特許 7580936 粒子、アフィニティー粒子、検査試薬、及び検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-01

(45)【発行日】2024-11-12

(54)【発明の名称】粒子、アフィニティー粒子、検査試薬、及び検出方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20241105BHJP

【ＦＩ】

G01N33/543 541A

G01N33/543 525C

G01N33/543 525U

【請求項の数】 22

(21)【出願番号】P 2020071661

(22)【出願日】2020-04-13

(65)【公開番号】P2020183946

(43)【公開日】2020-11-12

【審査請求日】2023-04-07

(31)【優先権主張番号】P 2019085963

(32)【優先日】2019-04-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000001007

【氏名又は名称】キヤノン株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100126240

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 琢磨

(74)【代理人】

【識別番号】100223941

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 佳子

(74)【代理人】

【識別番号】100159695

【弁理士】

【氏名又は名称】中辻 七朗

(74)【代理人】

【識別番号】100172476

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 一史

(74)【代理人】

【識別番号】100126974

【弁理士】

【氏名又は名称】大朋 靖尚

(72)【発明者】

【氏名】名取 良

(72)【発明者】

【氏名】小林 本和

(72)【発明者】

【氏名】掛川 法重

(72)【発明者】

【氏名】山内 文生

(72)【発明者】

【氏名】金崎 健吾

(72)【発明者】

【氏名】笹栗 大助

【審査官】倉持 俊輔

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１２－１７７６９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－１３３０７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／２０４２０９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１６－１９１６８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／１４０２１６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２００９－３００２３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００７／１２６１５１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開平１１－１９１５１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００７－５２７４５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１４／０１２４６９６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２０１３－２３８５４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１１－２１６８３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００６－２６５６８６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／５４３，

Ｂ２２Ｆ １／０２

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

磁性体を含有する磁性粒子を含む粒子であって、
前記磁性粒子の表面に樹脂が存在し、
前記粒子の体積平均粒径が、０．７μｍ以上０．９μｍ以下であり、
前記粒子の密度が、５．１ｇ／ｃｍ^３以上１０．０ｇ／ｃｍ^３以下であり、前記樹脂が、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、エポキシ基、マレイミド基、及びスクシンイミジル基からなる群より選択される少なくとも１種の官能基を有することを特徴とする粒子。

【請求項2】

前記粒子の密度が、５．１ｇ／ｃｍ^３以上６．５ｇ／ｃｍ^３以下である請求項１に記載の粒子。

【請求項3】

前記樹脂の重量平均分子量が、１００００以上である請求項１または２に記載の粒子。

【請求項4】

前記樹脂が、下記式（２）及び（３）の繰り返し単位を有する請求項１乃至３のいずれか１項に記載の粒子。

【化1】

【化2】

【請求項5】

前記樹脂が、スチレン、及びアクリル酸に由来するユニットを有する請求項１乃至４のいずれか１項に記載の粒子。

【請求項6】

前記樹脂は、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリルアミド、グリシジル（メタ）アクリレート、Ｎ－スクシンイミジルアクリレート、グリセロール（メタ）アクリレート、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、スチレン、ｐ－クロロスチレン、α－メチルスチレン、及びビニルピロリドンのいずれかに由来するユニットを有する、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の粒子。

【請求項7】

前記粒子が、検体検査用である請求項１乃至６のいずれか１項に記載の粒子。

【請求項8】

前記磁性粒子に占める前記磁性体の数が、１個であり、かつ、
前記磁性粒子に占める前記磁性体の含有率が、１００％である請求項１乃至７のいずれか１項に記載の粒子。

【請求項9】

前記磁性体が、金属、及び金属酸化物からなる群より選択される少なくとも１種を含む請求項１乃至８のいずれか１項に記載の粒子。

【請求項10】

前記磁性体が、鉄、ニッケル、及びマグネタイトからなる群より選択される少なくとも１種を含む請求項１乃至８のいずれか１項に記載の粒子。

【請求項11】

前記磁性体が、前記鉄を含み、
前記磁性体に占める鉄原子の含有率が、８０ｍｏｌ％以上１００ｍｏｌ％以下である請求項１０に記載の粒子。

【請求項12】

前記磁性体が、前記ニッケルを含み、
前記磁性体に占めるニッケル原子の含有率が、８０ｍｏｌ％以上１００ｍｏｌ％以下である請求項１０に記載の粒子。

【請求項13】

前記官能基が、カルボキシル基である請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の粒子。

【請求項14】

前記樹脂が、シロキサン結合を有する請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の粒子。

【請求項15】

磁性体を含有する磁性粒子を含む粒子であって、
前記磁性粒子の表面に樹脂が存在し、
前記粒子の体積平均粒径が、０．４μｍ以上１．５μｍ以下であり、
前記粒子の密度が、５．１ｇ／ｃｍ ^３ 以上１０．０ｇ／ｃｍ ^３ 以下であり、前記樹脂が、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、エポキシ基、マレイミド基、及びスクシンイミジル基からなる群より選択される少なくとも１種を有し、
前記樹脂が、シロキサン結合を有することを特徴とする粒子。

【請求項16】

請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の粒子と、前記粒子に結合するリガンドとを有することを特徴とするアフィニティー粒子。

【請求項17】

前記リガンドが、抗体、及び抗原のいずれかである請求項１６に記載のアフィニティー粒子。

【請求項18】

請求項１６又は１７に記載のアフィニティー粒子と、前記アフィニティー粒子を分散させる分散媒を有することを特徴とする検査試薬。

【請求項19】

検体に含まれる測定対象物質の検出方法であって、
重力方向の下側に第１のリガンドが固定された容器内に、測定対象物質を含む検体と、アフィニティー粒子及び前記アフィニティー粒子を分散させる分散媒を有する検査試薬と、を添加する第１工程と、
前記アフィニティー粒子が、前記測定対象物質を介して前記第１のリガンドに結合するように、磁場を印加する第２工程と、
前記測定対象物質を介して前記第１のリガンドに結合していない前記アフィニティー粒子が、前記第１のリガンドから遠ざかるように、磁場を印加する第３工程と、を有し、
前記アフィニティー粒子が、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の粒子と、前記粒子に結合する第２のリガンドとを有し、
前記第１のリガンドと前記第２のリガンドが、前記測定対象物質に結合可能であることを特徴とする検出方法。

【請求項20】

前記第１のリガンドと前記第２のリガンドが、同じであることを特徴とする請求項１９に記載の検出方法。

【請求項21】

前記第１のリガンドと前記第２のリガンドが、異なることを特徴とする請求項１９に記載の検出方法。

【請求項22】

前記測定対象物質を介して前記第１のリガンドに結合した前記アフィニティー粒子からの信号を検出する工程を有することを特徴とする請求項１９乃至２１のいずれか１項に記載の検出方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、粒子、アフィニティー粒子、検査試薬、及び検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、磁性粒子は、多種多様な用途に使用されている。特に、医療分野においては、血液中の抗原や抗体などを測定して診断に用いるための検体検査用として、磁性粒子を使用している。具体的には、検体から抗原（抗体）を検出するために、抗原（抗体）と特異的に結合する抗体（抗原）を結合した磁性粒子、及び抗原（抗体）と特異的に結合する抗体（抗原）を固定化した平板を用いる方法がある。検体に抗原（抗体）が存在すると、抗原抗体反応により、抗体（抗原）を固定化した平板に、抗原（抗体）を介して磁性粒子が結合する。このような抗原（抗体）の検出方法においては、検出までの時間の短縮（すなわち、検出速度が速いこと）が求められている。

【0003】

検体検査に用いる粒子として、磁性体であるマグネタイトを用いる、磁性体含有樹脂微粒子が提案されている（特許文献１参照）。さらに、マグネタイトを含む固体微粒子と、高分子化合物を含む複合粒子が提案されている（特許文献２参照）。さらに、磁性粒子と磁性粒子の表面に被着したポリマーとを有する磁性マーカー粒子が提案されている（特許文献３）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特開２００４－０９９８４４号公報

【文献】特開２００９－３００２３９号公報

【文献】特開２０１２－１７７６９１号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明者らは、抗原と特異的に結合する抗体を固定化した、特許文献１～３に記載の粒子に相当する粒子と、抗原と特異的に結合する抗体を固定化した平板を用いて、検体から抗原を検出する検討を行った。その結果、検出速度が十分に得られない場合があることが判明した。

【0006】

したがって、本発明の目的は、検体から抗原や抗体などの測定対象物質を検出する際に、検出速度の速い粒子を提供することにある。また、本発明の別の目的は、粒子を使用するアフィニティー粒子、検査試薬、及び検出方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、磁性体を含有する磁性粒子を含む粒子であって、前記磁性粒子の表面に樹脂が存在し、前記粒子の体積平均粒径が、０．４μｍ以上１．５μｍ以下であり、前記粒子の密度が、５．１ｇ／ｃｍ^３以上１０．０ｇ／ｃｍ^３以下であり、前記樹脂が、リガンドを結合できる官能基を有することを特徴とする粒子に関する。

【0008】

また、本発明は、前記構成の粒子と、前記粒子に結合するリガンドとを有することを特徴とするアフィニティー粒子に関する。

【0009】

また、本発明は、前記構成のアフィニティー粒子と、アフィニティー粒子を分散させる分散媒を有することを特徴とする検査試薬に関する。

【0010】

さらに、本発明は、前記構成のアフィニティー粒子と、前記アフィニティー粒子に結合するリガンドを固定化した平板とを用いることを特徴とする検出方法に関する。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、検体から抗原や抗体などの測定対象物質を検出する際に、検出速度の速い粒子、前記粒子を使用するアフィニティー粒子、検査試薬、及び検出方法を提供することができる。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本発明の実施の形態について、詳細に述べる。各種の物性値は、特に断りのない限り、２５℃における値である。粒子の体積平均粒径、及び密度は、磁性粒子の表面に存在する樹脂も考慮した体積平均粒径、及び密度のことである。以下、検体から検出する測定対象物質として、抗原を例に挙げて説明する。

【0013】

検体から抗原を検出する際に、抗原と特異的に結合する抗体を結合した粒子と、抗原と特異的に結合する抗体を固定化した平板を用いる場合、平板を重力方向の下側に配置し、平板近くに磁力を発生させる磁石などを配置する。これにより、重力と磁力の作用で、平板近くに磁性粒子を含む粒子を引き寄せることが可能となる。そして、抗原抗体反応を利用することで、平板近くに引き寄せられた粒子は、抗体及び抗原を介して、平板に結合する。さらに、重力方向の上側に磁石などを配置することで、平板に結合していない粒子を除去する。これにより、平板に結合する粒子の存在を確認でき、検体から抗原を検出できる。

【0014】

このような方法で検体から抗原や抗体などの測定対象物質を検出する際、磁性粒子への測定対象物質以外のタンパク質の吸着を抑制して、検出感度を向上させることが重要である。そのために、粒子の表面に、リガンドを結合できる官能基を有する樹脂を設ける。

【0015】

しかし、このような粒子を用いても、粒子にかかる重力と磁力が十分ではないため、平板近くに粒子を引き寄せるのに時間を要してしまい、検出速度が十分に得られない場合があることが判明した。

【0016】

そこで、本発明者らは、粒子にかかる重力と磁力を十分にするために、粒子の体積平均粒径、及び密度を大きくすることが重要であると考えた。粒子の体積平均粒径を大きくすることで、粒子にかかる重力と磁力を十分にすることができ、粒子の密度を大きくすることで、粒子にかかる磁力を十分にすることができる。結果として、粒子の移動速度が速くなり、検出速度が十分に得られる。一方、粒子の体積平均粒径、及び密度が所定の範囲を満たさないと、粒子にかかる重力と磁力が十分ではなく、平板近くに粒子を引き寄せるのに時間を要してしまい、検出速度が十分に得られない。

【0017】

特許文献１に記載の粒子は、ｎｍサイズのマグネタイト微粒子を油性モノマーに分散させて、ミニエマルション重合により重合して形成される。粒子の密度は、１．３ｇ／ｃｍ^３であり、粒子にかかる磁力が十分ではなく、平板近くに粒子を引き寄せるのに時間を要してしまい、検出速度が十分に得られないと考えられる。

【0018】

特許文献２に記載の粒子は、有機溶媒に分散させた磁性体をせん断することで製造される。このようにして製造可能な粒子の体積平均粒径は、０．３μｍ程度と制限されてしまう。これにより、粒子にかかる重力と磁力が十分ではなく、平板近くに粒子を引き寄せるのに時間を要してしまい、検出速度が十分に得られないと考えられる。

【0019】

特許文献３に記載の磁性マーカー粒子は、粒子の密度が高々４．７３ｇ／ｃｍ^３であるため、平板近くに磁性粒子を引き寄せるのに時間を要してしまい、検出速度が十分に得られないと考えられる。また、磁性粒子中の磁性体の含有量が１００質量％未満であるため、飽和磁化が小さく、同様に、磁性粒子を引き寄せるのに時間を要してしまうと考えられる。

【0020】

＜粒子＞
粒子は、検体検査用であることが好ましい。粒子は、磁性体を含有する磁性粒子を含む。本発明において、粒子中の磁性粒子の領域は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察することにより特定される領域であると定義される。粒子が２０個程度視野に入る倍率で、ＴＥＭによる画像撮影を行う。ここで、ＴＥＭは、比重の異なる成分を、コントラストを持って撮影することができるため、磁性粒子中の磁性体の領域を同定することが可能となる。得られた画像について、最も外側にある磁性体と、その磁性体の対極にあり、かつ、最も外側にある磁性体を直線で結び、その直線の中心が円の中心になるように描いた円の領域を磁性粒子とする。

【0021】

磁性粒子に占める磁性体の含有率は、８０％以上１００％以下であり、９０％以上１００％以下であることが好ましい。磁性粒子に占める磁性体の含有率を大きくすることで、粒子にかかる重力と磁力が大きくなり、粒子の移動速度がさらに早くなることで、検出速度が向上する。ここで、磁性粒子に占める磁性体の含有率は、以下の方法により算出できる。

【0022】

磁性粒子に占める磁性体の含有率は、「粒子中の磁性体の含有率×（粒子の直径の平均値）^３÷（磁性粒子の直径の平均値）^３」の式から求める。式中の含有率、及び平均値は、以下のように算出される。少なくとも２０個の粒子について、画像解析装置（ルーゼックスＡＰ、ニレコ製）を用いて、粒子の直径と、上述のように決定した磁性粒子の直径とを測定し、それぞれの直径の平均値を算出する。粒子中の磁性体の含有率は、熱重量測定装置（ＴＧＡ）やＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ）を用いて、算出する。ＴＧＡを用いる場合は、有機成分を熱分解する前後の重量比から求められ、ＸＰＳを用いる場合は、磁性体に特有の元素の比から求められる。

【0023】

粒子の体積平均粒径は、０．４μｍ以上１．５μｍ以下である。体積平均粒径が１．５μｍを超えると、検出速度が十分に得られないことに加えて、単位質量あたりの表面積が小さくなるため、粒子において抗原抗体反応が可能な領域が小さくなり、抗原抗体反応の効率が低下してしまう場合がある。粒子の体積平均粒径は、０．７μｍ以上１．２μｍ以下であることが好ましく、０．７μｍ以上０．９μｍ以下であることがさらに好ましい。体積平均粒径は、動的光散乱法により測定できる。

【0024】

粒子の密度は、５．１ｇ／ｃｍ^３以上１０．０ｇ／ｃｍ^３以下であり、５．１ｇ／ｃｍ^３以上６．５ｇ／ｃｍ^３以下であることが好ましい。密度は、乾式自動密度計により測定できる。

【0025】

（磁性体）
磁性体とは、磁場の印加により磁化される材料のことである。磁性体は、金属、及び金属酸化物からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。金属としては、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどが挙げられる。金属酸化物としては、四酸化三鉄（Ｆｅ_３Ｏ_４）、三酸化二鉄（γ－Ｆｅ_２Ｏ_３）、フェライトなどが挙げられる。なかでも、磁性体は、鉄、ニッケル、及びマグネタイトからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。鉄、ニッケルは、密度が大きく、マグネタイトは、飽和磁化が大きく、かつ、残留磁化が小さい。これにより、粒子にかかる重力や磁力が大きくなり、検出速度が向上する。さらに、磁性体は、鉄、又はニッケルであることが好ましい。

【0026】

ここで、磁化とは、磁性体に外部磁場をかける際に、その磁性体が分極して磁石となる現象のことであり、飽和磁化とは、磁場の強さとともに増大する磁化が飽和する値のことである。また、残留磁化とは、磁性体に外部磁場をかけた後に磁場をなくす場合に、磁性体に残留する磁化のことである。

【0027】

磁性体が鉄を含む場合、磁性体に占める鉄原子の含有率は、磁性体の密度を向上させることができるため、８０％以上１００％以下であることが好ましい。磁性体がニッケルを含む場合、磁性体に占めるニッケル原子の含有率は、磁性体の密度を向上させることができるため、８０％以上１００％以下であることが好ましい。これらの含有率は、磁性体に占める全原子数（ｍｏｌ）に対する、鉄原子数又はニッケル原子数（ｍｏｌ）を示している。

【0028】

磁性粒子に占める磁性体の個数は、１個以上であることが好ましい。磁性粒子に占める磁性体の個数が２個以上である場合、磁性体の粒径は、５０ｎｍ以下であることが好ましく、５ｎｍ以上３０ｎｍ以下であることが好ましい。磁性粒子に占める磁性体の個数が１個である場合、０．１μｍ以上であることが好ましく、１．２μｍ以下であることがさらに好ましい。なかでも、磁性粒子に占める磁性体の個数は、１個であり、かつ、磁性粒子に占める磁性体の含有率は、１００％であることが好ましい。すなわち、磁性粒子は、単一粒子であることが好ましい。これにより、粒子の密度が大きくなり、検出速度が向上する。

【0029】

粒子の検出速度を向上させるためには、粒子の沈降速度を向上させることが好ましい。粒子の沈降速度を算出する式としては、ストークスの式（Ｖ＝｛ｇ（ρ_ｐ－ρ_ｆ）Ｄ^２｝／１８μ）が知られている。Ｖは沈降速度（ｃｍ／ｓ）、ｇは重力加速度（９８０．７ｃｍ／ｓ^２）、ρ_ｐは粒子の密度（ｇ／ｃｍ^３）、ρ_ｆは分散媒の密度（ｇ／ｃｍ^３）を表す。また、Ｄは粒径（ｃｍ）、μは分散媒の粘度（ｇ／ｃｍ・ｓ）を表す。ストークスの式より、粒子の沈降速度Ｖは、粒径の２乗に比例して大きくなる。

【0030】

ストークスの式より求められる沈降速度は、１．０Ｅ－０５（ｃｍ／ｓ）以上であることが好ましい。沈降速度が１．０Ｅ－０５未満であると、検出に時間を要し、検出速度が十分に得られない場合がある。沈降速度は、５．０Ｅ－０５（ｃｍ／ｓ）以上であることがより好ましく、１．０Ｅ－０４（ｃｍ／ｓ）以上であることがさらに好ましい。

【0031】

（樹脂）
以下、「（メタ）アクリレート」と記載した場合は、「アクリレート、又はメタクリレート」を表すものとする。

【0032】

樹脂は、リガンドを結合できる官能基を有する。リガンドを結合できる官能基は、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、エポキシ基、マレイミド基、及びスクシンイミジル基からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。なかでも、リガンドを結合できる官能基は、カルボキシル基であることが好ましい。

【0033】

樹脂の重合に際し、（メタ）アクリル酸などのカルボキシル基を有するモノマー；（メタ）アクリルアミドなどのアミノ基を有するモノマー；グリシジル（メタ）アクリレートなどのエポキシ基を有するモノマー；Ｎ－スクシンイミジルアクリレートなどのスクシンイミジル基を有するモノマー；を用いることが好ましい。

【0034】

樹脂の重合に際し、上記モノマー以外に、グリセロール（メタ）アクリレート、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレートなどの親水性基を有する（メタ）アクリレート類；スチレン、ｐ－クロロスチレン、α－メチルスチレンなどのスチレン類；なども用いることができる。磁性粒子への非特異的な吸着を抑制するために、親水性基を有する（メタ）アクリレート類を用いることが好ましい。

【0035】

また、リガンドを結合できる官能基は、樹脂の重合の後に付加することも可能である。例えば、（メタ）アクリル酸などのカルボキシル基を有するモノマーを重合して得られる樹脂に、メルカプトジオールを付加することでチオール基を導入できる。また、重合して得られる樹脂に、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）マレイミドを付加することでマレイミド基を導入できる。

【0036】

樹脂は、下記式（２）及び（３）の繰り返し単位を有することが好ましい。

【0037】

【化1】

【0038】

【化2】

【0039】

樹脂は、スチレン、及びアクリル酸に由来するユニットを有することが好ましい。ここで、ユニットとは、１つのモノマーに対応する単位構造のことを意味する。

【0040】

樹脂は、シロキサン結合を有することが好ましい。すなわち、樹脂の重合に際し、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、ｐ－スチリルトリメトキシシラン、３－メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３－メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３－メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３－メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３－アクリロキシプロピルトリメトキシシランなどの有機シランを含むモノマーを用いることが好ましい。

【0041】

樹脂の重量平均分子量は、１００００以上であることが好ましく、１０００００以下であることがさらに好ましい。また、４００００以上１０００００以下であることがより好ましく、６００００以上８００００以下であることがさらに好ましい。重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定できる。

【0042】

＜アフィニティー粒子＞
本発明のアフィニティー粒子は、上述の構成の粒子と、粒子に結合するリガンドとを有する。リガンドとは、測定対象物質が有する受容体に特異的に結合する化合物のことである。リガンドが測定対象物質と結合する部位は、決まっており、選択的又は特異的に高い親和性を有する。測定対象物質とリガンドの組み合わせの例としては、抗原と抗体、酵素タンパク質とその基質、ホルモンや神経伝達物質などのシグナル物質とその受容体などが挙げられる。リガンドは、抗原及び抗体のいずれかであることが好ましい。また、アフィニティー粒子には１種のリガンドが結合していてもよいし、複数種のリガンドが結合していてもよい。複数種のリガンドが結合したアフィニティー粒子を用いることで、複数種の測定対象物質を検出することが容易になる。また、測定対象物質がリガンドに認識される認識部位が複数ある場合、複数の認識部位に応じた複数種のリガンドをアフィニティー粒子に結合させておくとよい。

【0043】

粒子にリガンドを固定化し、アフィニティー粒子とするためには、粒子が有する、リガンドが結合可能な官能基を利用し、化学結合、物理吸着などの従来公知の方法を適用することができる。特に、粒子にリガンドをアミド結合させる場合は、１－［３－（ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド］などの触媒を用いることができる。

【0044】

アフィニティー粒子は、リガンドを固定化した平板を用い、抗原抗体反応によって平板に測定対象物質を介して粒子を結合させ、磁力により結合していない粒子を平板近くから除去し、平板に結合した粒子を検出する方法に用いられることが好ましい。

【0045】

＜検査試薬＞
検査試薬として、上記構成のアフィニティー粒子と、アフィニティー粒子を分散させる分散媒を有する。アフィニティー粒子の含有量は、分散媒全質量を１００質量％として、０．００１質量％以上２０質量％以下であることが好ましく、０．０１質量％以上１０質量％以下であることがさらに好ましい。検査試薬には、溶剤やブロッキング剤などを含んでいてもよい。溶剤やブロッキング剤などは、２種以上を組み合わせてもよい。溶剤としては、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液、アンモニア緩衝液などの緩衝液が挙げられる。

【0046】

＜検出方法＞
本実施形態において、検体に含まれる測定対象物質の検出方法は以下の工程を少なくとも有する。

【0047】

（第１工程）
第１工程では、重力方向の下側に第１のリガンドが固定された容器内に、測定対象物質を含む検体と、アフィニティー粒子及びアフィニティー粒子を分散させる分散媒を有する検査試薬と、を添加する。

【0048】

（第２工程）
第２工程では、アフィニティー粒子が測定対象物質を介して第１のリガンドに結合するように、磁場を印加する。

【0049】

（第３工程）
第３工程では、測定対象物質を介して第１のリガンドに結合していないアフィニティー粒子が、第１のリガンドから遠ざかるように、磁場を印加する。

【0050】

本実施形態に係る検出方法において、第１のリガンド、第２のリガンドは測定対象物質に結合可能であればよく、前述のリガンドを用いることができる。第１のリガンド、第２のリガンドとは同じであってもよいし、異なっていてもよい。

【0051】

また、第１のリガンドは、容器（筐体）内の、重力方向の下側に具備した平坦な面や、容器内に設けた平板上に設けることができる。検出方法の一例は以下の工程を有する。
（１）重力方向の下側に、アフィニティー粒子と結合するリガンドを固定化した平板を具備する容器内に、検体、及び上記構成の検査試薬を入れる第１工程。
（２）平板近くに磁石を配置させて検査試薬中のアフィニティー粒子を平板近くに引き寄せる第２工程。
（３）並びに重力方向の上側に磁石を配置させて、平板に結合していないアフィニティー粒子を除去する第３工程を有する。さらに、測定対象物質を介して第１のリガンドに結合したアフィニティー粒子からの信号を検出する工程を実行することで、測定対象物質の有無や濃度を測定することができる。抗原抗体反応により、検体中の測定対象物質を介して、平板に粒子が結合することで、検体中の測定対象物質の存在（有無や濃度）を確認できる。

【実施例】

【0052】

以下、実施例、及び比較例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、下記の実施例によって何ら限定されるものではない。なお、成分量に関して「部」、及び「％」と記載しているものは、特に断らない限り質量基準である。

【0053】

＜実施例１＞
３００ｍＬのフラスコに、１０ｍＭのトリス緩衝液（東京化成工業株式会社製）１００ｍＬ、磁性体である鉄粒子（ＮＰ－ＦＥ－１、ＥＭジャパン株式会社製）１．０ｇを混合し、２５℃で、２０分間撹拌した。ここで、トリス緩衝液のｐＨは、塩酸で調整し、９．０であった。また、鉄粒子の体積平均粒径は、０．８μｍであった。得られた溶液に、ドーパミン塩酸塩（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）１．０ｇを添加して、２５℃で一晩撹拌し、分散液を得た。

【0054】

その後、分散液を遠心分離して、上澄みを除去してイオン交換水で洗浄する操作を３回行い、沈殿物にｐＨ＝７．４のリン酸塩緩衝液（キシダ化学株式会社製）を加え、リン酸塩緩衝液に置換した分散液を得た。得られた分散液に、樹脂である、Ｎ－ビニルピロリドン－アクリル酸共重合体（ポリマーソース製）１．０ｇを溶かした。ここで、Ｎ－ビニルピロリドン－アクリル酸共重合体の重量平均分子量は、６００００であり、ビニルピロリドンに対応する単位構造の合計のモル量と、アクリル酸に対応する単位構造の合計のモル量との比は、４：６であった。

【0055】

樹脂を含む分散液に、３－メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（ＬＳ－３３８０、信越化学工業株式会社製）０．４ｇ、及びスチレン（キシダ化学株式会社製）１．３ｇを添加し、２５℃で窒素を吹き込みながら、１５分間撹拌し、乳濁液を得た。得られた乳濁液を、オイルバスを用いて７０℃に加熱した。その加熱した乳濁液に、ペルオキソ二硫酸カリウム（和光純薬工業株式会社（現：富士フイルム和光純薬株式会社）製）０．３ｇをｐＨ＝７．４のリン酸塩緩衝液（キシダ化学株式会社製）１０ｍＬに溶かした溶液を添加した。７０℃で７時間、乳濁液を撹拌した後、乳濁液の温度を２５℃に戻した。その後、乳濁液を遠心分離し、磁性粒子の表面に樹脂が存在する粒子を回収し、上澄みを捨て、イオン交換水で再分散させた。この遠心分離による粒子の回収と、イオン交換水による再分散の操作を３回行い、粒子の含有量が１．０％である粒子１の分散液を得た。

【0056】

＜実施例２＞
実施例１の粒子の分散液の調製において、樹脂を含む分散液に添加する材料を、スチレン（キシダ化学株式会社製）のみに変更した。それ以外は、実施例１の粒子の分散液の調製と同様の手順で、粒子の含有量が１．０％である粒子２の分散液を得た。

【0057】

＜実施例３＞
３００ｍＬのフラスコに、１０ｍＭのトリス緩衝液（東京化成工業株式会社製）１００ｍＬ、磁性体である鉄粒子（ＮＰ－ＦＥ－１、ＥＭジャパン株式会社製）１．０ｇを混合し、２５℃で、２０分間撹拌した。ここで、トリス緩衝液のｐＨは、塩酸で調整し、９．０であった。また、鉄粒子の体積平均粒径は、０．８μｍであった。得られた溶液に、ドーパミン塩酸塩（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）１．０ｇを添加して、２５℃で一晩撹拌し、分散液を得た。

【0058】

その後、分散液を遠心分離して、上澄みを除去してイオン交換水で洗浄する操作を３回行い、沈殿物にイオン交換水を加え、イオン交換水に置換した分散液を得た。得られた分散液に、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ－Ｋ３０、キシダ化学株式会社製）１．０ｇ、及び１－アミノ－３，６，９，１２，１５，１８－ヘキサオキサヘンイコサン－２１－酸２．０ｇを混合し、一晩２５℃で撹拌し、分散液を得た。その分散液を遠心分離し、磁性粒子の表面に樹脂が存在する粒子を回収し、上澄みを捨て、イオン交換水で再分散させた。この遠心分離による粒子の回収と、イオン交換水による再分散の操作を３回行い、粒子の含有量が１．０％である粒子３の分散液を得た。樹脂の重量平均分子量は、６００００であった。

【0059】

＜実施例４＞
１Ｌのセパラブルフラスコに、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５％とノニオン性乳化剤（エマルゲン１５０、花王株式会社製）０．５％を含有する水溶液７５０ｇ、及び鉄粒子（ＮＰ－ＦＥ－１、ＥＭジャパン株式会社製）３０ｇを順に投入し、溶液を得た。得られた溶液をホモジナイザーで分散し、７０℃に加熱した。

【0060】

得られた溶液に、水溶液７５ｇに、シクロへキシルメタクリレート１４ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート１ｇ、及びｔ－ブチルペルオキシ－２－エチルヘキサネート（パーブチルＯ、日本油脂製）０．３ｇを入れて分散させた分散液を、１時間かけて滴下した。ここで、水溶液は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５％とノニオン性乳化剤（エマルゲン１５０、花王株式会社製）０．５％を含有する。これにより、磁性粒子の表面に、樹脂を含む第１層を有する粒子を含む液体を得た。

【0061】

得られた液体に、水溶液７５ｇに、シクロへキシルメタクリレート１４ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート１ｇ、及びｔ－ブチルペルオキシ－２－エチルヘキサネート（パーブチルＯ、日本油脂株式会社（現：日油株式会社）製）０．３ｇを入れて分散させた分散液を、１時間かけて滴下した。ここで、水溶液は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５％とノニオン性乳化剤（エマルゲン１５０、花王株式会社製）０．５％を含有する。これにより、磁性粒子の表面に、樹脂を含む２層（第１層、第２層）が存在する粒子を含む液体を得た。２層に含まれる樹脂の重量平均分子量は、８００００であった。

【0062】

得られた液体を８０℃に昇温した後、２時間重合を続けて、反応を完了させて、分散液を得た。その分散液を遠心分離し、磁性粒子の表面に樹脂が存在する粒子を回収し、上澄みを捨て、イオン交換水で再分散させた。この遠心分離による粒子の回収と、イオン交換水による再分散の操作を３回行い、粒子の含有量が１．０％である粒子４の分散液を得た。

【0063】

＜実施例５＞
実施例３の粒子の分散液の調製において、磁性体の種類を、ニッケル粒子に変更した。ここで、ニッケル粒子の体積平均粒径は、０．４５μｍであった。それ以外は、実施例３の粒子の分散液の調製と同様の手順で、粒子の含有量が１．０％である粒子５の分散液を得た。

【0064】

＜比較例１＞
実施例３の粒子の分散液の調製において、磁性体の種類を、マグネタイト粒子に変更した。ここで、マグネタイト粒子の体積平均粒径は、０．７μｍであった。それ以外は、実施例３の粒子の分散液の調製と同様の手順で、粒子の含有量が１．０％である粒子６の分散液を得た。

【0065】

＜比較例２＞
ＦｅＣｌ_３及びＦｅＣｌ_２を水に溶解させて溶解液とした。この溶解液を２５℃に維持したまま、激しく撹拌した。その後、この溶解液にアンモニア水を加えて、マグネタイトの懸濁液を得た。得られた懸濁液に、オレイン酸を加え、７０℃で１時間、１１０℃で１時間、懸濁液を撹拌し、スラリーを得た。このスラリーを多量の水で洗浄し、減圧乾燥することで、粉末の疎水化マグネタイトを得た。得られた疎水化マグネタイトの平均粒径は、１１ｎｍであり、分子量分布は、１．３であった。ここで、疎水化マグネタイトの平均粒径は、透過型電子顕微鏡を用いて算出した値である。

【0066】

次いで、クロロホルム４ｇ中に、スチレン２ｇと疎水化マグネタイト３ｇを秤量して、混合液１を得た。水１２ｇに、ドデシル硫酸ナトリウム０．０１ｇを溶解させて、混合液２を得た。混合液１及び混合液２を混合して混合液３として、この混合液３を、撹拌式ホモジナイザーにて冷却しながら１０分間せん断することで、複数の磁性体を含有する磁性粒子を含む液体を得た。

【0067】

この磁性粒子を含む液体をエバポレータにて減圧処理することで、分散媒からクロロホルムを優先的に分留した。得られた磁性粒子を窒素バブリングにより脱酸素した後、重合開始剤０．０１ｇを添加し、７０℃、６時間でスチレンを重合し、磁性粒子の表面に樹脂が存在する粒子７の分散液（粒子７の含有量が１．０％）を得た。重合開始剤としては、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライドを用いた。樹脂の重量平均分子量は、７００００であった。

【0068】

＜比較例３＞
ＦｅＣｌ_３及びＦｅＣｌ_２を水に溶解させて溶解液とした。この溶解液を２５℃に維持したまま、激しく撹拌した。その後、この溶解液にアンモニア水を加えて、マグネタイトの懸濁液を得た。得られた懸濁液に、オレイン酸を加え、７０℃で１時間、１１０℃で１時間、懸濁液を撹拌し、スラリーを得た。このスラリーを多量の水で洗浄し、減圧乾燥することで、粉末の疎水化マグネタイトを得た。

【0069】

得られた疎水化マグネタイトに、ポリエチレンオキサイド鎖を有する非イオン性界面活性剤（Ｅｍｕｌｇｅｎ １１５０Ｓ－７０、花王株式会社製）０．３ｇを溶解した水溶液を加えて、ソニケーションした。これにより、疎水化マグネタイト粒子表面に、非イオン性界面活性剤を吸着させることで、粒子表面に親水性を付与したマグネタイト粒子のコロイド溶液を得た。このコロイド溶液に、ＨＣｌ溶液５６μＬに、イオン性界面活性剤であるアミノウンデカン１０μＬを溶解させた水溶液を添加し、粒子表面に非イオン性界面活性剤及びイオン性界面活性剤の両方を吸着させたマグネタイト粒子のコロイド溶液を得た。

【0070】

得られたコロイド溶液に、スチレン２．７ｇ、アクリル酸０．３ｇ、重合開始剤０．０２５ｇ、ジビニルベンゼン０．０８ｇ、及びジエチルエーテル２．５ｇを添加し、ソニケーションを行い、乳化液を得た。ここで、重合開始剤として、アゾビスイソブチロニトリルを用い、ジビニルベンゼンは、架橋剤として用いた。

【0071】

乳化液に、全量が１２５ｇとなるように水を添加し、ソニケーションした。その後、３５０ｒｐｍで撹拌しながら加熱し、乳化液の温度が７０℃に達したところで、純水５ｍＬに、水溶性の重合開始剤（Ｖ－５０、和光純薬工業株式会社（現：富士フイルム和光純薬株式会社）製）５０ｍｇを溶かした水溶液を添加した。その後、１２時間の重合反応を行い、磁性粒子の表面に樹脂が存在する粒子１０の分散液（粒子の含有量が１．０％）を得た。樹脂の重量平均分子量は、６００００であった。

【0072】

［磁性粒子中の磁性体の含有率］
磁性粒子に占める磁性体の含有率は、「粒子中の磁性体の含有率×（粒子の直径の平均値）^３÷（磁性粒子の直径の平均値）^３」の式から求めた。式中の含有率、及び平均値は、以下のように算出した。少なくとも２０個の粒子について、画像解析装置（ルーゼックスＡＰ、ニレコ製）を用いて、粒子の直径と、磁性粒子の直径とを測定し、それぞれの直径の平均値を算出した。粒子中の磁性体の含有率は、Ｘ線光電子分光分析（ＸＰＳ）を用いて、算出した。

【0073】

［体積平均粒径の測定方法］
粒子の体積平均粒径は、粒子の分散液を純水で２５０倍（体積基準）に希釈した水溶液を測定サンプルとし、動的光散乱法による粒度分布計（ナノトラックＵＰＡ－ＥＸ１５０、日機装株式会社製）を使用して、測定した値である。測定条件は、ＳｅｔＺｅｒｏ：３０ｓ、測定回数：３回、測定時間：１８０秒、形状：非球形、屈折率：１．５１である。

【0074】

［密度の測定方法］
磁性粒子の密度は、乾式自動密度計（アキュピックＩＩ １３４０、株式会社島津製作所製）を使用して、測定した値である。測定は、温度２３℃で行った。

【0075】

測定装置は、ヘリウムガス導入管が接続された試料室、及びヘリウムガス排出管が接続された膨張室を有する。また、試料室と膨張室は、連結管によって接続されている。ヘリウムガス導入管、連結管、及びヘリウムガス排出管は、いずれもストップバルブを備える。試料室は、室内の圧力を測定する圧力計を有する。

【0076】

上記の測定装置を用いて、具体的には以下のように測定した。まず、標準球を用いて、試料室の容積（Ｖ_ＣＥＬＬ）、及び膨張室の容積（Ｖ_ＥＸＰ）を測定した。試料としては、４０℃で２４時間減圧乾燥したものを用いた。圧力は、ゲージ圧であり、絶対圧力から周囲圧力を差し引いた圧力である。試料室に試料を入れ、試料室のヘリウムガス導入管、連結管、及び膨張室のヘリウムガス排出管を通してヘリウムガスを２時間流して、測定装置内をヘリウムガスで置換した。次に、連結管、及びヘリウムガス排出管のストップバルブを閉じ、試料室に、ヘリウムガス導入管からヘリウムガスを１３４ｋＰａになるまで導入し、ヘリウムガス導入管のストップバルブを閉じた。ヘリウムガス導入管のストップバルブを閉じてから５分後に試料室の圧力（Ｐ_１）を測定した。さらに、連結管のストップバルブを開いてヘリウムガスを膨張室に移送し、その際の圧力（Ｐ_２）を測定した。

【0077】

以下の式（４）から、試料の体積（Ｖ_ＳＡＭＰ）を算出し、得られた値、及び試料の重量（Ｗ_ＳＡＭＰ）を用いて、試料の密度ρ（Ｗ_ＳＡＭＰ／Ｖ_ＳＡＭＰ）を求めた。
Ｖ_ＳＡＭＰ＝Ｖ_ＣＥＬＬ－Ｖ_ＥＸＰ［（Ｐ_１－Ｐ_２）－１］ 式（４）

【0078】

［重量平均分子量の測定方法］
樹脂の重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により、以下のようにして測定した。２５℃で２４時間かけて、樹脂をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した。得られた溶液を、メンブレンフィルターでろ過して、サンプル溶液を得た。サンプル溶液は、ＴＨＦに可溶な成分の濃度が約０．３％となるように調整した。このサンプル溶液を用いて、以下の条件で樹脂の重量平均分子量を測定した。
装置：Ｗａｔｅｒｓ２６９５ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｍｏｄｕｌｅ、Ｗａｔｅｒｓ製ＲＩ検出器：２４１４ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ｗａｔｅｒｓ製
カラム：ＫＦ－８０６Ｍの４連、昭和電工製
溶離液：テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
オーブン温度：４０℃
試料注入量：１００μＬ

【0079】

樹脂の重量平均分子量の算出にあたっては、標準ポリスチレン樹脂（ＴＳＫスタンダード ポリスチレン Ｆ－８５０、Ｆ－４５０、Ｆ－２８８、Ｆ－１２８、Ｆ－８０、Ｆ－４０、Ｆ－２０、Ｆ－１０、Ｆ－４、Ｆ－２、Ｆ－１、Ａ－５０００、Ａ－２５００、Ａ－１０００、Ａ－５００、東ソー製）を用いて作成した分子量校正曲線を使用した。

【0080】

＜アフィニティー粒子の作製＞
実施例及び比較例の各磁性粒子に、抗ＣＲＰ抗体を以下のように結合させた。ここで、ＣＲＰとは、Ｃ－Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎの略で、体内で炎症が起きたり、組織が破壊されたりする場合に、血中に現れるタンパク質のことである。

【0081】

まず、磁性粒子の分散液を、１５０００ｒｐｍ（２０４００ｇ）、１５分間遠心して、磁性粒子を沈殿させた。上澄みを除去した後、磁性粒子のペレットを、ＭＥＳ緩衝液で再分散させ、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）、及びＮ－ヒドロキシスクシンイミドを加えた。その後、２５℃で３０分間撹拌し、遠心分離により磁性粒子を回収した。回収した磁性粒子をＭＥＳ緩衝液で洗浄し、ＭＥＳ緩衝液で再分散させて、抗体の終濃度が２ｍｇ／ｍＬとなるように抗ＣＲＰ抗体を加えた。その後、２５℃で６０分間撹拌し、遠心分離により磁性粒子を回収し、磁性粒子をＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄し、抗ＣＲＰ抗体が結合したアフィニティー粒子の分散液を得た。

【0082】

磁性粒子に抗体が結合していることは、抗体を加えたＭＥＳ緩衝液中の抗体の濃度の減少量を、タンパク質を比色定量することが可能なＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイで確認した。

【0083】

［非特異吸着性の確認］
実施例のアフィニティー粒子の分散液を用いて、アフィニティー粒子の非特異吸着性の確認を行った。アフィニティー粒子の分散液５０μＬに、リン酸生理食塩水で５０倍に希釈した血清溶液５１μＬを添加し、添加の前後で、アフィニティー粒子への非特異吸着による粒子の凝集の有無を目視で確認したところ、顕著な凝集は見られなかった。

【0084】

［検出感度の確認］
実施例のアフィニティー粒子の分散液を用いて、アフィニティー粒子の検出感度の確認を行った。抗ＣＲＰ抗体が結合した平板を６ｍＬのバイアル瓶の下部にセットした。また、アフィニティー粒子の含有量が０．０１％の水溶液をバイアル瓶に入れ、アフィニティー粒子を分散させた。バイアル瓶に、抗ＣＲＰ抗原を３０μＬ添加し、バイアル瓶の下部に５分間ネオジム磁石を当てた後、ネオジム磁石を外して、バイアル瓶を１分間静置した。次に、バイアル瓶の上部に１分間ネオジム磁石を当て、上澄みのアフィニティー粒子を除去した後、抗ＣＲＰ抗体が結合した平板を取り出し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により、平板上の抗体に、抗原を介してアフィニティー粒子が結合していることを確認した。

【0085】

＜評価＞
本発明においては、下記の評価の評価基準で、４を許容できるレベルとし、３、２、又は１を許容できないレベルとした。表１に評価結果を記載する。

【0086】

（検出速度）
アフィニティー粒子の含有量が０．０１％の水溶液１０ｍＬをバイアル瓶に入れ、アフィニティー粒子を分散させた。バイアル瓶の下部に６０秒間ネオジム磁石を当てた後、ネオジム磁石を外して、バイアル瓶中を粒子が沈降する様子を目視で観察した。アフィニティー粒子が沈降しやすいほど、沈降したアフィニティー粒子の濃度の検出速度が速いことを意味する。
４：アフィニティー粒子は８０秒ですべて沈降し、上澄みは清澄であった。
３：アフィニティー粒子は１２０秒ですべて沈降し、上澄みは清澄であった。
２：アフィニティー粒子は１２０秒で一部沈降し、上澄みの一部にアフィニティー粒子が見られた。
１：アフィニティー粒子は１２０秒で一部沈降し、上澄みの全体にアフィニティー粒子が見られた。

【0087】

【表1】