特許7580154共重合体、抗体－共重合体コンジュゲート作成キット、抗体－共重合体コンジュゲート、抗原の濃縮方法、及び、抗原の検出方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-31
(45)【発行日】2024-11-11
(54)【発明の名称】共重合体、抗体－共重合体コンジュゲート作成キット、抗体－共重合体コンジュゲート、抗原の濃縮方法、及び、抗原の検出方法
(51)【国際特許分類】
C08F 8/14 20060101AFI20241101BHJP
C08F 8/30 20060101ALI20241101BHJP
C08F 220/54 20060101ALI20241101BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20241101BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20241101BHJP
【ＦＩ】
C08F8/14
C08F8/30
C08F220/54
G01N33/569 L
G01N33/53 D
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2023514514
(86)(22)【出願日】2022-03-07
(86)【国際出願番号】 JP2022009632
(87)【国際公開番号】W WO2022219967
(87)【国際公開日】2022-10-20
【審査請求日】2023-07-11
(31)【優先権主張番号】P 2021066984
(32)【優先日】2021-04-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】301023238
【氏名又は名称】国立研究開発法人物質・材料研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】110003535
【氏名又は名称】スプリング弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】荏原 充宏
(72)【発明者】
【氏名】トルバ アーメッドナビル アーメッドエルセイト
【審査官】中村 英司
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０３０４４２０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／０６８２７１（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０８Ｆ ８／１４
Ｃ０８Ｆ ８／３０
Ｃ０８Ｆ ２２０／５４
Ｇ０１Ｎ ３３／５６９
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｃ０７Ｋ １６／１０
Ｃ０７Ｋ １４／１６５
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式１で表される繰り返し単位である、単位１、及び、下記式２－１で表される繰り返し単位である、単位２を含む共重合体。【化1】
【化2】
【化3】
【請求項2】
全繰り返し単位を１００モル％としたとき、前記単位２の含有量が、１．０～３０．０モル％である、請求項１に記載の共重合体。
【請求項3】
前記単位２が、下記式３で表される単位３、又は、下記式４で表される単位４である、請求項１又は２に記載の共重合体。【化4】
【請求項4】
更に、下記式５で表される繰り返し単位を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の共重合体。【化5】
【請求項5】
全繰り返し単位を１００モル％としたとき、前記単位２の含有量が、５～３０モル％以下である、請求項１～４のいずれか１項に記載の共重合体。
【請求項6】
数平均分子量が、５０００～５００００である、請求項１～５のいずれか１項に記載の共重合体。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項に記載の共重合体と、下記式６で表されるリンカーとを有する、抗体－共重合体コンジュゲート作成キット。【化6】
【請求項8】
下記式１で表される繰り返し単位である、単位１、及び、下記式７で表される繰り返し単位である、単位７を有する抗体－共重合体コンジュゲート。【化7】
【請求項9】
前記Ａｂが、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である、請求項８に記載の抗体－共重合体コンジュゲート。
【請求項10】
請求項８又は９に記載の抗体－共重合体コンジュゲートと、前記抗体に対応する抗原とを含有する混合液Ａを調製し、前記抗体－共重合体コンジュゲートと前記抗原との複合体を形成することと、前記混合液Ａを２０～４０℃に加熱して、前記複合体を沈殿させることと、を有する、抗原の濃縮方法。
【請求項11】
下記式６で表されるリンカーと、抗体とを、前記抗体が有するアミノ基に由来するアミド結合を介して結合させ、抗体－リンカー複合体を調製することと、前記抗体－リンカー複合体と、下記式１で表される繰り返し単位である単位１と、下記式２－１で表される繰り返し単位である、単位２と、を含む共重合体とを含有する混合液Ｂを調製することと、
前記混合液Ｂ中で、前記抗体－リンカー複合体が有するアジド基と、前記共重合体が有するアルキニレン基とを反応させることで結合させ、抗体－共重合体コンジュゲートを生成することと、
抗体－共重合体コンジュゲートと、前記抗体に対応する抗原とを含有する混合液Ａを調製し、前記抗体－共重合体コンジュゲートと前記抗原との複合体を形成することと、
前記混合液Ａを２０℃以上に加熱して、前記複合体を沈殿させることと、を有する、抗原の濃縮方法。
【化8】
【化9】
【化10】
【化11】
【請求項12】
前記抗体が、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である、請求項１０又は１１に記載の抗原の濃縮方法。
【請求項13】
前記抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパクである、請求項１２に記載の抗原の濃縮方法。
【請求項14】
前記混合液Ｂ中における前記抗体－リンカー複合体が含有する前記抗体の含有量に対する、前記共重合体の含有量のモル基準の比が、０．５～３０である、請求項１１に記載の抗原の濃縮方法。
【請求項15】
請求項１０～１４のいずれか１項に記載の抗原の濃縮方法によって抗原を濃縮することと、前記濃縮した抗原を検出することと、を含む、抗原の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、共重合体、抗体－共重合体コンジュゲート作成キット、抗体－共重合体コンジュゲート、抗原の濃縮方法、及び、抗原の検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
溶液の温度変化に応じて相転移が起こし、物性を変化させる「温度応答性高分子」が知られている。このような温度応答性高分子として、特許文献１には、「アジド基又はアルキン基を有するイソプロピルアクリルアミド誘導体」の重合体が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特開２０１２－２０１６３４号公報
【発明の概要】
【発明の解決しようとする課題】
【0004】
ＣＯＶＩＤ－１９（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の診断においては、検体中のウィルス、抗体、及び／又は、抗原（特に抗原）の量が少ないことに起因して、偽陽性率が高いことが問題となっており、検査ターゲットとなる対象物を簡便に濃縮し検査感度を向上させる方法が求められている。
【0005】
そこで、本発明は、抗体を固定することによって、抗原の濃縮に利用できる共重合体を提供することを課題とする。また、本発明は、抗体－共重合体コンジュゲート作成キット、抗体－共重合体コンジュゲート、抗原の濃縮方法、及び、抗原の検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。
【0007】
［１］ 後述する単位１、及び、後述する単位２を含む共重合体。
［２］ 全繰り返し単位を１００モル％としたとき、上記単位２の含有量が、１．０～３０．０モル％である、［１］に記載の共重合体。
［３］ 上記単位２が、後述する式３で表される単位３、又は、後述する式４で表される単位４である、［１］又は［２］に記載の共重合体。
［４］ 更に、後述する式５で表される繰り返し単位を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の共重合体。
［５］ 全繰り返し単位を１００モル％としたとき、上記単位２の含有量が、５～３０モル％以下である、［１］～［４］のいずれかに記載の共重合体。
［６］ 数平均分子量が、５０００～５００００である、［１］～［５］のいずれかに記載の共重合体。
［７］ ［１］～［６］のいずれかに記載の共重合体と、後述する式４で表されるリンカーとを有する、抗体－共重合体コンジュゲート作成キット。
［８］ 後述する単位１、及び、後述する単位７を有する抗体－共重合体コンジュゲート。
［９］ 上記抗体－共重合体コンジュゲートにおけるＡｂが、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である、［８］に記載の抗体－共重合体コンジュゲート。
［１０］ ［８］又は［９］に記載の抗体－共重合体コンジュゲートと、上記抗体に対応する抗原とを含有する混合液Ａを調製し、上記抗体－共重合体コンジュゲートと上記抗原との複合体を形成することと、上記混合液Ａを２０～４０℃に加熱して、上記複合体を沈殿させることと、を有する、抗原の濃縮方法。
［１１］ 更に、後述する式４で表されるリンカーと、上記抗体とを、上記抗体が有するアミノ基に由来するアミド結合を介して結合させ、抗体－リンカー複合体を調製することと、上記抗体－リンカー複合体と、後述する単位１と、後述する単位２と、を含む共重合体とを含有する混合液Ｂを調製することと、上記混合液Ｂ中で、上記抗体－リンカー複合体が有するアジド基と、上記共重合体が有するアルキニレン基とを反応させることで結合させ、上記抗体－共重合体コンジュゲートを生成することと、を含む、［１０］に記載の抗原の濃縮方法。
［１２］ 上記抗体が、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である、［１０］又は［１１］に記載の抗原の濃縮方法。
［１３］ 上記抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパクである、［１２］に記載の抗原の濃縮方法。
［１４］ 上記混合液Ｂ中における上記抗体－リンカー複合体が含有する上記抗体の含有量に対する、上記共重合体の含有量のモル基準の比が、０．５～３０である、［１１］に記載の抗原の濃縮方法。
［１５］ ［１０］～［１４］のいずれかに記載の抗原の濃縮方法によって抗原を濃縮することと、上記濃縮した抗原を検出することと、を含む、抗原の検出方法。
［２］ 全繰り返し単位を１００モル％としたとき、上記単位２の含有量が、１．０～３０．０モル％である、［１］に記載の共重合体。
［３］ 上記単位２が、後述する式３で表される単位３、又は、後述する式４で表される単位４である、［１］又は［２］に記載の共重合体。
［４］ 更に、後述する式５で表される繰り返し単位を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の共重合体。
［５］ 全繰り返し単位を１００モル％としたとき、上記単位２の含有量が、５～３０モル％以下である、［１］～［４］のいずれかに記載の共重合体。
［６］ 数平均分子量が、５０００～５００００である、［１］～［５］のいずれかに記載の共重合体。
［７］ ［１］～［６］のいずれかに記載の共重合体と、後述する式４で表されるリンカーとを有する、抗体－共重合体コンジュゲート作成キット。
［８］ 後述する単位１、及び、後述する単位７を有する抗体－共重合体コンジュゲート。
［９］ 上記抗体－共重合体コンジュゲートにおけるＡｂが、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である、［８］に記載の抗体－共重合体コンジュゲート。
［１０］ ［８］又は［９］に記載の抗体－共重合体コンジュゲートと、上記抗体に対応する抗原とを含有する混合液Ａを調製し、上記抗体－共重合体コンジュゲートと上記抗原との複合体を形成することと、上記混合液Ａを２０～４０℃に加熱して、上記複合体を沈殿させることと、を有する、抗原の濃縮方法。
［１１］ 更に、後述する式４で表されるリンカーと、上記抗体とを、上記抗体が有するアミノ基に由来するアミド結合を介して結合させ、抗体－リンカー複合体を調製することと、上記抗体－リンカー複合体と、後述する単位１と、後述する単位２と、を含む共重合体とを含有する混合液Ｂを調製することと、上記混合液Ｂ中で、上記抗体－リンカー複合体が有するアジド基と、上記共重合体が有するアルキニレン基とを反応させることで結合させ、上記抗体－共重合体コンジュゲートを生成することと、を含む、［１０］に記載の抗原の濃縮方法。
［１２］ 上記抗体が、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である、［１０］又は［１１］に記載の抗原の濃縮方法。
［１３］ 上記抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパクである、［１２］に記載の抗原の濃縮方法。
［１４］ 上記混合液Ｂ中における上記抗体－リンカー複合体が含有する上記抗体の含有量に対する、上記共重合体の含有量のモル基準の比が、０．５～３０である、［１１］に記載の抗原の濃縮方法。
［１５］ ［１０］～［１４］のいずれかに記載の抗原の濃縮方法によって抗原を濃縮することと、上記濃縮した抗原を検出することと、を含む、抗原の検出方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、抗体を固定することによって、抗原の濃縮に利用できる共重合体が提供できる。また、本発明によれば、抗体－共重合体コンジュゲート作成キット、抗体－共重合体コンジュゲート、抗原の濃縮方法、及び、抗原の検出方法も提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】合成したＨＩＰＡＡｍを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で可視化したものである。
【図2】ＨＩＰＡＡｍモノマーの１Ｈ ＮＭＲ 分析結果である。
【図3】Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ）の１Ｈ ＮＭＲ分析結果である。
【図4】特定共重合体（Ｉ）の１Ｈ ＮＭＲ分析結果である。
【図5】合成したＰ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ）のＬＣＳＴ（Ｌｏｗｅｒ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）測定結果である。
【図6】合成した特定共重合体（Ｉ）のＬＣＳＴ測定結果である。
【図7】抗体と特定共重合体（Ｉ）とのコンジュゲートのＬＣＳＴ測定結果である。
【図8】Ｃｏｖｉｄ－１９抗体あたりのアジド（ＥＧ）４－ＮＨＳの導入量をフルオレスカミンで測定した結果である。
【図9】ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる、抗体と異なる濃度の合成ポリマーとのクリック反応の評価結果である。
【図10】抗体コンジュゲートの濃度を変えた場合のＣＯＶＩＤ－１９組換えタンパク質の濃縮率を表す図である。
【図11】ラテラルフロー免疫測定法（ＬＦＩＡ）によるＣＯＶＩＤ－１９抗体温度応答性ポリマーの濃縮効果の評価である。
【図12】ラテラルフロー免疫測定法（ＬＦＩＡ）によるＣＯＶＩＤ－１９抗体温度応答性ポリマーの濃縮効果の評価である。
【図13】合成した共重合体（ＩＩ）のＬＣＳＴの測定結果である。
【図14】Ｃｏｖｉｄ－１９抗体（Ｓタンパク捕捉用抗体）あたりのアジド（ＥＧ）４－ＮＨＳの導入量をフルオレスカミンで測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下、本発明について詳細に説明する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
【0011】
［共重合体］
本発明の実施形態に係る共重合体（以下、「特定共重合体」ともいう。）は、下記式１で表される繰り返し単位（単位１）、及び、下記式２で表される繰り返し単位（単位２）を含む共重合体である。
本発明の実施形態に係る共重合体（以下、「特定共重合体」ともいう。）は、下記式１で表される繰り返し単位（単位１）、及び、下記式２で表される繰り返し単位（単位２）を含む共重合体である。
【0012】
【化1】
【0013】
（単位１）
単位１は、それ単独で構成される重合体が水に対してＬＣＳＴ（Ｌｏｗｅｒ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）が３２℃の温度応答性を示す。単位１を含むことによって、特定共重合体は温度応答性を有する。
単位１は、それ単独で構成される重合体が水に対してＬＣＳＴ（Ｌｏｗｅｒ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）が３２℃の温度応答性を示す。単位１を含むことによって、特定共重合体は温度応答性を有する。
【0014】
特定共重合体に含まれる単位１の含有量としては特に制限されず、全繰り返し単位を１００モル％としたとき、典型的には、１～９９モル％が好ましい。なかでも、特定共重合体がより敏感な温度応答性を有する観点、及び／又は、ＬＣＳＴを抗原の濃縮のために適した温度範囲に制御しやすい（具体的には、ＬＣＳＴが室温～４０℃程度になりやすい）観点で、特定共重合体中における単位１の含有量は５０モル％を超えることが好ましく、６０モル％以上がより好ましく、９７モル％以下が好ましく、９０モル％以下がより好ましい。
【0015】
式１中、Ｘ１は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を表し、特定共重合体がより敏感な温度応答性を有する観点で、水素原子、又は、炭素数が１～４個の直鎖状のアルキル基が好ましく、水素原子、又は、メチル基がより好ましい。
【0016】
特に制限されないが、単位１は、以下の式１′で表される単量体（モノマー）に基づく単位であることが好ましい。
【0017】
【化2】
【0018】
式１′中、Ｘ１は、式１中のＸ１と同義であり、好適形態も同様である。式１′で表される単量体は、例えば、公知の方法、例えば、後述する実施例に記載の方法により合成してもよいし、市販品を用いてもよい。
【0019】
（単位２）
特定共重合体は、式２で表される単位２を有する。単位２は、繰り返し単位の１つにつき、環状アルキン（アルキニレン基）を含む部位（クリック反応部位）を１つ有し、後述するリンカーが有するアジド基とクリック反応により結合し、容易に複合体を形成し得る。例えば、リンカーとタンパク質（抗体等）とを予め結合させておけば、リンカーを介してタンパク質を特定共重合体に固定できる。すなわち、抗体－共重合体コンジュゲートを作製できる。
作製されるコンジュゲートは、特定共重合体に由来する温度応答性により、ＬＣＳＴ又はこれ以上の温度で凝集、沈殿を起こす。これを利用し、抗体に対応する抗原を濃縮できる。
特定共重合体は、式２で表される単位２を有する。単位２は、繰り返し単位の１つにつき、環状アルキン（アルキニレン基）を含む部位（クリック反応部位）を１つ有し、後述するリンカーが有するアジド基とクリック反応により結合し、容易に複合体を形成し得る。例えば、リンカーとタンパク質（抗体等）とを予め結合させておけば、リンカーを介してタンパク質を特定共重合体に固定できる。すなわち、抗体－共重合体コンジュゲートを作製できる。
作製されるコンジュゲートは、特定共重合体に由来する温度応答性により、ＬＣＳＴ又はこれ以上の温度で凝集、沈殿を起こす。これを利用し、抗体に対応する抗原を濃縮できる。
【0020】
特定共重合体中における単位２の含有量としては特に制限されないが、特定共重合体が有する全繰り返し単位を１００モル％としたとき、典型的には、１～９９モル％が好ましい。
なかでも、ＬＣＳＴをより低い温度とし、濃縮後に抗原を検出する際により高感度に検出できる観点では、１モル％以上が好ましく、２モル％以上がより好ましく、５モル％以上が更に好ましく、３０モル％以下が好ましく、２０モル％以下がより好ましい。
なかでも、ＬＣＳＴをより低い温度とし、濃縮後に抗原を検出する際により高感度に検出できる観点では、１モル％以上が好ましく、２モル％以上がより好ましく、５モル％以上が更に好ましく、３０モル％以下が好ましく、２０モル％以下がより好ましい。
【0021】
単位２は、典型的には他の繰り返し単位と比較して疎水性がより高く、単位２の含有量を増加させることによって、ＬＣＳＴをより低温化することができる。
また、単位２の含有量が多いほど、抗体がより導入されやすい。一方で、２０～４０℃に加熱して濃縮する用途に鑑みると、単位２の含有量は、１モル％以上が好ましく、２モル％以上がより好ましく、５モル％以上が更に好ましく、１０モル％が特に好ましく、３０モル％以下が好ましく、２０モル％以下がより好ましい。
また、単位２の含有量が多いほど、抗体がより導入されやすい。一方で、２０～４０℃に加熱して濃縮する用途に鑑みると、単位２の含有量は、１モル％以上が好ましく、２モル％以上がより好ましく、５モル％以上が更に好ましく、１０モル％が特に好ましく、３０モル％以下が好ましく、２０モル％以下がより好ましい。
【0022】
【化3】
【0023】
式２中、Ｘ２は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を表し、特定共重合体がより敏感な温度応答性を有する観点で、水素原子、又は、炭素数が１～４個の直鎖状のアルキル基が好ましく、水素原子、又は、メチル基がより好ましい。
【0024】
式２中、Ｌ２は、２価の基を表す。Ｌ２としては特に制限されないが、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＮＲＡ－（ＲＡは水素原子又は１価の置換基）、炭素数が１～２０個の直鎖状、分枝鎖状、又は、環状の脂肪族炭化水素基、炭素数が６～２０個の単環、又は、縮合環の芳香族炭化水素基、及び、これらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
なかでも、より優れた本発明の効果を有する共重合体が得られる観点では、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲＡ－、炭素数が１～１０の直鎖状のアルキレン基、及び、これらの組合せからなる群より選択される１種の基がより好ましく、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、及び、－ＮＲＡ－からなる群より選択される少なくとも１種の基が更に好ましく、－０－、－Ｃ（Ｏ）－、又は、－ＮＨ－が特に好ましい。
なかでも、より優れた本発明の効果を有する共重合体が得られる観点では、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲＡ－、炭素数が１～１０の直鎖状のアルキレン基、及び、これらの組合せからなる群より選択される１種の基がより好ましく、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、及び、－ＮＲＡ－からなる群より選択される少なくとも１種の基が更に好ましく、－０－、－Ｃ（Ｏ）－、又は、－ＮＨ－が特に好ましい。
【0025】
式２中、Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＲ５、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、炭素数が１～２４個のアルキル基、炭素数が２～２４個のアルケニル基、及び、炭素数が６～２４個の（ヘテロ）アリール基からなる群より選択され、２つ以上のＲ１は互いに結合して環を形成していてもよく、Ｒ５は、水素、ハロゲン原子、及び、炭素数１～２４個のアルキル基、炭素数６～２４個の（ヘテロ）アリール基からなる群から選択され、Ｚは、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ、及び、ＮＲ１からなる群より選択され、ａ′は、０～８の整数であり、ａ″は、０～８の整数であり、ａ′とａ″の和は１０未満である。なお複数あるＲ１は互いに同一でも異なってもよい。
【0026】
単位２は、Ｌ２との結合部位を「＊」としたとき、例えば、以下の式Ｃで表される構造（クリック反応部位）を有することが好ましい。言い換えれば、以下の式で表される波線以降に「＊」の位置で結合される部位（１価の基）として、以下の式Ｃで表される構造を有することが好ましい。
【0027】
【化4】
【0028】
【化5】
【0029】
より優れた本発明の効果を有する共重合体が得られる観点では、単位２は、以下の式で表される単位からなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
なお、下記式中、Ｌ２１は２価の基を表し、式２中のＬ２と同義であり、好適形態も同様である。また、Ｘ２は、式２中のＸ２と同義であり、好適形態も同様である。
なお、下記式中、Ｌ２１は２価の基を表し、式２中のＬ２と同義であり、好適形態も同様である。また、Ｘ２は、式２中のＸ２と同義であり、好適形態も同様である。
【0030】
【化6】
【0031】
なかでも、より優れた本発明の効果を有する共重合体が得られる観点で、単位２は、以下の式３又は４で表される単位３又は単位４が好ましい。
【0032】
【化7】
【0033】
式３、及び、式４中、Ｘ２は水素原子、又は、炭素数１～６直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を表し、式３中、Ｌ３は－Ｏ－、－Ｓ－、及び、－ＮＲＢ－からなる群より選択される１種の基であり、ＲＢは、水素原子、又は、炭素数１～６個のアルキル基を表し、ｎは１～１０の整数を表し、式４中、Ｌ２は、２価の基を表し、好適形態は、式２中のＬ２の２価の基と同様である。
【0034】
単位２の合成方法としては特に制限されず、公知の合成方法が使用できるが、より簡便に単位２を得ることができる点で、以下の式２′で表される単位２′に前駆体化合物を結合させて、単位２を得る方法が好ましい。
【0035】
【化8】
【0036】
式２′中、ＲＣは反応性置換基であり、具体的には、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、グリシジル基、メルカプト基、ヒドロキシスクシンイミドエステル、及び、マレイミド等が挙げられ、ヒドロキシ基が好ましい。
【0037】
前駆体化合物としては、例えば、クリック反応部位と、上記ＲＣと反応し得る基とを有する化合物を用いればよく、市販品を用いることもできるし、公知の方法で合成して用いることもできる。なかでも、上述の式Ｃで表される構造（クリック反応部位）と、カルボキシ基とを有する前駆体化合物を用いると、より簡便に、特定共重合体を合成できる。
【0038】
前駆体化合物の合成方法は、例えば、クリック反応部位が二フッ素化シクロオクチンであれば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，３４，１１４８６－１１４９３のスキーム１及び２に記載されている方法が使用できる。また、クリック反応部位がジベンゾアザシクロオクチンであれば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１０），４６（１），９７－９９のスキーム１に記載された方法が使用できる。
【0039】
また、クリック反応部位であるＢＣＮ（ｂｉｃｙｃｌｏ［６．１．０］ｎｏｎｙｎｅ）、及び、ＤＢＣＯ等に、アミノ基、ヒドロキシ基、及び、カルボキシ基等の置換基が付加されたものや、マレイミド、及び、ヒドロキシスクシンイミドエステル化されたものが市販されており、前駆体化合物としては、これらを用いることもできる。
【0040】
なかでも、より簡便に単位２が得られる点で、単位２′は、以下の式５で表される単位５であることが好ましい。この場合、前駆体化合物としては、典型的には、カルボキシ基と、式Ｃで表される構造とを有する前駆体化合物を用いればよい。
【0041】
【化9】
【0042】
なお、特定共重合体を合成する際に、未反応の単位５があると、言い換えれば、特定共重合体が、単位１、単位２、及び、単位５を含む場合、ＬＣＳＴを高温側に調整することができる。単位５は、他の繰り返し単位と比較して親水性が高いため、単位５の含有量を増加させることで、ＬＣＳＴを高温側へと調整することができる。
【0043】
上記式５中、Ｘ５は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を表し、共重合体がより敏感な温度応答性を有する観点で、水素原子、又は、炭素数が１～４個の直鎖状のアルキル基が好ましく、水素原子、又は、メチル基がより好ましい。
【0044】
特定共重合体における単位５の含有量としては特に制限されないが、特定共重合体の全繰り返し単位を１００モル％としたとき、０～１５モル％が好ましい。
【0045】
特定共重合体の分子量としては特に制限されないが、典型的には、数平均分子量として２０００～１０００００が好ましく、５０００～５００００がより好ましく、１００００～３００００が更に好ましい。
数平均分子量が５０００以上であると、より優れた濃縮効率が得られやすく（言い換えれば、より優れた温度応答性が得られやすく）、一方で、５００００以下であると、抗体とのコンジュゲートを形成しやすく、又は、抗原－抗体反応がより進行しやすい。
数平均分子量が５０００以上であると、より優れた濃縮効率が得られやすく（言い換えれば、より優れた温度応答性が得られやすく）、一方で、５００００以下であると、抗体とのコンジュゲートを形成しやすく、又は、抗原－抗体反応がより進行しやすい。
【0046】
なかでも、得られる共重合体によって作製した抗体－共重合体コンジュゲートを用いたとき、より優れた濃縮効率が得られる点で、数平均分子量が、１５０００以上であることが好ましく、２００００以上であることがより好ましい。一般に抗体は親水性が高いことが多く、そのような場合には、より優れた濃縮効率を有する共重合体が必要であるが、上記共重合体の数平均分子量が上記数値範囲内であると、優れた濃縮効率が得られやすい。
また、抗体の分子量に対する、特定共重合体の分子量の比（特定共重合体／抗体）としては特に制限されないが、１／３０～１／５が好ましい。
また、抗体の分子量に対する、特定共重合体の分子量の比（特定共重合体／抗体）としては特に制限されないが、１／３０～１／５が好ましい。
【0047】
特定共重合体の分子量分散度（ＰＤＩ）としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する共重合体が得られる観点では、１．５以下が好ましく、１．３以下がより好ましい。
【0048】
（その他の単位）
特定共重合体は、上記以外の繰り返し単位を有していてもよい。上記以外の繰り返し単位としては、例えば、Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝４６℃）、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２２℃）、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２８℃）、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３５℃）、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝５６℃）、Ｎ－メチル－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２３℃）、Ｎ－メチル－Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２０℃）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３２℃）、Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝５９℃）、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝４４℃）、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２８℃）、及び、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３５℃）等に基づく繰り返し単位が挙げられる。
特定共重合体は、上記以外の繰り返し単位を有していてもよい。上記以外の繰り返し単位としては、例えば、Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝４６℃）、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２２℃）、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２８℃）、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３５℃）、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝５６℃）、Ｎ－メチル－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２３℃）、Ｎ－メチル－Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２０℃）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３２℃）、Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝５９℃）、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝４４℃）、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２８℃）、及び、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３５℃）等に基づく繰り返し単位が挙げられる。
【0049】
［特定共重合体の製造方法］
特定共重合体の製造方法としては、特に制限されないが、より簡便に特定共重合体を製造できる観点で、以下の工程（１）、及び、工程（２）をこの順に有することが好ましい。
特定共重合体の製造方法としては、特に制限されないが、より簡便に特定共重合体を製造できる観点で、以下の工程（１）、及び、工程（２）をこの順に有することが好ましい。
【0050】
工程（１）：以下の式１′、及び、式３′で表される単量体を共重合させて、共重合体（前駆体）を得る工程。
【0051】
【化10】
【0052】
上記式１′、及び、３′中、Ｘ１、及び、Ｘ２はそれぞれ、式１中のＸ１、及び、式２′中のＸ２のそれぞれと同義であり、好適形態も同様である。
【0053】
上記単量体を共重合させる方法は特に制限されず、リビングラジカル重合法、リビングアニオン重合法、及び、リビングカチオン重合法等のリビング重合法を用いることが好ましい。なかでも、より簡便に共重合体（前駆体）が得られる観点では、リビングラジカル重合法が好ましい。
【0054】
リビングラジカル重合法とは、熱、光、及び、金属触媒等を作用させ、成長反応における少量の成長ラジカル（フリーラジカル）種と多量の休止（ドーマント）種の素早い平衡を確立させる事に基づいている。休止（ドーマント）鎖により種々の形式のリビングラジカル重合が提案されている。
【0055】
例えば、ドーマントとしてハロゲン化アルキルを用いるＡＴＲＰ法（原子移動ラジカル重合法）、チオエステルを用いるＲＡＦＴ法（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｈａｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ）、アルコキシアミンを用いるＮＭＰ法（ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）等がある。
【0056】
ＲＡＦＴ法は、通常のラジカル重合の系にＲＡＦＴ剤と呼ばれる高い連鎖移動定数を有する連鎖移動剤を添加してビニル系モノマーを重合させる方法である。ＲＡＦＴ剤としては、チオエステルを使用することができる。
【0057】
ＲＡＦＴ剤の量は、目的とする共重合体の分子量によって適宜選択できる。すなわち、各共重合体の末端にＲＡＦＴ剤が結合するため、例えば、１００量体の共重合体を目的物とする場合、単量体１００モル％に対して、０．１～３モル％使用すればよい。
【0058】
ＲＡＦＴ重合に使用するラジカル重合開始剤は特に制限されず、アゾ化合物、パーオキサイド、及び、レドックス型等の公知の開始剤の中から適宜選択されればよい。
【0059】
アゾ化合物の例としては２，２′－アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２′－アゾビス２，４－ジメチルバレロニトリル、２，２′－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩、４，４′－アゾビス（４－シアノ吉草酸）が挙げられる。
【0060】
重合開始剤は一般にＲＡＦＴ剤の１モルに対して、０．１～５０モル％が好ましい。ＲＡＦＴ法の反応は、用いるラジカル重合開始剤によって決まるが、一般的に４０℃～１５０℃で行われることが多い。大気圧下での重合が多いが、加圧下でも重合は可能である。
【0061】
ＲＡＦＴ法は、溶媒不存在下で行うことができるが、溶媒の存在下でも行うことができる。必要に応じて使用する溶媒としては特に制限されず、公知の溶媒が使用できる。また、水中でも反応を行うことは可能であり、乳化重合でも反応は進行する。その際に使用する乳化剤は、一般的な乳化重合に使用可能なノニオン性乳化剤、カチオン性乳化剤、アニオン性乳化剤が使用できる。
【0062】
工程（２）：得られた共重合体（前駆体）と、式４′で表される前駆体化合物とを反応させて、特定共重合体を得る工程。
【0063】
【化11】
【0064】
式１０中、Ｚは、クリック反応部位（例えば環状アルキン）を含む基であり、すでに説明した式Ｃで表される基から選択される基であることが好ましい。なお、式Ｃ中、＊はＬ１０との結合位置とする。
また、Ｌ１０は２価の基を表し、式２中のＬ２と同義であり、好適形態も同様である。
また、Ｌ１０は２価の基を表し、式２中のＬ２と同義であり、好適形態も同様である。
【0065】
共重合体（前駆体）が有するヒドロキシ基と、式４′で表される前駆体化合物が有するカルボキシ基とによって、エステル結合を形成する（縮合させる）ことにより、所望の特定共重合体が合成される。
【0066】
エステル結合を形成する方法としては特に制限されないが、例えば、共重合体（前駆体）と前駆体化合物とを、縮合剤、触媒、及び溶媒の存在下で、０～１５０℃（好ましくは０～１００℃）において、３０分～２４時間（好ましくは３～１５時間）縮合反応させる方法が挙げられる。
【0067】
縮合剤としては、トリフェニルホスファイト、Ｎ，Ｎ′－ジシクロヘキシルカルボジイミド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、Ｎ，Ｎ′－カルボニルジイミダゾール、ジメトキシ－１，３，５－トリアジニルメチルモルホリニウム、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート、及び、（２，３－ジヒドロ－２－チオキソ－３－ベンゾオキサゾリル）ホスホン酸ジフェニル等を用いることができ、なかでも、Ｎ，Ｎ′－ジシクロヘキシルカルボジイミドが好ましく、この場合、触媒としては、Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン等を用いることができ、溶媒としてはジクロロメタン等を用いることができる。
【0068】
（特定共重合体の用途）
特定共重合体は、ＬＣＳＴを有し、かつ、クリック反応部位を有するため、例えば、水を含む液体媒体に分散した、又は、溶解したアジド基を有する化合物等と特異的かつ不可逆に結合し、複合体を形成する。この溶液をＬＣＳＴ又はそれ以上の温度に加熱すると複合体は速やかに凝集、沈殿し、液体媒体から容易に分離することができる。
例えば、アジド基を有する化合物と抗体との複合体を予め作製し、特定共重合体とのコンジュゲートを作製すれば、又は、アジド基を有する化合物と抗体と、特定共重合体とを混合してコンジュゲートを作製すれば、対応する抗原を結合させて複合化した後、ＬＣＳＴ又はそれ以上に加熱して、コンジュゲートごと抗原を回収することができる。
特定共重合体は、ＬＣＳＴを有し、かつ、クリック反応部位を有するため、例えば、水を含む液体媒体に分散した、又は、溶解したアジド基を有する化合物等と特異的かつ不可逆に結合し、複合体を形成する。この溶液をＬＣＳＴ又はそれ以上の温度に加熱すると複合体は速やかに凝集、沈殿し、液体媒体から容易に分離することができる。
例えば、アジド基を有する化合物と抗体との複合体を予め作製し、特定共重合体とのコンジュゲートを作製すれば、又は、アジド基を有する化合物と抗体と、特定共重合体とを混合してコンジュゲートを作製すれば、対応する抗原を結合させて複合化した後、ＬＣＳＴ又はそれ以上に加熱して、コンジュゲートごと抗原を回収することができる。
【0069】
［抗体－共重合体コンジュゲート］
本発明の実施形態に係る抗体－共重合体コンジュゲートは、すでに説明した共重合体と、抗体とが、以下の式６で表されるリンカーを介して結合した抗体－共重合体コンジュゲートである。
本発明の実施形態に係る抗体－共重合体コンジュゲートは、すでに説明した共重合体と、抗体とが、以下の式６で表されるリンカーを介して結合した抗体－共重合体コンジュゲートである。
【0070】
【化12】
【0071】
式６中、Ｌ６はヘテロ原子を有していてもよい２価の炭化水素基を表し、（ポリ）オキシアルキレン基（アルキレン基の炭素数は１～６個が好ましい）、及び、炭素数が１～２０個の直鎖状、分枝鎖状、又は、環状の炭化水素基等が好ましく、ポリオキシアルキレン基がより好ましい。
なお、ポリオキシアルキレン基の繰り返し数は、２～１０が好ましく、２～８がより好ましい。
なお、ポリオキシアルキレン基の繰り返し数は、２～１０が好ましく、２～８がより好ましい。
【0072】
式６で表されるリンカーは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳエステル）を有し、タンパク質の一級アミン（例えば、リジン残基）とアミド結合を形成できる。すなわち、抗体が有する－ＮＨ２と結合して複合体を形成する。一方、リンカーは、アジド基を有しており、特定共重合体が有するアルキニレン基（クリック反応部位）と結合し、トリアゾール環を形成する。
【0073】
抗体－共重合体コンジュゲートの好ましい形態としては、以下の式１で表される繰り返し単位、及び、以下の式７で表される繰り返し単位を有する抗体－共重合体コンジュゲートが挙げられる。
【0074】
【化13】
【0075】
式７中、Ｘ２は、水素原子、又は、炭素数１～６の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を表し、式２中におけるＸ２と同義であり、好適形態も同様である。
また、Ｌ２は２価の基を表し、式２中におけるＬ２と同義であり、好適形態も同様である。また、Ｌ６はヘテロ原子を有していてもよい２価の炭化水素基を表し、式６中のＬ６と同義であり、好適形態も同様である。
また、Ａｂは抗体残基を表す。すなわち、抗体の第１級アミンとリンカーのＮＨＳエステルによってアミド結合が形成され、抗体がリンカーを介して特定共重合体に固定された状態を表している。
また、Ｌ２は２価の基を表し、式２中におけるＬ２と同義であり、好適形態も同様である。また、Ｌ６はヘテロ原子を有していてもよい２価の炭化水素基を表し、式６中のＬ６と同義であり、好適形態も同様である。
また、Ａｂは抗体残基を表す。すなわち、抗体の第１級アミンとリンカーのＮＨＳエステルによってアミド結合が形成され、抗体がリンカーを介して特定共重合体に固定された状態を表している。
【0076】
なお、上記形態では、抗体と単位７とが１対１で結合しているが、抗体－共重合体コンジュゲートとしては上記形態に制限されず、抗体が有する複数の第１級アミンが、それぞれリンカーを介して特定共重合体が有するアルキニレン基と結合した状態、すなわち、抗体分子を中心とした架橋構造様のものが形成されていてもよい。
【0077】
また、抗体－共重合体コンジュゲートは、上記の繰り返し単位以外にも、式２で表される単位２を含んでいてもよい。すなわち、未反応の単位２を含んでいてもよい。一形態として、特定共重合体の分子は、抗体の分子と比較して小さいため、特定共重合体に対し、多数の抗体が結合しにくい場合もある。この場合、抗体－共重合体コンジュゲートには、未反応の単位２が残存してもよい。
【0078】
抗体と特定共重合体との比は特に制限されないが、一形態として、抗体の１モルに対して、共重合体の０．１～５０モルが好ましい。
【0079】
また、抗体－共重合体コンジュゲートは、特定共重合体が含んでもよい、他の単位（単位５）等を含んでいてもよく、各単位の含有量の好適範囲は、特定共重合体における好適範囲と同様である。
【0080】
抗体としては特に制限されず、公知の抗体を使用できるが、なかでも、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体が好ましく、例えば、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ１９）ヌクレオカプシド（タンパク）抗体、及び、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（タンパク）抗体等がより好ましい。このとき、抗体－共重合体コンジュゲート中における、抗体の含有量に対する特定共重合体の含有量のモル基準の含有量比は特に制限さないが、０．５～３０が好ましい。
【0081】
［抗原の濃縮方法］
本発明の実施形態に係る抗原の濃縮方法は、上記抗体－特定共重合体コンジュゲートと、抗原とを含有する混合液Ａを調製し、抗体－特定共重合体コンジュゲートと抗原との複合体を形成することと、混合液Ａを２０～４０℃に加熱して、上記複合体を沈殿させることと、を含む抗原の濃縮方法である。
本発明の実施形態に係る抗原の濃縮方法は、上記抗体－特定共重合体コンジュゲートと、抗原とを含有する混合液Ａを調製し、抗体－特定共重合体コンジュゲートと抗原との複合体を形成することと、混合液Ａを２０～４０℃に加熱して、上記複合体を沈殿させることと、を含む抗原の濃縮方法である。
【0082】
混合液Ａは、例えば、被験者から採取した、だ液、及び、喀痰等を必要に応じて液体媒体（例えば、リン酸緩衝食塩水等）によって希釈、又は、分散させた検体に、抗体－特定共重合体コンジュゲートを加えて調製できる。
【0083】
なお、混合液Ａは、抗体－特定共重合体コンジュゲートと、抗原とを含めばよく、予め、抗体－共重合体コンジュゲートを調製し、そこに抗原を添加してもよいし、特定共重合体、リンカー、及び、抗体を混合した溶液に、抗原を添加してもよいし、特定共重合体、リンカー、抗体、及び、抗原を一度に混合してもよい。
【0084】
検体に対する抗体－特定共重合体コンジュゲートの添加量としては特に制限されないが、添加量と濃縮率とには相関関係があり、例えば、検体中の抗原タンパク質の１ｍｇに対して、特定共重合体の添加量として０．１ｍｇ以上であることが好ましく、０．５ｍｇ以上であることがより好ましく、１．０ｍｇ以上であることが更に好ましい。上限は特に制限されないが、一般に、５．０ｍｇ以下が好ましい。
更に具体的には、検体液（例えば、唾液等を含む）の１ｍＬに対して、特定共重合体添加量として０．１～１０．０ｍｇが好ましい。
更に具体的には、検体液（例えば、唾液等を含む）の１ｍＬに対して、特定共重合体添加量として０．１～１０．０ｍｇが好ましい。
【0085】
このとき、混合液Ａに、遊離状態の特定共重合体（抗体とのコンジュゲートを形成していないもの）を更に添加してもよい。特定共重合体を添加することで、熱に対する応答をより鋭敏にし、より効率的に抗原を濃縮することができる。特定共重合体の添加量としては特に制限されないが、抗体－共重合体コンジュゲートが含有する共重合体のモル基準の含有量を１としたとき、０．１～２０倍が好ましい。
【0086】
更に、抗原の濃縮方法は、すでに説明したリンカーと、抗体とを、抗体が有するアミノ基に由来するアミド結合を介して結合させ、抗体－リンカー複合体を調製することと、抗体－リンカー複合体と、特定共重合体とを含有する混合液Ｂを調製することと、混合液Ｂ中で、抗体－リンカー複合体が有するアジド基と、共重合体が有するアルキニレン基とを反応させることで結合させ、抗体－特定共重合体コンジュゲートを生成することとを含むことが好ましい。
【0087】
本方法により濃縮できる抗原としては特に制限されず、抗体－共重合体コンジュゲートが有する抗体の種類に応じて適宜選択可能である。なかでも、抗原はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパクが好ましく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク、及び、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク等がより好ましい。
【0088】
［キット］
本発明の実施形態に係る抗体－特定共重合体コンジュゲート作成キットは、すでに説明した共重合体と、リンカーとを含む。上記キットには、特定共重合体と、リンカーとが含まれればよく、更に、溶媒等が含まれていてもよい。
また、イムノクロマト法による抗原検査キットの展開液に予め添加されていてもよい。この場合、展開液（溶液）中で、特定共重合体と、リンカーとが予め結合された状態となっていてもよい。
本発明の実施形態に係る抗体－特定共重合体コンジュゲート作成キットは、すでに説明した共重合体と、リンカーとを含む。上記キットには、特定共重合体と、リンカーとが含まれればよく、更に、溶媒等が含まれていてもよい。
また、イムノクロマト法による抗原検査キットの展開液に予め添加されていてもよい。この場合、展開液（溶液）中で、特定共重合体と、リンカーとが予め結合された状態となっていてもよい。
【0089】
［抗原検査キット］
本発明の実施形態に係る抗原検査キットは、すでに説明した特定共重合体と、リンカーとを含む抗原検査キットである。本抗原検査キットには、上記以外に、公知の抗原検査デバイスが含まれていてもよい。
抗原検査デバイスの具体的な構成は特に制限されないが、免疫学的手法による検査に用いるものであることが好ましい。例えば、イムノクロマト法による検査に一般的に使用される試験片であってもよく、その他の構成を有するデバイスであってもよい。
本発明の実施形態に係る抗原検査キットは、すでに説明した特定共重合体と、リンカーとを含む抗原検査キットである。本抗原検査キットには、上記以外に、公知の抗原検査デバイスが含まれていてもよい。
抗原検査デバイスの具体的な構成は特に制限されないが、免疫学的手法による検査に用いるものであることが好ましい。例えば、イムノクロマト法による検査に一般的に使用される試験片であってもよく、その他の構成を有するデバイスであってもよい。
【0090】
抗原検査キットの具体的な構成は、特に制限されない。例えば、特定共重合体と、リンカーと、抗原検査デバイスとが分離した状態であっても、特定共重合体と、リンカーと、抗原検査デバイスとが一体化した状態であってもよい。
【実施例】
【0091】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0092】
［ＨＩＰＡＡｍの合成］
ＨＩＰＡＡｍ（Ｈｙｄｒｏｘｙ ＩｓｏＰｒｏｐｙｌ ＡｃｒｙｌＡｍｉｄｅ）は、以下の手順に従って合成した。Ｄ，Ｌ－２－アミノ－１－プロパノール（０．１５ｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．１５ｍｏｌ）とを無水クロロホルムによく溶かし、５℃で２０分間撹拌した後、塩化アクリロイル（０．１５ｍｏｌ）をゆっくりと加え、５℃で２時間撹拌した。
ＨＩＰＡＡｍ（Ｈｙｄｒｏｘｙ ＩｓｏＰｒｏｐｙｌ ＡｃｒｙｌＡｍｉｄｅ）は、以下の手順に従って合成した。Ｄ，Ｌ－２－アミノ－１－プロパノール（０．１５ｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．１５ｍｏｌ）とを無水クロロホルムによく溶かし、５℃で２０分間撹拌した後、塩化アクリロイル（０．１５ｍｏｌ）をゆっくりと加え、５℃で２時間撹拌した。
【0093】
溶媒を蒸発させた後、２－プロパノールに再溶解し、－２０℃で２４時間以上保持した。最後にろ過して塩類を除去し、カラムクロマトグラフィーで濃縮、精製した。ＨＩＰＡＡｍが合成されたことは、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）と１Ｈ ＮＭＲ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）（溶媒はＤ２Ｏ）で確認した。
【0094】
【化14】
【0095】
［Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ）の合成］
Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ）は、下記スキームに示すようにＨＩＰＡＡｍとＮＩＰＡＡｍとのＲＡＦＴ重合により合成した。ＮＩＰＡＡｍ １．８９ｇ、ＨＩＰＡＡｍ ０．１１ｇ、ＡＩＢＮ １．３１ｍｇ、ＣＤＴ（Ｃｙａｎｏｍｅｔｈｙｌ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｔｒｉｔｈｉｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）１２．７ｍｇ、及び、エタノール １７．６ｍｌを含む溶液を２０℃で２０時間攪拌し、蒸発させて真空乾燥した。
Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ）は、下記スキームに示すようにＨＩＰＡＡｍとＮＩＰＡＡｍとのＲＡＦＴ重合により合成した。ＮＩＰＡＡｍ １．８９ｇ、ＨＩＰＡＡｍ ０．１１ｇ、ＡＩＢＮ １．３１ｍｇ、ＣＤＴ（Ｃｙａｎｏｍｅｔｈｙｌ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｔｒｉｔｈｉｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）１２．７ｍｇ、及び、エタノール １７．６ｍｌを含む溶液を２０℃で２０時間攪拌し、蒸発させて真空乾燥した。
【0096】
【化15】
【0097】
［Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＳＡＫＩＰＡＡｍ）の合成］
下記スキームのとおり、アルキニレン基を持つジベンジルシクロオクチン酸（ＤＢＣＯ）をＨＩＰＡＡｍのヒドロキシ基に脱水縮合で導入し、クリッカブル応答性ポリマーＰ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＳＡＫＩＰＡＡｍ）を得た。
ＤＣＭ（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）３０ｍｌ、ＤＢＣＯ酸３５．８ｍｇ、ＤＭＡＰ（４－Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）１２ｍｇ、Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ）１００ｍｇ、ＤＣＣ（Ｎ′，Ｎ′－Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）２０ｍｇを含む溶液を一晩攪拌し、蒸発させて真空乾燥させた。なお、この得られたＰ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＳＡＫＩＰＡＡｍ）を以下では「共重合体（Ｉ）」ともいう。
下記スキームのとおり、アルキニレン基を持つジベンジルシクロオクチン酸（ＤＢＣＯ）をＨＩＰＡＡｍのヒドロキシ基に脱水縮合で導入し、クリッカブル応答性ポリマーＰ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＳＡＫＩＰＡＡｍ）を得た。
ＤＣＭ（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）３０ｍｌ、ＤＢＣＯ酸３５．８ｍｇ、ＤＭＡＰ（４－Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）１２ｍｇ、Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ）１００ｍｇ、ＤＣＣ（Ｎ′，Ｎ′－Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）２０ｍｇを含む溶液を一晩攪拌し、蒸発させて真空乾燥させた。なお、この得られたＰ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＳＡＫＩＰＡＡｍ）を以下では「共重合体（Ｉ）」ともいう。
【0098】
【化16】
【0099】
［ポリマー合成の評価］
Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ）、及び、共重合体（Ｉ）は、いずれも、その構造を１Ｈ ＮＭＲ（溶媒：Ｄ２Ｏ、ＤＭＳＯ）、分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）（溶媒：ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、標準物質：ポリスチレン）で確認した。また、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ：Ｌｏｗｅｒ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）は、溶媒をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ：７．４、濃度：２．０ｍｇ／ｍＬ、温度：１０～４０℃）として確認した。
Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ）、及び、共重合体（Ｉ）は、いずれも、その構造を１Ｈ ＮＭＲ（溶媒：Ｄ２Ｏ、ＤＭＳＯ）、分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）（溶媒：ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、標準物質：ポリスチレン）で確認した。また、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ：Ｌｏｗｅｒ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）は、溶媒をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ：７．４、濃度：２．０ｍｇ／ｍＬ、温度：１０～４０℃）として確認した。
【0100】
［抗体へのアジド基の導入］
アジド－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル（Ａｚｉｄｏ－ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ （ＥＧ４）－ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ、東京化成工業）粉末をＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、炭酸緩衝液（ＰＨ８．６）を用いて、異なる濃度のアジド－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステルを調製した。アジド－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステルを異なる供給比率で抗体（ａｎｔｉ－ＣＯＶＩＤ－１９ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、＞９５％、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ製、ａｎｔｉ－ＣＯＶＩＤ－１９ ａｎｔｉｂｏｄｙ ：： ａｎｔｉ－Ｖｉｒａｌ ＣＯＶＩＤ １９ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ （ＮＰ） Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）に添加した後、下記式に示すように、４℃で５時間攪拌し、抗体にアジド基を導入した。
アジド－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル（Ａｚｉｄｏ－ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ （ＥＧ４）－ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ、東京化成工業）粉末をＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、炭酸緩衝液（ＰＨ８．６）を用いて、異なる濃度のアジド－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステルを調製した。アジド－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステルを異なる供給比率で抗体（ａｎｔｉ－ＣＯＶＩＤ－１９ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、＞９５％、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ製、ａｎｔｉ－ＣＯＶＩＤ－１９ ａｎｔｉｂｏｄｙ ：： ａｎｔｉ－Ｖｉｒａｌ ＣＯＶＩＤ １９ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ （ＮＰ） Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）に添加した後、下記式に示すように、４℃で５時間攪拌し、抗体にアジド基を導入した。
【0101】
【化17】
【0102】
抗体にアジド基を導入した後、「Ｉｎｆｉｎｉｔｅ」２００ ＰＲＯプレートリーダーを用いて、以下のように抗体試料の蛍光を測定した。アジド修飾抗体サンプルを０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、異なる濃度のＤＬ－２－アミノ酪酸（５０μＬ／ウェル、標準物質）を加えた９６マイクロウェルプレートに塗布した後、各ウェルに５μＬのフルオレスカミン（５０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、暗所で１５分間インキュベートして蛍光を測定した（３９５ｎｍ／４９５ｎｍ）。
【0103】
［クリック反応によるＣＯＶＩＤ－１９抗体－温度応答性共重合体コンジュゲートの作製］
クリックケミストリーを用いて、以下のようにアジド修飾抗体をアルキニレン基修飾温度応答性共重合体にコンジュゲートさせた。７５μｌの共重合体（Ｉ）を５０μｌのアジド修飾抗ＣＯＶＩＤ １９抗体（ＰＢＳで２．５ｍｇ／ｍＬ）と混合し、下記式に示すように４℃で１２時間撹拌した。
クリックケミストリーを用いて、以下のようにアジド修飾抗体をアルキニレン基修飾温度応答性共重合体にコンジュゲートさせた。７５μｌの共重合体（Ｉ）を５０μｌのアジド修飾抗ＣＯＶＩＤ １９抗体（ＰＢＳで２．５ｍｇ／ｍＬ）と混合し、下記式に示すように４℃で１２時間撹拌した。
【0104】
共重合体（Ｉ）の濃度は、抗体と共重合体（Ｉ）の比率が１：１、１：２、１：４、１：８、１：１５、１：３０（いずれもモル基準）になるように調整した。成功したコンジュゲートは、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により、抗体と共重合体（Ｉ）それぞれを単独で使用した場合と比較して、その特徴を明らかにした。
【0105】
【化18】
【0106】
［ＣＯＶＩＤ－１９抗体－温度応答性共重合体の濃縮効果の評価］
先に調製したＣＯＶＩＤ－１９抗体－共重合体コンジュゲート（１：１）の濃縮効果を熱沈殿法で評価した。精製したＣＯＶＩＤ－１９－共重合体コンジュゲート（１．３ｍｇ／ｍＬの濃度で１００μＬのＰＢＳ溶液で１５当量の遊離状態の特定共重合体を含む。）をマイクロチューブに加え、３７℃で５分間遠心分離（１３０００×ｇ）した。その後、上澄み液（９０μＬ）と沈殿物（１０μＬ）を回収し、２８０ｎｍの吸光度を紫外可視吸光光度計で測定した。液相と固相とにおけるＣＯＶＩＤ－１９抗体のモル基準の比を推定し、濃縮率を算出した。
先に調製したＣＯＶＩＤ－１９抗体－共重合体コンジュゲート（１：１）の濃縮効果を熱沈殿法で評価した。精製したＣＯＶＩＤ－１９－共重合体コンジュゲート（１．３ｍｇ／ｍＬの濃度で１００μＬのＰＢＳ溶液で１５当量の遊離状態の特定共重合体を含む。）をマイクロチューブに加え、３７℃で５分間遠心分離（１３０００×ｇ）した。その後、上澄み液（９０μＬ）と沈殿物（１０μＬ）を回収し、２８０ｎｍの吸光度を紫外可視吸光光度計で測定した。液相と固相とにおけるＣＯＶＩＤ－１９抗体のモル基準の比を推定し、濃縮率を算出した。
【0107】
［ＣＯＶＩＤ－１９抗体－温度応答性共重合体の抗原濃縮効果の評価］
精製したＣＯＶＩＤ－１９抗体－共重合体コンジュゲート（１．３、０．７、０．３５、０．１７、０．０８、０ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ ＰＢＳ、１５当量の共重合体（Ｉ）単体を含む）に対して、ＣＯＶＩＤ－１９組換えタンパク質（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ製）の濃縮能力を評価した。
精製したＣＯＶＩＤ－１９抗体－共重合体コンジュゲート（１．３、０．７、０．３５、０．１７、０．０８、０ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ ＰＢＳ、１５当量の共重合体（Ｉ）単体を含む）に対して、ＣＯＶＩＤ－１９組換えタンパク質（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ製）の濃縮能力を評価した。
【0108】
ＣＯＶＩＤ－１９抗体－共重合体コンジュゲート（異なる濃度、５０μＬ ＰＢＳ）をＣＯＶＩＤ－１９組換えタンパク質（１．０ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ ＰＢＳ）と混合し、１時間インキュベートした後、溶液に遊離ポリマーを加え、マイクロチューブ中で３７℃、１３０００×ｇ、５分間遠心分離した。
上澄み液（９０μＬ）と沈殿物（１０μＬ）を回収し、上澄み液中のＣＯＶＩＤ－１９組換えタンパク質を、メーカーの指示に従ってｍｏｄｉｆｉｅｄ ｌｏｗｅｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて測定し、最後に濃縮率を算出した。
上澄み液（９０μＬ）と沈殿物（１０μＬ）を回収し、上澄み液中のＣＯＶＩＤ－１９組換えタンパク質を、メーカーの指示に従ってｍｏｄｉｆｉｅｄ ｌｏｗｅｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて測定し、最後に濃縮率を算出した。
【0109】
［ラテラルフローイムノアッセイストリップを用いたＣＯＶＩＤ－１９抗体－温度応答性共重合体抗原濃縮効果の評価］
ＣＯＶＩＤ－１９組換えタンパク質の異なる濃度（５０～１０００ｐｇ／ｍＬ、２０μＬ ＰＢＳ）を、ラテラルフローイムノアッセイストリップを用いて試験した。ＣＯＶＩＤ－１９組換えタンパク質（５０、１００ｐｇ／ｍＬ、１００μＬ ＰＢＳ）を、ＣＯＶＩＤ－１９抗体－特定共重合体コンジュゲート（１．３ｍｇ／ｍＬ、１００ μＬ ＰＢＳ）と混合し、１時間インキュベートした後、１５当量の遊離ポリマー［共重合体（Ｉ）］を添加し、マイクロチューブで３７℃、１３０００×ｇ、５分間遠心分離した。
上澄み液（１８０μＬ）と沈殿物（２０μＬ）を回収し、濃縮された部分をＬＦＩＡで測定した。
ＣＯＶＩＤ－１９組換えタンパク質の異なる濃度（５０～１０００ｐｇ／ｍＬ、２０μＬ ＰＢＳ）を、ラテラルフローイムノアッセイストリップを用いて試験した。ＣＯＶＩＤ－１９組換えタンパク質（５０、１００ｐｇ／ｍＬ、１００μＬ ＰＢＳ）を、ＣＯＶＩＤ－１９抗体－特定共重合体コンジュゲート（１．３ｍｇ／ｍＬ、１００ μＬ ＰＢＳ）と混合し、１時間インキュベートした後、１５当量の遊離ポリマー［共重合体（Ｉ）］を添加し、マイクロチューブで３７℃、１３０００×ｇ、５分間遠心分離した。
上澄み液（１８０μＬ）と沈殿物（２０μＬ）を回収し、濃縮された部分をＬＦＩＡで測定した。
【0110】
［結果］
（ＨＩＰＡＡｍ合成の確認）
ＨＩＰＡＡｍモノマーの精製は、ＴＬＣ分析により確認した。図１中の画像中に記載された「（１）」は、ＨＩＰＡＡｍ標準試料、「（２）」は合成した試料のカラム精製前と精製後である。（固定相：シリカゲルプレート、移動相：酢酸エチル、可視化剤：ＫＭｎＯ４溶液）
（ＨＩＰＡＡｍ合成の確認）
ＨＩＰＡＡｍモノマーの精製は、ＴＬＣ分析により確認した。図１中の画像中に記載された「（１）」は、ＨＩＰＡＡｍ標準試料、「（２）」は合成した試料のカラム精製前と精製後である。（固定相：シリカゲルプレート、移動相：酢酸エチル、可視化剤：ＫＭｎＯ４溶液）
【0111】
図１によると、ＨＩＰＡＡｍは２つの主要な二次生成物を伴って成功裏に調製された。図１に示すように、ＨＩＰＡＡｍの精製にはカラムクロマトグラフィーを使用し、最後に１Ｈ ＮＭＲの結果を用いてＨＩＰＡＡｍの合成を確認した（図２）。
【0112】
（Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ）、及び、共重合体（Ｉ）の確認と特性評価）
１Ｈ ＮＭＲ解析の結、ＨＩＰＡＡｍとＮＩＰＡＡｍを３．６：９６．４（モル基準）の割合で重合し、３２℃程度で知られているＰ（ＮＩＰＡＡｍ）のＬＣＳＴをＨＩＰＡＡｍの水酸基導入により３７．４℃まで上昇させることに成功したこと、また、ひずみを持ったアルキンであるＳＡＫ基を結合させ、９６．４：１．２：２．４（モル基準）の割合で温度応答性共重合体（Ｉ）を形成したことを確認した（図３、４）。
１Ｈ ＮＭＲ解析の結、ＨＩＰＡＡｍとＮＩＰＡＡｍを３．６：９６．４（モル基準）の割合で重合し、３２℃程度で知られているＰ（ＮＩＰＡＡｍ）のＬＣＳＴをＨＩＰＡＡｍの水酸基導入により３７．４℃まで上昇させることに成功したこと、また、ひずみを持ったアルキンであるＳＡＫ基を結合させ、９６．４：１．２：２．４（モル基準）の割合で温度応答性共重合体（Ｉ）を形成したことを確認した（図３、４）。
【0113】
また、分子量については、ＧＰＣ分析の結果、図３～７及び、表１、に示すように、ＳＡＫ基の挿入により、合成したポリマーの分子量が１．９０４×１０４から２．０１４×１０４に変化したことがわかった。
【0114】
また、図５は、Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ）の、図６は共重合体（Ｉ）の、図７は、抗体－共重合体（Ｉ）コンジュゲートのＬＣＳＴの測定結果である。なお、測定は溶媒をＰＢＳ（ｐＨ７．４）とし、共重合体濃度を２．０ｍｇ／ｍＬとし、加熱速度を０．２℃／分とし、波長４５０ｎｍで測定した。ＬＣＳＴは、光透過度が５０％となったときの温度と定義した。ここから、ＬＣＳＴがＰ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ）の３７．４℃から共重合体（Ｉ）の３０．１℃に変化したことがわかった。
【0115】
【表1】
【0116】
（アジド－ＣＯＶＩＤ－１９抗体の合成）
ＣＯＶＩＤ－１９抗体へのアジド基の導入は、抗体のリジン残基（ε－アミノ基）にアジド－（ＥＧ）４－ＮＨＳを結合させることで行った。アジド（ＥＧ）４－ＮＨＳの確認と定量は、蛍光還元法を用いて行った。アジド（ＥＧ）４－ＮＨＳの添加量を増やすと、アジド基の結合量は図８のように徐々に増加し（０、６．７、１０．７、２０．９ｍｏｌ／ｍｏｌ）、アミン基の結合量は以下のように徐々に減少した（２１．１、１４．７、１０．７、０．２ｍｏｌ／ｍｏｌ）。ｐ－ｖａｌｕｅ＜０．０００１。
ＣＯＶＩＤ－１９抗体へのアジド基の導入は、抗体のリジン残基（ε－アミノ基）にアジド－（ＥＧ）４－ＮＨＳを結合させることで行った。アジド（ＥＧ）４－ＮＨＳの確認と定量は、蛍光還元法を用いて行った。アジド（ＥＧ）４－ＮＨＳの添加量を増やすと、アジド基の結合量は図８のように徐々に増加し（０、６．７、１０．７、２０．９ｍｏｌ／ｍｏｌ）、アミン基の結合量は以下のように徐々に減少した（２１．１、１４．７、１０．７、０．２ｍｏｌ／ｍｏｌ）。ｐ－ｖａｌｕｅ＜０．０００１。
【0117】
なお、抗体として、ａｎｔｉ－ＣＯＶＩＤ－１９ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（＞９５％、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ製、ａｎｔｉ－ＣＯＶＩＤ－１９ ａｎｔｉｂｏｄｙ ：： ａｎｔｉ－Ｖｉｒａｌ ＣＯＶＩＤ １９ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ （ＮＰ） Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）に代えて、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｓ１－ＮＴＤ） Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＃５６９９６」（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用したこと以外は同様にして、アジド－ＣＯＶＩＤ－１９抗体の合成を試みたところ、同様に、合成に成功した。図１４は、その結果であり、アジド（ＥＧ）４－ＮＨＳの添加量を増やすと、アジド基の結合量は徐々に増加し、アミン基の結合量は徐々に減少した。
【0118】
（クリック反応により合成されたＡｎｔｉ－ＣＯＶＩＤ－１９共重合体（Ｉ）コンジュゲートの確認）
図９は、ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）による、ＣＯＶＩＤ－１９抗体－共重合体（Ｉ）のコンジュゲートのゲル像である。
図９は、ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）による、ＣＯＶＩＤ－１９抗体－共重合体（Ｉ）のコンジュゲートのゲル像である。
【0119】
ここで、（１）と（１１）は、ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｄｄｅｒであり、（２）は抗体：共重合体（Ｉ）の１：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、（３）は１：２、（４）は１：４、（５）は１：８、（６）は１：１５、（７）は１：３０、（８）は共重合体（Ｉ）のそのもの、（９）はアジド－抗体であり、（１０）は抗体である。
【0120】
ＣＯＶＩＤ－１９抗体と共重合体（Ｉ）の比率を１：１、１：２、１：４、１：８、１：１５、１：３０（レーン２～７）と変えて調べたところ、反応液中の共重合体の量を増やすと抗体との結合が増え、最終的にバンドの幅が広がり、コンジュゲートの分子量も増加した。
これらの結果は、ＣＯＶＩＤ－１９抗体－特定共重合体コンジュゲートの合成に成功したことを示している。
これらの結果は、ＣＯＶＩＤ－１９抗体－特定共重合体コンジュゲートの合成に成功したことを示している。
【0121】
（ＣＯＶＩＤ－１９抗体－温度応答性共重合体の濃縮効果評価）
ＣＯＶＩＤ－１９抗体－温度応答性共重合体は、コントロールと比較して、熱析出を行った後、非常に有意な濃縮能を示した（ｐ＝０．０００６）。
ＣＯＶＩＤ－１９抗体－温度応答性共重合体は、コントロールと比較して、熱析出を行った後、非常に有意な濃縮能を示した（ｐ＝０．０００６）。
【0122】
（ＣＯＶＩＤ－１９抗体－温度応答性共重合体を用いた抗原濃縮）
図１０に示すように、ＣＯＶＩＤ－１９抗体－共重合体コンジュゲートの濃度を上げると、ＣＯＶＩＤ－１９リコンビナントタンパク質のフォールド数が０から最高濃度のコンジュゲート（１．３ｍｇ／ｍＬ）では元の抗原濃度の約６倍にまでシフトし、開発したシステムが低ウィルス量のサンプルを濃縮する能力があることを示している（ｐ＜０．０５）。なお、図１０の横軸の単位は、ｍｇ／ｍＬである。
図１０に示すように、ＣＯＶＩＤ－１９抗体－共重合体コンジュゲートの濃度を上げると、ＣＯＶＩＤ－１９リコンビナントタンパク質のフォールド数が０から最高濃度のコンジュゲート（１．３ｍｇ／ｍＬ）では元の抗原濃度の約６倍にまでシフトし、開発したシステムが低ウィルス量のサンプルを濃縮する能力があることを示している（ｐ＜０．０５）。なお、図１０の横軸の単位は、ｍｇ／ｍＬである。
【0123】
（ラテラルフローイムノアッセイストリップを用いた抗原の濃縮性の評価）
図１１に示すように、ＬＦＩＡを用いたＣＯＶＩＤ－１９組換えタンパク質の最小検出限界は約５０ｐｇ／ｍＬ（ａ５）であり、また、１００ｐｇ／ｍＬ（ａ４）ではテストゾーンに弱い微弱なバンドを示したが、図１１（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）に示すように、２００～１０００ｐｇ／ｍＬの濃度ではそれぞれ強い陽性バンドを示した。
図１１に示すように、ＬＦＩＡを用いたＣＯＶＩＤ－１９組換えタンパク質の最小検出限界は約５０ｐｇ／ｍＬ（ａ５）であり、また、１００ｐｇ／ｍＬ（ａ４）ではテストゾーンに弱い微弱なバンドを示したが、図１１（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）に示すように、２００～１０００ｐｇ／ｍＬの濃度ではそれぞれ強い陽性バンドを示した。
【0124】
図１２は濃縮前後の比較であり、（ｂ１）濃縮なしで５０ｐｇ／ｍＬ、（ｂ２）濃縮後で５０ｐｇ／ｍＬ、（ｂ３）濃縮なしで１００ｐｇ／ｍＬ、（ｂ４）濃縮後で１００ｐｇ／ｍＬである。ＣＯＶＩＤ－１９抗体－共重合体コンジュゲートを用いて濃縮すると、強い陽性バンド（図中の三角形で指示される部分）を示すことがわかった。
【0125】
［Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＳＡＫＩＰＡＡｍ）の合成２］
Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＳＡＫＩＰＡＡｍ）の合成において、ＮＩＰＡＡｍの添加量を１．８９ｇから１．６ｇとし、ＨＩＰＡＡｍの添加量を０．１ｇから０．００３４ｇに変更した以外には上記と同様にして、Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＳＡＫＩＰＡＡｍ）を合成した。以下では、合成した共重合体を「共重合体（ＩＩ）」という。
共重合体（ＩＩ）の分子量は１．８２×１０４で、全繰り返し単位を１００モル％としたときのＳＡＫＩＰＡＡｍの導入量は１４モル％であった。
Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＳＡＫＩＰＡＡｍ）の合成において、ＮＩＰＡＡｍの添加量を１．８９ｇから１．６ｇとし、ＨＩＰＡＡｍの添加量を０．１ｇから０．００３４ｇに変更した以外には上記と同様にして、Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＳＡＫＩＰＡＡｍ）を合成した。以下では、合成した共重合体を「共重合体（ＩＩ）」という。
共重合体（ＩＩ）の分子量は１．８２×１０４で、全繰り返し単位を１００モル％としたときのＳＡＫＩＰＡＡｍの導入量は１４モル％であった。
【0126】
【表2】
【0127】
図１３は、合成した共重合体（ＩＩ）のＬＣＳＴの測定結果である。図１３から、ＬＣＳＴが２９．１℃であることがわかった。
上記の結果から、全繰り返し単位を１００モル％としたとき、クリック反応部位を有するＳＡＫＩＰＡＡｍ単位（一般式２で表される単位に該当する）の含有量が５～３０モル％以下である共重合体（ＩＩ）は、共重合体（Ｉ）と比較して、より低温で抗原濃縮が行えることがわかった。
上記の結果から、全繰り返し単位を１００モル％としたとき、クリック反応部位を有するＳＡＫＩＰＡＡｍ単位（一般式２で表される単位に該当する）の含有量が５～３０モル％以下である共重合体（ＩＩ）は、共重合体（Ｉ）と比較して、より低温で抗原濃縮が行えることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【0128】
これまでに示したとおり、本共重合体は、検体中の対象物（抗原等）が少ないことに起因して起こる偽陽性率を劇的に低下させることができ、検査の精度を高めることができる。特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を固定した抗体－共重合体コンジュゲートを用いれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検査精度を劇的に高めることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】