特許 7580829 坑菌、抗真菌、抗炎活性及び歯牙齲蝕抑制活性を有する新規なストレプトコッカスサリバリウス菌株ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ及びこれを含む口腔用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-01

(45)【発行日】2024-11-12

(54)【発明の名称】坑菌、抗真菌、抗炎活性及び歯牙齲蝕抑制活性を有する新規なストレプトコッカスサリバリウス菌株ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ及びこれを含む口腔用組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20241105BHJP

   A23L 33/135 20160101ALI20241105BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20241105BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20241105BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20241105BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20241105BHJP

   A61K 35/744 20150101ALI20241105BHJP

   A61Q 11/00 20060101ALI20241105BHJP

   A61K 8/99 20170101ALI20241105BHJP

   C12R 1/46 20060101ALN20241105BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 E ZNA

A23L33/135

A61P31/10

A61P31/04

A61P1/02

A61K35/74 A

A61K35/74 G

A61K35/744

A61Q11/00

A61K8/99

C12R1:46

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2023118547

(22)【出願日】2023-07-20

(65)【公開番号】P2024137598

(43)【公開日】2024-10-07

【審査請求日】2023-07-20

(31)【優先権主張番号】10-2023-0038272

(32)【優先日】2023-03-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和４年１２月２３日にＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｋｏｒｅａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｏｒａｌ Ｈｅａｌｔｈ， ２０２２， ４６（４）： １－５において論文発表

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM13161P

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】523275983

【氏名又は名称】グリーンストア インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100130111

【弁理士】

【氏名又は名称】新保 斉

(72)【発明者】

【氏名】パク、ヨン チャン

(72)【発明者】

【氏名】パン、チェ ヨン

(72)【発明者】

【氏名】イ、ソン フン

(72)【発明者】

【氏名】ペク、ドン ホン

【審査官】市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】特表２００５－５１７４３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】Accession: FJ154800, Definition: Streptococcus salivarius strain CCUG 25922 16S ribosomal RNA gene, partial，[online], 掲載日: 2009.11.24, 検索日: 2024.4.16, Database: GenBank , <URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FJ154800.1/>

【文献】Appl. Environ. Microbiol.，2012年，Vol. 78, No. 7，pp.2190-2199

【文献】Clin. Exp. Dent. Res.，2020年，Vol. 6，pp.207-214

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ストレプトコッカスサリバリウスＧ７、寄託番号：ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７、寄託番号：ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）菌株を含む口腔細菌抑制用坑菌組成物であって、
前記坑菌の坑菌活性は、アグリゲイティバクターアクチノミセスコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、アクチノミセスイスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）、アクチノミセスネスランディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）、エンテロコッカスフェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、フソバクテリウムヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ポルフィロモナスジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラインターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ，Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、プレボテラニグレセンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）、アクチノミセスビスコーサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、及び黄色ブドウ状球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）からなる群から選ばれる１以上に対する坑菌活性を有する
ことを特徴とする菌株。

【請求項2】

ストレプトコッカスサリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７，ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）菌株又はその培養物を含む
ことを特徴とする口腔カンジダ症の治療又は改善用薬学組成物。

【請求項3】

前記口腔カンジダ症の治療又は改善用薬学組成物は、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）に対する抗真菌活性を有するものである
請求項２に記載の口腔カンジダ症の治療又は改善用薬学組成物。

【請求項4】

ストレプトコッカスサリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７，ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）菌株又はその培養物を含む
ことを特徴とする口臭抑制用組成物。

【請求項5】

口臭抑制は、硫化水素（Ｈ _２ Ｓ）及び硫化メチル（ＣＨ _３ ＳＨ）の濃度を抑制することによって行われる
請求項４に記載の口臭抑制用組成物。

【請求項6】

前記口臭抑制用組成物は、歯磨き粉、うがい製品、ガム、あめ類、カラメル類、ジェリー類、口腔スプレー、口腔用軟膏、口腔洗浄剤、口腔清浄剤及び歯牙美白剤からなる群から選ばれる一つに製品化されるものである
請求項４に記載の口臭抑制用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、坑菌、抗真菌、抗炎活性及び歯牙齲蝕抑制活性を有する新規なストレプトコッカスサリバリウス菌株及びこれを含む口腔用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

口腔内感染性疾患は、歯肉（歯茎、ｇｉｎｇｉｖａｌ）と歯牙（歯、ｄｅｎｔａｌ）性疾患とに区別でき、このような感染性疾患は、多種の細菌で形成されたバイオフィルム（ｂｉｏｆｉｌｍ）と関連がある。健康な人にとって、バイオフィルムは、共生バクテリアの比率が高い多種細菌によってバランスして形成される。しかし、このようなバランスが崩れて特定細菌が増殖してしまうと、これは口腔疾患につながる。

【0003】

アクチノミセスイスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）とアクチノミセスネスランディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）は代表的な歯肉炎原因菌であり、ストレプトコッカスミュータンス（虫歯菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）とストレプトコッカスソブリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）は、歯牙齲蝕性細菌として知られている（Ｈｏｗｅｌｌ Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９６２；Ｌｏｅｓｃｈｅ ＷＪ．ｅｔ ａｌ．，１９７８）。それらの細菌は、酸生成能（ａｃｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）と酸耐性能（ａｃｉｄｕｒｉｃｉｔｙ）の特徴を有しており、歯牙齲蝕症を誘発する（Ｃｏｎｒａｄｓ Ｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。また、エンテロコッカスフェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）は、ヒト腸内球菌の優勢種で、抗生剤耐性特性によって根管感染、歯周炎、インプラント周囲炎などの口腔疾患に関与する（Ｄａｈｌｅｎ Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｒａｍｓ ＴＥ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３）。（非特許文献１－５）

【0004】

一方、一部の菌株は口腔内使用を目的とするプロバイオティクスとして利用可能である（Ｌｉ Ｘ．，２０２１；Ｈａｌｅ ＪＤＦ．，ｅｔ ａｌ．，２０２２）。このような細菌は、細菌間の生息場所を競う過程でバクテリオシン（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ）を生産して周辺の細菌を抑制する。ストレプトコッカスサリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）もバクテリオシンと類似なｓａｌｉｖａｒｉｃｉｎ Ａ、ｓａｌｉｖａｒｉｃｉｎ Ｂ、ｓａｌｉｖａｒｉｃｉｎ ９及びｓａｌｉｖａｒｉｃｉｎ Ｇ３２１６－１８のような種々のランチビオティクス（ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）を生産する（Ｗｅｓｃｏｍｂｅ ＰＡ．，ｅｔ ａｌ．，２００６）。ストレプトコッカスサリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）は、グラム陽性通性嫌気性細菌で、人の粘膜表面に生息する共生細菌として活動しながら（Ａａｓ ＪＡ．，ｅｔ ａｌ．，２００５）病源体に対する障壁を形成し、付着及び集落を減少させる重要な生態学的役割を担い（Ｗｅｓｃｏｍｂｅ ＰＡ．，ｅｔ ａｌ．，２００６）、よって、口腔用プロバイオティクス使用可能性は着実に提起されている。（非特許文献６－１０）

【0005】

また、近年、様々な研究論文から、口腔内存在している有害菌が全身疾患（ループス、全身硬化症、炎症性腸疾患、認知症など）に悪影響を及ぼすという結果が発表されており、口腔内微生物バランスを維持することが、歯牙健康の他に全身健康にも影響を及ぼし得るという概念に拡張されている。

【0006】

全身疾患は、一般に、人体に正常細菌叢のバランス崩壊又は外部微生物の侵入及び増殖によって発生するものと知られている。したがって、微生物の生長を抑制する抗生剤を使用するよりは、坑菌効果を有しながらも微生物生態系を保持させ得る口腔用プロバイオティクスを用いる方が、国民健康を増進させることに役立ち得る。

【0007】

このため、広い坑菌活性を有する口腔用プロバイオティクスの開発が至急な実情である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【文献】韓国公開特許第１０－２０２２－０１３９２８０号、新規ラクトバチルスプランタルム菌株を含む口腔用組成物、２０２２年１０月１４日。公開。

【文献】韓国登録特許第２０２２年１０月１４日号、人体口腔由来ラクトバチルスファーメンタムＯＫ菌株を含む口臭又は虫歯改善、予防又は治療用組成物、２０２０年１２月２９日。登録。

【文献】韓国公開特許第１０－２０２３－００１７３７２号、スーパーオキシドディスムターゼ及び／又はバチルス菌株胞子を含む組成物及びその口腔健康改善用用途、２０２３年０２月０３日。公開。

【文献】韓国登録特許第２０２３年０２月０３日号、人体口腔由来ラクトバチルスガセリＨＨｕＭＩＮ Ｄを含む口臭又は虫歯改善、予防又は治療用組成物、２０２０年１２月２９日。登録。

【非特許文献】

【0009】

【文献】Ｈｏｗｅｌｌ Ａ，Ｓｔｅｐｈａｎ ＲＭ，Ｐａｕｌ Ｆ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ Ａｃｔｉｎ－ｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ，Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｎｅｍａ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ，ａｎｄ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｉｎ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｒｅａｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ａｎｄ ｓａｌｉｖａ．Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ １９６２；４１：１０５０－１０５９．

【文献】Ｌｏｅｓｃｈｅ ＷＪ，Ｓｙｅｄ ＳＡ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｉｎｇｉｖｉｔｉｓ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｌａｑｕｅ ａｎｄ ｇｉｎｇｉｖｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ１９７８；２１：８３０－８３９．

【文献】Ｃｏｎｒａｄｓ Ｇ，ｄｅ Ｓｏｅｔ ＪＪ，Ｓｏｎｇ Ｌ，Ｈｅｎｎｅ Ｋ，Ｓｚｔａｊｅｒ Ｈ，Ｗａｇｎｅｒ－Ｄｏｂｌｅｒ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃａｒｉｏｇｅｎｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ ａｎｄ Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ｏｎ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｌｅｖｅｌ．Ｊ Ｏｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１４；６：２６１８９．

【文献】Ｄａｈｌｅｎ Ｇ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ．Ａｄｖ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ １９９３；７：１６３－１７４．

【文献】Ｒａｍｓ ＴＥ，Ｆｅｉｋ Ｄ，Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ ＪＥ，Ｄｅｇｅｎｅｒ ＪＥ，Ｗｉｎｋｅｌｈｏｆｆ ＡＪ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ．Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ ２０１３；８４：１０２６－１０３３．

【文献】Ａａｓ ＪＡ，Ｐａｓｔｅｒ ＢＪ，Ｓｔｏｋｅｓ ＬＮ，Ｏｌｓｅｎ Ｉ，Ｄｅｗｈｉｒｓｔ ＦＥ．Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｌｏｒａ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００５；４３：５７２１－５７３２．

【文献】Ｗｅｓｃｏｍｂｅ ＰＡ，Ｂｕｒｔｏｎ ＪＰ，Ｃａｄｉｅｕｘ ＰＡ，Ｋｌｅｓｓｅ ＮＡ，Ｈｙｉｎｋ Ｏ，Ｈｅｎｇ ＮＣ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｇａｐｌａｓｍｉｄｓ ｅｎｃｏｄｅ ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ．Ａｎｔｏｎｉｅ Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ ２００６；９０：２６９－２８０．

【文献】Ｌｉ Ｘ，Ｆｉｅｌｄｓ ＦＲ，Ｈｏ Ｍ，Ｍａｒｓｈａｌｌ－Ｈｕｄｓｏｎ Ａ，Ｇｒｏｓｓ Ｒ，Ｃａｓｓｅｒ ＭＥ，ｅｔ ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＤＢ－Ｂ５ａｓ ａ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｆｏｒ ｏｒａｌ ｈｅａｌｔｈ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ Ｔｏｘｉｃｏｌ ２０２１；１５３：１１２２７７．

【文献】Ｈａｌｅ ＪＤＦ，Ｊａｉｎ Ｒ，Ｗｅｓｃｏｍｂｅ ＰＡ，Ｂｕｒｔｏｎ ＪＰ，Ｓｉｍｏｎ ＲＲ，Ｔａｇｇ ＪＲ．Ｓａｆｅｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｍ１８ａ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｆｏｒ ｏｒａｌ ｈｅａｌｔｈ．Ｂｅｎｅｆ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ２０２２；１３：４７－６０．

【文献】Ｗｅｓｃｏｍｂｅ ＰＡ，Ｕｐｔｏｎ Ｍ，Ｒｅｎａｕｌｔ Ｐ，Ｗｉｒａｗａｎ ＲＥ，Ｐｏｗｅｒ Ｄ，Ｂｕｒｔｏｎ ＪＰ，Ｃｈｉｌｃｏｔｔ ＣＮ，Ｔａｇｇ ＪＲ．Ｓａｌｉｖａｒｉｃｉｎ ９，ａ ｎｅｗ ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１１；１５７：１２９０－１２９９．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明の目的は、高い坑菌、抗真菌、抗炎効果を有する新規なストレプトコッカスサリバリウス菌株及びこれを含む口腔用組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0011】

上記の課題を解決するために、本発明は、坑菌、抗真菌、抗炎活性を有する新規なストレプトコッカスサリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７，ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）菌株を提供する。

【0012】

前記坑菌活性は、アグリゲイティバクターアクチノミセスコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、アクチノミセスイスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）、アクチノミセスネスランディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）、エンテロコッカスフェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、フソバクテリウムヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ポルフィロモナスジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラインターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ，Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、プレボテラニグレセンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）、ストレプトコッカスミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカスソブリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アクチノミセスビスコーサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及び黄色ブドウ状球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）からなる群から選ばれる１以上に対する坑菌活性を含むが、これに限定されるものではない。

【0013】

本発明において、「アグリゲイティバクターアクチノミセスコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）」は、代表的な歯肉炎誘発細菌の一つであり、局所攻撃性歯周炎と関連するグラム陰性、通性嫌気性非運動性バクテリアである。Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓはまれに心内膜炎のような非口腔感染を起こし、外毒素としてロイコトキシン（ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ，ＬＴ）と細胞毒性膨脹性毒素（ｃｙｔｏｌｅｔｈａｌ ｄｉｓｔｅｎｄｉｎｇ ｔｏｘｉｎ，Ｃｄｔ）を生成させる。外毒素ＬＴは、単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、中性球（好中球）及び一部のリンパ球の原形質膜に穴を形成して細胞を損傷させることによって免疫を阻害し、ＣｄｔはＤＮＡ分解酵素で、上皮細胞、歯肉線維芽細胞及びリンパ球を含む様々な細胞の細胞分裂を抑制し、細胞分裂の抑制された一部の細胞では細胞の自然死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導させる。内毒素としては脂質多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）を分泌し、大食細胞の前炎症性サイトカイン（ＩＬ－１，ＴＮＦ）生成を誘導し、骨吸収と膠様質破壊を誘導する。

【0014】

本発明において「アクチノミセスイスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）」は、正常人の膣、結腸及び口で共生し、個体免疫力が低下した時に感染病を起こす機会主義病原性細菌で、歯肉炎を誘発する。また、放線菌症は、Ａ．ｉｓｒａｅｌｉｉによって最も多く発生し、抗生剤で治療できる。

【0015】

本発明において「アクチノミセスネスランディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）」は、細菌性膣炎がある女性及びヒトの口で発見されるグラム陽性の棒状バクテリアで、虫歯を含む様々な歯周疾患と関連があり、特に歯肉炎を誘発しやすい。また、Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉは、放線菌症の原因となり、浮腫と膿を分泌し得る膿瘍を形成し、組織線維症を伴うことがある。Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉは、口、顔及び首にしばしば感染されるが、まれに、胸部、腹部、骨盤及び中枢神経系にも感染を起こすことがある。

【0016】

本発明において「エンテロコッカスフェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）」は、人と他の哺乳動物の胃腸管に生息するグラム陽性、共生細菌で、代表的な歯根端炎症誘発細菌の一つである。歯牙の根管（歯根管）治療をした歯牙において一般に保菌率の３０～９０％の範囲で発見され、再感染された歯根管治療歯牙は、１次感染の場合に比べて、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓを保有する可能性が約９倍も高いことが知られている。まれに、心内膜炎、敗血症、尿路感染（ＵＴＩ）、髓膜炎及びその他ヒトの感染を誘発することがあり、多く使用される抗菌剤であるアミノグリコシド、アズトレオナム、セファロスポリン、クリンダマイシン、半合成ペニシリン類ナフシリンとオキサシリン、トリメトプリム／スルファメトキサゾールに抵抗性を示す多重薬物耐性（Ｍｕｌｔｉ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＭＤＲ）を有することが知られている。

【0017】

本発明において「フソバクテリウムヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）」は、ヒトの口腔に共生するグラム陰性細菌であって、歯周炎を誘発する代表的な細菌の一つであり、口腔内の他のバクテリア種と凝集する能力によって歯周プラークを構成する主要要素となる。その他にも多くの研究から胎児の早産、結腸直膓癌との連関性が立証された。

【0018】

本発明において「ポルフィロモナスジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）」は、非運動性、グラム陰性、棒状、嫌気性、病原性バクテリアで、代表的な歯周炎誘発細菌である。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは、歯周炎のある口腔と上部胃腸管、呼吸器官及び結腸から発見され、アルツハイマー病及びリウマチ関節炎とも関連があることが知られている。

【0019】

本発明において「プレボテラインターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ，Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）」は、歯肉炎及び歯周炎を含む歯周感染に関与するグラム陰性絶対嫌気性病原性細菌であり、しばしば急性壊死性潰瘍性歯肉炎から発見される。Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａはステロイドホルモンを成長因子とすることにより、妊産婦に相対的に多く見られ、細菌性膣炎を持つ女性からも分離される。

【0020】

本発明において「プレボテラニグレセンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）」は、グラム陰性菌であって、正常口腔細菌叢の一部であり、機会性歯周炎誘発細菌の一つで、歯周疾患以外にも鼻咽頭及び腹腔内感染、頚動脈粥状動脈硬化症と関連があるものと知られている。

【0021】

本発明において「アクチノミセスビスコーサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）」は、成人の７０％の口に生息するグラム陽性、通性嫌気性細菌である。Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓは、動物において歯周疾患を起こし、人の歯石及び歯根表面齲蝕症の他に心内膜炎を起こすこともあり、非常にまれには肺感染を起こすことがある。

【0022】

本発明において「ストレプトコッカスミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）」は、虫歯菌とも知られており、ラクトバチルスと共に虫歯の主原因菌である。Ｓ．ｍｕｔａｎｓは歯牙齲蝕を誘発し、歯牙を黒い色に変色させて虫歯にする。

【0023】

本発明において「ストレプトコッカスソブリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）」は、グラム陽性、非運動性及び嫌気性細菌で、Ｓ．ｍｕｔａｎｓと結合して歯牙内虫歯形成を促進する。特に、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓは、齲蝕の有病率においてＳ．ｍｕｔａｎｓに比べてより密接な関連があるものと知られている。

【0024】

本発明において「肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）」は、グラム陽性及び溶血性を示す連鎖状球菌の一種である。健康な人々には症状を起こさないが、免疫力の弱い子供や老人に肺炎と髓膜炎を起こす主原因であり、上気道疾患を誘発する。

【0025】

本発明において「ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）」は、化膿性連鎖状球菌で、グラム陽性の好気性細菌である。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓは、咽喉、生殖器粘膜、直腸及び皮膚に生息して連鎖球菌咽頭炎、リウマチ熱、リウマチ性心臓病、猩紅熱のような様々な疾病を起こすことがあり、上気道疾患を誘発する。

【0026】

本発明において「大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」は、代表的なグラム陰性病原性細菌で、大腸菌が含まれた食べ物を食べたり、それに感染された動物を触る場合に感染され、腹部痙攣痛、ムカツキ、嘔吐などを誘発する。

【0027】

本発明において「黄色ブドウ状球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）」は、代表的なグラム陽性病原性細菌で、化膿性疾患及び食中毒の原因菌である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、鼻、呼吸系統、皮膚に存在し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる食中毒は、菌が食品内に増殖しながら生成された毒素を摂取することによって発生する毒素型食中毒である。

【0028】

本発明において、抗真菌活性は、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）に対する抗真菌活性であるが、これに限定されるものではない。

【0029】

本発明において「カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）」は、機会病原性真菌で、ヒト腸内細菌叢の共通構成員である。健康な成人の４０～６０％で胃腸管及び口から発見されるが、免疫の弱化した個体で病原性になってカンジダ症を起こす。カンジダ症は、世界的に３位又は４位に頻繁な病原感染であり、特に、皮膚及び生殖器の他に口腔及び食道感染も起こし、全身感染に対してアンフォテリシンＢ、エキノカンジン又はフルコナゾールなどで治療する。

【0030】

本発明の新規なストレプトコッカスサリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７，ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）菌株は、従来のストレプトコッカスサリバリウスＫ１２（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｋ１２）及びストレプトコッカスサリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＡＴＣＣ７０７３（ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ））と比較して４～８倍も高い坑菌効果を有する。

【0031】

本発明の新規なストレプトコッカスサリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７，ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）菌株は、従来のストレプトコッカスサリバリウスＫ１２（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｋ１２）及びストレプトコッカスサリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＡＴＣＣ７０７３（ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ））と比較して高い口臭抑制効果を有する。本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）培養液は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ培養液の口臭誘発揮発性硫黄化合物である硫化水素（Ｈ_２Ｓ）及び硫化メチル（ＣＨ_３ＳＨ）の濃度を低減させることによって口腔疾患による口臭を顕著に抑制できる。

【0032】

本発明は、前記坑菌、抗真菌、抗炎活性を有する新規なストレプトコッカスサリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７，ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）菌株；その破砕物；その濃縮物；その乾燥物；その培養物；その抽出物；その熱処理培養乾燥物；及びその分画物のうち一つ以上を含む口腔疾患の予防又は改善用組成物を提供する。

【0033】

前記口腔疾患は、歯肉炎（ｇｉｎｇｉｖｉｔｉｓ）、歯周炎（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ）、歯牙齲蝕症（ｄｅｎｔａｌ ｃａｒｉｅｓ）、口臭（ｈａｌｉｔｏｓｉｓ）、しみる歯（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｅｅｔｈ）、口腔カンジダ症（ｏｒａｌ ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ）、上気道疾患（ｕｐｐｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｄｉｓｅａｓｅ）及び歯根端疾患（ｐｅｒｉａｐｉｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選ばれる１種以上であってよいが、これに限定されるものではない。

【0034】

前記口腔疾患は、口腔内又は上気道内病原菌又は真菌の感染によって誘発されることがあり、本発明の組成物は、坑菌、抗炎活性によって前記口腔疾患を予防又は改善することができる。

【0035】

前記口腔疾患の予防又は改善用組成物は、歯磨き粉、うがい製品、ガム、あめ類、カラメル類、ジェリー類、口腔スプレー、口腔用軟膏、口腔洗浄剤、口腔清浄剤及び歯牙美白剤からなる群から選ばれる一つに製品化できるが、これに限定されるものではない。

【0036】

本発明は、前記坑菌、抗真菌、抗炎活性を有する新規なストレプトコッカスサリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７，ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）菌株又はその培養物を含む口腔用プロバイオティクス組成物を提供する。前記口腔用プロバイオティクス組成物は、錠剤、カプセル、丸、顆粒、液状、粉末、片状、ペースト状、シロップ、ゲル、ジェリー、ガム類及びあめ類からなる群から選ばれる一つ以上の剤形であるが、これに限定されるものではない。前記プロバイオティクスに含み得る担体、賦形剤及び希釈剤には、ラクトース、デキストロース、マルトデキストリン、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合には、一般に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、甘味剤、酸味剤などの希釈剤又は賦形剤を使用することができる。

【0037】

本発明は、前記坑菌、抗真菌、抗炎活性を有する新規なストレプトコッカスサリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７，ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）菌株；その破砕物；その濃縮物；その乾燥物；その培養物；その抽出物；その熱処理培養乾燥物；及びその分画物のうち一つ以上を含む口腔疾患の予防又は治療用薬学組成物を提供する。

【0038】

前記口腔疾患は、歯肉炎（ｇｉｎｇｉｖｉｔｉｓ）、歯周炎（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ）、歯牙齲蝕症（ｄｅｎｔａｌ ｃａｒｉｅｓ）、口臭（ｈａｌｉｔｏｓｉｓ）、しみる歯（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｅｅｔｈ）、口腔カンジダ症（ｏｒａｌ ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ）、上気道疾患（ｕｐｐｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｄｉｓｅａｓｅ）及び歯根端疾患（ｐｅｒｉａｐｉｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選ばれる１種以上であってよい。

【0039】

前記新規なストレプトコッカスサリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７，ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）菌株；その破砕物；その濃縮物；その乾燥物；その培養物；その抽出物；その熱処理培養乾燥物；及びその分画物は、全体薬学組成物の全重量に対して、好ましくは０．００１～５０重量％、より好ましくは０．００１～４０重量％、最も好ましくは０．００１～３０重量％で添加されてよい。

【0040】

前記薬学的組成物は、それぞれ、通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、液剤、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤の形態で剤形化して使用されてよい。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、少なくとも一つの賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース又はラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調製できる。また、単純な賦形剤の他に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。

【0041】

本発明の薬学的組成物の投与量は、治療対象の年齢、性別、体重と、治療する特定疾患又は病理状態、疾患又は病理状態の深刻度、投与経路及び処方者の判断によって変わってよく、このような因子に基づく投与量の決定は、当業者のレベル内にあり、一般に、投与量は、１×１０^６ＣＦＵ／日～略１×１０^１１ＣＦＵ／日の範囲である。好ましい投与量は、１×１０^８ＣＦＵ／日～１×１０^１１ＣＦＵ／日であり、より好ましい投与量は、１×１０^８ＣＦＵ／日～１×１０^１０ＣＦＵ／日である。投与は、１日に１回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。前記投与量はいかなる面においても本発明の範囲を限定するものではない。本発明の薬学的組成物は、ネズミ、家畜、ヒトなどの哺乳動物に様々な経路で投与されてよい。

【0042】

前記組成物は、前記坑菌、抗真菌、抗炎活性を有する新規なストレプトコッカスサリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７，ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）菌株；その破砕物；その濃縮物；その乾燥物；その培養物；その抽出物；その熱処理培養乾燥物；及びその分画物のうち一つ以上を含む口腔疾患の予防又は改善用健康機能食品を提供する。

【0043】

前記健康機能食品は、前記坑菌、抗真菌、抗炎活性を有する新規なストレプトコッカスサリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７，ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）菌株；その破砕物；その濃縮物；その乾燥物；その培養物；その抽出物；その熱処理培養乾燥物；及びその分画物のうち一つ以上が全体食品全重量に対して、好ましくは０．００１～５０重量％、より好ましくは０．００１～３０重量％、最も好ましくは０．００１～１０重量％で添加されてよい。

【0044】

前記健康機能食品は、錠剤、カプセル剤、粉末、丸剤又は液剤などの形態を含み、本発明の抽出物を添加できる食品には、例えば、各種食品類、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康機能性食品類などがある。

【発明の効果】

【0045】

本発明は、坑菌、抗真菌、抗炎活性を有する新規なストレプトコッカスサリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７，ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）菌株及びこれを含む口腔疾患の予防又は改善用組成物、口腔用プロバイオティクスに関し、具体的には、新規なストレプトコッカスサリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７，ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）菌株は、歯周疾患を誘発する菌株に強い坑菌活性及び抗炎活性によって歯周疾患を予防、治療及び改善し、口腔疾患によって発生する口臭を抑制して口腔健康改善に寄与できる。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）１６Ｓ ｒＲＮＡ配列（配列番号１）を示す図である。

【図2】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）の系統図である。

【図3】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）の歯肉炎誘発細菌Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ａ．ｉｓｒａｅｌｉｉ、Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ及び歯根端炎症誘発細菌Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓに対する坑菌力実験結果である。

【図4】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）の歯周炎誘発細菌Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ，Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ，Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ及びＰ．ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓに対する坑菌力実験結果である。

【図5】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）の歯牙齲蝕誘発細菌Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ及びＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ、上気道疾患誘発細菌Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＳ．ｐｙｏｇｅｎeｓに対する坑菌力実験結果である。

【図6】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）の代表的なグラム陰性病原菌Ｅ．ｃｏｌｉ及びグラム陽性病原菌Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する坑菌力実験結果である。

【図7】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）の口腔カンジダ症誘発真菌Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する抗真菌力実験結果である。

【図8】本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）の細胞表面物質を含む細胞破砕物の病毒力を確認したものである。Ａ．ＴＮＦ－α ｍＲＮＡ発現、Ｂ．ＩＬ－８ｍＲＮＡ発現、Ｃ．ＴＮＦ－α生成、Ｄ．ＩＬ－８生成

【図9】Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＬＰＳによって誘導された炎症性サイトカインに本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）ＬＴＡが及ぼす効果を示すグラフである。Ａ．ＴＮＦ－α ｍＲＮＡ発現、Ｂ．ＩＬ－８ｍＲＮＡ発現、Ｃ．ＴＮＦ－α生成、Ｄ．ＩＬ－８生成

【図10】Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ＬＰＳによって誘導された炎症性サイトカインに本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）ＬＴＡが及ぼす効果を示すグラフである。Ａ．ＴＮＦ－α ｍＲＮＡ発現、Ｂ．ＩＬ－８ｍＲＮＡ発現、Ｃ．ＴＮＦ－α生成、Ｄ．ＩＬ－８生成

【図11】Ｆ．ａｌｏｃｉｓ ＬＴＡによって誘導された炎症性サイトカインに本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）ＬＴＡが及ぼす効果を示すグラフである。Ａ．ＴＮＦ－α ｍＲＮＡ発現、Ｂ．ＩＬ－８ｍＲＮＡ発現、Ｃ．ＴＮＦ－α生成、Ｄ．ＩＬ－８生成

【図12】本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＣＣＭ１３１６１Ｐ）ＬＴＡによるＬＰＳ及びＬＴＡの細胞付着抑制能を示す流細胞分析結果である。Ａ．Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＬＰＳ結合、Ｂ．Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ＬＰＳ結合、Ｃ．Ｆ．ａｌｏｃｉｓ ＬＴＡ結合。

【図13】本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）ＬＴＡによる歯周炎関連細菌物質ＣＤ１４及びＬＢＰ付着抑制能を示すグラフである。Ａ、Ｂ、Ｃ．Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｆ．ａｌｏｃｉｓのＣＤ１４付着抑制；Ｄ、Ｅ．Ｆ．Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｆ．ａｌｏｃｉｓのＬＢＰ付着抑制。

【図14】本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）培養液のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来揮発性硫黄化合物Ｈ_２Ｓ及びＣＨ_３ＳＨの濃度に及ぼす影響を示すグラフである。

【図15】本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）菌株のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来揮発性硫黄化合物Ｈ_２Ｓ及びＣＨ_３ＳＨの濃度に及ぼす影響を示すグラフである。

【図16】本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）処理の有無による齲蝕原性バイオフィルムの共焦点レーザー顕微鏡３次元イメージである。（緑色は、生きている細菌、赤色は、死んだ細菌）

【図17】本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）処理濃度による齲蝕原性バイオフィルム内全細菌数、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ及びＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７の菌数を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0047】

以下、本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。ただし、本発明は、ここで説明される実施例に限定されず、他の形態に具体化されてもよく、ここで紹介される内容は、本発明の思想を十分に伝達するために提供するものである。

【0048】

＜実施例１．ストレプトコッカスサリバリウスストレインの準備＞

【0049】

本発明のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）は、健康な韓国男性の歯肉縁下サンプルから分離して同定及び特性化し、韓国口腔微生物資源銀行（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｏｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＫＣＯＭ）に登録したし（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＫＣＯＭ ２１３７）、前記菌株が、坑菌、抗炎活性、歯牙齲蝕抑制活性及び口臭抑制活性において、従来Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓに比べて特に優れていることを確認し、韓国微生物保存センター（社団法人韓国種菌協会）に特許寄託した（寄託番号：ＫＣＣＭ１３１６Ｐ、寄託日：２０２３．０４．２１．）。

【0050】

本発明のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）の１６ＳｒＲＮＡ配列（配列番号１）を図１に示し、それに基づいて系統発生学的分析を行い、その結果を図２に示した。

【0051】

比較菌株としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｋ１２は販売中の製品で分離同定し、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＡＴＣＣ７０７３（ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）はアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）から購入して使用した。

【0052】

＜実施例２．坑菌、抗真菌活性評価＞

【0053】

２．１ 細菌培養

【0054】

前記菌株の坑菌力試験のための口腔細菌は総１２種の微生物であり、表１のように、口腔内疾患関連グラム陽性及びグラム陰性細菌、代表的な坑菌試験菌株、そして真菌で構成した。歯牙齲蝕菌関連細菌としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓＡＴＣＣ２５１７５、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓＡＴＣＣ２７６０７はトリプチケースソイブイヨン培地（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）；ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ ＡＴＣＣ １２１０４は、ブレインハートインフュージョン（ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）；ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）液体培地を用いて培養した。歯肉及び歯周疾患関連細菌としては、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ（ＡＴＣＣ １２１０２）、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（ＡＴＣＣ ４３７１８）はブレインハートインフュージョン（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（ＡＴＣＣ ２５５８６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＡＴＣＣ ３３２７７）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（ＡＴＣＣ ２５６１１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ（ＡＴＣＣ ３３５６３）はヘミン（ｈｅｍｉｎ；１μｇ／ｍｌ）とビタミンＫ（０．２μｇ／ｍｌ）を添加したＢＨＩ液体培地を用いて、３７℃嫌気状態（Ｈ ２５％、ＣＯ_２ １０％、Ｎ_２ ８５％）で培養した。歯根端炎関連細菌であるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（ＡＴＣＣ ２９２１２）は、ＢＨＩ液体培地を用いて３７℃嫌気状態（Ｈ ２５％、ＣＯ_２ １０％、Ｎ_２ ８５％）で培養した。真菌であるＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ１０２３１）は、ＴＳＢを用いて好気状態で培養した。上気道疾患関連細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１２３４４）及びＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ４９４１６）は、ｔｏｄｄ ｈｅｗｉｔｔ ｂｒｏｔｈ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて好気状態で培養した。最後に、代表的なグラム陽性及びグラム陰性細菌であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ ２３２３５）及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ ５３８６８）は、ＴＳＢを用いて好気状態で培養した。本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）は、Ｍ１７（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）液体培地を用いて培養した。

【0055】

【表1】

【0056】

２．２ 坑菌力試験

【0057】

坑菌力試験は、臨床検査標準研究所（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）推奨の方法を用いて行った。液体培地で培養された細菌を４，０００×ｇで５分間遠心分離し、清潔な液体培地を入れ、バクテリア計数チャンバー（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｃｈａｍｂｅｒ）を用いて細菌量を測定した。測定された細菌浮遊液に清潔な培地を用いて嫌気性細菌は１．５×１０^６ｃｅｌｌ／ｍｌ、好気性及び通性嫌気性細菌は１．０×１０^６ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように調整して実験に使用した。

【0058】

９６ウェルプレートにそれぞれの培地を１８０μｌずつ入れ、最初の列に準備された本発明のＧ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）及びＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｋ１２とＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＡＴＣＣ７０７３を２０μｌずつ入れた後、それぞれ２倍ずつ連続希釈法で希釈し、嫌気培養器で２４時間又は３６時間培養した。その後、分光光度計を用いて６６０ｎｍで吸光度を測定して細菌成長を分析し、図３～図６に示した。

【0059】

図３に見られるように、本発明に係るＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）は、歯肉炎誘発細菌Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ａ．ｉｓｒａｅｌｉｉ、Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ及び歯根端炎症誘発細菌Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓに対して、周知のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株であるＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＡＴＣＣ７０７３（ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）又はＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｋ１２に比べて優れた坑菌力を示した。Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓは歯肉炎を起こし、青少年に対しては歯周炎を誘発することもある。本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）は、Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓを１６倍希釈した培養された培地で成長が抑制されることが観察されたし、８倍希釈した培養された培地で完壁に成長を抑制させた。Ａ．ｉｓｒａｅｌｉｉも、８倍希釈した培養された培地で成長が抑制されることが観察されたし、４倍希釈した培養された培地で成長を完壁に抑制させ、また、Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉに対しては８倍希釈した培養された培地で成長が抑制されることが観察されたし、４倍希釈した培養された培地で成長を完壁に抑制させた。Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓは、１６倍希釈した培養された培地で成長が有意に抑制されることが観察されたし、８倍希釈した培養された培地で完壁に成長を抑制させた。このような結果は、従来菌株に比べて８倍以上の坑菌力を有することを示唆する。

【0060】

図４に見られるように、本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）は、歯周炎誘発細菌Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ及びＰ．ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓに対して、周知のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株であるＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＡＴＣＣ７０７３（ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）又はＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｋ１２に比べて優れた坑菌力を示した。Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）は、Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ及びＰ．ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓに対して１６倍希釈した培養された培地で成長が有意に抑制されることが観察されたし、８倍希釈した培養された培地で成長を完壁に抑制させることが見られた。このような結果は、従来菌株に比べて８倍以上の坑菌力を有することを示唆する。

【0061】

図５に見られるように、本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）は、歯牙齲蝕誘発細菌Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ及びＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓと上気道疾患誘発細菌Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＳ．ｐｙｏｇｅｎeｓに対して、周知のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株であるＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＡＴＣＣ７０７３（ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）又はＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｋ１２に比べて優れた坑菌力を示した。Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）は、Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ及びＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓとＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＳ．ｐｙｏｇｅｎeｓに対して１６倍希釈した培養された培地で成長が有意に抑制されることが観察されたし、８倍希釈した培養された培地で成長を完壁に抑制させることが見られた。このような結果は、従来菌株に比べて８倍以上の坑菌力を有することを示唆する。

【0062】

図６に見られるように、本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）は、代表的なグラム陰性病原菌Ｅ．ｃｏｌｉ及びグラム陽性病原菌Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して、周知のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株であるＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＡＴＣＣ７０７３（ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）又はＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｋ１２に比べて優れた坑菌力を示した。Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳ．ａｕｒｅｕｓに対して８倍希釈した培養された培地で成長が有意に抑制されることが観察されたし、４倍希釈した培養された培地で成長を完壁に抑制させることが見られた。このような結果は、従来菌株に比べて４倍以上の坑菌力を有することを示唆する。

【0063】

２．３ 抗真菌力試験

【0064】

前記坑菌試験と同じ方法で口腔カンジダ症誘発真菌Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する抗真菌力実験を行い、その結果を図７に示した。

【0065】

図７に見られるように、本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに対して、周知のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株であるＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＡＴＣＣ７０７３（ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）又はＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｋ１２に比べて優れた抗真菌力を示した。Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対して８倍希釈した培養された培地で成長が有意に抑制されることが観察されたし、４倍希釈した培養された培地で成長を完壁に抑制させることが見られた。このような結果は、従来菌株に比べて４倍以上の坑菌力を有することを示唆する。

【0066】

＜実施例３．抗炎症活性評価＞

【0067】

歯肉線維芽細胞を用いて本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）の炎症抑制効果を確認した。炎症誘発物質としては、下記表２のように、Ｐｏｒｐｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）又はＴａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ由来ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）又はＦｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ由来ＬＴＡ（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ）を使用した。

【0068】

【表2】

【0069】

Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＬＰＳ、Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ＬＰＳ及びＦ．ａｌｏｃｉｓ ＬＴＡはそれぞれ、口腔内細胞膜のＴＬＲ４及びＴＬＲ２との結合を始めに信号伝達を開始しながら炎症を誘発する。ＬＰＳ又はＬＴＡがＴＬＲ４及びＴＬＲ２に付着するためにはＣＤ１４とＬＢＰ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）が必要である。Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＬＴＡは、歯周炎細菌のＬＰＳ及びＬＴＡがＣＤ１４とＬＢＰへの付着を競合的に抑制してＴＬＲに付着することを防止することによって、ＬＰＳ及びＬＴＡの炎症誘導活性を抑制することができる。

【0070】

１２ウェルポリスチレンプレートに歯肉線維芽細胞株ＨＧＦ－１を接種して８０％程度満たされるまで培養した後に培地を除去し、２％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）とペニシリン／ストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）添加のＤＭＥＭ培地を１ｍｌを入れた。その後、超音波器を用いて本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）を破壊し、得られた細胞破砕物を処理し、炎症誘発物質であるＬＰＳ又はＬＰＡを１００μｇ混合処理した後、１２時間培養した。その後、培養液は、ＥＬＩＳＡキットを用いてＴＮＦ－α及びＩＬ－８を分析した。また、細胞は、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡは、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて純度及び濃度を測定し、１μｇの全ＲＮＡをＭａｘｉｍｅ ＲＴ ｐｒｅｍｉｘ（ＩｎｔｒｏｎＢｉｏｔｅｃｈ．，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ）を用いてｃＤＮＡを合成し、炎症関連サイトカインを実時間遺伝子増幅器（ＡＢ７５００Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ；Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて調査し、図８～図１１に示した。本実験に使用した炎症性サイトカインのプライマー情報は、下記表３の通りである。

【0071】

【表3】

【0072】

図８は、本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）の細胞表面物質を含む細胞破砕物の病毒力を確認したものである。ヒト歯肉線維芽細胞株ＨＧＦ－１に大腸菌由来リポポリサッカリド（Ｅｃ ＬＰＳ）、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ（ＡＴＣＣ７０７３）由来リポタイコ酸（Ｓｓ ｔｙｐｅ ＬＴＡ）、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ（ＡＴＣＣ７０７３）由来表面タンパク（Ｓｓ ｔｙｐｅ ＳＰ）、本発明に係るＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）由来ＬＴＡ（ＳＳ Ｇ７ＬＴＡ）、本発明に係るＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）由来ＳＰ（ＳＳ Ｇ７ＳＰ）を処理し、ＴＮＦ－α及びＩＬ－８のｍＲＮＡ及びタンパク質生成量を図８に示した。図８に見られるように、大腸菌由来ＬＰＳ（Ｅｃ ＬＰＳ）の処理時にのみＴＮＦ－α及びＩＬ－８のｍＲＮＡ及びタンパク質生成量が増加したし、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ種のＬＴＡ又はＳＰは毒力因子として作用しないことを確認した。

【0073】

図９は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＬＰＳによって誘導された炎症性サイトカインに本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）ＬＴＡが及ぼす効果を示すグラフである。図９に見られるように、歯肉線維芽細胞株ＨＧＦ－１にＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＬＰＳ（Ｐｇ ＬＰＳ）を処理した場合に、ＴＮＦ－α及びＩＬ－８のｍＲＮＡ及びタンパク質生成量が増加したし、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ及び本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）ＬＴＡを共に処理する場合に、ＴＮＦ－α及びＩＬ－８のｍＲＮＡ及びタンパク質生成量が抑制された。特に、本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）のＬＴＡは、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎと比較してＴＮＦ－α及びＩＬ－８のｍＲＮＡ及びタンパク質生成量を顕著に抑制することを確認した。

【0074】

図１０は、Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ＬＰＳによって誘導された炎症性サイトカインに本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）ＬＴＡが及ぼす効果を示すグラフである。図１０に見られるように、歯肉線維芽細胞株ＨＧＦ－１にＴ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ＬＰＳ（Ｔｆ ＬＰＳ）を処理した場合に、ＴＮＦ－α及びＩＬ－８のｍＲＮＡ及びタンパク質生成量が増加したし、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ及び本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）ＬＴＡを共に処理する場合に、ＴＮＦ－α及びＩＬ－８のｍＲＮＡ及びタンパク質生成量が抑制された。特に、本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）のＬＴＡは、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎと比較してＴＮＦ－α及びＩＬ－８のｍＲＮＡ及びタンパク質生成量を顕著に抑制することを確認した。

【0075】

図１１は、Ｆ．ａｌｏｃｉｓ ＬＴＡによって誘導された炎症性サイトカインに本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）ＬＴＡが及ぼす効果を示すグラフである。図１１に見られるように、歯肉線維芽細胞株ＨＧＦ－１にＦ．ａｌｏｃｉｓ ＬＴＡ（ＦａＬＴＡ）を処理した場合に、ＴＮＦ－α及びＩＬ－８のｍＲＮＡ及びタンパク質生成量が増加したし、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ及び本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）ＬＴＡを共に処理する場合に、ＴＮＦ－α及びＩＬ－８のｍＲＮＡ及びタンパク質生成量が抑制された。特に、本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）のＬＴＡは、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎと比較してＴＮＦ－α及びＩＬ－８のｍＲＮＡ及びタンパク質生成量を顕著に抑制することを確認した。

【0076】

上記の結果から、本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）は、歯周炎誘発細菌によって誘導される炎症を抑制できることを確認した。

【0077】

＜実施例４．歯周炎関連細菌の物質細胞付着抑制能評価＞

【0078】

４．１流細胞分析

【0079】

上記の結果に基づいて、本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）ＬＴＡが、歯周炎誘発細菌に由来するＬＰＳ又はＬＴＡが細胞に付着することを抑制できるかを評価した。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＬＰＳ、Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ＬＰＳ及びＦ．ａｌｏｃｉｓ ＬＴＡに蛍光物質を付着させた後、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ（ＡＴＣＣ７０７３）由来ＬＴＡ（Ｓｓ ｔｙｐｅ ＬＴＡ）又は本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）ＬＴＡをそれぞれ共にヒト歯肉線維芽細胞株ＨＧＦ－１に処理して培養し、細胞の蛍光程度を流細胞分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で確認して図１２に示した。

【0080】

Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ及びＴ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ由来ＬＰＳ（１ｍｇ）及びＦ．ａｌｏｃｉｓ由来ＬＴＡを４℃で３０分間冷たいメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応させた後、標準ＲＣ透析膜チューブ（ｓｔａｎｄａｒｄ ＲＣ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｕｂｉｎｇ）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒａｎｃｈ Ｄｏｍｉｎａｑｕｅｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）に反応液を入れ、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．５）で１２時間透析した。前記ＬＰＳ及びＬＴＡを含む溶液を２００ｍＭ ＫＣｌに溶解させて製造した１０ｍＭ Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ－４８８ヒドラジド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）と混合してカップリング緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で６時間室温で放置し、１Ｌの内毒素がない水で１２時間３回透析後に、蛍光標識されたＬＰＳ及びＬＴＡを新しいチューブに移して－２０℃に保管した。

【0081】

その後、前記Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ４８８で標識されたＬＰＳ又はＬＴＡを、様々な濃度のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７表面抽出物の存在又は不在下に３７℃で１時間ヒト単核球細胞株であるＴＨＰ－１細胞株に処理した。その後、ＣＯ_２インキュベーターで前記細胞を５００ｘｇで３分間遠心分離して得、冷たいＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７．２）で３回洗浄した。その後、前記細胞に対するＡｌｅｘａ ４８８標識されたＬＰＳ及びＬＴＡの結合を流動細胞測定法（ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒ，ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）で分析した。１０，０００個の細胞を計数してデータを収集したし、Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ４８８標識されたＬＰＳとＬＴＡの結合がＦＬ－１チャネルから検出されたし、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを分析した。

【0082】

図１２に見られるように、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＬＰＳ、Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ＬＰＳ及びＦ．ａｌｏｃｉｓ ＬＴＡの処理により、蛍光を帯びる細胞、すなわち、ＬＰＳ及びＬＴＡが付着された細胞が大きく増加したし、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ（ＡＴＣＣ７０７３）由来ＬＴＡ（Ｓｓ ｔｙｐｅ ＬＴＡ）又は本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）ＬＴＡを共に培養した場合に、蛍光を示す細胞数が大きく減少した。特に、本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）のＬＴＡは、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎと比較して、ＬＰＳ及びＬＴＡが付着された細胞が顕著に減少することを確認した。

【0083】

４．２ ＣＤ１４及びＬＢＰ付着抑制分析

【0084】

前記Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＬＰＳ、Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ＬＰＳ又はＦ．ａｌｏｃｉｓ ＬＴＡはそれぞれ、ＴＬＲ４及びＴＬＲ２によって炎症性サイトカインを誘発するためには、まず、ＬＰＳ及びＬＴＡが口腔内細胞膜のＣＤ１４及びＬＢＰと結合しなければならない。Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＬＴＡは、歯周炎細菌のＬＰＳ及びＬＴＡがＣＤ１４とＬＢＰへの付着を競合的に抑制するかを確認した。

【0085】

蛍光物質が付着されたＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＬＰＳ、Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ＬＰＳ又はＦ．ａｌｏｃｉｓ ＬＴＡを、濃度別Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ（ＡＴＣＣ７０７３）由来ＬＴＡ（Ｓｓ ｔｙｐｅ ＬＴＡ）又は本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）のＬＴＡの存在下にＣＤ１４又はＬＢＰタンパク質と培養して付着程度を測定し、その結果を図１３に示した。

【0086】

Ａｎｔｉ－ＬＢＰ ｍＡｂ（ＭＡＢ８７０，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）及びＡｎｔｉ－ＣＤ１４Ａｂ（ＡＦ９８２，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）をＤＰＢＳに１μｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、抗体（５０ｎｇ／ｗｅｌｌ）は、ＥＩＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）に分注した後に４℃で１２時間コートした。前記抗体のコートされたＥＩＡプレートを、０．１％ ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳＴ）で５回洗浄し、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）が含まれているＤＰＢＳＴを分注した後、弱い振盪条件で２時間不活性化させた。その後、組換えヒトＬＢＰ（ｒｈＬＢＰ，Ｒ＆Ｄシステム）及びヒトＣＤ１４（ｒｈＣＤ１４，Ｒ＆Ｄシステム）を、２μｇ／ｍｌの濃度でＤＰＢＳに溶解させ、前記抗体がコートされたＥＩＡプレートのウェルに添加した。前記プレートを室温で４時間放置後にＰＢＳＴで５回洗浄した後、ビオチン標識された（ｂｉｏｔｉｎ－ｌａｂｅｌｌｅｄ）ＬＰＳ又はＬＴＡを、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＬＴＡとそれぞれ又は共同で用意されたウェルに処理し、室温で２時間放置した。ｒｈＬＢＰ及びｒｈＣＤ１４に結合したビオチン標識されたＬＰＳ及びＬＴＡを測定するために、２％ ＢＳＡを含有するＰＢＳＴで５０μｌのＨＲＰ標識されたストレプトアビジン（１μｇ／ｍｌ）と１時間反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）溶液を前記ウェルに入れて室温で３０分間放置し、酵素反応を１Ｎ硫酸で停止させた。マイクロプレートリーダ機（Ｂｉｏｔｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）で４５０ｎｍ波長で吸光度を測定した。

【0087】

図１３に見られるように、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ（ＡＴＣＣ７０７３）由来ＬＴＡ（Ｓｓ ｔｙｐｅ ＬＴＡ）又は本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）のＬＴＡ濃度が増加するほど、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＬＰＳ、Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ＬＰＳ又はＦ．ａｌｏｃｉｓ ＬＴＡのＣＤ１４又はＬＢＰの結合が減少した。特に、本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）のＬＴＡは、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎと比較してＬＰＳ又はＬＴＡのＣＤ１４又はＬＢＰの結合を顕著に抑制することを確認した。

【0088】

＜実施例５．揮発性硫黄化合物抑制能評価＞

【0089】

本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）が口臭抑制効果を有するかを確認するために、揮発性黄化合物を生産するＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの培地を用いて実験を行った。１ｍｌのＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（１×１０^８ｃｅｌｌ／ｍｌ）を１０ｍｌ新しい培地に接種し、４８時間培養後に、細菌培養液３００μｌを清潔な５０ｍｌ円周チューブに移した後、前記Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ培養液が入っている円周チューブに、本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）培養液３００μｌ又は６００μｌ又は生菌１０^７又は１０^８ｃｅｌｌを入れ、最終量が５ｍｌとなるように培地を追加した。その後、前記円周チューブをｖｅｒｔｉｃａｌ ｓｈａｋｅｒを用いて１分間振盪し、５分間室温に放置した。その後、１ｍｌ注射器を用いて溶液表面の真上にある空気１ｍｌを取得し、ガスクロマトグラフィー（ＯｒａｌｃｈｒｏｍａＴＭ；Ｎｉｓｓｈａ ＦＩＳ，Ｉｎｃ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて硫化水素（Ｈ_２Ｓ）及び硫化メチル（ＣＨ_３ＳＨ）の濃度を測定し、その結果を図１４及び図１５に示した。

【0090】

図１４に見られるように、本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）培養液は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ培養液の口臭誘発揮発性硫黄化合物である硫化水素（Ｈ_２Ｓ）及び硫化メチル（ＣＨ_３ＳＨ）の濃度を濃度依存的に減少させた。

【0091】

また、図１５に見られるように、本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）菌株自体も、濃度依存的に硫化水素（Ｈ_２Ｓ）及び硫化メチル（ＣＨ_３ＳＨ）の濃度を減少させた。

【0092】

上記の結果から、本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）がＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓによって生成される口臭を効果的に抑制できることを確認した。

【0093】

＜実施例６．バイオフィルム形成抑制評価＞

【0094】

６．１ バイオフィルム形成抑制効果

【0095】

本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）が実質的にバイオフィルム形成を抑制するかを評価した。１０名の歯周炎を有しない成人の唾液を集めて混合した後、２本のチューブに分けて入れた。まず、唾液コートされたプレートを製造するために、前記チューブのいずれか一方に同量のリン酸緩衝溶液を入れ、４℃６，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄液を清潔なチューブに移した。唾液細菌は、残り他方のチューブの唾液混合液に同量のＢＨＩ培地を入れて２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄液を清潔なチューブに移して用意した。

【0096】

前記コーティング用唾液を８ウェルガラスプレートに２００μｌ分注し、４０℃オーブンで乾燥させる過程を１０回反復した。前記で作製した唾液コートされたプレートはＵＶ滅菌器に入れて滅菌させた。その後、２％ショ糖が含まれている１０ｍｌの唾液細菌浮遊液に、齲蝕原性バイオフィルムを形成するために１００μｌのＳ．ｍｕｔａｎｓ（１×１０^８ｃｅｌｌ／ｍｌ）を添加した後、８ウェルガラスプレート及び１２ウェルポリスチレンプレートにそれぞれ４００μｌ及び１ｍｌを入れ、好気状態で培養した。その後、対照群は毎日、２％ショ糖が含まれているＢＨＩ培地のみを用いて培地を交換しながら７日間培養したし、実験群は、２％ショ糖が含まれているＢＨＩに本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）を１０^７及び１０^８の菌株数を含むように２つの濃度で接種し、培地を交換しながら７日間培養した。その後、バイオフィルム量を調べるために、８ウェルプレートは、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて３Ｄ観察して図１６に示した。

【0097】

図１６に見られるように、唾液コートされたプレートに唾液菌株とＳ．ｍｕｔａｎｓが複合的にバイオフィルムを形成したし、ここに本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）を追加する場合に、死滅されたバイオフィルム形成菌株が増加しながらバイオフィルムが緩むことを確認した。

【0098】

６．２ バイオフィルム内の細菌数測定

【0099】

前記形成されたバイオフィルム内の全細菌数（Ｏｒａｌ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ及びＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）の細菌数を測定した。上記で１２ウェルプレートに１ｍｌのＤＰＢＳを入れて培養されたバイオフィルムを物理的に落とした。これを、５，０００×ｇで１分間遠心分離して細菌沈殿物を得た後、前記細菌沈殿物からＧ－ｓｐｉｎゲノムＤＮＡ抽出キット（ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ，Ｋｏｒｅａ）を用いて総ＤＮＡを抽出した後、実時間遺伝子増幅器を用いて細菌定量を行った。

【0100】

実時間遺伝子分析は、当該標準定量ＤＮＡとサンプルを共に行った。ＴＢ ｇｒｅｅｎ ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、ＲＯＸ ＩＩ染料、プライマー及びＤＮＡを混合して９４℃で５分間予熱（ｐｒｅ－ｈｅａｔｉｎｇ）後に、９５℃で１０秒（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｓｔａｇｅ）、６０℃で１０秒（ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｓｔａｇｅ）及び７２℃で３３秒（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｓｔａｇｅ）を４０回反復し、非特異的結合を調べるために生成物溶解曲線を用いて調べた。標準容量ＤＮＡを用いてＣｔ値と細菌量に対する標準曲線を形成し、これに基づいてサンプルＤＮＡのＣｔ値を用いて細菌数を計算し、その結果を図１７に示した。この時に使用したプライマーを表４に示す。

【0101】

【表4】

【0102】

図１７に見られるように、バイオフィルム内Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）量は、処理した量が増加するにつれてその菌数は増加したが、歯牙齲蝕原因菌であるＳ．ｍｕｔａｎｓは、本発明のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｇ７（寄託番号ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ）処理した量が増加するにつれて有意に減少したことを確認した。

【受託番号】

【0103】

寄託機関名：韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）
受託番号：ＫＣＣＭ１３１６１Ｐ
受託日：２０２２年４月２１日

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

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