特許 7579844 非定型スプリットインテインおよびそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-30

(45)【発行日】2024-11-08

(54)【発明の名称】非定型スプリットインテインおよびそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/00 20060101AFI20241031BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241031BHJP

【ＦＩ】

C07K14/00 ZNA

C07K19/00

C12N15/11 Z

C12N15/63 Z

C12N15/62 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【請求項の数】 21

(21)【出願番号】P 2022513402

(86)(22)【出願日】2019-08-28

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-19

(86)【国際出願番号】 US2019048508

(87)【国際公開番号】W WO2021040703

(87)【国際公開日】2021-03-04

【審査請求日】2022-08-25

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 １．掲載アドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｓ．ａｃｓ．ｏｒｇ／ｔｏｃ／ｊａｃｓａｔ／１４０／３７ ２．掲載日 ２０１８年８月２９日 ３．公開者 アダム ジェイ．スティーブンズ、ジリッダー セカール、ヨーゼフ エイ．グラムスパッハー、デイビッド カウバーン、トム ダブリュー．ミューア

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 〔刊行物等〕 １．刊行物名 Ａｄａｍ Ｊ．Ｓｔｅｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎ Ａｔｙｐｉｃａｌ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｓｐｌｉｔ Ｉｎｔｅｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｌｄｉｎｇ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，（米），２０１８年９月１９日，Ｖｏｌ．１４０，Ｎｏ．３７，ｐ．１１７９１－１１７９９ ２．発行日 ２０１８年９月１９日 ３．公開者 アダム ジェイ．スティーブンズ、ジリッダー セカール、ヨーゼフ エイ．グラムスパッハー、デイビッド カウバーン、トム ダブリュー．ミューア

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】500184305

【氏名又は名称】ザ・トラスティーズ・オブ・プリンストン・ユニバーシティ

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＴＲＵＳＴＥＥＳ ＯＦ ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

【住所又は居所原語表記】６１９ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｒｏａｄ， Ｓｕｉｔｅ １０２， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ ０８５４０－６０００ Ｕ．Ｓ．Ａ．

(73)【特許権者】

【識別番号】515314797

【氏名又は名称】アルバート アインシュタイン カレッジ オブ メディシン

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】トム、ダブリュー．ミューア

(72)【発明者】

【氏名】アダム、スティーブンズ

(72)【発明者】

【氏名】ヨーゼフ、グラムスパッハー

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド、カウバーン

(72)【発明者】

【氏名】ジリッダー、セカール

【審査官】福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／０８６８２５（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、配列番号１のＮ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体を含んでなる、スプリットインテインＮ末端断片。

【請求項2】

前記変異体が配列番号２～６、１２５～１２７および１６８～１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のスプリットインテインＮ末端断片。

【請求項3】

前記機能的に同等の変異体が配列番号４または配列番号１２５のアミノ酸配列を含んでなる、請求項２に記載のスプリットインテインＮ末端断片。

【請求項4】

（ｉ）目的化合物、および
（ｉｉ）請求項１に記載のスプリットインテインＮ末端断片、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる複合体であって、
前記複合体は、場合により（ｉ）と（ｉｉ）の間にリンカーを含んでなり、
前記目的化合物は、アミド結合によって前記スプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に連結されているか、あるいは
前記複合体がリンカーを含んでなる場合には、前記目的化合物はアミド結合によって前記リンカーに結合され、かつ／または前記リンカーは、アミド結合によって前記スプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に結合されている、
複合体。

【請求項5】

前記スプリットインテインＮ末端断片が、配列番号４９～６８からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号４９～６８と少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、それらのＮ末端切断を触媒する能力および／またはそれらのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体を含んでなる、請求項４に記載の複合体。

【請求項6】

前記目的化合物がポリペプチドもしくはタンパク質、抗体、またはタンパク質の断片であり、前記複合体がリンカーを含んでなる場合には、前記リンカーはペプチドリンカーである、請求項４または５に記載の複合体。

【請求項7】

配列番号７に記載のアミノ酸配列または配列の全長にわたって配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、配列番号７のＣ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片。

【請求項8】

前記変異体が配列番号８～４８および１２８～１６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項７に記載のスプリットインテインＣ末端断片。

【請求項9】

前記機能的に同等の変異体が配列番号１０～２２および１２８～１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項８に記載のスプリットインテインＣ末端断片。

【請求項10】

（ｉ）請求項７～９のいずれか一項に記載のスプリットインテインＣ末端断片または配列番号１１４～１２０からなる群から選択される配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
（ｉｉ）目的化合物
を含んでなる複合体であって、
前記複合体は、場合により（ｉ）と（ｉｉ）の間にリンカーを含んでなり、
前記目的化合物は、アミド結合によって前記スプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合されているか、あるいは
前記複合体がリンカーを含んでなる場合には、前記目的化合物はアミド結合によって前記リンカーに結合され、かつ／または前記リンカーは、アミド結合によって前記スプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合されている、
複合体。

【請求項11】

前記スプリットインテインＣ末端断片が配列番号６９～８７から選択される配列または配列番号６９～８７と少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、それらのＣ末端切断を触媒する能力および／またはそれらのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体を含んでなる、請求項１０に記載の複合体。

【請求項12】

前記目的化合物がポリペプチドもしくはタンパク質、抗体、またはタンパク質の断片であり、前記複合体がリンカーを含んでなる場合には、前記リンカーはペプチドリンカーである、請求項１１に記載の複合体。

【請求項13】

（ｉ）請求項７～９のいずれか一項に記載のスプリットインテインＣ末端断片または配列番号１１４～１２０からなる群から選択される配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、
（ｉｉ）目的化合物、および
（ｉｉｉ）請求項１～３のいずれか一項に記載のスプリットインテインＮ末端断片または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる複合体であって、
前記複合体は、場合により、（ｉ）と（ｉｉ）の間および／または（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の間にリンカーを含んでなり、
前記目的化合物は、アミド結合によって前記スプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に連結されているか、あるいは
前記複合体がリンカーを含んでなる場合には、前記目的化合物はアミド結合によって前記リンカーに結合され、かつ／または前記リンカーは、アミド結合によって前記スプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合され、
前記目的化合物は、アミド結合によって前記スプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に連結されているか、または
前記複合体がリンカーを含んでなる場合には、前記目的化合物はアミド結合によって前記リンカーに結合され、かつ／または前記リンカーは、アミド結合によって前記スプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に結合されている、
複合体。

【請求項14】

請求項４に記載の複合体および請求項１０に記載の複合体を含んでなる組成物。

【請求項15】

前記スプリットインテインＮ末端断片のＣ末端が、ペプチド結合によって前記スプリットインテインＣ末端断片のＮ末端に連結されている、請求項４に記載の複合体および請求項１０に記載の複合体を含んでなるコンジュゲート。

【請求項16】

（ａ）請求項６に記載の複合体、および
（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列、配列の全長にわたって配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、そのＣ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片
を含んでなるコンジュゲートであって、
前記スプリットインテインＮ末端断片のＣ末端がペプチド結合によって前記スプリットインテインＣ末端断片のＮ末端に連結されている、
コンジュゲート。

【請求項17】

以下から選択される物：
（ｉ）請求項１に記載のスプリットインテインＮ末端断片、もしくは
請求項６に記載の複合体、もしくは
請求項７に記載のスプリットインテインＣ末端断片、もしくは
請求項１２に記載の複合体、もしくは
請求項１３に記載の複合体であって、前記目的化合物がタンパク質であり、前記複合体がリンカーを含む場合、前記リンカーはペプチドリンカーである、複合体、もしくは
請求項１６に記載のコンジュゲート
をコードするポリヌクレオチド；または
（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドを含んでなるベクター；または
（ｉｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドもしくは（ｉｉ）のベクターを含んでなる宿主細胞。

【請求項18】

第１の目的化合物と第２の目的化合物の間のコンジュゲートを得るための方法であって、以下の方法から選択される方法：
（Ａ）以下を含んでなる方法
（ｉ）
（ａ）第１の目的化合物、および配列番号１のアミノ酸配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、そのＮ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片を含んでなる請求項４に記載の複合体
と、
（ｂ）第２の目的化合物、および配列番号７のアミノ酸配列もしくは配列の全長にわたって配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、そのＣ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片を含んでなる請求項１０に記載の複合体、あるいは
ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片またはその機能的に同等の変異体であって、ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片と少なくとも９０％の配列同一性を有し、そのＣ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、および第２の目的化合物を含んでなる複合体であって、
場合により、前記スプリットインテインＣ末端断片と前記第２の目的化合物の間にリンカーを含んでなり、
・第２の目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合されているか、または
・前記複合体がリンカーを含んでなる場合には、前記第２の目的化合物はアミド結合によって前記リンカーに結合され、かつ／または前記リンカーは、アミド結合によって前記スプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合されている、
複合体
とを、
前記スプリットインテインＮ末端断片と前記スプリットインテインＣ末端断片を結合させてインテイン中間体を形成させるために適当な条件下で接触させること、ならびに
（ｉｉ）前記インテイン中間体を反応させて、第１の目的化合物と第２の目的化合物の間のコンジュゲートを形成させること；並びに
（Ｂ）以下を含んでなる方法
（ｉ）
（ａ）第１の目的化合物、および配列番号１のアミノ配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、そのＮ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片を含んでなる請求項４に記載の複合体、あるいは
第２の目的化合物、およびＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片またはその機能的に同等の変異体であって、前記ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片と少なくとも９０％の配列同一性を有し、そのＮ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体を含んでなる複合体であって、
場合により、前記目的化合物と前記スプリットインテインＮ末端断片の間にリンカーを含んでなり、
・前記目的化合物は、アミド結合によって前記スプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に連結されているか、または
・前記複合体がリンカーを含んでなる場合には、前記目的化合物は、アミド結合によって前記リンカーに結合され、かつ／または前記リンカーは、アミド結合によって前記スプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に結合されている、複合体
と、
（ｂ）第２の目的化合物、および配列番号７のアミノ酸配列もしくは配列の全長にわたって配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、そのＣ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片を含んでなる請求項１０に記載の複合体
とを、
前記スプリットインテインＮ末端断片と前記スプリットインテインＣ末端断片を結合させてインテイン中間体を形成させるために適当な条件下で接触させること、ならびに
（ｉｉ）前記インテイン中間体を反応させて、第１の目的化合物と第２の目的化合物の間のコンジュゲートを形成させること。

【請求項19】

目的化合物と求核試薬のコンジュゲートを得るための方法であって、
（ｉ）
（ａ）スプリットインテインＮ末端断片が配列番号１のアミノ酸配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、そのＮ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる請求項４に記載の複合体、あるいは
目的化合物およびＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片またはその機能的に同等の変異体であって、前記ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片と少なくとも９０％の配列同一性を有し、そのＮ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体を含んでなる複合体であって、
場合により、前記目的化合物と前記スプリットインテインＮ末端断片の間にリンカーを含んでなり、
・前記目的化合物は、アミド結合によって前記スプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に連結されているか、または
・前記複合体がリンカーを含んでなる場合には、前記目的化合物は、アミド結合によって前記リンカーに結合され、かつ／または前記リンカーは、アミド結合によって前記スプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に結合されている、
複合体
と、
（ｂ）配列番号８、９、２３～４８および１４１～１６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片
とを、
前記スプリットインテインＮ末端断片と前記スプリットインテインＣ末端断片の間で結合させてインテイン中間体を形成させるために適当な条件下で接触させること、ならびに
（ｉｉ）前記インテイン中間体と外因性求核試薬を接触させること
を含んでなる、方法。

【請求項20】

（ａ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・第１の目的ポリペプチド、および
・配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、そのＮ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片もしくはその機能的に同等の変異体であって、前記ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片と少なくとも９０％の配列同一性を有し、そのＣ末端切断を触媒する能力および／またはトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号７の配列もしくは配列の全長にわたって配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、そのＣ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
・第２の目的ポリペプチド
を含んでなる第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド、
あるいは、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・第１の目的ポリペプチド、および
・ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片もしくはその機能的に同等の変異体であって、前記ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片と少なくとも９０％の配列同一性を有し、そのＮ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、そのＮ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに
（ｄ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・配列番号７の配列もしくは配列の全長にわたって配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、そのＣ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
・第２の目的ポリペプチド
を含んでなる第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド
を含んでなる組成物。

【請求項21】

細胞において目的遺伝子を発現させるための方法であって、以下の方法から選択される方法：
（Ａ）以下を含んでなる方法
（ｉ）前記細胞を
（ａ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・第１の目的ポリペプチド、および
・配列番号１の配列または配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、そのＮ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片もしくはその機能的に同等の変異体であって、前記ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片と少なくとも９０％の配列同一性を有し、そのＣ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号７の配列もしくは配列の全長にわたって配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、そのＣ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
・第２の目的ポリペプチド
を含んでなる第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド、
あるいは、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・第１の目的ポリペプチド、および
・ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片もしくはその機能的に同等の変異体であって、前記ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片と少なくとも９０％の配列同一性を有し、そのＮ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、そのＮ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド、および
（ｄ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・配列番号７の配列もしくは配列の全長にわたって配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、そのＣ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
・第２の目的ポリペプチド
を含んでなる第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド
と接触させること、
（ｉｉ）前記第１の融合タンパク質および前記第２の融合タンパク質が生産されるように前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドを発現させること、ならびに
（ｉｉｉ）前記スプリットインテインＮ末端断片が前記スプリットインテインＣ末端断片と結合してインテイン中間体を形成し、前記インテイン中間体が反応して前記第１の目的ポリペプチドのＣ末端と前記第２の目的ポリペプチドのＮ末端を共有結合的に連結するように、前記第１の融合タンパク質と前記第２の融合タンパク質を接触させること；
（Ｂ）以下を含んでなる方法
（ｉ）第１の細胞を、
Ｎ末端からＣ末端へ向かって
・第１の目的ポリペプチド、および
・配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、そのＮ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記第１の融合タンパク質はシグナルペプチドを含んでなる第１のポリヌクレオチド
と接触させること、ならびに
（ｉｉ）第２の細胞を、Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片もしくはその機能的に同等の変異体であって、前記ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片と少なくとも９０％の配列同一性を有し、そのＣ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号７の配列もしくは配列の全長にわたって配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、そのＣ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
・第２の目的ポリペプチド
を含んでなる第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、前記第２の融合タンパク質はシグナルペプチドを含んでなる第２のポリヌクレオチド
と接触させること、
あるいは、
（ｉｉｉ）第１の細胞を、Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・第１の目的ポリペプチド、および
・ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片もしくはその機能的に同等の変異体であって、前記ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬと少なくとも９０％の配列同一性を有し、そのＮ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、そのＮ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記第１の融合タンパク質はシグナルペプチドを含んでなる第１のポリヌクレオチド
と接触させること、ならびに
（ｉｖ）第２の細胞を、
Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・配列番号７の配列もしくは配列の全長にわたって配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体であって、そのＣ末端切断を触媒する能力および／またはそのトランススプライシング活性を維持または改善する変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
・第２の目的ポリペプチド
を含んでなる第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、前記第２の融合タンパク質はシグナルペプチドを含んでなる第２のポリヌクレオチド
と接触させること、
（ｖ）前記第１の融合タンパク質および前記第２の融合タンパク質が生産および分泌されるように前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドを発現させること、ならびに
（ｖｉ）前記スプリットインテインＮ末端断片が前記スプリットインテインＣ末端断片と結合してインテイン中間体を形成し、前記インテイン中間体が反応して前記第１の目的ポリペプチドのＣ末端と前記第２の目的ポリペプチドのＮ末端を共有結合的に連結するように、前記第１の融合タンパク質と前記第２の融合タンパク質を接触させること。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明における政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた助成番号ＧＭ０８６８６８、ＯＤ０１６３０５、ＲＲ０１５４９５およびＯＤ０１６４３２の下、政府の支援で行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

【0002】

発明の分野
本開示は、バイオテクノロジーの分野に含まれ、具体的には、スプリットインテインおよびそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
インテインは、宿主タンパク質からそれ自体を切り出すと同時に、痕跡無くその隣接ポリペプチド配列（エクステイン）を連結して天然型のペプチド結合を形成するタンパク質スプライシングと呼ばれる翻訳後オートプロセシングイベントを受ける介在タンパク質ドメインである。ほとんどのインテインは、単一の遺伝子内に埋め込まれた連続的ドメインとして見られ、シスでスプライスする。しかしながら、一部はスプリット形態で天然に存在し、それにより、各インテイン断片は別々に発現される遺伝子にコードされ、トランスでのスプライシングの前にまず会合しなければならない。これらのスプリットインテインはタンパク質工学のツールとして一般に適用され、それらの特異性の高い認識および独特な活性のために、細胞環境において特に使用しやすい。

【0004】

化学生物学においてインテインがますます使用されているにもかかわらず、それらの実用的有用性は、いくつかの一般的特徴、すなわち（ｉ）速度が遅い、（ｉｉ）直接隣接するエクステイン配列に関してコンテキスト依存性の効率、（ｉｉｉ）他のタンパク質との組換え融合の発現レベルが低い、および（ｉｖ）安定性が最適に至っていないことによって制約を受けてきた。

【0005】

よって、様々なタンパク質精製およびタンパク質修飾用途における使用のための、よりロバストでより効率的なスプリットインテインの必要性が存在する。

【発明の概要】

【0006】

発明の概要
本開示の著者らは、これにより、本願の実施例１（図５、表５および６）に示されるように、悪条件下でも加速化されたスプライシング速度および活性を示す、非定型スプリット部位を有するスプリットインテインを提供する。開示されるインテインは、発現されるタンパク質のＮ末端修飾に有用であり、発現したタンパク質の連結、トランスペプチダーゼに基づく連結戦略、および様々なタンパク質化学法など、タンパク質のＮ末端修飾に関して報告されている他の方法を補う。これに関して、これらのインテインのＮ末端インテイン断片は著しく短いことから、目的のスプリットインテインＮ末端断片の複合タンパク質が固相ペプチド合成を用いて容易に得ることができるので、単離されるポリペプチドは、ある範囲のタンパク質修飾において使用するのに理想的に適している。

【0007】

よって、本開示の１つの側面において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片に関する。

【0008】

本開示の別の側面は、
（ｉ）目的化合物、
（ｉｉ）本開示のスプリットインテインＮ末端断片、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる複合体であって、
上記複合体は、場合により（ｉ）と（ｉｉ）の間にリンカーを含んでなり、
上記目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に連結されているか、または
上記複合体がリンカーを含んでなる場合には、上記目的化合物はアミド結合によってリンカーに結合され、かつ／または上記リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に結合されている複合体に関する。

【0009】

本開示の別の側面は、配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその変異体を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片に関する。

【0010】

本開示の別の側面は、
（ｉ）本開示のスプリットインテインＣ末端断片または配列番号１１４～１２０からなる群から選択される配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
（ｉｉ）目的化合物
を含んでなる複合体であって、
上記複合体は、場合により（ｉ）と（ｉｉ）の間にリンカーを含んでなり、
上記目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合されているか、または
上記複合体がリンカーを含んでなる場合には、上記目的化合物はアミド結合によってリンカーに結合され、かつ／または上記リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合されている複合体に関する。

【0011】

別の側面において、本開示は、本開示の第１の複合体および第２の複合体を含んでなる組成物に関する。

【0012】

本開示の別の側面は、
（ｉ）本開示のスプリットインテインＣ末端断片または配列番号１１４～１２０からなる群から選択される配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、
（ｉｉ）目的化合物、および
（ｉｉｉ）本開示のスプリットインテインＮ末端断片または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる複合体であって、
上記複合体は、場合により、（ｉ）と（ｉｉ）の間および／または（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の間にリンカーを含んでなり、
上記目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に連結されているか、または
上記複合体がリンカーを含んでなる場合には、上記目的化合物はアミド結合によってリンカーに結合され、かつ／または上記リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合され、
上記目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に連結されているか、または
上記複合体がリンカーを含んでなる場合には、上記目的化合物はアミド結合によってリンカーに結合され、かつ／または上記リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に結合されている、
複合体に関する。

【0013】

本開示の別の側面は、（ａ）本開示の第１の複合体、および（ｂ）アミノ酸配列番号７の配列もしくは配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片を含んでなり、スプリットインテインＮ末端断片のＣ末端がペプチド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＮ末端に連結されているコンジュゲートに関する。

【0014】

別の側面において、本開示は、本開示のスプリットインテインＮ末端断片、または本開示のスプリットインテインＣ末端断片、または目的化合物がポリペプチドもしくはタンパク質であり、リンカーが、存在する場合、ペプチドリンカーである本開示の複合体のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドに関する。

【0015】

別の側面において、本開示は、本開示のポリヌクレオチドを含んでなるベクターに関する。

【0016】

別の側面において、本開示は、本開示のポリヌクレオチドまたはベクターを含んでなる宿主細胞に関する。

【0017】

別の側面において、本開示は、本開示の第１の複合体および本開示の第２の複合体を含んでなる組成物に関する。

【0018】

別の側面において、本開示は、第１の目的化合物と第２の目的化合物の間のコンジュゲートを得るための方法であって、
（ｉ）
（ａ）第１の目的化合物、および配列番号１のアミノ配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片を含んでなる本開示の第１の複合体と、
（ｂ）第２の目的化合物、および配列番号７のアミノ酸配列もしくは配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片を含んでなる本開示の第２の複合体、あるいは
ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片またはその機能的に同等の変異体および第２の目的化合物を含んでなる複合体であって、場合により、上記スプリットインテインＣ末端断片と上記第２の目的化合物の間にリンカーを含んでなり、
・第２の目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合されているか、または
・上記複合体がリンカーを含んでなる場合には、上記第２の目的化合物はアミド結合によってリンカーに結合され、かつ／または上記リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合されている、複合体
とを、スプリットインテインＮ末端断片とスプリットインテインＣ末端断片を結合させてインテイン中間体を形成させるために適当な条件下で接触させること、ならびに
（ｉｉ）上記インテイン中間体を反応させて、第１の目的化合物と第２の目的化合物の間のコンジュゲートを形成させること
を含んでなる方法に関する。

【0019】

別の側面において、本開示は、第１の目的化合物と第２の目的化合物の間のコンジュゲートを得るための方法であって、
（ｉ）
（ａ）第１の目的化合物、および配列番号１のアミノ配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片を含んでなる本開示の第１の複合体、あるいは
第２の目的化合物およびＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片またはその機能的に同等の変異体を含んでなる複合体であって、場合により、上記目的化合物とスプリットインテインＮ末端断片の間にリンカーを含んでなり、
・上記目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に連結されているか、または
・上記複合体がリンカーを含んでなる場合には、上記目的化合物は、アミド結合によってリンカーに結合され、かつ／または上記リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に結合されている、複合体と、
（ｂ）第２の目的化合物、および配列番号７のアミノ酸配列もしくは配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片を含んでなる本開示の第２の複合体
とを、スプリットインテインＮ末端断片とスプリットインテインＣ末端断片を結合させてインテイン中間体を形成させるために適当な条件下で接触させること、ならびに
（ｉｉ）上記インテイン中間体を反応させて、第１の目的化合物と第２の目的化合物の間のコンジュゲートを形成させること
を含んでなる方法に関する。

【0020】

別の態様において、本開示は、目的化合物と求核試薬のコンジュゲートを得るための方法であって、
（ｉ）
（ａ）スプリットインテインＮ末端断片が配列番号１のアミノ酸配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる本開示の第１の複合体、あるいは
目的化合物およびＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片またはその機能的に同等の変異体を含んでなる複合体であって、場合により、上記目的化合物とスプリットインテインＮ末端断片の間にリンカーを含んでなり、
・上記目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に連結されているか、または
・上記複合体がリンカーを含んでなる場合には、上記目的化合物は、アミド結合によってリンカーに結合され、かつ／または上記リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に結合されている、複合体と、
（ｂ）配列番号８、９、２３～４８および１４１～１６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片
とを、スプリットインテインＮ末端断片とスプリットインテインＣ末端断片の間で結合させてインテイン中間体を形成させるために適当な条件下で接触させること、ならびに
（ｉｉ）上記インテイン中間体と外因性求核試薬を接触させること
を含んでなる方法に関する。

【0021】

別の側面において、本開示は、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・第１の目的ポリペプチド、および
・配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体、または配列番号７の配列もしくは配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
・第２の目的ポリペプチド
を含んでなる第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド、
あるいは、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・第１の目的ポリペプチド、および
・ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片もしくはその変異体、または配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・配列番号７の配列もしくは配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
・第２の目的ポリペプチド
を含んでなる第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド
を含んでなる組成物に関する。

【0022】

別の側面において、本開示は、細胞において目的遺伝子を発現させるための方法であって、
（ｉ）上記細胞を
（ａ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・第１の目的ポリペプチド、および
・配列番号１の配列または少なくとも９０％を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片もしくはその機能的に同等の変異体、または配列番号７の配列もしくは配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
・第２の目的ポリペプチド
を含んでなる第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド、
あるいは、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・第１の目的ポリペプチド、および
・ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片もしくはその機能的に同等の変異体、または配列番号１の配列もしくは少なくとも９０％を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド、および
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・配列番号７の配列もしくは配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
・第２の目的ポリペプチド
を含んでなる第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド
と接触させること、
（ｉｉ）上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質が生産されるように上記第１のポリヌクレオチドおよび上記第２のポリヌクレオチドを発現させること、ならびに
（ｉｉｉ）上記スプリットインテインＮ末端断片が上記スプリットインテインＣ末端断片と結合してインテイン中間体を形成し、上記インテイン中間体が反応して上記第１の目的ポリペプチドのＣ末端と上記第２の目的ポリペプチドのＮ末端を共有結合的に連結するように、上記第１の融合タンパク質と上記第２の融合タンパク質を接触させること、
を含んでなる方法に関する。

【0023】

別の側面において、本開示は、目的遺伝子を発現させるための方法であって、
（ｉ）第１の細胞を、Ｎ末端からＣ末端へ向かって
・第１の目的ポリペプチド、および
・配列番号１の配列もしくは少なくとも９０％を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと接触させること、ここで、上記第１の融合タンパク質はシグナルペプチドを含んでなる、ならびに
（ｉｉ）第２の細胞を、Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片もしくはその機能的に同等の変異体、または配列番号７の配列もしくは配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
・第２の目的ポリペプチド
を含んでなる第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドと接触させること、上記第２の融合タンパク質はシグナルペプチドを含んでなる、
あるいは、
（ｉ）第１の細胞を、Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・第１の目的ポリペプチド、および
・ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片もしくはその機能的に同等の変異体、または配列番号１の配列もしくは少なくとも９０％を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと接触させること、ここで、上記第１の融合タンパク質はシグナルペプチドを含んでなる、ならびに
（ｉｉ）第２の細胞を、Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・配列番号７の配列もしくは配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
・第２の目的ポリペプチド
を含んでなる第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドと接触させること、ここで、上記第２の融合タンパク質はシグナルペプチドを含んでなる、
１．上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質が生産および分泌されるように上記第１のポリヌクレオチドおよび上記第２のポリヌクレオチドを発現させること、ならびに
２．上記スプリットインテインＮ末端断片が上記スプリットインテインＣ末端断片と結合してインテイン中間体を形成し、上記インテイン中間体が反応して上記第１の目的ポリペプチドのＣ末端と上記第２の目的ポリペプチドのＮ末端を共有結合的に連結するように、上記第１の融合タンパク質と上記第２の融合タンパク質を接触させること
を含んでなる方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】（Ａ）～（Ｅ）本研究において使用されるインテインのＲＰ－ＨＰＬＣ分析。各ＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムに相当する質量を表３に示す。

【図2】（Ａ）～（Ｄ）タンパク質トランススプライシング反応の代表的スプライシングゲル。（Ａ）示された温度におけるＣａｔおよびＡｃｅＬ^＊に関するタンパク質トランススプライシング反応の代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル。ＭＢＰ－Ｉｎｔ^Ｎ（Ｎ）、Ｉｎｔ^Ｃ－ＧＦＰ（Ｃ）およびスプライス産物（ＳＰ）に相当するバンドを示す。（Ｂ）示された尿素濃度におけるＣａｔおよびＡｃｅＬ^＊に関するタンパク質トランススプライシング反応の代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル。ＭＢＰ－Ｉｎｔ^Ｎ（Ｎ）、Ｉｎｔ^Ｃ－ＧＦＰ（Ｃ）およびスプライス産物（ＳＰ）に相当するバンドを示す。（Ｃ）示された－１および－２ Ｎ－エクステイン突然変異（ＷＴ「ＦＥ」配列からの）を有するＣａｔに関するタンパク質トランススプライシング反応の代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル。ＭＢＰ－Ｃａｔ^Ｎ（Ｎ）、Ｃａｔ^Ｃ－ＧＦＰ（Ｃ）およびスプライス産物（ＳＰ）に相当するバンドを示す。－１Ａおよび－１Ｐ突然変異ではＣ末端切断が見られ、ゲルに示される（ＧＦＰ）。（Ｄ）示された＋２および＋３ Ｃ－エクステイン突然変異（ＷＴ「ＥＦ」からの）を有するＣａｔに関するタンパク質トランススプライシング反応の代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル。ＭＢＰ－Ｃａｔ^Ｎ（Ｎ）、Ｃａｔ^Ｃ－ＧＦＰ（Ｃ）およびスプライス産物（ＳＰ）に相当するバンドを示す。

【図3】（Ａ）～（Ｂ）反応進行曲線。（Ａ）および（Ｂ）本研究において実施したスプライシング反応に関して反応進行曲線を示す。各反応のベストフィットラインを示す。

【図4】（Ａ）～（Ｄ）非定型スプリットインテインの発現。レーンは（Ｗ）全細胞溶解液、（Ｐ）封入体ペレット、（Ｓ）溶解液の可溶性画分、（ＦＴ）Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティービーズに結合した可溶性溶解液バッチのフロースルー、（Ｅ）２５０ｍＭイミダゾールの３ＣＶ溶出に相当する。（Ａ）大腸菌発現（１８℃、１６時間）からのＳＵＭＯ－ＧＯＳ^Ｃ、ＳＵＭＯ－ＡｃｅＬ^＊Ｃ、およびＳＵＭＯ－Ｃａｔ^Ｃの精製。（Ｂ）大腸菌発現（３７℃、３時間）からのＳＵＭＯ－ＧＯＳ^Ｃ、ＳＵＭＯ－ＡｃｅＬ^＊Ｃ－Ｓｕｍｏ、およびＳＵＭＯ－Ｃａｔ^Ｃの精製。（Ｃ）大腸菌発現（３７℃、３時間）からのＳＵＭＯ－ＧＯＳ^Ｎ、ＳＵＭＯ－ＡｃｅＬ^＊Ｎ、およびＳＵＭＯ－Ｃａｔ^Ｎの精製。（Ｄ）大腸菌発現（１８℃、１６時間）からのＧＯＳ^Ｃ－ＧＦＰ、ＡｃｅＬ^＊Ｃ－ＧＦＰ、およびＣａｔ^Ｃ－ＧＦＰの精製。

【図5】（Ａ）～（Ｄ）コンセンサス非定型（Ｃａｔ）スプリットインテインの特性決定。（Ａ）同一残基（黒）および類似残基（グレー）を強調したＣａｔおよびＡｃｅＬ^＊のペアワイズ配列アラインメント。（Ｂ）３０℃でのＣａｔスプライシングに関する反応進行曲線。（Ｃ）温度の関数としてのＣａｔおよびＡｃｅＬ^＊に関するスプライシング速度（ｎ＝３、誤差＝ＳＥＭ）。ＡｃｅＬ^＊は５０℃では不活性である。（Ｄ）添加した尿素の関数としてのＣａｔおよびＡｃｅＬ^＊に関するスプライシング速度（ｎ＝３、誤差＝ＳＥＭ）。ＡｃｅＬ^＊は、２Ｍおよび４Ｍ尿素（ＮＡ）の存在下では活性がない。

【図6】（Ａ）～（Ｄ）Ｃａｔ断片会合の構造的効果。（Ａ）非標識Ｃａｔ^Ｃを含まない１５Ｎ標識Ｃａｔ^Ｎ（黒）および非標識Ｃａｔ^Ｃとの複合体としての１５Ｎ標識Ｃａｔ^Ｎ（グレー）の^１Ｈ－^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル。（Ｂ）非標識Ｃａｔ^Ｎを含まない１５Ｎ標識Ｃａｔ^Ｃ（黒）および非標識Ｃａｔ^Ｎとの複合体としての１５Ｎ標識Ｃａｔ^Ｃ（グレー）の１Ｈ－１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル。（Ｃ）Ｃａｔ^Ｎ（黒）、Ｃａｔ^Ｃ（濃いグレー）およびＣａｔ^Ｎ＋Ｃａｔ^Ｃ複合体（薄いグレー）の遠ＵＶ円偏光二色性スペクトル。（Ｄ）Ｃａｔ^Ｎ（黒）、Ｃａｔ^Ｃ（濃いグレー）、およびＣａｔ^Ｎ＋Ｃａｔ^Ｃ複合体（薄いグレー）のサイズ排除クロマトグラム。

【図7】（Ａ）～（Ｄ）Ｃａｔ^Ｎの無秩序型から秩序型への遷移。（Ａ）Ｃａｔ^Ｃ（左）の存在下および不在下（右）のＣａｔ^Ｎの（^１５Ｎ－^１Ｈ）ヘテロ核ＮＯＥ。（Ｂ）Ｃａｔ^Ｃの存在下（左）および不在下（右）でのＣａｔ^Ｎのスピン－スピン弛緩速度。（Ｃ）Ｃａｔ^Ｃの存在下（左）および不在下（右）でのＣａｔ^ＮのＣαおよびＣβ化学シフトの摂動。Δδ（Ｃα，Ｃβ）＝（δＣβ－δＣα）Ｏｂｓｅｒｖｅｄ－（δＣβ－δＣα）Ｒａｎｄｏｍ Ｃｏｉｌ。

【図8】（Ａ）～（Ｃ）Ｃａｔの溶液ＮＭＲ構造。（Ａ）Ｃａｔ^Ｎ（暗い）－Ｃａｔ^Ｃ（明るい）スプリットインテイン複合体の構造計算で得られた２０の最低エネルギー立体配座異性体の骨格コンフォメーション。Ｃａｔ^Ｃ溶解度タグは、透明グレーで表す。構造を１８０°回転して示す（上面と底面を示す）。（Ｂ）最低エネルギー立体配座異性体のアニメーション表示である。構造を１８０°回転して示す（上面と底面を示す）。（Ｃ）Ａｌａ_１、Ｓｅｒ_７５、Ｈｉｓ_７８、およびＨｉｓ_１３３を棒として示すＣａｔ活性部位の拡大図である。Ａｌａ_１のカルボニル酸素とＳｅｒ_７５のアミドおよびヒドロキシルプロトンの間の距離を示す。

【図9】（Ａ）～（Ｃ）Ｃａｔ複合体の構造。（Ａ）ＮＭＲ構造計算で得られたＣａｔ^Ｎ－Ｃａｔ^Ｃ複合体の２０の最小エネルギー立体配座異性体の平均構造からの残差平均平方根偏差(Root Mean Square Deviation)（ＲＭＳＤ）当たりの平均。（Ｂ）Ｃａｔ^Ｎ（グレー）－Ｃａｔ^Ｃ（黒）複合体の残基数に対してプロットした残差ＲＭＳＤ当たりの平均。エクステイン領域をグレーで表示し、Ｃａｔ^Ｃとともに使用した溶解度タグを破線として示す。（Ｃ）ＴｅｒＬインテインホモログのアラインメント（表１）から作成したブロックＢループ（左）、ブロックＦループ（中央）およびＣ末端ブロックＧ（右）の配列ロゴ。

【図10】（Ａ）～（Ｃ）Ｃａｔ断片における無秩序の局在。（Ａ）示された時間の後に急冷したサンプルを用いたＣａｔ^Ｎ（左）、Ｃａｔ^Ｃ（中央）および１：１ Ｃａｔ^Ｎ＋Ｃａｔ^Ｃ複合体（右）の制限タンパク質分解から得られたＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラム。（Ｂ）Ｃａｔ^Ｃの無秩序領域が濃いグレーで強調され、保護中心が薄いグレーで強調されたＣａｔの配列。（Ｃ）Ｎ－インテインが薄いグレーで強調され、Ｃａｔ^Ｃの無秩序領域が濃いグレーで強調され、保護中心が中間的なグレーで強調された、ＮＭＲ構造上にマッピングしたＣａｔ無秩序のモデル。スプライシング残基を棒として示す活性部位の拡大図を示す。

【図11】（Ａ）～（Ｂ）Ｃａｔ断片の制限タンパク質分解のＲＰ－ＨＰＬＣ分析。（Ａ）表８のＥＳＩ－ＭＳデータに相当する番号の付いたサンプルを用いたＣａｔ^Ｎ（左）およびＣａｔ^Ｃ（右）タンパク質分解実験（ｔ＝３０分）から得られたＲＰ－ＨＰＬＣ。（Ｂ）制限タンパク質分解実験で使用したＣａｔ^ＮおよびＣａｔ^Ｃインテインの一次配列（検出されたタンパク質分解断片を下に角型括弧で示す）。各括弧の数字は、パネルＡのＲＰ－ＨＰＬＣピークに相当する。

【図12】（Ａ）～（Ｄ）疎水性残基はＣａｔ会合を駆動する。（Ａ）標準化コンセンサス疎水性スケールに基づいて疎水性残基をグレースケールで着色したＣａｔ^Ｎの表面レンダリング。Ｃａｔ^Ｃをアニメーションで表す。（Ｂ）疎水性残基をグレースケールで示すＣａｔ^Ｃの表面レンダリング。Ｃａｔ^Ｎをアニメーションで表す。（Ｃ）低塩バッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ黒）および高塩バッファー（５００ｍＭ ＮａＣｌグレーの破線）中、ＳＵＭＯ－Ｃａｔ^Ｃ（示された濃度）の存在下でのＦｌ－Ｃａｔ^Ｎ（５００ｐＭ）の平衡蛍光異方性測定。（Ｄ）低塩バッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ黒）および高塩バッファー（５００ｍＭ ＮａＣｌグレーの破線）中、得られたＦｌ－Ｃａｔ^Ｎ＋ＳＵＭＯ－Ｃａｔ^Ｃ会合速度の濃度依存性。

【図13】（Ａ）～（Ｃ）Ｃａｔ静電表面。（Ａ）Ｃａｔ^Ｎの静電表面電位（電気陰性領域が滑らかなグレースケールで着色され、電気陽性領域が模様のあるグレースケールで着色され、中性領域が白で着色される）Ｃａｔ^Ｃをアニメーションで表す。（Ｂ）Ｃａｔ^Ｃの静電表面電位（電気陰性領域が滑らかなグレースケールで着色され、電気陽性領域が模様のあるグレースケールで着色され、中性領域が白で着色される）。Ｃａｔ^Ｎをアニメーションで表す。（Ｃ）動態結合実験の代表的データおよびフィット。上：ＳＵＭＯ－Ｃａｔ^Ｃと混合した場合のＦｌ－Ｃａｔ^Ｎのストップフロー異方性測定の非線形最小２乗フィッティングの単一指数関数モデル（左）および二重指数関数モデル（右）。下：実験値と予測値の間に得られた残差値を単一指数関数フィット（左）および二重指数関数フィット（右）についてプロットした。

【図14】（Ａ）～（Ｅ）Ｃａｔのエクステイン依存性。（Ａ）Ｃａｔスプライシング時のローカルエクステイン配列の影響を検討するために使用したアッセイの模式図。Ｎ－エクステインマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）はＣａｔ^Ｎに融合し、Ｃ－エクステイン緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）はＣａｔ^Ｃに融合する。これらの融合タンパク質内に天然エクステイン配列（Ｐｈｅ_－２、Ｇｌｕ_－１、Ｃｙｓ_＋１、Ｇｌｕ_＋２、Ｐｈｅ_＋３）を示す。（Ｂ）非天然Ｃ－エクステイン残基（ｎ＝３、誤差＝ＳＥＭ）の存在下でのＣａｔのスプライシング速度。示されている各値は、野生型（ＷＴ）配列からの、Ｃ－エクステイン内の単一の点突然変異に相当する。（Ｃ）非天然Ｎ－エクステイン残基（ｎ＝３、誤差＝ＳＥＭ）の存在下でのＣａｔのスプライシング速度。示されている各値は、野生型（ＷＴ）配列からの、Ｎ－エクステイン内の単一の点突然変異に相当する。（Ｄ）Ｃｙｓ_＋１、Ｇｌｕ_＋２、Ａｓｐ_１１５、Ａｓｎ_１２３、Ｈｉｓ_１３３、およびＡｌａ_１３４を棒として示すＣａｔ活性部位の拡大図。（Ｅ）Ｇｌｕ_－１、Ａｌａ_１、Ｓｅｒ_７５、およびＨｉｓ_７８を棒として示すＣａｔ活性部位の拡大図。

【発明を実施するための形態】

【0025】

発明の詳細な説明
本開示は、新規非定型スプリットインテインおよび生物化学工学におけるその使用の提供に関する。

【0026】

スプリットインテインＮ末端断片
第１の側面において、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片に関する。

【0027】

本明細書において使用する場合、用語「インテイン」は、前駆体タンパク質からインテイン配列を切り出し、隣接配列（Ｎ－エクステインとＣ－エクステイン）をペプチド結合で連結するタンパク質スプライシング反応を触媒することができる、天然に存在するまたは人為的に構築されたポリペプチド配列を意味する。インテインは一般に１５０～５５０アミノ酸の大きさであり、ホーミングエンドヌクレアーゼドメインも含み得る。既知のインテインのリストは、https://inteins.biocenter.helsinki.fi/に公開されている。

【0028】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」または「タンパク質」は本明細書では、いずれの長さのアミノ酸ポリマーも指して、互換的に使用される。

【0029】

用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣剤を指す。さらに、用語「アミノ酸」は、Ｄ－アミノ酸およびＬ－アミノ酸（立体異性体）の両方を含む。

【0030】

用語「天然アミノ酸」または「天然に存在するアミノ酸」は、２０の天然に存在するアミノ酸を含んでなり、これらのアミノ酸は多くの場合、ｉｎ ｖｉｖｏで翻訳後修飾を受け、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニン；ならびに限定されるものではないが、２－アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むその他の異常アミノ酸が含まれる。

【0031】

本明細書において使用する場合、用語「非天然アミノ酸」または「合成アミノ酸」は、カルボン酸、またはアミン基で置換され、天然アミノ酸に構造的に関連するその誘導体を指す。修飾または異常アミノ酸の例示的非限定例としては、２－アミノアジピン酸、３－アミノアジピン酸、β－アラニン、２－アミノ酪酸、４－アミノ酪酸、６－アミノカプロン酸、２－アミノヘプタン酸、２－アミノイソ酪酸、３－アミノイソ酪酸、２－アミノピメリン酸、２，４－ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’－ジアミノピメリン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アリオヒドロキシリシン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－メチルイソロイシン、６－Ｎ－メチル－リシン、Ｎ－メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチンなどが挙げられる。この群にはまた、「天然アミノ酸」のＤ－異性体も含まれる。

【0032】

用語「スプリットインテイン」は、本明細書において使用する場合、Ｎ末端およびＣ末端アミノ酸配列がペプチド結合によって直接連結されず、その結果、Ｎ末端配列とＣ末端配列はトランススプライシング反応にとって機能的なインテインへと非共有結合的に再会合、または再構成し得る別個の断片となる、いずれのインテインも指す。

【0033】

本明細書において使用する場合、用語「スプリットインテインＮ末端断片」または「Ｎ末端スプリットインテイン」または「Ｎ末端インテイン断片」または「Ｎ末端インテイン配列」（「Ｉｎｔ Ｎ」と略される）は、トランススプライシング反応にとって機能的な、すなわち、機能的スプリットインテインＣ末端断片と会合して、宿主タンパク質からそれ自体を切り出してペプチド結合によるエクステインもしくは隣接配列の連結を触媒し得る完全なインテインを形成し得る、またはスプリットインテインＣ末端断片と会合した際に「Ｎ末端切断」、すなわち、エクステインとスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端の間のペプチド結合の求核攻撃を触媒して上記ペプチド結合の破断を生じるＮ末端アミノ酸配列を含んでなる、いずれのインテイン配列も指す。

【0034】

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「１つの(a)」、「１つの(an)」、および「その(the)」は、文脈がそうでないことを明示しない限り、複数の指示対象を含む。よって、例えば、「１つのスプリットインテイン」という場合には、複数のこのようなスプリットインテインを含み、「そのポリペプチド」という場合には、１以上のポリペプチドおよび当業者に公知のその等価物を含むなどであることに留意されたい。

【0035】

特定の実施形態において、スプリットインテインＮ末端断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる。スプリットインテインＮ末端断片は、配列番号１の配列のＮ末端および／またはＣ末端に連結されている付加的アミノ酸残基を含んでなり得る。特定の実施形態において、スプリットインテインＮ末端断片は、配列番号１の配列のＮ末端および／またはＣ末端に連結されている１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満、または１個の付加的アミノ酸残基を含んでなる。別の実施形態において、スプリットインテインＮ末端断片は、配列番号１のアミノ酸配列からなる。

【0036】

特定の実施形態において、スプリットインテインＮ末端断片は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列番号１のアミノ酸配列の変異体を含んでなる、またはからなる。

【0037】

用語「変異体」は、本明細書において使用する場合、特定のポリペプチド配列に実質的に類似するポリペプチド分子を指す。この変異体は、それが由来するポリペプチドに構造および生物活性が類似するものであり得る。よって、変異体は、ポリペプチド配列の突然変異体を指し得る。用語「突然変異体」は、その配列が、それが由来するポリペプチド分子に比べて１以上のアミノ酸付加、欠失、置換またはそれ以外の化学修飾を有するポリペプチド分子を指す。突然変異体は、それが由来するポリペプチド分子と実質的に同じ特性を保持してもよいし、または特許請求される配列の生物活性を欠いていてもよい。

【0038】

配列番号１のスプリットインテインＮ末端断片の変異体は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する。特定の実施形態において、配列番号１のスプリットインテインＮ末端断片の変異体は、配列番号１と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。

【0039】

本開示のこの側面の特定の実施形態において、配列番号１のスプリットインテインＮ断片の変異体は、１４～６０アミノ酸、例えば、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０アミノ酸の長さを有する。

【0040】

２以上のアミノ酸またはヌクレオチド配列に関して用語「同一性」、「同一」、「同一性パーセント」または「配列同一性」とは、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大限一致するように比較およびアラインした場合（必要であれば、ギャップを導入する）に同じである、または同じであるアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する２以上の配列または部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウエアもしくはアルゴリズムを用いて、または目視によって評価することができる。当技術分野では、アミノ酸配列のアラインメントを得るために使用することができる様々なアルゴリズムおよびソフトウエアが知られている。配列アラインメントアルゴリズムの１つのこのような限定されない例としては、Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-8に記載され、Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-7で改変され、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(Altschul et al., 1991 , Nucleic Acids Res., 25:3389-402)に組み込まれているものが挙げられる。特定の実施形態において、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-402に記載されているようにして使用するこができる。ＢＬＡＳＴ－２、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２(Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-80)、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）は、配列をアラインするために使用可能なさらなる公開ソフトウエアプログラムである。特定の別の実施形態において、Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-53 (1970))のアルゴリズムを組み込んでいるＧＣＧソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラムは、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定するために使用することができる（例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックス
またはＰＡＭ２５０マトリックス、およびギャップウエイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４およびレングスウエイト１、２、３、４、５を使用）。あるいは、特定の実施形態において、アミノ酸配列間の同一性パーセントは、Myers and Miller (CABIOS, 4:1 1 -7 (1989))のアルゴリズムを用いて決定される。例えば、同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を使用し、ＰＡＭ１２０を残基表、ギャップレングスペナルティー１２およびギャップペナルティー４とともに用いて決定することができる。特定のアラインメントソフトウエアによる最大アラインメントのための適当なパラメーターは、当業者により決定可能である。特定の実施形態において、アラインメントソフトウエアのデフォルトパラメーターを使用する。特定の実施形態において、第２のアミノ酸配列に対する第１のアミノ酸配列の同一性パーセンテージ「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）として計算され、式中、Ｙは、第１の配列と第２の配列のアラインメント（目視または特定の配列アラインメントプログラムによりアライン）において同一の一致としてスコアリングされたアミノ酸残基数であり、Ｚは、第２の配列の残基総数である。第２の配列が第１の配列よりも長い場合には、両配列の全体を考慮したグローバルアラインメントを使用し、従って、各配列の総ての文字およびヌルをアラインする必要がある。この場合、上と同じ式が使用可能であるが、Ｚ値としては、第１の配列と第２の配列がオーバーラップする領域の長さを用い、上記領域は第１の配列の長さと実質的に同じ長さを有する。

【0041】

限定されない例として、任意の特定のポリペプチドが参照配列に対して特定の配列同一性パーセンテージを有する（例えば、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一である、いくつかの実施形態においては、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である）かどうかは、特定の実施形態においては、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｕｎｉｘ用Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、マディソン、Ｗｌ ５３７１ １）を用いて決定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２配列間のホモロジーのベストセグメントを見つけ出すためにSmith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-9 (1981)のローカルホモロジーアルゴリズムを使用する。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは特定の配列が本開示に従って参照配列と例えば９５％同一であるかどうかを決定するための他のいずれかの配列アラインメントプログラムを用いる場合、パラメーターは、同一性のパーセンテージが参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、ホモロジーに参照配列のヌクレオチド総数の５％までのギャップを許容するように設定する。

【0042】

特定の実施形態において、配列番号１のスプリットインテインＮ末端断片の変異体は、配列の全長にわたって配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する。

【0043】

特定の実施形態において、配列番号１のスプリットＮ－インテイン断片の変異体は、配列番号２～６、および１２５～１２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、またはからなる。

【0044】

別の実施形態において、配列番号１のスプリットＮ－インテイン断片の変異体は、配列番号１の機能的に同等の変異体である。

【0045】

用語「機能的に同等の変異体」とは、本明細書において使用する場合、１以上のアミノ酸の修飾、挿入および／または欠失によって配列から誘導される総てのタンパク質を意味するものと理解され、その機能が実質的に維持される場合、特に、スプリットインテインＮ末端断片の機能的に同等の変異体の場合には、その活性を維持することを指す。

【0046】

特定の実施形態において、配列番号１のスプリットインテインＮ末端断片の機能的に同等の変異体は、配列番号１のスプリットインテインＮ末端断片の活性を維持または改善する。

【0047】

用語「活性」は、スプリットインテインＮ末端断片に関して本明細書において使用する場合、スプリットインテインＣ末端断片に結合し、「Ｎ末端切断」、すなわち、エクステインとスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端の間のペプチド結合の求核攻撃を触媒して上記ペプチド結合の破断を生じるスプリットインテインＮ末端断片の能力を指す。スプリットインテインＮ末端断片の活性はまた「トランススプライシング活性」も指すことができ、これは、機能的スプリットインテインＣ末端断片に結合し、宿主タンパク質から完全なインテインを切り出し、ペプチド結合によるエクステインまたは隣接配列の連結を触媒する上記スプリットインテインＮ末端断片の能力として理解される。この活性は、温度、ｐＨおよびカオトロピック剤の存在を含む反応条件に依存する。慣用単位はｔ_１／２であり、これは触媒される反応の半分が完了する時間を表す。さらに、インテイン活性はまた、触媒される反応の速度定数（ｋ）、すなわち、毎秒何回の反応が起こるかによって評価される。

【0048】

あるポリペプチドがそのトランススプライシング活性に関して、所与のスプリットＮ－インテインの機能的に同等の変異体であるかどうかを決定するための好適なアッセイは、これらのアッセイにおいて、スプリットインテインＮ末端断片が、機能的スプリットインテインＣ末端断片、すなわち、「Ｃ末端切断」を触媒し得るスプリットインテインＣ末端断片と組み合わされる限り、例えば、本願の方法またはShah NH et al (Shah NH et al., 2012, J Chem Soc, vol 134, 11338)に開示されている方法に記載されているものなどのスプライシングアッセイを含む。上記のアッセイは、機能的Ｎ－インテイン断片およびＣ－インテイン断片が互いに結合し、次に、それらが自身を切り出し、Ｎ－エクステインとＣ－エクステインの間に新たなペプチド結合を生じる反応を遂行するトランススプライシング反応の判定および特性決定を可能とする。その他のアッセイとして、機能的Ｎ－インテインおよびトランススプライシングを妨げるＣ－インテイン突然変異体の使用に頼り、その結果、Ｎ－インテインからＮ－エクステインが切り出された後に反応が停止されるものが開発されている。このようなアッセイ(Vila-Perello et al. J Am Cem Soc. 2013, 135(1): 286-292)は、Ｎ末端切断反応を遂行するＮ－インテインの能力の特性決定を可能とする。さらに、Ｎ末端インテインとＣ末端インテインの間の親和性を測定するための他のアッセイも存在する(Shah et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(29): 6511-5)。

【0049】

本開示によれば、本開示のスプリットＮ－インテインの活性は、機能的同等物がその活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％を有する場合に、実質的に維持されている。さらに、本開示のスプリットＮ－インテインの活性は、機能的に同等の変異体がその活性の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、または少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、またはそれを超える活性を有する場合に、実質的に改善されている。

【0050】

前述のように、本開示のスプリットＮ－インテインの活性は、温度、カオトロピック環境およびｐＨを含むいくつかの反応パラメーターに依存する。よって、１つの実施形態において、本開示のスプリットインテインＮ末端断片の機能的に同等の変異体は、少なくとも０℃、少なくとも５℃、少なくとも１０℃、少なくとも１５℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも３７℃、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃またはそれより高い温度、特定の実施形態においては、５０℃の温度でその活性を維持または改善する。同様に、別の実施形態において、本開示のスプリットＮ－インテインの機能的に同等の変異体は、少なくともｐＨ２．０で、または少なくともｐＨ２．５で、または少なくともｐＨ３．０で、または少なくともｐＨ３．５で、または少なくともｐＨ４．０で、または少なくともｐＨ４．５で、または少なくともｐＨ５．０で、または少なくともｐＨ５．５で、または少なくともｐＨ６．０で、または少なくともｐＨ６．５で、または少なくともｐＨ７．０で、または少なくともｐＨ７．２で、または少なくともｐＨ７．５で、または少なくともｐＨ８．０で、または少なくともｐＨ８．５で、または少なくともｐＨ９．０で、または少なくともｐＨ９．５で、または少なくともｐＨ１０．０で、または少なくともｐＨ１０．５で、または少なくともｐＨ１１．０で、または少なくともｐＨ１１．５で、または少なくともｐＨ１２．０で、または少なくともｐＨ１２．５で、または少なくともｐＨ１３．０で、または少なくともｐＨ１３．５で、または少なくともｐＨ１４で、特定の実施形態においては、ｐＨ７．２でその活性を維持または改善する。別の実施形態において、本開示のスプリットＮ－インテインの機能的に同等の変異体は、尿素１Ｍで、または少なくとも尿素１．５Ｍで、または尿素少なくとも２Ｍで、または少なくとも尿素３Ｍで、または少なくとも尿素３．５Ｍで、または少なくとも尿素４Ｍで、または少なくとも尿素４．５Ｍで、または少なくとも尿素５Ｍで、特定の実施形態においては、尿素２Ｍでまたは尿素４Ｍでその活性を維持または改善する。特定の実施形態において、本開示のスプリットＮ－インテインの機能的に同等の変異体は、尿素２Ｍまたは尿素４Ｍでその活性を維持または改善する。特定の実施形態において、本開示のスプリットＮ－インテインの機能的に同等の変異体は、５０℃の温度で、ｐＨ７．２で、および尿素２Ｍまたは尿素４Ｍでその活性を維持または改善する。また、温度、尿素濃度、その他の変性剤およびｐＨのあらゆる可能性のある組合せが本発明により企図される。

【0051】

特定の実施形態において、その活性を維持または改善する本開示のスプリットインテインＮ末端断片の機能的に同等の変異体は、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。

【0052】

別の実施形態において、配列番号１のスプリットインテインＮ末端断片の機能的に同等の変異体は、配列番号４または配列番号１２５のアミノ酸配列を含んでなるまたはからなる。

【0053】

スプリットインテインＮ末端断片を含んでなる複合体
別の側面において、本開示は、
（ｉ）目的化合物、
（ｉｉ）本開示のスプリットインテインＮ末端断片、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる複合体、以下、本開示の第１の複合体であって、
上記複合体は、場合により（ｉ）と（ｉｉ）の間にリンカーを含んでなり、
目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に連結されているか、または
上記複合体がリンカーを含んでなる場合には、目的化合物はアミド結合によってリンカーに結合され、かつ／または上記リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に結合されている複合体に関する。

【0054】

本明細書において使用する場合、用語「目的化合物」には、タンパク質またはペプチド、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド、小分子薬または細胞傷害性分子を含むいずれの合成または天然に存在する分子も含む。従って、この用語は、薬物、ワクチン、ならびにタンパク質、ペプチドなどの分子を含む生物製剤と従来見なされている化合物を包含する。治療薬の例は、メルクインデックス（第１４版）、ＰＤＲ（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）（第６４版）、およびＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第１版）などの周知の文献に記載され、それらには限定するものではないが、薬剤；疾患または病気の治療、予防、診断、治癒または緩和のために使用される物質；身体の構造または機能に影響を及ぼす物質；または生理学的環境に置かれた後に生物学的に活性型となるかもしくはより活性が高くなるプロドラッグが含まれる。さらに、「目的化合物」は、Ｎ－インテインのアミノ末端に結合することができるカルボキシル基を有するいずれの非タンパク質分子も含み得る。

【0055】

場合により、目的化合物およびスプリットインテインＮ末端断片はリンカーを介して連結されてもよく、従って、リンカーは目的化合物とＮ－インテインの間に配置される。リンカーの性質は、目的化合物の性質によって異なる。特定の実施形態において、リンカーはペプチドである。特定の実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００またはそれを超えるアミノ酸残基長を有するペプチドであり；具体的には、それは１～３アミノ酸残基であり得る。目的化合物がペプチドまたはタンパク質である場合、リンカーのＮ末端は目的化合物のＣ末端に連結され、リンカーのＣ末端はＮ－インテインのＮ末端にペプチド結合を介して連結される。

【0056】

特定の実施形態において、リンカーは、非ペプチドリンカーである。非ペプチドリンカーは、例えば、アルキルリンカー、例えば、－ＨＮ－（ＣＨ_２）ｓ－ＣＯ－であり、ここで、ｓ＝２～２０が使用可能である。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル（例えば、Ｃｉ－Ｃｅ）、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどのいずれの非立体障害基によってさらに置換されていてもよい。

【0057】

非ペプチドリンカーのもう１つのタイプは、ポリエチレングリコール基、例えば、－ＨＮ－（ＣＨ２）２－（０－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－０－ＣＨ２－ＣＯであり、ここで、ｎは、リンカーの総分子量がおよそ１０１～５０００、特定の実施形態においては、１０１～５００の範囲となるようなものである。

【0058】

別の実施形態において、非ペプチドリンカーは、塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、または他のポリマー化合物を含んでなる。

【0059】

特定の実施形態において、複合体は、目的化合物とスプリットインテインＮ末端断片の間にリンカーを含まない。この実施形態において、目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に連結されている。

【0060】

特定の実施形態において、複合体は、目的化合物とスプリットインテインＮ末端断片の間にリンカーを含んでなる。この実施形態において、目的化合物は、目的化合物およびリンカーの化学的性質に応じていずれの好適な手段によってリンカーに結合されてもよい。この実施形態において、リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に結合されている。別の実施形態において、目的化合物はアミド結合によってリンカーに結合され、この場合には、リンカーは、いずれの好適な手段によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に結合(found)されてもよい。別の実施形態において、目的化合物は、アミド結合によってリンカーに結合され、そのリンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に結合される。

【0061】

別の実施形態において、目的化合物は、配列番号１のＮ－インテインを含んでなるインテインによりスプライシングされ得るエクステインのＣ末端アミノ酸残基を有するタンパク質である。別の実施形態において、目的化合物は、そのＣ末端に配列Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕを有するタンパク質である。別の実施形態において、目的化合物は、そのＣ末端に配列Ｐｈｅ－Ｇｌｕを有するタンパク質である。別の実施形態において、目的化合物は、そのＣ末端に残基Ｇｌｕを有するタンパク質である。

【0062】

別の実施形態において、目的化合物がタンパク質でない場合、Ｎ－インテインは、配列番号４～６、１２５～１２７または１６８～１７０のポリペプチドを含んでなるまたはからなる。別の実施形態において、目的化合物がタンパク質でない場合、目的化合物およびＮ－インテインはリンカーを介して連結され、この場合には、リンカーは、配列番号１の配列のスプリットインテインＮ末端断片を含んでなるインテインによりスプライシングされ得るエクステインのＣ末端アミノ酸残基を有するペプチドであり、特定の実施形態においては、リンカーは、そのＣ末端に配列Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ、Ｐｈｅ－ＧｌｕまたはＧｌｕを有するペプチドである。

【0063】

別の実施形態において、目的化合物は、配列番号１のスプリットインテインＮ末端断片を含んでなるインテインによりスプライシングされ得るエクステインのＣ末端アミノ酸残基を有さないタンパク質であり、この場合には、（ｉ）Ｎ－インテインは配列番号４～６、１２５～１２７もしくは１６８～１７０の配列のポリペプチドを含んでなる、もしくはからなるか、または（ｉｉ）目的化合物およびＮ－インテインは、リンカーを介して連結され、この場合には、リンカーは、配列番号１のスプリットインテインＮ末端断片を含んでなるインテインによりスプライシングされ得るエクステインのＣ末端アミノ酸残基を有するペプチドであり、特定の実施形態においては、リンカーは、そのＣ末端に配列Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ、Ｐｈｅ－ＧｌｕまたはＧｌｕを有するペプチドである。

【0064】

「ペプチド結合」という句は、一方の分子のカルボキシ部分（カルボキシ成分と呼ばれる）が他方の分子のアミノ部分（アミノ成分と呼ばれる）と反応して分子の遊離を引き起こす場合に２分子間に形成される共有結合的化学結合－ＣＯ－ＮＨ－を指す。例えば、タンパク質を構成するＬ－アミノ酸は、１分子の水の遊離を伴って連結する際にペプチド結合を形成し得る。従って、タンパク質およびペプチドは、ペプチド結合によって一緒に保持されるアミノ酸残基の鎖と見なすことができる。ペプチド結合は、「アミド結合(amide bond)」または「アミド結合(amide linkage)」である。

【0065】

特定の実施形態において、目的化合物は、タンパク質またはポリペプチドである。

【0066】

別の実施形態において、目的化合物は、２５ＫＤａより大きい、５０ＫＤａより大きいまたは１００ＫＤａより大きいタンパク質である。

【0067】

特定の実施形態において、タンパク質は、Ｃａｓ９、またはＣａｓ９の断片である。用語「Ｃａｓ９」または「ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９」は、本明細書において使用する場合、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの特徴的なタンパク質であり、２つの非コードＲＮＡ：ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の複合体によって、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列モチーフに隣接するＤＮＡ標的配列にガイドされる大きな単量体ＤＮＡヌクレアーゼであるタンパク質を指す。Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼに相同な２つのヌクレアーゼドメインを含む。ＨＮＨヌクレアーゼドメインは相補的ＤＮＡ鎖を切断し、ＲｕｖＣ様ドメインは非相補鎖を切断し、結果として、標的ＤＮＡに平滑切断が導入される。Ｃａｓ９をｓｇＲＮＡとともに異種発現させると、様々な生物の生細胞のゲノムＤＮＡに部位特異的な二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することができる。Ｃａｓ９は、例えば、とりわけストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptocccus thermophilus)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aeureus)、野兎病菌(Francisella tularensis)、アクチノマイセス・ネスランディ(Actinomyces naeslundii)、髄膜炎菌(Neiserria meningitides)、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)を含む、いずれの起源のものであってもよい。特定の実施形態において、用語「Ｃａｓ９」は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｇ３ＥＣＲ１（２０１９年４月１０日のエントリーバージョン３１、２０１２年６月１３日の配列バージョン２）、Ｑ９９ＺＷ２（２０１９年７月３１日のエントリーバージョン１１２、２００１年６月１日の配列バージョン１）、Ｊ７ＲＵＡ５（２０１９年５月８日のエントリーバージョン３３、２０１２年１０月３１日の配列バージョン１）、Ａ０Ｑ５Ｙ３（２０１９年１月１６日のエントリーバージョン６２、２００７年１月９日の配列バージョン１）、Ｊ３Ｆ２Ｂ０（２０１９年５月８日のエントリーバージョン３３、２０１２年１０月３日の配列バージョン１）、Ｑ０３ＪＩ６（２０１９年５月８日のエントリーバージョン７０、２００６年１１月１４日の配列バージョン１）、Ｃ９Ｘ１Ｇ５（２０１９年７月３１日のエントリーバージョン４７、２００９年１１月２４日の配列バージョン１）、Ｑ９２７Ｐ４（２０１９年５月８日のエントリーバージョン９４、２００１年１２月１日の配列バージョン１）によって定義されるタンパク質のいずれか１つを指す。

【0068】

特定の実施形態において、複合体の目的化合物はポリペプチドまたはタンパク質であり、複合体がリンカーを含んでなる場合、リンカーはペプチドリンカーである。この実施形態において、複合体は融合タンパク質である。

【0069】

用語「融合タンパク質」は、当技術分野で周知であり、天然および／または人工の異なる起源に由来する２つ以上の配列を含んでなる人工的に設計された単一のポリペプチド鎖を指す。融合タンパク質は、定義に従えば、天然にそのものとしては見られない。

【0070】

用語「単一のポリペプチド鎖」は、本明細書において使用する場合、融合タンパク質のポリペプチド成分は端と端をコンジュゲートすることもできるし、共有結合により連結された、それらの間に挿入される１以上の任意選択のペプチドまたはポリペプチド「リンカー」または「スペーサー」を含んでもよいことを意味する。

【0071】

別の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗体または抗体のフラグメントである。

【0072】

本明細書において使用する場合、用語「抗体」は、決定された抗原、または抗原内のエピトープに対する結合能を有し、軽鎖または重鎖の全部または一部を含んでなる少なくとも１つのポリペプチドを含んでなる単量体または多量体タンパク質を指す。

【0073】

用語抗体はまた、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および遺伝子操作抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ヒト抗体、ラクダ科動物抗体および二重特異性抗体（ダイアボディを含む）、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および所望の生物活性を示す限り抗体フラグメントといったいずれのタイプの既知の抗体も含む。

【0074】

用語「抗体フラグメント」は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディおよびナノボディなどの抗体フラグメントを含む。

【0075】

抗体の例示的非限定例は、ＤＥＣ－２０５受容体に対する抗体である。用語「ＤＥＣ－２０５受容体」、または「リンパ球抗原７５」、または「Ｃ型レクチンドメインファミリー１３メンバーＢ」は、本明細書において使用する場合、捕捉した抗原を細胞外間隙から特殊な抗原プロセッシングコンパートメントへ向けるためのエンドサイトーシス受容体として働き、主として樹状細胞上に見られるタンパク質を指す。特定の実施形態において、ＤＥＣ－２０５は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｏ６０４４９（２０１９年７月３１日のエントリーバージョン１７０、２０１１年１月１１日の配列バージョン３）により定義されるヒトタンパク質である。特定の実施形態において、抗ＤＥＣ２０５抗体は、モノクローナル抗体である。抗ＤＥＣ－２０５抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ヒトなどのいずれの起源であってもよく、またはヒト化抗体であってもよい。特定の実施形態において、目的化合物は、抗ＤＥＣ－２０５抗体の鎖、特定の実施形態においては、重鎖である。別の実施形態において、目的化合物は、Stevens et al., JACS 2016, 138: 2162-5により記載されているようにマウスαＤＥＣ－２０５モノクローナル抗体の重鎖である。

【0076】

別の実施形態において、目的化合物はタンパク質の断片、特定の実施形態においては、２５ＫＤａより大きい、５０ＫＤａより大きいまたは１００ＫＤａより大きいタンパク質の断片である。

【0077】

別の実施形態において、目的化合物はタンパク質のＮ末端断片、特定の実施形態においては、２５ＫＤａより大きい、５０ＫＤａより大きいまたは１００ＫＤａより大きいタンパク質の断片である。用語「タンパク質のＮ末端断片」は、本明細書において使用する場合、タンパク質のＮ末端を含む様々な長さの断片を指す。特定の実施形態において、Ｎ末端断片は、全長タンパク質の長さの１００％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満を含んでなる断片である。

【0078】

特定の実施形態において、複合体は、配列番号１１１、１１２および１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるまたはからなるスプリットインテインＮ末端断片を含んでなる。

【0079】

特定の実施形態において、配列番号１１２および１１３の配列は、配列番号１の配列より高い温度安定性を有する。

【0080】

特定の実施形態において、複合体は、配列番号４９～６８またはその変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるまたはからなるスプリットインテインＮ末端断片を含んでなる。特定の実施形態において、変異体は、機能的に同等の変異体である。

【0081】

用語「変異体」および「機能的に同等の変異体」は、従前に定義されている。特定の実施形態において、配列番号４９～６８のスプリットインテインＮ末端断片の機能的に同等の変異体は、それらが由来する配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。

【0082】

特定の実施形態において、配列番号４９～６８のスプリットインテインＮ末端断片の機能的に同等の変異体は、それらが由来する配列の活性を維持するか、またはその活性を改善する。用語「活性」ならびにこの活性を測定するための方法は、配列番号１のスプリットインテインＮ末端断片の機能的に同等の変異体に関して従前に定義されている。配列番号１のスプリットインテインＮ末端断片の変異体の活性に関する実施形態は、配列番号４９～６８のスプリットインテインＮ末端断片の変異体の活性にもそのまま当てはまる。

【0083】

スプリットインテインＣ末端断片
別の側面において、本開示は、アミノ酸配列番号７の配列または配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその変異体を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片に関する。

【0084】

本明細書において互換的に使用される場合、用語「スプリットインテインＣ末端断片」、「Ｃ末端スプリットインテイン」、「Ｃ末端インテイン断片」および「Ｃ末端インテイン配列」（「Ｉｎｔ^Ｃ」と略す）は、トランススプライシング反応に関して機能的な、すなわち、機能的スプリットインテインＮ末端断片と会合して、宿主タンパク質からそれ自体を切り出してペプチド結合によるエクステインもしくは隣接配列の連結を触媒し得る完全なインテインを形成し得る、またはスプリットＮ－インテインと会合した際に「Ｃ末端切断」、すなわち、エクステインとスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端の間のペプチド結合の求核攻撃を触媒して上記ペプチド結合の破断を生じるＣ末端アミノ酸配列を含んでなる、いずれのインテイン配列も指す。よって、Ｉｎｔ^Ｃはまた、トランススプライシングが生じた際にスプライシングによって除去される配列も含んでなる。Ｉｎｔ^Ｃは、天然に存在するインテイン配列のＣ末端部分の修飾としての配列を含んでなり得る。例えば、それは、付加的アミノ酸残基および／または変異残基を含んでなり得る（そのような付加および／または変異残基の包含がＩｎｔ^Ｃをトランススプライシングに非機能的としない限り）。特定の実施形態において、付加的残基および／または変異残基の包含は、Ｉｎｔ^Ｃのトランススプライシング活性を改善または増強する。

【0085】

特定の実施形態において、スプリットインテインＣ末端断片は、配列番号７のアミノ酸配列を含んでなる。スプリットインテインＣ末端断片は、配列番号７の配列のＮ末端および／またはＣ末端に連結された付加的アミノ酸残基を含んでなり得る。特定の実施形態において、スプリットインテインＣ末端断片は、配列番号７の配列のＮ末端および／またはＣ末端に連結された１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満、または１個の付加的アミノ酸残基を含んでなる。別の実施形態において、スプリットインテインＮ末端断片は、配列番号７のアミノ酸配列からなる。

【0086】

特定の実施形態において、スプリットインテインＣ末端断片は、配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有する配列番号７のアミノ酸配列の変異体を含んでなるまたはからなる。

【0087】

用語「アミノ酸」および「変異体」は、Ｎ－インテインに関してすでに記載されており、この場合にも同様に当てはまる。

【0088】

配列番号７のスプリットインテインＣ末端断片の変異体は、配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有する。特定の実施形態において、配列番号７のスプリットインテインＣ末端断片の変異体は、配列番号７と少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。

【0089】

特定の実施形態において、配列番号７のスプリットインテインＣ末端断片の変異体は、５０～１６０アミノ酸長、特定の実施形態においては、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５または１６０アミノ酸長を有する。

【0090】

特定の実施形態において、配列番号７のスプリットインテインＣ末端断片の変異体は、配列の全長にわたって配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有する。

【0091】

特定の実施形態において、配列番号７の配列のスプリットインテインＣ末端断片の変異体は、配列番号８４８および１２８～１６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるまたはからなる。

【0092】

別の実施形態において、配列番号７のスプリットＣ－インテインの変異体は、配列番号７の機能的に同等の変異体である。

【0093】

用語「機能的に同等の変異体」は、スプリットインテインＣ末端断片に関して従前に定義されている。配列番号７のスプリットインテインＣ末端断片の機能的に同等の変異体の場合、スプリットインテインＣ末端断片の活性は、スプリットインテインＮ末端断片に結合し、「Ｃ末端切断」、すなわち、エクステインとスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端の間のペプチド結合の求核攻撃を触媒して上記ペプチド結合の破断を生じるその能力を指す。スプリットインテインＣ末端断片の活性はまた「トランススプライシング活性」を指す場合もあり、これは、機能的スプリットインテインＮ末端断片に結合し、宿主タンパク質から完全なインテインを切り出し、ペプチド結合によるエクステインまたは隣接配列の連結を触媒する上記スプリットインテインＣ末端断片の能力として理解される。あるポリペプチドがそのトランススプライシング活性に関して、所与のスプリットＣ－インテインの機能的に同等の変異体であるかどうかを決定するための好適なアッセイは、これらのアッセイにおいて、スプリットインテインＣ末端断片が、機能的スプリットインテインＮ末端断片、すなわち、Ｎ末端切断を触媒し得るスプリットインテインＮ末端断片と組み合わされる限り、例えば、本願の方法またはShah NH et al (Shah NH et al., 2012, J Chem Soc, vol 134, 11338)に開示されている方法に記載されているものなどのスプライシングアッセイを含む。また、タンパク質スプライシングの各段階、特に、本明細書において「Ｃ末端切断」(Shah et al. JACS 2013)と呼ぶＣ－インテインとＣ－エクステインの間のペプチド結合の切断を含む最終工程の特性決定を可能とする他のより詳細なアッセイも記載されている。

【0094】

本開示によれば、Ｃ－インテインの活性は、その機能的同等物が特許請求された配列のインテインの活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％を有する場合に、実質的に維持されている。さらに、Ｃ－インテインの活性は、機能的に同等の変異体が本開示のＣ－インテインの活性の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、または少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、またはそれを超える活性を有する場合に、実質的に改善されている。

【0095】

前述のように、本開示のスプリットインテインＣ末端断片の活性は、温度、カオトロピック環境およびｐＨを含むいくつかの反応パラメーターに依存する。よって、１つの実施形態において、本開示のスプリットインテインＣ末端断片の機能的に同等の変異体は、少なくとも０℃、少なくとも５℃、少なくともｌ０℃、少なくともｌ５℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも３７℃、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃またはそれより高い温度でその活性を維持または改善する。特定の実施形態において、本開示のスプリットインテインＣ末端断片の機能的に同等の変異体は、５０℃の温度でその活性を維持または改善する。同様に、別の実施形態において、本開示のスプリットインテインＣ末端断片の機能的に同等の変異体は、少なくともｐＨ０．１で、または少なくともｐＨ０．５で、または少なくともｐＨ１．０で、または少なくともｐＨ１．５で、または少なくともｐＨ２．０で、または少なくともｐＨ２．５で、または少なくともｐＨ３．０で、または少なくともｐＨ３．５で、または少なくともｐＨ４．０で、または少なくともｐＨ４．５で、または少なくともｐＨ５．０で、または少なくともｐＨ５．５で、または少なくともｐＨ６．０で、または少なくともｐＨ６．５で、または少なくともｐＨ７．０で、または少なくともｐＨ７．２で、または少なくともｐＨ７．５で、または少なくともｐＨ８．０で、または少なくともｐＨ８．５で、または少なくともｐＨ９．０で、または少なくともｐＨ９．５で、または少なくともｐＨ１０．０で、または少なくともｐＨ１０．５で、または少なくともｐＨ１１．０で、または少なくともｐＨ１１．５で、または少なくともｐＨ１２．０で、または少なくともｐＨ１２．５で、または少なくともｐＨ１３．０で、または少なくともｐＨ１３．５で、またはｐＨ１４でその活性を維持または改善する。特定の実施形態において、本開示のスプリットインテインＣ末端断片の機能的に同等の変異体は、ｐＨ７．２でその活性を維持または改善する。別の実施形態において、本開示のスプリットインテインＣ末端断片の機能的に同等の変異体は、尿素１Ｍで、または少なくとも尿素１．５Ｍで、または少なくとも尿素２Ｍで、または少なくとも尿素３Ｍで、または少なくとも尿素３．５Ｍで、または少なくとも尿素４Ｍで、または少なくとも尿素４．５Ｍで、または少なくとも尿素５Ｍでその活性を維持または改善する。特定の実施形態において、本開示のスプリットＣ－インテインの機能的に同等の変異体は、尿素２Ｍまたは尿素５Ｍでその活性を維持または改善する。特定の実施形態において、本開示のスプリットＣ－インテインの機能的に同等の変異体は、５０℃の温度、ｐＨ７．２および尿素２Ｍまたは尿素４Ｍでその活性を維持または改善する。温度、尿素濃度およびｐＨのあらゆる可能性のある組合せが本発明により企図される。

【0096】

特定の実施形態において、その活性を維持または改善する本開示のスプリットインテインＣ末端断片の機能的に同等の変異体は、配列番号７と少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。

【0097】

別の実施形態において、スプリットインテインＣ末端断片の機能的に同等の変異体は、配列番号１０～２２および１２８～１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるまたはからなる。

【0098】

スプリットインテインＣ末端断片を含んでなる複合体
別の側面において、本開示は、
（ｉ）配列番号７のスプリットインテインＣ末端断片または配列番号１１４～１２０からなる群から選択される配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
（ｉｉ）目的化合物
を含んでなる複合体、以下、本開示の第２の複合体であって、
上記複合体は、場合により、（ｉ）と（ｉｉ）の間にリンカーを含んでなり、
目的化合物がアミド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に連結されているか、または
上記複合体がリンカーを含んでなる場合には、目的化合物はアミド結合によってリンカーに結合され、かつ／または上記リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合されている複合体に関する。

【0099】

用語「目的化合物」および「リンカー」は、本開示の第１の複合体に関して従前に定義されている。本開示の第１の複合体の目的化合物およびリンカーの実施形態は総て、本開示の第２の複合体にそのまま当てはまる。

【0100】

特定の実施形態において、複合体は、目的化合物とスプリットインテインＣ末端断片の間にリンカーを含まない。この実施形態において、目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に連結される。

【0101】

特定の実施形態において、複合体は、目的化合物とスプリットインテインＣ末端断片の間にリンカーを含んでなる。この実施形態において、目的化合物は、目的化合物およびリンカーの化学的性質に応じていずれの好適な手段によってリンカーに結合されてもよい。この実施形態において、リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合されている。別の実施形態において、目的化合物はアミド結合によってリンカーに結合され、この場合には、リンカーは、いずれの好適な手段によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合されてもよい。別の実施形態において、目的化合物は、アミド結合によってリンカーに結合され、そのリンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合される。

【0102】

別の実施形態において、目的化合物は、配列番号７の配列のスプリットインテインＣ末端断片を含んでなるインテインによってスプライシングされ得るエクステインのＮ末端アミノ酸残基を有するタンパク質である。別の特定の実施形態において、目的化合物は、そのＮ末端に配列Ｃｙｓ－Ｘａａ_１－Ｘａａ_２またはＣｙｓ－Ｘａａ_１－Ｘａａ_２－Ｌｅｕを有するタンパク質であり、ここで、
Ｘａａ_１およびＸａａ_２は任意のアミノ酸であり；
Ｘａａ_１はＡｌａ、Ｇｌｙ、ＡｒｔまたはＰｈｅであり、Ｘａａ_２は任意のアミノ酸であり；
Ｘａａ_１は任意のアミノ酸であり、Ｘａａ_２はＧｌｙ、Ｇｌｕ、ＡｌａまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ_１はＡｌａ、Ｇｌｙ、ＡｒｔまたはＰｈｅであり、Ｘａａ_２はＧｌｙ、Ｇｌｕ、ＡｌａまたはＡｒｇである。

【0103】

別の実施形態において、目的化合物は、そのＮ末端にＣｙｓ－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ、Ｃｙｓ－Ａｌａ－Ｐｈｅ；Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ；Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ、Ｃｙｓ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ａｌａ、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ、Ｃｙｓ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ；Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ；Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ、Ｃｙｓ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－ＬｅｕおよびＣｙｓ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕから選択される配列を有するタンパク質である。

【0104】

別の実施形態において、目的化合物がタンパク質でない場合、Ｃ－インテインは、配列番号１０～４８または配列番号１２８～１６６からなる群から選択されるポリペプチドを含んでなるまたはからなる。別の実施形態において、目的化合物がタンパク質でない場合、目的化合物およびＣ－インテインはリンカーを介して連結され、この場合には、リンカーは、配列番号７の配列のスプリットインテインＣ末端断片を含んでなるインテインによりスプライシングされ得るエクステインのＮ末端アミノ酸残基を有するペプチドであり、特定の実施形態においては、リンカーは、そのＮ末端に配列Ｃｙｓ－Ｘａａ_１－Ｘａａ_２またはＣｙｓ－Ｘａａ_１－Ｘａａ_２－Ｌｅｕを有するペプチドであり、ここで、
Ｘａａ_１およびＸａａ_２は任意のアミノ酸であり；
Ｘａａ_１はＡｌａ、Ｇｌｙ、ＡｒｔまたはＰｈｅであり、Ｘａａ_２は任意のアミノ酸であり；
Ｘａａ_１は任意のアミノ酸であり、Ｘａａ_２はＧｌｙ、Ｇｌｕ、ＡｌａまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ_１はＡｌａ、Ｇｌｙ、ＡｒｔまたはＰｈｅであり、Ｘａａ_２はＧｌｙ、Ｇｌｕ、ＡｌａまたはＡｒｇである；
あるいはリンカーは、そのＮ末端にＣｙｓ－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ、Ｃｙｓ－Ａｌａ－Ｐｈｅ、Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ、Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ、Ｃｙｓ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ａｌａ、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ、Ｃｙｓ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ、Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ、Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ、Ｃｙｓ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－ＬｅｕおよびＣｙｓ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕから選択される配列を有するペプチドである。

【0105】

別の実施形態において、目的化合物は、配列番号７のスプリットＣ－インテインを含んでなるインテインによってスプライシングされ得るエクステインのＮ末端アミノ酸残基を有さないタンパク質であり、この場合には、（ｉ）Ｃ－インテインは、配列番号１０～４４もしくは１２８～１６６の配列のポリペプチドを含んでなるもしくはからなるか、または（ｉｉ）目的化合物およびＣ－インテインはリンカーを介して連結され、この場合には、リンカーは、配列番号７のスプリットインテインＣ末端断片を含んでなるインテインによってスプライシングされ得るエクステインのＣ末端アミノ酸残基を有するペプチドであり、特定の実施形態においては、リンカーは、そのＮ末端に配列Ｃｙｓ－Ｘａａ_１－Ｘａａ２またはＣｙｓ－Ｘａａ_１－Ｘａａ_２－Ｌｅｕを有するペプチドであり、ここで、
Ｘａａ_１およびＸａａ_２は任意のアミノ酸であり；
Ｘａａ_１はＡｌａ、Ｇｌｙ、ＡｒｔまたはＰｈｅであり、Ｘａａ_２は任意のアミノ酸であり；
Ｘａａ_１は任意のアミノ酸であり、Ｘａａ_２はＧｌｙ、Ｇｌｕ、ＡｌａまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ_１はＡｌａ、Ｇｌｙ、ＡｒｔまたはＰｈｅであり、Ｘａａ_２はＧｌｙ、Ｇｌｕ、ＡｌａまたはＡｒｇであり；
あるいはリンカーは、そのＮ末端にＣｙｓ－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ、Ｃｙｓ－Ａｌａ－Ｐｈｅ、Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ、Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ、Ｃｙｓ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ａｌａ、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ、Ｃｙｓ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ；Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ；Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ、Ｃｙｓ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－ＬｅｕおよびＣｙｓ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕから選択される配列を有するペプチドである。

【0106】

特定の実施形態において、目的化合物は、タンパク質またはポリペプチドである。

【0107】

別の実施形態において、目的化合物は、２５ＫＤａより大きい、５０ＫＤａより大きいまたは１００ＫＤａより大きいタンパク質である。

【0108】

特定の実施形態において、タンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ９の断片である。特定の実施形態において、目的化合物は、ポリペプチドまたはタンパク質であり、複合体がリンカーを含んでなる場合、リンカーはペプチドリンカーである。この実施形態において、複合体は融合タンパク質である。

【0109】

別の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗体または抗体のフラグメントである。特定の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗ＤＥＣ－２０５抗体の重鎖である。特定の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗ＤＥＣ－２０５モノクローナル抗体の重鎖である。特定の実施形態において、目的化合物は、Stevens et al., JACS 2016, 138: 2162-5により記載されているように、マウスαＤｅｃ２０５モノクローナル抗体の重鎖である。

【0110】

別の実施形態において、目的化合物は、タンパク質の断片、特定の実施形態においては、２５ＫＤａより大きい、５０ＫＤａより大きいまたは１００ＫＤａより大きいタンパク質の断片である。別の実施形態において、目的化合物は、タンパク質のＣ末端断片である。用語「タンパク質のＣ末端断片」は、本明細書において使用する場合、タンパク質のＣ末端を含む様々な長さの断片を指す。特定の実施形態において、Ｃ末端断片は、全長タンパク質の長さの１００％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満を含んでなる断片である。

【0111】

別の実施形態において、目的化合物は抗体である。抗体という用語は、Ｎ－インテインに関して記載されており、この場合にも同様に当てはまる。

【0112】

特定の実施形態において、複合体は、配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるまたはからなるスプリットインテインＣ末端断片を含んでなる。

【0113】

特定の実施形態において、配列番号１２３および１２４の配列は、配列番号７の配列よりも高い温度安定性を有する。

【0114】

特定の実施形態において、複合体は、配列番号６９～８７からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその変異体を含んでなるまたはからなるスプリットインテインＣ末端断片を含んでなる。特定の実施形態において、変異体は、機能的に同等の変異体である。

【0115】

用語「変異体」および「機能的に同等の変異体」は、従前に定義されている。特定の実施形態において、配列番号６９～８７のスプリットインテインＣ末端断片の機能的に同等の変異体は、それらが由来する配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。

【0116】

特定の実施形態において、配列番号６９～８７のスプリットインテインＣ末端断片の機能的に同等の変異体は、それらが由来する配列の活性を維持または改善する。用語「活性」ならびにこの活性を測定するための方法は、列番号７のスプリットインテインＮ末端断片の機能的に同等の変異体に関して従前に定義されている。配列番号７のスプリットインテインＣ末端断片の変異体の活性に関する実施形態は、配列番号６９～８７のスプリットインテインＣ末端断片の変異体の活性にそのまま当てはまる。

【0117】

スプリットインテインＮ末端断片およびスプリットインテインＣ末端断片を含んでなる複合体
別の側面において、本開示は、
（ｉｖ）本開示のスプリットインテインＣ末端断片または配列番号１１４～１２０からなる群から選択される配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、
（ｖ）目的化合物、および
（ｖｉ）本開示のスプリットインテインＮ末端断片、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる複合体、以下、本開示の第３の複合体であって、
上記複合体は、場合により、（ｉ）と（ｉｉ）の間および／または（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の間にリンカーを含んでなり、
目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に連結されているか、または
上記複合体がリンカーを含んでなる場合には、目的化合物はアミド結合によってリンカーに結合され、かつ／または上記リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合され、
目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に連結されているか、または
上記複合体がリンカーを含んでなる場合には、目的化合物はアミド結合によってリンカーに結合され、かつ／または上記リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に結合されている
複合体に関する。

【0118】

用語「目的化合物」および「リンカー」は、本開示の第１の複合体に関して従前に定義されている。本開示の第１の複合体の目的化合物およびリンカーの実施形態は総て、本開示の第２の複合体にそのまま当てはまる。

【0119】

特定の実施形態において、目的化合物はタンパク質またはポリペプチドである。

【0120】

別の実施形態において、目的化合物は、２５ＫＤａより大きい、５０ＫＤａより大きいまたは１００ＫＤａはより大きいタンパク質である。特定の実施形態において、目的化合物は、ポリペプチドまたはタンパク質であり、複合体がリンカーを含んでなる場合、リンカーはペプチドリンカーである。この実施形態において、複合体は融合タンパク質である。

【0121】

特定の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗体または抗体のフラグメントである。特定の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗ＤＥＣ－２０５抗体の重鎖である。特定の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗ＤＥＣ－２０５モノクローナル抗体の重鎖である。特定の実施形態において、目的化合物は、Stevens et al., JACS 2016, 138: 2162-5により記載されているようにマウスαＤＥＣ－２０５モノクローナル抗体の重鎖である。

【0122】

特定の実施形態において、複合体は、配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるまたはからなるスプリットインテインＣ末端断片を含んでなる。

【0123】

特定の実施形態において、配列番号１２３および１２４の配列は、配列番号７の配列より高い温度安定性を有する。

【0124】

特定の実施形態において、複合体は、配列番号６９～８７からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその変異体を含んでなるまたはからなるスプリットインテインＣ末端断片を含んでなる。特定の実施形態において、変異体は機能的に同等の変異体である。

【0125】

特定の実施形態において、複合体は、配列番号１１１、１１２および１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるまたはからなるスプリットインテインＮ末端断片を含んでなる。

【0126】

特定の実施形態において、配列番号１１２および１１３の配列は、配列番号１の配列より高い温度安定性を有する。

【0127】

特定の実施形態において、複合体は、配列番号４９～６８からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその変異体を含んでなるまたはからなるスプリットインテインＮ末端断片を含んでなる。別の実施形態において、変異体は機能的に同等の変異体である。

【0128】

用語「変異体」および「機能的に同等の変異体」は、従前に定義されている。これらの用語に関する実施形態は、本開示の第３の複合体にそのまま当てはまる。

【0129】

本開示の複合体を含んでなる組成物
別の側面において、本開示は、本開示の第１の複合体および第２の複合体を含んでなる組成物、以下、本開示の第１の組成物に関する。

【0130】

用語「組成物」は、指定の成分を含有する生成物、ならびに指定の量での指定の成分の組合せから直接または間接的に得られるいずれの生成物も包含することを意図する。組成物の成分は、単一の処方物として一緒に包装されてもよいし、または異なる処方物として別個に包装されてもよい。よって、ある実施形態において、本開示の第１の複合体は、単一の処方物中に本開示の第２の複合体と一緒に包装される。別の実施形態において、本開示の第１の複合体および本開示の第２の複合体は、別個に包装される。

【0131】

１つの実施形態において、第１の複合体および第２の複合体は、同じタンパク質のそれぞれＮ末端断片とＣ末端断片を、両複合体が本開示の方法に従って合わせられた場合に、タンパク質のＮ末端断片がそのタンパク質のＣ末端断片に連結されて全長タンパク質を生じるような様式で含んでなる。

【0132】

本開示のコンジュゲート
別の側面において、本開示は、本開示の第１の複合体および本開示の第２の複合体を含んでなるコンジュゲート、以下、本開示の第１のコンジュゲートであって、スプリットインテインＮ末端断片のＣ末端がペプチド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＮ末端に連結されているコンジュゲートに関する。

【0133】

別の側面において、本開示は、（ａ）本開示の第１の複合体、および（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列もしくは配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその変異体または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片を含んでなり、スプリットインテインＮ末端断片のＣ末端がペプチド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＮ末端に連結されているコンジュゲート、以下、本開示の第２のコンジュゲートに関する。

【0134】

特定の実施形態において、コンジュゲートは、配列番号１２１～１２４から選択される配列を含んでなるまたはからなるスプリットインテインＣ末端断片を含んでなる。

【0135】

特定の実施形態において、コンジュゲートは、配列番号６９～８７から選択される配列またはその変異体を含んでなるまたはからなるスプリットインテインＣ末端断片を含んでなる。特定の実施形態において、変異体は機能的に同等の変異体である。配列番号６９～８７のスプリットインテインＣ末端断片の機能的に同等の変異体は従前に定義されている。

【0136】

特定の実施形態において、目的化合物は、タンパク質またはポリペプチドである。

【0137】

別の実施形態において、目的化合物は、２５ＫＤａより大きい、５０ＫＤａより大きいまたは１００ＫＤａより大きいタンパク質である。

【0138】

特定の実施形態において、タンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ９の断片である。

【0139】

特定の実施形態において、目的化合物は、ポリペプチドまたはタンパク質であり、複合体がリンカーを含んでなる場合、リンカーはペプチドリンカーである。

【0140】

特定の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗体または抗体のフラグメントである。特定の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗ＤＥＣ－２０５抗体の重鎖である。特定の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗ＤＥＣ－２０５モノクローナル抗体の重鎖である。特定の実施形態において、目的化合物は、Stevens et al., JACS 2016, 138: 2162-5により記載されているようにマウスαＤＥＣ－２０５モノクローナル抗体の重鎖である。

【0141】

本開示のポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
別の側面において、本開示は、
本開示のスプリットインテインＮ末端断片、または
本開示のスプリットインテインＣ末端断片、または
本開示の第１、第２または第３の複合体（ここで、目的化合物はポリペプチドもしくはタンパク質であり、リンカーは、存在する場合、ペプチドリンカーである）、または
本開示のコンジュゲート
をコードするポリヌクレオチドに関する。

【0142】

本明細書において使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合（またはその関連構造変異体もしくは合成類似体）を介して連結された複数のヌクレオチド単位（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその関連構造変異体もしくは合成類似体）から構成されるポリマーを指す。用語ポリヌクレオチドには、二本鎖または一本鎖ゲノムおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成および遺伝子操作ポリヌクレオチド、ならびにセンスおよびアンチセンス両方のポリヌクレオチド（本開示にはセンス鎖のみが開示されている）が含まれる。これには一本鎖および二本鎖分子、すなわち、ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡおよびＲＮＡ－ＲＮＡハイブリッドが含まれる。

【0143】

本開示のポリヌクレオチドは、単離されたままの状態でまたは好適な宿主細胞中での上記ポリヌクレオチドの増幅を可能とするベクターの一部をなす状態で見られる。よって、別の側面において、本開示は、上記のような本開示のポリヌクレオチドを含んでなるベクターに関する。

【0144】

上記ポリヌクレオチドの挿入に好適なベクターは、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびその誘導体、ｍｐｌ８、ｍｐｌ９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥｌ、ｐＣＲｌ、ＲＰ４などの原核生物における発現ベクター；ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのファージおよび「シャトル」ベクター；酵母の発現ベクター、例えば、２ミクロンプラスミド、組込みプラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミドなどのタイプのベクターなど；ｐＡＣ系およびｐＶＬのベクターなどの昆虫細胞における発現ベクター；ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥ系などの植物における発現ベクター；ならびに任意の市販のバキュロウイルス系を用いて昆虫細胞を感染させるのに好適なバキュロウイルスを含む真核細胞の発現ベクターに由来するベクターである。真核細胞のためのベクターとしては、ウイルスベクター（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ），レトロウイルスおよびレンチウイルス）ならびにｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ４．１－ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ、ｐＨＭＣＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦＩ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ－ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５－Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびＰＫＳＶ－１０、ｐＢＰＶ－１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴｌなどの非ウイルスベクターが挙げられる。

【0145】

ベクターはまた、それと接触させた後にベクターに組み込まれた細胞を識別することを可能とするリポーターまたはマーカー遺伝子を含んでなってよい。

【0146】

本開示に関して有用なリポーター遺伝子としては、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、チミジンキナーゼ、ＧＦＰなどが挙げられる。本発明に関して有用なマーカー遺伝子としては、例えば、アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を付与するネオマイシン耐性遺伝子；ハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；オルニチンデカルボキシラーゼ（２－（ジフルオロメチル）－ＤＬ－オルニチン（ＤＦＭＯ）の阻害剤に対する耐性を付与するＯＤＣ遺伝子；メトトレキサートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子；ピューロマイシンに対する耐性を付与するピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ遺伝子；ゼオシンに対する耐性を付与するｂｌｅ遺伝子；９－β－Ｄ－キシロフラノースアデニンに対する耐性を付与するアデノシンデアミナーゼ遺伝子；Ｎ－（ホスホンアセチル）－Ｌ－アスパラギン酸の存在下での細胞の増殖を可能とするシトシンデアミナーゼ遺伝子；アミノプテリンの存在下での細胞の増殖を可能とするチミジンキナーゼ遺伝子；キサンチンの存在下およびグアニンの不在下での細胞の増殖を可能とするキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子；トリプトファンの代わりにインドールの存在下での細胞の増殖を可能とする大腸菌のｔｒｐＢ遺伝子；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチジノールを使用することを可能とする大腸菌のｈｉｓＤ遺伝子が挙げられる。選択遺伝子は、加えて真核細胞における上記遺伝子の発現に好適なプロモーター（例えば、ＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーター）、最適翻訳開始部位（例えば、いわゆるＫｏｚａｋルールに従う部位またはＩＲＥＳ）、ポリアデニル化部位、例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化またはホスホグリセリン酸キナーゼ部位、イントロン、例えば、β－グロブリン遺伝子イントロンを含み得るプラスミドに組み込まれる。あるいは、同じベクターに同時にリポーター遺伝子およびマーカー遺伝子の両方の組合せを使用することも可能である。

【0147】

他方、当業者が知るように、ベクターの選択は次にそれが導入される宿主細胞によって異なる。例として、上記ポリヌクレオチドが導入されるベクターは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰＩ由来人工染色体（ＰＡＣ）であってもよい。ＹＡＣ、ＢＡＣおよびＰＡＣの特徴は当業者に知られている。上記タイプのベクターに関する詳細な情報は、例えばGiraldo and Montoliu (Giraldo, P. & Montoliu L., 2001 Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals, Transgenic Research 10(2): 83-110)によって提供されている。本開示のベクターは、当業者に公知の従来法によって得ることができる(Sambrook J. et al., 2000 "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. Vol 1-3)。

【0148】

本開示のポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション（例えば、経皮エレクトロポレーション）、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体の使用を含む当技術分野で公知の方法によって、裸のＤＮＡプラスミドとして、また、ベクターを用いて、宿主細胞にｉｎ ｖｉｖｏ導入することができる。裸のＤＮＡを製剤し、哺乳動物筋肉組織に投与するための方法も知られている。Ｆｅｉｇｎｅｒ Ｐら、米国特許第５，５８０，８５９号、および同第５，５８９，４６６号を参照のこと。陽イオンオリゴペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド、または陽イオンポリマーなどの他の分子も、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて核酸のトランスフェクションを促進するために有用である。Ｂａｚｉｌｅ Ｄら、ＷＯ１９９５０２１９３１、およびＢｙｋ Ｇら．、ＷＯ１９９６０２５５０８を参照のこと。

【0149】

宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するために使用することができるもう１つの周知の方法は、粒子衝撃（ａｋａ微粒子銃形質転換）である。微粒子銃形質転換は一般に、いくつかの方法のうち１つで達成される。１つの一般的な方法は、不活性のまたは生物学的に活性な粒子を細胞に発射することを含む。Ｓａｎｆｏｒｄ Ｊら、米国特許第４，９４５，０５０号、同第５，０３６，００６号、および同第５，１００，７９２号を参照のこと。

【0150】

あるいは、ベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてリポフェクションによって導入することができる。陽イオン脂質の使用は、負電荷を有する核酸のカプセル封入を促進することができ、また、負電荷を有する細胞膜との融合を促進することもできる。Feigner P, Ringold G, Science 1989; 337:387-388を参照のこと。核酸の導入に有用な脂質化合物および組成物は記載されている。Ｆｅｉｇｎｅｒ Ｐら、米国特許第５，４５９，１２７号、Ｂｅｈｒ Ｊら、ＷＯ１９９５０１８８６３、およびＢｙｋ Ｇ、ＷＯ１９９６０１７８２３を参照のこと。

【0151】

よって、別の側面において、本開示は、本開示のポリヌクレオチドまたはベクターを含んでなる宿主細胞に関する。これらの細胞は、当業者に公知の従来の方法によって得ることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと、上記に引用）。

【0152】

用語「宿主細胞」は、本明細書において使用する場合、本開示によるポリヌクレオチドまたはベクターなどの本開示の核酸が導入され、本開示のスプリットインテインＮ末端断片または上記スプリットインテインＮ末端断片を含んでなる融合タンパク質を発現し得る細胞を指す。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書では互換的に使用される。特定の目的細胞だけでなくそのような細胞の後代または潜在的後代も指すと理解されるべきである。後続世代には突然変異または環境的影響のいずれかのために特定の改変が生じ得るので、このような後代は、実際には親細胞と同一とは言えないが、本明細書において使用する場合、この用語の範囲内にやはり含まれる。この用語は、異種ＤＮＡの導入によって改変され得るいずれの培養細胞も含む。特定の実施形態において、宿主細胞は、本開示のポリヌクレオチドが安定発現、翻訳後修飾、適当な細胞内コンパートメントへの局在、および適当な転写装置との会合が可能なものである。適当な宿主細胞の選択はまた、検出シグナルの選択によっても影響を受ける。例えば、リポーター構築物は、上記のように、転写調節タンパク質に応答した遺伝子転写の活性化または阻害の際に選択可能またはスクリーニング可能な形質を提供することができ、最適な選択またはスクリーニングを達成するために、宿主細胞表現型が考慮される。本開示の宿主細胞としては、原核細胞および真核細胞が挙げられる。原核生物としては、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌(E.coli)または桿菌が挙げられる。特定の実施形態においては、本開示のポリヌクレオチドまたはベクターを含んでなる転写制御配列の増幅のために原核細胞が使用されると理解される。形質転換のための好適な原核生物宿主細胞としては、例えば、大腸菌(E.coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、およびその他シュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、およびブドウ球菌属(Staphylococcus)の様々な種が挙げられる。真核細胞としては、限定するものではないが、酵母細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス）、哺乳動物細胞、および寄生生物細胞、例えば、トリパノソーマ属(trypanosomes)が挙げられる。本明細書において使用する場合、酵母には、厳密な分類学的意味においての酵母、すなわち、単細胞生物だけでなく、糸状真菌の酵母様多細胞真菌も含む。例示的な種としては、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyverei lactis)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、およびトウモロコシ黒穂菌(Ustilaqo maydis)、ならびにサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)が挙げられる。本開示の実施において使用可能な他の酵母としては、アカパンカビ(Neurospora crassa)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、およびハンセヌラ ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)がある。哺乳動物宿主細胞培養系としては、ＣＯＳ細胞、Ｌ細胞、３Ｔ３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、胚性幹細胞、ＢＨＫ、ＨｅＫまたはＨｅＬａ細胞などの樹立細胞株が挙げられる。特定の実施形態において、真核細胞が組換え遺伝子発現に使用される。

【0153】

２つの目的化合物をコンジュゲートするための方法
別の側面において、本開示は、第１の目的化合物と第２の目的化合物の間のコンジュゲートを得るための方法であって、
（ｉ）
（ａ）第１の目的化合物、および配列番号１のアミノ配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片を含んでなる本開示の第１の複合体と、
（ｂ）第２の目的化合物、および配列番号７のアミノ酸配列もしくは配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片を含んでなる本開示の第２の複合体、あるいは
ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片またはその機能的に同等の変異体および第２の目的化合物を含んでなる複合体であって、場合により、上記スプリットインテインＣ末端断片と上記第２の目的化合物の間にリンカーを含んでなり、
・第２の目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合されているか、または
・上記複合体がリンカーを含んでなる場合には、上記第２の目的化合物はアミド結合によってリンカーに結合され、かつ／または上記リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合されている、複合体
とを、スプリットインテインＮ末端断片とスプリットインテインＣ末端断片を結合させてインテイン中間体を形成させるために適当な条件下で接触させること、ならびに
（ｉｉ）上記インテイン中間体を反応させて、第１の目的化合物と第２の目的化合物の間のコンジュゲートを形成させること
を含んでなる方法に関する。

【0154】

別の側面において、本開示は、第１の目的化合物と第２の目的化合物の間のコンジュゲートを得るための方法であって、
（ｉ）
（ａ）第１の目的化合物、および配列番号１のアミノ配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片を含んでなる本開示の第１の複合体、あるいは
目的化合物およびＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片またはその機能的に同等の変異体を含んでなる複合体を含んでなる複合体であって、場合により、上記目的化合物とスプリットインテインＮ末端断片の間にリンカーを含んでなり、
・上記目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に連結されているか、または
・上記複合体がリンカーを含んでなる場合には、上記目的化合物は、アミド結合によってリンカーに結合され、かつ／または上記リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に結合されている、複合体と、
（ｂ）第２の目的化合物、および配列番号７のアミノ酸配列もしくは配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片を含んでなる請求項１７～２１のいずれか一項に記載の複合体
とを、スプリットインテインＮ末端断片とスプリットインテインＣ末端断片を結合させてインテイン中間体を形成させるために適当な条件下で接触させること、ならびに
（ｉｉ）上記インテイン中間体を反応させて、第１の目的化合物と第２の目的化合物の間のコンジュゲートを形成させること
を含んでなる方法に関する。

【0155】

用語「ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬインテイン」は、本明細書において使用する場合、南極の永久成層塩湖エース湖で同定された非カノニカルスプリットインテインの一ファミリーを指す。このファミリーのインテインは、Thiel et al., Angew. Chem. Int. Ed 2014, 53: 1306-1310によって記載されている。特定の実施形態において、ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片は、配列番号１０１または１０２の配列を含んでなるまたはからなる。特定の実施形態において、ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片は、配列番号９９または１００の配列を含んでなるまたはからなる。

【0156】

用語「目的化合物」および「機能的に同等の変異体」は、従前に記載されている。いくつかの実施形態において、第１の化合物および／または第２の化合物は、ペプチドまたはポリペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、第１の化合物および／または第２の化合物は、抗体、抗体鎖、または抗体重鎖であるかまたはそれを含む。特定の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗ＤＥＣ－２０５抗体の重鎖である。特定の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗ＤＥＣ－２０５モノクローナル抗体の重鎖である。特定の実施形態において、目的化合物は、Stevens et al., JACS 2016, 138: 2162-5に記載されているようにマウスαＤＥＣ－２０５モノクローナル抗体の重鎖である。

【0157】

いくつかの実施形態において、第１の化合物および／または第２の化合物は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、薬物、または細胞傷害性分子であるか、またはそれを含む。

【0158】

特定の実施形態において、スプリットインテインＮ末端断片は、配列番号１１１～１１３からなる群から選択される配列を含んでなるまたはからなる。

【0159】

特定の実施形態において、スプリットインテインＮ末端断片は、配列番号４９～６８からなる群から選択される配列またはその機能的に同等の変異体を含んでなるまたはからなる。

【0160】

特定の実施形態において、スプリットインテインＣ末端断片は、配列番号１２１～１２４からなる群から選択される配列を含んでなるまたはからなる。特定の実施形態において、スプリットインテインＣ末端断片は、配列番号６９～８７からなる群から選択される配列またはその機能的に同等の変異体を含んでなるまたはからなる。

【0161】

特定の実施形態において、スプリットインテインＮ末端断片は、配列番号４９～６８からなる群から選択される配列またはその機能的に同等の変異体を含んでなるまたはからなり、スプリットインテインＣ末端断片は、配列番号６９～８７からなる群から選択される配列またはその機能的に同等の変異体を含んでなるまたはからなる。

【0162】

スプリットインテインＮ末端断片とスプリットインテインＣ末端断片を結合させてインテイン中間体を形成させるための適当な条件は、当業者によって容易に決定することができる。特定の実施形態において、これらの条件は、第１の複合体と第２の複合体を０℃～７０℃、例えば５℃～６５℃、１０℃～６０℃、１５℃～５５℃、２０℃～５０℃、２５℃～４５℃、３０℃～４０℃、２５℃～３５℃、４５℃～５５℃の温度で、特定の実施形態においては、３０℃または５０℃で接触させることを含む。別の実施形態において、これらの条件は、第１の複合体と第２の複合体を０．１～１４、例えば０．５～１３．５、１．０～１３．０、１．５～１２．５、２．０～１２．０、２．５～１１．５、３．０～１１．０、３．５～１０．５、４．０～１０．０、４．５～９．５、５．０～９．０、５．５～８．５、６．０～８．０、６．５～７．５のｐＨで、特定の実施形態においては、ｐＨ７．２で接触させることを含む。別の実施形態において、これらの条件は、第１の複合体と第２の複合体を尿素の不在下で、または１Ｍ～５Ｍ、例えば１．５Ｍ～４．５Ｍ、２Ｍ～４．０Ｍ、２．５Ｍ～３．５Ｍの濃度の尿素の存在下で、特定の実施形態においては、尿素２Ｍもしくは尿素４Ｍで接触させることを含む。特定の実施形態において、これらの条件は、第１の複合体と第２の複合体を５０℃の温度、ｐＨ７．２、および尿素２Ｍまたは尿素４Ｍの存在下で接触させることを含む。また、温度、尿素濃度およびｐＨのあらゆる可能性のある組合せが本発明により企図される。

【0163】

目的化合物と求核試薬のコンジュゲートを得るための方法
別の側面において、本開示は、目的化合物と求核試薬のコンジュゲートを得るための方法であって、
（ｉ）
（ａ）スプリットインテインＮ末端断片が配列番号１のアミノ酸配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる本開示の第１の複合体、あるいは
目的化合物およびＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片またはその機能的に同等の変異体を含んでなる複合体であって、場合により、上記目的化合物とスプリットインテインＮ末端断片の間にリンカーを含んでなり、
・上記目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に連結されているか、または
・上記複合体がリンカーを含んでなる場合には、上記目的化合物は、アミド結合によってリンカーに結合され、かつ／または上記リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に結合されている、複合体と、
（ｂ）配列番号８、９、２３～４８および１４１～１６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片
とを、スプリットインテインＮ末端断片とスプリットインテインＣ末端断片の間で結合させてインテイン中間体を形成させるために適当な条件下で接触させること、ならびに
（ｉｉ）上記インテイン中間体と外因性求核試薬を接触させること
を含んでなる方法に関する。

【0164】

用語「ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片」、「目的化合物」および「機能的に同等の変異体」は、従前に定義されている。特定の実施形態において、ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片は、配列番号１０１または１０２の配列を含んでなるまたはからなる。いくつかの実施形態において、第１の化合物および／または第２の化合物は、ペプチドまたはポリペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、第１の化合物および／または第２の化合物は、抗体、抗体鎖、または抗体重鎖であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗体または抗体のフラグメントである。特定の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗ＤＥＣ－２０５抗体の重鎖である。特定の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗ＤＥＣ－２０５モノクローナル抗体の重鎖である。特定の実施形態において、目的化合物は、Stevens et al., JACS 2016, 138: 2162-5に記載されているようにマウスαＤＥＣ－２０５モノクローナル抗体の重鎖である。

【0165】

いくつかの実施形態において、第１の化合物および／または第２の化合物は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、薬物、または細胞傷害性分子であるか、またはそれを含む。

【0166】

用語「求核試薬」は、本明細書において使用する場合、電子対を求電子試薬に供与して反応に関連して化学結合を形成する任意の化学種を指す。自由な電子対または少なくとも１つのパイ結合を持つ総ての分子またはイオンが求核試薬として働き得る。求核試薬は電子を供与するため、それらは定義上ルイス塩基である。本開示の１つの実施形態において、求核試薬は、硫黄求核試薬または窒素求核試薬のいずれかであり得る。

【0167】

用語「硫黄求核試薬」は、本明細書において使用する場合、少なくとも１つの硫黄原子を含んでなる求核試薬を指す。硫黄求核試薬の例としては、硫化水素およびその塩、チオール（ＲＳＨ）、チオレートアニオン（ＲＳ－）、チオールカルボン酸のアニオン（ＲＣ（Ｏ）－Ｓ－）、およびジチオカーボネートのアニオン（ＲＯ－Ｃ（Ｓ）－Ｓ－）およびジチオカルバメート（Ｒ ２Ｎ－Ｃ（Ｓ）－Ｓ－）が挙げられる。本開示の１つの実施形態において、硫黄求核試薬はメスナまたはＤＴＴである。

【0168】

用語「窒素求核試薬」は、本明細書において使用する場合、少なくとも１つの窒素原子を含んでなる求核試薬を指す。窒素求核試薬としは、アンモニア、アジド、アミン、ヒドラジン、および亜硝酸塩が挙げられる。本開示の１つの実施形態において、窒素求核試薬はヒドラジンである。

【0169】

用語「外因性求核試薬」は、本明細書において使用する場合、求核試薬が本開示の複合体またはスプリットインテインＣ末端断片の一部をなさないことを意味する。

【0170】

よって、本方法において、目的化合物はタンパク質またはポリペプチドであり、インテイン中間体を求核試薬と反応させて結合したインテインＮ末端断片およびＣ末端断片から目的ポリペプチドを遊離させ、それにより、求核試薬によって修飾されたＣ末端を有するタンパク質またはポリペプチドが得られる。この種の修飾は、求核試薬のタイプによって異なる。例えば、求核試薬がチオールである場合、修飾された目的ポリペプチドはα－チオエステルであり、これは次に、例えば、種々の求核試薬（例えば、薬物、ポリマー、別のポリペプチド、オリゴヌクレオチド）、またはＣ末端におけるタンパク質修飾のための周知のα－チオエステル化学を用いるその他の任意の部分でさらに修飾することができる。この化学法の１つの利点は、Ｃ末端のみがさらなる修飾のためにチオエステルで修飾され、従って、ポリペプチド中の他の酸性残基ではなくＣ末端のみでの選択的修飾を可能とすることである。目的化合物がタンパク質またはポリペプチドでない場合には、目的化合物は求核試薬と反応することができる部分、すなわち求電子試薬を有する。求核試薬と反応し得る好適な求電子試薬は、当分野で一般に知られている。

【0171】

特定の実施形態において、求核試薬は、本開示の第１の複合体とスプリットインテインＣ末端断片を接触させた後に反応に添加する。別の実施形態において、本開示の第１の複合体、スプリットインテインＣ末端断片および求核試薬は同時に接触させる。

【0172】

特定の実施形態において、この方法は、目的化合物と求核試薬のコンジュゲートを第２の外因性求核試薬と接触させることをさらに含んでなる。

【0173】

本明細書に開示される方法においてインテイン中間体とともに、または例えばα－チオエステルと反応する後続のまたは第２の求核試薬として使用される求核試薬は、好適な求核部分を有するいずれの化合物または材料であってもよい。例えば、チオエステルを形成するためには、チオール部分が求核試薬として企図される。場合によっては、チオールは、１，２アミノチオール、または１，２－アミノセレノールである。α－セレノチオエステルは、セレノチオール（Ｒ－ＳｅＨ）を使用することで形成することができる。企図される別の求核試薬としては、アミン（すなわち、アミドを直接得るためのアミノリシス）、ヒドラジン（ヒドラジドを得るため）、アミノ－オキシ基（ヒドロキサム酸を与えるため）が挙げられる。さらに、求核試薬は、目的ポリペプチドとのコンジュゲーションのための目的化合物内の官能基であってもよく（例えば、タンパク質－薬物コンジュゲートを形成するための薬物）、または代わりにアジドもしくはアルキン（２つの官能基間のクリック化学反応によるトリアゾールの形成のため）、テトラゾール、ａ－ケト酸、アルデヒドもしくはケトン、またはシアノベンゾチアゾールなどの後続の既知の生体直交反応のための追加の官能基を有してもよい。

【0174】

特定の実施形態において、スプリットインテインＮ末端断片は、配列番号１１１～１１３からなる群から選択される配列を含んでなるまたはからなる。

【0175】

特定の実施形態において、スプリットインテインＮ末端断片は、配列番号４９～６８からなる群から選択される配列またはその機能的に同等の変異体を含んでなるまたはからなる。

【0176】

ポリヌクレオチドを含んでなる組成物
別の側面において、本開示は、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・第１の目的ポリペプチド、および
・配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体、または配列番号７の配列もしくは配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
・第２の目的ポリペプチド
を含んでなる第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド、
あるいは、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・第１の目的ポリペプチド、および
・ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片もしくはその変異体、または配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・配列番号７の配列もしくは配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
・第２の目的ポリペプチド
を含んでなる第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド
を含んでなる組成物、以下、本開示の第２の組成物に関する。

【0177】

特定の実施形態において、変異体は機能的に同等の変異体である。

【0178】

用語「組成物」は、従前に定義されている。特定の実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、単一の製剤として第２のポリヌクレオチドとともに包装される。別の実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが別個に包装される。

【0179】

用語「ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬインテイン」は、従前に定義されている。特定の実施形態において、ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片は、配列番号１０１または１０２の配列を含んでなるまたはからなる。特定の実施形態において、ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片は、配列番号９９または１００の配列を含んでなるまたはからなる。

【0180】

特定の実施形態において、第１の目的ポリペプチドはタンパク質のＮ末端断片であり、第２の目的ポリペプチドは上記タンパク質のＣ末端断片、特定の実施形態においては、第１の目的ポリペプチドのＣ末端と第２の目的ポリペプチドのＮ末端を共有結合的に連結すると全長タンパク質が得られるように、２５ＫＤａより大きい、５０ＫＤａより大きいまたは１００ＫＤａより大きいタンパク質である。

【0181】

いくつかの実施形態において、第１の化合物および第２の化合物は、抗体、抗体鎖、または抗体重鎖であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗体または抗体のフラグメントである。特定の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗ＤＥＣ－２０５抗体の重鎖である。特定の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗ＤＥＣ－２０５モノクローナル抗体の重鎖である。特定の実施形態において、目的化合物は、Stevens et al., JACS 2016, 138: 2162-5に記載されているようにマウスαＤＥＣ－２０５モノクローナル抗体の重鎖である。

【0182】

特定の実施形態において、スプリットインテインＮ末端断片は、配列番号１１１～１１３からなる群から選択される配列を含んでなるまたはからなる。

【0183】

特定の実施形態において、スプリットインテインＮ末端断片は、配列番号４９～６８からなる群から選択される配列またはその機能的に同等の変異体を含んでなるまたはからなる。

【0184】

特定の実施形態において、スプリットインテインＣ末端断片は、配列番号１２１～１２４からなる群から選択される配列を含んでなるまたはからなる。

【0185】

特定の実施形態において、スプリットインテインＣ末端断片は、配列番号６９～８７からなる群から選択される配列またはその機能的に同等の変異体を含んでなるまたはからなる。

【0186】

特定の実施形態において、スプリットインテインＮ末端断片は、配列番号４９～６８からなる群から選択される配列またはその機能的に同等の変異体を含んでなるまたはからなり、スプリットインテインＣ末端断片は、配列番号６９～８７からなる群から選択される配列またはその機能的に同等の変異体を含んでなるまたはからなる。

【0187】

本開示の第２の組成物は、本開示の方法を用いて細胞において目的遺伝子を発現させるために使用することができる。

【0188】

目的遺伝子を発現させるための方法
別の側面において、本開示は、細胞において目的遺伝子を発現させるための方法、以下、
目的遺伝子を発現させるための第１の方法であって、
（ｉ）上記細胞を
（ａ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・第１の目的ポリペプチド、および
・配列番号１の配列または少なくとも９０％を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片もしくはその機能的に同等の変異体、または配列番号７の配列もしくは配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
・第２の目的ポリペプチド
を含んでなる第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド、
あるいは、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・第１の目的ポリペプチド、および
・ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片もしくはその機能的に同等の変異体、または配列番号１の配列もしくは少なくとも９０％を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド、および
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・配列番号７の配列もしくは配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
・第２の目的ポリペプチド
を含んでなる第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド
と接触させること、
（ｉｉ）上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質が生産されるように上記第１のポリヌクレオチドおよび上記第２のポリヌクレオチドを発現させること、ならびに
（ｉｉｉ）上記スプリットインテインＮ末端断片が上記スプリットインテインＣ末端断片と結合してインテイン中間体を形成し、上記インテイン中間体が反応して上記第１の目的ポリペプチドのＣ末端と上記第２の目的ポリペプチドのＮ末端を共有結合的に連結するように、上記第１の融合タンパク質と上記第２の融合タンパク質を接触させること
を含んでなる方法に関する。

【0189】

別の側面において、本開示は、目的遺伝子を発現させるための方法であって、
（ｉ）第１の細胞を、Ｎ末端からＣ末端へ向かって
・第１の目的ポリペプチド、および
・配列番号１の配列もしくは少なくとも９０％を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと接触させること、上記第１の融合タンパク質はシグナルペプチドを含んでなる、ならびに
（ｉｉ）第２の細胞を、Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片もしくはその機能的に同等の変異体、または配列番号７の配列もしくは配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
・第２の目的ポリペプチド
を含んでなる第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドと接触させること、上記第２の融合タンパク質はシグナルペプチドを含んでなる、
あるいは、
（ｉ）第１の細胞を、Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・第１の目的ポリペプチド、および
・ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片もしくはその機能的に同等の変異体、または配列番号１の配列もしくは少なくとも９０％を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと接触させること、上記第１の融合タンパク質はシグナルペプチドを含んでなる、ならびに
（ｉｉ）第２の細胞を、Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
・配列番号７の配列もしくは配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその機能的に同等の変異体、または配列番号１１４～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
・第２の目的ポリペプチド
を含んでなる第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドと接触させること、上記第２の融合タンパク質はシグナルペプチドを含んでなる、
（ｉｉｉ）上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質が生産および分泌されるように上記第１のポリヌクレオチドおよび上記第２のポリヌクレオチドを発現させること、ならびに
（ｉｖ）上記スプリットインテインＮ末端断片が上記スプリットインテインＣ末端断片と結合してインテイン中間体を形成し、上記インテイン中間体が反応して上記第１の目的ポリペプチドのＣ末端と上記第２の目的ポリペプチドのＮ末端を共有結合的に連結するように、上記第１の融合タンパク質と上記第２の融合タンパク質を接触させること、
を含んでなる方法に関する。

【0190】

用語「ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬインテイン」は、従前に定義されている。特定の実施形態において、ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＮ末端断片は、配列番号１０１または１０２の配列を含んでなるまたはからなる。特定の実施形態において、ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬスプリットインテインＣ末端断片は、配列番号９９または１００の配列を含んでなるまたはからなる。

【0191】

特定の実施形態において、第１の目的ポリペプチドはタンパク質のＮ末端断片であり、第２の目的ポリペプチドは上記タンパク質のＣ末端断片、特定の実施形態においては、第１の目的ポリペプチドのＣ末端と第２の目的ポリペプチドのＮ末端を共有結合的に連結すると全長タンパク質が得られるように２５ＫＤａより大きい、５０ＫＤａより大きいまたは１００ＫＤａより大きいタンパク質である。

【0192】

特定の実施形態において、第１の目的ポリペプチドまたは第２の目的ポリペプチドは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９の断片である。特定の実施形態において、第１の目的ポリペプチドは、Ｃａｓ９のＮ末端断片であり、第２の目的ポリペプチドは、Ｃａｓ９のＣ末端断片である。別の実施形態において、第１の目的ポリペプチドがＣａｓ９のＮ末端断片であり、第２の目的ポリペプチドがＣａｓ９のＣ末端断片である場合、Ｃａｓ９のＮ末端断片のＣ末端とＣａｓ９のＣ末端断片のＮ末端を共有結合的に連結すると、全長Ｃａｓ９タンパク質が得られる。

【0193】

いくつかの実施形態において、第１の化合物および／または第２の化合物は、抗体、抗体フラグメント、抗体鎖、または抗体重鎖であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗ＤＥＣ－２０５抗体の重鎖である。特定の実施形態において、目的ポリペプチドは、抗ＤＥＣ－２０５モノクローナル抗体の重鎖である。特定の実施形態において、目的化合物は、Stevens et al., JACS 2016, 138: 2162-5に記載されているようにマウスαＤＥＣ－２０５モノクローナル抗体の重鎖である。

【0194】

特定の実施形態において、スプリットインテインＮ末端断片は、配列番号１１１～１１３からなる群から選択される配列を含んでなるまたはからなる。

【0195】

特定の実施形態において、スプリットインテインＮ末端断片は、配列番号４９～６８からなる群から選択される配列またはその機能的に同等の変異体を含んでなるまたはからなる。

【0196】

特定の実施形態において、スプリットインテインＣ末端断片は、配列番号１２１～１２４からなる群から選択される配列を含んでなるまたはからなる。

【0197】

特定の実施形態において、スプリットインテインＣ末端断片は、配列番号６９～８７からなる群から選択される配列またはその機能的に同等の変異体を含んでなるまたはからなる。

【0198】

特定の実施形態において、スプリットインテインＮ末端断片は、配列番号４９～６８からなる群から選択される配列またはその機能的に同等の変異体を含んでなるまたはからなり、スプリットインテインＣ末端断片は、配列番号６９～８７からなる群から選択される配列またはその機能的に同等の変異体を含んでなるまたはからなる。

【0199】

細胞を第１のポリヌクレオチドおよび／または第２のポリヌクレオチドと接触させることは、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、リポフェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体の使用など、目的ポリヌクレオチドを細胞に導入することを可能とするためのいずれの好適な手段によって行ってもよい。本開示の目的遺伝子を発現させるための第１の方法において、細胞を第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドに同時に接触させるか、または第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドと任意の順序で順次接触させる、すなわち、細胞をまず第１のポリヌクレオチドに接触させ、次に第２のポリヌクレオチドに接触させることもできるし、またはまず第２のポリヌクレオチドに接触させ、次に第１のポリヌクレオチドに接触させることができると考えられる。

【0200】

宿主細胞として従前に定義されるいずれの細胞もこれらの方法において使用可能である。

【0201】

用語「シグナルペプチド」または「分泌シグナルペプチド」は、本明細書において使用する場合、比較的短い、一般に５～３０アミノ酸残基長で、細胞内で合成されたタンパク質を分泌経路に向けるペプチドを指す。シグナルペプチドは通常、二次αヘリックス構造を採る一連の疎水性アミノ酸を含む。さらに、多くのペプチドは、そのトランスロケーションに好適なトポロジーを採るタンパク質に寄与し得る正電荷を有する一連のアミノ酸を含む。シグナルペプチドは、そのカルボキシル末端にペプチダーゼによる認識のためのモチーフを有する傾向があり、これはシグナルペプチドを加水分解して遊離シグナルペプチドと成熟タンパク質を生じ得る。シグナルペプチドは、目的タンパク質が適当な場所に達したところで切断され得る。いずれの分泌シグナルペプチドも本開示において使用可能である。

【0202】

特定の実施形態において、シグナルペプチドは、第１の融合タンパク質中の第１の目的ポリペプチドのＮ末端に連結される。

【0203】

特定の実施形態において、シグナルペプチドは、第２の融合タンパク質中のスプリットインテインＣ末端断片のＮ末端に連結される。

【0204】

本発明を以下の実施例により説明するが、これらは本開示の範囲を限定するものではなく単に例示と見なされるべきである。

【実施例】

【0205】

材料および方法
材料
オリゴヌクレオチドおよび合成遺伝子はＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（コーラルビル、ＩＡ）から購入した。クローニング用のＰｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｈｏｔｓａｒｔ融合ポリメラーゼはＡｇｉｌｅｎｔ（ラホヤ、ＣＡ）から購入した。総ての制限酵素および２×Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（イプスウィッチ、ＭＡ）から購入した。クローニングおよびタンパク質発現に使用される高コンピテント細胞は、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｂｌ２１（ＤＥ３）化学コンピテント大腸菌およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、ＣＡ）から購入したサブクローニングエフィシェンシーＤＨ５αコンピテント細胞から作製した。ＤＮＡ精製キットは、Ｑｉａｇｅｎ（バレンシア、ＣＡ）から購入した。総てのプラスミドはＧＥＮＥＷＩＺ（サウス・プレインフィールド、ＮＪ）によって配列決定した。Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地、および総ての緩衝塩はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ピッツバーグ、ＰＡ）から購入した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、クーマシーブリリアントブルー、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、β－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ＤＬ－ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（メスナ）、５（６）－カルボキシフルオレセイン、およびサーモライシンは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミルウォーキー、ＷＩ）から購入した。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）およびイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は、Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（セントルイス、ＭＯ）から購入した。タンパク質精製のためにＲｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、ブランチバーグ、ＮＪ）を使用した。ニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）樹脂は、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ロックフォード、ＩＬ）から購入した。Ｆｍｏｃアミノ酸は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ダルムシュタット、ドイツ）またはＢａｃｈｅｍ（トーランス、ＣＡ）から購入した。Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ピスカタワ、ＮＪ）から購入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｈａｌｏｃａｒｂｏｎ（ノースオーガスタ、ＳＣ）から購入した。ＭＥＳ－ＳＤＳランニングバッファーは、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（アッシュランド、ＭＡ）から購入した。

【0206】

機器
分析逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）は、Ｃ１８ Ｖｙｄａｃカラム（５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）を備えたＨｅｗｌｅｔｔ－Ｐａｃｋａｒｄ １１００および１２００シリーズ機で行った。総てのＨＰＬＣ分析では、以下の溶媒を１ｍＬ／分の流速で使用した：水中０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）（溶媒Ａ）および０．１％ＴＦＡを含有する水中９０％アセトニトリル（溶媒Ｂ）。総てのペプチドおよびタンパク質を勾配：０％Ｂ ２分、その後、０～７３％Ｂ ３０分を用いて分析した。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）は、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ ＭｉｃｒｏＴＯＦ－Ｑ ＩＩ質量分析計で実施した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて、分取実施にはＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ７５ １６／６０カラム（カラム容量１２５ｍＬ）および分析実施にはＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ７５ １０／３００カラムを用いて実施した。ゲルはＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージャーを用いて画像化した。円偏光二色性実験は、Ｃｈｉｒａｓｃａｎ円偏光二色性分光計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ）にて実施した。細胞溶解は、Ｓ－４５０Ｄ Ｂｒａｎｓｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒを用いて実施した。ＮＭＲ実験は、５ｍｍ ＴＣＩ三重共鳴クライオプローブを備えたＢｒｕｋｅｒ ９００、８００、６００および５００ＭＨｚ分光計にて実施した。定常状態の蛍光測定は、Ｈｏｒｉｂａ Ｆｌｏｕｍａｘ ４蛍光計にて実施した。ストップフロー異方性測定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ ＳＸ２０ストップフロー分光計にて実施した。

【0207】

コンセンサスタンパク質の設計
ＡｃｅＬ ＴｅｒＬのホモログをＴｅｒＬ ＤＮＡ配列を用いたＮＣＢＩ（ヌクレオチドコレクション）およびＪＧＩデータベースでのメタゲノムデータのＢＬＡＳＴ検索によって同定した。これによりＡｃｅＬと高い配列同一性を有するＴｅｒＬ Ｎ－インテインおよびＣ－インテインが同定された（表１）。同族のＮ－インテインとＣ－インテインを一致させることができなかったため、スプリットインテインを２つの異なるデータセットとして処理し、別々に分析した。 次に、これらのスプリットインテインのＭＳＡをＪａｌｖｉｅｗ^４で生成し、コンセンサス配列を決定した。Ｎ－インテインのいくつかの位置では、ＡｃｅＬに存在しないループに相当するアラインメントからのさらなる残基がコンセンサス配列に含まれた。

【0208】

【表1】

【0209】

組換えＤＮＡのクローニング
合成遺伝子を購入し、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いてｐＥＴ－３０発現ベクターに導入した。標的突然変異は、Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＨＦポリメラーゼを用いる逆ＰＣＲを使用して導入した。総ての組換えプラスミドの同一性を配列決定によって確認し、対応するタンパク質配列を表２に示す。

【0210】

【表2】

【0211】

スプライシングアッセイのためのインテインの発現および精製
インテインの発現および精製は、従前に記載されているように実施した。発現したＮ－インテイン構築物は、以下の構造を含んでいた：Ｈｉｓ_６－ＳＵＭＯ－ＭＢＰ－ＥＦＥ－Ｉｎｔ^Ｎ、ここで、「Ｈｉｓ_６」は６×ポリヒスチジンアフィニティータグであり、「ＳＵＭＯ」はユビキチン様タンパク質ＳＭＴ３であり、「ＭＢＰ」はマルトース結合タンパク質であり、「ＥＦＥ」はＴｅｒＬインテインの野生型－１、－２、および－３ Ｎ－エクステイン配列であり、Ｉｎｔ^ＮはＮ－インテインである。発現したＣ－インテイン構築物は、以下の構造を含んでいた：Ｈｉｓ _６ －ＳＵＭＯ－Ｉｎｔ ^Ｃ －ＣＥＦＬ－ＧＦＰ、ここで、「Ｉｎｔ^Ｃ」はＣ－インテインであり、「ＣＥＦＬ」はＴｅｒＬインテインの＋１、＋２、＋３、および＋４ Ｃ－エクステイン残基であり、「ＧＦＰ」は緑色蛍光タンパク質である。エクステイン依存性のスクリーニングのために、「ＥＦＥ」または「ＣＥＦＬ」エクステイン配列に示されている各点突然変異に相当する構築物を使用した。

【0212】

大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をＭＢＰ－Ｉｎｔ^ＮまたはＩｎｔ^Ｃ－ＧＦＰインテインプラスミドで形質転換させ、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する１ＬのＬＢ中、３７℃で増殖させた。培養物がＯＤ_６００＝０．６に達したところで、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを加えて発現を誘導した（終濃度０．５ｍＭ、１８℃で１８時間）。ＳＵＭＯ－Ｃａｔ^Ｃ構築物の試験発現のために、ＩＰＴＧの添加時にも３７℃で３時間発現試験を行った。発現後、細胞を遠心分離（５，０００ｒｃｆ、３０分）によりペレットとし、－８０℃で保存した。

【0213】

次に、細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する３０ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）に再懸濁させた。細胞を音波処理（３５％振幅、８×２０秒パルスオン／３０秒オフ）によって溶解させた後、遠心分離（３５，０００ｒｃｆ、３０分）によりペレットとした。上清を４ｍＬのＮｉ－ＮＴＡ樹脂とともに４℃で３０分間インキュベートしてＨｉｓタグを有するインテインを結合させた。次に、このスラリーをフリット付きカラムに載せ、フロースルーを回収し、カラムを２０ｍＬ
の溶解バッファーで洗浄した。その後、タンパク質を２０ｍＬの溶出バッファー（溶解バッファー＋２５０ｍＭイミダゾール）でカラムから溶出させた。

【0214】

溶出したタンパク質を溶解バッファーに対して透析するとともに１０ｍＭ ＴＣＥＰおよびＵｌｐ１プロテアーゼで、４℃にて一晩処理してＨｉｓ_６－ＳＵＭＯ発現タグを切断した。次に、透析されたタンパク質を４ｍＬ Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂とともに４℃で３０分間インキュベートし、その後、これをフリット付きカラムに適用し、フロースルーを１０ｍＬの溶解バッファー洗液と一緒に回収した。次に、タンパク質を１０ｍＭ ＴＣＥＰで処理し、２ｍＬに濃縮し、脱気したスプライシングバッファー（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）を移動相として用いるＳ７５ １６／６０ゲル濾過カラムで精製した。画分を分析ＲＰ－ＨＰＬＣおよびＥＳＩ－ＭＳにより分析し（図１、表３）、すぐにスプライシングアッセイに用いるか、または液体窒素中で急速冷凍した後にグリセロール（２０％ｖ／ｖ）中で長期保存した。

【0215】

【表3】

【0216】

スプライシングアッセイ
スプライシングアッセイは、従前に記載されたプロトコール^８から適合させたものとして実施した。簡単に述べれば、Ｎ－インテインおよびＣ－インテイン（４μＭ Ｉｎｔ^Ｎ、４μＭ Ｉｎｔ^Ｃ）を個々に、２ｍＭ ＴＣＥＰを含むスプライシングバッファー（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中で１５分間プレインキュベートした。スプライシング反応を示された温度および尿素濃度で実施した。エクステインの特性評価のために、示しているエクステイン突然変異を含むＣａｔ^Ｃ－ＧＦＰおよびＭＢＰ－Ｃａｔ^Ｎタンパク質は、それらの同族野生型Ｎ－インテインまたはＣ－インテインで３０℃にてスプライシングした。尿素の存在下でのＣａｔおよびＡｃｅＬ^＊のスプライシングを３０℃で行った。スプライシングは等容量のＮ－インテインとＣ－インテインを混合することによって開始し、示された時間にアリコートを取り出し、４×ローディング色素（１６０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．０８％ブロモフェノールブルー、８％ＢＭＥ）を１：１で添加することによって急冷した。サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動により分析し（１２％ビス－トリス、６０分、１５０ｖ）、濃度計により定量した（図２および３）。

【0217】

トランススプライシング反応の動態分析
トランススプライシング反応のスプライシング速度を決定するために、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いてデータを一次速度方程式に当てはめた。

【数1】

【0218】

式中、［Ｐ］は生成物正規化強度であり、［Ｐ］_ｍａｘは反応プラトーであり、ｋは速度定数（ｓ^－１）である。各値の平均および標準誤差を報告する（ｎ＝３）。

【0219】

構造研究のためのインテインの発現
構造特性評価のために最小のエクステイン配列でＣａｔ^Ｃを単離するためには構築物の最適化が必要であった。大腸菌での組換え発現の際（１８℃、１６時間または３７℃３時間）、ＡｃｅＬ^＊ＣおよびＧＯＳ^Ｃに比べてＳＵＭＯ－Ｃａｔ^Ｃは収量増を示した（図４）。しかしながら、ＳＵＭＯ発現タグを除去すると、切断時にＣａｔ^Ｃの凝集が生じた（おそらく生理学的ｐＨ、ｐＩ＝７．２でのその中性荷電のため）。従って、溶液中でのタンパク質の溶解度を改善するために直接隣接するＣａｔ^Ｃに荷電残基、具体的には、Ｎ末端ＦＬＡＧエピトープタグおよび「ＣＥＳＲＧＫ」Ｃ－エクステイン配列を付加した（ＳＵＭＯ－Ｆｌａｇ－Ｃａｔ^Ｃ）。これらの構造研究に使用したＣａｔ^Ｎ構築物はＳＵＭＯ融合物（ＳＵＭＯ－Ｃａｔ^Ｎ）として発現され、ＳＵＭＯ切断後に最小の「ＥＦＥ」Ｎ－エクステインを含む。さらに、会合した複合体の構造分析中にスプライシングを防ぐために構築物に不活性化Ｃ１ＡおよびＮ１３４Ａ突然変異を含めた。構造研究のためのこれらのＣａｔ^ＮおよびＣａｔ^Ｃ構築物の発現および精製は、スプライシングのために使用したタンパク質に関して上記した通りに実施した。

【0220】

ＮＭＲ分光法で使用するために、同位体が濃縮されたＣａｔタンパク質の発現を従前に記載したように実施した。インテインプラスミドを用いてＢＬ－２１（ＤＥ３）細胞を形質転換させ、これらの細胞を５ｍＬ ＬＢ開始培養液物中で一晩増殖させた（３７℃、１８時間）。次に、開始培養物を回転沈降させた（４，０００ｒｃｆ、５分）。上清を廃棄した後、細胞を唯一の炭素および窒素源として^１３Ｃ－グルコースおよび^１５ＮＨ_４Ｃｌを添加した１ＬのＭ９培地（５０μｇ／ｍＬカナマイシン、３７℃）に再懸濁させ、増殖させた。細胞がＯＤ_６００＝０．６に達したところで、ＩＰＴＧを添加して発現を誘導した（０．５ｍＭ、１８時間、１８℃）。発現後、細胞を遠心分離（５，０００ｒｃｆ、３０分）によって回転沈降させ、－８０℃で保存した。インテイン構築物に関して上記した一般法を用いて精製を行った。精製されたタンパク質の質量は、Ｃａｔ^ＮおよびＣａｔ^Ｃの両タンパク質で９９％の同位体標識効率に相当する。

【0221】

ＮＭＲ分光法
ＮＭＲ実験は、遊離形態および複合体のＣａｔ^ＮおよびＣａｔ^Ｃを用いて実施した。ＮＭＲサンプルは、精製タンパク質を２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ６．８、３７℃）にバッファー交換することによって調製した。均一に標識された^１５Ｎ、^１３Ｃ、^１Ｈタンパク質を終濃度が約３００～６００μＭとなるように濃縮した。図３Ａ、３Ｂに示す複合体のＨＳＱＣ実験に関して、同位体で標識したインテイン断片を相補的非標識インテイン溶液と１：１．５比で混合し、遊離タンパク質と同様の終濃度まで濃縮し、直接測定した。構造決定のために、同位体で標識したインテイン断片を１．５：１のＣａｔ^Ｎ：Ｃａｔ^Ｃ比で混合した。この複合体をサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製して遊離形態を除去した。

【0222】

実験は、６００、７００、８００または９００ＭＨｚの電界強度で実施し、要すれば非均一サンプリング(Non-Uniform Sampling)（ＮＵＳ）取得を採用した。ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ Ｔｏｐｓｐｉｎ ３．０またはＮＭＲ Ｐｉｐｅソフトウエアを用いて処理し、ＮＵＳスペクトルは、ｑＭＤＤを用いた圧縮センシングによって再構築した。

【0223】

化学シフトの割り当て
主鎖化学シフトは、ＨＮＣＯ、ＨＮ（ＣＡ）ＣＯ、ＨＮＣＡＣＢ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ三重共鳴実験を使用して割り当てた。側鎖の割り当ては、Ｈ（ＣＣ）（ＣＯ）ＮＨ、（Ｈ）ＣＣ（ＣＯ）ＮＨ、Ｈ（Ｃ）ＣＨ－ＴＯＣＹおよび（Ｈ）ＣＣＨ－ＴＯＣＳＹ実験から得た。芳香族の割り当てはＣＴ－^１３Ｃ分解［^１Ｈ，^１Ｈ］－ＮＯＥＳＹ（混合時間＝１００ｍｓ）、（ＨＢ）ＣＢ（ＣＧＣＤ）ＨＤおよび（ＨＢ）ＣＢ（ＣＧＣＤＣＥ）ＨＥ実験から得た。手動による化学シフトの割り当ておよびその他のデータ分析のためには、ＣｃｐＮｍｒ分析ソフトウエアを使用した。化学シフト値のバリデーションを行い、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｂａｎｋ（ＢＭＲＢ Ｎｏ：３０４８０）に寄託した。ランダムコイル化学シフトは、ＣｃｐＮｍｒ分析を用いて計算した。

【0224】

スピン弛緩の測定
^１５Ｎスピンのスピン－スピン弛緩（Ｒ_２）速度（混合時間０、１７、３４、５１、８５、１１９、１７０、２５５、３４０、５１０、６８０ｍｓ）および［^１５Ｎ－^１Ｈ］ＮＯＥ実験を６００ＭＨの電界強度で測定した。

【0225】

構造決定
二面角拘束は、ＴＡＬＯＳソフトウェアを使用して化学シフトから計算した^１３。ＮＯＥクロスピークは、^１５Ｎ分解［^１Ｈ，^１Ｈ］－ＮＯＥＳＹ実験（混合時間＝８０ｍｓ）、^１３Ｃ分解［^１Ｈ，^１Ｈ］－ＮＯＥＳＹ実験（混合時間＝８０ｍｓ）、ＣＴ－^１３Ｃ分解芳香族［^１Ｈ，^１Ｈ］－ＮＯＥＳＹ実験（混合時間＝１００ｍｓ）から選択し、ＡＲＩＡおよびＣＮＳソフトウエアを用いて自動的に割り当てた。割り当ておよび構造計算は８サイクルで行い、各ステップで２０の構造を計算した。割り当てられたＮＯＥを手動で確認し、違反分析を行った。確認済みのＮＯＥピークリストを用いて距離制限を生成した。３，２８３の明確な拘束、２０６の曖昧な拘束および１８０の二面角拘束を用いて、最終的に２５６の構造を計算した。２０の最小エネルギー構造を選択し、水の精密化を行った。構造のバリデーションを行い。タンパク質データバンク(Protein Data Bank)（ＰＤＢ ＩＤ：６ＤＳＬ）に寄託した。

【0226】

円偏光二色性（ＣＤ）
Ｃａｔ^Ｎ、Ｃａｔ^Ｃ、およびＣａｔ^ＮとＣａｔ^Ｃの１：１複合体をＣＤバッファー（２５ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．２）に対して透析した。ＣＤスペクトルを光路長１ｍｍのキュベットにて２５℃で測定した（１０μＭサンプル濃度）。

【0227】

分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
分析ＳＥＣ実験は、Ｓ７５ １０／３００カラムにて、４℃、スプライシングバッファー（２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．２）中で行った。総ての分析で、ＵＶ吸光度を２１４ｎｍでモニタリングした。サンプルはサンプル容量５００μＬ（２５μＭ）で注入し、流速０．５ｍＬ／分で溶出させた。

【0228】

制限タンパク質分解
ＥＦＥ－Ｃａｔ^Ｎ、Ｆｌａｇ－Ｃａｔ^Ｃ、およびＥＦＥ－Ｃａｔ^ＮとＦｌａｇ－Ｃａｔ^Ｃの１：１複合体をサーモライシンバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．４）に対して透析し、１０μＭの濃度まで希釈した。サーモライシン粉末（Ｓｉｇｍａ）をサーモライシンバッファーで溶解させて０．４ｍｇ／ｍＬとしたものを調製し、各溶液に添加した（１：５０ｖ／ｖ）。示された時点で、アリコートを取り出し、８ＭグアニジンＨＣＬ ４％ＴＦＡを１：３で添加して急冷した。次に、これらのサンプルをＲＰ－ＨＰＬＣおよびＥＳＩ－ＭＳによって分析した。各ピークからの質量をＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ＵＣＳＦ）から得られたインテインの推定切断生成物と比較した。

【0229】

結合実験のためのインテインの生産
フルオレセイン標識Ｃａｔ^Ｎ（Ｆｌ－Ｃａｔ^Ｎ）ペプチドを、標準的な９－フルオレニルメチル－オキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって合成した。ペプチドの最後のアミノ酸を結合した後、Ｎ末端を５（６）－カルボキシフルオレセインでキャップした。合成されたＦｌ－Ｃａｔ^Ｎペプチドを分取ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製し、分析ＲＰ－ＨＰＬＣおよびＥＳＩ－ＭＳによって特性評価した。結合実験のために発現させたＣ－インテインは、上記で詳細に示したＳＵＭＯ－Ｆｌａｇ－Ｃａｔ^Ｃ構築物であった。Ｕｌｐ１消化を行う代わりに、発現させたＳＵＭＯ－Ｆｌａｇ－Ｃａｔ^Ｃタンパク質はそのまま、Ｎｉ－ＮＴＡ濃縮の後にＳ７５ １６／６０ゲル濾過カラムで精製した。

【0230】

定常状態蛍光異方性
平衡測定は、低塩バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）および高塩バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）中で、所与の濃度のＳＵＭＯ－Ｆｌａｇ－Ｃａｔ^Ｃ（０ｐＭ～２，５００ｐＭ）とともに５００ｐＭ Ｆｌ－Ｃａｔ^Ｎを用いて実施した。タンパク質を保存溶液から所望の濃度に希釈し、２５℃で３０分間インキュベートした。サンプルを光路長１ｃｍのキュベットに移し、すぐに蛍光異方性を測定した。一部位結合方程式の定数を、ＭＡＴＬＡＢの非線形最小二乗曲線フィッティング法を用いて得た。高塩条件および低塩条件の両方で、これらのフィットから得られた定数（表４）は、測定に使用したＣａｔ^Ｎの濃度を下回った。よって、本発明者らは、より低濃度のＣａｔ^Ｎで蛍光異方性を測定することができなかったので、Ｋ_ｄを＜５００ｐＭと報告する。

【0231】

【表4】

【0232】

ストップフロー蛍光異方性
ストップフローシリンジにＦｌ－Ｃａｔ^ＮおよびＳＵＭＯ－Ｆｌａｇ－Ｃａｔ^Ｃタンパク質溶液を終濃度が１００ｎＭ Ｃａｔ^Ｎおよび示された濃度のＣａｔ^Ｃ（２００、３２５、５００、７５０、１０００ｎＭ）となるように充填した。異方性値の変化を低塩バッファーおよび高塩バッファー中で５０秒間測定した。異方性の経時的変化をＭＡＴＬＡＢの非線形最小二乗曲線フィッティング法を用いて従前に報告されている二重指数速度論モデルに当てはめて、各濃度について結合速度定数（ｋ_ｏｂｓ１およびｋ_ｏｂｓ２）を得た^１６。次に、ｋ_ｏｂｓ１値およびｋ_ｏｂｓ２値をＣａｔ^Ｃ濃度の関数としてプロットし、直線に当てはめ、直線の傾きをｋ_ｏｎと解釈した。

【0233】

結果
１．安定性および活性が増強されたコンセンサス非定型スプリットインテインの設計
断片会合の機構を決定するために、最少のエクステイン残基を有する非定型スプリットインテインを単離した。スプライシング速度がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて特徴付けられた両方の天然に存在する非定型スプリットインテインは、メタゲノムシーケンシングデータから、Ｔ４－バクテリオファージ型ＤＮＡパッケージングターミナーゼ大サブユニット（ＴｅｒＬ）内に同定された。南極の塩水部分循環エース湖からの第１のものは（ＡｃｅＬ）、８℃で最適スプライシング速度を示す（ｔ１／２＝７分）。さらに、定向進化により、３７℃で活性を増す（ｔ１／２＝６分）ＡｃｅＬ内の安定化突然変異（ＡｃｅＬ^＊）が見出された。２番目に特徴付けられた非定型スプリットインテインは、グローバル・オーシャン・サンプリング・プロジェクト（ＧＯＳ）においてプンタ・コルモラント(Punta Cormorant)から採取されたサンプルで配列決定され、最適温度３０℃でスプライスする（ｔ１／２＝３分）。大腸菌での発現からの可溶性ＧＯＳ^Ｎ（すなわち、Ｎ末端ＧＯＳインテイン断片）、ＧＯＳ^Ｃ、またはＡｃｅＬ^＊Ｃの精製は、大きな安定化エクステインタンパク質によって行った（図４）。カオトロピック剤を用いた不溶性封入体画分から可溶化エクステインを欠く非定型スプリットインテインの抽出は、再折りたたみの際の凝集問題のために上手くいかなかった。

【0234】

コンセンサス設計は、安定化突然変異を予測するために相同タンパク質配列からの進化情報を利用するタンパク質工学的戦略であり、活性の高い耐熱性天然スプリットＤｎａＥインテイン（Ｃｆａ）を作製するためにこれまでに適用されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ構造特性評価に適した非定型スプリットインテインを作出しようと、ＪＧＩおよびＮＣＢＩデータベースにおけるメタゲノム配列決定情報のＢＬＡＳＴ検索から発見されたＴｅｒＬ^ＮおよびＴｅｒＬ^Ｃインテインのマルチプル配列アラインメント（ＭＳＡ）からコンセンサス非定型（Ｃａｔ）ＴｅｒＬインテインを設計した（表１）。Ｃａｔ^Ｎ（６０％）およびＣａｔ^Ｃ（６４％）は両方ともそれぞれＡｃｅＬ^＊ＮおよびＡｃｅＬ^＊Ｃとの高い配列類似性を含み、非同一残基は一次配列中に分散していた（図５）。Ｃａｔインテイン対を単離し、そのｉｎ ｖｉｔｒｏトランススプライシング活性を測定するためにモデルエクステインに融合した（表５）。Ｃａｔは、超高速のスプライシング活性を示し（３０℃でｔ_１／２＝５９ｓ）、一連の温度で一貫してＡｃｅＬ^＊を上回る（図５）。さらに、Ｃａｔは、ＡｃｅＬ^＊がスプライスできない温度である５０℃でも活性を維持する。ＰＴＳはまた、凝集しやすいエクステイン断片を可溶化させるためによく使用されるカオトロピック剤の存在下でも測定した。１ Ｃａｔはカオトロピック安定性の増強を示し、２Ｍおよび４Ｍ尿素の両方でスプライス可能であり（図５、表６）、一方、ＡｃｅＬ^＊はこれらの条件の両方の下で不活性である。悪条件下での加速されたスプライシング速度と活性は、Ｃａｔをこれまでに報告された最も速く、最も堅牢な非定型スプリットインテインとして確立し、従って、タンパク質の合成Ｎ末端修飾のツールとして役立つはずである。

【0235】

【表5】

【0236】

【表6】

【0237】

２．断片のアセンブリは無秩序型から秩序型への構造遷移を誘導する
非定型スプリットインテインの会合過程を検討するために、最小エクステインを保持するＣａｔ^ＮおよびＣａｔ^Ｃを同位体濃縮培地（^１５Ｎ、^１３Ｃ）中で発現させ、精製し、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法によって分析した。これらの構築物には、複合体の構造分析中にスプライシングを防ぐために不活性化Ｃ１ＡおよびＮ１３４Ａ突然変異も含めたことに留意されたい。単独のＣａｔ^Ｎの^１Ｈ－^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルは、^１Ｈ次元に最小の分散を示し、これは無秩序なタンパク質に共通の現象で、Ｓｓｐ^ＣおよびＮｐｕ^Ｃに関してこれまでに見られている（図６）。非標識Ｃａｔ^Ｃを添加するとスターク遷移が起こり、よく分散した^１Ｈ－^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルが得られるが、これはＣａｔ^Ｎの折りたたみと一致している（図６）。さらに、Ｃａｔ^Ｎにおける^１Ｈ－^１５Ｎヘテロ核ＮＯＥ、スピン－スピン弛緩速度、およびＣα－Ｃβ化学シフト摂動の測定により、Ｃａｔ^Ｃの結合時の、Ｃａｔ^Ｎの無秩序型から秩序型への遷移のさらなる証拠が得られる（図７）。単独のＣａｔ^Ｃの^１Ｈ－^１５Ｎ ＨＳＱＣは、そのタンパク質の残基数から予想されるよりもはるかに少ないクロスピークを示し、これは化学交換を受けている動的タンパク質に存在する特徴であり、ＳｓｐＮおよびＮｐｕＮの両方でこれまでに見られたものである（図６）。非標識Ｃａｔ^Ｎの添加は、新たなクロスピークの出現をもたらし、これはより秩序的な複合体への遷移を示す（図６）。遊離形態のＣａｔ^Ｃのスペクトルの質のために本発明者らはタンパク質の割り当てができなかったが、いくつかのクロスピークは結合型で見られたものとオーバーラップし、このことは、遊離形態と結合形態のＣａｔ^Ｃは部分的な構造同一性を有することを示唆する。

【0238】

ＮＭＲ研究と一致して、円偏光二色性分光法による分析は、非結合型のＣａｔ^Ｎは二次構造を抽出する傾向があってあまり構造化されず、Ｃａｔ^ＮおよびＣａｔ^Ｃインテインは両方とも会合時に構造遷移を受けることを示す（図６）。Ｃａｔ^Ｃはより小さい分子量を有するにもかかわらず結合した複合体よりも速く溶出するので、結合時の折りたたみのさらなる証拠はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって得られた（図６）。ＳＥＣ溶出プロファイルは、その同族インテインが結合した際のＣａｔ^Ｃの圧縮と一致している。

【0239】

３．非定型スプリットインテイン複合体の溶液構造
同位体が濃縮されたＣａｔ^ＮおよびＣａｔ^Ｃタンパク質を複合体に組み立て、その構造をＮＭＲ分光法から得られた距離制限および二面角拘束から計算した。構造計算から得られた２０の最低エネルギーの立体配座異性体を示す（図８Ａ、ＰＤＢ ＩＤ：６ＤＳＬ）。この構造アンサンブルは、タンパク質の総ての領域（Ｃａｔ^Ｃおよびエクステイン内の短い溶解性タグを除く）で正確であり、平均構造に対する平均主鎖ＲＭＳＤは１．１９Åである（表７）。タンパク質の構造化された領域で、＜０．５Åの残基的主鎖ＲＭＳＤ値が得られた（図９Ａおよび９Ｂ）。Ｃａｔの構造は主としてβ－シートであり、Ｃａｔ^ＮのＣ末端に存在する最後の８残基が唯一のα－ヘリックスである（図８）。それはＨＩＮＴドメインを含むタンパク質に典型的な馬蹄形構造を有する。Ｃａｔの構造は、Ｎｐｕ（ＰＤＢ ＩＤ：２ＫＥＱ、アラインされた９２のＣα原子にわたってＲＭＳＤ １．４５Å）およびＳｓｐ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＺＤＥ、アラインされた９０のＣα原子にわたってＲＭＳＤ １．３４Å）などのＤｎａＥインテインの構造と類似している（ただし、ＮｐｕおよびＳｓｐは付加的なヘリックスを有し、これはＣａｔには存在しない）。

【0240】

Ｃａｔ活性部位において、セリン残基（Ｓｅｒ_７５）は、カノニカルなＴＸＸＨ Ｂ－ブロックモチーフに位置するトレオニンに置き換わっている（図９Ｃ）。Ｃ１Ａのカルボニル酸素は、Ｓｅｒ７５のアミドプロトン（２．４Å）およびヒドロキシルプロトン（３．７Å）に近接している（図８Ｃ）。ＤｎａＥインテインのトレオニン残基は類似の立体配座を採り、Ｓｅｒ７５がＮ末端の切れやすいペプチド結合の切断を補助するトレオニンの役割を果たしていることが示唆される。構造上のもう１つの注目すべき特徴がＦ－ブロックヒスチジンの欠如であり（図９Ｃ）、従って、分岐のある中間体の分解能は、最後から２番目のＧ－ブロックヒスチジン（Ｈｉｓ１３３）によって媒介される可能性がある。

【表7】

【0241】

４．Ｃａｔにおける無秩序局在のマッピング
Ｃａｔにおける局部構造の分布を検討するためにサーモライシン消化による制限タンパク質分解を適用した（図１０Ａ）。単独で、Ｃａｔ^Ｎは急速分解を受けるが、Ｃａｔ^Ｃは、タンパク質分解に対してやや大きい耐性を示す。しかしながら、インテイン複合体は３０分後に無傷のままであった。見られたプロテアーゼ感受性の変動は、大部分無秩序なＣａｔ^Ｎ、部分的に無秩序なＣａｔ^Ｃ、および結合時の球状の折りたたみの形成と一致している。本発明者らは、次に、タンパク質分解から保護される領域（局在構造要素に相当するはずである）を決定するためにエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）を用いて切断生成物（ｔ＝３０分）を調べた（図１１、表８）。Ｃａｔ^Ｎでは、切断部位は一次配列中に一様に分散していると思われた。これに対して、Ｃａｔ^Ｃの大部分はタンパク質分解に対して耐性がある。残基５７～１１２を中心とする無傷断片に相当する多くのピークが見られ、これはこの領域を無秩序なＮ末端およびＣ末端ペプチドによって挟み込まれた構造化領域として指し示す（図１０Ｂ）。このモデルをＣａｔの構造上にマッピングすると、Ｃａｔ^ＣのＮ末端およびＣ末端がＣａｔ^Ｎと直接相互作用することが示される（図１０Ｃ）。さらに、スクシンイミド形成のための重要な触媒残基（Ａｓｐ１１５、Ｈｉｓ１３３、およびＡｓｎ_１３４）は、Ｃａｔ^Ｃの無秩序領域内に存在する。

【0242】

【表8】

【0243】

５．アセンブリは主として疎水性相互作用によって誘導される
スプリット形態におけるＣａｔ断片の構造特性を調べた後に、会合を引き起こす分子成分の同定をしようとした。Ｃａｔ^ＮおよびＣａｔ^Ｃの一次配列は電荷の分離を示すが、Ｃａｔ^Ｎ－Ｃａｔ^Ｃの結合表面は疎水性残基に富む（図１２ＡおよびＢ）。複合体では、Ｃａｔ^ＮおよびＣａｔ^Ｃの両方の荷電残基は、タンパク質の外部に向かって排除されるが、疎水性残基は結合界面にクラスター化する（図１３ＡおよびＢ）。これらの疎水性相互作用が複合体の形成を誘導することを確認するために、断片会合に及ぼすバッファーのイオン強度の影響を、蛍光異方性に基づく結合アッセイを用いて評価した。Ｎ末端フルオレセインを含むＣａｔ^Ｎ（Ｆｌ－Ｃａｔ^Ｎ）を固相ペプチド合成によって合成し、ＳＵＭＯ－Ｃａｔ^Ｃ融合タンパク質と会合した際の蛍光異方性の増大を観察した（図１２Ｃ）。この異方性の増大は、非結合Ｃａｔ^Ｎと比べた場合のＣａｔ複合体の回転相関時間の予想される増大を一致し、Ｃａｔ複合体形成の尺度として使用した。他のスプリットインテインと同様に、Ｃａｔ^ＮおよびＣａｔ^Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて高い結合アフィニティーを示し、Ｋｄ値は、このアッセイの検出限界であった５００ｐＭを下回った（表９）。重要なこととして、Ｃａｔ複合体形成の結合等温線は少なくともバッファーのイオン強度の変化によって摂動し、疎水性相互作用によって引き起こされる会合過程と一致する。

【0244】

次に、Ｆｌ－Ｃａｔ^ＮとＳＵＭＯ－Ｃａｔ^Ｃの間の結合の速度をストップフロー蛍光によってモニタリングし、そのデータは二重指数関数モデルに最もよく当てはまることが分かった（図１３Ｃ）。決定された両速度定数（ｋｏｂｓ１およびｋｏｂｓ２）は濃度依存性を示し、計算値は、低塩条件下でｋｏｎ１（２．８０±０．２８）×１０６ Ｍ－１ ｓ－１およびｋｏｎ２（０．１６±０．０１９）×１０６ Ｍ－１ ｓ－１、高塩条件下でｋｏｎ１（２．３４±０．３０）×１０６ Ｍ－１ ｓ－１およびｋｏｎ２（０．１８±０．０１６）×１０６ Ｍ－１ ｓ－１となる（図１２Ｄ、表４）。このモデルは、インテインの異なる立体配座異性体から並行会合事象が進行する可能性があり、立体配座異性体のサブセットは速度論的に識別可能であることを示唆する。さらに、ｋｏｂｓ１およびｋｏｂｓ２はどちらも、総ての測定されたＣａｔ^Ｃ濃度でバッファーイオン強度によって摂動しないという所見は、会合が主として疎水性相互作用によって引き起こされるということをさらに示唆する。

【0245】

【表9】

【0246】

６．Ｃａｔのエクステイン依存性
これまでに、特性評価した総てのインテインが、隣接エクステイン残基に依存するスプライシング速度を示す。天然エクステイン配列からの逸脱は多くの場合スプライシングを減速し、その結果、ＰＴＳの適用を制限し得る。ＴｅｒＬインテインのエクステイン依存性はまだ十分に特性評価がなされていないことから、本発明者らは、天然残基とは電荷および立体的嵩の異なる置換を導入することによってＣａｔの配列好選性を特定しようとした（図１４Ａ）。天然Ｃ－エクステインからの、Ｃｙｓ＋１、Ｇｌｕ＋２、Ｐｈｅ＋３の置換を＋２および＋３の位置に導入し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイした（図１４Ｂ、表１０）。Ｃａｔは顕著なＣ－エクステイン無差別性を示し、１～３分の範囲の半減期でスプライシングを行う。Ｃ－エクステイン置換に対するこの広い許容は、従前に無差別な活性を有するように設計されたＮｐｕの操作バージョンよりもさらに優れている。このＣ－エクステイン置換に対する許容性とは異なり、Ｃａｔは－１残基の同一性にスターク依存性を示し、この位置へのアラニン（ｔ１／２＝５４分）、グリシン（ｔ１／２＝１４６分）、またはプロリン（ｔ１／２＝１５８分）の挿入から活性の低下が生じる（図１４Ｃ、表１０）。評価されたｉｎ ｖｉｔｒｏエクステイン依存性はおそらくＣａｔ複合体の溶液構造に見られる相互作用によって説明される。Ｇｌｕ＋２およびＰｈｅ＋３はいずれも、活性部位触媒残基との接触が最小であると思われ、実験的に見られたＣ－エクステイン無差別性と一致する（図１４Ｄ）。興味深いことに、Ｇｌｕ＋２は、Ｆ－ブロックヒスチジンの代わりに存在するＡｓｎ１２３と接触する。これに対して、Ｇｌｕ－１は、チオエステル形成に関与する２つの保存されている残基Ｓｅｒ７５およびＨｉｓ７８と直接相互作用する（図１４Ｅ）。従って、Ｎ－エクステイン置換は、Ｓｅｒ７５およびＨｉｓ７８のタンパク質スプライシング触媒能に直接干渉し得る。

【0247】

【表10】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【配列表】

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