ホーム > 特許ランキング > ＬＥＭＯＮＥＸ ＩＮＣ．
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-31
(45)【発行日】2024-11-11
(54)【発明の名称】アトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7105 20060101AFI20241101BHJP
A61K 9/16 20060101ALI20241101BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20241101BHJP
A61K 47/04 20060101ALI20241101BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20241101BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20241101BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20241101BHJP
A61P 17/04 20060101ALI20241101BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20241101BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241101BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20241101BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241101BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20241101BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7105
A61K9/16
A61K31/713
A61K47/04
A61P11/02
A61P11/06
A61P17/00
A61P17/04
A61P27/02
A61P29/00
A61P37/08
A61P43/00 111
C12N15/113 Z ZNA
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2021505844
(86)(22)【出願日】2019-08-01
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-12-02
(86)【国際出願番号】 KR2019095028
(87)【国際公開番号】W WO2020027641
(87)【国際公開日】2020-02-06
【審査請求日】2021-02-02
【審判番号】
【審判請求日】2022-11-01
(31)【優先権主張番号】62/714,628
(32)【優先日】2018-08-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】10-2019-0093707
(32)【優先日】2019-08-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】517022072
【氏名又は名称】レモネックス インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＬＥＭＯＮＥＸ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】（ＤＭ Ｔｏｗｅｒ， Ｂａｎｇｂａｅ－ｄｏｎｇ） １０３， Ｂａｎｇｂａｅ－ｒｏ， Ｓｅｏｃｈｏ－ｇｕ， Ｓｅｏｕｌ ０６６８３ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100137095
【弁理士】
【氏名又は名称】江部 武史
(72)【発明者】
【氏名】ウォン， チョル ヘ
【合議体】
【審判長】原田 隆興
【審判官】前田 佳与子
【審判官】田中 耕一郎
(56)【参考文献】
【文献】韓国公開特許第１０－２０１６－００１６４７５（ＫＲ，Ａ）
【文献】特開２０１７－１２７３３３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１１－１２１８１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００８－５３８２１７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００８－５１２１５１（ＪＰ，Ａ）
【文献】Ｓｍａｌｌ，２０１２年，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．１１，ｐ．１７５２－１７６１
【文献】Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１７年，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４７，ｐ．１－１３
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
A61K31/00-33/44
A61K47/00-47/69
A61K39/395
A61P1/00-43/00
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を気孔内部に担持した多孔性シリカ粒子；を含み、前記多孔性シリカ粒子は、前記核酸分子を担持する前に下記数式１の吸光度の比が１／２となるｔが２４以上であり、
前記多孔性シリカ粒子は、前記核酸分子を担持する前に、前記多孔性シリカ粒子の平均直径が１５０ｎｍ～１，０００ｎｍであり、前記多孔性シリカ粒子のＢＥＴ表面積は２００ｍ ２ ／ｇ～７００ｍ ２ ／ｇであり、前記多孔性シリカ粒子の気孔のｇ当たりの体積は０．７ｍｌ～２．２ｍｌであり、
前記多孔性シリカ粒子は、前記核酸分子を担持する前に前記気孔内部が中性のｐＨで陽電荷を帯びる、アトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
[数式１]
Ａｔ／Ａ０
（式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した前記多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
前記懸濁液のｐＨは７．４であり、
Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した前記多孔性シリカ粒子の吸光度である。）
【請求項2】
前記核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＰＮＡまたはｍｉＲＮＡのいずれか一つである、請求項１に記載のアトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【請求項3】
前記核酸分子は、配列番号１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号４７の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号２の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号４８の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２５の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号３の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号４９の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２６の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号４の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５０の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２７の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号５の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５１の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２８の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号６の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５２の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２９の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号７の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５３の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３０の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号８の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５４の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３１の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号９の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５５の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３２の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１０の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５６の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３３の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５７の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１２の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５８の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３５の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１３の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５９の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３６の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１４の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６０の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３７の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１５の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６１の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３８の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１６の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６２の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３９の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１７の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６３の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号４０の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１８の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６４の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号４１の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１９の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６５の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号４２の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号２０の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６６の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号４３の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号２１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６７の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号４４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号２２の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６８の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号４５の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号２３の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６９の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ及び配列番号４６の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ；からなる群より選択される少なくとも一つのｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む、請求項２に記載のアトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【請求項4】
前記センスＲＮＡ及び前記アンチセンスＲＮＡ配列の３’末端にＵＵの配列をさらに含むものである、請求項３に記載のアトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【請求項5】
前記センスＲＮＡ及び前記アンチセンスＲＮＡ配列の３’末端にｄＴｄＴの配列をさらに含むものである、請求項３に記載のアトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【請求項6】
前記核酸分子は、配列番号１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号４７の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１４の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６０の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３７の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号２１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６７の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ及び配列番号４４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ；からなる群より選択される少なくとも一つのｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む、請求項３に記載のアトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【請求項7】
前記核酸分子は、配列番号１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号４７の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡまたは配列番号２４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡを含む、請求項６に記載のアトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【請求項8】
前記多孔性シリカ粒子は、親水性または疎水性の官能基を有するものである、請求項１に記載のアトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【請求項9】
前記アトピー性疾患は、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、掻痒症および食物アレルギーからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１に記載のアトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、優れたアトピー性疾患の予防または治療効果を有する薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
アトピー性皮膚炎は、慢性のかゆみと皮膚の炎症症状を伴う難治性疾患である。アトピー性皮膚炎とじんましんの臨床的症状の最も大きな違いは、かゆみを誘発するメカニズムの違いに起因する。一般的にじんましんのかゆみは、肥満細胞から分泌されるヒスタミンによって媒介されるので、抗ヒスタミン薬で治療が可能であるが、アトピー性皮膚炎のかゆみは、ヒスタミンの他にも様々な免疫炎症反応によって媒介されるので、抗ヒスタミン薬だけではかゆみの症状さえも効果的に調節することができない。したがって、アトピー性疾患の効果的な治療のためには、免疫反応によって媒介されるかゆみを癒すことが非常に重要である。
【0003】
ＴＳＬＰ（thymic stromal lymphopoietin）は、アトピー性疾患の慢性炎症反応によって皮膚上皮細胞であるケラチン細胞（keratinocytes）から多く分泌され、慢性のアトピー性皮膚炎患者の複合喘息患者への進行を媒介する重要な因子である。また、皮膚上皮細胞から分泌されたＴＳＬＰは、ＴＲＰＡ－１陽性－体性感覚ニューロンを活性化させてかゆみを誘発する。前記ＴＳＬＰのすべての機能の詳細は知られていないが、最近の研究結果によると、ＴＳＬＰの発現は、病理学的、免疫学的、そして分子生物学的にアトピー性皮膚炎及び／又は喘息疾患などのアトピー性疾患と関連しているところ、ＴＳＬＰは美容、治療、薬剤学的に重要な因子と考えられる。
【0004】
ＴＳＬＰの発現抑制のために、化学的治療方法のようにアンチセンス核酸を用いるか、または干渉ＲＮＡとして知られている方法を利用することができる。また、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）オリゴヌクレオチドとｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いることができる。
【0005】
一方、現在までｓｉＲＮＡの送達のために、陽イオン性高分子、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ウイルスおよび様々なナノ物質が開発された。陽イオン性高分子とＬＮＰの臨床的適用は、生体内構造の毒性及び／又は不安定性に注意する必要があり、ウイルス性の遺伝子の送達は、低い包装能力のほか突然変異誘発の問題がある。ｓｉＲＮＡバックボーンの化学的変形は、安定性と細胞吸収を増加させることができるが、依然として、高コスト、労働集約性、時間のかかる工程、及び標的細胞での満足できる効果を得るための多量のｓｉＲＮＡ投与のような欠点を有している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、ＴＳＬＰの発現を高効率で抑制し、優れたアトピー性疾患の予防または治療効果を有する組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
１．ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を担持した多孔性シリカ粒子；を含み、
前記多孔性シリカ粒子は、下記数式１の吸光度の比が１／２となるｔが２４以上である、アトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
[数式１]
Ａｔ／Ａ０
（式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した前記多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
前記懸濁液のｐＨは７．４であり、
Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した前記多孔性シリカ粒子の吸光度である。）
前記多孔性シリカ粒子は、下記数式１の吸光度の比が１／２となるｔが２４以上である、アトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
[数式１]
Ａｔ／Ａ０
（式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した前記多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
前記懸濁液のｐＨは７．４であり、
Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した前記多孔性シリカ粒子の吸光度である。）
【0008】
２．前記項目１において、前記多孔性シリカ粒子は、直径５ｎｍ未満の気孔を有するシリカ粒子を１２０℃～１８０℃で２４時間～９６時間膨張剤と反応させ、前記直径５ｎｍ未満の気孔を膨張させるステップと、前記気孔が膨張されたシリカ粒子を４００℃以上の温度で３時間以上か焼するステップとを含んで製造されたものである、アトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【0009】
３．前記項目１において、前記多孔性シリカ粒子の平均直径は１５０ｎｍ～１，０００ｎｍであり、そのＢＥＴ表面積は２００ｍ２／ｇ～７００ｍ２／ｇであり、そのｇ当たりの体積は０．７ｍｌ～２．２ｍｌである、アトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【0010】
４．前記項目１において、前記核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＰＮＡまたはｍｉＲＮＡのいずれか一つである、アトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【0011】
５．前記項目４において、前記核酸分子は、配列番号１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号４７の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号２の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号４８の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２５の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号３の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号４９の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２６の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号４の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５０の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２７の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号５の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５１の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２８の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号６の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５２の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２９の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号７の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５３の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３０の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号８の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５４の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３１の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号９の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５５の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３２の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１０の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５６の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３３の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５７の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１２の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５８の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３５の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１３の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５９の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３６の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１４の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６０の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３７の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１５の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６１の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３８の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１６の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６２の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３９の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１７の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６３の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号４０の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１８の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６４の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号４１の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１９の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６５の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号４２の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号２０の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６６の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号４３の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号２１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６７の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号４４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号２２の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６８の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号４５の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号２３の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６９の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ及び配列番号４６の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ；からなる群より選択される少なくとも一つのｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む、アトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【0012】
６．前記項目５において、前記センスＲＮＡ及び前記アンチセンスＲＮＡ配列の３’末端にＵＵの配列をさらに含むものである、アトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【0013】
７．前記項目５において、前記センスＲＮＡ及び前記アンチセンスＲＮＡ配列の３’末端にｄＴｄＴの配列をさらに含むものである、アトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【0014】
８．前記項目５において、前記核酸分子は、配列番号１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号４７の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１４の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６０の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３７の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号２１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６７の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ及び配列番号４４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ；からなる群より選択される少なくとも一つのｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む、アトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【0015】
９．前記項目８において、前記核酸分子は、配列番号１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号４７の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡまたは配列番号２４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡを含む、アトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【0016】
１０．前記項目１において、前記多孔性シリカ粒子は、外部表面または気孔内部が中性のｐＨで陽電荷を帯びるものである、アトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【0017】
１１．前記項目１において、前記多孔性シリカ粒子は、親水性または疎水性の官能基を有するものである、アトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【0018】
１２．前記項目１において、前記アトピー性疾患は、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、掻痒症および食物アレルギーからなる群より選択される少なくとも一つである、アトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【発明の効果】
【0019】
本発明の組成物は、ＴＳＬＰの発現を効果的に抑制できる核酸分子を高効率で徐放的に送達して、優れた効率でＴＳＬＰの発現を抑制することができる。これによって、ＴＳＬＰの過剰発現による様々なアトピー性疾患の予防または治療効果を示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図6】図６は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の気孔直径別の顕微鏡写真である。 ＤＤＶ（Degradable Delivery Vehicle）は、実施例の粒子であり、括弧内の数字は粒子の直径を、下付き文字の数字は気孔の直径を意味する。例えば、ＤＤＶ（２００）１０は、粒子直径が２００ｎｍ、気孔直径が１０ｎｍである実施例の粒子を意味する。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明の具体的な説明において用語の具体的な意味を定義するが、これは当該分野の通常の技術者に理解される意味として受け入れられるものであるだけで、下記に定義された特定の意味に限定しようとする意図ではない。
【0022】
「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉または遺伝子サイレンシングを媒介することができる核酸分子を意味する。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制できるので、効率のよい遺伝子ノックダウン方法または遺伝子治療方法として提供される。ｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖（標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に相応する（corresponding）配列）と、アンチセンス鎖（標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に相補的な配列）とが互いに反対側に位置して二重鎖をなす構造を有することができる。また、ｓｉＲＮＡ分子は、自己相補性（self－complementary）のセンス及びアンチセンス鎖を有する単一鎖の構造を有することができる。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ同士にペアをなす二重鎖ＲＮＡの部分が完全に対をなすものに限定されず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）等によって対を成していない部分が含まれ得る。ｓｉＲＮＡの末端構造は、標的遺伝子の発現をＲＮＡｉ（RNA interference）効果により抑制できるものであれば、平滑（blunt）末端または粘着（cohesive）末端のいずれも可能である。粘着末端構造としては、３’－末端突出構造と５’－末端突出構造のいずれも可能である。また、ｓｉＲＮＡ分子は、自己相補性のセンスとアンチセンス鎖との間に短いヌクレオチド配列（例えば、約５－１５ｎｔ）が挿入された形態を有することができる。この場合、ヌクレオチド配列の発現によって形成されたｓｉＲＮＡ分子は、分子内混成化によってヘアピン構造を形成することになり、全体としてはステム・アンド・ループ構造を形成することになる。このステム・アンド・ループ構造は、インビトロ（in vitro）またはインビボ（in vivo）でプロセシングされ、ＲＮＡｉを媒介できる活性のｓｉＲＮＡ分子を生成する。
【0023】
「ｄｓＲＮＡ」とは、ｓｉＲＮＡの前駆体分子であり、標的細胞のＤＩＣＥＲ酵素（Ribonuclease III）を含むＲＩＳＣ複合体と会合してｓｉＲＮＡに切断され、この過程でＲＮＡｉが発生する。ｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡよりも数ヌクレオチドだけ長い配列を有し、センス鎖（標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に相応する（corresponding）配列）とアンチセンス鎖（標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に相補的な配列）が互いに反対側に位置して二重鎖をなす構造を有することができる。
【0024】
「ＰＮＡ」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡと類似の構造を持つが、ＤＮＡ又はＲＮＡとは異なり、電荷を帯びないように設計され、強い結合力を有する合成ポリマーである。ＤＮＡとＲＮＡがデオキシリボース（deoxyribose）又はリボース（ribose）糖バックボーン（backbone）をそれぞれ有するのに対して、ＰＮＡのバックボーンは、反復的なＮ－（２－アミノエチル）－グリシン（（N－（2－aminoethyl）－glycine）単位がペプチド結合で連結された構造を有する。プリン（purine）とピリミジン（pyrimidine）塩基がメチレン（－ＣＨ２－）とカルボニル基（－Ｃ＝Ｏ－）でバックボーンに連結されている構造であり、ペプチドと同様に両末端にそれぞれＮ－末端とＣ－末端を有する。
【0025】
「核酸」とは、任意のＰＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、組織サンプルに存在する染色体、ミトコンドリア、ウイルス及び／又は細菌核酸を含む意味である。二本鎖核酸分子のいずれか１つ又は２つの鎖を含み、無損傷核酸分子の任意の断片または一部を含む。
【0026】
「遺伝子」とは、タンパク質のコーディングまたは転写時、または他の遺伝子発現の調節時に機能的な役割を持つ任意の核酸配列またはその一部を意味する。遺伝子は、機能的タンパク質をコードするすべての核酸またはタンパク質をコードまたは発現する核酸の一部のみからなり得る。核酸配列は、エクソン、イントロン、開始または終了領域、プロモーター配列、他の調節配列または遺伝子に隣接する特有の配列内に遺伝子異常を含むことができる。
【0027】
用語「遺伝子発現」とは、一般的に生物学的活性のあるポリペプチドがＤＮＡ配列から生成され、細胞で生物学的活性を示す細胞プロセスを意味する。その意味で、遺伝子発現は、転写及び解読のプロセスを含むだけでなく、遺伝子または遺伝子産物の生物学的活性に影響を与えることができる転写後および解読後のプロセスを含む。前記プロセスは、ＲＮＡの合成、加工及び輸送だけでなく、ポリペプチドの合成、輸送、およびポリペプチドの解読後の変形を含むが、これらに限定されるものではない。タンパク質産物を暗号化しない遺伝子、例えばｓｉＲＮＡ遺伝子の場合における「遺伝子発現」という用語は、前駆体ｓｉＲＮＡが遺伝子から生成されるプロセスを意味する。通常、前記プロセスは、タンパク質暗号遺伝子に対してＲＮＡポリメラーゼＩＩによって誘導される転写とは異なり、ｓｉＲＮＡ遺伝子の転写産物が解読されてタンパク質を生成しないが、転写と呼ばれる。それにもかかわらず、ｓｉＲＮＡ遺伝子からの成熟ｓｉＲＮＡの生成は、その用語が本明細書に使用されるように「遺伝子発現」という用語によって含まれる。
【0028】
用語「標的遺伝子（target gene）」とは、本願に開示される主題の方法および組成物を使用して調整するために標的とする遺伝子を意味する。このため、標的遺伝子は、その発現レベルがｍＲＮＡまたはポリペプチドのレベルにｓｉＲＮＡによって下向き調節される核酸配列を含む。同様に、用語「標的ＲＮＡ」または「標的ｍＲＮＡ」とは、ｓｉＲＮＡが結合して標的遺伝子の発現の調節を誘導する標的遺伝子の転写体を意味する。
【0029】
用語「転写（transcription）」とは、遺伝子の暗号配列に存在する構造情報のＲＮＡへの発現を誘導する遺伝子とＲＮＡポリメラーゼの相互作用を含む細胞プロセスを意味する。
【0030】
「下向き調節（down－regulation）」という表現は、正常組織細胞に比べて、活性化された細胞で細胞内転写（gene transcription）または翻訳（gene translation）によって、特定の遺伝子のｍＲＮＡへの発現またはタンパク質への発現量が顕著に減少したことを意味する。
【0031】
「治療」とは、有益な、または望ましい臨床的結果を得るためのアクセスを意味する。本発明の目的のために、有益な、または望ましい臨床的結果は、非限定的に、症状の緩和、疾患の範囲の減少、疾患状態の安定化（即ち、悪化しない）、疾患の進行の遅延化または緩徐化、疾患状態の改善または一時的緩和および軽減（部分的または完全な）、検出可能かまたは検出不可能かを含む。また、「治療」は、治療を受けていないときに予想される生存率と比較して生存率を伸ばすことを意味し得る。治療は、治療学的治療および予防的または予防措置方法のすべてを指す。前記治療は、予防される障害だけでなく、既に発生した障害において要する治療を含む。
【0032】
「予防」とは、関連疾患の発症を抑制または遅延させるあらゆる行為を意味する。本願の組成物が、初期症状、または示される前に投与した場合に関連疾患を予防できることは、当業者に自明であろう。
【0033】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0034】
本発明は、ＴＳＬＰ（thymic stromal lymphopoietin）遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を担持した多孔性シリカ粒子；を含むＴＳＬＰ遺伝子発現抑制用組成物を提供するものである。前記多孔性シリカ粒子は、シリカ（ＳｉＯ２）素材の粒子であり、ナノサイズの粒径を有する。
【0035】
本発明の多孔性シリカナノ粒子は、多孔性粒子であり、ナノサイズの気孔を有し、その表面（外部表面）及び／又は気孔内部にＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を担持することができる。
【0036】
本発明のＴＳＬＰ ｍＲＮＡは、対象ターゲット種と同じ種由来のｍＲＮＡであってもよく、例えば、ヒトの場合には配列番号１４９の配列であってもよいが、これに限定されるものではない。例えば、本発明のＴＳＬＰ ｍＲＮＡは、ヒトＴＳＬＰ ｍＲＮＡ、マウスＴＳＬＰ ｍＲＮＡ、サルＴＳＬＰ ｍＲＮＡ、ウサギＴＳＬＰ ｍＲＮＡであってもよく、好ましくは、ヒトＴＳＬＰ ｍＲＮＡであってもよいが、これらに限定されない。
【0037】
本発明の核酸分子は、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡ配列によって異なるように製作することができる。例えば、本発明の核酸分子は、ヒトＴＳＬＰ ｍＲＮＡ配列に相補的に結合できるように製作されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0038】
本発明の多孔性シリカ粒子は、生分解性粒子であり、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を担持して体内に投与されたとき、体内で生分解されてＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を放出することができる。つまり、本発明の多孔性シリカ粒子は、体内で徐々に分解され、担持されたＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子が徐放的に放出されるようにすることができる。例えば、下記数式１の吸光度の比が１／２となるｔは、２４以上である。
【0039】
[数式１]
Ａｔ／Ａ０
（式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
前記懸濁液のｐＨは、７．４であり、
Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した多孔性シリカ粒子の吸光度である。）
Ａｔ／Ａ０
（式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
前記懸濁液のｐＨは、７．４であり、
Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した多孔性シリカ粒子の吸光度である。）
【0040】
前記数式１は、多孔性シリカ粒子が体内と同様の環境でどの程度の速度で分解されるかを意味するものである。
【0041】
前記数式１における吸光度Ａ０、Ａｔは、例えば図８に示されているように、円筒状の透過膜に多孔性シリカ粒子および懸濁液を入れ、透過膜の外部にも同じ懸濁液を入れて測定したものであり得る。
【0042】
本発明の多孔性シリカ粒子は、生分解性であり、懸濁液中で徐々に分解され得る。直径５０ｋＤａは約５ｎｍに相当するものであり、生分解された多孔性シリカ粒子は、直径５０ｋＤａの透過膜を通過することができる。円筒状の透過膜は、６０ｒｐｍの水平攪拌下にあるので、懸濁液を均一に混合することができ、分解された多孔性シリカ粒子は、透過膜の外部に放出され得る。
【0043】
前記数式１での吸光度は、例えば、透過膜の外部の懸濁液が新しい懸濁液に入れ替わる環境下で測定したものであり得る。懸濁液は、持続的に入れ替わるものであってもよく、一定期間ごとに入れ替わるものであってもよい。前記一定期間は、定期的または不定期的な期間であってもよい。例えば、１時間～１週間の範囲内で、１時間おき、２時間おき、３時間おき、６時間おき、１２時間おき、２４時間おき、２日おき、３日おき、４日おき、７日おき等に入れ替えることができるが、これらに限定されるものではない。
【0044】
前記「吸光度の比が１／２となる」ということは、ｔ時間後の吸光度が初期吸光度の半分になるということであり、これは多孔性シリカ粒子の約半分が分解されたことを意味する。
【0045】
前記懸濁液は緩衝溶液であってもよく、具体例としては、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）およびＳＢＦ（疑似体液）からなる群より選択される１種以上であってもよく、より具体的にはＰＢＳであってもよい。
【0046】
本発明の前記数式１の吸光度の比が１／２となるｔは２４以上であり、例えばｔは２４～１２０であってもよく、例えば、前記範囲内で２４～９６、２４～７２、３０～７０、４０～７０、５０～６５などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0047】
本発明の多孔性シリカ粒子は、前記数式１の吸光度の比が１／５となるｔが、例えば７０～１４０であってもよく、例えば、前記範囲内で８０～１４０、８０～１２０、８０～１１０、７０～１４０、７０～１２０、７０～１１０などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0048】
本発明の多孔性シリカ粒子は、前記数式１の吸光度の比が１／２０となるｔが、例えば１３０～２２０であってもよく、例えば、前記範囲内で１３０～２００、１４０～２００、１４０～１８０、１５０～１８０などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0049】
本発明の多孔性シリカ粒子は、測定される吸光度が０．０１以下となるｔが、例えば、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、５００以上、１，０００以上などであってもよく、その上限は２，０００であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0050】
本発明の多孔性シリカ粒子における前記数式１の吸光度の比とｔは、高い量の相関関係を有するものであり、例えば、ピアソン相関係数が０．８以上であってもよく、例えば０．９以上、０．９５以上であってもよい。
【0051】
前記数式１のｔは、多孔性シリカ粒子が体内と同様の環境でどの程度の速度で分解されるかを意味するものである。これは、例えば多孔性シリカ粒子の表面積、粒径、気孔直径、表面及び／又は気孔内部の置換基、表面の緻密さの程度などを調節することによって調節できる。
【0052】
例えば、粒子の表面積を増加させてｔを減少させるか、表面積を減少させてｔを増加させることができる。表面積は、粒子の直径、気孔の直径を調節することによって調節できる。また、表面及び／又は気孔内部に置換基を位置させ、多孔性シリカ粒子が環境（溶媒など）に直接露出することを減らしてｔを増加させることができる。また、多孔性シリカ粒子にＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を担持させ、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子と多孔性シリカ粒子間の親和度を増加させ、多孔性シリカ粒子が環境に直接露出することを減らしてｔを増加させることができる。また、粒子の製造時に表面をより緻密に製造してｔを増加させることもできる。前記に数式１のｔを調節できる様々な例を示したが、それらに限定されるものではない。
【0053】
本発明の多孔性シリカ粒子は、例えば球状粒子であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0054】
本発明の多孔性シリカ粒子は、平均粒径が例えば１５０ｎｍ～１，０００ｎｍであってもよく、例えば、前記範囲内で１５０ｎｍ～８００ｎｍ、１５０ｎｍ～５００ｎｍ、１５０ｎｍ～４００ｎｍ、１５０ｎｍ～３００ｎｍ、１５０ｎｍ～２００ｎｍであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0055】
本発明の多孔性シリカ粒子は、平均気孔直径が例えば１ｎｍ～１００ｎｍであってもよく、例えば、前記範囲内で５ｎｍ～１００ｎｍ、７ｎｍ～１００ｎｍ、７ｎｍ～５０ｎｍ、１０ｎｍ～５０ｎｍ、１０ｎｍ～３０ｎｍ、７ｎｍ～３０ｎｍであってもよいが、これらに限定されるものではない。前記のような大きな直径を持って多量のＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を担持することができ、サイズの大きいＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の担持も可能である。
【0056】
本発明の多孔性シリカ粒子は、ＢＥＴ表面積が、例えば２００ｍ２／ｇ～７００ｍ２／ｇであってもよい。例えば、前記範囲内で２００ｍ２／ｇ～７００ｍ２／ｇ、２００ｍ２／ｇ～６５０ｍ２／ｇ、２５０ｍ２／ｇ～６５０ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ～７００ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ～６５０ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ～６００ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ～５５０ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ～５００ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ～４５０ｍ２／ｇなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0057】
本発明の多孔性シリカナノ粒子は、ｇ当たりの体積が例えば０．７ｍｌ～２．２ｍｌであってもよい。例えば、前記範囲内で０．７ｍｌ～２．０ｍｌ、０．８ｍｌ～２．２ｍｌ、０．８ｍｌ～２．０ｍｌ、０．９ｍｌ～２．０ｍｌ、１．０ｍｌ～２．０ｍｌなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。ｇ当たりの体積が小さすぎると、分解速度が速くなりすぎることがあり、大きすぎると、製造が困難であるか、完全な形状を有しないことがある。
【0058】
本発明の多孔性シリカ粒子は、外部表面及び／又は気孔内部に親水性置換基及び／又は疎水性置換基が存在し得る。例えば、表面及び気孔内部の両方に親水性置換基のみが存在するか、疎水性置換基のみが存在してもよく、表面または気孔内部の一方のみに親水性置換基が存在するか、疎水性置換基が存在してもよい。また、表面に親水性置換基が、気孔内部に疎水性置換基が存在してもよく、その逆の場合も可能である。
【0059】
本発明の多孔性シリカ粒子に担持されたＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の放出は、主に、ナノ粒子の分解によって行われるものである。このため、前記置換基の調節によりＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の放出環境に対する多孔性シリカ粒子の相互作用を調節し、ナノ粒子自体の分解速度を調節して、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の放出速度を調節することができる。また、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子は、ナノ粒子から拡散して放出させることもできるが、前記置換基の調節によりＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子のナノ粒子への結合力を調節し、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の放出を調節することができる。
【0060】
また、難溶性（疎水性）のＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質との結合力を強化するために、気孔内部に疎水性置換基が存在し、使用、製剤化のし易さなどの側面で粒子の表面に親水性置換基が存在するようにするなどの処理も可能である。
【0061】
親水性置換基としては、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、カルボニル基、スルフヒドリル基、ホスフェート基、チオール基、アンモニウム基、エステル基、イミド基、チオイミド基、ケト基、エーテル基、インデン基、スルホニル基、ポリエチレングリコール基などが挙げられる。疎水性置換基としては、例えば、置換または非置換のＣ１～Ｃ３０のアルキル基、置換または非置換のＣ３～Ｃ３０のシクロアルキル基、置換または非置換のＣ６～Ｃ３０のアリール基、置換または非置換のＣ２～Ｃ３０のヘテロアリール基、ハロゲン基、Ｃ１～Ｃ３０のエステル基、及びハロゲン含有基などが挙げられる。
【0062】
また、本発明の多孔性シリカ粒子は、外部表面及び／又は気孔内部が陽電荷、陰電荷、及び／又は無電荷に帯電されたものであってもよい。例えば、表面及び気孔内部の両方が陽電荷に帯電されるか、陰電荷に帯電されてもよく、表面または気孔内部の一方のみが陽電荷に帯電されるか、陰電荷に帯電されてもよい。また、表面が陽電荷、気孔内部が陰電荷に帯電されてもよく、その逆の場合も可能であり、無電荷の場合も同様である。
【0063】
前記帯電は、例えば、非イオン性置換基、陽イオン性置換基または陰イオン性置換基が存在することによって行われたものであり得る。
【0064】
前記陽イオン性置換基は、例えば、塩基性基としてアミノ基、その他の窒素含有基などであってもよく、具体的には、アミノ基、アミノアルキル基、アルキルアミノ基、窒素原子を含むヘテロ環芳香族化合物基、シアン基及びグアニジン基からなる群より選択される少なくとも一つの官能基であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0065】
前記陰イオン性置換基は、例えば、酸性基としてカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、スルホン酸基（－ＳＯ３Ｈ）、チオール基（－ＳＨ）などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0066】
同様に、前記帯電によって前記置換基の調節によりＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の放出環境に対する多孔性シリカ粒子の相互作用を調節し、ナノ粒子自体の分解速度を調節して、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の放出速度を調節することができる。また、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子は、ナノ粒子から拡散されて放出させることもできるが、前記置換基の調節によりＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子のナノ粒子への結合力を調節し、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の放出を調節することができる。
【0067】
また、本発明の多孔性シリカ粒子は、その表面及び／又は気孔内部に前記の他にＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の担持、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の標的細胞への移動、その他の目的のための物質の担持、又はその他の追加置換基の結合などのための置換基が存在してもよく、それに結合された抗体、リガンド、細胞透過性のペプチドまたはアプタマーなどをさらに含んでいてもよい。
【0068】
前述した表面及び／又は気孔内部の置換基、電荷、結合物質などは、例えば、表面改質によって付加することができる。
【0069】
表面改質は、例えば、導入しようとする置換基を有する化合物を粒子と反応させて行うことができ、前記化合物は、例えば、Ｃ１～Ｃ１０のアルコキシ基を有するアルコキシシランであってもよいが、これに限定されるものではない。前記アルコキシシランは、前記アルコキシ基を１つ以上有するものであり、例えば１～３つを有することができ、アルコキシ基の結合していない部位に導入しようとする置換基があるか、又はそれで置換された置換基があってもよい。
【0070】
本発明の多孔性シリカ粒子は、例えば、小気孔の粒子の製造および気孔拡張工程を経て製造したものであってもよく、必要に応じて、か焼（calcination）工程、表面改質工程などをさらに経て製造したものであってもよい。か焼及び表面改質工程をすべて経た場合は、か焼後に表面改質されたものであってもよい。
【0071】
前記小気孔の粒子は、例えば、平均気孔直径が１ｎｍ～５ｎｍの粒子であってもよい。
【0072】
前記小気孔の粒子は、溶媒に界面活性剤とシリカ前駆物質を入れて攪拌及び均質化して得ることができる。
【0073】
前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ－ブチロラクトン、１，３－ジメチル－イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４－ヒドロキシ－４－メチル－２－ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ－メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ－ジオキサン、Ｐ－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはアルコール、より具体的にはメタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【0074】
前記溶媒において、水と有機溶媒の混合溶媒の使用時の割合は、例えば、水と有機溶媒を１：０．７～１．５の体積比、例えば１：０．８～１．３の体積比で使用できるが、これらに限定されるものではない。
【0075】
前記界面活性剤は、例えば、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、ＴＭＡＢｒ（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム）、ＴＭＰｒＣｌ（塩化ヘキサデシルトリメチルピリジニウム）、ＴＭＡＣｌ（塩化テトラメチルアンモニウム）などであってもよく、具体的にはＣＴＡＢを使用することができる。
【0076】
前記界面活性剤は、例えば、溶媒１リットル当たりに１ｇ～１０ｇ、例えば、前記範囲内で１ｇ～８ｇ、２ｇ～８ｇ、３ｇ～８ｇなどの量で添加できるが、これらに限定されるものではない。
【0077】
前記シリカ前駆物質は、溶媒に界面活性剤を添加して攪拌した後に添加することができる。シリカ前駆物質は、例えば、ＴＭＯＳ（テトラメチルオルソシリケート）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0078】
前記攪拌は、例えば１０分～３０分間行うことができるが、これに限定されるものではない。
【0079】
前記シリカ前駆物質は、例えば溶媒１リットル当たりに０．５ｍｌ～５ｍｌ、例えば、前記範囲内で０．５ｍｌ～４ｍｌ、０．５ｍｌ～３ｍｌ、０．５ｍｌ～２ｍｌ、１ｍｌ～２ｍｌなどの量で添加できるが、これらに限定されるものではない。
【0080】
必要に応じて、触媒として水酸化ナトリウムをさらに使用することができるが、これは溶媒に界面活性剤を添加した後、シリカ前駆物質の添加前に撹拌しながら添加することができる。
【0081】
前記水酸化ナトリウムは、例えば、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を基準で溶媒１リットル当たりに０．５ｍｌ～８ｍｌ、例えば、前記範囲内で０．５ｍｌ～５ｍｌ、０．５ｍｌ～４ｍｌ、１ｍｌ～４ｍｌ、１ｍｌ～３ｍｌ、２ｍｌ～３ｍｌなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0082】
前記シリカ前駆物質の添加後に溶液を攪拌して反応させることができる。攪拌は、例えば２時間～１５時間行うことができ、例えば、前記範囲内で３時間～１５時間、４時間～１５時間、４時間～１３時間、５時間～１２時間、６時間～１２時間、６時間～１０時間などであってもよいが、これらに限定されるものではない。攪拌時間（反応時間）が短すぎると、結晶核生成（nucleation）が不足することがある。
【0083】
前記攪拌の後には、溶液を熟成（aging）させることができる。熟成は、例えば、８時間～２４時間行うことができ、例えば、前記範囲内で８時間～２０時間、８時間～１８時間、８時間～１６時間、８時間～１４時間、１０時間～１６時間、１０時間～１４時間などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0084】
その後、反応産物を洗浄及び乾燥して多孔性シリカ粒子を得ることができる。必要に応じて、洗浄の前に未反応物質の分離を先行することができる。
【0085】
前記未反応物質の分離は、例えば、遠心分離で上澄み液を分離して行うことができる。遠心分離は、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、例えば、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0086】
前記洗浄は、水及び／又は有機溶媒で行うことができ、具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上１０回以下、例えば、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
【0087】
前記有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ－ブチロラクトン、１，３－ジメチル－イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４－ヒドロキシ－４－メチル－２－ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ－メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ－ジオキサン、Ｐ－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはアルコール、より具体的にはエタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【0088】
前記洗浄は遠心分離下で行うことができ、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、例えば、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0089】
前記洗浄は、遠心分離をせずに、フィルタで粒子をろ過して行うこともできる。フィルタは、多孔性シリカ粒子の直径以下の気孔を有するものであってもよい。反応液を、そのようなフィルタでろ過すると、粒子だけがフィルタの上に残り、そのフィルタの上に水及び／又は有機溶媒を注ぎ、洗浄することができる。
【0090】
前記洗浄時には、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば、２回以上１０回以下、例えば、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
【0091】
前記乾燥は、例えば２０℃～１００℃で行うことができるが、これらに限定されず、真空状態で行うこともできる。
【0092】
その後、前記で得られた多孔性シリカ粒子の気孔を拡張する。気孔の拡張は、気孔膨張剤を用いて行うことができる。
【0093】
前記気孔膨張剤としては、例えば、トリメチルベンゼン、トリエチルベンゼン、トリプロピルベンゼン、トリブチルベンゼン、トリペンチルベンゼン、トリヘキシルベンゼン、トルエン、ベンゼンなどを使用でき、具体的にはトリメチルベンゼンを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【0094】
また、前記気孔膨張剤としては、例えばＮ，Ｎ－ジメチルヘキサデシルアミン（N,N－dimethylhexadecylamine、DMHA）を使用できるが、これに限定されるものではない。
【0095】
前記気孔の拡張は、例えば、溶媒中の多孔性シリカ粒子を気孔膨張剤と混合し、加熱して反応させて行うことができる。
【0096】
前記溶媒は、例えば、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用でき、具体的にはアルコール、より具体的にはエタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【0097】
前記多孔性シリカ粒子は、例えば、溶媒１リットル当たりに１０ｇ～２００ｇ、例えば、前記範囲内で１０ｇ～１５０ｇ、１０ｇ～１００ｇ、３０ｇ～１００ｇ、４０ｇ～１００ｇ、５０ｇ～１００ｇ、５０ｇ～８０ｇ、６０ｇ～８０ｇなどの割合で添加できるが、これらに限定されるものではない。
【0098】
前記多孔性シリカ粒子は、溶媒中に均一に分散されているものであってもよく、例えば、溶媒に多孔性シリカ粒子を添加して超音波分散したものであってもよい。混合溶媒を使用する場合には、第１の溶媒に多孔性シリカ粒子を分散した後、第２の溶媒を添加したものであってもよい。
【0099】
前記気孔膨張剤は、例えば、溶媒１００体積部に対して１０～２００体積部、前記範囲内で１０～１５０体積部、１０～１００体積部、１０～８０体積部、３０～８０体積部、３０～７０体積部などの割合で添加できるが、これらに限定されるものではない。
【0100】
前記反応は、例えば１２０℃～１９０℃で行うことができる。例えば、前記範囲内で１２０℃～１９０℃、１２０℃～１８０℃、１２０℃～１７０℃、１３０℃～１７０℃、１３０℃～１６０℃、１３０℃～１５０℃、１３０℃～１４０℃などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【0101】
前記反応は、例えば６時間～９６時間行うことができる。例えば、前記範囲内で３０時間～９６時間、３０時間～９６時間、３０時間～８０時間、３０時間～７２時間、２４時間～８０時間、２４時間～７２時間、３６時間～９６時間、３６時間～８０時間、３６時間～７２時間、３６時間～６６時間、３６時間～６０時間、４８時間～９６時間、４８時間～８８時間、４８時間～８０時間、４８時間～７２時間、６時間～９６時間、７時間～９６時間、８時間～８０時間、９時間～７２時間、９時間～８０時間、６時間～７２時間、９時間～９６時間、１０時間～８０時間、１０時間～７２時間、１２時間～６６時間、１３時間～６０時間、１４時間～９６時間、１５時間～８８時間、１６時間～８０時間、１７時間～７２時間などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0102】
前記例示した範囲内で時間および温度を調節して、反応が過剰せずに十分に行われるようにすることができる。例えば、反応温度が低くなると反応時間を増やしたり、反応温度が高くなると反応時間を短くしたりすることができる。反応が十分でないと、気孔の拡張が十分でないことがあり、反応が進行しすぎると、気孔の過剰拡張により粒子が崩壊することがある。
【0103】
前記反応は、例えば、段階的に昇温して行うことができる。具体的には、常温から前記温度まで０．５℃／分～１５℃／分の速度で段階的に昇温して行うことができ、例えば、前記範囲内で１℃／分～１５℃／分、３℃／分～１５℃／分、３℃／分～１２℃／分、３℃／分～１０℃／分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0104】
前記反応は、攪拌下で行うことができる。例えば１００ｒｐｍ以上の速度で攪拌することができ、具体的には１００ｒｐｍ～１，０００ｒｐｍの速度で行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【0105】
前記反応後は、反応液を徐々に冷却することができ、例えば、段階的に減温して冷却することができる。具体的には、前記温度から常温まで０．５℃／分～２０℃／分の速度で段階的に減温して行うことができ、例えば、前記範囲内で１℃／分～２０℃／分、３℃／分～２０℃／分、３℃／分～１２℃／分、３℃／分～１０℃／分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0106】
前記冷却後に反応産物を洗浄および乾燥し、気孔が拡張された多孔性シリカ粒子を得ることができる。必要に応じて、洗浄の前に未反応物質の分離を先行することができる。
【0107】
前記未反応物質の分離は、例えば、遠心分離で上澄み液を分離して行うことができる。遠心分離は、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、例えば、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0108】
前記洗浄は、水及び／又は有機溶媒で行うことができる。具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上、１０回以下、例えば、３回、４回、５回、６回、７回、８回などであってもよい。
【0109】
前記有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用することができ、具体的にはアルコール、より具体的にはエタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【0110】
前記洗浄は遠心分離下で行うことができ、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、例えば、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0111】
前記洗浄は遠心分離をせずに、フィルタで粒子をろ過して行うこともできる。フィルタは、多孔性シリカ粒子の直径以下の気孔を有するものであってもよい。反応液を、そのようなフィルタでろ過すると、粒子だけがフィルタの上に残り、そのフィルタの上に水及び／又は有機溶媒を注ぎ、洗浄することができる。
【0112】
前記洗浄時には、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上１０回以下、例えば、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
【0113】
前記乾燥は、例えば２０℃～１００℃で行うことができるが、これに限定されるものではなく、真空状態で行うこともできる。
【0114】
その後、得られた粒子は、か焼することができる。か焼は、粒子を加熱してその表面および内部のシラノール基を除去して粒子の反応性を下げ、より緻密な構造にし、気孔を満たす有機物を除去する工程であり、例えば４００℃以上の温度に加熱して行うことができる。その上限は特に限定されず、例えば、１，０００℃、９００℃、８００℃、７００℃等であってもよい。加熱は、例えば３時間以上、４時間以上など行うことができる。その上限は特に限定されず、例えば、２４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、５時間などであってもよい。より具体的には、４００℃～７００℃で３時間～８時間、具体的には５００℃～６００℃で４時間～５時間行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【0115】
気孔を満たす有機物を除去することにより、残存有機物によって示される細胞毒性、泡の発生などの問題を防止することができる。
【0116】
その後、得られた多孔性シリカ粒子は、表面改質することができる。表面改質は、表面及び／又は気孔内部に行うことができる。粒子表面と気孔内部は、同じように表面改質してもよく、異なるように表面改質してもよい。
【0117】
前記表面改質により粒子が帯電されるようにするか、または親水性及び／又は疎水性の性質を持つようにすることができる。
【0118】
より具体的には、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の効果的な担持のために、アミノ基、アミノアルキル基、アルキルアミノ基、窒素原子を含むヘテロ環芳香族化合物基、シアン基及びグアニジン基からなる群より選択される少なくとも一つの置換基を有するようにして、前記多孔性シリカ粒子の表面改質を行うことができる。
【0119】
表面改質は、例えば、導入しようとする親水性、疎水性、陽イオン性、陰イオン性などの置換基を有する化合物を粒子と反応させて行うことができる。前記化合物は、例えばＣ１～Ｃ１０のアルコキシ基を有するアルコキシシランであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0120】
前記アルコキシシランは、前記アルコキシ基を１個以上有するものであり、例えば１～３個有することができ、アルコキシ基が結合していない部位に導入しようとする置換基があるか、又はそれで置換された置換基があってもよい。
【0121】
前記アルコキシシランを多孔性シリカ粒子と反応させると、シリコン原子と酸素原子との共有結合が形成され、アルコキシシランが多孔性シリカ粒子の表面及び／又は気孔内部と結合することができる。前記アルコキシシランは、導入しようとする置換基を有しているので、当該置換基を多孔性シリカ粒子の表面及び／又は気孔内部に導入することができる。
【0122】
前記反応は、溶媒に分散した多孔性シリカ粒子をアルコキシシランと反応させて行うことができる。
【0123】
前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ－ブチロラクトン、１，３－ジメチル－イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４－ヒドロキシ－４－メチル－２－ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ－メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ－ジオキサン、Ｐ－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはトルエンを使用できるが、これらに制限されるものではない。
【0124】
前記陽電荷での帯電は、例えばアミノ基、アミノアルキル基などの窒素含有基などの塩基性基を有するアルコキシシランと反応させて行うことができる。具体的には、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（N－［3－（Trimethoxysilyl）propyl］ethylenediamine）、Ｎ１－（３－トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン（N1－（3－Trimethoxysilylpropyl）diethylenetriamine）、（３－アミノプロピル）トリメトキシシラン（（3－Aminopropyl）trimethoxysilane）、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］アニリン（N－［3－（Trimethoxysilyl）propyl］aniline）、トリメトキシ［３－（メチルアミノ）プロピル］シラン（Trimethoxy［3－（methylamino）propyl］silane）、３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン（3－（2－Aminoethylamino）propyldimethoxymethylsilane）などを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【0125】
前記陰電荷での帯電は、例えばカルボキシ基、スルホン酸基、チオール基などの酸性基を有するアルコキシシランと反応させて行うことができる。具体的には、（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（（3－Mercaptopropyl）trimethoxysilane）などを使用できるが、これに限定されるものではない。
【0126】
前記無電荷（陽電荷または陰電荷でなない、電荷がない状態）での帯電は、電荷を持たない通常の官能基を有するアルコキシシランと反応させて行うことができ、前記陽電荷での帯電と陰電荷での帯電を適宜組み合わせて、陽電荷と陰電荷の相殺による無電荷に帯電させることができるが、これに限定されるものではない。
【0127】
前記親水性の性質は、親水性基、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、カルボニル基、スルフヒドリル基、ホスフェート基、チオール基、アンモニウム基、エステル基、イミド基、チオイミド基、ケト基、エーテル基、インデン基、スルホニル基、ポリエチレングリコール基などを有するアルコキシシランと反応させて持たせることができる。具体的には、 Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（N－［3－（Trimethoxysilyl）propyl］ethylenediamine）、Ｎ１－（３－トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン（N1－（3－Trimethoxysilylpropyl）diethylenetriamine）、（３－アミノプロピル）トリメトキシシラン（（3－Aminopropyl）trimethoxysilane）、（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（（3－Mercaptopropyl）trimethoxysilane）、トリメトキシ［３－（メチルアミノ）プロピル］シラン（Trimethoxy［3－（methylamino）propyl］silane）、 ３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン（3－（2－Aminoethylamino）propyldimethoxymethylsilane）などを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【0128】
前記疎水性の性質は、疎水性置換基、例えば、置換または非置換のＣ１～Ｃ３０のアルキル基、置換または非置換のＣ３～Ｃ３０のシクロアルキル基、置換または非置換のＣ６～Ｃ３０のアリール基、置換または非置換のＣ２～Ｃ３０のヘテロアリール基、ハロゲン基、Ｃ１～Ｃ３０のエステル基、ハロゲン含有基などを有するアルコキシシランと反応させて持たせることができる。具体的には、トリメトキシ（オクタデシル）シラン（Trimethoxy（octadecyl）silane）、トリメトキシ－ｎ－オクチルシラン（Trimethoxy－n－octylsilane）、トリメトキシ（プロピル）シラン（Trimethoxy（propyl）silane）、イソブチル（トリメトキシ）シラン（Isobutyl（trimethoxy）silane）、トリメトキシ（７－オクテン－１－イル）シラン（Trimethoxy（7－octen－1－yl）silane）、トリメトキシ（３，３，３－トリフルオロプロピル）シラン（Trimethoxy（3，3，3－trifluoropropyl）silane）、トリメトキシ（２－フェニルエチル）シラン（Trimethoxy（2－phenylethyl）silane）、ビニルトリメトキシシラン（Vinyltrimethoxysilane）、シアノメチル（Cyanomethyl）、［３－（トリメトキシシリル）プロピル］トリチオカーボネート（［3－（trimethoxysilyl）propyl］trithiocarbonate）、（３－ブロモプロピル）トリメトキシシラン（（3－Bromopropyl）trimethoxysilane）などを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【0129】
そのほか、前記表面改質により難溶性（疎水性）のＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質との結合力を強化するために、気孔内部に疎水性置換基が存在し、使用、製剤化のし易さなどの側面で粒子の表面に親水性置換基が存在するようにするなどの処理も可能であり、表面に他のＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質を結合するための置換基が存在してもよい。
【0130】
また、前記表面改質は、複合的に行うこともできる。例えば、外部表面または気孔内部に２回以上の表面改質を行うこともできる。具体例として、アミノ基が導入されたシリカ粒子にカルボキシル基を含む化合物をアミド結合で結合して陽電荷に帯電した粒子を、他の表面特性を持つように変化させることができるが、これに限定されるものではない。
【0131】
前記多孔性シリカ粒子のアルコキシシランとの反応は、例えば、加熱下で行うことができる。加熱は、例えば８０℃～１８０℃、例えば、前記範囲内で８０℃～１６０℃、８０℃～１５０℃、１００℃～１６０℃、１００℃～１５０℃、１１０℃～１５０℃などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【0132】
前記多孔性シリカ粒子のアルコキシシランとの反応は、例えば４時間～２０時間、例えば、前記範囲内で４時間～１８時間、４時間～１６時間、６時間～１８時間、６時間～１６時間、８時間～１８時間、８時間～１６時間、８時間～１４時間、１０時間～１４時間などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【0133】
前記反応温度、時間、そして表面改質に使用される化合物の量などは、表面改質しようとする程度によって選択できる。本発明の核酸分子または物質の親水性、疎水性、電荷の程度によって反応条件を変えて多孔性シリカ粒子の親水性、疎水性、電荷の程度を調節することにより、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質の放出速度を調節することができる。例えば、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質が中性のｐＨで強い陰電荷を帯びる場合には、多孔性シリカ粒子が強い陽電荷を帯びるようにするために、反応温度を高くしたり、反応時間を長くしたり、化合物の処理量を増やすことができるが、これらに限定されるものではない。
【0134】
また、本発明の多孔性シリカ粒子は、例えば、小気孔の粒子の製造、気孔の拡張、表面改質、気孔内部の改質工程を経て製造されたものであってもよい。
【0135】
前記小気孔の粒子の製造および気孔拡張工程は前述通りの工程によって行うことができ、小気孔の粒子の製造後、そして気孔拡張工程の後に洗浄及び乾燥工程を行うことができる。
【0136】
必要に応じて、洗浄の前に未反応物質の分離を先行することができる。未反応物質の分離は、例えば遠心分離で上澄み液を分離して行うことができる。
【0137】
前記遠心分離は、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、具体的には、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0138】
前記小気孔の粒子の製造後の洗浄は、先に例示した範囲内の方法／条件で行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【0139】
前記気孔拡張後の洗浄は、先の例示よりは緩和された条件で行うことができる。例えば、洗浄を３回以内行うことができるが、これに限定されるものではない。
【0140】
前記表面改質と気孔内部改質のそれぞれは、前述通りの工程によって行うことができる。表面改質と気孔内部改質の順に工程を行うことができ、前記両工程の間に粒子の洗浄工程をさらに行うことができる。
【0141】
前記小気孔の粒子の製造および気孔拡張の後に洗浄をより緩和された条件で行う場合、気孔内部には粒子製造、気孔拡張に使用された界面活性剤などの反応液が満たされているため、表面改質時に気孔内部が改質されずに、表面だけが改質され得る。その後、粒子を洗浄すると、気孔内部の反応液が除去され得る。
【0142】
前記表面改質工程と気孔内部改質工程との間の粒子の洗浄は、水及び／又は有機溶媒で行うことができる。具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上１０回以下、具体的には、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
【0143】
前記洗浄は遠心分離下で行うことができ、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、具体的には、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0144】
前記洗浄は遠心分離をせずに、フィルタで粒子をろ過して行うこともできる。フィルタは、多孔性シリカ粒子の直径以下の気孔を有するものであってもよい。反応液をそのようなフィルタでろ過すると、粒子だけがフィルタの上に残り、そのフィルタの上に水及び／又は有機溶媒を注ぎ、洗浄することができる。
【0145】
前記洗浄時には、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上１０回以下、具体的には、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
【0146】
前記乾燥は、例えば２０℃～１００℃で行うことができるが、これに限定されるものではなく、真空状態で行うこともできる。
【0147】
ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子は、多孔性シリカ粒子の表面及び／又は気孔内部に担持することができる。担持は、例えば、溶媒中の多孔性シリカ粒子とＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子とを混合して行うことができる。
【0148】
前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用することができる。
【0149】
また、前記溶媒として、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、ＳＢＦ（疑似体液）、Borate－buffered saline、Tris－buffered salineなどを使用することもできる。
【0150】
前記多孔性シリカ粒子と本発明の核酸分子の割合は、特に限定されず、例えば、重量比が１：０．０５～０．８、例えば、前記範囲内で１：０．０５～０．７、１：０．０５～０．６、１：０．１～０．８、１：０．１～０．６、１：０．２～０．８、１：０．２～０．６等であってもよい。
【0151】
前記多孔性シリカ粒子に担持されたＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子は、延長された時間をかけて段階的に放出され得る。このような遅い放出は、連続または非連続性、線形または非線形であってもよく、多孔性シリカ粒子の特徴及び／又はそれとＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子との相互作用に起因して異なり得る。
【0152】
前記多孔性シリカ粒子に担持されたＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子は、多孔性シリカ粒子が生分解されながら放出されるが、本発明に係る多孔性シリカ粒子は徐々に分解され、担持されたＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子が徐放的に放出されるようにすることができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子の表面積、粒径、気孔直径、表面及び／又は気孔内部の置換基、表面の緻密さの程度などを調節することで調節できるが、これらに限定されるものではない。
【0153】
また、前記多孔性シリカ粒子に担持されたＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子は、多孔性シリカ粒子から離脱して拡散しながらも放出できる。これは多孔性シリカ粒子とＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の放出環境との関係に影響を受けるものであるところ、これを調整して、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の放出を調節することができる。例えば、表面改質によって多孔性シリカ粒子のＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子との結合力を強化または弱化させることによって調節することができる。
【0154】
より具体的な例として、担持されるＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質が難溶性（疎水性）である場合には、粒子の表面及び／又は気孔内部が疎水性置換基を有することにより、多孔性シリカ粒子とＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質との結合力が増加し得る。これにより、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子が疎水性置換基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。
【0155】
本明細書で「難溶性」とは、（水に対して）不溶性（insoluble）、実質的に不溶性（practically insoluble）、またはごくわずかの可溶性（only slightly soluble）を含む意味である。これは「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（USP、Remington、Mack Publishing Company発行）に定義されている用語である。
【0156】
前記難溶性の物質は、例えば１気圧、２５℃での水溶解度が１０ｇ／Ｌ未満、具体的には５ｇ／Ｌ未満、より具体的には１ｇ／Ｌ未満であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0157】
担持されるＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質が水溶性（親水性）である場合には、粒子の表面及び／又は気孔内部が親水性置換基を有することにより、多孔性シリカ粒子とＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質との結合力が増加し得る。これにより、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子が親水性置換基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。
【0158】
水溶性物質は、例えば１気圧、２５℃での水溶解度が１０ｇ／Ｌ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0159】
担持されるＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質が電荷を帯びる場合には、粒子の表面及び／又は気孔内部がその逆の電荷に帯電することにより、多孔性シリカ粒子とＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質との結合力が増加し得る。これにより、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子が酸性基または塩基性基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。
【0160】
具体的には、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質が中性のｐＨで陽電荷を帯びるものであれば、粒子の表面及び／又は気孔内部が中性のｐＨで陰電荷に帯電するものであってよい。これにより、多孔性シリカ粒子とＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質との結合力が増加して、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子がカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、スルホン酸基（－ＳＯ３Ｈ）などの酸性基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。
【0161】
また、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質が中性のｐＨで陰電荷を帯びるものであれば、粒子の表面及び／又は気孔内部が陽電荷に帯電するものであってもよい。これにより、多孔性シリカ粒子とＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質との結合力が増加して、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子がアミノ基、その他窒素含有基などの塩基性基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。
【0162】
ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質は、必要な治療の種類、放出環境、使用される多孔性シリカ粒子に依存して、例えば７日～１年またはそれ以上の期間にわたって放出され得る。
【0163】
また、本発明の多孔性シリカ粒子は、生分解性で１００％分解され得るので、これに担持されたＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質は、１００％放出され得る。
【0164】
前記核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＰＮＡまたはｍｉＲＮＡの１つの鎖（strand）をなすものであってもよい。このような場合には、前記ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＰＮＡまたはｍｉＲＮＡは、ＲＮＡi（ＲＮＡ干渉；RNA interference）によって、前記ＴＳＬＰ遺伝子の発現を抑制するものであってもよく、より具体的には、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合してＴＳＬＰ遺伝子の発現を抑制するものであってもよい。
【0165】
前記核酸分子は、具体的には、下記表１に示す配列番号１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号４７の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号２の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号４８の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２５の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号３の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号４９の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２６の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号４の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５０の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２７の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号５の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５１の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２８の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号６の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５２の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号２９の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号７の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５３の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３０の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号８の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５４の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３１の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号９の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５５の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３２の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１０の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５６の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３３の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５７の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１２の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５８の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３５の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１３の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５９の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３６の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１４の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６０の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３７の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１５の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６１の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３８の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１６の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６２の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３９の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１７の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６３の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号４０の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１８の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６４の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号４１の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号１９の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６５の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号４２の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号２０の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６６の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号４３の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号２１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６７の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号４４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号２２の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６８の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号４５の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号２３の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６９の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡまたは配列番号４６の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡの１つ以上であってもよいが、これらに限定されない。なお、以下に示す表１及び２において、「Target sequence」は「標的配列」を、「Position in gene sequence」は「遺伝子配列の位置」を、「GC content」は「GC含有量」を、「Sense strand」は「センス鎖」を、「Antisense strand」は「アンチセンス鎖」を、それぞれ意味する。
【0166】
【表1】
【0167】
本発明の核酸分子は、ヒトを含む動物、例えば、サル（monkeys）、ブタ（pigs）、ウマ（horses）、ウシ（cows）、ヒツジ（sheeps）、イヌ（dogs）、ネコ（cats）、マウス（mice）、ウサギ（rabbits）などに由来するものであってもよく、好ましくは、ヒト由来のものであってもよい。
【0168】
本発明の核酸分子は、それを構成する核酸分子の作用性等価物、例えば、本発明の核酸分子の一部の塩基配列が、欠失（deletion）、置換（substitution）または挿入（insertion）によって変形されたが、本発明の核酸分子と機能的に同じ作用をすることができる変異体（variants）を含む概念である。
【0169】
より具体的には、本発明の核酸分子がｓｉＲＮＡのセンスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡをなす場合には、前記センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡ配列の３’末端にＵＵまたはｄＴｄＴの配列をさらに含むものであってもよい。これは核酸加水分解酵素への抵抗性の増大によるｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの構造的安定性の向上、安定したＲＩＳＣの誘導によるｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡのＲＮＡｉ効率性の向上などの利点をｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡに付与することができる。
【0170】
本発明の核酸分子は、標準分子生物学技術、例えば、化学的合成方法または組換え方法を用いて分離または製造するか、又は市販のものを使用することができる。また、本発明の組成物は、本発明の核酸分子そのものだけでなく、細胞内で本発明の核酸分子の発現率を増加させることができる他の物質、例えば化合物、天然物、新規タンパク質などを含むことができる。
【0171】
一方、本発明の核酸分子は、細胞内発現のためのベクターに含んで提供することができる。
【0172】
本発明の核酸分子は、ＤＮＡ及びＤＥＡＥ－デキストランの複合体、ＤＮＡ及び核タンパク質の複合体、ＤＮＡ及び脂質の複合体などの様々な形質転換技術を用いて細胞内に導入できる。そのために、本発明の核酸分子は、細胞内への効率的な導入を可能にする送達体内に含まれたものであってもよい。前記送達体は、好ましくはベクターであり、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターのいずれも使用可能である。ウイルスベクター（viral vector）としては、例えば、レンチウイルス（lentivirus）、レトロウイルス（retrovirus）、アデノウイルス（adenovirus）、ヘルペスウイルス（herpes virus）およびアビポックスウイルス（avipox virus）ベクターなどを使用することができ、好ましくはレンチウイルスベクターであるが、これらに限定されるものではない。レンチウイルスは、レトロウイルスの一種であり、核膜孔（nucleopore）や完全な核膜への能動導入を可能にする事前－統合複合体（ウイルス「シェル（shell）」）の求核性により、分裂細胞だけでなく、未分裂細胞も感染させる特徴がある。
【0173】
また、本発明の核酸分子を含むベクターは、選別マーカーをさらに含むことが好ましい。前記「選別マーカー（selection marker）」とは、本発明の核酸分子が導入された細胞の選別を容易にするためのものである。前記ベクターで使用できる選別マーカーとしては、ベクターの導入有無を容易に検出または測定できる遺伝子であれば特に限定されないが、代表的には、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能な表現型を付与するマーカー、例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ピューロマイシン（puromycin）、ネオマイシン（Neomycin：Neo）、ハイグロマイシン（hygromycin：Hyg）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（histidinol dehydrogenase gene：hisD）、及びグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（guanine phosphosribosyltransferase：Gpt）などがあり、好ましくは、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）及びピューロマイシンマーカーを使用することができる。
【0174】
また、本発明は、上述したＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を担持した多孔性シリカ粒子；を含むＴＳＬＰ遺伝子発現抑制用組成物；を含む、アトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供するものである。
【0175】
前記核酸分子、多孔性シリカ粒子、ＴＳＬＰ遺伝子発現の抑制等に関する具体的な内容は前述の通りである。
【0176】
本発明の薬学的組成物は、アトピー性疾患の予防または治療効果を有するものであり、この効果は本発明の核酸分子のＴＳＬＰ遺伝子の発現を抑制することにより達成される効果であり得る。
【0177】
本発明の薬学的組成物の予防または治療の対象疾患であるアトピー性疾患の例としては、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、掻痒症または食物アレルギーのようなアレルギー性疾患からなる群より選択される少なくとも一つの疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、ＴＳＬＰの過剰発現による疾患に該当するものであれば特に制限されない。
【0178】
「アトピー性皮膚炎」は、アトピー性皮膚炎によって皮膚の感染部位が変化した状態を意味する。この状態は、皮膚疾患とみなされる状態および皮膚疾患とみなされない状態をすべて含む。
【0179】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、担体と共に製剤化することができる。本発明で用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せず投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤を意味する。液状溶液に製剤化される組成物において薬学的に許容可能な担体は、滅菌および生体に適したものとして、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液及び静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
【0180】
本発明の薬学的組成物は、本発明の核酸分子を有効成分として含むいずれの剤型にも適用可能であり、経口用または非経口用の剤形に製造することができる。本発明の薬学的剤形は、口腔（oral）、直腸（rectal）、鼻腔（nasal）、局所（topical；頬及び舌下を含む）、皮下、膣（vaginal）または非経口（parenteral；筋肉内、皮下及び静脈内を含む）投与に適したもの、あるいは吸入（inhalation）または注入（insufflation）による投与に適した形態を含む。
【0181】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量を投与する。有効容量は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、排出割合、治療期間、同時使用される薬物を含む要素、及びその他の医学分野でよく知られている要素によって決定できる。本発明の薬学的組成物は、個々の治療剤として投与しても、他の治療剤と併用して投与してもよい。また、従来の治療剤と順次または同時に投与することができ、単一または多重投与することができる。前記の要素をすべて考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定され得る。
【0182】
本発明の薬学的組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食物、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによってその範囲が非常に多様である。適正な投与量は、例えば、患者の体内に蓄積された薬物の量及び／又は使用される本発明の核酸分子の具体的な効能程度によって異なり得る。一般的に、イン・ビボ動物モデル及びイン・ビトロで効果的なものと測定されたＥＣ５０に基づいて計算することができ、例えば、体重１ｋｇ当たりに０．０１μｇ～１ｇであってもよい。日、週、月、または年の単位期間に、単位期間当たりの一回または数回に分けて投与してもよく、若しくはインフュージョンポンプを用いて長期間連続して投与してもよい。反復投与の回数は、薬物の体内滞在時間、体内薬物濃度などを考慮して決定する。疾患の治療経過によっては、治療された後でも再発防止のために組成物を投与することができる。
【0183】
本発明の薬学的組成物は、アトピー性疾患の治療に関連して同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上、または有効成分の溶解性及び／又は吸収性を維持／増加させる化合物をさらに含有することができる。また必要に応じて、化学治療剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、及び／又は免疫調節剤などをさらに含むことができる。
【0184】
また、本発明の薬学的組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供できるように、当該分野で公知の方法を用いて剤形化することができる。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質のゼラチンカプセル、滅菌注射液、滅菌粉末の形態であってもよい。
【0185】
さらに、本発明は、前述したＴＳＬＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を担持した多孔性シリカ粒子；を含むＴＳＬＰ遺伝子発現抑制用組成物；を含む、アトピー性疾患の予防または改善用の化粧料組成物を提供するものである。
【0186】
前記核酸分子、多孔性シリカ粒子、ＴＳＬＰ遺伝子発現の抑制、アトピー性疾患等の詳細は、前述の通りである。
【0187】
本発明の化粧料組成物は、アトピー性疾患の予防または改善効果を有するものであり、この効果は本発明の核酸分子のＴＳＬＰ遺伝子の発現を抑制することにより達成される効果であり得る。
【0188】
本発明の化粧料組成物は、化粧料組成物に通常使用される成分をさらに含むことができ、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常の補助剤および担体を含むことができるが、これらに限定されない。
【0189】
前記組成物を添加できる製品としては、例えば、収斂化粧水、柔軟化粧水、栄養化粧水、各種クリーム、エッセンス、パック、ファンデーションなどの化粧品類とクレンジング、洗顔剤、石鹸、トリートメント、美容液などがあるが、これらに限定されない。
【0190】
本発明の化粧料組成物の具体的な剤形は、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、エッセンス、栄養エッセンス、パック、石鹸、シャンプー、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディローション、ボディクレンザー、乳液、口紅、メークアップベース、ファンデーション、プレスパウダー、ルースパウダー、アイシャドウなどの剤形を含むことができるが、これらに限定されない。
【0191】
また、本発明は、アトピー性疾患の治療方法に関するものである。
【0192】
本発明のアトピー性疾患の治療方法は、ＴＳＬＰの発現を抑制させる物質を担持した多孔性シリカ粒子を個体に投与することを含む。
【0193】
ＴＳＬＰの発現を抑制させる物質は、前述した範囲内のものであってもよい。
【0194】
多孔性シリカ粒子は、先に例示した範囲内のものであってもよく、先に例示した範囲内の方法／条件などで製造されたものであってもよい。
【0195】
個体は、ヒトを含む哺乳類であってもよく、具体的にはヒトであってもよい。
【0196】
前記ＴＳＬＰの発現を抑制させる物質は、組成物の形態で前述した範囲内の方法で剤形化することができる。
【0197】
投与方法は限定されず、例えば、口腔（oral）、直腸（rectal）、鼻腔（nasal）、局所（topical；頬及び舌下を含む）、皮下、膣（vaginal）または非経口（parenteral；筋肉内、皮下及び静脈内を含む）投与に適したもの、あるいは吸入（inhalation）または注入（insufflation）による投与などの方法であってもよい。
【0198】
また、本発明は、ＴＳＬＰの発現を抑制させる物質を担持した多孔性シリカ粒子のアトピー性疾患の予防または治療用の医薬組成物を製造するための用途に関するものである。
【0199】
ＴＳＬＰの発現を抑制させる物質は、前述した範囲内のものであってもよい。
【0200】
多孔性シリカ粒子は、先に例示した範囲内のものであってもよく、先に例示した範囲内の方法／条件などで製造されたものであってもよい。
【0201】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明することにする。
【0202】
以下、本発明で使用されるｓｉＲＮＡは「ｓｉＴＳＬＰ」に、本発明の多孔性シリカ粒子は「ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬまたはＤＤＶ」に、ｓｉＴＳＬＰが担持されたＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬは「ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ 」に略称することがある。
【0203】
実験方法
１．実験材料
ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬとＴＡＭＲＡが結合したＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬは、Ｌｅｍｏｎｅｘ，Ｉｎｃ．（ソウル、大韓民国）から提供された。細胞計数キット－８（Cell counting kit－8）は、Dojindo molecular technologies，Inc．（Maryland、USA）から購入した。１０％リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、ロズウェルパーク記念研究所１６４０（ＲＰＭＩ １６４０）、ペニシリン－ストレプトマイシン及び０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡは、ＷｅｌＧｅｎｅ（大韓民国）から購入した。ＰＣＲプライマーは、いずれもＣｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ（ソウル、大韓民国）から購入した。Ｔｒｉｚｏｌ細胞溶解液は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Carlsbad、CA、USA）から購入した。ＰＣＲ試薬は、いずれもＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．（Shiga、Japan）から購入した。すべての化学物質は、受領してそのまま使用した。
１．実験材料
ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬとＴＡＭＲＡが結合したＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬは、Ｌｅｍｏｎｅｘ，Ｉｎｃ．（ソウル、大韓民国）から提供された。細胞計数キット－８（Cell counting kit－8）は、Dojindo molecular technologies，Inc．（Maryland、USA）から購入した。１０％リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、ロズウェルパーク記念研究所１６４０（ＲＰＭＩ １６４０）、ペニシリン－ストレプトマイシン及び０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡは、ＷｅｌＧｅｎｅ（大韓民国）から購入した。ＰＣＲプライマーは、いずれもＣｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ（ソウル、大韓民国）から購入した。Ｔｒｉｚｏｌ細胞溶解液は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Carlsbad、CA、USA）から購入した。ＰＣＲ試薬は、いずれもＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．（Shiga、Japan）から購入した。すべての化学物質は、受領してそのまま使用した。
【0204】
ＴＳＬＰの発現の誘導に用いられるＳＬＩＧＲＬペプチドは、Ｌｅｍｏｎｅｘ（ソウル、大韓民国）によって合成された。合成されたペプチドのＭＳ分析の結果を図１に示す。
【0205】
塩基配列は、米国国立生物情報センター（http://www.ncbi.nim.nih.gov）で検索可能であり、公式シンボル（ＴＳＬＰ）と公式名称thymic stromal lymphopoietinとして記載される。承認番号ＮＭ_０３３０３５．４のヒト配列を用いて、ヒトＴＳＬＰに対するｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ配列をデザインした。ｓｉＲＮＡデザインを提供するインターネットサイトのうち、ＧＥヘルスケア（http://dharmacon.gelifesciences.com/designcenter/?redirect=true）でDharmacon RNAi & Gene Expressionサービスを通じてｓｉＲＮＡをデザインした。このとき、デザインしたＤＮＡ切片の中、ターゲット配列のＧＣ含有量が３０％～７０％であるｓｉＲＮＡ配列１～配列１０までの配列１０個を選別した。また、配列１１～配列２３までの配列１３個は、発明者がＧＣ含有量が３０％～７０％であるｓｉＲＮＡ配列をデザインした。最終選別された２３個のｓｉＲＮＡは、バイオニア（http://www.bioneer.co.kr）に注文依頼して作製した。このとき、ｓｉＲＮＡの作製のために、ＴＳＬＰのターゲット配列に対するセンス配列及びアンチセンス配列をそれぞれデザインした。また、それぞれの単一の配列であるセンス配列とアンチセンス配列を特異的な塩基対結合によってｓｉＲＮＡ及びｄｓＲＮＡを作製した。
【0206】
前記記載された配列の具体的な情報を、添付の配列表及び下記表２に具体的に示す。
【0207】
【表2】
【0208】
２．多孔性シリカ粒子（ＤＤＶまたはＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ）
２－１．多孔性シリカ粒子の製造
（１）多孔性シリカ粒子の製造
１）小気孔粒子の製造
２Ｌ丸底フラスコに蒸留水（ＤＷ）の９６０ｍｌとＭｅＯＨの８１０ｍｌを入れた。前記フラスコにＣＴＡＢを７．８８ｇ入れた後、攪拌しながら１Ｍ ＮａＯＨの４．５２ｍｌを素早く入れた。１０分間攪拌して均一な混合液を得た後、ＴＭＯＳの２．６ｍｌを入れた。６時間攪拌して均一に混合した後、２４時間熟成し、反応液を得た。
その後、前記反応液を２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノール及び蒸留水で交互に５回洗浄した。
その後、７０℃のオーブンで乾燥し、１．５ｇの粉末状の小気孔多孔性シリカ粒子（気孔平均直径２ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。
２－１．多孔性シリカ粒子の製造
（１）多孔性シリカ粒子の製造
１）小気孔粒子の製造
２Ｌ丸底フラスコに蒸留水（ＤＷ）の９６０ｍｌとＭｅＯＨの８１０ｍｌを入れた。前記フラスコにＣＴＡＢを７．８８ｇ入れた後、攪拌しながら１Ｍ ＮａＯＨの４．５２ｍｌを素早く入れた。１０分間攪拌して均一な混合液を得た後、ＴＭＯＳの２．６ｍｌを入れた。６時間攪拌して均一に混合した後、２４時間熟成し、反応液を得た。
その後、前記反応液を２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノール及び蒸留水で交互に５回洗浄した。
その後、７０℃のオーブンで乾燥し、１．５ｇの粉末状の小気孔多孔性シリカ粒子（気孔平均直径２ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。
【0209】
２）気孔の拡張
１．５ｇの小気孔多孔性シリカ粒子の粉末をエタノール１０ｍｌに添加して超音波分散し、水１０ｍｌ、ＴＭＢ（trimethyl benzene）１０ｍｌを添加して超音波分散し、分散液を得た。
その後、前記分散液をオートクレーブに入れて１６０℃、４８時間反応させた。
反応は２５℃で開始し、１０℃／分の速度で昇温して行った。その後、オートクレーブ内で１～１０℃／分の速度で徐々に冷却した。
冷却した反応液を２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
その後７０℃のオーブンで乾燥し、粉末状の多孔性シリカ粒子（気孔直径１０～１５ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。
１．５ｇの小気孔多孔性シリカ粒子の粉末をエタノール１０ｍｌに添加して超音波分散し、水１０ｍｌ、ＴＭＢ（trimethyl benzene）１０ｍｌを添加して超音波分散し、分散液を得た。
その後、前記分散液をオートクレーブに入れて１６０℃、４８時間反応させた。
反応は２５℃で開始し、１０℃／分の速度で昇温して行った。その後、オートクレーブ内で１～１０℃／分の速度で徐々に冷却した。
冷却した反応液を２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
その後７０℃のオーブンで乾燥し、粉末状の多孔性シリカ粒子（気孔直径１０～１５ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。
【0210】
３）か焼
前記２）で製造された多孔性シリカ粒子をガラスバイアル（vial）に入れて５５０℃で５時間加熱し、反応終了後、常温まで徐々に冷却して粒子を製造した。
前記２）で製造された多孔性シリカ粒子をガラスバイアル（vial）に入れて５５０℃で５時間加熱し、反応終了後、常温まで徐々に冷却して粒子を製造した。
【0211】
（２）多孔性シリカ粒子の製造
気孔拡張時の反応条件を１４０℃、７２時間に変更した以外は、前記２－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
気孔拡張時の反応条件を１４０℃、７２時間に変更した以外は、前記２－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0212】
（３）多孔性シリカ粒子の製造（１０Ｌスケール）
５倍大きな容器を使用し、各物質をいずれも５倍の容量で使用した以外は、実施例２－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
５倍大きな容器を使用し、各物質をいずれも５倍の容量で使用した以外は、実施例２－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0213】
（４）多孔性シリカ粒子の製造（粒径３００ｎｍ）
小気孔粒子の製造時に蒸留水９２０ｍｌ、メタノール８５０ｍｌを使用した以外は、２－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
小気孔粒子の製造時に蒸留水９２０ｍｌ、メタノール８５０ｍｌを使用した以外は、２－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0214】
（５）多孔性シリカ粒子の製造（粒径５００ｎｍ）
小気孔粒子の製造時に蒸留水８００ｍｌ、メタノール１，０１０ｍｌ、ＣＴＡＢ １０．６ｇを使用した以外は、２－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
小気孔粒子の製造時に蒸留水８００ｍｌ、メタノール１，０１０ｍｌ、ＣＴＡＢ １０．６ｇを使用した以外は、２－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0215】
（６）多孔性シリカ粒子の製造（粒径１，０００ｎｍ）
小気孔粒子の製造時に蒸留水６２０ｍｌ、メタノール１，３８０ｍｌ、ＣＴＡＢ ７．８８ｇを使用した以外は、２－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
小気孔粒子の製造時に蒸留水６２０ｍｌ、メタノール１，３８０ｍｌ、ＣＴＡＢ ７．８８ｇを使用した以外は、２－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0216】
（７）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径４ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを２．５ｍｌ使用した以外は、２－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
気孔拡張時にＴＭＢを２．５ｍｌ使用した以外は、２－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0217】
（８）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径７ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを４．５ｍｌ使用した以外は、２－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
気孔拡張時にＴＭＢを４．５ｍｌ使用した以外は、２－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0218】
（９）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径１７ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを１１ｍｌ使用した以外は、２－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
気孔拡張時にＴＭＢを１１ｍｌ使用した以外は、２－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0219】
（１０）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径２３ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを１２．５ｍｌ使用した以外は、２－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
気孔拡張時にＴＭＢを１２．５ｍｌ使用した以外は、２－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0220】
（１１）多孔性シリカ粒子の製造（二重改質）
１）小気孔粒子の製造
実施例２－１－（１）－１）の方法と同様にして小気孔粒子を製造した。
１）小気孔粒子の製造
実施例２－１－（１）－１）の方法と同様にして小気孔粒子を製造した。
【0221】
２）気孔の拡張
実施例２－１－（１）－２）の方法と同様にして小気孔粒子をＴＭＢと反応させ、冷却し、遠心分離して上澄み液を除去した。その後、実施例２－１－（１）－２）と同じ条件で遠心分離し、エタノール及び蒸留水で交互に３回洗浄した。その後、実施例２－１－（１）－２）と同じ条件で乾燥し、粉末状の多孔性シリカ粒子（気孔直径１０～１５ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。
実施例２－１－（１）－２）の方法と同様にして小気孔粒子をＴＭＢと反応させ、冷却し、遠心分離して上澄み液を除去した。その後、実施例２－１－（１）－２）と同じ条件で遠心分離し、エタノール及び蒸留水で交互に３回洗浄した。その後、実施例２－１－（１）－２）と同じ条件で乾燥し、粉末状の多孔性シリカ粒子（気孔直径１０～１５ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。
【0222】
３）表面改質
気孔が拡張された多孔性シリカ粒子０．８ｇ～１ｇを５０ｍｌのトルエンに分散した後、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3－aminopropyl）triethoxysilane）を５ｍｌ入れて１２０℃で還流したまま１２時間加熱した。この過程では、前述の洗浄過程および乾燥過程を経た後、１ｍｌのトリエチレングリコール（PEG3，2－[2－（2－methoxyethoxy）ethoxy] acetic acid）と、１００ｍｇのＥＤＣ（1－Ethyl－3－（3－dimethylaminopropyl）carbodiimide）と、２００ｍｇのＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（N－Hydroxysuccinimide，ＮＨＳ）を３０ｍｌのＰＢＳに分散して常温で攪拌したまま１２時間反応する。その後、生成物は、前記の洗浄及び乾燥過程を経る。
気孔内部に、前のステップの反応液が残っているため、気孔内部は改質されない。
気孔が拡張された多孔性シリカ粒子０．８ｇ～１ｇを５０ｍｌのトルエンに分散した後、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3－aminopropyl）triethoxysilane）を５ｍｌ入れて１２０℃で還流したまま１２時間加熱した。この過程では、前述の洗浄過程および乾燥過程を経た後、１ｍｌのトリエチレングリコール（PEG3，2－[2－（2－methoxyethoxy）ethoxy] acetic acid）と、１００ｍｇのＥＤＣ（1－Ethyl－3－（3－dimethylaminopropyl）carbodiimide）と、２００ｍｇのＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（N－Hydroxysuccinimide，ＮＨＳ）を３０ｍｌのＰＢＳに分散して常温で攪拌したまま１２時間反応する。その後、生成物は、前記の洗浄及び乾燥過程を経る。
気孔内部に、前のステップの反応液が残っているため、気孔内部は改質されない。
【0223】
４）気孔内部の洗浄
表面改質された粒子粉末８００ｍｇを２Ｍ ＨＣｌ／エタノール４０ｍｌに溶かし、１２時間強く撹拌下で還流した。
その後、冷却された反応液を１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
その後、７０℃のオーブン中で乾燥して粉末状の多孔性シリカ粒子を得た。
表面改質された粒子粉末８００ｍｇを２Ｍ ＨＣｌ／エタノール４０ｍｌに溶かし、１２時間強く撹拌下で還流した。
その後、冷却された反応液を１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
その後、７０℃のオーブン中で乾燥して粉末状の多孔性シリカ粒子を得た。
【0224】
５）気孔内部の改質
ｉ）後述する実施例２－２－（２）－１）の方法と同様にして気孔内部にプロピル基を導入した。
ｉｉ）後述する実施例２－２－（２）－２）の方法と同様にして気孔内部にオクチル基を導入した。
ｉ）後述する実施例２－２－（２）－１）の方法と同様にして気孔内部にプロピル基を導入した。
ｉｉ）後述する実施例２－２－（２）－２）の方法と同様にして気孔内部にオクチル基を導入した。
【0225】
２－２．多孔性シリカ粒子の表面改質
（１）陽電荷での帯電
１）粒径３００ｎｍの粒子
実施例２－１－（４）の多孔性シリカ粒子を（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3－Aminopropyl）triethoxysilane，ＡＰＴＥＳ）と反応させて、陽電荷に帯電させた。
具体的には、１００ｍＬ丸底フラスコにおいて、１００ｍｇの多孔性シリカ粒子を１０ｍＬのトルエンに洗浄器（bath sonicator）で分散させた。その後、１ｍＬのＡＰＴＥＳを添加し、４００ｒｐｍで攪拌し、１３０℃で攪拌して１２時間反応させた。
反応後、常温まで徐々に冷却し、１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
その後、７０℃のオーブン中で乾燥し、表面および気孔内部にアミノ基を有する粉末状の多孔性シリカ粒子を得た。
（１）陽電荷での帯電
１）粒径３００ｎｍの粒子
実施例２－１－（４）の多孔性シリカ粒子を（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3－Aminopropyl）triethoxysilane，ＡＰＴＥＳ）と反応させて、陽電荷に帯電させた。
具体的には、１００ｍＬ丸底フラスコにおいて、１００ｍｇの多孔性シリカ粒子を１０ｍＬのトルエンに洗浄器（bath sonicator）で分散させた。その後、１ｍＬのＡＰＴＥＳを添加し、４００ｒｐｍで攪拌し、１３０℃で攪拌して１２時間反応させた。
反応後、常温まで徐々に冷却し、１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
その後、７０℃のオーブン中で乾燥し、表面および気孔内部にアミノ基を有する粉末状の多孔性シリカ粒子を得た。
【0226】
２）粒径２００ｎｍの粒子
ｉ）実施例２－１－（１）の多孔性シリカ粒子を（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3－Aminopropyl）triethoxysilane，ＡＰＴＥＳ）と反応させて陽電荷に帯電させ、ＡＰＴＥＳを０．４ｍｌ添加し、反応時間を３時間とした以外は、前記実施例２－２－（１）－１）の方法と同様にして改質した。
ｉｉ）実施例２－１－（９）の多孔性シリカ粒子を（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3－Aminopropyl）triethoxysilane，ＡＰＴＥＳ）と反応させて陽電荷に帯電させ、それ以外は、前記実施例２－２－（１）－１）の方法と同様にして改質した。
ｉｉｉ）実施例２－１－（１０）の多孔性シリカ粒子を（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3－Aminopropyl）triethoxysilane，ＡＰＴＥＳ）と反応させて陽電荷に帯電させ、それ以外は、前記実施例２－２－（１）－１）の方法と同様にして改質した。
ｉ）実施例２－１－（１）の多孔性シリカ粒子を（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3－Aminopropyl）triethoxysilane，ＡＰＴＥＳ）と反応させて陽電荷に帯電させ、ＡＰＴＥＳを０．４ｍｌ添加し、反応時間を３時間とした以外は、前記実施例２－２－（１）－１）の方法と同様にして改質した。
ｉｉ）実施例２－１－（９）の多孔性シリカ粒子を（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3－Aminopropyl）triethoxysilane，ＡＰＴＥＳ）と反応させて陽電荷に帯電させ、それ以外は、前記実施例２－２－（１）－１）の方法と同様にして改質した。
ｉｉｉ）実施例２－１－（１０）の多孔性シリカ粒子を（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3－Aminopropyl）triethoxysilane，ＡＰＴＥＳ）と反応させて陽電荷に帯電させ、それ以外は、前記実施例２－２－（１）－１）の方法と同様にして改質した。
【0227】
（２）疎水性基の導入
１）プロピル基
前記実施例２－１－（１）の多孔性シリカ粒子をトリメトキシ（プロピル）シラン（Trimethoxy（propyl）silane）と反応させて、表面および気孔内部にプロピル基を導入し、ＡＰＴＥＳの代わりにトリメトキシ（プロピル）シラン（Trimethoxy（propyl）silane）を０．３５ｍｌ添加し、１２時間反応させた以外は、前記実施例２－２－（１）の方法と同様にして改質した。
１）プロピル基
前記実施例２－１－（１）の多孔性シリカ粒子をトリメトキシ（プロピル）シラン（Trimethoxy（propyl）silane）と反応させて、表面および気孔内部にプロピル基を導入し、ＡＰＴＥＳの代わりにトリメトキシ（プロピル）シラン（Trimethoxy（propyl）silane）を０．３５ｍｌ添加し、１２時間反応させた以外は、前記実施例２－２－（１）の方法と同様にして改質した。
【0228】
２）オクチル基
前記実施例２－１－（１）の多孔性シリカ粒子をトリメトキシ－ｎ－オクチルシラン（Trimethoxy－n－octylsilane）と反応させて、表面および気孔内部にプロピル基を導入し、ＡＰＴＥＳの代わりにトリメトキシ－ｎ－オクチルシラン（Trimethoxy－n－octylsilane）を０．５ｍｌ添加し、１２時間反応させた以外は、前記実施例２－２－（１）の方法と同様にして改質した。
前記実施例２－１－（１）の多孔性シリカ粒子をトリメトキシ－ｎ－オクチルシラン（Trimethoxy－n－octylsilane）と反応させて、表面および気孔内部にプロピル基を導入し、ＡＰＴＥＳの代わりにトリメトキシ－ｎ－オクチルシラン（Trimethoxy－n－octylsilane）を０．５ｍｌ添加し、１２時間反応させた以外は、前記実施例２－２－（１）の方法と同様にして改質した。
【0229】
（３）陰電荷での帯電
１）カルボキシル基
前記実施例２－１－（１）の多孔性シリカ粒子を無水コハク酸（succinic anhydride）と反応させて陰電荷に帯電させ、トルエンの代わりにＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を使用し、ＡＰＴＥＳの代わりに８０ｍｇの無水コハク酸（succinic anhydride）を添加して２４時間常温で攪拌し反応させ、洗浄時に蒸留水の代わりにＤＭＳＯを使用した以外は、前記実施例２－２－（１）－１）の方法と同様にして改質した。
１）カルボキシル基
前記実施例２－１－（１）の多孔性シリカ粒子を無水コハク酸（succinic anhydride）と反応させて陰電荷に帯電させ、トルエンの代わりにＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を使用し、ＡＰＴＥＳの代わりに８０ｍｇの無水コハク酸（succinic anhydride）を添加して２４時間常温で攪拌し反応させ、洗浄時に蒸留水の代わりにＤＭＳＯを使用した以外は、前記実施例２－２－（１）－１）の方法と同様にして改質した。
【0230】
２）チオール基
ＡＰＴＥＳの代わりにＭＰＴＥＳの１．１ｍＬを使用した以外は、前記実施例２－２－（１）－１）の方法と同様にして改質した。
ＡＰＴＥＳの代わりにＭＰＴＥＳの１．１ｍＬを使用した以外は、前記実施例２－２－（１）－１）の方法と同様にして改質した。
【0231】
３）スルホン酸基
前記実施例２－２－（３）－２）の多孔性シリカナノ粒子１００ｍｇを、１Ｍ硫酸水溶液１ｍＬと３０％過酸化水素水２０ｍＬに分散して常温で攪拌し、酸化反応を誘導してチオール基をスルホン酸基に酸化した。その後、前記実施例２－２－（１）－１）の方法と同様にして洗浄および乾燥した。
前記実施例２－２－（３）－２）の多孔性シリカナノ粒子１００ｍｇを、１Ｍ硫酸水溶液１ｍＬと３０％過酸化水素水２０ｍＬに分散して常温で攪拌し、酸化反応を誘導してチオール基をスルホン酸基に酸化した。その後、前記実施例２－２－（１）－１）の方法と同様にして洗浄および乾燥した。
【0232】
３．核酸分子の担持
前記実施例２－２－（１）－２）－ｉｉ）の多孔性シリカ粒子１０μｇと５０ｐｍｏｌの核酸分子を１ｘＰＢＳの条件下で混合した後、常温で３０分間置いて積載した。
前記核酸分子は、前記表２の配列の中、配列番号７０の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号９３の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ（以下、ｓｉＴＳＬＰ＃１）、配列番号８３の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号１０６の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ（以下、ｓｉＴＳＬＰ＃１４）、及び／又は配列番号９０の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号１１３の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ（以下、ｓｉＴＳＬＰ＃２１）を用いて下記実験を行った。但し、後述する内容で核酸分子を構成する配列（e.g.センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ）に対し別途の言及がある場合には、別途言及された配列を含む核酸分子を担持したものと見ることができる。
以下では、ｓｉＴＳＬＰ＃１が担持されたＤＤＶをＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ＃１、ｓｉＴＳＬＰ＃１４が担持されたＤＤＶをＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ＃１４、ｓｉＴＳＬＰ＃２１が担持されたＤＤＶをＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ＃２１で表示した。
前記実施例２－２－（１）－２）－ｉｉ）の多孔性シリカ粒子１０μｇと５０ｐｍｏｌの核酸分子を１ｘＰＢＳの条件下で混合した後、常温で３０分間置いて積載した。
前記核酸分子は、前記表２の配列の中、配列番号７０の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号９３の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ（以下、ｓｉＴＳＬＰ＃１）、配列番号８３の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号１０６の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ（以下、ｓｉＴＳＬＰ＃１４）、及び／又は配列番号９０の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号１１３の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ（以下、ｓｉＴＳＬＰ＃２１）を用いて下記実験を行った。但し、後述する内容で核酸分子を構成する配列（e.g.センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ）に対し別途の言及がある場合には、別途言及された配列を含む核酸分子を担持したものと見ることができる。
以下では、ｓｉＴＳＬＰ＃１が担持されたＤＤＶをＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ＃１、ｓｉＴＳＬＰ＃１４が担持されたＤＤＶをＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ＃１４、ｓｉＴＳＬＰ＃２１が担持されたＤＤＶをＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ＃２１で表示した。
【0233】
４．細胞生存の測定
Ａ５４９及びＨａＣａＴ細胞を１００μｌの成長培地（５０～７０％コンフルエント）を有する９６ウェル培養プレートにウェル当たり１０，０００細胞の密度で接種した。細胞を血清含有培地で適切な濃度のＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ（実施例２－２－（１）－２）－ｉｉの多孔性シリカ粒子）で処理し、３７℃で２４時間培養した。培養後、細胞を１ｘＰＢＳで２回洗浄した後、１０μｌのＣＣＫ－８を含有した１００μｌの無血清培地を添加し、さらに１時間培養した。培養プレート内の各ウェルの光学密度を４５０ｎｍの波長で測定した。三重項（deviation of triplicates）の平均及び標準偏差が計算され、プロットされた（図２６を参照）。
Ａ５４９及びＨａＣａＴ細胞を１００μｌの成長培地（５０～７０％コンフルエント）を有する９６ウェル培養プレートにウェル当たり１０，０００細胞の密度で接種した。細胞を血清含有培地で適切な濃度のＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ（実施例２－２－（１）－２）－ｉｉの多孔性シリカ粒子）で処理し、３７℃で２４時間培養した。培養後、細胞を１ｘＰＢＳで２回洗浄した後、１０μｌのＣＣＫ－８を含有した１００μｌの無血清培地を添加し、さらに１時間培養した。培養プレート内の各ウェルの光学密度を４５０ｎｍの波長で測定した。三重項（deviation of triplicates）の平均及び標準偏差が計算され、プロットされた（図２６を参照）。
【0234】
５．細胞ベースのＴＳＬＰノックダウン（knockdown）の分析
５－１．ヒト皮膚角質形成細胞株ＨａＣａＴ細胞の培養
ヒトＴＳＬＰ特異的なｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドが、皮膚細胞で発生するＴＳＬＰの生産を阻害できるかどうかの探索実験を行うために、ヒト皮膚の構成細胞株である角質形成細胞ＨａＣａＴ細胞株（CLC cell line service、Germany）を用いた。ＨａＣａＴ細胞株を１０％ウシ胎児血清（fetal bovine serum，FBS；Gibco BRL、USA）と抗生物質が含有されたＤＭＥＭ培養液（Gibco BRL、USA）で培養した。培養皿は１００ｍｍの培養皿、６－ウェルプレート及び２４－ウェルプレートを用いて、５％ＣＯ２が供給される３７℃のインキュベーターで培養した。培養液は２日毎に交換し、細胞が過剰増殖される直前に継代培養した。
５－１．ヒト皮膚角質形成細胞株ＨａＣａＴ細胞の培養
ヒトＴＳＬＰ特異的なｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドが、皮膚細胞で発生するＴＳＬＰの生産を阻害できるかどうかの探索実験を行うために、ヒト皮膚の構成細胞株である角質形成細胞ＨａＣａＴ細胞株（CLC cell line service、Germany）を用いた。ＨａＣａＴ細胞株を１０％ウシ胎児血清（fetal bovine serum，FBS；Gibco BRL、USA）と抗生物質が含有されたＤＭＥＭ培養液（Gibco BRL、USA）で培養した。培養皿は１００ｍｍの培養皿、６－ウェルプレート及び２４－ウェルプレートを用いて、５％ＣＯ２が供給される３７℃のインキュベーターで培養した。培養液は２日毎に交換し、細胞が過剰増殖される直前に継代培養した。
【0235】
５－２．ＨａＣａＴ細胞にＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰを処理
無血清培地に分散させたＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ（２５ｐｍｏｌ）を、２４－ウェルプレート内で培養したＨａＣａＴ細胞に処理した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で６時間培養した後、無血清培養液を除去した。１ｘＰＢＳで２回洗浄した後、血清含有細胞培地を入れ替えた。さらに６時間後、血清含有培養培地を除去し、１ｘＰＢＳで洗浄した。血清を含有した培地でＳＬＩＧＲＬペプチド（２００μＭ）を細胞に処理した。ＴＳＬＰ誘導を確認するために培養０、６、１２及び２４時間後、Ｔｒｉｚｏｌ（Invitrogen社、USA）を用いて総ＲＮＡを抽出した。
無血清培地に分散させたＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ（２５ｐｍｏｌ）を、２４－ウェルプレート内で培養したＨａＣａＴ細胞に処理した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で６時間培養した後、無血清培養液を除去した。１ｘＰＢＳで２回洗浄した後、血清含有細胞培地を入れ替えた。さらに６時間後、血清含有培養培地を除去し、１ｘＰＢＳで洗浄した。血清を含有した培地でＳＬＩＧＲＬペプチド（２００μＭ）を細胞に処理した。ＴＳＬＰ誘導を確認するために培養０、６、１２及び２４時間後、Ｔｒｉｚｏｌ（Invitrogen社、USA）を用いて総ＲＮＡを抽出した。
【0236】
また、ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰによるＴＳＬＰノックダウンの持続期間を測定するために、ＰＡＭ２１２細胞を無血清培地でＬＮＰを含有したＬＮＰ－ｓｉＴＳＬＰ（mouse）（２５ｐｍｏｌ ｓｉＴＳＬＰ）及びｓｉＴＳＬＰ（mouse）（２５ｐｍｏｌ）で処理した。５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で６時間培養した後、無血清培養液を除去した。１ｘＰＢＳで２回洗浄した後、血清含有細胞培地を入れ替えた。指示された時間培養を行った後、細胞を血清含有培地でＳＬＩＧＲＬ（２００μＭ）を細胞に処理し、ＴＳＬＰ誘導のために、さらに１２時間細胞を培養した。総ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌを用いて抽出した。
【0237】
６．ＲＴ－ＰＣＲ
１μｇの総ＲＮＡとｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混ぜて１６μＬになるように準備した。その後、７０℃で５分間反応させてＲＮＡを変性（denature）させ、氷で急速に冷やした後、短く遠心分離して蒸発した溶液を集めた。その後、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｐｒｅｍｉｘ（エルピスバイオテック、contain random hexamer、5x ready－to－use mix、cat＃EBT－1511）の４μＬを入れてよく混ぜた後、４２℃で１時間反応させた。その後、９４℃で５分間反応した後、氷上で冷やして－２０℃で保存した。
１μｇの総ＲＮＡとｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混ぜて１６μＬになるように準備した。その後、７０℃で５分間反応させてＲＮＡを変性（denature）させ、氷で急速に冷やした後、短く遠心分離して蒸発した溶液を集めた。その後、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｐｒｅｍｉｘ（エルピスバイオテック、contain random hexamer、5x ready－to－use mix、cat＃EBT－1511）の４μＬを入れてよく混ぜた後、４２℃で１時間反応させた。その後、９４℃で５分間反応した後、氷上で冷やして－２０℃で保存した。
【0238】
次いで、ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを７．４μＬ、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（５μＭ）をそれぞれ０．８μＬ、先に合成したｃＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅを１μＬ、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（appliedbiosystems、2x ready－to－use mix、cat＃4367659）を１０μＬ混ぜて混合溶液を作成した。
【0239】
ｍＲＮＡ発現量の分析に用いられたＲＴ－ＰＣＲプライマー配列は、表３に示す通りである。
【0240】
【表3】
【0241】
ＰＣＲは、９５℃で３分間変性（denature）した後、９５℃で１０秒、６０℃で５秒、２ステップサイクルを繰り返した（ＧＡＰＤＨ：３０サイクル、ＴＳＬＰ：３６サイクル）。最終の反応物を１％アガロースゲル（agarose gel）に供して確認した。
【0242】
７．ｓｉＴＳＬＰ及び多孔性シリカ粒子が投与された部位の生体組織イメージング
ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ（０．７ｎｍｏｌ ｓｉＴＳＬＰ（mouse）、１５０μｇ ＤＤＶ）（ＦＩＴＣ－接合ｓｉＴＳＬＰ（mouse）及びＴＡＭＲＡ－ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ）２０μｌをマウスの頬部位の皮膚に注射した。前記ＤＤＶとしては、実施例２－２－（１）－２）－ｉｉ）の多孔性シリカ粒子を用いた。ｓｉＴＳＬＰ（mouse）としては、センスＲＮＡ配列（5’－CGAGCAAAUCGAGGACUGUdTdT－3’（配列番号１２４））及びアンチセンスＲＮＡ配列（5’－ACAGUCCUCGAUUUGCUCGdTdT－3’（配列番号１２５））が結合されたものを用いた。マウスを犠牲にした後、ＦＯＢＩイメージング機器（NeoScience Co.，Ltd.、Seoul、Korea）を用いて、切除されたマウスの頬部位の皮膚の蛍光画像を撮影した。得られた皮膚サンプルを４％ＰＦＡ溶液に入れた。サンプルをパラフィンに包埋し、１０μｍの厚さに切断した。脱水過程の後、切片されたサンプルをＤＡＰＩで染色した。サンプルは２０ｘ対物レンズ（Olympus、Tokyo、Japan）が装着されたＢＸ７１顕微鏡により観察した。
ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ（０．７ｎｍｏｌ ｓｉＴＳＬＰ（mouse）、１５０μｇ ＤＤＶ）（ＦＩＴＣ－接合ｓｉＴＳＬＰ（mouse）及びＴＡＭＲＡ－ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ）２０μｌをマウスの頬部位の皮膚に注射した。前記ＤＤＶとしては、実施例２－２－（１）－２）－ｉｉ）の多孔性シリカ粒子を用いた。ｓｉＴＳＬＰ（mouse）としては、センスＲＮＡ配列（5’－CGAGCAAAUCGAGGACUGUdTdT－3’（配列番号１２４））及びアンチセンスＲＮＡ配列（5’－ACAGUCCUCGAUUUGCUCGdTdT－3’（配列番号１２５））が結合されたものを用いた。マウスを犠牲にした後、ＦＯＢＩイメージング機器（NeoScience Co.，Ltd.、Seoul、Korea）を用いて、切除されたマウスの頬部位の皮膚の蛍光画像を撮影した。得られた皮膚サンプルを４％ＰＦＡ溶液に入れた。サンプルをパラフィンに包埋し、１０μｍの厚さに切断した。脱水過程の後、切片されたサンプルをＤＡＰＩで染色した。サンプルは２０ｘ対物レンズ（Olympus、Tokyo、Japan）が装着されたＢＸ７１顕微鏡により観察した。
【0243】
実験結果
１．本発明の核酸分子のＴＳＬＰ発現抑制の分析
前記表２に含まれた配列によって製造された核酸分子（ｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ）のＴＳＬＰの発現抑制率を確認するために、核酸分子をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Invitrogen社、USA）と陽イオンリポソーム（cationic liposome）を用いてＨａＣａＴ細胞にトランスフェクションを行った後、ＴＳＬＰ発現抑制効率を確認した。
核酸分子（ｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ）を用いたＴＳＬＰの発現抑制率を下記表４に示す。
１．本発明の核酸分子のＴＳＬＰ発現抑制の分析
前記表２に含まれた配列によって製造された核酸分子（ｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ）のＴＳＬＰの発現抑制率を確認するために、核酸分子をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Invitrogen社、USA）と陽イオンリポソーム（cationic liposome）を用いてＨａＣａＴ細胞にトランスフェクションを行った後、ＴＳＬＰ発現抑制効率を確認した。
核酸分子（ｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ）を用いたＴＳＬＰの発現抑制率を下記表４に示す。
【0244】
【表4】
【0245】
２．多孔性シリカ粒子（ＤＤＶまたはＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ）
２－１．粒子の形成及び気孔拡張の確認
実験方法の実施例２－１－（１）～（３）の粒子の小気孔粒子、製造された多孔性シリカ粒子を顕微鏡で観察し、小気孔粒子が均一に生成されているか、気孔が十分に拡張されて多孔性シリカ粒子が均一に形成されているかを確認した（図２～５）。
図２は、実施例２－１－（１）の多孔性シリカ粒子の写真、図３は、実施例２－１－（２）の多孔性シリカ粒子の写真であり、気孔が十分に拡張された球状の多孔性シリカ粒子が均一に生成されたことを確認することができる。
図４は、実施例２－１－（１）の小気孔粒子の写真、図５は、実施例２－１－（１）と２－１－（３）の小気孔粒子の比較写真であり、球状の小気孔粒子が均一に生成されたことを確認することができる。
２－１．粒子の形成及び気孔拡張の確認
実験方法の実施例２－１－（１）～（３）の粒子の小気孔粒子、製造された多孔性シリカ粒子を顕微鏡で観察し、小気孔粒子が均一に生成されているか、気孔が十分に拡張されて多孔性シリカ粒子が均一に形成されているかを確認した（図２～５）。
図２は、実施例２－１－（１）の多孔性シリカ粒子の写真、図３は、実施例２－１－（２）の多孔性シリカ粒子の写真であり、気孔が十分に拡張された球状の多孔性シリカ粒子が均一に生成されたことを確認することができる。
図４は、実施例２－１－（１）の小気孔粒子の写真、図５は、実施例２－１－（１）と２－１－（３）の小気孔粒子の比較写真であり、球状の小気孔粒子が均一に生成されたことを確認することができる。
【0246】
２－２．ＢＥＴ表面積および気孔体積の計算
実験方法の実施例２－１－（１）の小気孔粒子、実施例２－１－（１）、（７）、（８）、（１０）の多孔性シリカ粒子の表面積と気孔体積を計算した。表面積は、ブルナウアー－エメット－テラー（Brunauer－Emmett－Teller）（ＢＥＴ）方法により計算し、気孔サイズの分布は、バーレット－ジョイナー－ハレンダ（Barrett－Joyner－Halenda）（ＢＪＨ）方法により計算した。
前記各粒子の顕微鏡写真を図６に、計算の結果を下記表５に示す。
実験方法の実施例２－１－（１）の小気孔粒子、実施例２－１－（１）、（７）、（８）、（１０）の多孔性シリカ粒子の表面積と気孔体積を計算した。表面積は、ブルナウアー－エメット－テラー（Brunauer－Emmett－Teller）（ＢＥＴ）方法により計算し、気孔サイズの分布は、バーレット－ジョイナー－ハレンダ（Barrett－Joyner－Halenda）（ＢＪＨ）方法により計算した。
前記各粒子の顕微鏡写真を図６に、計算の結果を下記表５に示す。
【0247】
【表5】
【0248】
２－３．生分解性の確認
実験方法の実施例２－１－（１）の多孔性シリカ粒子の生分解性を確認するために、３７℃、ＳＢＦ（ｐＨ７．４）における生分解の程度を０時間、１２０時間、３６０時間に顕微鏡で観察した。それを図７に示す。
これを参照すると、多孔性シリカ粒子が生分解され、３６０時間経過後はほぼすべてが分解されたことを確認することができる。
実験方法の実施例２－１－（１）の多孔性シリカ粒子の生分解性を確認するために、３７℃、ＳＢＦ（ｐＨ７．４）における生分解の程度を０時間、１２０時間、３６０時間に顕微鏡で観察した。それを図７に示す。
これを参照すると、多孔性シリカ粒子が生分解され、３６０時間経過後はほぼすべてが分解されたことを確認することができる。
【0249】
２－４．吸光度比の測定
時間別に下記数式１による吸光度比を測定した。
時間別に下記数式１による吸光度比を測定した。
【0250】
[数式１]
Ａｔ／Ａ０
（式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した多孔性シリカ粒子の吸光度である。）
Ａｔ／Ａ０
（式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した多孔性シリカ粒子の吸光度である。）
【0251】
具体的には、多孔性シリカ粒子粉末５ｍｇをＳＢＦ（ｐＨ７．４）５ｍｌに溶かした。その後、５ｍｌの多孔性シリカ粒子溶液を、図８に示す直径５０ｋＤａの気孔を有する透過膜に入れた。外部膜に１５ｍｌのＳＢＦを添加し、外部膜のＳＢＦは１２時間ごとに入れ替えた。多孔性シリカ粒子の分解は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌して行った。
その後、紫外・可視分光法（UV－vis spectroscopy）によって吸光度を測定し、λ＝６４０ｎｍで分析した。
その後、紫外・可視分光法（UV－vis spectroscopy）によって吸光度を測定し、λ＝６４０ｎｍで分析した。
【0252】
（１）吸光度比の測定
実験方法の実施例２－１－（１）の多孔性シリカ粒子の吸光度比を前記方法に従って測定した。その結果を図９に示す。
これを参照すると、吸光度比が１／２となるｔは約５８時間であり、非常にゆっくりと分解されることが確認できた。
実験方法の実施例２－１－（１）の多孔性シリカ粒子の吸光度比を前記方法に従って測定した。その結果を図９に示す。
これを参照すると、吸光度比が１／２となるｔは約５８時間であり、非常にゆっくりと分解されることが確認できた。
【0253】
（２）粒径別
実験方法の実施例２－１－（１）、（５）、（６）の多孔性シリカ粒子の吸光度を前記数式１により測定した。その結果を図１０に示す（懸濁液と溶媒としては、ＳＢＦを使用した。）。
これを参照すると、粒径の増加によってｔが減少することが分かる。
実験方法の実施例２－１－（１）、（５）、（６）の多孔性シリカ粒子の吸光度を前記数式１により測定した。その結果を図１０に示す（懸濁液と溶媒としては、ＳＢＦを使用した。）。
これを参照すると、粒径の増加によってｔが減少することが分かる。
【0254】
（３）気孔の平均直径別
実験方法の実施例２－１－（１）、（９）の多孔性シリカ粒子、そしてコントロールとして実験方法の実施例２－１－（１）の小気孔多孔性シリカ粒子の吸光度を前記数式１により測定した。その結果を図１１に示す（懸濁液と溶媒としては、ＳＢＦを使用した。）。
これを参照すると、実施例の多孔性シリカ粒子は、コントロールに比べてｔが非常に大きいことが確認できる。
実験方法の実施例２－１－（１）、（９）の多孔性シリカ粒子、そしてコントロールとして実験方法の実施例２－１－（１）の小気孔多孔性シリカ粒子の吸光度を前記数式１により測定した。その結果を図１１に示す（懸濁液と溶媒としては、ＳＢＦを使用した。）。
これを参照すると、実施例の多孔性シリカ粒子は、コントロールに比べてｔが非常に大きいことが確認できる。
【0255】
（４）ｐＨ別
実験方法の実施例２－１－（４）の多孔性シリカ粒子のｐＨ別吸光度を測定した。吸光度は、ＳＢＦで、そしてｐＨ２、５及び７．４のＴｒｉｓで測定した。その結果を図１２に示す。
これを参照すると、ｐＨ別にｔの差はあるが、いずれも吸光度の比が１／２となるｔは２４以上であった。
実験方法の実施例２－１－（４）の多孔性シリカ粒子のｐＨ別吸光度を測定した。吸光度は、ＳＢＦで、そしてｐＨ２、５及び７．４のＴｒｉｓで測定した。その結果を図１２に示す。
これを参照すると、ｐＨ別にｔの差はあるが、いずれも吸光度の比が１／２となるｔは２４以上であった。
【0256】
（５）帯電
実験方法の実施例２－２－（１）－１）の多孔性シリカ粒子の吸光度を測定し、その結果を図１３に示す（懸濁液と溶媒としては、トリス（Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４）を使用した。）。
これを参照すると、陽電荷に帯電した粒子も吸光度の比が１／２となるｔは２４以上であった。
実験方法の実施例２－２－（１）－１）の多孔性シリカ粒子の吸光度を測定し、その結果を図１３に示す（懸濁液と溶媒としては、トリス（Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４）を使用した。）。
これを参照すると、陽電荷に帯電した粒子も吸光度の比が１／２となるｔは２４以上であった。
【0257】
２－５．担持した核酸分子の放出
Ｃｙ５－ｓｉＲＮＡをロードした多孔性シリカ粒子１０μｌをＳＢＦ（ｐＨ７．４、３７℃）に再浮遊させ、気孔直径２０ｋＤａの透過膜（図１４のチューブ）に入れた。
その後、透過チューブを１．５ｍｌのＳＢＦに浸漬した。
ｓｉＲＮＡの放出は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌して行われた。
２４時間の前には、０．５、１、２、４、８、１２、２４時間経過した時間に放出溶媒を回収した。その後は２４時間間隔で０．５ｍｌの放出溶媒を蛍光測定のために回収し、等量のＳＢＦを添加した。
Ｃｙ５－ｓｉＲＮＡの蛍光強度は、６７０ｎｍの波長（λｅｘ＝６４７ｎｍ）で測定し、ｓｉＲＮＡの放出程度を測定した。その結果を図１５に示す。
これを参照すると、ｓｉＲＮＡが５０％放出された時間は約４８時間であることを確認することができる。
Ｃｙ５－ｓｉＲＮＡをロードした多孔性シリカ粒子１０μｌをＳＢＦ（ｐＨ７．４、３７℃）に再浮遊させ、気孔直径２０ｋＤａの透過膜（図１４のチューブ）に入れた。
その後、透過チューブを１．５ｍｌのＳＢＦに浸漬した。
ｓｉＲＮＡの放出は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌して行われた。
２４時間の前には、０．５、１、２、４、８、１２、２４時間経過した時間に放出溶媒を回収した。その後は２４時間間隔で０．５ｍｌの放出溶媒を蛍光測定のために回収し、等量のＳＢＦを添加した。
Ｃｙ５－ｓｉＲＮＡの蛍光強度は、６７０ｎｍの波長（λｅｘ＝６４７ｎｍ）で測定し、ｓｉＲＮＡの放出程度を測定した。その結果を図１５に示す。
これを参照すると、ｓｉＲＮＡが５０％放出された時間は約４８時間であることを確認することができる。
【0258】
３．イン・ビトロＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ処理結果
３－１．ＨａＣａＴ細胞及びＨｅＬａ細胞内形態の確認
（１）実験方法
ＨａＣａＴ細胞またはＨｅＬａ細胞を８－ウェルチャンバー（Lab－Tek Chamber slide system）に２．０×１０３個だけシーディング（seeding）した後、２４時間インキュベート（incubation）する。１ｘＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、ＴＡＭＲＡ蛍光が標識されたｓｉＲＮＡ（５０ｎｇ）をＦＩＴＣ蛍光が標識されたＤＤＶ（１μｇ）に担持してｓｉＲＮＡとＤＤＶ複合体を作成する。その後、無血清培地（serum－free media）の条件下で細胞に２時間処理する。
３－１．ＨａＣａＴ細胞及びＨｅＬａ細胞内形態の確認
（１）実験方法
ＨａＣａＴ細胞またはＨｅＬａ細胞を８－ウェルチャンバー（Lab－Tek Chamber slide system）に２．０×１０３個だけシーディング（seeding）した後、２４時間インキュベート（incubation）する。１ｘＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、ＴＡＭＲＡ蛍光が標識されたｓｉＲＮＡ（５０ｎｇ）をＦＩＴＣ蛍光が標識されたＤＤＶ（１μｇ）に担持してｓｉＲＮＡとＤＤＶ複合体を作成する。その後、無血清培地（serum－free media）の条件下で細胞に２時間処理する。
【0259】
前記ＤＤＶとしては、実施例２－２－（１）－２）－ｉｉ）の多孔性シリカ粒子を用いた。ｓｉＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡ＃１を用いた。
【0260】
２時間後、１ｘＰＢＳで細胞を２回洗浄する。次いで、１０％ＦＢＳ添加培地（FBS－containing media）に入れ替えた後、時間順に（２、６、８、１２、１８、２４時間）細胞をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Invitrogen）を用いて核染色する。Delta Vision Elite High Resolution Microscope（GE Healthcare Life Sciences）の６０ｘレンズを用いて、細胞の形態（morphology）変化と細胞内に存在するｓｉＲＮＡとＤＤＶの細胞内分布を時間によって観察する。
【0261】
（２）実験結果
ｓｉＲＮＡとＤＤＶ複合体を細胞に処理してから２時間程度となる初期には、細胞内でオレンジ色ないし黄色蛍光が多く示されることを確認した。これは緑色蛍光が標識されたＤＤＶに赤色蛍光が標識されたｓｉＲＮＡが担持された状態で細胞内に導入されるので、細胞内で緑色蛍光と赤色蛍光が重なってオレンジ色ないし黄色蛍光が示されるものと思われる。
ｓｉＲＮＡとＤＤＶ複合体を細胞に処理してから２時間程度となる初期には、細胞内でオレンジ色ないし黄色蛍光が多く示されることを確認した。これは緑色蛍光が標識されたＤＤＶに赤色蛍光が標識されたｓｉＲＮＡが担持された状態で細胞内に導入されるので、細胞内で緑色蛍光と赤色蛍光が重なってオレンジ色ないし黄色蛍光が示されるものと思われる。
【0262】
時間が経過するにつれて、オレンジ色ないし黄色蛍光が多くなくなり、緑色蛍光が優勢に示されることを確認した。これはＤＤＶからｓｉＲＮＡが放出されるので、時間が経過するほどオレンジ色ないし黄色蛍光が消え、ｓｉＲＮＡの緑色蛍光が優勢に示されるものと思われる。
【0263】
前記結果から、ＤＤＶとｓｉＲＮＡの複合体が細胞内に良好に流入され、細胞内でｓｉＲＮＡ薬物が徐放的に放出されることを確認した。
【0264】
３－２．イン・ビトロ上のＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰのＴＳＬＰ ｍＲＮＡノックダウンの確認
ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰのターゲット遺伝子ノックダウン効率を測定するために、ＨａＣａＴ（ヒトケラチノサイト細胞）を、前述の方法により製造されたＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ＃１、ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ＃１４、及びＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ＃２１を用いて下記実験を行った。
ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰのターゲット遺伝子ノックダウン効率を測定するために、ＨａＣａＴ（ヒトケラチノサイト細胞）を、前述の方法により製造されたＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ＃１、ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ＃１４、及びＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ＃２１を用いて下記実験を行った。
【0265】
ＴＳＬＰ ｍＲＮＡノックダウン確認実験を行う前に、ＨａＣａＴ細胞にＳＬＩＧＲＬを処理すると、ＴＳＬＰの発現が誘導されることを確認した（図１８を参照）。
【0266】
まず、ＨａＣａＴ細胞を前記３種のＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ（２５ｐｍｏｌ）で処理した後、ＴＳＬＰの発現を誘導するために、２００νＭのＳＬＩＧＲＬと共に培養した。その結果、細胞株に対するＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰの処理は、ＴＳＬＰのｍＲＮＡ発現レベルを低減し、特にＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ＃１の処理時はＴＳＬＰのｍＲＮＡ発現抑制に有意な効果を示した。
【0267】
一方、対照群（ｓｉＴＳＬＰ＃１、ｓｉＴＳＬＰ＃１４、ｓｉＴＳＬＰ＃２１のみ）は、ｓｉＲＮＡのみを処理した場合であり、ＨａＣａＴ細胞においてＴＳＬＰのｍＲＮＡ発現抑制効果を示さなかった（図１９を参照）。この結果は、対照群とは異なり、ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰが細胞内へｓｉＴＳＬＰを効率的にトランスフェクション（transfection）することができ、ＴＳＬＰ遺伝子のノックダウンを誘導することを意味する。
【0268】
４．イン・ビトロ上のＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰの徐放的なｓｉＴＳＬＰの放出
ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰは、ＨａＣａＴ細胞においてＬＮＰよりもＴＳＬＰノックダウン効果をより長く維持することを本実験を通じて確認した。
ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰは、ＨａＣａＴ細胞においてＬＮＰよりもＴＳＬＰノックダウン効果をより長く維持することを本実験を通じて確認した。
【0269】
ＨａＣａＴ細胞をＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ＃１（２５ｐｍｏｌ）及びＬＮＰに担持されたｓｉＴＳＬＰ＃１（２５ｐｍｏｌ）で処理した後、ＳＬＩＧＲＬ処理によりＴＳＬＰの発現を誘導した。
【0270】
前記ｓｉＴＳＬＰ＃１を担持したＤＤＶは、実施例２－２－（１）－２）－ｉｉ）の多孔性シリカ粒子を用いた。
【0271】
ＨａＣａＴ細胞でＴＳＬＰ発現の抑制は、ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ＃１の処理後９６時間まで持続されたが（ＴＳＬＰ発現レベル、７２時間：１５％、９６時間：２２％）、ＬＮＰに担持されたｓｉＴＳＬＰ＃１のＴＳＬＰ発現抑制効率は７２時間、９６時間のいずれにおいても高くなかった（ＴＳＬＰ発現レベル、７２時間：４３％、９６時間：５６％）（図２０を参照）。つまり、ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰは、細胞において、ＬＮＰに担持されたｓｉＴＳＬＰと比較して、より長い期間、高いレベルでターゲットｍＲＮＡの発現を抑制することが分かる。
【0272】
５．ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰの送達及び分布変化のｅｘ－ｖｉｖｏ分析
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの頬組織にＴＡＭＲＡ－接合されたＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬに担持されたＦＩＴＣ－接合されたｓｉＴＳＬＰで構成された蛍光標識ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰを注入し、担持されていないＦＩＴＣ－接合されたｓｉＴＳＬＰのみを皮下注入経路を介して注入して、ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰとｓｉＴＳＬＰの注入部位での持続時間を比較した。本実験を通じてＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰの送達効果及び分布変化を確認した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの頬組織にＴＡＭＲＡ－接合されたＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬに担持されたＦＩＴＣ－接合されたｓｉＴＳＬＰで構成された蛍光標識ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰを注入し、担持されていないＦＩＴＣ－接合されたｓｉＴＳＬＰのみを皮下注入経路を介して注入して、ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰとｓｉＴＳＬＰの注入部位での持続時間を比較した。本実験を通じてＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰの送達効果及び分布変化を確認した。
【0273】
前記ＤＤＶとしては、実施例２－２－（１）－２）－ｉｉ）の多孔性シリカ粒子を用いた。前記ｓｉＴＳＬＰとしては、ｓｉＲＮＡ＃１を用いた。
【0274】
切除されたマウスの頬部位の皮膚と切片化された頬部位の皮膚の蛍光画像解析は、注入後１、２、４日目に行った。ＦＩＴＣ－ｓｉＴＳＬＰを担持したＴＡＭＲＡ－ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの蛍光は、１日目に注入部位で強い発光を示した。そして、蛍光は、時間の経過によって徐々に減少したが、注入後４日目まで注入部位での蛍光が強く維持された（図２１及び２３を参照）。時間の経過によって注入部位での蛍光が減少する傾向は、皮膚切片スライドの傾向によった。これに対して、担持されていないＦＩＴＣ－ｓｉＴＳＬＰのみを注入したマウスから切除した皮膚や切片化した皮膚のスライドでは、蛍光シグナルが観察されなかった。これはＤＤＶのないｓｉＴＳＬＰのみを投与した場合には、ｓｉＴＳＬＰが体内で急速に分散してしまったり、非常に迅速な拡散を誘導する小さな断片に分解されることを暗示する（図２２及び２３を参照）。前記データから、ＤＤＶに担持されていないｓｉＴＳＬＰを処理した場合と比べて、ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰを処理した場合には、皮膚内でｓｉＴＳＬＰを顕著に高い濃度レベルで、注入後少なくとも４日目まで維持できることが分かった。
【0275】
６．ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰ注入によるＴＳＬＰノックダウン効果のイン・ビボ分析
ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰが注入されたマウスでのＴＳＬＰノックダウン効果をマウスの行動分析により確認した。
ＬＥＭ－ｓｉＴＳＬＰが注入されたマウスでのＴＳＬＰノックダウン効果をマウスの行動分析により確認した。
【0276】
マウスの頬組織をきれいに除毛した後、右頬部位にＰＢＳ、ｓｉＴＳＬＰが担持されたＤＤＶ（０．７ｎｍｏｌ ｓｉＲＮＡ、１５０μｇ ＢＡＬＬ in ２０μＬ ＰＢＳ）をそれぞれ皮内注射（intradermal（ID）injection）した。
【0277】
前記ＤＤＶとしては、実施例２－２－（１）－２）－ｉｉ）の多孔性シリカ粒子を用いた。前記ｓｉＴＳＬＰとしては、センスＲＮＡ配列（5’－CGAGCAAAUCGAGGACUGUdTdT－3’（配列番号１２４））及びアンチセンスＲＮＡ配列（5’－ACAGUCCUCGAUUUGCUCGdTdT－3’（配列番号１２５））が結合されたものを用いた。
【0278】
注入後４８時間が経過した後、ＳＬＩＧＲＬペプチド１００μｇ（in 20ul PBS）を皮内注射（ID injection）してＴＳＬＰ誘導（induction）を行った。注入直後から３０分間擦過行動（scratching behavior）を観察し、行動様相を比較した。
【0279】
具体的には、マウスが頬部位を擦る回数を分析したが、グルーミング行動と区別するために「後足」で頬を擦る回数だけをカウントした。後足を上げて下げることを１回としてカウントすることが基本であるが、足を下げずに１秒以上継続的に擦る場合には、持続時間を測定して１秒当たりに１回でカウントした。
【0280】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【配列表】