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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-31
(45)【発行日】2024-11-11
(54)【発明の名称】人工合成ｍＲＮＡ及びその利用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20241101BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20241101BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241101BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241101BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241101BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241101BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/113 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2021552479
(86)(22)【出願日】2020-10-16
(86)【国際出願番号】 JP2020039160
(87)【国際公開番号】W WO2021075567
(87)【国際公開日】2021-04-22
【審査請求日】2023-08-02
(31)【優先権主張番号】P 2019189929
(32)【優先日】2019-10-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成３０年度／平成３１年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、感染症実用化研究事業 肝炎等克服実用化研究事業 Ｂ型肝炎創薬実用化等研究事業、「個別化医療に対応したゲノム編集技術による肝臓内ＨＢＶゲノムの完全不活化を目指した革新的治療法の包括的開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願）
(73)【特許権者】
【識別番号】506218664
【氏名又は名称】公立大学法人名古屋市立大学
(74)【代理人】
【識別番号】100179578
【弁理士】
【氏名又は名称】野村 和弘
(72)【発明者】
【氏名】星野 真一
(72)【発明者】
【氏名】細田 直
【審査官】三谷 直也
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／０８９８４６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１２－１００５９３（ＪＰ，Ａ）
【文献】Accession No. NM_002046.7，Database GenBank [online]，2019年09月28日，[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_002046.7/]，[2020年12月4日検索]
【文献】Igor RUIZ DE LOS MOZOS et al.，PLOS Genetics，2013年，Vol. 9, Issue 12，e1004001 (pp. 1-18)
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
タンパク質をコードするｍＲＮＡの５´非翻訳領域と、前記５´非翻訳領域に対する相補性が４０％以上８０％以下である３´非翻訳領域と、
を備える、人工合成ｍＲＮＡ。
【請求項2】
請求項１に記載の人工合成ｍＲＮＡであって、前記タンパク質は、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼと、β－ｇｌｏｂｉｎと、ＲＰＳ８と、ＬＤＨＢとからなる群から選ばれる、人工合成ｍＲＮＡ。
【請求項3】
請求項１又は請求項２に記載の人工合成ｍＲＮＡであって、前記３´非翻訳領域は、前記５´非翻訳領域に対する相補性が５０％以上７５％以下である、人工合成ｍＲＮＡ。
【請求項4】
請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載の人工合成ｍＲＮＡを、細胞（ヒトの生体内の細胞を除く）に導入する工程を含む方法。
【請求項5】
請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載の人工合成ｍＲＮＡが導入された細胞。
【請求項6】
タンパク質をコードするｍＲＮＡの５´非翻訳領域と、前記５´非翻訳領域との相補性が４０％以上８０％以下である３´非翻訳領域と、を備える人工合成ｍＲＮＡを調製する工程を含む、人工合成ｍＲＮＡの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、人工合成ｍＲＮＡ及びその利用に関する。本出願は、２０１９年１０月１７日に出願された日本国特許出願第２０１９－１８９９２９号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【0002】
これまで遺伝子治療はウイルスをはじめとするＤＮＡをベクターとして実施されてきたが、ゲノムに組込まれることによる発癌等の危険性が大きな問題として残されていた。一方で、ｍＲＮＡは、ＤＮＡと異なりゲノムへの挿入などのリスクがない安全な核酸医薬として注目を集めているが、ＲＮＡが本来もつ不安定性と翻訳効率の低さが欠点として指摘されている（例えば、特許文献１から特許文献３）。
【0003】
特許文献１には、ｍＲＮＡの細胞内における分解機構を解明することにより、この機構の発生を抑制する技術として、目的遺伝子のｍＲＮＡに、２’－５’－オリゴアデニル酸合成酵素の機能抑制物質を用いる方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特開２０１８－７４９５４号公報
【文献】特開２０１５－２２１０２６号公報
【文献】特開２０１５－２２６５３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
たしかに、特許文献１に記載の技術によれば、ＲＮＡが本来もつ不安定性さは改善される。しかしながら、ｍＲＮＡの翻訳効率の向上については改善の余地があった。
【0006】
このため、本発明者らは鋭意研究を進めることにより、ｍＲＮＡの翻訳効率を向上させる方法を発明するに至った。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、上述の課題を解決するためになされたものであり、以下の形態として実現することが可能である。
【0008】
（１）本発明の一形態によれば、人工合成ｍＲＮＡが提供される。この人工合成ｍＲＮＡは、タンパク質をコードするｍＲＮＡの５´非翻訳領域と、前記５´非翻訳領域に対する相補性が４０％以上８０％以下である３´非翻訳領域と、を備える。
【0009】
（２）上述の人工合成ｍＲＮＡであって、前記タンパク質は、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼと、β－ｇｌｏｂｉｎと、ＲＰＳ８と、ＬＤＨＢとからなる群から選ばれてもよい。
【0010】
（３）上述の人工合成ｍＲＮＡであって、前記３´非翻訳領域は、前記５´非翻訳領域に対する相補性が５０％以上７５％以下であってもよい。
【0011】
（４）本発明の他の形態によれば、上述の人工合成ｍＲＮＡを、細胞に導入する工程を含む方法が提供される。
【0012】
（５）本発明の他の形態によれば、上述の人工合成ｍＲＮＡが導入された細胞が提供される。
【0013】
（６）本発明の他の形態によれば、人工合成ｍＲＮＡの製造方法が提供される。この人工合成ｍＲＮＡの製造方法は、タンパク質をコードするｍＲＮＡの５´非翻訳領域と、前記５´非翻訳領域との相補性が４０％以上８０％以下である３´非翻訳領域と、を備える人工合成ｍＲＮＡを調製する工程を含む。
【0014】
（７）本発明の他の形態によれば、人工合成ｍＲＮＡが提供される。この人工合成ｍＲＮＡは、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｍＲＮＡの５´非翻訳領域と、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｍＲＮＡの３´非翻訳領域と、を備える。
【0015】
（８）本発明の他の形態によれば、人工合成ｍＲＮＡの製造方法が提供される。この人工合成ｍＲＮＡの製造方法は、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｍＲＮＡの５´非翻訳領域と、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｍＲＮＡの３´非翻訳領域と、を備える人工合成ｍＲＮＡを調製する工程を含む。
【0016】
（９）本発明の他の形態によれば、上記（７）の人工合成ｍＲＮＡを、細胞に導入する工程を含む方法が提供される。
【0017】
（１０）本発明の他の形態によれば、上記（７）の人工合成ｍＲＮＡが導入された細胞が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図。
【図2】人工合成ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を測定した結果を示す図。
【図4】作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図。
【図5】人工合成ｍＲＮＡごとの発現量を示す図。
【図6】人工合成ｍＲＮＡを腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞に導入した場合の人工合成ｍＲＮＡごとの発現量を示す図。
【図7】作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図。
【図8】ＧＡＰＤＨのＵＴＲ配列の有無に起因する発現量の違いを示す図。
【図9】ＬＤＨＢのＵＴＲ配列の有無に起因する発現量の違いを示す図。
【図10】ＡＣＡＴ２のＵＴＲ配列の有無に起因する発現量の違いを示す図。
【図11】作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図。
【図12】ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列の欠失の有無に起因する発現量の違いを示す図。
【図13】作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図。
【図14】ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列の欠失の有無に起因する発現量の違いを示す図。
【図15】作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図。
【図16】５´ＵＴＲ ２８ｎｔと３´ＵＴＲ ２８ｎｔの有無に起因する発現量の違いを示す図。
【図17】作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図。
【図18】相補性に起因する発現量の違いを示す図。
【図19】作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図。
【図20】相補性に起因する発現量の違いを示す図。
【図21】作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図。
【図22】癌抑制遺伝子ｐ５３を用いた場合における発現量の違いを示す図。
【図23】得られた効果の推定メカニズムを説明するための図。
【図24】ゲノム編集遺伝子ｈＣａｓ９を用いた場合における発現量の違いを示す図。
【図25】ゲノム編集遺伝子ｈＣａｓ９を用いた場合におけるゲノム編集量の違いを示す図。
【図26】β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲを用いた場合における発現量の違いを示す図。
【図27】ＲＰＳ８の５´ＵＴＲを用いた場合における発現量の違いを示す図。
【図28】ＬＤＨＢの５´ＵＴＲを用いた場合における発現量の違いを示す図。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本明細書の開示は、翻訳効率の高い人工合成ｍＲＮＡ及びその利用に関する。尚、人為的な操作によって調製されるという特徴を表すとともに、細胞内（内在性）ｍＲＮＡと区別する目的で、本発明のｍＲＮＡのことを「人工合成ｍＲＮＡ」と呼称することがある。ここで、本明細書において、「ｍＲＮＡ」とは、タンパク質に翻訳され得る塩基配列情報と構造を持ったＲＮＡを示す。また、二つの用語「抑制」と「阻害」は、その意味するところが重複し、しばしば置換可能に用いられる。そこで本明細書では、前後の文脈から区別が特に必要な場合を除き、統一して用語「抑制」を使用する。「翻訳効率が高い」とは、翻訳量の増大を意味する。
【0020】
１．ｍＲＮＡ
本発明のｍＲＮＡは目的遺伝子のコード領域（目的遺伝子の発現産物であるタンパク質をコードする領域）を備える。「目的遺伝子」とは、本発明のｍＲＮＡを利用して細胞内で発現させる遺伝子である。様々な遺伝子を目的遺伝子として採用できる。本発明のｍＲＮＡを導入することにより目的遺伝子を発現させる細胞を、本明細書において「標的細胞」とも呼ぶ。目的遺伝子としては、例えば、酵素（例えばヌクレアーゼ（ＺＦＮ(Zinc Finger Nuclease)、ＴＡＬＥＮ(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９等）、サイトカイン、ホルモン、神経伝達物質等の遺伝子、その機能低下（例えば変異によるもの）や欠損などが疾患の原因となる遺伝子、正常に機能をしているがその発現の増強が望まれる遺伝子、標的細胞が本来有しない遺伝子であってそれが発現されることにより標的細胞の生存、維持等に有益な遺伝子、標的細胞に作用し、標的細胞が本来有する機能を高めるタンパク質又は標的細胞が本来有する機能とは異なる機能を発揮させるタンパク質をコードする遺伝子、標的細胞には作用せず、標的細胞から分泌されて周囲の細胞に作用するタンパク質（例えば、細胞間ネットワークに関与するタンパク質）をコードする遺伝子等を挙げることができる。標的細胞及び周囲の細胞に対しては実質的に作用しないタンパク質をコードする遺伝子も目的遺伝子となり得る。このような遺伝子として、例えば、医薬品等に利用されるタンパク質等をコードする遺伝子（例えば、ヒトエリスロポエチン遺伝子、ヒトフィブリノーゲン遺伝子、ヒト血清アルブミン遺伝子、ヒトラクトフェリン遺伝子、ヒトα-グルコシダーゼ遺伝子）が挙げられる。かかる遺伝子を採用することにより、標的細胞内で医薬品等として利用可能な組換えタンパク質を産生させることが可能である。
本発明のｍＲＮＡは目的遺伝子のコード領域（目的遺伝子の発現産物であるタンパク質をコードする領域）を備える。「目的遺伝子」とは、本発明のｍＲＮＡを利用して細胞内で発現させる遺伝子である。様々な遺伝子を目的遺伝子として採用できる。本発明のｍＲＮＡを導入することにより目的遺伝子を発現させる細胞を、本明細書において「標的細胞」とも呼ぶ。目的遺伝子としては、例えば、酵素（例えばヌクレアーゼ（ＺＦＮ(Zinc Finger Nuclease)、ＴＡＬＥＮ(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９等）、サイトカイン、ホルモン、神経伝達物質等の遺伝子、その機能低下（例えば変異によるもの）や欠損などが疾患の原因となる遺伝子、正常に機能をしているがその発現の増強が望まれる遺伝子、標的細胞が本来有しない遺伝子であってそれが発現されることにより標的細胞の生存、維持等に有益な遺伝子、標的細胞に作用し、標的細胞が本来有する機能を高めるタンパク質又は標的細胞が本来有する機能とは異なる機能を発揮させるタンパク質をコードする遺伝子、標的細胞には作用せず、標的細胞から分泌されて周囲の細胞に作用するタンパク質（例えば、細胞間ネットワークに関与するタンパク質）をコードする遺伝子等を挙げることができる。標的細胞及び周囲の細胞に対しては実質的に作用しないタンパク質をコードする遺伝子も目的遺伝子となり得る。このような遺伝子として、例えば、医薬品等に利用されるタンパク質等をコードする遺伝子（例えば、ヒトエリスロポエチン遺伝子、ヒトフィブリノーゲン遺伝子、ヒト血清アルブミン遺伝子、ヒトラクトフェリン遺伝子、ヒトα-グルコシダーゼ遺伝子）が挙げられる。かかる遺伝子を採用することにより、標的細胞内で医薬品等として利用可能な組換えタンパク質を産生させることが可能である。
【0021】
標的細胞は特に限定されず、例えば、各種真核細胞を標的細胞として用いることができる。より具体的には、標的細胞として、例えば、哺乳動物（ヒト、サル、ウシ、ウマ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等）の各種細胞、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、破骨細胞、実質細胞、表皮角化細胞（ケラチノサイト）、上皮細胞（皮膚表皮細胞、角膜上皮細胞、結膜上皮細胞、口腔粘膜上皮、毛包上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、気道粘膜上皮細胞、腸管粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（角膜内皮細胞、血管内皮細胞など）、神経細胞、グリア細胞、脾細胞、膵臓β細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、肝細胞、これらの前駆細胞又は幹細胞、或いは人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）などを使用することができる。また、標的細胞として、例えば、継代細胞、特定の細胞系譜へと分化誘導された細胞、株化細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｓｆ９細胞）等を使用することができる。
【0022】
生体から分離された状態の標的細胞（即ち、単離された標的細胞）、又は生体を構成した状態の標的細胞に対して、本発明のｍＲＮＡを導入してもよい。従って、In vitro、In vivo及びEx vivoのいずれの環境下でも本発明を実施することが可能である。ここでの「単離された」とは、その本来の環境（例えば生体を構成した状態）から取り出された状態にあることを示す。従って、通常は、単離された標的細胞は培養容器内又は保存容器内に存在し、それへのin vitroでの人為的操作が可能である。具体的には、生体から分離され、生体外で培養状態にある細胞（株化された細胞を含む）は、単離された標的細胞としての適格を有する。尚、上記の意味において単離された状態にある限り、組織体を形成した状態であっても単離された細胞である。
【0023】
単離された標的細胞は、生体（例えば患者）より調製することができる。一方、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター、独立行政法人 製品評価技術基盤機構、ＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)、ＤＳＭＺ（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）などより入手した細胞を、単離された標的細胞として使用してもよい。
【0024】
本発明のｍＲＮＡは、５´非翻訳領域（５´ＵＴＲ: 5' untranslated region）と３´非翻訳領域（３´ＵＴＲ: 3' untranslated region）を備える。
【0025】
本発明の一実施形態のｍＲＮＡは、タンパク質をコードするｍＲＮＡの５´ＵＴＲと、５´ＵＴＲとの相補性が４０％以上８０％以下である３´ＵＴＲと、を備える。換言すると、本発明の実施形態のｍＲＮＡは、目的タンパク質をコードする翻訳領域と、目的タンパク質とは異なるタンパク質をコードするｍＲＮＡの５´ＵＴＲと、５´ＵＴＲとの相補性が４０％以上８０％以下である３´ＵＴＲと、を備える。この形態とすることにより、翻訳効率を向上させることができる。翻訳効率をより向上させる観点から、３´ＵＴＲにおける５´ＵＴＲとの相補性が５０％以上７５％以下であることが好ましい。翻訳効率を向上させることができる結果、目的タンパク質の発現効率を向上させることができる。
【0026】
タンパク質をコードするｍＲＮＡの５´ＵＴＲとしては、特に限定されないが、例えば、細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）あたりのタンパク質発現量が１０６分子以上のタンパク質をコードするｍＲＮＡの５´ＵＴＲが好ましい。このタンパク質としては、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼと、β－ｇｌｏｂｉｎと、ＲＰＳ８と、ＬＤＨＢとからなる群から選ばれるタンパク質がより好ましい。
【0027】
さらに、本発明の他の実施形態のｍＲＮＡは、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をコードするｍＲＮＡの５´ＵＴＲと、ＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡの３´ＵＴＲと、を備える。換言すると、本発明の実施形態のｍＲＮＡは、ＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡの５´ＵＴＲと、ＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡの３´ＵＴＲと、ＧＡＰＤＨではないタンパク質をコードするＯＲＦ（Open Reading Frame）と、を備える。この形態とすることにより、翻訳効率を向上させることができる。本明細書において、「～をコードするｍＲＮＡのＵＴＲ」を、単に「～のＵＴＲ」とも呼ぶ。例えば、「ＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡの５´ＵＴＲ」を、「ＧＡＰＤＨのＵＴＲ」とも呼ぶ。
【0028】
本明細書において、ＧＡＰＤＨのＵＴＲとして、ヒト由来のＧＡＰＤＨのＵＴＲを用いるが、本発明はこれに限られない。ＧＡＰＤＨのＵＴＲとして、例えば、他の生物（例えば、マウス）由来のＧＡＰＤＨのＵＴＲを用いてもよい。また、本発明のｍＲＮＡが備えるＧＡＰＤＨのＵＴＲの長さは、生物由来のＧＡＰＤＨのＵＴＲの７割以上１３割以下であることが好ましく、８割以上１２割以下であることがより好ましく、９割以上１１割以下であることがさらに好ましい。また、本発明のｍＲＮＡが備えるＧＡＰＤＨのＵＴＲは、生物由来のＧＡＰＤＨのＵＴＲとの一致率が７割以上であることが好ましく、８割以上であることがより好ましく、９割以上であることがさらに好ましい。
【0029】
本発明の他の実施形態のｍＲＮＡは、ＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡの５´ＵＴＲと、５´ＵＴＲとの相補性が４０％以上８０％以下である３´ＵＴＲと、を備える。換言すると、本発明の実施形態のｍＲＮＡは、ＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡの５´ＵＴＲと、５´ＵＴＲとの相補性が４０％以上８０％以下である３´ＵＴＲと、ＧＡＰＤＨではないタンパク質をコードするＯＲＦと、を備える。この形態とすることにより、翻訳効率を向上させることができる。翻訳効率をより向上させる観点から、３´ＵＴＲにおける５´ＵＴＲとの相補性が５０％以上７５％以下であることが好ましい。
【0030】
本実施形態のｍＲＮＡは、その翻訳に必要な５´キャップ構造（m7G（7-メチルグアノシン）が５´末端ヌクレオシドに５´－５´三リン酸橋を介して結合した構造）及びポリ（Ａ）鎖を備えてもよい。ポリ（Ａ）鎖の長さは、特に限定されないが、例えば、３０～２００塩基である。５´キャップ構造には翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅが結合し、ポリ（Ａ）鎖にはポリ（Ａ）鎖結合タンパク質ＰＡＢＰ（poly（A）-binding protein）が結合することによって、両者が足場タンパク質である翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇを介して複合体を形成することにより、ｍＲＮＡは環状構造を形成する（Wells SE, et al. Mol Cell. 1998;2:135-140）。さらに、翻訳終結因子ｅＲＦ３はＰＡＢＰ－ｅＩＦ４Ｇと複合体を形成することにより、３´ＵＴＲをループアウトする（Uchida N, et al. J Biol Chem. 2002; 277: 50286-50292）。このようなｍＲＮＡの環状化は、翻訳終結部位と翻訳開始部位を物理的に近づけ、翻訳を終えたリボソームを、３´ＵＴＲを経ることなく終止コドンから次の翻訳開始にリサイクルすることで、翻訳開始の効率に大きく寄与する。５´末端キャップ構造とポリ（Ａ）鎖は、このような翻訳の効率化だけでなく、エキソヌクレアーゼによる末端からのｍＲＮＡ分解を阻害することでｍＲＮＡを安定化し、翻訳の効率化とｍＲＮＡ安定化の両過程において転写後の遺伝子発現制御に大きく貢献する。
【0031】
本発明のｍＲＮＡは、例えば、in vitro転写系、化学合成等の方法によって調製することができる。in vitro転写用のキット（例えば、プロメガ社が提供するRiboMAXsystem、ニッポンジーン社が提供するCUGA7 in vitro transcription kit、ライフテクノロジーズ社が提供するMEGAscript T7 kit）を利用することにより、簡便に目的のｍＲＮＡを調製することが可能である。また、５´キャップ構造の付加についても公知の方法で行うことができ、例えば、New England Biolabs社が提供する3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analogを利用することができる。
【0032】
本発明のｍＲＮＡとして、２種類以上のｍＲＮＡを併用することにしてもよい。例えば、特定の遺伝子のコード領域を有するｍＲＮＡと、当該遺伝子の発現産物と相互作用する発現産物をコードする領域を有するｍＲＮＡを併用することができる。
【0033】
本発明のｍＲＮＡの量は、使用目的、使用する目的遺伝子の特徴、標的細胞の種類等を考慮しつつ、標的細胞内で十分な量の発現産物が得られるように設定すればよい。ｍＲＮＡ量の例を示すと、一回分の量として３ｃｍ培養ディッシュあたり０．５～１．０μｇのｍＲＮＡを含有させてもよい。
【0034】
人工合成ｍＲＮＡの保護を目的として、例えば、エキソヌクレアーゼ阻害剤、エンドヌクレアーゼ阻害剤、リン脂質、リン酸カルシウム、ポリエチレンイミン、ナノミセル形成剤であるポリエチレングリコール－ポリカチオン、緩衝剤、無機塩類、２価イオン等を用いてもよく、細菌の混入を阻止することを目的として抗生物質等を用いてもよく、細胞の増殖能を亢進させることを目的として、動物血清、成長因子、糖類、ビタミン類、２価イオン等を用いてもよい。また、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を用いてもよい。更に、有効成分の細胞導入効率を亢進させることを目的として、ライフテクノロジー社が提供するＯｐｔｉ－ＭＥＭ等の特殊合成培地を用いてもよい。
【0035】
２．導入方法
本発明を利用して標的細胞内で目的遺伝子を発現させるためには、標的細胞に目的遺伝子のｍＲＮＡを導入するステップを行う。
本発明を利用して標的細胞内で目的遺伝子を発現させるためには、標的細胞に目的遺伝子のｍＲＮＡを導入するステップを行う。
【0036】
ｍＲＮＡの標的細胞への導入は公知の方法で行うことができる。例えば、リン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポレーション(Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1987))、マイクロインジェクション(Graessmann, M. & Graessmann,A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73,366-370(1976))、Hanahanの方法(Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557-580(1983))、酢酸リチウム法(Schiestl, R.H. et al., Curr. Genet. 16, 339-346(1989))、プロトプラスト－ポリエチレングリコール法(Yelton, M.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1470-1474(1984))、超音波遺伝子導入法、カチオン性ポリアミン酸を利用した方法（例えば特開２０１１－１７３８０２号公報を参照）、カチオン性ポリマーセグメントと非架電親水性ポリマーセグメントとを有するブロックコポリマーからなるポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）型の高分子ミセルを利用した方法（例えば、特開２００４－３５２９７２号公報、国際公開第２０１２／００５３７６号パンフレットを参照）等によって実施することができる。
【0037】
３．用途
本発明のｍＲＮＡによれば、標的細胞内で翻訳効率が向上するため、目的タンパク質が高発現する。従って、本発明は、目的タンパク質の高発現が望まれる様々な用途への適用が可能である。本発明の用途の例として、（Ａ）各種ウイルス性疾患（例えばＢ型肝炎、後天性免疫不全症候群ＡＩＤＳ、成人Ｔ細胞白血病）や遺伝病（例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー、嚢胞性腺維症、βサラセミア、Ｈｕｒｌｅｒ症候群、網膜色素変性症、X連鎖型腎性尿崩症）の治療、（Ｂ）癌免疫療法、（Ｃ）ｉＰＳ細胞の作製、（Ｄ）幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多分化能幹細胞）又は前駆細胞の分化誘導等を挙げることができる。
本発明のｍＲＮＡによれば、標的細胞内で翻訳効率が向上するため、目的タンパク質が高発現する。従って、本発明は、目的タンパク質の高発現が望まれる様々な用途への適用が可能である。本発明の用途の例として、（Ａ）各種ウイルス性疾患（例えばＢ型肝炎、後天性免疫不全症候群ＡＩＤＳ、成人Ｔ細胞白血病）や遺伝病（例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー、嚢胞性腺維症、βサラセミア、Ｈｕｒｌｅｒ症候群、網膜色素変性症、X連鎖型腎性尿崩症）の治療、（Ｂ）癌免疫療法、（Ｃ）ｉＰＳ細胞の作製、（Ｄ）幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多分化能幹細胞）又は前駆細胞の分化誘導等を挙げることができる。
【0038】
上記（Ａ）及び（Ｂ）は、いわゆるＲＮＡ医薬として本発明を利用するものである。（Ａ）の具体例としてのＢ型肝炎の治療では、例えば、ゲノムに組み込まれたウイルスＤＮＡを切断・分解するヌクレアーゼ（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）遺伝子を目的遺伝子として組み込んだｍＲＮＡを用いることにより、従来のウイルスベクターを使用した方法で問題となる発がんリスクを伴わないウイルス治療が可能となる。このように、本発明はウイルス除去剤としても有用である。遺伝病の治療においては、例えば、疾患原因遺伝子（機能低下又は欠損により疾患を引き起こすもの）を目的遺伝子とし、本発明を適用する。上記（Ｂ）の用途では、本発明を利用してがん抗原のｍＲＮＡを抗原提示細胞に導入し、癌ワクチンを体内で産生させることになる。上記（Ｃ）及び（Ｄ）の用途に本発明を適用すれば、ウイルスベクターを使用することなく初期化因子を導入することが可能になるため、細胞のがん化の問題を克服することができる。
【0039】
本発明をＲＮＡ医薬として利用する場合の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、緩衝剤、賦形剤、崩壊剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水、担体など）を含有させることができる。緩衝剤としてはリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などを用いることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
【0040】
製剤化する場合の剤型も特に限定されない。剤型の例は注射剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤及びシロップ剤である。
【0041】
本発明のＲＮＡ医薬はその剤型に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経粘膜など）によって対象に適用される。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用してもよい（例えば、経口投与と同時に又は所定時間経過後に静脈注射等を行う等）。ここでの「対象」は特に限定されず、ヒト及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウズラ等である）を含む。好ましい一態様では本発明のＲＮＡ医薬はヒトに対して適用される。
【0042】
本発明のＲＮＡ医薬の投与量は、期待される治療効果が得られるように設定される。治療上有効な投与量の設定においては一般に患者の症状、年齢、性別、及び体重などが考慮される。尚、当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。投与スケジュールとしては例えば１日１回～数回、２日に１回、或いは３日に１回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、患者の症状や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。
【実施例】
【0043】
１．目的
様々な臨床応用が期待されている人工合成ｍＲＮＡの標的細胞内での翻訳効率の向上を目指し、以下の検討を行った。
様々な臨床応用が期待されている人工合成ｍＲＮＡの標的細胞内での翻訳効率の向上を目指し、以下の検討を行った。
【0044】
２．研究材料および方法
（１）プラスミド
ＲＮＡトランスフェクション用のベクターとして、pBK-5F-EGFP-pA72を用いた。pBK-5F-EGFP-pA72の作製方法としては、Nogimori et al., “Dom34 mediates targeting of exogenous RNA in the antiviral OAS/RNase L pathway” Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue 1, 10 January 2019, Pages 432－449に記載された方法を用いた。
（１）プラスミド
ＲＮＡトランスフェクション用のベクターとして、pBK-5F-EGFP-pA72を用いた。pBK-5F-EGFP-pA72の作製方法としては、Nogimori et al., “Dom34 mediates targeting of exogenous RNA in the antiviral OAS/RNase L pathway” Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue 1, 10 January 2019, Pages 432－449に記載された方法を用いた。
【0045】
（２）非翻訳領域の挿入
・ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲの挿入
ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に関しては、配列番号１と配列番号２に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列は、配列番号２７に示す。
・ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲの挿入
ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に関しては、配列番号１と配列番号２に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列は、配列番号２７に示す。
【0046】
・ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲの挿入
ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列に関しては、ＨｅＬａ細胞から抽出したtotal RNAと、配列番号３と配列番号４に示すオリゴヌクレオチドとを用いた逆転写ＰＣＲ法により単離した。単離した配列は、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列は、配列番号２８に示す。
ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列に関しては、ＨｅＬａ細胞から抽出したtotal RNAと、配列番号３と配列番号４に示すオリゴヌクレオチドとを用いた逆転写ＰＣＲ法により単離した。単離した配列は、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列は、配列番号２８に示す。
【0047】
・ＡＣＡＴ２の５´ＵＴＲの挿入
ＡＣＡＴ２の５´ＵＴＲ配列に関しては、ＨｅＬａ細胞から抽出したtotal RNAと、配列番号５と配列番号６に示すオリゴヌクレオチドとを用いた逆転写ＰＣＲ法により単離した。単離した配列は、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＡＣＡＴ２の５´ＵＴＲ配列は、配列番号２９に示す。
ＡＣＡＴ２の５´ＵＴＲ配列に関しては、ＨｅＬａ細胞から抽出したtotal RNAと、配列番号５と配列番号６に示すオリゴヌクレオチドとを用いた逆転写ＰＣＲ法により単離した。単離した配列は、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＡＣＡＴ２の５´ＵＴＲ配列は、配列番号２９に示す。
【0048】
・ＡＣＡＴ２の３´ＵＴＲの挿入
ＡＣＡＴ２の３´ＵＴＲ配列に関しては、ＨｅＬａ細胞から抽出したtotal RNAと、配列番号７と配列番号８に示すオリゴヌクレオチドとを用いた逆転写ＰＣＲ法により単離した。単離した配列は、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＡＣＡＴ２の３´ＵＴＲ配列は、配列番号３０に示す。
ＡＣＡＴ２の３´ＵＴＲ配列に関しては、ＨｅＬａ細胞から抽出したtotal RNAと、配列番号７と配列番号８に示すオリゴヌクレオチドとを用いた逆転写ＰＣＲ法により単離した。単離した配列は、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＡＣＡＴ２の３´ＵＴＲ配列は、配列番号３０に示す。
【0049】
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲの挿入
ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列に関しては、ＨｅＬａ細胞から抽出したtotal RNAと、配列番号９と配列番号１０に示すオリゴヌクレオチドとを用いた逆転写ＰＣＲ法により単離した。単離した配列は、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列は、配列番号３１に示す。
ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列に関しては、ＨｅＬａ細胞から抽出したtotal RNAと、配列番号９と配列番号１０に示すオリゴヌクレオチドとを用いた逆転写ＰＣＲ法により単離した。単離した配列は、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列は、配列番号３１に示す。
【0050】
・ＬＤＨＢの３´ＵＴＲの挿入
ＬＤＨＢの３´ＵＴＲ配列に関しては、ＨｅＬａ細胞から抽出したtotal RNAと、配列番号１１と配列番号１２に示すオリゴヌクレオチドとを用いた逆転写ＰＣＲ法により単離した。単離した配列は、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＬＤＨＢの３´ＵＴＲ配列は、配列番号３２に示す。
ＬＤＨＢの３´ＵＴＲ配列に関しては、ＨｅＬａ細胞から抽出したtotal RNAと、配列番号１１と配列番号１２に示すオリゴヌクレオチドとを用いた逆転写ＰＣＲ法により単離した。単離した配列は、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＬＤＨＢの３´ＵＴＲ配列は、配列番号３２に示す。
【0051】
・ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲの挿入
ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲ配列に関しては、配列番号１３と配列番号１４に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲ配列は、配列番号３３に示す。
ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲ配列に関しては、配列番号１３と配列番号１４に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲ配列は、配列番号３３に示す。
【0052】
・ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が９４％である３´ＵＴＲの挿入
ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が９４％である３´ＵＴＲ配列に関しては、配列番号１５と配列番号１６に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が９４％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号３４に示す。
ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が９４％である３´ＵＴＲ配列に関しては、配列番号１５と配列番号１６に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が９４％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号３４に示す。
【0053】
・ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が８８％である３´ＵＴＲの挿入
ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が８８％である３´ＵＴＲ配列に関しては、配列番号１７と配列番号１８に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が８８％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号３５に示す。
ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が８８％である３´ＵＴＲ配列に関しては、配列番号１７と配列番号１８に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が８８％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号３５に示す。
【0054】
・ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が７５％である３´ＵＴＲの挿入
ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が７５％である３´ＵＴＲ配列に関しては、配列番号１９と配列番号２０に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が７５％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号３６に示す。
ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が７５％である３´ＵＴＲ配列に関しては、配列番号１９と配列番号２０に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が７５％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号３６に示す。
【0055】
・ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲの挿入
ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲ配列に関しては、配列番号２１と配列番号２２に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号３７に示す。
ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲ配列に関しては、配列番号２１と配列番号２２に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号３７に示す。
【0056】
・ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が２５％である３´ＵＴＲの挿入
ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が２５％である３´ＵＴＲ配列に関しては、配列番号２３と配列番号２４に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が２５％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号３８に示す。
ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が２５％である３´ＵＴＲ配列に関しては、配列番号２３と配列番号２４に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が２５％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号３８に示す。
【0057】
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲの挿入
β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列に関しては、配列番号４１と配列番号４２に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列は、配列番号９４に示す。
β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列に関しては、配列番号４１と配列番号４２に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列は、配列番号９４に示す。
【0058】
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲの挿入
β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲに関しては、配列番号４３と配列番号４４に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲ配列は、配列番号９５に示す。
β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲに関しては、配列番号４３と配列番号４４に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲ配列は、配列番号９５に示す。
【0059】
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が９２％である３´ＵＴＲの挿入
β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が９２％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号４５と配列番号４６に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が９２％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号９６に示す。
β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が９２％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号４５と配列番号４６に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が９２％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号９６に示す。
【0060】
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が８８％である３´ＵＴＲの挿入
β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が８８％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号４７と配列番号４８に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が８８％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号９７に示す。
β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が８８％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号４７と配列番号４８に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が８８％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号９７に示す。
【0061】
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が７４％である３´ＵＴＲの挿入
β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が７４％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号４９と配列番号５０に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が７４％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号９８に示す。
β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が７４％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号４９と配列番号５０に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が７４％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号９８に示す。
【0062】
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲの挿入
β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号５１と配列番号５２に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号９９に示す。
β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号５１と配列番号５２に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号９９に示す。
【0063】
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が２４％である３´ＵＴＲの挿入
β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が２４％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号５３と配列番号５４に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が２４％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１００に示す。
β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が２４％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号５３と配列番号５４に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列と相補性が２４％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１００に示す。
【0064】
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲの挿入
ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列に関しては、配列番号５５と配列番号５６に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列は、配列番号１０１に示す。
ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列に関しては、配列番号５５と配列番号５６に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のKpnI、XhoIサイトに挿入した。ここで、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列は、配列番号１０１に示す。
【0065】
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲの挿入
ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲに関しては、配列番号５７と配列番号５８に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１０２に示す。
ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲに関しては、配列番号５７と配列番号５８に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１０２に示す。
【0066】
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が９３％である３´ＵＴＲの挿入
ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が９３％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号５９と配列番号６０に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が９３％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１０３に示す。
ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が９３％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号５９と配列番号６０に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が９３％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１０３に示す。
【0067】
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が８６％である３´ＵＴＲの挿入
ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が８６％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号６１と配列番号６２に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が８６％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１０４に示す。
ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が８６％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号６１と配列番号６２に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が８６％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１０４に示す。
【0068】
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が７１％である３´ＵＴＲの挿入
ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が７１％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号６３と配列番号６４に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が７１％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１０５に示す。
ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が７１％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号６３と配列番号６４に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が７１％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１０５に示す。
【0069】
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲの挿入
ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号６５と配列番号６６に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１０６に示す。
ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号６５と配列番号６６に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１０６に示す。
【0070】
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が２９％である３´ＵＴＲの挿入
ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が２９％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号６７と配列番号６８に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が２９％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１０７に示す。
ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が２９％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号６７と配列番号６８に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が２９％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１０７に示す。
【0071】
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が１４％である３´ＵＴＲの挿入
ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が１４％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号６９と配列番号７０に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が１４％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１０８に示す。
ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が１４％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号６９と配列番号７０に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列と相補性が１４％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１０８に示す。
【0072】
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲの挿入
ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲに関しては、配列番号７１と配列番号７２に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１０９に示す。
ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲに関しては、配列番号７１と配列番号７２に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と完全相補である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１０９に示す。
【0073】
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が９３％である３´ＵＴＲの挿入
ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が９３％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号７３と配列番号７４に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が９３％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１１０に示す。
ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が９３％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号７３と配列番号７４に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が９３％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１１０に示す。
【0074】
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が８７％である３´ＵＴＲの挿入
ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が８７％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号７５と配列番号７６に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が８７％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１１１に示す。
ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が８７％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号７５と配列番号７６に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が８７％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１１１に示す。
【0075】
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が７５％である３´ＵＴＲの挿入
ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が７５％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号７７と配列番号７８に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が７５％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１１２に示す。
ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が７５％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号７７と配列番号７８に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が７５％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１１２に示す。
【0076】
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲの挿入
ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号７９と配列番号８０に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１１３に示す。
ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号７９と配列番号８０に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１１３に示す。
【0077】
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が２５％である３´ＵＴＲの挿入
ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が２５％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号８１と配列番号８２に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が２５％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１１４に示す。
ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が２５％である３´ＵＴＲに関しては、配列番号８１と配列番号８２に示すオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、pBK-5F-EGFP-pA72のEcoRI、XbaIサイトに挿入した。ここで、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列と相補性が２５％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号１１４に示す。
【0078】
・Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ合成プラスミドの作製
Ｃａｓ９のｃＤＮＡ配列はMail et al “RNA-guided human genome engineering via Cas9” Science. 2013 Feb 15;339(6121):823-6 に記載されているｈＣａｓ９プラスミド（Addgene plasmid # 41815）と、配列番号８３と配列番号８４に示すオリゴヌクレオチドとを用いたＰＣＲ法により単離した。単離した配列をpBK-5F-EGFP-pA72のHindIIIサイトに挿入したプラスミドと、配列番号８３と配列番号８５に示すオリゴヌクレオチドを用いたインバースＰＣＲ法によりpBK-F-hCas9-pA72プラスミドを得た。ここでｈＣａｓ９のｃＤＮＡ配列は配列番号１１５に示し、ｈＣａｓ９のアミノ酸配列は配列番号１１６に示す。
Ｃａｓ９のｃＤＮＡ配列はMail et al “RNA-guided human genome engineering via Cas9” Science. 2013 Feb 15;339(6121):823-6 に記載されているｈＣａｓ９プラスミド（Addgene plasmid # 41815）と、配列番号８３と配列番号８４に示すオリゴヌクレオチドとを用いたＰＣＲ法により単離した。単離した配列をpBK-5F-EGFP-pA72のHindIIIサイトに挿入したプラスミドと、配列番号８３と配列番号８５に示すオリゴヌクレオチドを用いたインバースＰＣＲ法によりpBK-F-hCas9-pA72プラスミドを得た。ここでｈＣａｓ９のｃＤＮＡ配列は配列番号１１５に示し、ｈＣａｓ９のアミノ酸配列は配列番号１１６に示す。
【0079】
・Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ合成プラスミドへのＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲの挿入
pBK-F-hCas9-pA72プラスミドと、配列番号８６と配列番号８７に示すオリゴヌクレオチドを用いたインバースＰＣＲ法により、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲを挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲは、配列番号２７に示す。
pBK-F-hCas9-pA72プラスミドと、配列番号８６と配列番号８７に示すオリゴヌクレオチドを用いたインバースＰＣＲ法により、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲを挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲは、配列番号２７に示す。
【0080】
・Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ合成プラスミドへのＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が７５％である３´ＵＴＲの挿入
pBK-F-hCas9-pA72プラスミドと、配列番号８８と配列番号８９に示すオリゴヌクレオチドを用いたインバースＰＣＲ法により、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が７５％である３´ＵＴＲを挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が７５％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号３６に示す。
pBK-F-hCas9-pA72プラスミドと、配列番号８８と配列番号８９に示すオリゴヌクレオチドを用いたインバースＰＣＲ法により、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が７５％である３´ＵＴＲを挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が７５％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号３６に示す。
【0081】
・Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ合成プラスミドへのＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲの挿入
pBK-F-hCas9-pA72プラスミドと、配列番号９０と配列番号９１に示すオリゴヌクレオチドを用いたインバースＰＣＲ法により、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲを挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号３７に示す。
pBK-F-hCas9-pA72プラスミドと、配列番号９０と配列番号９１に示すオリゴヌクレオチドを用いたインバースＰＣＲ法により、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲを挿入した。ここで、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列と相補性が５０％である３´ＵＴＲ配列は、配列番号３７に示す。
【0082】
・ｐ５３のｃＤＮＡの挿入
ｐ５３のｃＤＮＡ配列は、U20S細胞から抽出したtotal RNAと、配列番号２５と配列番号２６に示すオリゴヌクレオチドとを用いた逆転写ＰＣＲ法により単離した。単離したｐ５３のｃＤＮＡ配列は、pBK-5F-EGFP-pA72のHindIIIサイトに挿入した。ここで、ｐ５３のｃＤＮＡ配列は配列番号３９に示し、ｐ５３のアミノ酸配列は配列番号４０に示す。
ｐ５３のｃＤＮＡ配列は、U20S細胞から抽出したtotal RNAと、配列番号２５と配列番号２６に示すオリゴヌクレオチドとを用いた逆転写ＰＣＲ法により単離した。単離したｐ５３のｃＤＮＡ配列は、pBK-5F-EGFP-pA72のHindIIIサイトに挿入した。ここで、ｐ５３のｃＤＮＡ配列は配列番号３９に示し、ｐ５３のアミノ酸配列は配列番号４０に示す。
【0083】
（３）ＲＮＡ合成
各種pBK-5F-EGFP-pA72、各種pBK-5F-p53-pA72および各種pBK-F-hCas9-pA72プラスミドを、BsmBIで処理したものを鋳型として、5xFlag-EGFP-pA72、5xFlag-p53-pA72およびFlag-hCas9-pA72 ｍＲＮＡを合成した。ＲＮＡ合成は、T7 RNAポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）を用い、このT7 RNAポリメラーゼの取扱い説明書に従って行った。
各種pBK-5F-EGFP-pA72、各種pBK-5F-p53-pA72および各種pBK-F-hCas9-pA72プラスミドを、BsmBIで処理したものを鋳型として、5xFlag-EGFP-pA72、5xFlag-p53-pA72およびFlag-hCas9-pA72 ｍＲＮＡを合成した。ＲＮＡ合成は、T7 RNAポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）を用い、このT7 RNAポリメラーゼの取扱い説明書に従って行った。
【0084】
（４）トランスフェクション
ＨｅＬａ細胞、２９３Ｔ細胞、Ｕ２ＯＳ細胞は、いずれも5% fetal bovine serumを添加したDulbecco’s Modified Eagle’s Medium （日水製薬株式会社）を用い、５％ＣＯ２存在下３７℃で培養した。ＨｅＬａ細胞を約５０％コンフルエントとなるように３５ ｍｍディッシュに撒種した後、２４時間培養した。その後、合成した各種ＲＮＡをLipofectamine RNAiMAX（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用い、この取扱い説明書に従って導入した。
ＨｅＬａ細胞、２９３Ｔ細胞、Ｕ２ＯＳ細胞は、いずれも5% fetal bovine serumを添加したDulbecco’s Modified Eagle’s Medium （日水製薬株式会社）を用い、５％ＣＯ２存在下３７℃で培養した。ＨｅＬａ細胞を約５０％コンフルエントとなるように３５ ｍｍディッシュに撒種した後、２４時間培養した。その後、合成した各種ＲＮＡをLipofectamine RNAiMAX（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用い、この取扱い説明書に従って導入した。
【0085】
（５）ＲＮＡの解析
ＲＮＡトランスフェクション後のＨｅＬａ細胞からのtotal RNAの単離は、グアニジンチオシアン酸塩、酸性フェノール、クロロホルムを用いた方法であるＡＧＰＣ（acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction）法により行った。調製したtotal RNAは、アガロースMOPSバッファーゲル（２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ ７．０）,５ｍＭ酢酸ナトリウム,１ｍＭ ＥＤＴＡ,２．０％Ａｇａｒｏｓｅ,２．４６Ｍホルムアルデヒド）により分離した後、２０ｘＳＳＣバッファー中でナイロン膜Biodyne-B (日本ポール株式会社)に転写した。転写後のナイロン膜は、ＵＶで固定したのち、ＤＩＧ標識プローブを用いハイブリダイズした。ＤＩＧ標識プローブの作製およびハイブリダイゼーションは、DIG RNA Labeling Mix (ロシュ ダイアグノスティックス株式会社)およびDIG Wash and Block Buffer Set (ロシュ ダイアグノスティックス株式会社)を用い取扱い説明書に従い行った。ｍＲＮＡの検出は、化学発光試薬CDP-Star (ロシュ ダイアグノスティックス株式会社)を用い、LAS3000mini（富士写真フィルム株式会社）により検出した。
ＲＮＡトランスフェクション後のＨｅＬａ細胞からのtotal RNAの単離は、グアニジンチオシアン酸塩、酸性フェノール、クロロホルムを用いた方法であるＡＧＰＣ（acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction）法により行った。調製したtotal RNAは、アガロースMOPSバッファーゲル（２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ ７．０）,５ｍＭ酢酸ナトリウム,１ｍＭ ＥＤＴＡ,２．０％Ａｇａｒｏｓｅ,２．４６Ｍホルムアルデヒド）により分離した後、２０ｘＳＳＣバッファー中でナイロン膜Biodyne-B (日本ポール株式会社)に転写した。転写後のナイロン膜は、ＵＶで固定したのち、ＤＩＧ標識プローブを用いハイブリダイズした。ＤＩＧ標識プローブの作製およびハイブリダイゼーションは、DIG RNA Labeling Mix (ロシュ ダイアグノスティックス株式会社)およびDIG Wash and Block Buffer Set (ロシュ ダイアグノスティックス株式会社)を用い取扱い説明書に従い行った。ｍＲＮＡの検出は、化学発光試薬CDP-Star (ロシュ ダイアグノスティックス株式会社)を用い、LAS3000mini（富士写真フィルム株式会社）により検出した。
【0086】
（６）タンパク質の解析
タンパク質の細胞内発現は、以下に示すウエスタンブロット法により行った。導入後の細胞からのタンパク質ライセートの調整は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファー（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）,４％グリセロール、２％ＳＤＳ、２％２－メルカプトエタノール、０．００４％ブロモフェノールブルー)を用いて行った。タンパク質ライセートは、８、１０、１２、もしくは１５％のアクリルアミドを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により分離した後、ニトロセルロース膜BioTrace NC (日本ポール株式会社)に電気的に転写した。転写後のニトロセルロース膜は、抗Flag M２マウスモノクローナル抗体(シグマアルドリッチジャパン合同会社)、抗GAPDH抗体（Saito et al JBC）、抗PABPC1抗体（Osawa et al RNA(2012)）、および、ペルオキシダーゼ付加抗マウスIgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.）もしくはペルオキシダーゼ付加抗ウサギIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)とインキュベートした。ニトロセルロース膜上のペルオキシダーゼ酵素活性は、ルミノール化学発光法を用い、LAS3000mini（富士写真フィルム株式会社）により検出した。
タンパク質の細胞内発現は、以下に示すウエスタンブロット法により行った。導入後の細胞からのタンパク質ライセートの調整は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファー（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）,４％グリセロール、２％ＳＤＳ、２％２－メルカプトエタノール、０．００４％ブロモフェノールブルー)を用いて行った。タンパク質ライセートは、８、１０、１２、もしくは１５％のアクリルアミドを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により分離した後、ニトロセルロース膜BioTrace NC (日本ポール株式会社)に電気的に転写した。転写後のニトロセルロース膜は、抗Flag M２マウスモノクローナル抗体(シグマアルドリッチジャパン合同会社)、抗GAPDH抗体（Saito et al JBC）、抗PABPC1抗体（Osawa et al RNA(2012)）、および、ペルオキシダーゼ付加抗マウスIgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.）もしくはペルオキシダーゼ付加抗ウサギIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)とインキュベートした。ニトロセルロース膜上のペルオキシダーゼ酵素活性は、ルミノール化学発光法を用い、LAS3000mini（富士写真フィルム株式会社）により検出した。
【0087】
（７）ＡＡＶＳ領域ゲノム編集効率の定量
ゲノム編集効率の定量は、以下に示すＴ７エンドヌクレアーゼアッセイ法により行った。ＡＡＶＳ領域を認識するｓｇＲＮＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）と合成した各種ｈＣａｓ９ ｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞に導入した。導入した細胞を、５０ｍＭ ＮａＯＨで処理することにより、ゲノムＤＮＡを調整した。調整したゲノムＤＮＡと、配列番号９２と配列番号９３に示すオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ法によりＡＡＶＳゲノム配列を増幅した。増幅したゲノム配列を熱変性ののちアニーリングさせることによりミスマッチを含む配列とした。アニーリングしたＡＡＶＳゲノム配列は、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（ニュー イングランド バイオラボ株式会社）により処理した。処理後のＡＡＶＳゲノム配列は、アガロースゲル電気泳動により分離した後、エチジウムブロマイドで染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００（ＧＥヘルスケア株式会社）により検出した。
ゲノム編集効率の定量は、以下に示すＴ７エンドヌクレアーゼアッセイ法により行った。ＡＡＶＳ領域を認識するｓｇＲＮＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）と合成した各種ｈＣａｓ９ ｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞に導入した。導入した細胞を、５０ｍＭ ＮａＯＨで処理することにより、ゲノムＤＮＡを調整した。調整したゲノムＤＮＡと、配列番号９２と配列番号９３に示すオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ法によりＡＡＶＳゲノム配列を増幅した。増幅したゲノム配列を熱変性ののちアニーリングさせることによりミスマッチを含む配列とした。アニーリングしたＡＡＶＳゲノム配列は、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（ニュー イングランド バイオラボ株式会社）により処理した。処理後のＡＡＶＳゲノム配列は、アガロースゲル電気泳動により分離した後、エチジウムブロマイドで染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００（ＧＥヘルスケア株式会社）により検出した。
【0088】
３．実験結果
（ｉ）実験１
図１は、作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図である。図１に示す人工合成ｍＲＮＡは、上から順に、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列及びＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列及びＬＤＨＢの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＡＣＡＴ２の５´ＵＴＲ配列及びＡＣＡＴ２の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡを示す。この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡの５´末端には、キャップ構造が付加されているとともに、３´末端にはポリＡ鎖が７２塩基付加されている。また、この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡのタンパク質コード領域であるＯＲＦには、５ｘＦｌａｇタグを付加したＥＧＦＰ（enhanced green fluorescent protein）を有する。
（ｉ）実験１
図１は、作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図である。図１に示す人工合成ｍＲＮＡは、上から順に、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列及びＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列及びＬＤＨＢの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＡＣＡＴ２の５´ＵＴＲ配列及びＡＣＡＴ２の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡを示す。この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡの５´末端には、キャップ構造が付加されているとともに、３´末端にはポリＡ鎖が７２塩基付加されている。また、この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡのタンパク質コード領域であるＯＲＦには、５ｘＦｌａｇタグを付加したＥＧＦＰ（enhanced green fluorescent protein）を有する。
【0089】
図２は、人工合成ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を測定した結果を示す図である。タンパク質発現量は、図１に示す人工合成ｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞に導入することにより測定した。図２は、人工合成ｍＲＮＡごとの発現量を示す。
【0090】
【0091】
図２の結果から、ＧＡＰＤＨのＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡは、ＡＣＡＴ２のＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと比較して、約１０倍の発現量を示すことが分かった。また、発現効率が高い人工合成ｍＲＮＡとして標準的に用いられるβ-グロビンの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと比較して、ＧＡＰＤＨのＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡは、約５倍の発現量を示すことが分かった。
【0092】
図３は、図１に示す人工合成ｍＲＮＡの安定性を示す図である。図３の横軸は、細胞に人工合成ｍＲＮＡを導入してからの経過時間を示し、図３の縦軸は、細胞に人工合成ｍＲＮＡを導入したときのｍＲＮＡの量を１００％とした場合のｍＲＮＡの量を示す。
【0093】
図３の結果から、いずれの人工合成ｍＲＮＡもＨｅＬａ細胞内において同様の分解速度を示すことが分かった。図２と図３に示す結果から、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列及びＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列が奏する効果は、安定性が向上するという効果ではなく、翻訳効率が向上する効果であることが分かった。
【0094】
（ｉｉ）実験２
図４は、作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図である。図４に示す人工合成ｍＲＮＡは、上から順に、ＡＣＡＴ２の５´ＵＴＲ配列及びＡＣＡＴ２の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＡＣＡＴ２の５´ＵＴＲ配列及びＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列及びＡＣＡＴ２の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列及びＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡを示す。この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡの５´末端には、キャップ構造が付加されているとともに、３´末端にはポリＡ鎖が７２塩基付加されている。また、この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡのタンパク質コード領域であるＯＲＦは、５ｘＦｌａｇタグを付加したＥＧＦＰを有する。
図４は、作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図である。図４に示す人工合成ｍＲＮＡは、上から順に、ＡＣＡＴ２の５´ＵＴＲ配列及びＡＣＡＴ２の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＡＣＡＴ２の５´ＵＴＲ配列及びＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列及びＡＣＡＴ２の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列及びＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡを示す。この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡの５´末端には、キャップ構造が付加されているとともに、３´末端にはポリＡ鎖が７２塩基付加されている。また、この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡのタンパク質コード領域であるＯＲＦは、５ｘＦｌａｇタグを付加したＥＧＦＰを有する。
【0095】
図５は、人工合成ｍＲＮＡごとの発現量を示す図である。タンパク質発現量は、図４に示す人工合成ｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞に導入することにより測定した。図５では、ＡＣＡＴ２の５´ＵＴＲ配列及びＡＣＡＴ２の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡの発現量を１とした場合の発現量の相対値を示す。
【0096】
図５の結果から、ＡＣＡＴ２の５´ＵＴＲ配列及びＡＣＡＴ２の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと比較して、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列及びＡＣＡＴ２の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡは、約１０倍の発現量を示すことが分かった。さらに、ＡＣＡＴ２の５´ＵＴＲ配列及びＡＣＡＴ２の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと比較して、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列及びＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡは、約２５倍の発現量を示すことが分かった。つまり、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を有することにより翻訳効率の向上効果を得られるが、さらに、ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を有することにより相乗的な翻訳効率の向上効果が得られることが分かった。
【0097】
図６は、人工合成ｍＲＮＡを腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞に導入した場合の人工合成ｍＲＮＡごとの発現量を示す図である。図５に関する実験と比較して、導入する細胞を変更した以外は、同様の方法にて実験を行った。図６の結果からも、図５の結果から分かったことと同様の傾向が見られた。つまり、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を有することにより翻訳効率の向上効果を得られるが、さらに、ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を有することにより相乗的な翻訳効率の向上効果が得られることが分かった。図５と図６に関する実験結果から、ＧＡＰＤＨのＵＴＲ配列を有することによって得られる翻訳効率の向上効果は、いずれの細胞においても有効であり、細胞特異性がないことが分かった。
【0098】
（ｉｉｉ）実験３
図７は、作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図である。図７に示す人工合成ｍＲＮＡは、上から順に、ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡと、５´ＵＴＲ配列を有するが３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡと、５´ＵＴＲ配列を有さないが３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、５´ＵＴＲ配列及び３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡを示す。この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡの５´末端には、キャップ構造が付加されているとともに、３´末端にはポリＡ鎖が７２塩基付加されている。また、この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡのタンパク質コード領域であるＯＲＦは、５ｘＦｌａｇタグを付加したＥＧＦＰを有する。
図７は、作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図である。図７に示す人工合成ｍＲＮＡは、上から順に、ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡと、５´ＵＴＲ配列を有するが３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡと、５´ＵＴＲ配列を有さないが３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、５´ＵＴＲ配列及び３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡを示す。この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡの５´末端には、キャップ構造が付加されているとともに、３´末端にはポリＡ鎖が７２塩基付加されている。また、この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡのタンパク質コード領域であるＯＲＦは、５ｘＦｌａｇタグを付加したＥＧＦＰを有する。
【0099】
図８は、ＧＡＰＤＨのＵＴＲ配列の有無に起因する発現量の違いを示す図である。図９は、ＬＤＨＢのＵＴＲ配列の有無に起因する発現量の違いを示す図である。図１０は、ＡＣＡＴ２のＵＴＲ配列の有無に起因する発現量の違いを示す図である。タンパク質発現量は、図７に示す人工合成ｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞に導入することにより測定した。図８，９，１０では、ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡの発現量を１とした場合の発現量の相対値を示す。
【0100】
図８の結果から、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列及びＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡの発現量は、５´ＵＴＲ配列を有するが３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡの発現量と、５´ＵＴＲ配列を有さないが３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡの発現量との和よりも大きい。つまり、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列とＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列とを有することにより、相乗的な翻訳効率の向上効果が得られることが分かった。
【0101】
一方、図９の結果から、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列及びＬＤＨＢの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡの発現量は、５´ＵＴＲ配列を有するが３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡの発現量と、５´ＵＴＲ配列を有さないが３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡの発現量との和と同等であった。つまり、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列とＬＤＨＢの３´ＵＴＲ配列とを有することにより得られる効果は、相加的な効果にとどまった。
【0102】
また、図１０の結果から、ＡＣＡＴ２のＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡの発現量は、ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡの発現量と比較して、翻訳効率が低下することが分かった。図８から図１０の結果から、５´ＵＴＲ配列と３´ＵＴＲ配列とを有することにより得られる相乗的な翻訳効率の向上効果は、ＧＡＰＤＨに特徴的な効果であることが分かった。
【0103】
（ｉｖ）実験４
図１１は、作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図である。図１１に示す人工合成ｍＲＮＡは、上から順に、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列及びＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ（以下、「野生型」とも呼ぶ）と、５´ＵＴＲ配列を３分割した部分のうちの最も５´末端側の部分を欠失した人工合成ｍＲＮＡ（欠失変位体１）と、５´ＵＴＲ配列を３分割した部分のうちの中央の部分を欠失した人工合成ｍＲＮＡ（欠失変位体２）と、５´ＵＴＲ配列を３分割した部分のうちの最も３´末端側の部分を欠失した人工合成ｍＲＮＡ（欠失変位体３）を示す。この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡの５´末端には、キャップ構造が付加されているとともに、３´末端にはポリＡ鎖が７２塩基付加されている。また、この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡのタンパク質コード領域であるＯＲＦは、ＥＧＦＰを有する。
図１１は、作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図である。図１１に示す人工合成ｍＲＮＡは、上から順に、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列及びＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ（以下、「野生型」とも呼ぶ）と、５´ＵＴＲ配列を３分割した部分のうちの最も５´末端側の部分を欠失した人工合成ｍＲＮＡ（欠失変位体１）と、５´ＵＴＲ配列を３分割した部分のうちの中央の部分を欠失した人工合成ｍＲＮＡ（欠失変位体２）と、５´ＵＴＲ配列を３分割した部分のうちの最も３´末端側の部分を欠失した人工合成ｍＲＮＡ（欠失変位体３）を示す。この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡの５´末端には、キャップ構造が付加されているとともに、３´末端にはポリＡ鎖が７２塩基付加されている。また、この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡのタンパク質コード領域であるＯＲＦは、ＥＧＦＰを有する。
【0104】
図１２は、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列の欠失の有無に起因する発現量の違いを示す図である。タンパク質発現量は、図１１に示す人工合成ｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞に導入することにより測定した。図１２では、野生型の発現量を１００とした場合の発現量の相対値を示す。
【0105】
図１３は、作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図である。図１３に示す人工合成ｍＲＮＡは、上から順に、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列及びＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ（野生型）と、３´ＵＴＲ配列を３分割した部分のうちの最も５´末端側の部分を欠失した人工合成ｍＲＮＡ（欠失変位体４）と、３´ＵＴＲ配列を３分割した部分のうちの中央の部分を欠失した人工合成ｍＲＮＡ（欠失変位体５）と、３´ＵＴＲ配列を３分割した部分のうちの最も３´末端側の部分を欠失した人工合成ｍＲＮＡ（欠失変位体６）を示す。この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡの５´末端には、キャップ構造が付加されているとともに、３´末端にはポリＡ鎖が７２塩基付加されている。また、この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡのタンパク質コード領域であるＯＲＦは、ＥＧＦＰを有する。
【0106】
図１４は、ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列の欠失の有無に起因する発現量の違いを示す図である。タンパク質発現量は、図１３に示す人工合成ｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞に導入することにより測定した。図１４において、野生型の発現量を１００とした場合の発現量の相対値を示す。
【0107】
図１２，１４の結果から、いずれの欠失変異体についても、野生型と比較して発現効率が低下したことが分かった。このことから、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列及びＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列は、ともに全領域が存在することが翻訳効率の向上効果に寄与していることが分かった。
【0108】
（ｖ）実験５
図１５は、作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図である。一般に、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列は、ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列と全領域にわたり相補性を有している。この実験では、互いの相補性が特に高い領域である５´ＵＴＲ配列の一部と３´ＵＴＲ配列の一部とを有する人工合成ｍＲＮＡを用いた。具体的には、５´ＵＴＲ配列として、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を３分割した部分のうちの最も５´末端側の部分であるＣＵがリッチな領域（２８ヌクレオチド）（以下、「５´ＵＴＲ ２８ｎｔ」とも呼ぶ）を用いた。ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列として、ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を３分割した部分のうちの最も５´末端側の部分であるＡＧがリッチな領域（２８ヌクレオチド）（以下、「３´ＵＴＲ ２８ｎｔ」とも呼ぶ）を用いた。
図１５は、作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図である。一般に、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列は、ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列と全領域にわたり相補性を有している。この実験では、互いの相補性が特に高い領域である５´ＵＴＲ配列の一部と３´ＵＴＲ配列の一部とを有する人工合成ｍＲＮＡを用いた。具体的には、５´ＵＴＲ配列として、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を３分割した部分のうちの最も５´末端側の部分であるＣＵがリッチな領域（２８ヌクレオチド）（以下、「５´ＵＴＲ ２８ｎｔ」とも呼ぶ）を用いた。ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列として、ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を３分割した部分のうちの最も５´末端側の部分であるＡＧがリッチな領域（２８ヌクレオチド）（以下、「３´ＵＴＲ ２８ｎｔ」とも呼ぶ）を用いた。
【0109】
図１６は、５´ＵＴＲ ２８ｎｔと３´ＵＴＲ ２８ｎｔの有無に起因する発現量の違いを示す図である。タンパク質発現量は、人工合成ｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞に導入することにより測定した。図１６において、野生型の発現量を１とした場合の発現量の相対値を示す。
【0110】
図１６の結果から、５´ＵＴＲ ２８ｎｔと３´ＵＴＲ ２８ｎｔの少なくとも一方を有する人工合成ｍＲＮＡは、野生型と比較して、翻訳効率が低下したことが分かった。この結果からも、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列及びＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列は、ともに全領域が存在することが翻訳効率の向上効果に寄与していることが分かった。
【0111】
（ｖｉ）実験６
図１７は、作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図である。この実験では、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を有し、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して所定の相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡを用いた。具体的には、図１７に示す人工合成ｍＲＮＡは、上から順に、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して９４％の相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して８８％の相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して７５％の相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して５０％の相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して２５％の相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡを示す。この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡの５´末端には、キャップ構造が付加されているとともに、３´末端にはポリＡ鎖が７２塩基付加されている。また、この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡのタンパク質コード領域であるＯＲＦは、ＥＧＦＰを有する。
図１７は、作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図である。この実験では、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を有し、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して所定の相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡを用いた。具体的には、図１７に示す人工合成ｍＲＮＡは、上から順に、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して９４％の相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して８８％の相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して７５％の相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して５０％の相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して２５％の相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡを示す。この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡの５´末端には、キャップ構造が付加されているとともに、３´末端にはポリＡ鎖が７２塩基付加されている。また、この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡのタンパク質コード領域であるＯＲＦは、ＥＧＦＰを有する。
【0112】
図１８は、相補性に起因する発現量の違いを示す図である。タンパク質発現量は、人工合成ｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞に導入することにより測定した。図１８において、野生型の発現量を１とした場合の発現量の相対値を示す。
【0113】
図１８の結果から、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して５０％の相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して７５％の相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡとが、野生型の２．５倍以上高い翻訳効率を示すことが分かった。
【0114】
図１９は、作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図である。この実験では、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を有し、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して１００％の相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡを用いた。この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡの５´末端には、キャップ構造が付加されているとともに、３´末端にはポリＡ鎖が７２塩基付加されている。また、この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡのタンパク質コード領域であるＯＲＦは、ＥＧＦＰを有する。
【0115】
図２０は、相補性に起因する発現量の違いを示す図である。タンパク質発現量は、人工合成ｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞に導入することにより測定した。図２０では、野生型の発現量を１００とした場合の発現量の相対値を示す。
【0116】
図２０の結果から、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して１００％の相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡは、タンパク質の発現が見られなかった。この結果から、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して部分的な相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有することが重要であることが分かった。
【0117】
（ｖｉｉ）実験７
図２１は、作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図である。この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡの５´末端には、キャップ構造が付加されているとともに、３´末端にはポリＡ鎖が７２塩基付加されている。また、この実験は実用化を目的とし、タンパク質コード領域として癌抑制遺伝子ｐ５３のＯＲＦを用いた。ＯＲＦには、５ｘＦｌａｇタグを付加した。
図２１は、作製した人工合成ｍＲＮＡを示す図である。この実験に用いた人工合成ｍＲＮＡの５´末端には、キャップ構造が付加されているとともに、３´末端にはポリＡ鎖が７２塩基付加されている。また、この実験は実用化を目的とし、タンパク質コード領域として癌抑制遺伝子ｐ５３のＯＲＦを用いた。ＯＲＦには、５ｘＦｌａｇタグを付加した。
【0118】
図２２は、癌抑制遺伝子ｐ５３を用いた場合における発現量の違いを示す図である。タンパク質発現量は、人工合成ｍＲＮＡをＵ２ＯＳ細胞に導入することにより測定した。図２２において、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して７５％の相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡの発現量を１００とした場合の発現量の相対値を示す。
【0119】
図２２の結果から、発現効率が高い人工合成ｍＲＮＡとして標準的に用いられるβ-グロビンの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡと比較して、野生型は約４倍高い翻訳効率を示すことが分かり、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して７５％の相補性を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡは約１０倍高い翻訳効率を示すことが分かった。
【0120】
図２３は、得られた効果の推定メカニズムを説明するための図である。本実施形態の人工合成ｍＲＮＡは、ＧＡＰＤＨの５´非翻訳領域と、ＧＡＰＤＨの３´非翻訳領域と、を備える。もしくは、本実施形態の人工合成ｍＲＮＡは、５´非翻訳領域と、５´非翻訳領域との相補性が４０％以上８０％以下である３´非翻訳領域と、を備える。換言すると、本実施形態の人工合成ｍＲＮＡは、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して、３´ＵＴＲ配列は、いずれも部分的な相補性を有する。このような部分的な相補性がｍＲＮＡの環状化を促進することにより、リボソームを効率的にリサイクルさせるため、翻訳効率が向上すると考えられる。
【0121】
（ｖｉｉｉ）実験８
図２４は、ゲノム編集遺伝子ｈＣａｓ９を用いた場合における発現量の違いを示す図である。図の縦軸は、発現量（Expression (fold increase)）を示す。この実験では、以下のｍＲＮＡを用いた。図は、５´ＵＴＲ配列及び３´ＵＴＲ配列を有さないときの発現量を１とした場合の発現量の相対値を示す。
・５´ＵＴＲ配列及び３´ＵＴＲ配列を有さないゲノム編集遺伝子ｈＣａｓ９（コントロール）
・ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を有し、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して７５％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を有し、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して５０％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
図２４は、ゲノム編集遺伝子ｈＣａｓ９を用いた場合における発現量の違いを示す図である。図の縦軸は、発現量（Expression (fold increase)）を示す。この実験では、以下のｍＲＮＡを用いた。図は、５´ＵＴＲ配列及び３´ＵＴＲ配列を有さないときの発現量を１とした場合の発現量の相対値を示す。
・５´ＵＴＲ配列及び３´ＵＴＲ配列を有さないゲノム編集遺伝子ｈＣａｓ９（コントロール）
・ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を有し、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して７５％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を有し、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して５０％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
【0122】
図２４の結果から、５´ＵＴＲ配列及び３´ＵＴＲ配列を有さないゲノム編集遺伝子ｈＣａｓ９と比較して、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡは２倍以上の翻訳効率を示すことが分かり、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して７５％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ及びＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して５０％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡは５倍以上の翻訳効率を示すことが分かった。
【0123】
図２５は、ゲノム編集遺伝子ｈＣａｓ９を用いた場合におけるゲノム編集量の違いを示す図である。図の縦軸は、ゲノム編集量（Genome editing (fold increase)）を示す。この実験では、図２４と同じｍＲＮＡを用いた。図は、５´ＵＴＲ配列及び３´ＵＴＲ配列を有さないゲノム編集遺伝子ｈＣａｓ９のゲノム編集量を１とした場合のゲノム編集量の相対値を示す。
【0124】
図２５の結果から、５´ＵＴＲ配列及び３´ＵＴＲ配列を有さないゲノム編集遺伝子ｈＣａｓ９と比較して、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡは２倍以上のゲノム編集量を示すことが分かり、ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して７５％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ及びＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列に対して５０％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡは３倍以上のゲノム編集量を示すことが分かった。
【0125】
（ｉｘ）実験９
図２６は、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲを用いた場合における発現量の違いを示す図である。図の縦軸は、発現量（Expression (fold increase)）を示す。この実験では、以下のｍＲＮＡを用いた。図は、５´ＵＴＲ配列及び３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡの発現量を１とした場合の発現量の相対値を示す。
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列を有し、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列に対して１００％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列を有し、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列に対して９２％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列を有し、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列に対して８８％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列を有し、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列に対して７４％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列を有し、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列に対して５０％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列を有し、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列に対して２４％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列を有し、３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡ
・５´ＵＴＲ配列及び３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡ
・ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を有し、ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
図２６は、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲを用いた場合における発現量の違いを示す図である。図の縦軸は、発現量（Expression (fold increase)）を示す。この実験では、以下のｍＲＮＡを用いた。図は、５´ＵＴＲ配列及び３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡの発現量を１とした場合の発現量の相対値を示す。
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列を有し、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列に対して１００％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列を有し、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列に対して９２％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列を有し、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列に対して８８％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列を有し、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列に対して７４％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列を有し、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列に対して５０％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列を有し、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列に対して２４％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列を有し、３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡ
・５´ＵＴＲ配列及び３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡ
・ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を有し、ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
【0126】
図２６の結果から、β－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列に対して７４％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ及びβ－ｇｌｏｂｉｎの５´ＵＴＲ配列に対して５０％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡが優れた翻訳効率を示すことが分かった。
【0127】
（ｘ）実験１０
図２７は、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲを用いた場合における発現量の違いを示す図である。図の縦軸は、発現量（Expression (fold increase)）を示す。この実験では、以下のｍＲＮＡを用いた。図は、５´ＵＴＲ配列及び３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡの発現量を１とした場合の発現量の相対値を示す。
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列を有し、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列に対して１００％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列を有し、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列に対して９３％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列を有し、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列に対して８６％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列を有し、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列に対して７１％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列を有し、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列に対して５０％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列を有し、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列に対して２９％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列を有し、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列に対して１４％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列を有し、３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡ
・５´ＵＴＲ配列及び３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡ
・ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を有し、ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
図２７は、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲを用いた場合における発現量の違いを示す図である。図の縦軸は、発現量（Expression (fold increase)）を示す。この実験では、以下のｍＲＮＡを用いた。図は、５´ＵＴＲ配列及び３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡの発現量を１とした場合の発現量の相対値を示す。
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列を有し、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列に対して１００％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列を有し、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列に対して９３％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列を有し、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列に対して８６％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列を有し、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列に対して７１％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列を有し、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列に対して５０％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列を有し、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列に対して２９％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列を有し、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列に対して１４％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列を有し、３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡ
・５´ＵＴＲ配列及び３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡ
・ＧＡＰＤＨの５´ＵＴＲ配列を有し、ＧＡＰＤＨの３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
【0128】
図２７の結果から、ＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列に対して７１％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ及びＲＰＳ８の５´ＵＴＲ配列に対して５０％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡが優れた翻訳効率を示すことが分かった。
【0129】
（ｘ）実験１０
図２８は、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲを用いた場合における発現量の違いを示す図である。図の縦軸は、発現量（Expression (fold increase)）を示す。この実験では、以下のｍＲＮＡを用いた。図は、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列を有し３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡの発現量を１とした場合の発現量の相対値を示す。
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列を有し、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列に対して１００％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列を有し、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列に対して９３％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列を有し、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列に対して８７％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列を有し、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列に対して７５％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列を有し、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列に対して５０％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列を有し、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列に対して２５％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列を有し、３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡ
図２８は、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲを用いた場合における発現量の違いを示す図である。図の縦軸は、発現量（Expression (fold increase)）を示す。この実験では、以下のｍＲＮＡを用いた。図は、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列を有し３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡの発現量を１とした場合の発現量の相対値を示す。
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列を有し、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列に対して１００％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列を有し、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列に対して９３％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列を有し、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列に対して８７％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列を有し、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列に対して７５％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列を有し、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列に対して５０％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列を有し、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列に対して２５％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ
・ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列を有し、３´ＵＴＲ配列を有さない人工合成ｍＲＮＡ
【0130】
図２８の結果から、ＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列に対して７５％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡ及びＬＤＨＢの５´ＵＴＲ配列に対して５０％の相補性の３´ＵＴＲ配列を有する３´ＵＴＲ配列を有する人工合成ｍＲＮＡが優れた翻訳効率を示すことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【0131】
本発明によれば、標的細胞に導入した人工合成ｍＲＮＡの翻訳効率が向上し、目的遺伝子の高発現が可能となる。本発明の用途として、例えば、ｍＲＮＡ医薬（各種ウイルス性疾患の治療、癌免疫療法等）、ｉＰＳ細胞の作製、幹細胞又は前駆細胞の分化誘導が想定される。
【0132】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【配列表】