特許 7579577 標的核酸断片の検出方法及びキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-30

(45)【発行日】2024-11-08

(54)【発明の名称】標的核酸断片の検出方法及びキット

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20241031BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20241031BHJP

   C12Q 1/34 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 11/00 20060101ALI20241031BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20241031BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20241031BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20241031BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12Q1/6876 Z ZNA

C12Q1/34

C12N11/00

C12M1/34 E

G01N37/00 102

G01N21/64 Z

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2021529209

(86)(22)【出願日】2020-07-06

(86)【国際出願番号】 JP2020026371

(87)【国際公開番号】W WO2021002476

(87)【国際公開日】2021-01-07

【審査請求日】2023-04-14

(31)【優先権主張番号】P 2019125564

(32)【優先日】2019-07-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国立研究開発法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業 チーム型研究（さきがけネットワーク）「１分子機能カウンティングから紐解く高次生命科学」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】503359821

【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100165179

【弁理士】

【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100175824

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100152272

【弁理士】

【氏名又は名称】川越 雄一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100181722

【弁理士】

【氏名又は名称】春田 洋孝

(72)【発明者】

【氏名】渡邉 力也

(72)【発明者】

【氏名】濡木 理

(72)【発明者】

【氏名】西増 弘志

【審査官】藤澤 雅樹

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１７／０３６２６４４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／１１５６３５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／０９８３０１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／１０４０５８（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｇ０１Ｎ ３７／００

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｃ１２Ｎ １１／００

Ｃ１２Ｑ １／００－３／００

Ｇ０１Ｎ ２１／００

Ｃ１２Ｍ １／３００－３／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中の標的核酸断片の検出方法であって、
前記試料を、前記標的核酸断片に相補的なｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、及び、基質核酸断片と接触させる工程であって、
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、前記ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであり、
前記基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものであり、
前記接触を１０ａＬ～１００ｐＬの容積を有する反応空間内で行い、その結果、前記試料中に前記標的核酸断片が存在した場合に前記３者複合体が形成されて前記基質核酸断片が切断され、前記蛍光物質が前記消光物質から離れる工程と、
前記蛍光物質に前記励起光を照射し、前記蛍光を検出する工程と、
を含み、前記蛍光が検出されたことが、前記試料中に前記標的核酸断片が存在することを示し、
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質である、方法。

【請求項2】

前記標的核酸断片が、前記反応空間１つあたりに０個又は１個導入される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記反応空間が基板上に形成されたウェルである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、前記ウェルの内表面に固定されている、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

容積が１０ａＬ～１００ｐＬであるウェルが表面に形成された基板と、
標的核酸断片に相補的なｇＲＮＡと、
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質と、
基質核酸断片と、を含み、
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、前記ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであり、
前記基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものであり、
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質である、
前記標的核酸断片の検出用キット。

【請求項6】

前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、前記ウェルの内表面に固定されている、請求項５に記載のキット。

【請求項7】

前記ｇＲＮＡが、前記ウェルの内表面に固定されている、請求項５又は６に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、標的核酸断片の検出方法及びキットに関する。本願は、２０１９年７月４日に、日本に出願された特願２０１９－１２５５６４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

【背景技術】

【0002】

試料中の標的核酸断片を高感度に検出する技術が求められている。例えば、血液中には、細胞死によって細胞から放出された遊離ＤＮＡ（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ）が存在することが知られている。癌患者のｃｆＤＮＡの中には癌細胞由来のＤＮＡである血中腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ）も含まれている。

【0003】

また、被験者の咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液等の試料中に、感染症の原因ウイルスが存在するか否かを試験する需要がある。

【0004】

また、様々な細胞がエクソソームと呼ばれる膜小胞を分泌し、唾液、血液、尿、羊水、悪性腹水等の生体試料や、培養細胞の上清中には、エクソソームが含まれていることが知られている。エクソソームには、それを分泌した細胞に由来する様々なタンパク質、脂質、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＤＮＡ等が含まれている。

【0005】

近年、ｃｆＤＮＡや、エクソソーム等の膜小胞中のｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＤＮＡ等を検出し、癌やその他の様々な疾患の早期発見、抗癌剤の効果予測、病気の素因診断、遺伝性疾患の診断等に応用する研究が行われている。試料中の標的核酸断片を高感度に検出する技術は、一例として、このような分野に適用することができる。

【0006】

ところで、原核生物において発見された獲得免疫機構はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと呼ばれており、近年ゲノム編集に応用されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質には複数のファミリーが存在する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質ファミリーのうち、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３は、ｃｒＲＮＡ及び標的核酸と３者複合体を形成し、標的核酸を切断すると、周囲のＤＮＡ又はＲＮＡを切断する活性を発現することが明らかにされている。例えば、非特許文献１～３には、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３のこのような活性を利用して、標的核酸断片を高感度に検出する方法が報告されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【文献】Gootenberg J. S., et al., Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2., Science, 356 (6336), 438-442, 2017.

【文献】Gootenberg J. S., et al., Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6., Science, 360 (6387), 439-444, 2018.

【文献】Chen J. S., et al., CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity., Science, 360 (6387), 436-439, 2018.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

しかしながら、非特許文献１～３に記載された方法では、標的核酸断片を増幅する工程を必要とする。そこで、本発明は、標的核酸断片を増幅しなくても高感度に検出することができる技術を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は以下の態様を含む。
［１］試料中の標的核酸断片の検出方法であって、前記試料を、前記標的核酸断片に相補的なｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、及び、基質核酸断片と接触させる工程であって、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、前記ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであり、前記基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記接触を１０ａＬ～１００ｐＬの容積を有する反応空間内で行い、その結果、前記試料中に前記標的核酸断片が存在した場合に前記３者複合体が形成されて前記基質核酸断片が切断され、前記蛍光物質が前記消光物質から離れる工程と、前記蛍光物質に前記励起光を照射し、前記蛍光を検出する工程と、を含み、前記蛍光が検出されたことが、前記試料中に前記標的核酸断片が存在することを示す、方法。
［２］前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質である、［１］に記載の方法。
［３］前記標的核酸断片が、前記反応空間１つあたりに０個又は１個導入される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記反応空間が基板上に形成されたウェルである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、前記ウェルの内表面に固定されている、［４］に記載の方法。
［６］容積が１０ａＬ～１００ｐＬであるウェルが表面に形成された基板と、標的核酸断片に相補的なｇＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質と、基質核酸断片と、を含み、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、前記ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであり、前記基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものである、前記標的核酸断片の検出用キット。
［７］前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質である、［６］に記載のキット。
［８］前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、前記ウェルの内表面に固定されている、［６］又は［７］に記載のキット。
［９］前記ｇＲＮＡが、前記ウェルの内表面に固定されている、［６］～［８］のいずれかに記載のキット。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、標的核酸断片を増幅しなくても高感度に検出することができる技術を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】（ａ）及び（ｂ）は、標的核酸断片の検出方法を説明する模式図である。

【図2】（ａ）は、流体デバイスの一例を示す上面図である。（ｂ）は、（ａ）のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。

【図3】（ａ）～（ｃ）は、本実施形態の方法を実施する手順の一例を説明する模式断面図である。

【図4】（ａ）～（ｄ）は、ウェルの内表面にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を固定する方法を説明する模式図である。

【図5】（ａ）～（ｆ）はウェルアレイの形成の各工程を説明する模式断面図である。

【図6】（ａ）～（ｃ）は、実験例１の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。（ｄ）は、実験例１の結果を示すグラフである。

【図7】（ａ）～（ｃ）は、実験例２の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。（ｄ）は、実験例２の結果を示すグラフである。

【図8】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３の結果を示すグラフである。

【図9】（ａ）～（ｄ）は、実験例４の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。

【図10】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４の結果を示すグラフである。

【図11】実験例４の結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。

【0013】

［標的核酸断片の検出方法］
１実施形態において、本発明は、試料中の標的核酸断片の検出方法であって、試料を、標的核酸断片に相補的なｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、及び、基質核酸断片と接触させる工程と、基質核酸断片に励起光を照射し、蛍光を検出する工程と、を含み、蛍光が検出されたことが、前記試料中に前記標的核酸断片が存在することを示す、方法を提供する。

【0014】

本実施形態の方法において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものである。また、基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、上記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものである。また、試料、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質及び基質核酸断片の接触は１０ａＬ～１００ｐＬの容積を有する反応空間内で行う。

【0015】

この結果、試料中に標的核酸断片が存在した場合に上記３者複合体が形成されて基質核酸断片が切断され、蛍光物質が消光物質から離れる。そして、励起光を照射すると蛍光が検出される。

【0016】

図１（ａ）及び（ｂ）は、本実施形態の方法を説明する模式図である。図１（ａ）及び（ｂ）では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がＣａｓ１２ａタンパク質である場合を例に説明する。

【0017】

まず、図１（ａ）に示すように、Ｃａｓ１２ａタンパク質１１０と、ｇＲＮＡ１２０とを接触させると、これらは結合し、２者複合体１３０を形成する。ｇＲＮＡ１２０は、一部に標的核酸断片１４０と相補的な塩基配列を有している。

【0018】

続いて、２者複合体１３０に試料中の標的核酸断片１４０が接触すると、Ｃａｓ１２ａタンパク質１１０、ｇＲＮＡ１２０、標的核酸断片１４０が３者複合体１００を形成する。この段階では、Ｃａｓ１２ａタンパク質１１０は、ヌクレアーゼ活性を発現していないため、基質核酸断片１５０は切断されない。図１（ａ）及び（ｂ）の例では、基質核酸断片１５０は、蛍光物質Ｆ及び消光物質Ｑで標識された１本鎖ＤＮＡ断片である。基質核酸断片１５０に励起光を照射しても蛍光は発生しない。

【0019】

３者複合体１００が形成されると、Ｃａｓ１２ａタンパク質１１０が、標的核酸断片１４０の標的部位を切断する。図１（ａ）では、標的核酸断片１４０の標的部位を矢頭で示す。図１（ｂ）は、標的核酸断片１４０の標的部位が切断された３者複合体１００’を示す模式図である。図１（ｂ）に示すように、３者複合体１００’はヌクレアーゼ活性を発現する。そして、３者複合体１００’の周囲に存在する基質核酸断片１５０を切断する。この結果、基質核酸断片１５０の蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから離れる。消光物質Ｑから離れた蛍光物質Ｆは、励起光の照射により蛍光を発する。

【0020】

続いて、上記蛍光物質Ｆに励起光を照射し、蛍光を検出する。蛍光が検出された場合、試料中に標的核酸断片１４０が存在していたと判断することができる。

【0021】

本実施形態の方法において、試料、ｇＲＮＡ１２０、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０、基質核酸断片１５０は、どのような順序で混合して接触させてもよい。

【0022】

例えば、まず、ｇＲＮＡ１２０及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０を接触させて、予め２者複合体１３０を形成させた後に、試料を接触させてもよい。この場合、試料中に標的核酸断片１４０が存在する場合には、２者複合体１３０に標的核酸断片１４０が結合し、３者複合体１００が形成される。その後、基質核酸断片１５０を接触させてもよい。

【0023】

あるいは、２者複合体１３０を形成した後に、標的核酸断片１４０及び基質核酸断片１５０を同時に接触させてもよい。

【0024】

あるいは、ｇＲＮＡ１２０、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０、試料を同時に接触させてもよい。この場合においても、試料中に標的核酸断片１４０が存在する場合、最終的には３者複合体１００が形成される。その後、基質核酸断片１５０を接触させてもよい。

【0025】

あるいは、試料、ｇＲＮＡ１２０、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０、基質核酸断片１５０を同時に接触させてもよい。この場合においても、試料中に標的核酸断片１４０が存在する場合、最終的には３者複合体１００が形成され、３者複合体１００において、標的核酸断片１４０の標的部位が切断されると、３者複合体１００’に変換され、ヌクレアーゼ活性を発現し、基質核酸断片１５０が切断される。

【0026】

（試料）
試料としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、唾液、血液、尿、羊水、悪性腹水、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液等の生体試料や、培養細胞の上清等が挙げられる。

【0027】

（標的核酸断片）
試料中の標的核酸断片としては、例えば、上述した、ｃｆＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、エクソソーム由来のＤＮＡ等が挙げられる。例えば、癌遺伝子のホットスポット領域を含む核酸断片を標的核酸断片とすることにより、試料中に含まれる癌遺伝子の変異を検出することもできる。

【0028】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がＣａｓ１２タンパク質である場合、標的核酸断片として二本鎖ＤＮＡ断片を検出することができる。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がＣａｓ１３タンパク質である場合、標的核酸断片として一本鎖ＲＮＡ断片又は一本鎖ＤＮＡ断片を検出することができる。

【0029】

（ｇＲＮＡ）
本実施形態の方法において、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質に用いることができるものであれば特に限定されず、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との複合体であってもよいし、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡを組み合わせた単一のｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよいし、ｃｒＲＮＡのみであってもよい。

【0030】

使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がＣａｓ１２ａタンパク質である場合、ｃｒＲＮＡは、例えば、次の塩基配列とすることができる。まず、標的塩基配列からプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を除いた塩基配列をスペーサー塩基配列とする。続いて、スペーサー塩基配列の３’末端に、スキャフォールド配列を連結した塩基配列を設計し、その相補鎖をｃｒＲＮＡの塩基配列とする。

【0031】

例えば、標的塩基配列からＰＡＭ配列を除いた塩基配列が「5'-GCCAAGCGCACCTAATTTCC-3'」（配列番号１）である場合、Ｃａｓ１２ａタンパク質用のｃｒＲＮＡの塩基配列は「5'-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGAAAUUAGGUGCGCUUGGC-3'」（配列番号２）とすることができる。

【0032】

使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がＣａｓ１３ａタンパク質である場合、ｃｒＲＮＡは、例えば、次の塩基配列とすることができる。まず、標的塩基配列に相補的な塩基配列の３’末端に、スキャフォールド配列を連結した塩基配列を設計し、その相補鎖をｃｒＲＮＡの塩基配列とする。

【0033】

例えば、標的塩基配列が「5'-AUGGAUUACUUGGUAGAACAGCAAUCUA-3'」（配列番号３）である場合、Ｃａｓ１３ａタンパク質用のｃｒＲＮＡの塩基配列は「5'-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUAGAUUGCUGUUCUACCAAGUAAUCCAU-3'」（配列番号４）とすることができる。

【0034】

標的塩基配列は、標的核酸断片の塩基配列の部分塩基配列である。標的塩基配列は、１種類の標的核酸断片中に少なくとも１種類設定する。１種類の標的核酸断片中に複数種類の標的塩基配列を設定することにより、１分子の標的核酸断片上に複数分子の３者複合体を形成することができる。

【0035】

すなわち、１種類の標的核酸断片に対して複数種類のｇＲＮＡを使用することにより、１分子の標的核酸断片上に形成される３者複合体の分子数を増加させることができる。この結果、標的核酸断片１分子あたりの、ヌクレアーゼ活性を発現する３者複合体の分子数を増加させることが可能になり、標的核酸断片の検出感度を更に上昇させることができる。

【0036】

したがって、１実施形態において、本発明は、上述した標的核酸断片の検出方法において、検出感度を上昇させる方法であって、複数種類のｇＲＮＡを用いることにより、１分子の標的核酸断片上に複数分子の３者複合体を形成する工程を含む方法を提供する。

【0037】

（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質）
本実施形態の方法において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質としては、ｇＲＮＡ及び標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであれば用いることができる。上述したように、より正確には、３者複合体を形成し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が標的核酸断片を切断した後に、ヌクレアーゼ活性を発現する。

【0038】

このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質としては、Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１３タンパク質等が挙げられる。本明細書において、Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１３タンパク質、これらのタンパク質のオルソログ、これらのタンパク質の改変体等であってもよい。

【0039】

本実施形態の方法に用いることができるより具体的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質としては、例えば、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣａｓ１２ａタンパク質（ＬｂＣａｓ１２ａ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ａ０Ａ１８２ＤＷＥ３）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣａｓ１２ａタンパク質（ＡｓＣａｓ１２ａ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ｕ２ＵＭＱ６）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ１２ａタンパク質（ＦｎＣａｓ１２ａ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ａ０Ｑ７Ｑ２）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ由来のＣａｓ１２ｂタンパク質（ＡａＣａｓ１２ｂ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ｔ０Ｄ７Ａ２）、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ由来のＣａｓ１３ａタンパク質（ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０２１７４６７７４．１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＫ４Ａ１７９由来のＣａｓ１３ａタンパク質（ＬｂａＣａｓ１３ａ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０２２７８５４４３．１）、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ Ｃ－１０１３－ｂ由来のＣａｓ１３ａタンパク質（ＬｂｕＣａｓ１３ａ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１５７７０００４．１）、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＢｚｏＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿００２６６４４９２）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｉｎＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０３６８６０８９９）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｕｃｃａｅ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｂｕＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿００４３４３９７３）、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｓｐ． ＺＯＲ０００９由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＡｓｐＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０４７４４７９０１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ． ＭＡ２０１６由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０３６９２９１７５）、Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＲａｎＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿００４９１９７５５）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰａｕＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０２５０００９２６）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｓａＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０５１５２２４８４）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（Ｐｉｎ２Ｃａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０６１８６８５５３）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＣｃａＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１３９９７２７１）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｇｕＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０３９４３４８０３）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ． Ｐ５－１２５由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｓｐＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０４４０６５２９４）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｉｇＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０５３４４４４１７）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（Ｐｉｎ３Ｃａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０５０９５５３６９）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｉｔａｌｉｃｕｓ由来のＣｓｍ６タンパク質（ＥｉＣｓｍ６、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿００７２０８９５３．１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ由来のＣｓｍ６タンパク質（ＬｓＣｓｍ６、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０８１５０９１５０．１）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣｓｍ６タンパク質（ＴｔＣｓｍ６、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１１２２９１４８．１）等が挙げられる。

【0040】

本実施形態の方法において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、上述したＣａｓファミリータンパク質の変異体であってもよい。変異体としては、例えば、３者複合体を形成した後のヌクレアーゼ活性が上昇した変異体等を用いることができる。

【0041】

（基質核酸断片）
基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものである。

【0042】

基質核酸断片は、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質の基質特異性に応じて適宜選択すればよい。例えば、Ｃａｓ１２タンパク質は、１本鎖ＤＮＡを基質として切断する。そこで、Ｃａｓ１２タンパク質を用いる場合には、基質核酸断片として、１本鎖ＤＮＡを使用するとよい。また、Ｃａｓ１３タンパク質は、１本鎖ＲＮＡを基質として切断する。そこで、Ｃａｓ１３タンパク質を用いる場合には、基質核酸断片として、１本鎖ＲＮＡを使用するとよい。

【0043】

蛍光物質及び消光物質の組み合わせは、互いに近接させた場合に蛍光物質の蛍光を消光させることができる組み合わせのものを用いる。例えば、蛍光物質として、ＦＡＭ、ＨＥＸ等を用いる場合には、消光物質としてＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ（ＩＤＴ社）やＴＡＭＲＡ等を用いることができる。

【0044】

ところで、Ｃａｓ１３タンパク質の種類により、切断する１本鎖ＲＮＡの塩基配列に特異性が存在することが知られている。具体的には、例えば、ＬｗａＣａｓ１３ａタンパク質、ＣｃａＣａｓ１３ｂタンパク質、ＬｂａＣａｓ１３ａタンパク質、ＰｓｍＣａｓ１３ｂタンパク質は、それぞれ、基質核酸断片中のＡＵ、ＵＣ、ＡＣ、ＧＡの塩基配列を認識して切断することが報告されている。

【0045】

そこで、本実施形態の方法において、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質として、ＬｗａＣａｓ１３ａタンパク質、ＣｃａＣａｓ１３ｂタンパク質、ＬｂａＣａｓ１３ａタンパク質、ＰｓｍＣａｓ１３ｂタンパク質を用い、ｇＲＮＡとして、各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質にそれぞれ異なるｇＲＮＡを結合させ、基質核酸断片として、ＡＵ、ＵＣ、ＡＣ、ＧＡの塩基配列を含む１本鎖ＲＮＡを用い、更に、各基質核酸断片を互いに識別可能な異なる蛍光色素で標識することにより、１つの反応空間で４種類の標的核酸断片を検出することができる。すなわち、多色検出を行うことができる。

【0046】

（反応空間）
標的物質を精度よく検出する手法として、多数の微小な反応空間内で酵素反応を行う技術が検討されている。これらの手法はデジタル計測と呼ばれている。デジタル計測では、試料を極めて多数の微小な反応空間に分割してシグナルを検出する。

【0047】

そして、各反応空間からの信号を２値化し、標的物質が存在するか否かのみを判別して、標的物質の分子数を計測する。デジタル計測によれば、従来のＥＬＩＳＡやリアルタイムＰＣＲ法等と比較して、検出感度及び定量性を格段に向上させることができる。

【0048】

本実施形態の方法は、デジタル計測により行う。より具体的には、試料、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、ｇＲＮＡ、基質核酸断片の接触を微小な反応空間に分割して行う。反応空間１つあたりの容積は１０ａＬ～１００ｐＬであり、例えば１０ａＬ～１０ｐＬであってもよく、例えば１０ａＬ～１ｐＬであってもよく、例えば１０ａＬ～１００ｆＬであってもよく、例えば１０ａＬ～１０ｆＬであってもよい。反応空間が上記の範囲であることにより、標的核酸断片を増幅しなくても、その存在を高感度に検出することが可能になる。

【0049】

本実施形態の方法を、標的核酸断片が、反応空間１つあたりに０個又は１個導入される条件で行うことにより、デジタル計測を行うことができる。つまり、シグナルが検出された反応空間の個数を、試料中の標的核酸断片の分子数と対応させることができる。

【0050】

反応空間は、例えば液滴であってもよい。あるいは、反応空間は、基板上に形成されたウェルであってもよい。図２（ａ）は、ウェル１つあたりの容積が１０ａＬ～１００ｐＬであるウェルが表面に形成された基板を備えた流体デバイスの一例を示す上面図である。図２（ｂ）は、図２（ａ）のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。

【0051】

図２（ａ）及び（ｂ）に示すように、流体デバイス２００は、容積が１０ａＬ～１００ｐＬであるウェル２１１が表面に形成された基板２１０と、スペーサー２２０と、液体導入口２３１を形成した蓋部材２３０とを有している。ウェル２１１は複数存在し、ウェルアレイ２１２を形成している。基板２１０と蓋部材２３０との間の空間は、試料、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、基質核酸断片等を流す流路として機能する。

【0052】

ウェルは、容積が上述した範囲内である限り、その形状には特に制限はなく、例えば、円筒形、複数の面により構成される多面体（例えば、直方体、六角柱、八角柱等）等であってもよい。

【0053】

流体デバイス２００では、同形同大の複数のウェル２１１がウェルアレイ２１２を形成している。同形同大とは、デジタル計測を行うために要求される程度に同一の形状で同一の容量であればよく、製造上の誤差程度のばらつきであれば許容される。

【0054】

図３（ａ）～（ｃ）は、流体デバイス２００を用いて本実施形態の方法を実施する手順の一例を説明する模式断面図である。まず、試料、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を混合し、３者複合体を形成させる。続いて、３者複合体と基質核酸断片を混合してアッセイ溶液３１０を調製し、直ちに流体デバイス２００の液体導入口２３１から導入する。その結果、図３（ａ）に示すように、ウェル２１１の内部及び基板２１０と蓋部材２３０との間の空間が、アッセイ溶液３１０で満たされる。

【0055】

続いて、図３（ｂ）に示すように、液体導入口２３１から封止剤３２０を導入する。図３（ｂ）の例では、封止剤３２０として、脂質３２１を含有する有機溶媒を用いている。脂質３２１としては、大豆や大腸菌等に由来する天然脂質、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）等の人工脂質を用いることができる。有機溶媒としては、ヘキサデカンやクロロホルムを用いることができる。封止剤３２０が導入されると、ウェル２１１の内部にアッセイ溶液３１０が満たされた状態で、ウェル２１１の開口部が第１脂質膜３２２により封止される。第１脂質膜３２２を構成する各脂質３２１の親水基は、ウェル２１１側に向いている。この結果、各ウェル２１１は独立した反応空間となる。この状態でウェルアレイ２１２に励起光を照射して蛍光を測定してもよい。

【0056】

また、第１脂質膜３２２に更に脂質膜を積層し、脂質二重膜を形成することもできる。この場合、図３（ｃ）に示すように、液体導入口２３１から脂質二重膜３２４を形成するための膜形成用水溶液３３０を導入する。膜形成用水溶液３３０の組成としては、例えば、１０ｍＭのｐＨ緩衝液（ｐＨ５～９）、１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液等を用いることができる。膜形成用水溶液３３０を導入すると、第１脂質膜３２２に第２脂質膜３２３が積層され、脂質二重膜３２４が形成される。この結果、各ウェル２１１は独立した反応空間となる。この状態でウェルアレイ２１２に励起光を照射して蛍光を測定してもよい。

【0057】

ウェル２１１の開口部が脂質二重膜３２４で封入されている場合、脂質小胞を脂質二重膜３２４に融合させることができる。例えば、エクソソームを脂質二重膜３２４に融合させることにより、エクソソームの内容物をウェル２１１の内部に放出させることができる。

【0058】

そこで、例えば、ウェル２１１に、まず、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、基質核酸断片を封入してウェル２１１の開口部を脂質二重膜３２４で封止しておき、その後、試料としてエクソソームを脂質二重膜３２４に接触させてもよい。

【0059】

その結果、脂質二重膜３２４にエクソソームが融合し、エクソソームの内容物がウェル２１１の内部に放出される。エクソソームの内容物に、標的核酸断片が存在していた場合、ウェル２１１の内部で３者複合体が形成され、基質核酸断片が切断され、励起光の照射により蛍光が検出される。

【0060】

図４（ａ）に示すように、本実施形態の方法において、ウェル２１１の内表面にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０を予め固定していてもよい。ここで、図４（ｂ）に示すように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０は、ｇＲＮＡ１２０と結合し、２者複合体１３０を形成していてもよい。その結果、試料を接触させた場合に３者複合体１００がウェル２１１の内部に存在する可能性を向上させることができ、検出感度を飛躍的に向上させることができる。

【0061】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質をウェル２１１の内表面に固定する方法としては、物理的吸着、化学リンカーを用いてウェル２１１の内表面に存在する官能基とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質の表面に存在する官能基とを共有結合させる方法等が挙げられる。官能基としては、水酸基、アミノ基、チオール基等が挙げられる。あるいは、例えば、アジド基とアルキン基とを用いたクリック反応等を利用してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質をウェル２１１の内表面に固定してもよい。

【0062】

［標的核酸断片の検出用キット］
１実施形態において、本発明は、容積が１０ａＬ～１００ｐＬであるウェルが表面に形成された基板と、標的核酸断片に相補的なｇＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質と、基質核酸断片と、を含み、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、前記ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであり、前記基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものである、前記標的核酸断片の検出用キットを提供する。本実施形態のキットを用いることにより、上述した標的核酸断片の検出方法を好適に実施することができる。

【0063】

本実施形態のキットにおいて、容積が１０ａＬ～１００ｐＬであるウェルが表面に形成された基板、標的核酸断片、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、基質核酸断片については、上述したものと同様である。

【0064】

本実施形態のキットにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、Ｃａｓ１２タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質であってもよい。具体的なＣａｓ１２タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質については上述したものと同様である。

【0065】

図４（ａ）に示すように、本実施形態のキットにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０は、ウェル２１１の内表面に固定されていてもよい。ここで、図４（ｂ）に示すように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０は、ｇＲＮＡ１２０と結合し、２者複合体１３０を形成していてもよい。その結果、試料を接触させた場合に３者複合体１００がウェル２１１の内部に存在する可能性を向上させることができ、検出感度を飛躍的に向上させることができる。

【0066】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質のウェルの内表面への固定方法は上述したものと同様である。

【0067】

あるいは、図４（ｃ）に示すように、本実施形態のキットにおいて、ｇＲＮＡ１２０が、ウェル２１１の内表面に固定されていてもよい。ここで、ｇＲＮＡ１２０には、リンカーとして機能する付加的な配列が付加されていてもよい。

【0068】

この結果、図４（ｄ）に示すように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０をウェル２１１に導入すると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０は、ｇＲＮＡ１２０と結合して２者複合体１３０を形成し、ウェル２１１の内表面に固定される。

【0069】

タンパク質を固定したウェルと比較して、ｇＲＮＡを固定したウェルの方が保存が容易である場合がある。

【実施例】

【0070】

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0071】

［材料及び方法］
（Ｃａｓ１２ａタンパク質の調製）
Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃａｓ１２ａ（ＬｂＣａｓ１２ａ）の発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株にトランスフェクションして発現させた。発現ベクターは、Ｎ末端に、１０×Ｈｉｓタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有するｐＥＴベースのベクターであった。発現したＣａｓ１２ａタンパク質はＮｉ－ＮＴＡ樹脂を用いて精製した。続いて、ＴＥＶプロテアーゼを４℃、一晩反応させた後、ＭＢＰＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社）及びこれに接続したＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いてカチオン交換クロマトグラフィーを行い、更にＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥヘルスケア社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。

【0072】

（Ｃａｓ１３ａタンパク質の調製）
Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ Ｃａｓ１３ａ（ＬｗＣａｓ１３ａ）の発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株にトランスフェクションして発現させた。発現ベクターは、Ｎ末端に、１０×Ｈｉｓタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有するｐＥＴベースのベクターであった。発現したＣａｓ１３ａタンパク質はＮｉ－ＮＴＡ樹脂を用いて精製した。続いて、ＴＥＶプロテアーゼを４℃、一晩反応させた後、ＭＢＰＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社）及びこれに接続したＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いてカチオン交換クロマトグラフィーを行い、更にＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥヘルスケア社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。

【0073】

（標的核酸断片の調製）
標的核酸断片（二本鎖ＤＮＡ断片）は外注（ＩＤＴ社）によりそれぞれ化学合成した、一本鎖ＤＮＡ断片（配列番号５）及びこれに相補的な一本鎖ＤＮＡ断片をアニーリングして調整した。標的核酸断片（一本鎖ＲＮＡ断片、配列番号６）は外注（ＩＤＴ社）により化学合成した。

【0074】

（ｇＲＮＡの調製）
Ｔ７プロモーター配列、２０塩基の標的配列及びスキャフォールド配列を含むオーバーラッピングプライマーを鋳型としたＰＣＲ増幅により、ｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするＤＮＡ断片を調製した。続いて、得られたＤＮＡ断片をインビトロ転写反応に供しｃｒＲＮＡを調製した。Ｃａｓ１２ａタンパク質用のｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の塩基配列を配列番号２に示し、Ｃａｓ１３ａタンパク質用のｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の塩基配列を配列番号４に示す。

【0075】

（基質核酸断片の調製）
基質核酸断片（一本鎖ＤＮＡ断片）は外注（ＩＤＴ社）により化学合成した。基質核酸断片の５’末端を蛍光物質であるＦＡＭで標識し、３’末端を消光物質であるＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ（ＩＤＴ社）で標識した。化学合成した基質核酸断片（一本鎖ＤＮＡ断片）の塩基配列は「5'-(FAM)TTATT(IABkFQ)-3'」（ここで、「IABkFQ」はＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱを示す。）であった。

【0076】

基質核酸断片（一本鎖ＲＮＡ断片）は外注（ＩＤＴ社）により化学合成した。基質核酸断片の５’末端を蛍光物質であるＦＡＭで標識し、３’末端を消光物質であるＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ（ＩＤＴ社）で標識した。化学合成した基質核酸断片（一本鎖ＲＮＡ断片）の塩基配列は「5'-(FAM)UUUUU(IABkFQ)-3'」（ここで、「IABkFQ」はＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱを示す。）であった。

【0077】

（ウェルアレイの作製）
図５（ａ）～（ｆ）はウェルアレイの形成の各工程を説明する模式断面図である。まず、図５（ａ）に示すように、ガラス基板２１０を１０Ｍの水酸化カリウム溶液に２４時間程度浸し、表面にヒドロキシル基を形成させた。

【0078】

続いて、図５（ｂ）に示すように、ガラス基板２１０の表面に、フッ素樹脂（ＣＹＴＯＰ、ＡＧＣ株式会社製）をスピンコートして膜５２０を形成した。スピンコートの条件は、２０００ｒｐｓ（ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｐｅｒ ｓｅｃｏｎｄ）で３０秒とした。この条件では、膜５２０の膜厚が約５００ｎｍとなる。

【0079】

続いて、１８０℃のホットプレートで１時間ベークして、膜５２０（ＣＹＴＯＰ）のシラノール基とガラス表面のヒドロキシル基とを脱水縮合することにより、膜５２０をガラス基板５１０の表面に密着させた。

【0080】

続いて、図５（ｃ）に示すように、膜５２０の表面にレジスト（ＡＺ－４９０３、ＡＺ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製）を４０００ｒｐｓで６０秒スピンコートし、レジスト膜５３０を形成した。

【0081】

続いて、ガラス基板２１０を１１０℃のホットプレートで１時間ベークして、レジスト膜５３０内の有機溶媒を蒸発させることにより、レジスト膜５３０を膜５２０の表面に密着させた。

【0082】

続いて、図５（ｄ）に示すように、ウェルアレイのパターンのマスクを用いて、露光機（ＳＡＮ－ＥＩ製）で２５０Ｗ、７秒間紫外線を照射してレジスト膜５３０を露光した。続いて現像液（ＡＺ ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ、ＡＺ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製）に５分間浸して現像した。この結果、ウェルを形成する部分のレジスト膜５３０が除去された。

【0083】

続いて、図５（ｅ）に示すように、レジスト膜５３０でマスクされた膜５２０を、Ｒｅａｃｔｉｃｅ ｉｏｎ ｅｔｃｈｉｎｇ装置（Ｓａｍｃｏ社製）を用いて、Ｏ_２ ５０ｓｃｃｍ、圧力１０Ｐａ、出力５０Ｗの条件で３０分間ドライエッチングすることにより、膜５２０にウェル２１１を形成した。

【0084】

続いて、図５（ｆ）に示すように、ガラス基板２１０をアセトンに浸し、イソプロパノールで洗浄した後に純水で洗浄することにより、レジスト膜５３０を除去し、ウェル２１１のアレイを得た。ウェルアレイ２１２は、直径４μｍ、深さ５００ｎｍの円柱状のウェル２１１が１ｃｍ^２に１，０００，０００個並んだ形状であった。ウェルアレイ２１２の１ウェルあたりの容積は６ｆＬであった。

【0085】

（流体デバイスの作製）
図２（ａ）及び（ｂ）に示すように、上述のようにして作製したウェル２１１が表面に形成された基板２１０に、スペーサー２２０を配置し、更に、液体導入口２３１を形成したガラス板２３０を載せ、流体デバイスを作製した。この結果、ウェルアレイ２１２とガラス板２３０との間の空間が流路である流体デバイス２００が形成された。

【0086】

［実験例１］
（３者複合体の濃度依存性の検討）
上述した、Ｃａｓ１２ａタンパク質、ｇＲＮＡ（配列番号２）及び標的核酸断片を、Ｃａｓ１２ａタンパク質の終濃度が２００ｎＭとなり、ｇＲＮＡの終濃度が２５０ｎＭとなり、標的核酸断片の終濃度が２００ｎＭとなるように、下記表１に示す組成のバッファーＡに混合し、３７℃で３０分間静置し、３者複合体を形成させた。以下、この溶液を３者複合体溶液という。

【0087】

【表1】

【0088】

また、下記表２に示す組成のバッファーＢに、終濃度が５μＭとなるように基質核酸断片を溶解した溶液を調製した。

【0089】

【表2】

【0090】

上述した流体デバイスを５個用意した。続いて、上述した３者複合体溶液と、基質核酸断片の溶液を混合し、３者複合体の終濃度が、それぞれ、２６６ｐＭ、１３３ｐＭ、６７ｐＭ、３４ｐＭ、１７ｐＭであるアッセイ溶液を調製し、直ちに各流体デバイスの液体導入口から導入した。この結果、各アッセイ溶液が各ウェルアレイの各ウェルに導入された。

【0091】

続いて、封止剤（「ＦＣ－４０」、シグマ社）を各流体デバイスの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液が導入されたウェルが封止剤で封止され、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間となった。数分後、蛍光顕微鏡で各流体デバイスのウェルアレイを観察した。

【0092】

図６（ａ）は３者複合体の終濃度が１７ｐＭであるアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図６（ｂ）は３者複合体の終濃度が６７ｐＭであるアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図６（ｃ）は３者複合体の終濃度が１３３ｐＭであるアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。また、図６（ｄ）は、各アッセイ溶液を導入したウェルアレイの写真に基づいて、蛍光が検出されたウェルの割合を算出した結果を示すグラフである。

【0093】

その結果、３者複合体の濃度依存的に蛍光が検出されたウェルの割合が上昇したことが明らかとなった。

【0094】

［実験例２］
（標的核酸断片の濃度依存性の検討）
上述した、Ｃａｓ１２ａタンパク質、ｇＲＮＡ（配列番号２）及び標的核酸断片を、Ｃａｓ１２ａタンパク質の終濃度が２００ｎＭとなり、ｇＲＮＡの終濃度が２５０ｎＭとなり、標的核酸断片の終濃度が、それぞれ、４０００ｐＭ、４００ｐＭ、４０ｐＭ、４ｐＭ、０．４ｐＭとなるように、上記表１に示す組成のバッファーＡに混合し、３７℃で３０分間静置し、３者複合体を形成させた。以下、この溶液を３者複合体溶液という。

【0095】

上述した流体デバイスを５個用意した。また、上記表２に示す組成のバッファーＢに、終濃度５μＭとなるように基質核酸断片を溶解した溶液を調製した。

【0096】

続いて、上述した３者複合体溶液と、基質核酸断片の溶液を混合したアッセイ溶液をそれぞれ調製し、直ちに各流体デバイスの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液がウェルアレイの各ウェルに導入された。

【0097】

続いて、封止剤（「ＦＣ－４０」、シグマ社）を各流体デバイスの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液が導入されたウェルが封止剤で封止され、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間となった。数分後、蛍光顕微鏡で各流体デバイスのウェルアレイを観察した。

【0098】

図７（ａ）は標的核酸断片の終濃度が４ｐＭであるアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図７（ｂ）は標的核酸断片の終濃度が４０ｐＭであるアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図７（ｃ）は標的核酸断片の終濃度が４００ｐＭであるアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。また、図７（ｄ）は、各アッセイ溶液を導入したウェルアレイの写真に基づいて、蛍光が検出されたウェルの割合を算出した結果を示すグラフである。

【0099】

その結果、標的核酸断片の濃度依存的に蛍光が検出されたウェルの割合が上昇したことが明らかとなった。

【0100】

［実験例３］
（Ｃａｓ１３ａを用いた検討１）
上述した、Ｃａｓ１３ａタンパク質、ｇＲＮＡ（配列番号４）及び標的核酸断片を、Ｃａｓ１３ａタンパク質の終濃度が２００ｎＭとなり、ｇＲＮＡの終濃度が２５０ｎＭとなり、標的核酸断片の終濃度が２００ｎＭとなるように、上記表１に示す組成のバッファーＡに混合し、３７℃で３０分間静置し、３者複合体を形成させた。

【0101】

また、上記表２に示す組成のバッファーＢに、終濃度が２、５、１０μＭとなるように基質核酸断片を溶解した溶液をそれぞれ調製した。

【0102】

上述した流体デバイスを４個用意した。続いて、上述した３者複合体溶液と、基質核酸断片の溶液を混合し、３者複合体の終濃度が３０ｐＭであり、基質核酸断片の終濃度が２、５、１０μＭであるアッセイ溶液をそれぞれ調製し、直ちに各流体デバイスの液体導入口から導入した。また、比較のために標的核酸断片を含まないアッセイ溶液も調製して流体デバイスの液体導入口から導入した。この結果、各アッセイ溶液が各ウェルアレイの各ウェルに導入された。

【0103】

続いて、封止剤（「ヘキサデカン」、シグマ社）を各流体デバイスの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液が導入されたウェルが封止剤で封止され、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間となった。続いて、各流体デバイスのウェルアレイを経時的に蛍光顕微鏡で観察した。

【0104】

図８（ａ）は、各アッセイ溶液の蛍光が検出されたウェルについて、蛍光強度の経時変化をまとめたグラフである。横軸は時間（秒）であり、縦軸は蛍光強度である。図８（ａ）中、「ｗ／ｏ ｔｇＲＮＡ」は標的核酸断片を含まないアッセイ溶液の結果であることを示し、「ｗ／ ｔｇＲＮＡ」は標的核酸断片を含むアッセイ溶液の結果であることを示し、「ＦＡＭ－Ｑ」は基質核酸断片を示す。その結果、約２分間で蛍光強度の上昇が飽和することが明らかとなった。

【0105】

図８（ｂ）は、図８（ａ）に基づいて、基質核酸断片の濃度と蛍光強度の上昇速度との関係を示すグラフである。横軸は基質核酸断片の濃度（μＭ）を示し、縦軸は蛍光強度の上昇速度（ΔＩ／ｓ）を示す。その結果、蛍光強度の上昇速度が基質核酸断片の濃度に比例することが明らかとなった。

【0106】

［実験例４］
（Ｃａｓ１３ａを用いた検討２）
上述した、Ｃａｓ１３ａタンパク質、ｇＲＮＡ（配列番号４）及び標的核酸断片を、Ｃａｓ１３ａタンパク質の終濃度が２００ｎＭとなり、ｇＲＮＡの終濃度が２５０ｎＭとなり、標的核酸断片の終濃度が、それぞれ、３０ｐＭ、３ｐＭ、０．３ｐＭ、０ｐＭとなるように、上記表１に示す組成のバッファーＡに混合し、３７℃で３０分間静置し、３者複合体を形成させた。以下、この溶液を３者複合体溶液という。

【0107】

上述した流体デバイスを４個用意した。また、上記表２に示す組成のバッファーＢに、終濃度５μＭとなるように基質核酸断片を溶解した溶液を調製した。

【0108】

続いて、上述した３者複合体溶液と、基質核酸断片の溶液を混合したアッセイ溶液をそれぞれ調製し、直ちに各流体デバイスの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液がウェルアレイの各ウェルに導入された。

【0109】

続いて、封止剤（「ヘキサデカン」、シグマ社）を各流体デバイスの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液が導入されたウェルが封止剤で封止され、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間となった。数分後、蛍光顕微鏡で各流体デバイスのウェルアレイを観察した。

【0110】

図９（ａ）は標的核酸断片の終濃度が０ｐＭであるアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図９（ｂ）は標的核酸断片の終濃度が０．３ｐＭであるアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図９（ｃ）は標的核酸断片の終濃度が３ｐＭであるアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。また、図９（ｄ）は標的核酸断片の終濃度が３０ｐＭであるアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍである。

【0111】

図１０（ａ）は、各アッセイ溶液を導入したウェルアレイの写真に基づいて、所定の蛍光強度（相対値）を示したウェルの数を示す代表的なグラフである。図１０（ｂ）は、標的核酸断片の終濃度が、それぞれ、３０ｐＭ、３ｐＭ、０．３ｐＭ、０ｐＭであるアッセイ溶液についての図１０（ａ）と同様のグラフおいて、図１０（ａ）における点線で囲んだ領域に相当する領域を拡大して並べたグラフである。

【0112】

その結果、標的核酸断片の濃度依存的に蛍光が検出されたウェルの割合が上昇したことが明らかとなった。

【0113】

図１１は、蛍光が検出されたウェルの個数と標的核酸断片の終濃度の関係を示すグラフである。縦軸は蛍光が検出されたウェルの個数を示し、横軸は標的核酸断片の終濃度を示す。図１１中、実線の丸は流体デバイスを用いた結果であることを示し、破線の丸は同様の実験をプレートリーダーを用いて行った結果であることを示す。図１１中、左上のグラフは拡大図を示す。プレートリーダーを用いた実験では、流体デバイスの代わりに３８４ウェルプレートを使用した。その結果、流体デバイスを用いた場合の検出感度が５６ｆＭであることが分かった。

【産業上の利用可能性】

【0114】

本発明によれば、標的核酸断片を増幅しなくても高感度に検出することができる技術を提供することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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