特許 7579703 抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体およびその調製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-30

(45)【発行日】2024-11-08

(54)【発明の名称】抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体およびその調製方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20241031BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20241031BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20241031BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241031BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241031BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241031BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20241031BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241031BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241031BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20241031BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46

A61K35/12

A61K35/76

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K48/00

A61P35/00

A61P35/02

C07K16/28

C07K16/30 ZNA

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/10 200Z

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12P21/08

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2020502753

(86)(22)【出願日】2018-03-28

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-04-30

(86)【国際出願番号】 CN2018080858

(87)【国際公開番号】W WO2018177324

(87)【国際公開日】2018-10-04

【審査請求日】2021-03-24

【審判番号】

【審判請求日】2022-12-16

(31)【優先権主張番号】201710214705.7

(32)【優先日】2017-04-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】516082925

【氏名又は名称】北京韓美薬品有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＢＥＩＪＩＮＧ ＨＡＮＭＩ ＰＨＡＲＭ． ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001818

【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ

(72)【発明者】

【氏名】▲劉▼ 家望

(72)【発明者】

【氏名】宋 楠萌

(72)【発明者】

【氏名】楊 ▲亜▼平

(72)【発明者】

【氏名】金 孟燮

【合議体】

【審判長】福井 悟

【審判官】北田 祐介

【審判官】高堀 栄二

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５２３４０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５３０８９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５１４４１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５０６０６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５０５１２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５３３２４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５０４２６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／２０８６９５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／２０７３１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５１０２１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１６年，Ｖｏｌ．７，Ａｒｔｉｃｌｅ ３９４

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

C12N 15/00

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０／ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合できる第一抗原結合機能領域と、ＰＤ－１と特異的に結合できる第二抗原結合機能領域とを含むヘテロダイマー二重特異性抗体であって、前記二重特異性抗体が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって連結された第一Ｆｃ鎖と第二Ｆｃ鎖とを含み、前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖はそれぞれＰＤ－Ｌ１抗原結合機能領域およびＰＤ－１抗原結合機能領域と共有結合もしくはリンカーによって連結されるか、または、前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖はそれぞれ前記ＰＤ－１抗原結合機能領域および前記ＰＤ－Ｌ１抗原結合機能領域と共有結合もしくはリンカーによって連結され、そして、前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖は、五つのアミノ酸置換を含み、
ここで、前記第一Ｆｃ鎖のアミノ酸置換は、Ｔ３６６ＬおよびＤ３９９Ｒであり、前記第二Ｆｃ鎖のアミノ酸置換は、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７ＬおよびＫ４０９Ｖであり、
前記アミノ酸置換を含む前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖は、各々のホモダイマーではなく、互いとヘテロダイマーを形成する傾向があり、および、
前記ＰＤ－Ｌ１抗原結合機能領域は、配列番号２および６に示すアミノ酸配列を含み、前記ＰＤ－１抗原結合機能領域は、配列番号１６および１８に示すアミノ酸配列を含み、
前記アミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステムにしたがって番号付けされる、ヘテロダイマー二重特異性抗体。

【請求項2】

前記Ｆｃ鎖がＩｇＧ由来である、請求項１に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体。

【請求項3】

前記ＰＤ－Ｌ１抗原結合機能領域および前記ＰＤ－１抗原結合機能領域がＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントである、請求項１または２に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体。

【請求項4】

前記ＰＤ－Ｌ１抗原結合機能領域および前記ＰＤ－１抗原結合機能領域がどちらもＦａｂフラグメントである、請求項１～３のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体。

【請求項5】

前記ＰＤ－Ｌ１抗原結合機能領域および前記ＰＤ－１抗原結合機能領域の一方がＦａｂフラグメントであり、他方がｓｃＦｖである、請求項１～３のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体。

【請求項6】

前記第一Ｆｃ鎖およびそれに連結された前記ＰＤ－Ｌ１抗原結合機能領域ならびに前記第二Ｆｃ鎖およびそれに連結された前記ＰＤ－１抗原結合機能領域、または、前記第一Ｆｃ鎖およびそれに連結された前記ＰＤ－１抗原結合機能領域ならびに前記第二Ｆｃ鎖およびそれに連結された前記ＰＤ－Ｌ１抗原結合機能領域が、還元剤の存在下で単独で存在する場合、５０重量％未満の割合でホモダイマーを形成する、請求項１～５のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体。

【請求項7】

前記ヘテロダイマー二重特異性抗体は、それぞれ配列番号８および１４に示すアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体。

【請求項8】

請求項１～７のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体と、医薬的に許容される担体と、を含む、組成物。

【請求項9】

対象において疾患を予防および／または治療するための薬剤の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体、および／または、請求項８に記載の組成物の使用。

【請求項10】

前記対象が哺乳類である、請求項９に記載の使用。

【請求項11】

前記疾患が、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮がん、非小細胞肺がん、鼻咽腔がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、胆嚢がん、肝臓がん、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞がん、黒色腫からなる群から選択される腫瘍である、請求項９に記載の使用。

【請求項12】

対象における疾患の予防および／または治療のための薬剤として使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体、および／または、請求項８に記載の組成物。

【請求項13】

前記対象が哺乳類である、請求項１２に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体、もしくは組成物。

【請求項14】

前記疾患が、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮がん、非小細胞肺がん、鼻咽腔がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、胆嚢がん、肝臓がん、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞がん、黒色腫からなる群から選択される腫瘍である、請求項１２に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体、もしくは組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体およびその調製方法に関する。具体的には、本発明は、天然ＩｇＧの特徴を有し、ミスマッチ重鎖－軽鎖を有さない非常に安定なヘテロダイマー抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１二重特異性抗体、およびその調製方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

モノクローナル抗体は、単抗原性エピトープに対してのみ作用する非常に特異的な抗体であり、がん、炎症および自己免疫疾患、ならびに感染性疾患などの多くの疾患の治療において広く用いられている。しかしながら、疾患の複雑さのために、そのような治療分子はいずれも単独で使用した場合には充分な有効性を示さない。例えば、がんまたは炎症性疾患は、多くの場合、様々な疾患媒介性分子経路およびシグナル伝達経路の相互作用と関連する。このような状況下で、単一標的化分子は至適治療効果をもたらさない場合がある一方で、治療効果は、複数の標的または単一の標的の複数の部位を同時にブロックする分子によって改善され得る場合がある。一方、多重特異性、例えば二重特異性分子を使用する二重標的化療法は、新規薬物の開発を簡単にする可能性がある。というのも、このような分子は単一の分子であるからである。複数の単一特異性分子の併用投与と比較すると、患者と介護従事者との両方にとってより便利となるであろう。

【0003】

二重特異性抗体または二機能性分子の多くの異なる様式が当該技術分野で報告されている。第一の二重特異性抗体は、二機能性カップリング試薬を使用して二つの既存のＩｇＧ分子であるＦａｂ’、または（Ｆａｂ’）２フラグメントを一緒に連結する化学的方法によって得られた。しかしながら、そのような化学的にカップリングさせた二重特異性抗体には、産生の作業強度、異種構造（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）のコンジュゲートの精製、同種構造（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）のコンジュゲートおよびもとの単一特異性抗体もしくはフラグメントの除去の複雑さ、ならびに低収率など、において、多くの制限がある。

【0004】

二重特異性抗体を産生するための別の方法は、異なる抗体を分泌する二つのハイブリドーマ細胞株の体細胞融合によって産生される、ハイブリッド－ハイブリドーマ（またはクアドローマ）の技術を利用する。イムノグロブリン重鎖および軽鎖の任意の対合のために、所望の機能的二重特異性抗体は抗体混合物のわずか１／１０でしかなく、そのことが精製プロセスを複雑にし、産生収率を低下させる。

【0005】

特許文献１：国際公開第２０１３／０６０８６７号は、ヘテロダイマー二重特異性抗体の大量生産の方法であって、二つのホモダイマー抗体を混合物中でまず還元し、次に、非対称アミノ酸変異を二つのホモダイマー抗体のＣＨ３領域に導入して異なる抗体間のＦａｂアーム交換を促進し、安定な二重特異性抗体を最後にヒンジ領域の鎖間ジスルフィド結合の酸化によって形成する方法を記載している。

【0006】

特許文献２：国際公開第２００９／０８９００４号は、ヘテロダイマータンパク質を調製する方法であって、ヘテロダイマーの形成が静電気的に好都合である一方でホモダイマーの形成が静電的に不都合であるようにＣＨ３－ＣＨ３界面のアミノ酸を荷電アミノ酸に変異させる方法を記載している。

【0007】

特許文献３：米国特許第５７３１ｌ６８号は、「ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ－ｉｎｔｏ－ｃａｖｉｔｙ」ストラテジーにしたがってヘテロダイマーＩｇＧを調製する方法であって、第一鎖のＣＨ３領域の界面の小さなアミノ酸をより大きなアミノ酸で置換することによって「凸部（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅｓ）」を構築し、同時に、第二鎖のＣＨ３界面の対応する大きなアミノ酸をより小さなアミノ酸で置換することによって「凹部（ｃａｖｉｔｉｅｓ）」を創出する方法を記載している。前記凸部と前記凹部との相互作用はヘテロダイマーＩｇＧの形成に好都合であるが、ホモダイマーの形成には不都合である。

【0008】

特許文献４：国際公開第２０１２／０５８７６８号は、安定且つ非常に特異的なヘテロダイマーＩｇＧを調製する方法を記載している。この方法は、コンピュータ構造モデル化誘導プロテインエンジニアリングの技術とともにネガティブデザインとポジティブデザインの両方を組み合わせて、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン中の複数のアミノ酸を変異させ、それによって低含有量のホモダイマー不純物を有する安定なヘテロダイマーＩｇＧを形成する。

【0009】

抗体の有効性を改善するための有効な手段として、エフェクタ細胞を動員することができる二機能性抗体を設計することができる。今に至るまで、ＣＤ３分子の機能の利用が最も研究されてきた。キラーＴ細胞をＣＤ３分子で活性化することによって、関心対象の腫瘍を効果的に除去することができる（非特許文献１：Ｈａａｓ Ｃ. ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，２１４：４４１－４５３，２００９）。上述したもののうち、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ， Ｉｎｃ．によって開発された組換え二機能性Ｔ細胞刺激抗体であるＢｉＴＥがかなり有望であることが示されている。しかしながら、最大の課題は、その血清半減期が非常に短く、ヒトの体内でのその半減期はわずか１時間しかないことである（非特許文献２：Ｌｏｆｆｌｅｒ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９５：２０９８－２１０３）。これは、分子量わずか６０ｋＤａの二つの単鎖抗体フラグメントで構成され、半減期延長に対して著しい効果を有する抗体分子中のＦｃフラグメントが欠損している、ＢｉＴＥ自体の構造によるものである。

【0010】

別の前途有望な多機能性抗体としてのカツマクソマブは、ＣＤ３およびＥｐＣＡＭを標的とするハイブリッドＩｇ分子である。近年、この製品は、腹水がんの治療について認可されている（非特許文献３：Ｊａｇｅｒ Ｍ. ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７２：２４－３２，２０１２）。第二相臨床試験下にあるさらに別の多機能性抗体は、ＣＤ３およびＰＤ－Ｌ１を標的とするエルツマキソマブである。ハイブリッド抗体の一つの重鎖と一つの軽鎖はラットＩｇＧ由来であり、ＣＤ３を標的とし、別の重鎖および軽鎖は、マウスＩｇＧ由来であり、ＰＤ－Ｌ１を標的とする。その結果、二機能性抗ＣＤ３／抗ＰＤ－Ｌ１抗体を発現できるクアドローマは二機能性エルツマキソマブを発現する細胞株を得ることを必要とするので、そのような産物の産生は非常に困難であるという問題がある。前記クアドローマは、まず、ＣＤ３抗体を発現するジプロイドハイブリドーマ株と、ＰＤ－Ｌ１抗体を発現するジプロイドハイブリドーマ株とを得、次いで二つのハイブリドーマ株をハイブリダイズすることによって得られる。対照的に、従来型単一標的化抗体の産生には一つのジプロイドハイブリドーマ株しか必要でない。それと比べると、クアドローマを得るのはなお一層困難であるので、二機能性抗体の産生プロセスはさらに複雑である。さらに、マウス起源はその非常に高い免疫原性をもたらす。

【0011】

さらに、抗ＣＤ３抗体によって引き起こされるほとんどの明らかな副作用は、サイトカインストームとも呼ばれる、インビボの短時間でのサイトカインのバーストである。したがって、腫瘍細胞の表面に同時に腫瘍細胞を動員する新規二機能性抗体が必要とされる。

【0012】

プログラム死受容体－１（ＰＤ－１）は近年多くの注目を集める免疫チェックポイントである。ＰＤ－１はＣＤ２８ファミリーに属するメンバーである。ジスルフィド結合を介した共有結合ダイマーを形成することができるＣＴＬＡ４などのＣＤ２８ファミリーの他のメンバーとは異なり、ＰＤ－１はモノマー形態で存在する。ＰＤ－１の構造は主にイムノグロブリン可変領域様細胞外ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。細胞内ドメインは、二つの独立したリン酸化部位：免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）および免疫受容体チロシン系スイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）をそれぞれ含む。ＰＤ－１は主に、活性化Ｔ細胞の表面上で、またＢ細胞、ＮＫ細胞、単球、およびＤＣ細胞上でも誘導的に発現される。ＰＤ－１は主に、Ｔ細胞活性化の負の制御に関与し、免疫応答の強度および期間を調節することができる。ＰＤ－１のリガンドは、ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）とＰＤ－Ｌ２（プログラム死リガンド２）とを含む。これらのリガンドはＢ７ファミリーに属する。上述したものにおいて、ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＤＣ細胞、および内皮細胞、上皮細胞などを含む様々な免疫細胞の表面上で誘導的に発現される一方で、ＰＤ－Ｌ２はマクロファージ、ＤＣ細胞およびＢ細胞をはじめとする一部の免疫細胞上でのみ誘導的に発現される。ＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－１のリガンドとして作用するだけでなく、ＣＤ８０のリガンドとしても作用し、負の調節シグナルをＴ細胞へ伝達し、Ｔ細胞の免疫寛容を誘導する（非特許文献４：Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｒｅｖ，２０１３，１２（１１）：１０９１－１１００、非特許文献５：Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏ１，２０１３，４：４８１、非特許文献６：Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、２０１２，１２（４）：２５２－２６４、非特許文献７：Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏ１ Ｍｅｄ．２０１５ Ｊａｎ；２１（１）：２４－３３、非特許文献８：Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２ Ｄｅｃ １５；１８（２４）：６５８０－７）。

【0013】

通常の状況下で、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１は、生命体組織の自己免疫寛容を媒介し維持することができ、免疫系が過剰活性化したり炎症プロセスにおける自己組織を損なったりするのを防ぐことができ、自己免疫疾患の発生の回避に対して正の影響を及ぼすことができる。病理学的状況下で、それらは腫瘍免疫ならびに様々な自己免疫疾患の発生および発達に関与する。ＰＤ－Ｌ１が様々な腫瘍組織において高度に発現され、ＰＤ－１は腫瘍浸潤性リンパ球において高度に発現されることを報告するいくつかの刊行物がある。さらに、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１の過剰発現は腫瘍の不良な臨床予後と密接に関連する（非特許文献９：Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１５；１５（３）：３０７－１３、非特許文献１０：Ｈｅｍａｔｏ１ Ｏｎｃｏ１ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒ．２０１４ Ｍａｒ；７（１）：１－１７、非特許文献１１：Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｅｔ Ｍｅｄ． ２０１５ Ｊａｎ； ２１（１）：２４－３３、非特許文献１２：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１３ Ｊｕｌ ２５；３９（１）：６１－７３、非特許文献１３：Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏ１．２０１５ Ｊｕｎ １０；３３（１７）：１９７４－８２）。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２のＰＤ－１ ｍＡｂでのブロッキング、またはＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１およびＣＤ８０／ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂでのブロッキングは、前臨床および臨床試験の両方において満足できる抗腫瘍効果を示す。現在のところ、ＰＤ－１ ｍＡｂはアメリカ食品医薬品局により、非小細胞肺がん、黒色腫、頭頸部がんなどをはじめとする様々な腫瘍の治療について認可されている。ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂはまた、非小細胞肺がんおよび尿路上皮がんの治療についても認可されている。しかしながら、腫瘍患者のごく一部はそのようなモノクローナル抗体療法から恩恵を受けることができるが、ほとんど患者はそのようなモノクローナル抗体に反応しない（非特許文献１４：Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ．２０１４ Ｄｅｃ；１８（１２）：１４０７－２０、非特許文献１５：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｗｉ１１ｉｓｔｏｎ Ｐａｒｋ）．２０１４ Ｎｏｖ；２８ Ｓｕｐｐｌ３：１５－２８）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0014】

【文献】国際公開第２０１３／０６０８６７号

【文献】国際公開第２００９／０８９００４号

【文献】米国特許第５７３１ｌ６８号

【文献】国際公開第２０１２／０５８７６８号

【非特許文献】

【0015】

【文献】Ｈａａｓ Ｃ. ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，２１４：４４１－４５３，２００９）

【文献】Ｌｏｆｆｌｅｒ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９５：２０９８－２１０３

【文献】Ｊａｇｅｒ Ｍ. ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７２：２４－３２，２０１２

【文献】Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｒｅｖ，２０１３，１２（１１）：１０９１－１１００

【文献】Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏ１，２０１３，４：４８１

【文献】Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、２０１２，１２（４）：２５２－２６４

【文献】Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏ１ Ｍｅｄ．２０１５ Ｊａｎ；２１（１）：２４－３３

【文献】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２ Ｄｅｃ １５；１８（２４）：６５８０－７

【文献】Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１５；１５（３）：３０７－１３

【文献】Ｈｅｍａｔｏ１ Ｏｎｃｏ１ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒ．２０１４ Ｍａｒ；７（１）：１－１７

【文献】Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｅｔ Ｍｅｄ． ２０１５ Ｊａｎ； ２１（１）：２４－３３

【文献】Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１３ Ｊｕｌ ２５；３９（１）：６１－７３

【文献】Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏ１．２０１５ Ｊｕｎ １０；３３（１７）：１９７４－８２

【文献】Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ．２０１４ Ｄｅｃ；１８（１２）：１４０７－２０

【文献】Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｗｉ１１ｉｓｔｏｎ Ｐａｒｋ）．２０１４ Ｎｏｖ；２８ Ｓｕｐｐｌ３：１５－２８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0016】

したがって、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２およびＣＤ８０／ＰＤ－Ｌ１を同時にブロックし、免疫細胞を腫瘍細胞の表面に動員する新規でさらに有効な二機能性抗体を開発することが必要である。

【課題を解決するための手段】

【0017】

発明の概要
本発明は、天然ＩｇＧの構造特性を有し、ミスマッチ重鎖－軽鎖を有さず、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１を同時にブロックすることができる非常に安定なヘテロダイマー二重特異性抗体を提供し、これを調製する方法を提供する。二機能性抗体は、腫瘍細胞上で発現されたＰＤ－Ｌ１および免疫細胞上で発現されたＰＤ－１と同時に結合し、それによって非常に有効かつ特異的な殺滅効果、および毒性の低い副作用を同時に発揮する。

【0018】

第一の態様において、本発明は、ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合できる第一抗原結合機能領域と、ＰＤ－１と特異的に結合できる第二抗原結合機能領域とを含むヘテロダイマー二重特異性抗体に関し、前記二重特異性抗体は、一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって連結された第一Ｆｃ鎖と第二Ｆｃ鎖とを含み、前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖は共有結合またはリンカーによってＰＤ－Ｌ１抗原結合機能領域およびＰＤ－１抗原結合機能領域とそれぞれ連結され、前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖は、以下の位置での五つのアミノ酸置換、すなわち、前記第一Ｆｃ鎖上の位置３６６および３９９でのアミノ酸の置換と、前記第二Ｆｃ鎖上の位置３５１、４０７および４０９でのアミノ酸の置換とを含み、上述のアミノ酸置換を含む前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖は、各々のホモダイマーを形成するのではなく、互いとヘテロダイマーを形成する傾向があり、アミノ酸位置はＫａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステムに従って番号付けされる。

【0019】

いくつかの実施形態において、前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖の前記アミノ酸置換は以下のとおりである、
ａ）位置３５１でのグリシン、チロシン、バリン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはトリプトファンによる置換、
ｂ）位置３６６でのロイシン、プロリン、トリプトファンまたはバリンによる置換、
ｃ）位置３９９でのシステイン、アスパラギン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、トレオニンまたはアラニンによる置換、
ｄ）位置４０７でのロイシン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニンまたはヒスチジンによる置換、
ｅ）位置４０９でのシステイン、プロリン、セリン、フェニルアラニン、バリン、グルタミンまたはアルギニンによる置換。

【0020】

いくつかの実施形態において、前記アミノ酸置換は以下のものである。
ａ）前記第一Ｆｃ鎖上のＴ３６６ＬおよびＤ３９９Ｒの置換、前記第二Ｆｃ鎖上のＬ３５１Ｅ、Ｙ４０７ＬおよびＫ４０９Ｖの置換、
ｂ）前記第一Ｆｃ鎖上のＴ３６６ＬおよびＤ３９９Ｃの置換、前記第二Ｆｃ鎖上のＬ３５１Ｇ、Ｙ４０７ＬおよびＫ４０９Ｃの置換、
ｃ）前記第一Ｆｃ鎖上のＴ３６６ＬおよびＤ３９９Ｃの置換、前記第二Ｆｃ鎖上のＬ３５１Ｙ、Ｙ４０７ＡおよびＫ４０９Ｐの置換、
ｄ）前記第一Ｆｃ鎖上のＴ３６６ＰおよびＤ３９９Ｎの置換、前記第二Ｆｃ鎖上のＬ３５１Ｖ、Ｙ４０７ＰおよびＫ４０９Ｓの置換、
ｅ）前記第一Ｆｃ鎖上のＴ３６６ＷおよびＤ３９９Ｇの置換、前記第二Ｆｃ鎖上のＬ３５ｌＤ、Ｙ４０７ＰおよびＫ４０９Ｓの置換、
ｆ）前記第一Ｆｃ鎖上のＴ３６６ＰおよびＤ３９９Ｉの置換、前記第二Ｆｃ鎖上のＬ３５１Ｐ、Ｙ４０７ＦおよびＫ４０９Ｆの置換、
ｇ）前記第一Ｆｃ鎖上のＴ３６６ＶおよびＤ３９９Ｔの置換、前記第二Ｆｃ鎖上のＬ３５１Ｋ、Ｙ４０７ＴおよびＫ４０９Ｑの置換、
ｈ）前記第一Ｆｃ鎖上のＴ３６６ＬおよびＤ３９９Ａの置換、前記第二Ｆｃ鎖上のＬ３５１Ｗ、Ｙ４０７ＨおよびＫ４０９Ｒの置換。

【0021】

いくつかの実施形態において、前記第一Ｆｃ鎖上の前記アミノ酸置換はＴ３６６ＬおよびＤ３９９Ｒであり、前記第二Ｆｃ鎖上の前記アミノ酸置換はＬ３５１Ｅ、Ｙ４０７ＬおよびＫ４０９Ｖである。

【0022】

いくつかの実施形態において、前記Ｆｃ鎖はＩｇＧから誘導される。

【0023】

いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１抗原結合機能領域および前記ＰＤ－１抗原結合機能領域はＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントである。

【0024】

いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１抗原結合機能領域および前記ＰＤ－１抗原結合機能領域はどちらもＦａｂフラグメントである。

【0025】

いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１抗原結合機能領域および前記ＰＤ－１抗原結合機能領域の一方はＦａｂフラグメントであり、他方はｓｃＦｖである。

【0026】

いくつかの実施形態において、前記Ｆａｂフラグメントは、異なる第一重鎖可変領域および第二重鎖可変領域と、異なる第一軽鎖可変領域および第二軽鎖可変領域とを含む。

【0027】

いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体のアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８からなる群から選択される。

【0028】

第二の態様において、本発明は、第一の態様によるヘテロダイマー二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。

【0029】

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択される。

【0030】

第三の態様において、本発明は、第二の態様による単離されたポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターに関する。

【0031】

いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、ｐＣＤＮＡに基づいた操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）によって得られるプラスミドベクターＸ０ＧＣである。

【0032】

第四の態様において、本発明は、第二の態様による単離されたポリヌクレオチド、または第三の態様による組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。

【0033】

いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ヒト胚腎細胞ＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３ＥなどのＨＥＫ２９３細胞に基づく操作によって得られる細胞、ハムスター卵巣細胞ＣＨＯまたはＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－ｄｈｆｒ^－、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯなどのＣＨＯ細胞に基づく操作によって得られる細胞、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたはＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、ＯｒｉｇａｍｉなどのＥ．ｃｏｌｉに基づく操作によって得られる株、酵母またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａなどの酵母に基づく操作によって得られる株、昆虫細胞またはＨｉｇｈ５、ＳＦ９などの昆虫細胞に基づく操作によって得られる細胞、植物細胞、哺乳類乳房細胞、体細胞などから選択される。

【0034】

第五の態様において、本発明は、第一の態様によるヘテロダイマー二重特異性抗体、または第二の態様による単離されたポリヌクレオチド、または第三の態様による組換え発現ベクター、または第四の態様による宿主細胞と、医薬的に許容される担体とを含む組成物に関する。

【0035】

第六の態様において、本発明は、第一の態様によるヘテロダイマー二重特異性抗体を産生する方法であって
１）宿主細胞において第二の態様による単離されたポリヌクレオチドまたは第三の態様による組換え発現ベクターを別々に発現させるステップと、
２）前記宿主細胞において別々に発現されたタンパク質を還元するステップと、
３）還元されたタンパク質を混合し、次いで混合物を酸化するステップと、を含む、方法に関する。

【0036】

いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ヒト胚腎細胞ＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３ＥなどのＨＥＫ２９３細胞に基づく操作によって得られる細胞、ハムスター卵巣細胞ＣＨＯまたはＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－ｄｈｆｒ^－、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯなどのＣＨＯ細胞に基づく操作によって得られる細胞、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたはＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、ＯｒｉｇａｍｉなどのＥ．ｃｏｌｉに基づく操作によって得られる株、酵母またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａなどの酵母に基づく操作によって得られる株、昆虫細胞またはＨｉｇｈ５、ＳＦ９などの昆虫細胞に基づく操作によって得られる細胞、植物細胞、哺乳類乳房細胞、体細胞などから選択される。

【0037】

いくつかの実施形態において、前記還元するステップは、１）還元剤が、２－メルカプトエチルアミン、ジチオトレイトール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンもしくはその化学誘導体、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、還元反応を実施し、２）前記還元剤を除去することを含む。

【0038】

いくつかの実施形態において、前記酸化するステップは空気中での酸化であるが、Ｌ－デヒドロアスコルビン酸または他の化学誘導体からなる群から選択される酸化剤の存在下で酸化反応を実施することも含む。

【0039】

いくつかの実施形態において、前記方法は分離および精製のステップもさらに含む。

【0040】

第七の態様において、本発明は、対象における疾患を予防および／または治療するための薬剤の製造における、第一の態様によるヘテロダイマー二重特異性抗体、および／または第二の態様による単離されたポリヌクレオチド、および／または第三の態様による組換え発現ベクター、および／または第四の態様による宿主細胞、および／または第五の態様による組成物の使用に関する。

【0041】

第八の態様において、本発明は、対象における疾患を予防および／または治療するための薬剤として使用するための、第一の態様によるヘテロダイマー二重特異性抗体、および／または第二の態様による単離されたポリヌクレオチド、および／または第三の態様による組換え発現ベクター、および／または第四の態様による宿主細胞、および／または第五の態様による組成物に関する。

【0042】

第九の態様において、本発明は、疾患を予防および／または治療するための方法であって、それを必要とする対象に、第一の態様によるヘテロダイマー二重特異性抗体、および／または第二の態様による単離されたポリヌクレオチド、および／または第三の態様による組換え発現ベクター、および／または第四の態様による宿主細胞、および／または第五の態様による組成物を投与することを含む方法に関する。

【0043】

いくつかの実施形態において、前記対象は哺乳類、好ましくはヒト対象である。

【0044】

いくつかの実施形態において、前記疾患は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮がん、非小細胞肺がん、鼻咽腔がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、胆嚢がん、肝臓がん、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞がん、黒色腫からなる群から選択される腫瘍である。

【0045】

本発明者らは、天然ＩｇＧの特徴を有し、かつミスマッチ重鎖－軽鎖を有さない非常に安定なヘテロダイマー抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１二重特異性抗体である、完全に新しい抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体を設計する。前記二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１の二つの標的分子と同時に結合することができ、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２およびＣＤ８０／ＰＤ－Ｌ１を同時にブロックすることができ、免疫細胞を腫瘍細胞の表面に動員することができ、腫瘍治療においてより強力な有効性を示すはずである。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1】図１は、ヘテロダイマー抗体分子のモノマーの溶出ピークを示す。

【図2】図２は、ヘテロダイマー抗体分子のモノマーのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図3】図３は、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体分子の構造を示す。

【図4】図４は、１本の重鎖および１本の軽鎖の半抗体分子の概略的構造を示す。

【図5】図５は、抗ＰＤ－Ｌ１および抗ＰＤ－１抗体の半抗体分子の酸化産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。

【図6】図６は、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体分子の溶出ピークを示す。

【図7】図７は、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体分子のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。

【図8】図８は、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体分子のＳＥＣ分析の結果を示す。

【図9】図９は、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体分子のＰＤ－Ｌ１結合活性およびＰＤ－１結合活性を示し、パネルＡおよびパネルＢは、それぞれ、ＰＤ－Ｌ１結合活性およびＰＤ－１結合活性を示す。

【図10】図１０は、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体分子が、ＰＤ－Ｌ１の高い発現を伴ってＳＫ－ＢＲ－３細胞と、ＰＤ－１の高い発現を伴ってＣＨＯ／ＰＤ－１細胞と、同時に結合することを示し、パネルＡ～パネルＤは、それぞれ、ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ、ＰＤ－１ ｍＡｂ、ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ＋ＰＤ－１ ｍＡｂ、および抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１_ＢＪＨＭとの結合を示す。

【図11】図１１は、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体分子がサイトカインＩＬ－２およびＩＦＮ－γの分泌を促進することを示す。

【図12】図１２は、腫瘍細胞に対するＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体分子のインビトロ殺滅活性を示す。

【図13】図１３は、マウスモデルにおける腫瘍細胞に対する抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体分子の殺滅活性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0047】

発明の詳細な説明
定義
ヘテロダイマー二重特異性抗体において、「共有結合」とは、二つのＦｃ鎖間、またはいずれか一つのＦｃ鎖と各抗原結合機能領域とを連結させて分子を形成する共有結合を指し、ここで、前記Ｆｃ鎖は、第一抗原結合機能領域と一つ以上の共有結合（例えば、ジスルフィド結合）によって連結された第二抗原結合機能領域とを含み、第一Ｆｃ鎖および第二Ｆｃ鎖は、それぞれ共有結合（イミン結合またはアミド結合など）を介して前記抗原結合機能領域に連結されている。

【0048】

前記抗原結合機能領域は、抗原などの標的分子と特異的に相互作用することができる領域を指す。そのような相互作用は非常に選択的である。概して、一つの標的分子を認識する配列は、他の分子の配列を認識することができない。代表的な前記抗原結合機能領域は、抗体可変領域、アロステリック抗体可変領域、受容体結合領域、リガンド結合領域、または酵素結合領域を含む。

【0049】

一つ以上の「鎖間ジスルフィド結合」とは、第一Ｆｃ鎖と第二Ｆｃ鎖との間の一つ以上のジスルフィド結合を指し、これは、前記鎖を結合させて、ヘテロダイマーフラグメントを形成する。本発明において、一つ以上のジスルフィド結合は、前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖、または前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖ならびにそれらに連結された前記抗原結合機能領域が同じ細胞中で合成される場合に形成することができるか、または前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖、または前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖ならびにそれらに連結された前記抗原結合機能領域が異なる細胞中で別々に合成された後にインビトロ還元－酸化プロセスによって形成することができる。

【0050】

前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖とは、共有結合によって形成された複合フラグメント（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ）であって、前記共有結合がジスルフィド結合を含むものを指す。

【0051】

各鎖は、イムノグロブリン重鎖定常領域の少なくとも一部を含む。さらに、前記第一鎖および前記第二鎖は、少なくとも一つのアミノ酸位置における差異など、アミノ酸配列において異なっている。本発明の第一Ｆｃ鎖および第二Ｆｃ鎖において、同じ鎖間に強力な反発力が存在し、その一方で、異なる鎖間には引力が存在する。したがって、前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖、または前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖ならびにそれらに連結された前記抗原結合機能領域は、細胞において同時発現された場合、ヘテロダイマーを形成する傾向を有する。前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖、または前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖ならびにそれらに連結された前記抗原結合機能領域が二つの宿主細胞において別々に発現される場合、前記第一Ｆｃ鎖または前記第一Ｆｃ鎖およびそれらに連結された前記抗原結合機能領域はホモダイマーを形成する傾向を有さず、前記第二Ｆｃ鎖、または前記第二Ｆｃ鎖およびそれに連結された前記抗原結合機能領域はホモダイマーを形成する傾向を有さない。本発明において、前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖、または前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖ならびにそれに連結された前記抗原結合機能領域は還元剤の存在下で二つの宿主細胞において別々に発現され、ホモダイマーの割合は５０％未満である。すなわち、モノマーの割合（前記Ｆｃ鎖または前記Ｆｃ鎖およびそれに連結された前記抗原結合機能領域）は５０％超である。

【0052】

イムノグロブリンは、より長く、より高い相対分子量を有し、４５０～５５０のアミノ酸残基を含み、５５，０００Ｄａ～７０，０００Ｄａの相対分子量を有する二つの同じ重鎖と、より短く、より低い相対分子量を有し、約２１０のアミノ酸残基を含み、約２４，０００Ｄａの相対分子量を含む二つの同じ軽鎖（Ｌ鎖）とを含む四つのポリペプチド鎖の対称構造を有する。Ｎ末端付近の約１１０アミノ酸の配列は、異なるイムノグロブリン重鎖および軽鎖において高可変性であり、可変領域（Ｖ領域）として知られている。Ｃ末端付近の残りのアミノ酸配列は比較的安定であり、定常領域（Ｃ領域）として知られている。重鎖において、前記可変領域は前記重鎖の長さの約１／４を占め、その一方で、前記定常領域は前記重鎖の長さの約３／４を占める。既知の五つのＩｇアイソタイプ、すなわちＩｇＧ（γ）、ＩｇＡ（α）、ＩｇＤ（δ）、ＩｇＭ（μ）およびＩｇＥ（ε）に関しては、前者の３つのＩｇアイソタイプ、すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３のＨ鎖には三つの定常領域がある。後者の二つのアイソタイプ（ＩｇＭおよびＩｇＥ）のＨ鎖では、一つのＶＨ領域と四つの定常領域、すなわち、ＣＨ１～ＣＨ４がある。前記定常領域は、イムノグロブリン分子のフレームワークであると同様に、免疫応答を活性化する領域の一つである。

【0053】

本発明において、前記定常領域の一部は少なくとも前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖の相互作用領域を含む。ＩｇＧについて、前記領域は、少なくともＧＬＮ３４７、ＴＹＲ３４９、ＴＨＲ３５０、ＬＥＵ３５１、ＳＥＲ３５４、ＡＲＧ３５５、ＡＳＰ３５６、ＧＬＵ３５７、ＬＹＳ３６０、ＳＥＲ３６４、ＴＨＲ３６６、ＬＥＵ３６８、ＬＹＳ３７０、ＡＳＮ３９０、ＬＹＳ３９２、ＴＨＲ３９４、ＰＲ０３９５、ＶＡＬ３９７、ＡＳＰ３９９、ＳＥＲ４００、ＰＨＥ４０５、ＴＹＲ４０７、ＬＹＳ４０９、ＬＹＳ４３９をはじめとする、ＣＨ３領域中のいくつかのアミノ酸である。

【0054】

共有結合またはリンカーを介した前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖と、それぞれ「一つの抗原結合機能領域」との連結とは、前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖が共有結合またはリンカーを介してそれぞれ抗体の抗原結合フラグメント、または抗原を認識することができる単鎖抗体、または抗原を認識することができる他のアロステリック抗体フラグメント、またはリガンドを認識することができる受容体、または受容体を認識することができるリガンドと連結していることを指す。前記共有結合とは、一種の化学結合であり、二つ以上の原子がそれらの外側の電子を共有し、理想的には飽和状態に達し、それによって共有結合と呼ばれる比較的安定な化学構造を構成する。言い換えると、前記共有結合とは、電子対を共有することによって原子間に形成される相互作用である。同じ元素および異なる元素の原子は、どちらも前記共有結合を介して結合することができる。本発明の第一Ｆｃ鎖と第二Ｆｃ鎖との間の前記共有結合としては、限定されるものではないが、一つのアミノ酸分子のアミノ基と別のアミノ酸分子のカルボキシル基との間の脱水反応によって形成されたアミド結合またはエチレングリコール、もしくはポリエチレングリコール、もしくは他の化合物、もしくはそのポリマーのアルデヒド基と一つのアミノ酸分子のアミノ基から形成されたアミド結合もしくはイミン結合が含まれる。前記リンカーは、アミノ酸配列または二つのポリペプチド鎖を、共有結合を介して連結することができる化合物もしくは化合物のポリマーのセグメントである。アミノ酸配列のセグメントとしては、限定されるものではないが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳなどの小さなペプチドセグメントが含まれる。前記第一Ｆｃ鎖または前記第二Ｆｃ鎖、および抗原を認識することができる単鎖抗体、または抗原を認識することができる他のアロステリック抗体フラグメントはアミド結合を介して連結させることができる。

【0055】

「前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖は各々のホモダイマーを形成するのではなくヘテロダイマーを形成する傾向がある」ことに関連する文脈は、前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖に関して、同じ鎖間に存在する反発力および異なる鎖間に存在する引力のために、前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖、または前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖およびそれらに連結された前記抗原結合機能領域は細胞において同時発現された場合にヘテロダイマーを形成する傾向を有することを指す。前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖、または前記第一Ｆｃ鎖および前記第二Ｆｃ鎖およびそれに連結された前記抗原結合機能領域が二つの宿主細胞において別々に発現される場合、前記第一Ｆｃ鎖または前記第一Ｆｃ鎖およびそれらに連結された前記抗原結合機能領域はホモダイマーを形成する傾向を有さず、前記第二Ｆｃ鎖、または前記第二Ｆｃ鎖およびそれに連結された前記抗原結合機能領域はホモダイマーを形成する傾向を有さない。

【0056】

Ｋａｂａｔインデックスナンバリングシステムとは、抗体配列の各アミノ酸に番号を割り当てるためのＫａｂａｔによって使用される方法を指し、これは当該技術分野において標準的な方法になっている。Ｋａｂａｔナンバリングスキームは彼の研究を越えて、他の抗体に拡張することができる。保存されたアミノ酸に基づいて、標的抗体をＫａｂａｔによって同定されたコンセンサス配列のうちの一つと整列させる。

【0057】

「Ｆｃドメイン」とは、エフェクタ分子または細胞と相互作用するＩｇの部分である、ＩｇのＣＨ２およびＣＨ３ドメインに対応するフラグメント結晶化可能な領域（Ｆｃ）を指す。

【0058】

イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）の略号であるＩｇＧは血清中の主な抗体成分である。ヒトＩｇＧは、ＩｇＧ分子のｒ鎖における抗原性の相違に基づいて４つのサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に分類される。

【0059】

「半抗体」分子とは、抗体の一つの重鎖と一つの軽鎖によって形成される構造であって、前記重鎖および前記軽鎖が前記共有結合を介して連結されてもよいし、連結されなくてもよいものを指す。それは抗原を認識する一価抗体構造である。

【0060】

「Ｆａｂフラグメント」、すなわち、抗原結合（Ｆａｂ）のフラグメントは、インタクトな軽鎖と、重鎖のＶＨおよびＣＨＩドメインとから構成される、抗体分子の二つのアームに対応する分子認識配列である。「ｓｃＦｖ」は分子認識配列であり、抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の遺伝子操作によって得られる改変抗体フラグメントである。膜受容体の「細胞外領域」は分子認識配列である。前記膜受容体は概して、対応する抗原またはリガンドを認識し結合する細胞の外側に位置する細胞外領域と、細胞表面上の受容体上に固定する膜貫通領域と、細胞内キナーゼ活性を有するかまたはシグナル伝達経路を伝送することができる、細胞の内部の細胞内領域とを含む。細胞膜受容体の「リガンド」とは、タンパク質、小ペプチド、または膜受容体の細胞外領域によって認識することができ結合できる化合物を指す。サイトカインは、免疫原、マイトジェン、または他の刺激物によって誘導される様々なタイプの細胞によって産生され、自然免疫および適応免疫、造血、細胞成長、成人多能性幹細胞（ＡＰＳＣ）の調整、および損傷組織の修復などの様々な機能を有する低分子量可溶性タンパク質である。サイトカインは、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子スーパーファミリー、コロニー刺激因子、ケモカイン、成長因子などに分類される。「タンパク質発現タグ」とは、標的タンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加される、小さなペプチドまたはある長さのアミノ酸のいずれかであるアミノ酸配列のセグメントを指す。タグの付加は、タンパク質の正しいフォールディング、タンパク質の単離および精製、ならびにタンパク質の細胞内分解の減少に有利であり得る。通常使用されるタグとしては、限定されるものではないが、ＨＡ、ＳＵＭＯ、Ｈｉｓ、ＧＳＴ、ＧＦＰ、およびＦｌａｇが含まれる。

【0061】

本発明のヘテロダイマー二重特異性抗体に適用可能な抗体に制限はない。好ましくは、疾患の治療および／または予防のために当該技術分野で公知の任意の抗体を本発明で使用することができる。

【0062】

本発明のヘテロダイマー二重特異性抗体は、一つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入を有していてもよい。例えば、いくつかのアミノ酸は、他のポリペプチド（例えば抗原）または細胞に対する結合における可能性の著しい損失なしにタンパク質構造中の他のアミノ酸と置換することができる。タンパク質の生物学的機能活性はタンパク質の結合能力および特性によって決定されるので、タンパク質配列を、その生物学的エフェクタ活性の著しい損失なしにいくつかのアミノ酸配列の置換に供することができる。

【0063】

多くの場合、ポリペプチド変異体は一つ以上の保存的置換を含む。「保存的置換」とは、ペプチド化学の当業者がポリペプチドの二次構造および親水性特性は実質的に変化しないと予想するような、類似の特性を有する他のアミノ酸でのアミノ酸の置換を指す。

【0064】

アミノ酸置換は、概して、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどのアミノ酸の側鎖置換基の相対的類似性に基づく。様々な特性を考慮して、例示的置換は当業者には周知であり、アルギニンおよびリジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸、セリンおよびトレオニン、グルタミンおよびアスパラギン、ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンが含まれる。

【0065】

本発明で使用される用語「同一性」は、当該分野で通常知られている意味を有し、（必要ならば最大相同性％を達成するために）配列を整列させギャップを導入した際のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列変異体および非変異体配列間の同じ残基のパーセンテージを指す。異なる配列間の同一性を決定するための規則および範疇も当業者には知られている。本発明において、同一性の定義が満足される場合、得られた変異体配列は、親配列が保有する生物学的活性を有することも必要とされる。活性を有する変異体配列をスクリーニングするための方法および手段は当業者には周知である。本明細書中で開示する教示から、当業者はそのような変異体配列を容易に達成するであろう。具体的な実施形態において、前記ポリヌクレオチドおよびポリペプチド変異体は、本明細書中で記載する前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド同一性を有する。遺伝子コードの重複性のために、これらの配列と同じアミノ酸配列をコードする変異体がある。

【0066】

本発明の別の実施形態において、中程度から高度にストリンジェントな条件下で、本発明によって提供されるポリヌクレオチド配列、またはそのフラグメント、またはその相補配列とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド組成物が提供される。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の分野では周知である。例示の目的で、本発明のポリヌクレオチドの他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するための好適な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液で予洗し、５０℃～６０℃にて５×ＳＳＣの条件下で一晩ハイブリダイズし、そして０．１％ＳＤＳを含む２×、０．５×および０．２×ＳＳＣで６５℃にて２回２０分間洗浄することを含む。当業者は、例えばハイブリダイゼーション溶液および／またはハイブリダイゼーション温度の塩含有量を変えることによって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを容易に操作し得ることを理解している。例えば、別の実施形態において、好適な高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、ハイブリダイゼーション温度を、例えば６０～６５℃または６５～７０℃まで上昇させることを除く条件が含まれる。

【0067】

本発明の宿主細胞は、限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳類細胞をはじめとする、異種の遺伝子発現のために使用されるいかなる細胞であってもよい。

【0068】

本発明のベクターとしては、例えば、限定されるものではないが、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、およびミニ染色体をはじめとする、任意の種類の細胞または生命体中で複製できるベクターが含まれる。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、ポリヌクレオチドの伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）もしくは複製に適したベクター、または本発明のポリペプチドの発現に適したベクターである。そのようなベクターは、当該技術分野で公知であり、市販されている。

【0069】

「ベクター」には、シャトルベクターおよび発現ベクターが含まれる。概して、プラスミド構築物はまた、複製起源（例えば、ＣｏＥｌ複製起源）ならびにプラスミド複製および細菌における選択のためにそれぞれ使用される選択可能なマーカー（例えば、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性）も含む。「発現ベクター」とは、細菌または真核細胞において、抗体フラグメントを含む、本発明の抗体を発現するために必要な制御配列または調要素を含むベクターを指す。

【0070】

本発明のベクターは、限定されるものではないが、プラスミドベクターをはじめとする、異種の遺伝子発現のために使用される任意のベクターであってよく、プラスミドベクターは少なくとも複製起源、プロモータ、関心対象の遺伝子、複数のクローニング部位および選択マーカー遺伝子を含む。好ましくは、本発明のベクターには、限定されるものではないが、Ｘ０ＧＣベクターなどの、ｐｃＤＮＡに基づく改変によって得られるプラスミドベクターが含まれる。

【0071】

本発明の対象には、家禽、爬虫類、哺乳類などが含まれる。好ましくは、前記哺乳類には齧歯類および霊長類が含まれる。好ましくは、前記霊長類にはヒトが含まれる。

【0072】

本発明に関連する疾患の範囲には、限定されるものではないが、腫瘍が含まれる。好ましくは、前記腫瘍には、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮がん、非小細胞肺がん、鼻咽腔がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、胆嚢がん、肝臓がん、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞がん、黒色腫が含まれる。

【0073】

薬剤的に許容される担体とは、調剤分野で一般的に用いられる医薬担体、例えば、希釈剤、賦形剤、水など、デンプン、スクロース、ラクトース、微結晶セルロースなどのフィラー、セルロース誘導体、アルギネート、ゼラチンおよびポリビニルピロリドンなどの結合剤、グリセリンなどの湿潤剤、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロース、寒天、炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、四級アンモニウム化合物などの吸収増強剤、ヘキサデカノール、ラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤、カオリナイト、ベントナイトなどの吸着担体、タルク、ステアリン酸カルシウムおよびステアリン酸マグネシウム、微粉化シリカゲルおよびポリエチレングリコールなどの潤滑剤を指す。さらに、矯味矯臭剤および甘味料などの他のアジュバントを組成物に添加してもよい。

【0074】

本発明を、以下の非限定例を参照して、本明細書中でさらに説明する。本発明の主旨から逸脱することなく本発明に様々な改変を加えることができることは当業者にはよく知られている。そのような改変も本発明の範囲内に含まれる。

【実施例】

【0075】

以下の実験方法は、特に記載しない限り、すべて通常の方法である。採用した実験材料は、特に別段の記載がない限り、商業的企業から容易に入手することができる。本発明の以下の実施例で使用する抗体は、すべて、市販の標準的抗体である。

【0076】

実施例１．ヘテロダイマー抗体分子のベクター構築
それぞれ、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖および軽鎖を含むＸ０ＧＣ発現ベクターを構築し、抗体可変領域の配列は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ１１５９５から得た。重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１由来であった。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１として示され、そのアミノ酸配列は配列番号２として示され、軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は配列番号３として示され、そのアミノ酸配列は配列番号４として示され、重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号５として示され、そのアミノ酸配列は配列番号６として示され、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は配列番号７として示され、そのアミノ酸配列は配列番号８として示される。前記軽鎖可変領域および前記軽鎖定常領域、前記重鎖可変領域および前記重鎖定常領域をそれぞれＰＣＲ法によって増幅した。Ｐｈｕｓｉｏｎハイフィテリティ（Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆ－５３０Ｌ、ＮＥＢ，Ｉｎｃ．製）を本願の全てのＰＣＲ反応で使用した。ＰＣＲプライマーを、相補塩基対合の原則および酵素消化部位の要件にしたがって従来通りに設計した。すべての反応系は、８．９μｌのＨ_２Ｏ、４μＬの５×ＰｈｕｓｉｏｎハイフィテリティＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、４μＬの１ｍＭ ｄＮＴＰ、１μｌの上流プライマー、１μｌの下流プライマー、０．１μｌのＰｈｕｓｉｏｎハイフィテリティＤＮＡ ポリメラーゼ、および１μｌの鋳型であった。可変領域および定常領域のＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供し、対応するフラグメントを、ＤＮＡ回収キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ９２８２、以下同様）を使用して回収した。前記可変領域の上流プライマーおよび前記定常領域の下流プライマーを使用して、回収した可変領域フラグメントおよび定常領域フラグメントを鋳型として用いてさらなるＰＣＲを実施した。次に、対応するフラグメントを回収して、軽鎖または重鎖の完全長フラグメントを得た。Ｘ０ＧＣベクターおよび完全長フラグメントをＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｒ３１０１Ｌ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｒ３１０４Ｌ）で消化した。酵素消化反応系は、２μＬの１０×緩衝液３、それぞれ０．５μｌのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ、前記ゲルから回収した３μＬの完全長フラグメント、および１４．５μＬのＨ_２Ｏであった。酵素消化反応系を３７℃で３時間反応させた。酵素消化産物をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｖ）（以下同様）でライゲーションさせた。反応系は、２μｌの１０×リガーゼ緩衝液、０．５μｌのリガーゼ、ゲルから回収された３μｌの完全長フラグメント、ゲルから回収された３μｌのＸ０ＧＣベクター、および１１．５μｌのＨ_２Ｏであった。ライゲーションを室温で１２時間実施した。ライゲーションされた産物をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換させ（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＣＢ１０４、以下同様）、それぞれ真核細胞において抗体重鎖および軽鎖を発現させるために、抗体重鎖および軽鎖の各Ｘ０ＧＣ発現ベクターを得た。

【0077】

抗ＰＤ－１（Ｐｅｍ）抗体の重鎖および軽鎖のＸ０ＧＣ発現ベクターをそれぞれ構築し、抗体可変領域の配列はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ／ｃｇｉ／ｄｅｔａｉｌｓ．ｃｇｉ？ｐｄｂｃｏｄｅ＝９７９８から入手し、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号９として示され、そのアミノ酸配列は配列番号１０として示され、軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は配列番号３として示され、そのアミノ酸配列は配列番号４として示され、重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１１として示され、そのアミノ酸配列は配列番号１２として示され、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は配列番号１３として示され、そのアミノ酸配列は配列番号１４として示される。真核細胞において抗体重鎖および軽鎖をそれぞれ発現させるために抗体重鎖および軽鎖の各Ｘ０ＧＣ発現ベクターを得た。

【0078】

抗ＰＤ－１抗体（ＢＪＨＭ）の重鎖および軽鎖のＸ０ＧＣ発現ベクターも本発明において構築した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１５として示され、そのアミノ酸配列は配列番号１６として示され、軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は配列番号３として示され、そのアミノ酸配列は配列番号４として示され、重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１７として示され、そのアミノ酸配列は配列番号１８として示され、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は配列番号１３として示され、そのアミノ酸配列は配列番号１４として示される。抗体重鎖および軽鎖の各Ｘ０ＧＣ発現ベクターを、真核細胞においてそれぞれ抗体重鎖および軽鎖を発現するために入手した。

【0079】

実施例２．ヘテロダイマー抗体分子の発現
前記抗体重鎖および軽鎖の各発現ベクターを２９３Ｆ細胞株に同時トランスフェクトした（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３－Ｆ細胞、カタログ番号Ｒ７９００７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、トランスフェクションの前日に、細胞を接種した。トランスフェクション当日に、前記細胞を遠心分離によって収集し、次いで新鮮なＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（カタログ番号１２３３８００１、Ｇｉｂｃｏ）中に２００×１０^５細胞／ｍＬの細胞密度で再懸濁させた。プラスミドをトランスフェクション体積にしたがって３６．６７ｕｇ／ｍＬの最終濃度になるように添加し、穏やかに混合した。次に、線状ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、線状、Ｍ．Ｗ．２５０００、カタログ番号４３８９６、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）を５５ｕｇ／ｍＬの最終濃度になるように添加し、穏やかに混合した。その後、混合物を細胞インキュベータ中に入れ、シェーカー中で１２０ｒｐｍ、３７℃にて１時間インキュベートした。次いで、前記トランスフェクション体積の１９倍の体積の新鮮な培地を添加した。インキュベーションをシェーカー中で、１２０ｒｐｍ、３７℃にて続けた。５～６日間トランスフェクトした細胞培養の上清を遠心分離によって収集した。

【0080】

発現量をＥＬＩＳＡ法によって決定した。クロマトグラフィーカラムを適用することによる精製前に、沈殿を、０．２μｍフィルター膜でのろ過によって除去した。このステップを４℃で実施した。

【0081】

実施例３．ヘテロダイマー抗体分子発現産物の精製
精製は、４℃でＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗアフィニティクロマトグラフィーカラム（１６ｍｍＬＤ、２２ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。まず、クロマトグラフィーカラムを移動相Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ＰＨ７．４）で平衡化した。ベースラインを安定化させたのち、上述の様に処理した細胞上清を５ｍｌ／分の流速でロードした。ローディングプロセス後、移動相Ａを平衡化のために使用した。その後、５カラム容積の移動相Ｂ１（移動相Ａ＋０．５Ｍアルギニン）を、カラムを洗浄するために使用し、そして５カラム容積の移動相Ｂ２（１００ｍＭクエン酸、ＰＨ３．０）を、溶出ピーク、すなわち、関心対象のタンパク質のピークを溶出させて集めるために使用した。溶出ステップのすべてにおいて流速は５ｍｌ／分であった。抗ＰＤ－Ｌ１発現産物の溶出ピークのクロマトグラムを図１に示す。抗ＰＤ－１発現産物の溶出ピークはこれと類似している（結果は含まれていない）。表示された溶出ピーク（図示した灰色部分）を収集し、１Ｍ酢酸ナトリウム溶液の滴下によってｐＨをｐＨ５．０に調節した。

【0082】

精製産物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ法によって分析し、結果を図２に示す。

【0083】

実施例４．抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体分子の調製および精製
抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体分子の構造を図３に示す。

【0084】

ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（１６ｍｍＩ．Ｄ．、２２ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の方法で得られた抗体の半抗体分子をインビトロ再構築に供して、ヘテロダイマーを得た。上述のようにして精製し収集したタンパク質溶液をまず限外ろ過濃縮管（１０ｋＤａの公称カットオフ分子量）を通した限外ろ過によって濃縮し、次いで溶液をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ＝７．４）で置換した。抗ＰＤ－Ｌ１および抗ＰＤ－１抗体の半抗体分子の得られた分子溶液は、ＰＢＳをそれぞれ添加することによって１ｍｇ／ｍｌに調節した。ＤＴＴの最終濃度がそれぞれ５ｍＭとなるように、１ＭのＤＴＴを最終溶液の１／２００倍で添加した。還元を４℃で（３～８時間）実施して、ジスルフィド結合を切断した。抗ＰＤ－１半抗体分子中に少量で含まれるホモダイマー抗体分子のヒンジ領域中のジスルフィド結合も切断し、それによって図４に図示した構造のような一つの重鎖と一つの軽鎖とを含む半抗体分子を形成した。還元サンプルをＳＥＣ－ＨＰＬＣで分析した。前記半抗体分子の割合は９０％超であった。

【0085】

その後、還元抗ＰＤ－Ｌ１および抗ＰＤ－１半抗体分子を等モル比で混合し、４℃で２４時間再構築反応に供した。再構築中、前記抗ＰＤ－Ｌ１および前記抗ＰＤ－１半抗体分子の両方を含むヘテロダイマー二重特異性抗体を、前記抗ＰＤ－Ｌ１および前記抗ＰＤ－１半抗体分子からＣＨ２／ＣＨ３間の非共有結合性相互作用を介して形成した。次いで、タンパク質溶液は、限外ろ過濃縮管（１０ｋＤａの公称カットオフ分子量）を通した限外ろ過によって濃縮した。溶液をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ－７．４）で置換して還元を停止させた。酸化を空気中、または酸化剤を使用して実施して、ヘテロダイマー二重特異性抗体のジスルフィド結合を再編成させた。酸化条件は以下の通りであった。１００ｍＭのＬ－デヒドロアスコルビン酸を酸化剤として添加、前記タンパク質の最終濃度は１ｍｇ／ｍｌであり、前記酸化剤の最終濃度は１ｍＭであった、酸化反応は４℃で２４時間実施した。前記酸化反応によって得られたサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に供した。結果を図５に示す。

【0086】

前記抗ＰＤ－Ｌ１および前記抗ＰＤ－１半抗体分子の還元－酸化によって得られるヘテロダイマー分子は、限外ろ過濃縮管（１０ｋＤａの公称カットオフ分子量）を通した限外ろ過によって濃縮した。溶液を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．８）で置換した。精製を４℃で、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびイオンクロマトグラフィーカラムＳｏｕｒｃｅ １５Ｓ（１６ｍｍＩ．Ｄ．、１７ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。まず、クロマトグラフィーカラムを移動相Ａ（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で平衡化した。ベースラインを安定化させた後、上述のように処理したタンパク質溶液を３ｍｌ／分の流速でロードした。ローディングプロセス後、移動相Ａを平衡化のために使用した。その後、カラムを２０カラム容積でＡ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８）からＢ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８）（０％Ｂ－１００％Ｂ、１７０分、流速２ｍｌ／分）の勾配にて溶出させた。表示された主要溶出ピークを収集し（図６に示す）、収集したタンパク質溶液を、限外ろ過濃縮管（１０ｋＤａの公称カットオフ分子量）を通した限外ろ過によって濃縮した。溶液をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）で置換し、ろ過により滅菌し、４℃で保存した。精製産物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ法によって分析した。結果を図７に示す。ＳＥＣ－ＨＰＬＣによる純度分析により、図８に示す結果として純度は９６．４４％であった。

【0087】

実施例５．抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体分子のインビトロ標的結合活性
単抗原に対するＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体の結合能力を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。

【0088】

アッセイの詳細なプロセスは以下のとおりである。組換えヒトＰＤ－Ｌ１（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、カタログ番号１０３７７－Ｈ０８Ｈ）またはヒトＰＤ－１（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、カタログ番号１０３７７－Ｈ０８Ｈ）は、ｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液を使用し、ウェルあたり１００μＬのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着性ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。コーティングを４℃で一晩実施した。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。次いで、前記プレートは、１％のＢＳＡを含有する３００μＬ／ウェルのＰＢＳＴでブロックし、２５℃で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで５回洗浄した。１％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴで段階希釈した、ヘテロダイマー抗体のサンプルおよび対照を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。前記プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴで１：２０００にて希釈した、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ３０９Ｐ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、１０分間室温にて発色させた。１ＭのＨ_２ＳＯ_４を１００μＬ／ウェルで添加することによって発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。

【0089】

図９に示した結果によると、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１_ｐｅｍおよび抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１_ＢＪＨＭの両方がＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１に対して高い親和性を有し、二価モノクローナル抗体の抗原親和性活性は充分に保持された。上述したことにおいて、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１_ＢＪＨＭは抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１_ｐｅｍよりも高いＰＤ－１親和性を有する。

【0090】

実施例６．二重標的に対して同時に結合することによる誘導細胞結合の抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体分子の活性
二重標的に対して同時に結合することによる細胞結合を誘導するＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体の活性を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって高ＰＤ－１発現でＰＤ－Ｌ１およびＣＨＯ／ＰＤ－１細胞を発現するＨＣＣ８２７細胞（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｍ００５２９）に関して測定した。

【0091】

ＣＨＯ／ＰＤ－１細胞をＰＫＨ２６キット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＳＬＢＨ４５６８Ｖ）の使用説明書に従って染色した。手短に言うと、ＣＨＯ／ＰＤ－１細胞を収集し、無血清培地で一回洗浄し、ＰＫＨ２６キット中の希釈剤Ｃで２×１０^７／ｍＬにて懸濁させた。ＰＫＨ２６染料を希釈剤Ｃで４μＭに希釈し、１：１の比で細胞懸濁液と混合した。１×１０^７／ｍｌの細胞密度および２μＭのＰＫＨ２６濃度を有する混合懸濁液を１分間室温でインキュベートし、次いで等体積のＦＢＳとともに１分間インキュベートして染色を停止させた。懸濁液を４００ｇで１０分間遠心分離し、完全培地で２回洗浄し、さらなる使用のために完全培地中に再懸濁させた。ＨＣＣ８２７細胞をＣＦＳＥキット（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号Ｃ３４５５４）の使用説明書に従って染色した。手短に言うと、ＣＦＳＥをＰＢＳで０．５ＰＭの処理濃度（ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）に希釈し、３７℃で予熱した。ＨＣＣ８２７細胞を１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって収集し、次いで予熱したＣＦＳＥ処理溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で懸濁させ、３７℃で１５分間インキュベートした。細胞を１０００ｒｐｍで５分の延伸分離によって収集し、完全培地中に再懸濁させ、３０分間インキュベートした。次いで、前記細胞を前記完全培地で一回洗浄し、次いでさらなる使用のために前記完全培地中に再懸濁させた。

【0092】

染色細胞を遠心分離によって集め、２％ＦＢＳを含む冷ＰＢＳで一回洗浄した。前記細胞を、２％ＦＢＳを含む冷ＰＢＳ中に５×１０^６／ｍＬの細胞密度で再懸濁させた。ＨＣＣ８２７およびＣＨＯ／ＰＤ－１細胞を１：１の比で混合した。１００μＬの細胞混合物を各流管中に採取し（すなわち、２．５×１０^５のＨＣＣ８２７と２．５×１０^５のＣＨＯ／ＰＤ－１）、次いで、２％ＦＢＳを含有する冷ＰＢＳ中で希釈した１００μＬのヘテロダイマー抗体サンプル、対照、またはアイソタイプ対照（ヒトイムノグロブリン、Ｊｉａｎｇｘｉ Ｂｏｙａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ１ Ｃｏ，， Ｌｔｄ．、全国薬物認可番号（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ａｐｐｒｏｖａｌ Ｎｏ．）Ｓ１９９９３０１２）を添加した。流管を氷上で３０分間インキュベートし、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで二回洗浄し、次いで５００μＬの冷ＰＢＳ中に再懸濁させた。細胞懸濁液を検出し、フローサイトメトリで分析した。

【0093】

結果を表１および図１０に示す。ヘテロダイマー抗体を用いた高ＰＤ－１発現でＰＤ－Ｌ１およびＣＨＯ／ＰＤ－１細胞を発現するＨＣＣ８２７細胞に対する同時結合によって、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体はＨＣＣ８２７とＣＨＯ／ＰＤ－１細胞との間の密接な結合を誘導することができ、これはＴ細胞による腫瘍細胞殺滅を媒介するための基礎となる。

【0094】

【表1】

【0095】

実施例７．抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体分子のＴ細胞調節活性
Ｔ細胞免疫応答に対するＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体の調節活性を、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって決定した。

【0096】

ヒト樹状細胞（ＤＣ）の取得：
ヒトＰＢＭＣ細胞（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ－２７０２）を復活させ、収集した。前記ヒトＰＢＭＣ細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中、５×１０^６／ｍＬの細胞密度で再懸濁させ、細胞培養フラスコ中に接種し、ＣＯ_２インキュベータ中、３７℃にて９０分間インキュベートした。培養上清を廃棄し、細胞を懸濁させた後、付着細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、カタログ番号１００１５－ＨＮＡＨ）および１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、カタログ番号１ｌ８４６－ＨＮＡＥ）を添加した完全培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）中で培養した。３日間のインキュベーションの後、培地を交換し、細胞をさらに３日間インキュベートした。次いで、培養培地を、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４および２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ－αを含む前記完全培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）と交換し、前記細胞を１日間インキュベートしてＤＣ細胞を得た。

【0097】

ヒトＴ細胞の取得：
ヒトＰＢＭＣ細胞を復活させ、収集し、続いてこのＰＢＭＣ細胞およびＤＣ細胞を誘導するためのＰＢＭＣを異なる個体から誘導した。ヒトＴ細胞をＰａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号５１５０４１４８２０）の使用説明書に従って分離した。手短に言うと、前記ＰＢＭＣをＰＢＳで一回洗浄し、そして４０μＬの分離緩衝液（２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳ、ｐＨ＝７．２）あたり１０^７細胞で再懸濁させた（本明細書では、以下、量はすべて１０^７細胞で算出した）。１０μＬのＰａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｃｋｔａｉｌを添加し、４℃で５分間インキュベートした。その後、３０μＬの分離緩衝液および２０μＬのＰａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｃｏｃｋｔａｉｌを添加し、４℃で１０分間インキュベートした。Ｔ細胞はＭＡＣＳ分離カラムを通して得た。

【0098】

収集したヒトＤＣ細胞およびヒトＴ細胞を完全培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁させ、９６ウェルプレート上に１×１０^４／ウェルおよび１×１０^５／ウェルでそれぞれ接種し、そして混合物中で培養した。完全培地中で段階希釈した前記ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体のサンプルと対照とを添加した。培養プレートを３７℃で５日間のインキュベーションのためにＣＯ_２インキュベータ中に入れた。インキュベーションが完了したら、ウェル中の上清を採取し、サイトカインＩＬ－２（Ｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＥＬＨ－ＩＬ２）およびＩＦＮ－γ（Ｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＥＬＨ－ＩＦＮｇ）をキットマニュアルにしたがって検出した。

【0099】

図１１に示すように、同種異系ＤＣ細胞によって刺激されたヒトＴ細胞は、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γを活性化することができ、分泌することができる。ＰＤ－Ｌ１抗体またはＰＤ－１抗体の添加はＴ細胞の活性化を増強することができ、サイトカインの分泌を促進することができる。ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体は、モノクローナル抗体よりも強力なＴ細胞調節活性を有し、サイトカインＩＬ－２およびＩＦＮ－γの分泌をより著しく促進する。

【0100】

実施例８．腫瘍細胞に対する抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体分子のインビトロ殺滅活性
ＨＣＣ８２７腫瘍細胞を収集した。ＨＣＣ８２７細胞を完全培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）中に５×１０^４／ｍＬの細胞密度で再懸濁させ、９６ウェルプレート上にウェルあたり１００μＬ（各ウェル中５×１０^３細胞）で接種した。プレートを、３７℃にて３～４時間、ＣＯ_２インキュベータ中で３～４時間インキュベートした。ヒトＰＢＭＣ細胞（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ－２７０２）を再懸濁させ、収集した。前記ＰＢＭＣを完全培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）中に２×１０^６／ｍＬの細胞密度で再懸濁させ、エフェクタ細胞の標的細胞に対する比が２０：１となるように９６ウェルプレート中に５０μＬ／ウェル（ウェルあたり１×１０^５細胞）で添加した。Ｔｒｏｐ－２／ＣＤ３ヘテロダイマー抗体（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｈａｎｍｅｉ Ｐｈａｒｍ．）を１ｎＭの最終濃度で添加した。前記完全培地中で段階希釈したＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体のサンプルと対照とを添加した。各ウェル中の液体の合計体積は２００μＬであった。インキュベーションプレートを３７℃で３日間インキュベーションするためにＣＯ_２インキュベータ中に入れた。インキュベーションの最後に、培養上清および懸濁ＰＢＭＣ細胞を廃棄した。ＨＣＣ８２７細胞をＰＢＳで２回洗浄して、残留ＰＢＭＣを除去した。最後に、１００μＬの前記完全培地および２０μＬのＭＴＳ発色剤（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ３５８Ｂ）を添加し、２～３時間インキュベートした。４９０ｎｍでの吸収をマイクロプレートリーダーで検出した。

【0101】

図１２に示すように、Ｔｒｏｐ－２／ＣＤ３ヘテロダイマー抗体はＨＣＣ８２７腫瘍細胞上のＰＢＭＣによって細胞殺滅を開始し、ＰＤ－Ｌ１抗体またはＰＤ－１抗体は濃度に依存して腫瘍細胞に対するＰＢＭＣの殺滅効果を増強することができる一方で、ＰＤ－Ｌｌ／ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体はモノクローナル抗体およびモノクローナル抗体の組み合わせよりも腫瘍細胞に対してより強力な殺滅活性を有する。

【0102】

実施例９．異種移植腫瘍モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体分子の抗腫瘍効果
Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌｓｔａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ． Ｌｔｄ．から購入した６～８週令のメスＮＰＧ（ＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^ｎｕｌｌ）マウスを実験材料として使用した。１週間の環境への適応後、５×１０^６のＨＣＣ８２７ヒト肺がん細胞を各マウスの右背部に皮下接種した。腫瘍体積が約１００ｍｍ^３まで成長したら、前記マウスを前記腫瘍体積にしたがって、各グループ６匹の腫瘍保有マウスとなるようにグループ分けした。動物それぞれにビヒクル（ＰＢＳ）、７０ｎｍｏ１／ｋｇのＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体、７０ｎｍｏ１／ｋｇのＰＤ－１モノクローナル抗体、７０ｎｍｏ１／ｋｇのＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体＋７０ｎｍｏ１／ｋｇのＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体との医薬組成物、７０ｎｍｏｌ／ｋｇの抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－１ヘテロダイマーを腹腔内注射によって２週間にわたり週２回投与した。投与日から始めて、前記腫瘍体積を週に３回測定した。長径ａおよび短径ｂを測定し、前記腫瘍体積を式：腫瘍体積（ｍｍ^３）＝（ａ×ｂ^２）／２にしたがって算出した。

【0103】

結果は図１３に示すとおりである。ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂおよびＰＤ－１ ｍＡｂはどちらも抗腫瘍効果を示したが、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１ヘテロダイマー抗体はモノクローナル抗体およびモノクローナル抗体の組み合わせよりも強力な抗腫瘍効果を示した。さらに、薬物中止の後でも良好な腫瘍管理が示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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