプル）。圧力上昇／低下の速度を制御した。圧力プロファイルの形状（正弦波／方形波など）を観察した。サンプルの温度を、内蔵電熱器を使用して制御した。使用した最高圧力は４０ＫＰＳＩであった。典型的なアッセイは、大気圧から１０～４０ＫＰＳＩまでを１Ｈｚサイクルで適用し、１時間の持続時間で行った。

【0140】

３７℃で毎分１回の４０ｋＰＳＩ圧力サイクル下でのｏＨＡ－Ｌ－ＰのＡｓｐＮによる消化は、３７℃で大気圧でのｏＨＡ－Ｌ－Ｐの１２時間のＡｓｐＮによる消化と同程度に有効であると判定した。全ての実験を、Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｂａｒｏｃｙｃｌｅｒ（モデル２３２０ＥＸＴ、Ｓｏｕｔｈ Ｅａｓｔｏｎ、ＭＡ）を使用して行った。

【0141】

３７℃で、４０ＫＰＳＩ圧力と大気圧との間を１分間隔で１時間サイクルすることを使用するＡｓｐＮによる消化は、３７℃で大気圧下での１２時間と同様の消化効率をもたらしたことが確定した。同様に、ＨＡアーゼ（ＥＣ４．２．２．１）を、１０ＫＰＳＩ圧力と大気圧との間を１分のサイクル時間で２時間サイクルすることを使用して消化した。これにより、観察されたオリゴマーに基づくと、３７℃で大気圧下での２４時間の消化のような結果が得られた。

【0142】

全般に、新規な各酵素を、温度および圧力、圧力プロファイル、適用される圧力の頻度および持続時間に関して最適化した。

【0143】

サンプル純度および主要不純物の判定を分析した（図１５）。穏やかな加水分解条件下でのインタクトなペプチドの放出を確認した（４℃、１４日間、または３７℃、２４時間）。両方の放出方法が、ＬＣ／ＭＳによる不純物分析に十分な材料を産生し、０．０１％以下であった。放出しても不純物を産生しないことが実証された。

【0144】

リンカー－ペプチドの対照を、ｔ＝０および全放出時間で分析した。ｔ＝０で高レベルの不純物がリンカー－ペプチドに観察された。不純物分析は、放出されたペプチドのＬＣ／ＭＳをアッセイすることによって実行した。

【0145】

総合的結論
ＬＣ／ＭＳ法による定量化の完成および実行が成功した。完全なＡｓｐＮによる消化を生み出す消化条件が実証された。マトリックスは問題ではないことが分かった。方法の良好な再現性および線形性が実証された。

【0146】

ＬＣ／ＭＳによって得られた結果は、直交性ＮＭＲ法によって得られた結果と一致していた。第二世代圧力サイクラーを使用する方法は、総分析時間を有意に短縮した。この方法は、参照方法として、および製剤最適化研究を補助するための両方に適用される。不純物の放出および分析の方法が確立した。例えば、放出条件が確立され、不純物が検出され、同定された。

【0147】

均等物
本開示は、その趣旨または本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化することができる。したがって、上記の実施形態は、あらゆる点で、本開示を限定するものではなく、説明するものと考えられるべきである。したがって、本開示の範囲は、上記の説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、したがって、特許請求の範囲の意味および均等範囲の中にある全ての変更は、本明細書に包含されるものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

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