特許 7581183 ユニバーサルドナー細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-01

(45)【発行日】2024-11-12

(54)【発明の名称】ユニバーサルドナー細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20241105BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20241105BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20241105BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20241105BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241105BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20241105BHJP

   C12N 5/074 20100101ALI20241105BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20241105BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241105BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20241105BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20241105BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20241105BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241105BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241105BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20241105BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241105BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/85 Z

C12N15/55

C07K19/00

C07K16/28

C12N5/071

C12N5/074

C12N5/0735

C12N5/10

C12N9/22

A61K35/12

A61P37/06

A61P43/00 111

A61K48/00

A61K35/545

C12N15/12 ZNA

【請求項の数】 19

(21)【出願番号】P 2021512530

(86)(22)【出願日】2019-09-07

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-12-16

(86)【国際出願番号】 IB2019057555

(87)【国際公開番号】W WO2020049535

(87)【国際公開日】2020-03-12

【審査請求日】2022-09-05

(31)【優先権主張番号】62/728,529

(32)【優先日】2018-09-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】518370079

【氏名又は名称】クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100092624

【弁理士】

【氏名又は名称】鶴田 準一

(74)【代理人】

【識別番号】100114018

【弁理士】

【氏名又は名称】南山 知広

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100108903

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 和広

(72)【発明者】

【氏名】アリレザ レザニア

(72)【発明者】

【氏名】トニー ダブリュ．ホー

(72)【発明者】

【氏名】レベッカ ラモス－ザヤス

【審査官】田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／０７９６７３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Nature，2017年，Vol.543，p.113-117，doi:10.1038/nature21405

【文献】Nature Biotechnology，2017年，Vol.35, No.8，p.765-772，doi:10.1038/nbt.3860

【文献】BioTechniques，2014年，Vol.57，p.115-124，doi 10.2144/000114196

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ ５／０７１

Ｃ１２Ｎ ５／０７４

Ｃ１２Ｎ ５／０７３５

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｎ ９／２２

Ａ６１Ｋ ３５／１２

Ａ６１Ｐ ３７／０６

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３５／５４５

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ユニバーサルドナー細胞を作製する方法であって、
前記細胞のゲノムにおいて、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）である免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドの挿入を導入することによって、細胞を遺伝子改変することを含む方法であって、
ここで、前記遺伝子改変が、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座位内の部位を標的化するガイドＲＮＡを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ系を送達することを含み、そして前記免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドは、（ａ）前記Ｂ２Ｍ遺伝子座位内の部位の左に位置する領域と配列相同性を有する配列番号１３で示されるヌクレオチド配列及び（ｂ）前記Ｂ２Ｍ遺伝子座位内の部位の右に位置する領域と配列相同性を有する配列番号１９で示されるヌクレオチド配列と隣接し、ここで前記Ｂ２Ｍ遺伝子座位は、前記標的部位で切断され、且つＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドが、前記Ｂ２Ｍ遺伝子座位内の部位の５０塩基対以内で前記Ｂ２Ｍ遺伝子座位に挿入され、それにより前記Ｂ２Ｍ遺伝子を破壊し、そしてユニバーサルドナー細胞を作製し、
前記遺伝子改変された細胞が、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、方法。

【請求項2】

前記ユニバーサルドナー細胞が、未改変細胞と比較して免疫回避及び／又は細胞生存の増加を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ガイドＲＮＡによって標的化される部位は、配列番号１～３の少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記ガイドＲＮＡによって標的化される部位は、配列番号２の核酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドが外来プロモーターをさらに含み、前記免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドが前記外来プロモーターに作動可能に連結される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記外来プロモーターが、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、又は細胞型特異的プロモーターである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記外来プロモーターがＣＡＧプロモーターである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドがベクターを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ベクターが、配列番号３３で示される核酸配列を含むプラスミドベクターである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｎ末端核移行シグナル（ＮＬＳ）及び／又はＣ末端ＮＬＳを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記ガイドＲＮＡが、１：１の重量比で存在する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として、１つ以上のガイドＲＮＡと予め複合体を形成する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記ユニバーサルドナー細胞が哺乳動物細胞である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記ユニバーサルドナー細胞が、系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞に分化することができる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記系列限定前駆細胞が、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、間葉系前駆細胞、筋肉前駆細胞、芽球細胞、又は神経前駆細胞である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記完全に分化した体細胞が、膵ベータ細胞などの内分泌性細胞、上皮細胞、内胚葉細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血液細胞、又は免疫系細胞である、請求項１７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１８年９月７日に出願された米国仮特許出願第６２／７２８，５２９号明細書の利益を主張するものであり、その開示は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、遺伝子編集の分野に関し、いくつかの実施形態では、複数の対象に適合する細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞を作製するための遺伝子改変に関する。

【背景技術】

【0003】

ＨＬＡ適合、抗体によりＴ細胞活性化を誘発する経路の遮断、免疫抑制剤のカクテルの使用、及び自己細胞療法を含む、移植された細胞又は生着された細胞の同種拒絶を克服するために、様々な手法が提案されてきた。移植片拒絶を弱める別の戦略は、移植された細胞又は生着された細胞とレシピエントの間の同種間相違の最小化を含む。６番染色体上のヒト主要組織適合抗原複合体に位置する遺伝子によってコードされる分子である細胞表面に発現されるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、免疫拒絶の主要なメディエーターである。ドナーと対象の間の単一のＨＬＡ遺伝子の不一致が、強い免疫応答を引き起こし得る（Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｕｅｒ Ｋ．ｅｔ ａｌ．「Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ＨＬＡ－Ｂ４４」，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，１９９０，３２３：１８１８－１８２２）。ＨＬＡ遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）及びＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）に分類される。ＭＨＣ－Ｉ遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ）は、ほとんど全ての組織型において発現され、「非自己」の抗原がプロセシングされたペプチドをＣＤ８＋Ｔ細胞に提示し、それにより細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞へのそれらの活性化を促進する。「非自己」ＭＨＣ－Ｉ分子を発現する移植された細胞又は生着された細胞は、これらの細胞に向けられる強い細胞性免疫応答を引き起こすことになり、最終的に、活性化された細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞によるそれらの消滅をもたらす。ＭＨＣ－Ｉタンパク質は、本質的に、小胞体中のベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と関連し、これは細胞表面上で機能的ＭＨＣ－Ｉ分子を形成するのに必須である。

【0004】

ＭＨＣ－Ｉ遺伝子の広範な細胞での発現とは対照的に、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子の発現は、樹状細胞、マクロファージ、及びＢ細胞などの抗原提示細胞に制限される。ＨＬＡ抗原遺伝子は、ヒトゲノムにおいて観察される最も多型の遺伝子である（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ Ｐ．，「ＨＬＡ ｍａｔｃｈｉｎｇ ｆｏｒ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ－－ｈｏｗ ｍｕｃｈ ｉｓ ｅｎｏｕｇｈ？」Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，２００１，３４５：１８４２－１８４４）。どのＨＬＡ遺伝子型とも適合する「ユニバーサルドナー」細胞の作製は、免疫拒絶及び免疫回避のための既存の方法論の関連する経済的コストを解決し得る代替の戦略を提供する。

【0005】

そのようなユニバーサルドナー細胞の系列を作製するために、先行する１つの手法は、ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩクラス遺伝子の発現を機能的に破壊した。これは、例えば、ＭＨＣ－Ｉ軽鎖、Ｂ２Ｍをコードする両方の遺伝子アレルの遺伝子破壊により活性化され得る。得られたＢ２Ｍ ＫＯ細胞株及びその派生体は、表面ＭＨＣ－Ｉの著しい減少、それにより同種のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する免疫原性の低減を呈すると予想されるであろう。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）で標的化する手法を使用して、Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン２中の数ヌクレオチドの欠失によってＢ２Ｍ欠損ｈＥＳＣ株を作製してきた（Ｌｕ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，「Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｈｙｐｏｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ ２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ」，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ．２０１３，９：８０６－８１３）。Ｂ２Ｍ標的化ｈＥＳＣ株は表面ＨＬＡ－Ｉ欠損であると思われたが、それらは、依然としてＢ２Ｍ及びＭＨＣ－Ｉに特異的なｍＲＮＡを含有することが見出された。Ｂ２Ｍ及びＭＨＣ－Ｉ ｍＲＮＡは、非標的化ｈＥＳＣのものと同等のレベルで発現された（両方ともに構成的であり且つＩＦＮ－ｇ誘導性）。したがって、これらのＴＡＬＥＮ Ｂ２Ｍ標的化ｈＥＳＣ株は、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡも発現するＢ２Ｍ２／２マウス細胞で観察されたように、免疫拒絶を引き起こすのに十分であると考えられる残留の細胞表面ＭＨＣ－Ｉを発現する可能性があるという懸念がある（Ｇｒｏｓｓ，Ｒ．及びＲａｐｐｕｏｌｉ，Ｒ．「Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ」，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１９９３，９０：３９１３－３９１７）。ＴＡＬＥＮ Ｂ２Ｍ標的化ｈＥＳＣ株は、オフターゲット切断現象について試験されなかったが、ＴＡＬＥＮを使用する際の非特異的切断の発生は、それらの臨床使用に対して主要な安全性の懸念を強いると考えられる重大な問題のままである（Ｇｒａｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．「ＴＡＬＥＮｏｆｆｅｒ：ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＴＡＬＥＮ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ」，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１３，２９：２９３１－２９３２；Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．「Ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＤＮＡ－ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１４，１１：４２９－４３５）。さらに、別の報告では、第１のＢ２Ｍアレルをノックアウトし、且つ第２のＢ２ＭアレルでＨＬＡ－Ｅ遺伝子をノックインして、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃの表面発現がない状態でＨＬＡ－Ｅの二量体又は三量体の表面発現をもたらすことによって、同種認識を回避したＩＰＳ細胞を作製した（Ｇｏｒｎａｌｕｓｓｅ，Ｇ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，「ＨＬＡ－Ｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｓｃａｐｅ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｌｙｓｉｓ ｂｙ ＮＫ ｃｅｌｌｓ」，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３５，７６５－７７３）。

【0006】

上記の戦略のうちの一部の潜在的な制約は、ＭＨＣクラスＩ陰性細胞が、ＨＬＡ分子がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する主要なリガンド阻害剤として機能するためナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって溶解されやすいことである。宿主ＮＫ細胞は、移植されたか又は生着されたＢ２Ｍ－／－ドナー細胞を除去することが示されており、同様の現象は、ＭＨＣクラスＩ陰性ヒト白血病株によりインビトロで発生する（Ｂｉｘ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，「Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＨＣ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｈａｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ＭＨＣ－ｍａｔｃｈｅｄ ｍｉｃｅ」，Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３４９，３２９－３３１；Ｚａｒｃｏｎｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，「Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｓ ａｓ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ」，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８７，４７，２６７４－２６８２）。したがって、先行する方法を改善して免疫応答を回避できるユニバーサルドナー細胞を作製する必要性、及び生着後に生存できる細胞を作製する必要性が存在する。本明細書に記載されるとおり、生着後の細胞の生存は、同種拒絶に依存しない多くの他の経路、例えば、低酸素、活性酸素種、栄養欠乏、及び酸化ストレスによって媒介され得る。また、本明細書に記載されるとおり、生存因子（遺伝子及び／又はタンパク質）の遺伝的導入は、細胞が生着後に生存する助けとなり得る。本明細書に記載されるとおり、ユニバーサルドナー細胞株は、同種拒絶及び生着後の生存の両方に対処する特性を兼ね備え得る。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

いくつかの態様では、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を作製する方法を包含する。第１の方法は、（ｉ）ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子のうちの１つ以上をコードする少なくとも１つの遺伝子内又は近傍の部位で細胞のゲノム中の少なくとも１つの塩基対の欠失及び／又は挿入を導入すること；並びに（ｉｉ）細胞のゲノムにおいて（ｉ）の部位に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位で免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの挿入を導入することによって、細胞を遺伝子改変し、それによりユニバーサルドナー細胞を作製することを含む。第２の方法は、（ｉ）ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子のうちの１つ以上をコードする少なくとも１つの遺伝子内又は近傍の部位で細胞のゲノム中の少なくとも１つの塩基対の欠失及び／又は挿入を導入すること；並びに（ｉｉ）細胞のゲノムにおいてセーフハーバー座位に免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの挿入を導入することによって、細胞を遺伝子改変し、それによりユニバーサルドナー細胞を作製することを含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、未改変細胞と比較して免疫回避及び／又は細胞生存の増加を有する。

【0008】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、若しくはＨＬＡ－Ｃから選択されるＭＨＣ－Ｉ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、若しくはＨＬＡ－ＤＲから選択されるＭＨＣ－ＩＩ遺伝子、又はＢ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、若しくはＲＦＸＡＮＫから選択される遺伝子である。

【0009】

いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４、又はＣＤ４７のうちの１つ以上をコードする１つ以上のポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、外来プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、外来プロモーターは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、又は細胞型特異的プロモーターであり、任意選択により、外来プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦｌａ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、又はＵＢＣプロモーターである。

【0010】

いくつかの実施形態では、（ｉ）の欠失及び／又は挿入は、Ｂ２Ｍ内又は近傍にあり、（ｉｉ）の挿入は、ＰＤ－Ｌ１又はＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドである。

【0011】

いくつかの実施形態では、方法はさらに、未修飾細胞に対して少なくとも１つの生存因子の発現を増加させるか又は減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの生存因子の発現を増加させるか又は減少させる少なくとも１つの遺伝子改変は、未改変細胞に対してＭＡＮＦの発現を増加させる、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドの挿入；又は未改変細胞に対してＺＮＦ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１、若しくはＪＮＫの発現を減少させるか又は消失させる、ＺＮＦ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１、若しくはＪＮＫをコードする遺伝子内又は近傍での少なくとも１つの塩基対の欠失及び／若しくは挿入である。いくつかの実施形態では、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドは、セーフハーバー座位、又はＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、若しくはＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子に属する遺伝子に挿入される。

【0012】

いくつかの実施形態では、細胞を遺伝子改変することは、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ系を細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ系は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、そのホモログ、その改変バージョン、そのコドン最適化バージョン、又はこれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｎ末端核移行シグナル（ＮＬＳ）及び／又はＣ末端ＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡは、１：１の重量比で存在する。

【0013】

いくつかの実施形態では、（ｉ）の欠失及び／又は挿入は、Ｂ２Ｍ遺伝子座位内又は近傍にあり、（ｉｉ）の挿入は、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、（ｉ）及び（ｉｉ）のために使用されるガイドＲＮＡは、配列番号１～３又は配列番号３５～４４の少なくとも１つを含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、（ａ）（ｉ）における部位の左に位置する領域と配列相同性を有するヌクレオチド配列及び（ｂ）（ｉ）における部位の右に位置する領域と配列相同性を有するヌクレオチド配列と隣接する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、（ｉ）における部位の５０塩基対以内のＢ２Ｍ遺伝子座位に挿入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド中の（ａ）は、配列番号１３のヌクレオチド配列から本質的になり、且つポリヌクレオチド中の（ｂ）は、配列番号１９のヌクレオチド配列から本質的になる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、外来プロモーターに作動可能に連結され、任意選択により、外来プロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。

【0014】

いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞であり、任意選択により、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞であり、任意選択により、幹細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、分化細胞又は体細胞である。

【0015】

いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞に分化することができる。いくつかの実施形態では、系列限定前駆細胞は、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、間葉系前駆細胞、筋肉前駆細胞、芽球細胞、又は神経前駆細胞である。いくつかの実施形態では、完全に分化した体細胞は、膵ベータ細胞などの内分泌性細胞、上皮細胞、内胚葉細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血液細胞、又は免疫系細胞である。

【0016】

他の態様では、本開示は、本明細書で開示される方法のいずれかによって作製される複数のユニバーサルドナー細胞を包含する。いくつかの実施形態では、複数のユニバーサルドナー細胞は、細胞が分化を経るのに十分な時間及び条件下で維持され得る。

【0017】

さらなる態様では、本開示は、（ｉ）１つ以上のＭＨＣ－１及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子をコードする少なくとも１つの遺伝子内又は近傍での少なくとも１つの欠失；並びに（ｉｉ）（ｉ）の遺伝子欠失の部位に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位での少なくとも１つの免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つの挿入を含む細胞の組成物を提供する。

【0018】

追加の態様では、本開示は、治療を必要とする対象に本明細書で開示されるユニバーサルドナー細胞のいずれかを投与する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞への分化後に本明細書で開示されるとおりの複数のユニバーサルドナー細胞を得ること又は得たこと；及び対象に系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞を投与することを含む。本発明はまた、必要とする対象への投与のための細胞を得る方法を提供する。方法は、（ｉ）本明細書で開示されるユニバーサルドナー細胞のいずれかを得ること又は得たこと；及び（ｉｉ）細胞が系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞に分化するのに十分な時間及び条件下でユニバーサルドナー細胞を維持することを含む。いくつかの実施形態では、系列限定前駆細胞は、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、間葉系前駆細胞、筋肉前駆細胞、芽球細胞、又は神経前駆細胞である。いくつかの実施形態では、完全に分化した体細胞は、膵ベータ細胞などの内分泌性細胞、上皮細胞、内胚葉細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血液細胞、又は免疫系細胞である。いくつかの実施形態では、対象は、疾患を有するか、有すると疑われるか、又はそのリスクがあるヒトであり、疾患は、遺伝的に受け継がれる疾患であり得る。

【0019】

本開示は、様々な改変及び代替の形態に影響されやすいが、その特定の実施形態は、図面中の例を通して示され、本明細書で詳細に記載されることになる。しかしながら、本明細書に示される図面及び詳細な説明は、本開示を開示された特定の実施形態に限定することを意図したものではなく、逆に、添付の特許請求の範囲によって定義されるとおりの本開示の精神及び範囲内に入る全ての変更形態、同等物、及び代替物を包含することを意図していることが理解されるべきである。

【0020】

本発明の他の特徴及び利点は、添付の図面を参照して、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明において明らかになるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1A-1C】免疫回避のための特定の遺伝子編集戦略を提供する。図１Ａは、指定された細胞型における免疫回避のための例示的な改変を記載する表である。図１Ｂは、Ｂ２Ｍ座位を改変するための例示的な戦略を提供する。図１Ｃは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ／Ｃ、及びＣＩＩＴＡ座位を改変するための例示的な戦略を提供する。

【図2】Ｂ２Ｍ遺伝子（配列番号６）の一部及び標的化するエクソン１のためのｇＲＮＡ（Ｂ２Ｍ－１、Ｂ２Ｍ－２、及びＢ２Ｍ－３）の位置を示す。ＰＣＲプライマー（Ｂ２ＭＦ２及びＢ２ＭＲ２）の位置も示される。

【図3A-3C】ＴＣ１１３３ ｉＰＳＣ細胞株におけるＢ２Ｍ ｇＲＮＡのスクリーニングから結果を示す。図３Ａは、各Ｂ２Ｍ ｇＲＮＡのインデル（挿入＋欠失）頻度を示すグラフである。Ｂ２Ｍ－１ ｇＲＮＡは、２．５％±１．１％（ｎ＝２）のインデル頻度をもたらした。Ｂ２Ｍ－２ ｇＲＮＡは、８７．６％±１４．１％（ｎ＝２）のインデル頻度をもたらした。Ｂ２Ｍ－３ ｇＲＮＡは、６３．９％±０．９％（ｎ＝２）のインデル頻度をもたらした。図３Ｂ及び３Ｃは、Ｂ２Ｍ－２（図３Ｂ）及びＢ２Ｍ－３（図３Ｃ）ｇＲＮＡに関するインデル結果の分布の概要を示すグラフである。

【図4A-4B】Ｂ２Ｍ－２ ｇＲＮＡを使用するｉＰＳＣにおけるＢ２Ｍノックアウト（ＫＯ）の結果を示す。図４Ａは、ｉＰＳＣにおけるＢ２Ｍ－２ ｇＲＮＡに関するインデル結果の分布の概要を示すグラフである。図４Ｂは、Ｂ２Ｍノックアウト（ＫＯ）のためのクローンホモ接合型（「ホモ」）及びＢ２Ｍ ＫＯのためのクローンヘテロ接合型（「ヘテロ」）を示す。

【図5】Ｂ２Ｍ ＫＯ ｉＰＳＣクローンの評価を示す。試験された３つ全てのＢ２Ｍ ＫＯクローンは、野生型、又は未改変細胞に対してＢ２ＭのｍＲＮＡ発現の減少を示した。

【図6A-6D】インターフェロン－ガンマによる４７時間の処理の後のＢ２Ｍ ＫＯ ｉＰＳＣクローンにおけるＢ２Ｍ及びＨＬＡ－ＡＢＣの発現を示す。図６Ａは、野生型細胞における発現を示す。図６Ｂは、Ｂ２Ｍ ＫＯクローンＣ４における発現を示す。図６Ｃは、Ｂ２Ｍ ＫＯクローンＣ９における発現を示す。図６Ｄは、Ｂ２Ｍ ＫＯクローンＣ１２における発現を示す。

【図7A-7D】ＳＳＥＡ－４及びＴＲＡ－１－６０の発現レベルの評価を通してＢ２Ｍ ＫＯ ｉＰＳＣクローンの多能性を実証する。図７Ａは、野生型細胞における発現を示す。図７Ｂは、Ｂ２Ｍ ＫＯクローンＣ４における発現を示す。図７Ｃは、Ｂ２Ｍ ＫＯクローンＣ９における発現を示す。図７Ｄは、Ｂ２Ｍ ＫＯクローンＣ１２における発現を示す。

【図8】ＣｙＴ４９細胞におけるＢ２Ｍ ｇＲＮＡ切断のＴＩＤＥ分析を示す。Ｂ２Ｍ ｇＲＮＡ－１、－２、又は－３が試験された。

【図9A-9B】ＷＴ ＣｙＴ４９細胞（図９Ａ）及び編集されたＣｙＴ４９細胞（図９Ｂ）におけるＩＦＮ－γ有り無し両方でのＢ２Ｍ発現のフローサイトメトリー評価を示す。

【図10】ＨＤＲのためのＢ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＰＤ－Ｌ１ドナーベクターのプラスミドマップを示す。

【図11】Ｂ２Ｍ ＫＯ＋ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ ＣｙＴ４９幹細胞の多能性のフローサイトメトリー分析を示す。派生したクローンは、多能性に不可欠な２つの転写因子であるＯＣＴ４及びＳＯＸ２の＞９９％の二重陽性であった。ＩｇＧは、陰性対照として使用された。

【図12A-12B】ＷＴ ＣｙＴ４９（図１２Ａ）及びＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ（図１２Ｂ）に由来する幹細胞クローンのフローサイトメトリー分析を示す。ＷＴ細胞は、ＩＦＮγに応答するＢ２Ｍ発現を上方制御する。Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩクローンは、ＰＤ－Ｌ１を十分に発現し、ＩＦＮγ処理の有無に関わらずＢ２Ｍを発現しない。ＮＴ－１＝未処理。ＩＮＴＧ－１＝５０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγで４８時間処理された細胞。

【図13】ＨＤＲのためのＢ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＨＬＡ－Ｅドナーベクターのプラスミドマップを示す。

【図14】Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ ＣｙＴ４９幹細胞の多能性のフローサイトメトリー分析を示す。派生したクローンは、多能性に不可欠な２つの転写因子であるＯＣＴ４及びＳＯＸ２の＞９９％の二重陽性であった。ＩｇＧは、陰性対照として使用された。

【図15】ＷＴ ＣｙＴ４９及びＢ２Ｍ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ ＣｙＴ４９幹細胞クローンのフローサイトメトリー分析を示す。ＷＴ細胞は、ＩＦＮγに応答するＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ発現を上方制御する。Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩクローンは、ＩＦＮγ処理の有無に関わらずＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃを発現しない。ＩＦＮγ＝５０ｎｇ／ｍＬ。細胞は、ＩＦＮγで４８時間処理された。

【図16】Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ ＣｙＴ４９幹細胞クローンのＨＬＡ－Ｅ発現のためのフローサイトメトリー分析を示す。未編集のクローンは、ＨＬＡ－Ｅ発現のための対照として使用された。

【図17】野生型、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ、又はＢ２ＭＫＯ ｈＥＳＣから分化した段階１（胚体内胚葉）細胞でのＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７に関するフローサイトメトリーを示す。

【図18】野生型、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ、又はＢ２Ｍ ＫＯ細胞から分化した段階１（胚体内胚葉）細胞におけるＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７発現に関する定量的パーセンテージを示す。

【図19】野生型、Ｂ２Ｍ ＫＯ、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ（Ｖ１Ａ）、又はＨＬＡ－Ｅ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ（Ｖ２Ａ）細胞から分化した段階４（ＰＥＣ）細胞におけるＣＨＧＡ、ＰＤＸ１、及びＮＫＸ６．１発現の定量的パーセンテージを示す。

【図20】段階４（ＰＥＣ）の細胞の不均一な集団を示す。

【図21A-21B】野生型、ＰＤ－Ｌ１ＫＩ／Ｂ２ＭＫＯ、又はＢ２ＭＫＯ細胞から分化した細胞（図２１Ａ）及びＢ２Ｍ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ（Ｖ２Ａ）細胞から分化した細胞（図２１Ｂ）における分化時間経過にわたる選択された遺伝子発現を示す。

【図22A-22F】野生型、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ、又はＢ２Ｍ ＫＯ細胞から分化した細胞におけるＰＥＣ段階でのＢ２Ｍ及びＰＤ－Ｌ１発現を示す。図２２Ａは、野生型細胞におけるＢ２Ｍ発現を示す。図２２Ｂは、Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞におけるＢ２Ｍ発現を示す。図２２Ｃは、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞におけるＢ２Ｍ発現を示す。図２２Ｄは、野生型細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現を示す。図２２Ｅは、Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現を示す。図２２Ｆは、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現を示す。

【図23A-23F】野生型、ＰＤ－Ｌ１／Ｂ２Ｍ ＫＯ、又はＢ２Ｍ ＫＯ細胞から分化した細胞におけるＰＥＣ段階でのＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ発現を示す。図２３Ａは、野生型細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現を示す。図２３Ｂは、Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現を示す。図２３Ｃは、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現を示す。図２３Ｄは、野生型細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ ＰＤ－Ｌ１発現を示す。図２３Ｅは、Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ発現を示す。図２３Ｆは、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ発現を示す。

【図24A-24D】ＣＦＳＥ増殖アッセイを使用するＴ細胞活性化のためのフローサイトメトリー分析を示す。ヒト初代ＣＤ３＋ Ｔ細胞を、ＷＴ、Ｂ２Ｍ ＫＯ、又はＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ ＣｙＴ４９クローンに由来するＰＥＣと共インキュベートした。図２４Ａは、野生型細胞における活性化を示す。図２４Ｂは、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞における活性化を示す。図２４Ｃは、Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞における活性化を示す。図２４Ｄは、様々な細胞におけるＴ細胞活性化を要約する。対照として「ＣＦＳＥ－Ｔ単独」セットを伴う一方向ＡＮＯＶＡ（ダネット多重比較検定によるα＝０．０５）。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。ｎ．ｓ．＝非有意。

【発明を実施するための形態】

【0022】

Ｉ．定義
欠失：本明細書で使用する場合、用語「遺伝子欠失」又は「ノックアウト」と互換的に使用され得る用語「欠失」は一般に、ゲノムＤＮＡの部位又は領域が、任意の分子生物学的方法、例えば、本明細書に記載される方法、例えば、ゲノムＤＮＡの部位にエンドヌクレアーゼ及び少なくとも１つのｇＲＮＡを送達することによって除去される遺伝子改変を指す。任意の数のヌクレオチドが欠失され得る。いくつかの実施形態では、欠失は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、又は少なくとも２５個のヌクレオチドの除去を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、１０～５０、２５～７５、５０～１００、５０～２００、又は１００を超えるヌクレオチドの除去を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、標的遺伝子全体、例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子の除去を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、標的遺伝子の部分、例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子のプロモーター及び／又はコード配列の全て又は部分の除去を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、転写調節因子、例えば、標的遺伝子のプロモーター領域の除去を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、コード領域によって正常に発現される産物が、もはや発現されないか、切断型として発現されるか、又は低いレベルで発現されるようなコード領域の全て又は部分の除去を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、未改変細胞に対して、遺伝子の発現の減少をもたらす。

【0023】

エンドヌクレアーゼ：本明細書で使用する場合、用語「エンドヌクレアーゼ」は一般に、ポリヌクレオチド内のホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡポリヌクレオチド内のホスホジエステル結合を特異的に切断する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）、メガヌクレアーゼ、ＭｅｇａＴＡＬ、又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。ある種の態様では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、若しくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、若しくはそのホモログ、その天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化バージョン、若しくはその改変バージョン、又はその組合せである。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）及び／又は１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入し得る。

【0024】

遺伝子改変：本明細書で使用する場合、用語「遺伝子改変」は一般に、任意の分子生物学的方法、例えば、本明細書に記載される方法を使用して、例えば、ゲノムＤＮＡの部位にエンドヌクレアーゼ及び少なくとも１つのｇＲＮＡを送達することによって遺伝的に編集されたか又は操作されたゲノムＤＮＡの部位を指す。遺伝子改変の例としては、挿入、欠失、重複、逆位、及び転座、及びこれらの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、挿入である。他の実施形態では、遺伝子改変は、標的遺伝子のリーディングフレームが移動されて、改変された遺伝子産物をもたらすか又は遺伝子産物をもたらさないような挿入－欠失変異（又はインデル）である。

【0025】

ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）：本明細書で使用する場合、用語「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」は一般に、エンドヌクレアーゼと相互作用でき、例えば、結合でき、且つ標的ゲノム部位又は領域と結合できるか、又はハイブリダイズできる短いリボ核酸を指す。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、スペーサー伸長領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、一本鎖である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、天然に存在するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、化学修飾されたｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、化学修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル糖修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、修飾された核酸骨格を含む。いくつかの実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル－ホスホロチオエート残基を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼと予め複合体を形成し得る。

【0026】

挿入：本明細書で使用する場合、用語「遺伝子挿入」又は「ノックイン」と互換的に使用され得る用語「挿入」は一般に、ポリヌクレオチドが、任意の分子生物学的方法、例えば、本明細書に記載される方法、例えば、ゲノムＤＮＡの部位にエンドヌクレアーゼ及び少なくとも１つのｇＲＮＡを送達することによって、ゲノムＤＮＡの部位又は領域に導入されるか又は付加される遺伝子改変を指す。いくつかの実施形態では、挿入は、以前の遺伝子改変、例えば、欠失又は挿入－欠失変異の部位であったゲノムＤＮＡの部位の内部又は近傍で起こり得る。いくつかの実施形態では、挿入は、以前の遺伝子改変、例えば、欠失又は挿入－欠失変異の部位と部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有されるゲノムＤＮＡの部位で起こる。いくつかの実施形態では、挿入は、セーフハーバー座位で起こる。いくつかの実施形態では、挿入は、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの導入を含む。いくつかの実施形態では、挿入は、免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドの導入を含む。いくつかの実施形態では、挿入は、生存因子をコードするポリヌクレオチドの導入を含む。いくつかの実施形態では、挿入は、外来プロモーター、例えば、構成的プロモーター、例えば、ＣＡＧプロモーターの導入を含む。いくつかの実施形態では、挿入は、非コード遺伝子をコードするポリヌクレオチドの導入を含む。一般に、挿入されることになるポリヌクレオチドは、挿入の部位にあるか又はその近傍のゲノムＤＮＡと実質的な配列相同性を有する配列（例えば、ホモロジーアーム）と隣接する。

【0027】

主要組織適合抗原複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）：本明細書で使用する場合、用語「主要組織適合抗原複合体クラスＩ」又は「ＭＨＣ－Ｉ」は一般に、哺乳動物、例えば、ヒトを含む脊椎動物における全ての有核細胞の細胞表面に見出される生体分子のクラス；及び免疫応答を刺激するために、非自己又は外来抗原のペプチド、例えば、タンパク質を、細胞内（すなわち、サイトゾル）から細胞傷害性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞に提示する機能を指す。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ生体分子は、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子又はＭＨＣ－Ｉタンパク質である。ＭＨＣ－Ｉタンパク質のベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）タンパク質との複合体形成は、全てのＭＨＣ－Ｉタンパク質の細胞表面発現のために必要とされる。いくつかの実施形態では、未改変細胞に対してＭＨＣ－Ｉヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の発現を減少させることは、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子の発現における減少（又は低減）を含む。いくつかの実施形態では、未改変細胞に対してＭＨＣ－Ｉヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の発現を減少させることは、ＭＨＣ－Ｉタンパク質の細胞表面発現における減少（又は低減）を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ生体分子は、ＨＬＡ－Ａ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１０５）、ＨＬＡ－Ｂ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１０６）、ＨＬＡ－Ｃ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１０７）、又はＢ２Ｍ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：５６７）である。

【0028】

主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）：本明細書で使用する場合、用語「主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ」又は「ＭＨＣ－ＩＩ」は一般に、哺乳動物、例えば、ヒトを含む脊椎動物における抗原提示細胞の細胞表面に典型的に見出される生体分子のクラス；及び免疫応答を刺激するために、非自己又は外来抗原のペプチド、例えば、タンパク質を、細胞の外部（細胞外）から細胞傷害性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞に提示する機能を指す。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージ、又はＢ細胞である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ－ＩＩ生体分子は、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子又はＭＨＣ－ＩＩタンパク質である。いくつかの実施形態では、未改変細胞に対してＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の発現を減少させることは、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子の発現における減少（又は低減）を含む。いくつかの実施形態では、未改変細胞に対してＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の発現を減少させることは、ＭＨＣ－ＩＩタンパク質の細胞表面発現における減少（又は低減）を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ－ＩＩ生体分子は、ＨＬＡ－ＤＰＡ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１１３）、ＨＬＡ－ＤＰＢ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１１５）、ＨＬＡ－ＤＭＡ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１０８）、ＨＬＡ－ＤＭＢ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１０９）、ＨＬＡ－ＤＯＡ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１１１）、ＨＬＡ－ＤＯＢ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１１２）、ＨＬＡ－ＤＱＡ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１１７）、ＨＬＡ－ＤＱＢ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１１９）、ＨＬＡ－ＤＲＡ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１２２）、又はＨＬＡ－ＤＲＢ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１２３）である。

【0029】

ポリヌクレオチド：本明細書で使用する場合、用語「核酸」と互換的に使用され得る用語「ポリヌクレオチド」は一般に、２個以上のヌクレオチドを含む生体分子を指す。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも５００個、又は任意の数のヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子であり得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡの部位又は領域である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、未改変細胞又はユニバーサルドナー細胞のゲノム内に含まれる内在性の遺伝子である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに組み込まれていない外来ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに組み込まれている外来ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、プラスミド、又はアデノ随伴ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、環状又は線状分子である。

【0030】

セーフハーバー座位：本明細書で使用する場合、用語「セーフハーバー座位」は一般に、遺伝子挿入を、細胞に対する有害作用を伴わずに当該位置、部位、又は領域に収容できるゲノムＤＮＡの任意の位置、部位、又は領域を指す。いくつかの実施形態では、セーフハーバー座位は、遺伝子内又は遺伝子外領域である。いくつかの実施形態では、セーフハーバー座位は、典型的には転写的にサイレントであるゲノムＤＮＡの領域である。いくつかの実施形態では、セーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、又はＴＴＲ座位である。いくつかの実施形態では、セーフハーバー座位は、Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，「Ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｕｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ＤＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ」，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，Ｖｏｌ １２，５１－５８頁において記載される。

【0031】

安全スイッチ：本明細書で使用する場合、用語「安全スイッチ」は一般に、細胞にアポトーシスを起こさせる生体分子を指す。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、タンパク質又は遺伝子である。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、自殺遺伝子である。いくつかの実施形態では、安全スイッチ、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）は、プロドラッグ、例えば、ガンシクロビルを代謝することによって、細胞にアポトーシスを起こさせる。いくつかの実施形態では、自身に対する過剰発現された安全スイッチの存在が、細胞にアポトーシスを起こさせる。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、ｐ５３系分子、ＨＳＶ－ｔｋ、又は誘導性カスパーゼ－９である。

【0032】

対象：本明細書で使用する場合、用語「対象」は、哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト霊長類又は齧歯類である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、疾患又は障害を有するか、有すると疑われるか、又はそのリスクがある。いくつかの実施形態では、対象は、疾患又は障害の１つ以上の症状を有する。

【0033】

生存因子：本明細書で使用する場合、用語「生存因子」は一般に、細胞において増加するか又は減少するとき、未改変細胞に対して、宿主対象への移植又は生着後に細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞がより高い生存率で生存することを可能にするタンパク質（例えば、本明細書に記載されるとおりのポリヌクレオチドによって発現される）を指す。いくつかの実施形態では、生存因子は、ヒト生存因子である。いくつかの実施形態では、生存因子は、細胞生存に関与する決定的な経路のメンバーである。いくつかの実施形態では、細胞生存に関与する決定的な経路は、低酸素、活性酸素種、栄養欠乏、及び／又は酸化ストレスに対する影響を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの生存因子の遺伝子改変、例えば、欠失又は挿入は、生着後に未改変細胞より長い期間、例えば、少なくとも１．０５倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又は少なくとも５０倍長い期間ユニバーサルドナー細胞が生存することを可能にする。いくつかの実施形態では、生存因子は、ＺＮＦ１４３（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：７７０２）、ＴＸＮＩＰ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：１０６２８）、ＦＯＸＯ１（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：２３０８）、ＪＮＫ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：５５９９）、又はＭＡＮＦ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：７８７３）である。いくつかの実施形態では、生存因子は、細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞に挿入される。いくつかの実施形態では、生存因子は、細胞、ユニバーサルドナー細胞から欠失される。いくつかの実施形態では、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドの挿入は、未改変細胞に対して、宿主対象への移植又は生着の後に細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞がより高い生存率で生存することを可能にする。いくつかの実施形態では、ＺＦＮ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１、又はＪＮＫ遺伝子内又は近傍での欠失又は挿入－欠失変異は、未改変細胞に対して、宿主対象への移植又は生着の後に細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞がより高い生存率で生存することを可能にする。

【0034】

免疫寛容原性因子：本明細書で使用する場合、用語「免疫寛容原性因子」は一般に、細胞において増加するか又は減少するとき、未改変細胞に対して、宿主対象への移植又は生着後に細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞がより高い率で免疫拒絶を阻害するか又は回避することを可能にするタンパク質（例えば、本明細書に記載されるとおりのポリヌクレオチドによって発現される）を指す。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、ヒト免疫寛容原性因子である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫寛容原性因子の遺伝子改変（例えば、少なくとも１つの免疫寛容原性因子の挿入又は欠失）は、生着後に未改変細胞より少なくとも１．０５倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又は少なくとも５０倍高い率で細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞が免疫拒絶を阻害するか又は回避することを可能にする。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１３３）、ＨＬＡ－Ｇ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１３５）、ＣＴＬＡ－４（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：１４９３）、ＣＤ４７（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：９６１）、又はＰＤ－Ｌ１（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：２９１２６）である。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞に挿入される。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞から欠失される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ４７、及び／又はＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドの挿入は、宿主対象への移植又は生着後に細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞が免疫拒絶を阻害するか又は回避することを可能にする。

【0035】

ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子：本明細書で使用する場合、用語「ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子」は一般に、ＭＨＣ－Ｉ及び／又はＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現を調節する、例えば、増加させるか又は減少させる生体分子を指す。いくつかの実施形態では、生体分子は、ポリヌクレオチド、例えば、遺伝子、又はタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子は、少なくとも１つのＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩタンパク質の細胞表面発現を増加させることになるか又は減少させることになる。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子は、少なくとも１つのＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩ遺伝子の発現を増加させることになるか又は減少させることになる。いくつかの実施形態では、転写調節因子は、ＣＩＩＴＡ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：４２６１）又はＮＬＲＣ５（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：８４１６６）である。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ又はＮＬＲＣ５の発現の欠失又は低減は、少なくとも１つのＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩ遺伝子の発現を減少させる。

【0036】

ユニバーサルドナー細胞：本明細書で使用する場合、用語「ユニバーサルドナー細胞」は一般に、未改変細胞に対して、細胞移植中に同種拒絶になりにくく、且つ／又は移植後の生存の増加を実証する遺伝子改変細胞を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるとおりの遺伝子改変細胞は、ユニバーサルドナー細胞である。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、未改変細胞と比較して免疫回避及び／又は細胞生存の増加を有する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、未改変細胞と比較して細胞生存の増加を有する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、幹細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）であってもよい。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、分化細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、体細胞（例えば、免疫系細胞）であってもよい。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、対象に投与される。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、疾患を有するか、又は有すると疑われるか、又はそのリスクがある対象に投与される。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞に分化することができる。いくつかの実施形態では、系列限定前駆細胞は、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、間葉系前駆細胞、筋肉前駆細胞、芽球細胞、又は神経前駆細胞である。いくつかの実施形態では、完全に分化した体細胞は、膵ベータ細胞などの内分泌性細胞、上皮細胞、内胚葉細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血液細胞、又は免疫系細胞である。

【0037】

未改変細胞：本明細書で使用する場合、用語「未改変細胞」は、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子、生存因子、及び／又は免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチド又は遺伝子を含む遺伝子改変にかけられたことがない細胞を指す。いくつかの実施形態では、未改変細胞は、幹細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、未改変細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）であってもよい。いくつかの実施形態では、未改変細胞は、分化細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、未改変細胞は、体細胞（例えば、免疫系細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）から選択され得る。ユニバーサルドナー細胞が、「未改変細胞に対して」比較される場合、ユニバーサルドナー細胞及び未改変細胞は、同じ細胞型であるか又は共通の親細胞株を共有し、例えば、ユニバーサルドナーｉＰＳＣは、未改変ｉＰＳＣに対して比較される。

【0038】

遺伝子内又は近傍：本明細書で使用する場合、用語「遺伝子内又は近傍」は、前記遺伝子のイントロン又はエクストロン構成要素であるか又は前記遺伝子に隣接して位置するゲノムＤＮＡの部位又は領域を指す。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡの部位は、それが前記遺伝子のイントロン又はエクソンの少なくとも一部を含む場合、遺伝子内にある。いくつかの実施形態では、遺伝子の近傍に位置するゲノムＤＮＡの部位は、前記遺伝子の５’又は３’末端（例えば、前記遺伝子のコード領域の５’又は３’末端）にあってもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子の近傍に位置するゲノムＤＮＡの部位は、前記遺伝子の発現を調節するプロモーター領域又はリプレッサー領域であってもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子の近傍に位置するゲノムＤＮＡの部位は、前記遺伝子と同じ染色体上にあってもよい。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡの部位又は領域は、前記遺伝子の５’又は３’末端（例えば、前記遺伝子のコード領域の５’又は３’末端）に対して５０Ｋｂ、４０Ｋｂ、３０Ｋｂ、２０Ｋｂ、１０Ｋｂ、５Ｋｂ、１Ｋｂ以内、又はそれより近傍にある場合、遺伝子の近傍にある。

【0039】

ＩＩ．ゲノム編集方法
ゲノム編集は一般に、ゲノムのヌクレオチド配列を、好ましくは的確な又は既定の様式で改変するプロセスを指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるとおりのゲノム編集方法、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ系を使用して、例えば、ユニバーサルドナー細胞を作製するために本明細書に記載されるとおりの細胞を遺伝子改変してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるとおりのゲノム編集方法、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ系を使用して、例えば、未改変細胞に対して、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及び／若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の他の構成要素の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子内又は近傍に少なくとも１つの遺伝子改変を導入するため；未改変細胞に対して、免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現を増加させる少なくとも１つの遺伝子改変を導入するため；及び／又は未改変細胞に対して、生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させるか又は減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を導入するために本明細書に記載されるとおりの細胞を遺伝子改変してもよい。

【0040】

本明細書に記載されるゲノム編集の方法の例は、ゲノム中の的確な標的位置でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を切断する部位特異的ヌクレアーゼを使用して、それによりゲノム内の特定の位置で一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ切断を作製する方法を含む。そのような切断は、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ：ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ」，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，２１（２），１２１－３１において記載されるとおり、相同組換え修復（ＨＤＲ）及び非相同末端連結（ＮＨＥＪ）などの天然の内在性細胞プロセスによって修復される場合があり、且つ規則的に修復される。これらの２つの主要なＤＮＡ修復プロセスは、代替の経路のファミリーからなる。ＮＨＥＪは、二本鎖切断の結果生じるＤＮＡ末端を直接的に結合するものであり、ヌクレオチド配列の欠損又は付加を伴うこともあり、遺伝子の発現を破壊するか又は増強し得る。ＨＤＲは、切断点で既定のＤＮＡ配列を挿入する鋳型として、相同配列、又はドナー配列を利用する。相同配列は、姉妹染色分体などの内在性のゲノム中に存在し得る。或いは、ドナー配列は、ヌクレアーゼ切断座位と高い相同性の領域（例えば、左及び右ホモロジーアーム）を有するが、切断される標的座位に組み込まれ得る欠失を含む追加の配列又は配列変化も含有し得るプラスミド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、二重鎖オリゴヌクレオチド又はウイルスなどの外来ポリヌクレオチドであってもよい。第三の修復機構は、遺伝的な結果が、若干の欠損及び挿入が切断部位で生じ得るという点でＮＨＥＪに類似する、「代替的ＮＨＥＪ」とも呼ばれるマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）であってもよい。ＭＭＥＪは、ＤＮＡ切断部位に隣接する数塩基対の相同配列を利用して、より好ましいＤＮＡ末端連結修復結果を促進でき、最近の報告はさらに、このプロセスの分子メカニズムを解明した；例えば、Ｃｈｏ及びＧｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５，５１８，１７４－７６；Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，２２（３）：２３０－７；Ｍａｔｅｏｓ－Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５，５１８，２５４－５７；Ｃｅｃｃａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５，５２８，２５８－６２を参照されたい。いくつかの場合において、ＤＮＡ切断の部位での潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づいて、修復結果を予測できる可能性がある。

【0041】

これらのゲノム編集機構の各々を使用して、所望の遺伝子改変を作製できる。ゲノム編集プロセスにおける工程は、１つ又は２つのＤＮＡ切断を作製することであり得るが、後者は、意図した変異部位の近傍としての標的座位における、二本鎖切断又は２つの一本鎖切断である。これは、本明細書に記載され、且つ示されるとおりのエンドヌクレアーゼの使用を介して達成され得る。

【0042】

ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ系
ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ系は、遺伝子編集のために使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用されてきた原核生物において天然に存在する防御機構である。ＣＲＩＳＰＲ系としては、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、及びＶＩ型の系が挙げられる。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系である。他の態様では、ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｒｆ系である。ＣＲＩＳＰＲ系は、ＤＮＡの切断を標的化するＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、並びに２つの非コードＲＮＡであるｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に依拠する。

【0043】

ｃｒＲＮＡは、典型的には標的ＤＮＡ中の約２０ヌクレオチド（ｎｔ）配列とのワトソン－クリック塩基対形成を介してＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ複合体の配列認識及び特異性を促進する。ｃｒＲＮＡ中の５’ ２０ｎｔの配列を変化させることによって、特定の座位へのＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ複合体の標的化が可能になる。ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ複合体は単に、標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる特定の短いＤＮＡモチーフ（配列ＮＧＧを有する）に続いている場合、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の最初の２０ｎｔに一致する配列を含有するＤＮＡ配列に結合する。

【0044】

ＴｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端とハイブリダイズしてＲＮＡ二重鎖構造を形成し、エンドヌクレアーゼによって結合されて触媒活性のあるＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ複合体を形成し、続いてこれにより標的ＤＮＡを切断できる。

【0045】

ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ複合体が標的部位でＤＮＡに結合すると、エンドヌクレアーゼ内の２つの独立したヌクレアーゼドメインがそれぞれＰＡＭ部位の３塩基上流のＤＮＡ鎖の一方を切断し、ＤＮＡの両鎖が塩基対（平滑末端）で終結する二本鎖切断（ＤＳＢ）を残す。

【0046】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するが、他のＣａｓ９ホモログ、例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９、Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ３ Ｃａｓ９、又はＴ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９が使用されてもよい。他の場合において、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１、例えば、Ｌ．バクテリウム（Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１又はアシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、野生型バリアントが使用されてもよい。いくつかの実施形態では、前述のエンドヌクレアーゼの改変バージョン（例えば、そのホモログ、その天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化、又はその改変バージョン）が使用されてもよい。

【0047】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、少なくとも１つの核移行シグナル（ＮＬＳ）に連結され得る。少なくとも１つのＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのアミノ末端の５０アミノ酸で又はそれ以内に位置してもよく、且つ／又は少なくとも１つのＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのカルボキシ末端の５０アミノ酸で又はそれ以内に位置してもよい。

【0048】

例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドは、Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｕａｌ－ＲＮＡ ａｎｄ Ｃａｓ９ ａｍｏｎｇ ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，４２：２５７７－２５９０において公表されるとおりのＣａｓ９ポリペプチドを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子の命名法は、Ｃａｓ遺伝子が発見されて以来、広範な書き直しを経てきた。Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ．ａｌ．もまた、様々な種に由来するＣａｓ９ポリペプチドのためのＰＡＭ配列を提供する。

【0049】

ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＩＩ型エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインに連結された操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインで構成されるモジュラータンパク質である。ＦｏｋＩは二量体としてのみ機能するため、一対のＺＦＮは、触媒活性のあるＦｏｋＩ二量体の形成を可能にするために、反対側のＤＮＡ鎖上の同一標的「ハーフサイト」配列に、正確な間隔で結合するように設計されなければならない。それ自体は配列特異性を有しないＦｏｋＩドメインが二量体化すると、ゲノム編集の開始ステップとしてＺＦＮのハーフサイト間にＤＮＡ二本鎖切断が生じる。

【0050】

各ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは通常、豊富なＣｙｓ２－Ｈｉｓ２構造の３～６個のジンクフィンガーで構成されており、各フィンガーは主に標的ＤＮＡ配列の一本鎖上のヌクレオチドのトリプレットを認識するが、４番目のヌクレオチドとの鎖交差相互作用も重要であり得る。ＤＮＡと重要な接触を作る位置におけるフィンガーのアミノ酸の改変は、所与のフィンガーの配列特異性を改変する。したがって、４フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、１２ｂｐの標的配列を選択的に認識することになり、標的配列は、各フィンガーによって与えられるトリプレット優先度で構成されるが、トリプレット優先度は、隣接するフィンガーによって様々な程度まで影響され得る。ＺＦＮの重要な態様は、それらが、個々のフィンガーを単に改変することによって、ほとんどのゲノムアドレスに容易に再標的化され得ることである。ＺＦＮの大部分の適用において、４～６個のフィンガーのタンパク質が使用され、それぞれ１２～１８ｂｐを認識する。したがって、一対のＺＦＮは通常、ハーフサイト間に典型的な５～７ｂｐのスペーサーを含まない２４～３６ｂｐの組み合わされた標的配列を認識することになる。結合部位は、１５～１７ｂｐを含むより大きいスペーサーによりさらに分離され得る。この長さの標的配列は、ヒトゲノムの中で固有なものになると考えられ、設計プロセスの間に反復した配列又は遺伝子ホモログは除外されると想定される。それにもかかわらず、ＺＦＮのタンパク質－ＤＮＡの相互作用は、それらの特異性において絶対的なものではないため、２つのＺＦＮの間のヘテロ二量体として、又は一方若しくは他方のＺＦＮのホモ二量体として、オフターゲットの結合及び切断現象が生じる。後者の可能性は、ＦｏｋＩドメインの二量体化インターフェースを操作して、互いに且つそれら自体ではなく単に二量体化できる絶対ヘテロ二量体バリアントとしても知られる「プラス」及び「マイナス」のバリアントを作ることによって、効率的に排除された。絶対ヘテロ二量体を強制することによって、ホモ二量体の形成を妨げる。これにより、ＺＦＮだけでなく、これらのＦｏｋＩバリアントを採用する任意の他のヌクレアーゼの特異性が大幅に増強された。

【0051】

様々なＺＦＮに基づく系は、当該技術分野において記載されており、その変更形態は、定期的に報告され、多数の参考文献が、ＺＦＮの設計を導くために使用される規則及びパラメーターを記載している；例えば、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１９９９ ９６（６）：２７５８－６３；Ｄｒｅｉｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２０００，３０３（４）：４８９－５０２；Ｌｉｕ Ｑ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２００２，２７７（６）：３８５０－６；Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２００５，２８０（４２）：３５５８８－９７；及びＤｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１，２７６（３１）：２９４６６－７８を参照されたい。

【0052】

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ＴＡＬＥＮは、ＺＦＮと同様に、操作されたＤＮＡ結合ドメインがＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに連結され、一対のＴＡＬＥＮが直列に作動して標的化されるＤＮＡの切断を実現する、モジュラーヌクレアーゼの別の形式を表す。ＺＦＮとの主な違いは、ＤＮＥ結合ドメインの性質及び会合される標的ＤＮＡ配列認識の特性である。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥタンパク質に由来し、これは、植物の病原性微生物であるキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ）において最初に記載された。ＴＡＬＥは、３３～３５アミノ酸リピートの直列配列で構成され、各リピートは、典型的には最大で２０ｂｐの長さの標的ＤＮＡ配列において一塩基対を認識し、最大で４０ｂｐの総標的配列長を与える。各リピートのヌクレオチド特異性は、１２位及び１３位での２つのアミノ酸を含む反復可変二残基（ＲＶＤ）によって決定される。塩基のグアニン、アデニン、シトシン及びチミンは、それぞれ４つのＲＶＤ：Ａｓｎ－Ａｓｎ、Ａｓｎ－Ｉｌｅ、Ｈｉｓ－Ａｓｐ及びＡｓｎ－Ｇｌｙによって主に認識される。これは、ジンクフィンガーよりもはるかに単純な認識コードとなり、したがって、ヌクレアーゼ設計においてジンクフィンガーよりも有利となる。それにもかかわらず、ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮのタンパク質－ＤＮＡ相互作用は、それらの特異性において絶対的ではなく、且つＴＡＬＥＮもまた、オフターゲット活性を低減するＦｏｋＩドメインの絶対ヘテロ二量体バリアントの使用から恩恵を得た。

【0053】

触媒機能において不活性化されているＦｏｋＩドメインの追加のバリアントが作製されてきた。ＴＡＬＥＮ又はＺＦＮのいずれかの対の片方が不活性なＦｏｋＩドメインを含有する場合、ＤＳＢではなく、標的部位で一本鎖ＤＮＡの切断（ニッキング）のみが生じることになる。この結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１の「ニッカーゼ」変異体（Ｃａｓ９切断ドメインの１つが不活性化されている）の使用と同等である。ＤＮＡニックを使用して、ＨＤＲによるゲノム編集を駆動することができるが、ＤＳＢによるものより効率は低い。主な利点は、オフターゲットニックが、ＮＨＥＪに媒介される誤修復を起こしやすいＤＳＢとは異なり、迅速且つ正確に修復されることである。

【0054】

様々なＴＡＬＥＮに基づく系は、当該技術分野において記載されており、その変更形態は、定期的に報告される；例えば、Ｂｏｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９ ３２６（５９５９）：１５０９－１２；Ｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３５（６０６９）：７１６－９；及びＭｏｓｃｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３２６（５９５９）：１５０１を参照されたい。「ゴールデンゲート」プラットフォーム、又はクローニングスキームに基づくＴＡＬＥＮの使用は、複数のグループによって記載されている；例えば、Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１１，３９（１２）：ｅ８２；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１１，３９（１４）：６３１５－２５；Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．，２０１１，６（２）：ｅ１６７６５；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１４，４１（６）：３３９－４７．；及びＣｅｒｍａｋ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２０１５ １２３９：１３３－５９を参照されたい。

【0055】

ホーミングエンドヌクレアーゼ
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）は、長い認識配列（１４～４４塩基対）を有する配列特異的エンドヌクレアーゼであり、高い特異性で（ゲノム中の固有の部位である場合が多い）ＤＮＡを切断する。真核生物、原生生物、細菌、古細菌、シアノバクテリア及びファージを含む幅広い宿主に由来するＧＩＹ－ＹＩＧ、Ｈｉｓ－Ｃｉｓボックス、Ｈ－Ｎ－Ｈ、ＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ｘＫ、及びＶｓｒ様を含むそれらの構造によって分類されるとおりの少なくとも６つの既知のＨＥのファミリーがある。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと同様に、ＨＥを使用して、ゲノム編集における最初の工程として標的座位でＤＳＢを引き起こすことができる。加えて、いくつかの天然のＨＥ及び操作されたＨＥは、ＤＮＡの一本鎖のみを切断し、それにより、部位特異的ニッカーゼとして機能する。ＨＥの広い標的配列及びそれらが提供する特異性が、それらを部位特異的なＤＳＢを起こすための魅力的な候補にした。

【0056】

様々なＨＥに基づく系は、当該技術分野において記載されており、その変更形態は、定期的に報告される；例えば、Ｓｔｅｅｎｔｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４，２４（８）：６６３－８０；Ｂｅｌｆｏｒｔ ａｎｄ Ｂｏｎｏｃｏｒａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２０１４，１１２３：１－２６；並びにＨａｆｅｚ及びＨａｕｓｎｅｒ，Ｇｅｎｏｍｅ，２０１２，５５（８）：５５３－６９による概説を参照されたい。

【0057】

ＭｅｇａＴＡＬ／Ｔｅｖ－ｍＴＡＬＥＮ／ＭｅｇａＴｅｖ
ハイブリッドヌクレアーゼのさらなる例として、ＭｅｇａＴＡＬプラットフォーム及びＴｅｖ－ｍＴＡＬＥＮプラットフォームは、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメイン及び触媒活性のあるＨＥの融合を使用し、ＴＡＬＥの調整可能なＤＮＡ結合及び特異性の両方、並びにＨＥの切断配列特異性を利用する；例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１４，４２：２５９１－２６０１；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇ３，２０１４，４：１１５５－６５；並びにＢｏｉｓｓｅｌ及びＳｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１５，１２３９：１７１－９６を参照されたい。

【0058】

さらなる変種において、ＭｅｇａＴｅｖ構造は、メガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａ）のＧＩＹ－ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼＩ－ＴｅｖＩ（Ｔｅｖ）に由来するヌクレアーゼドメインとの融合物である。２つの活性部位は、ＤＮＡ基質上で約３０ｂｐ離れた位置にあり、適合性のない付着末端を伴う２つのＤＳＢを生成する；例えば、Ｗｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１４，４２，８８１６－２９を参照されたい。既存のヌクレアーゼに基づく手法の他の組合せは、発展することになり、且つ本明細書に記載される標的化ゲノム改変を実現するのに有用であることが予想される。

【0059】

ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ又はｄＣｐｆ１－ＦｏｋＩ及び他のヌクレアーゼ
上記のヌクレアーゼプラットフォームの構造的且つ機能的な特性を組み合わせることによって、固有の欠点のいくつかを克服できる可能性のあるゲノム編集へのさらなる手法を提供する。例として、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集系は通常、単一のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して、ＤＳＢを引き起こす。標的化の特異性は、標的ＤＮＡとワトソン－クリック塩基対形成を起こすガイドＲＮＡ中の２０又は２４個のヌクレオチド配列（その上、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９の場合においては隣接するＮＡＧ又はＮＧＧ ＰＡＭ配列中の追加の２塩基）によって促進される。そのような配列は、ヒトゲノムにおいて固有であるのに十分なほど長いが、ＲＮＡ／ＤＮＡ相互作用の特異性は絶対的ではなく、特に、標的配列の５’側の半分において著しい乱雑さが許容される場合があり、特異性を促進する塩基の数を効率的に低減する。これに対する一つの解決策は、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１の触媒機能を完全に不活性化し（ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合機能のみ保持する）、代わりに不活性化されたＣａｓ９にＦｏｋＩドメインを融合することであった；例えば、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０１４，３２：５６９－７６；及びＧｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０１４，３２：５７７－８２を参照されたい。ＦｏｋＩは二量体化して、触媒的に活性にならなければならないため、２つのガイドＲＮＡが、二量体を形成し且つＤＮＡを切断するために、近位に２つのＦｏｋＩ融合物を繋ぎ止めるために必要となる。これにより、組み合わされた標的部位における塩基の数が本質的に２倍になり、それによって、ＣＲＩＳＰＲに基づく系による標的化の厳密さが高まる。

【0060】

さらなる例として、Ｉ－ＴｅｖＩなどの触媒活性のあるＨＥへのＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの融合は、オフターゲット切断がさらに低減され得るとの期待をもって、ＴＡＬＥの調整可能なＤＮＡ結合及び特異性の両方、並びにＩ－ＴｅｖＩの切断配列特異性を利用する。

【0061】

ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ
本明細書で使用されるとおりのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ系は、野生型の例示的なエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９（米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号明細書の配列番号８又はＳａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３９（２１）：９２７５－９２８２（２０１１））と少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）と１０個の連続したアミノ酸にわたって少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を含み得る。エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）と１０個の連続したアミノ酸にわたって最大７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を含み得る。エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）とエンドヌクレアーゼのＨＮＨヌクレアーゼドメイン中の１０個の連続したアミノ酸にわたって少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を含み得る。エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）とエンドヌクレアーゼのＨＮＨヌクレアーゼドメイン中の１０個の連続したアミノ酸にわたって最大７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を含み得る。エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）とエンドヌクレアーゼのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン中の１０個の連続したアミノ酸にわたって少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を含み得る。エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）とエンドヌクレアーゼのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン中の１０個の連続したアミノ酸にわたって最大７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を含み得る。

【0062】

エンドヌクレアーゼは、野生型の例示的なエンドヌクレアーゼの改変形態を含み得る。野生型の例示的なエンドヌクレアーゼの改変形態は、エンドヌクレアーゼの核酸切断活性を低減する変異を含み得る。野生型の例示的なエンドヌクレアーゼの改変形態は、野生型の例示的なエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）の核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満を有し得る。エンドヌクレアーゼの改変形態は、実質的な核酸切断活性を有し得ない。エンドヌクレアーゼが、実質的な核酸切断活性を有しない改変形態であるとき、それは、「酵素活性のない」と本明細書で呼ばれる。

【0063】

企図される変異は、置換、付加、及び欠失、又はこれらの任意の組合せを含み得る。変異は、変異されるアミノ酸をアラニンに変換する。変異は、変異されるアミノ酸を別のアミノ酸（例えば、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、又はアルギニン）に変換する。変異は、変異されるアミノ酸を非天然アミノ酸（例えば、セレノメチオニン）に変換する。変異は、変異されるアミノ酸をアミノ酸ミミック（例えば、ホスホミミック）に変換する。変異は、保存的変異であってもよい。例えば、変異は、変異されるアミノ酸を、変異されるアミノ酸のサイズ、形状、電荷、極性、立体配座、及び／又は回転異性体と類似するアミノ酸に変換する（例えば、システイン／セリン変異、リジン／アスパラギン変異、ヒスチジン／フェニルアラニン変異）。変異は、リーディングフレームの移動及び／又は未成熟終止コドンの生成を引き起こす可能性がある。変異は、遺伝子の調節領域又は１つ以上の遺伝子の発現に影響を及ぼす座位に対する変化を引き起こす可能性がある。

【0064】

ガイドＲＮＡ
本開示は、ポリヌクレオチド内の特定の標的部位に対して関連するエンドヌクレアーゼの活性を方向づけることができるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。ガイドＲＮＡは、目的の標的核酸配列、及びＣＲＩＳＰＲリピート配列にハイブリダイズする少なくとも１つのスペーサー配列を含み得る。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系において、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡを含む。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ＣＲＩＳＰＲリピート配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズして、二重鎖を形成する。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系において、ｇＲＮＡは、二重鎖を形成するｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼに結合することができ、その結果、ｇＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼは複合体を形成する。ｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼとの会合のために複合体に対する標的特異性をもたらすことができる。したがって、ゲノム標的化核酸は、エンドヌクレアーゼの活性を方向づけることができる。

【0065】

例示的なガイドＲＮＡとしては、１５～２００個のヌクレオチドを含むスペーサー配列を含み、ｇＲＮＡは、ＧＲＣｈ３８ヒトゲノムアセンブリに基づくゲノム位置を標的化する。当業者によって理解されるとおり、各ｇＲＮＡは、そのゲノム標的部位又は領域に相補的なスペーサー配列を含むように設計され得る。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３７，８１６－８２１及びＤｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４７１，６０２－６０７を参照されたい。

【0066】

ｇＲＮＡは、二重分子ガイドＲＮＡであり得る。ｇＲＮＡは、一分子ガイドＲＮＡであり得る。

【0067】

二重分子ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの二本の鎖を含み得る。第１の鎖は、５’から３’方向において、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列及び最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含み得る。

【0068】

一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’方向において、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列、一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含み得る。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、ガイドＲＮＡに対する追加の機能性（例えば、安定性）に寄与する要素を含み得る。一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲリピート及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結して、ヘアピン構造を形成することができる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、１つ以上のヘアピンを含み得る。

【0069】

いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端で２０ヌクレオチドのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端で２０ヌクレオチド未満のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端で２０ヌクレオチドより長いスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端で１７～３０ヌクレオチドを有する可変長スペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、又は２００個を超えるヌクレオチドの長さを有するスペーサー延長配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個未満のヌクレオチドの長さを有するスペーサー延長配列を含む。

【0070】

いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、別の部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、又はリボザイム）を含むスペーサー延長配列を含む。部分は、核酸を標的化する核酸の安定性を低減することができるか又は増大させることができる。部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）であり得る。部分は、真核細胞において機能し得る。部分は、原核細胞において機能し得る。部分は、真核細胞及び原核細胞の両方において機能し得る。好適な部分の非限定的な例としては、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニレートキャップ（ｍ７ Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及びタンパク質複合体による安定性の調節並びに／又は接触性の調節を可能にする）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、クロロプラストなど）に標的化する配列、追跡をもたらす修飾又は配列（例えば、蛍光分子への直接的なコンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）、及び／又はタンパク質のための結合部位をもたらす修飾又は配列（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに対して作用するタンパク質）が挙げられる。

【0071】

いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド中の配列にハイブリダイズするスペーサー配列を含む。ｇＲＮＡのスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介して配列特異的な様式で標的ポリヌクレオチドと相互作用することができる。スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に依存して変化してもよい。

【0072】

ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ系において、スペーサー配列は、系において使用されるエンドヌクレアーゼのＰＡＭの５’に位置する標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするように設計され得る。スペーサーは、標的配列と完全に一致してもよいし、ミスマッチを有してもよい。各エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、それが標的ＤＮＡ中で認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９は、配列５’－ＮＲＧ－３’（ここで、Ｒは、Ａ又はＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列によって標的化される標的核酸配列の３’のすぐ近くにある）を含むＰＡＭを認識する。

【0073】

標的ポリヌクレオチド配列は、２０個のヌクレオチドを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、２０個未満のヌクレオチドを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、２０個より多いポリヌクレオチドを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個以上のヌクレオチドを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、最大５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個以上のヌクレオチドを含み得る。標的ポリヌクレオチド配列は、ＰＡＭの第１のヌクレオチドの５’のすぐ近くに２０個の塩基を含み得る。

【0074】

標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするスペーサー配列は、少なくとも約６個のヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有し得る。スペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ若しくは少なくとも約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約８０ｎｔ、約６ｎｔ～約５０ｎｔ、約６ｎｔ～約４５ｎｔ、約６ｎｔ～約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約３５ｎｔ、約６ｎｔ～約３０ｎｔ、約６ｎｔ～約２５ｎｔ、約６ｎｔ～約２０ｎｔ、約６ｎｔ～約１９ｎｔ、約１０ｎｔ～約５０ｎｔ、約１０ｎｔ～約４５ｎｔ、約１０ｎｔ～約４０ｎｔ、約１０ｎｔ～約３５ｎｔ、約１０ｎｔ～約３０ｎｔ、約１０ｎｔ～約２５ｎｔ、約１０ｎｔ～約２０ｎｔ、約１０ｎｔ～約１９ｎｔ、約１９ｎｔ～約２５ｎｔ、約１９ｎｔ～約３０ｎｔ、約１９ｎｔ～約３５ｎｔ、約１９ｎｔ～約４０ｎｔ、約１９ｎｔ～約４５ｎｔ、約１９ｎｔ～約５０ｎｔ、約１９ｎｔ～約６０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３５ｎｔ、約２０ｎｔ～約４０ｎｔ、約２０ｎｔ～約４５ｎｔ、約２０ｎｔ～約５０ｎｔ、又は約２０ｎｔ～約６０ｎｔであり得る。いくつかの例において、スペーサー配列は、２０個のヌクレオチドを含み得る。いくつかの例において、スペーサーは、１９個のヌクレオチドを含み得る。いくつかの例において、スペーサーは、１８個のヌクレオチドを含み得る。いくつかの例において、スペーサーは、２２個のヌクレオチドを含み得る。

【0075】

いくつかの例において、スペーサー配列と標的核酸の間の相補性パーセントは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％である。いくつかの例において、スペーサー配列と標的核酸の間の相補性パーセントは、最大約３０％、最大約４０％、最大約５０％、最大約６０％、最大約６５％、最大約７０％、最大約７５％、最大約８０％、最大約８５％、最大約９０％、最大約９５％、最大約９７％、最大約９８％、最大約９９％、又は１００％である。いくつかの例において、スペーサー配列と標的核酸の間の相補性パーセントは、標的核酸の相補鎖の標的配列の６個の連続した５’の大部分のヌクレオチドにわたって１００％である。スペーサー配列と標的核酸の間の相補性パーセントは、約２０個の連続したヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。スペーサー配列及び標的核酸の長さは、１～６個のヌクレオチドで異なってもよく、これは、バルジ又はバルジ（複数）と考えられ得る。

【0076】

ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、細胞中において最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列にハイブリダイズするヌクレオチドを含み得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、二重鎖、すなわち、塩基対形成した二本鎖構造を形成し得る。合わせると、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び最小ＣＲＩＳＰＲリピートは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合できる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも一部は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列にハイブリダイズできる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％相補的であり得る。

【0077】

最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド（ｎｔ）～約５０ｎｔ、約７ｎｔ～約４０ｎｔ、約７ｎｔ～約３０ｎｔ、約７ｎｔ～約２５ｎｔ、約７ｎｔ～約２０ｎｔ、約７ｎｔ～約１５ｎｔ、約８ｎｔ～約４０ｎｔ、約８ｎｔ～約３０ｎｔ、約８ｎｔ～約２５ｎｔ、約８ｎｔ～約２０ｎｔ、約８ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ又は約１５ｎｔ～約２５ｎｔ長であり得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ９ヌクレオチド長であり得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１２ヌクレオチドであり得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡは、上記のＪｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．において記載されるｔｒａｃｒＲＮＡ ｎｔ ２３～４８からなり得る。

【0078】

最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一続きの少なくとも６、７、又は８個の連続したヌクレオチドにわたって基準の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、野生型、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）配列と少なくとも約６０％同一であり得る。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一続きの少なくとも６、７、又は８個の連続したヌクレオチドにわたって基準の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と少なくとも約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一又は１００％同一であり得る。

【0079】

最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡの間の二重鎖は、二重らせんを含み得る。最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡの間の二重鎖は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上のヌクレオチドを含み得る。最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡの間の二重鎖は、最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上のヌクレオチドを含み得る。

【0080】

二重鎖は、ミスマッチを含み得る（すなわち、二重鎖の２本の鎖は、１００％相補的ではない）。二重鎖は、少なくとも約１、２、３、４、又は５個のミスマッチを含み得る。二重鎖は、最大約１、２、３、４、又は５個のミスマッチを含み得る。二重鎖は、２個以下のミスマッチを含み得る。

【0081】

いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、基準のｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。

【0082】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、約１ヌクレオチド～約４００ヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、又は２００個を超えるヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、約２０～約５０００個以上のヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個未満の長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１０未満のヌクレオチド長を含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１０～３０ヌクレオチド長であり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、３０～７０ヌクレオチド長であり得る。

【0083】

ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、機能性部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を含み得る。機能性部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）を含み得る。機能性部分は、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）～約１００ヌクレオチド、約１０ｎｔ～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約６０ｎｔ、約６０ｎｔ～約７０ｎｔ、約７０ｎｔ～約８０ｎｔ、約８０ｎｔ～約９０ｎｔ、若しくは約９０ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、又は約１５ｎｔ～約２５ｎｔの全長を有し得る。

【0084】

いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、約３ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有するリンカー配列を含み得る。上記のＪｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．において、例えば、単純な４ヌクレオチド「テトラループ」（－ＧＡＡＡ－）が使用された（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３７（６０９６）：８１６－８２１）。例示的なリンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）～約９０ｎｔ、約３ｎｔ～約８０ｎｔ、約３ｎｔ～約７０ｎｔ、約３ｎｔ～約６０ｎｔ、約３ｎｔ～約５０ｎｔ、約３ｎｔ～約４０ｎｔ、約３ｎｔ～約３０ｎｔ、約３ｎｔ～約２０ｎｔ、約３ｎｔ～約１０ｎｔの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔ～約５ｎｔ、約５ｎｔ～約１０ｎｔ、約１０ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２５ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約３５ｎｔ、約３５ｎｔ～約４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約６０ｎｔ、約６０ｎｔ～約７０ｎｔ、約７０ｎｔ～約８０ｎｔ、約８０ｎｔ～約９０ｎｔ、又は約９０ｎｔ～約１００ｎｔの長さを有し得る。一分子ガイド核酸のリンカーは、４～４０ヌクレオチドであり得る。リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、又は７０００個以上のヌクレオチドであり得る。リンカーは、最大約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、又は７０００個以上のヌクレオチドであり得る。

【0085】

リンカーは、様々な配列のうちのいずれかを含み得るが、いくつかの例において、リンカーは、ガイドの他の機能性領域に支障をきたすであろう分子内結合を引き起こす可能性があるガイドＲＮＡの他の部分と相同性の広範な領域を有する配列を含まないことになる。上記のＪｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．において、単純な４ヌクレオチド配列－ＧＡＡＡ－が使用されたが（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３７（６０９６）：８１６－８２１）、より長い配列を含む多数の他の配列が同様に使用されてもよい。

【0086】

リンカー配列は、機能性部分を含み得る。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質－相互作用ヘアピン、タンパク質結合部位、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、又はエクソンを含む１つ以上の特徴を含み得る。リンカー配列は、少なくとも約１、２、３、４、又は５個以上の機能性部分を含み得る。いくつかの例において、リンカー配列は、最大約１、２、３、４、又は５個以上の機能性部分を含み得る。

【0087】

いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、例えば、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まない。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、例えば、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つ以上のウラシルを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のウラシル（Ｕ）を含む。

【0088】

ｓｇＲＮＡは、化学修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、化学修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル糖修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、修飾された核酸骨格を含む。いくつかの実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル－ホスホロチオエート残基を含む。いくつかの実施形態では、化学修飾は、当該技術分野において記載されるとおり、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性又は程度を低減し、且つ／又は他の特質を増強する。

【0089】

いくつかの実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、修飾された骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、モルホリノ、メチルホスホネート、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間結合又は短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式糖間結合を含んでもよい。

【0090】

モルホリノ系化合物は、Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１４）：４５０３－４５１０；Ｇｅｎｅｓｉｓ，２００１，Ｖｏｌｕｍｅ ３０，Ｉｓｓｕｅ ３；Ｈｅａｓｍａｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００２，２４３：２０９－２１４；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０００，２６：２１６－２２０；Ｌａｃｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０００，９７：９５９１－９５９６；及び１９９１年７月２３日に登録された米国特許第５，０３４，５０６号明細書において記載されている。

【0091】

シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチドミメティックは、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２：８５９５－８６０２において記載されている。

【0092】

いくつかの実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、２’位において１つ以上の置換された糖部分、例えば、以下のもののうちの１つを含んでもよい：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ₃、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ₃、ＯＣＨ₃Ｏ（ＣＨ₂）ｎＣＨ₃、Ｏ（ＣＨ₂）ｎＮＨ₂、又はＯ（ＣＨ₂）ｎＣＨ₃（ｎは１～約１０である）；Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリール又はアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ₃；ＯＣＦ₃；Ｏ－、Ｓ－、又はＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、又はＮ－アルケニル；ＳＯＣＨ₃；ＳＯ₂ＣＨ₃；ＯＮＯ₂；ＮＯ₂；Ｎ₃；ＮＨ₂；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；干渉物質；２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）；２’－メトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ₃）；２’－プロポキシ（２’－ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃）；及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）。同様の修飾はまた、ｇＲＮＡ上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位でなされてもよい。いくつかの例において、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合の両方、すなわち、骨格は、新規の基で置き換えられてもよい。

【0093】

ガイドＲＮＡはまた、追加的に又は代替的に、核酸塩基（当該技術分野において単に「塩基」と呼ばれる場合が多い）修飾又は置換を含んでもよい。本明細書で使用する場合、「未修飾」又は「天然」核酸塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基としては、天然の核酸においてまれに又は一時的にのみ見出される核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６－メチルアデニン、５－Ｍｅピリミジン、特に、５－メチルシトシン（５－メチル－２’－デオキシシトシンとも呼ばれ、且つ当該技術分野において５－Ｍｅ－Ｃと呼ばれる場合が多い）、５－ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＭＨＣ及びゲントビオシルＨＭＣ、並びに合成核酸塩基、例えば、２－アミノアデニン、２－（メチルアミノ）アデニン、２－（イミダゾリルアルキル）アデニン、２－（アミノアルキルアミノ）アデニン又は他のヘテロ置換アルキルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、８－アザグアニン、７－デアザグアニン、Ｎ６（６－アミノヘキシル）アデニン、及び２，６－ジアミノプリンが挙げられる。Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ７５－７７，１９８０；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，１５：４５１３。当該技術分野において知られる「ユニバーサル」塩基、例えば、イノシンもまた含まれてもよい。５－Ｍｅ－Ｃ置換は、０．６～１．２℃によって核酸二重鎖の安定性を増大させることが示され（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，ｉｎ Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、塩基置換の態様である。

【0094】

修飾された核酸塩基は、５ーメチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－メチル並びに他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル並びに他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（プソイド－ウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル並びに他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチル並びに他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルクアニン（７－ｍｅｔｈｙｌｑｕａｎｉｎｅ）及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン、並びに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンなどの他の合成並びに天然核酸塩基を含んでもよい。

【0095】

ゲノム標的化核酸及びエンドヌクレアーゼの複合体
ｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ）と相互作用し、それにより複合体を形成する。ｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼを標的ポリヌクレオチドに導く。

【0096】

エンドヌクレアーゼ及びｇＲＮＡはそれぞれ、細胞又は対象に別々に投与され得る。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、１つ以上のガイドＲＮＡ、又はｔｒａｃｒＲＮＡと合わせた１つ以上のｃｒＲＮＡと予め複合体を形成し得る。次に、予め複合体を形成した材料が、細胞又は対象に投与され得る。そのような予め複合体を形成した材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られる。ＲＮＰ中のエンドヌクレアーゼは、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであってもよい。エンドヌクレアーゼは、１つ以上の核移行シグナル（ＮＬＳ）によって、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＮ末端及びＣ末端の両方で隣接され得る。例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、２つのＮＬＳであるＮ末端に位置する１つ目のＮＬＳ及びＣ末端に位置する２つ目のＮＬＳによって隣接され得る。ＮＬＳは、ＳＶ４０ ＮＬＳなどの当該技術分野において知られる任意のＮＬＳであり得る。ＲＮＰ中のゲノム標的化核酸とエンドヌクレアーゼの重量比は、１：１であり得る。例えば、ＲＮＰ中のｓｇＲＮＡとＣａｓ９エンドヌクレアーゼの重量比は、１：１であり得る。

【0097】

核酸コード化系構成要素
本開示は、本開示のゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、本開示のエンドヌクレアーゼ、及び／又は本開示の方法の態様を実行するのに必要な任意の核酸若しくはタンパク質性分子を提供する。コード化核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はその組合せであり得る。

【0098】

本開示のゲノム標的化核酸をコードする核酸、本開示のエンドヌクレアーゼ、及び／又は本開示の方法の態様を実行するのに必要な任意の核酸若しくはタンパク質性分子は、ベクター（例えば、組換え発現ベクター）を含み得る。

【0099】

用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。ベクターの１つの型は、追加の核酸セグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。ベクターの別の型は、ウイルスベクターであり、追加の核酸セグメントは、ウイルスゲノムにライゲートされ得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞における自律的複製が可能である（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。

【0100】

いくつかの例において、ベクターは、それらが作動可能に連結される核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」、又はより単純には、同じ機能を果たす「発現ベクター」と呼ばれる。

【0101】

用語「作動可能に連結された」は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されていることを意味する。用語「調節配列」は、例えば、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような調節配列は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９０，１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡにおいて記載されている。調節配列としては、宿主細胞の多くの型においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、ある種の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計が、標的細胞の選択、所望される発現のレベルなどの要因に依存し得ることは当業者によって認識されることになる。

【0102】

企図される発現ベクターとしては、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、並びにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳癌ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）及び他の組換えベクターに基づくウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。真核生物の標的細胞のために企図される他のベクターとしては、ベクターｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞と適合する限り、他のベクターを使用してもよい。

【0103】

いくつかの例において、ベクターは、１つ以上の転写及び／又は翻訳制御エレメントを含んでもよい。利用される宿主／ベクター系に依存して、構成的プロモーター及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むいくつかの好適な転写及び翻訳制御エレメントのうちのいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る。ベクターは、ウイルス配列又はＣＲＩＳＰＲ機構若しくは他のエレメントの構成要素のいずれかを不活性化する自己不活性化ベクターであってもよい。

【0104】

好適な真核生物のプロモーター（すなわち、真核細胞において機能するプロモーター）の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の末端反復配列（ＬＴＲ）、ヒト伸長因子－１プロモーター（ＥＦ１）、ニワトリベータ－アクチンプロモーター（ＣＢＡ）、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ニワトリベータ－アクチンプロモーターに融合されたサイトメガロウイルスエンハンサーを含むハイブリッドコンストラクト（ＣＡＧ）、プロモーター、第１エクソン、及びニワトリベータ－アクチン遺伝子の第１イントロンに融合されたサイトメガロウイルスエンハンサーを含むハイブリッドコンストラクト（ＣＡＧ又はＣＡＧＧＳ）、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１座位プロモーター（ＰＧＫ）、及びマウスメタロチオネイン－Ｉプロモーターに由来するものが挙げられる。

【0105】

プロモーターは、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体調節性プロモーターなど）であってもよい。プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＣＡＧプロモーター）であってもよい。いくつかの場合において、プロモーターは、空間に制約されるプロモーター及び／又は時間に制約されるプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）であってもよい。

【0106】

本開示の複合体、ポリペプチド、及び核酸の細胞への導入は、ウイルス又はバクテリオファージ感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接的マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介性核酸送達などによって行われてもよい。

【0107】

ＩＩＩ．免疫応答を回避し、生存期間を増加させる戦略
本明細書では、遺伝子改変細胞、すなわち、ユニバーサルドナー細胞が、免疫応答を回避し、且つ／又は対象への生着後のそれらの生存期間、又は生存率を増加させることを可能にする戦略が記載される。いくつかの実施形態では、これらの戦略は、ユニバーサルドナー細胞が、未改変細胞より高い成功率で免疫応答を回避し、且つ／又は生存することを可能にする。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、未改変細胞に対して、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子内又は近傍での少なくとも１つの遺伝子改変；未改変細胞に対して、免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現を増加させる少なくとも１つの遺伝子改変；並びに／又は未改変細胞に対して、生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を改変する少なくとも１つの遺伝子改変の導入を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、未改変細胞に対して、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子内又は近傍での少なくとも１つの遺伝子改変；未改変細胞に対して、免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現を増加させる少なくとも１つの遺伝子改変；並びに未改変細胞に対して、生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を改変する少なくとも１つの遺伝子改変の導入を含む。他の実施形態では、遺伝子改変細胞は、未改変細胞に対して、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現を改変する少なくとも１つの遺伝子内又は近傍での少なくとも１つの欠失又は挿入－欠失変異；並びに１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩ ＨＬＡの発現を改変する遺伝子の欠失の部位と部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位での少なくとも１つの免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つの挿入を含む。さらに他の実施形態では、遺伝子改変細胞は、未改変細胞に対して、生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を改変する少なくとも１つの遺伝子改変を含む。

【0108】

主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）をコードする遺伝子は、ヒトＣｈｒ．６ｐ２１上に位置する。ＭＨＣ遺伝子によってコードされる結果としてのタンパク質は、細胞移植中のドナー適合性に必須である一連の表面タンパク質である。ＭＨＣ遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）及びＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）に分類される。ＭＨＣ－Ｉ遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ）は、ほとんど全ての組織型において発現され、「非自己」の抗原がプロセシングされたペプチドをＣＤ８＋Ｔ細胞に提示し、それにより細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞へのそれらの活性化を促進する。「非自己」ＭＨＣ－Ｉ分子を発現する移植された細胞又は生着された細胞は、これらの細胞に向けられる強い細胞性免疫応答を引き起こすことになり、最終的に、活性化された細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞によるそれらの消滅をもたらす。ＭＨＣ－Ｉタンパク質は、本質的に、小胞体中のベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と関連し、これは細胞表面上で機能的ＭＨＣ－Ｉ分子を形成するのに必須である。加えて、免疫調節機能を有する３つの非古典的ＭＨＣ－１ｂ分子（ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇ）が存在する。ＭＨＣ－ＩＩ生体分子としては、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲが挙げられる。免疫応答におけるそれらの主要な機能に起因して、ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩ生体分子は、非宿主細胞の細胞生着、例えば、再生医療を目的とする細胞生着後の免疫拒絶に寄与する。

【0109】

ＭＨＣ－Ｉ細胞表面分子は、ＭＨＣにコードされる重鎖（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ）及びインバリアントなサブユニットベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）で構成される。したがって、細胞内でのＢ２Ｍ濃度の低減は、ＭＨＣ－Ｉ細胞表面分子の細胞表面発現を低減する効果的な方法を可能にする。

【0110】

いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩ遺伝子の遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＨＣ－Ｉ及び／又はＭＨＣ－ＩＩの発現を調節する１つ以上のポリヌクレオチド配列の遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変は、本明細書に記載される方法を含むが、それらに限定されない任意の遺伝子編集方法を使用して実施される。

【0111】

いくつかの実施形態では、未改変細胞に対して、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現を減少させることは、例えば、ＭＨＣ－Ｉ及び／又はＭＨＣ－ＩＩ遺伝子における直接的な少なくとも１つの塩基対の遺伝子欠失及び／又は挿入のための標的化によって達成される。いくつかの実施形態では、未改変細胞に対して、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現を減少させることは、例えば、遺伝子欠失のために、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化することによって達成される。いくつかの実施形態では、未改変細胞に対して、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現を減少させることは、例えば、遺伝子欠失のために、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの少なくとも１つの転写調節因子を標的化することによって達成される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子は、ＮＬＲＣ５、又はＣＩＩＴＡ遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子は、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＩＲＦ－１、及び／又はＴＡＰ１遺伝子である。

【0112】

いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及び／又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子の全体又は一部を欠失させるために改変されている。いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及び／又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子のプロモーター領域の全体又は一部を欠失させるために改変されている。いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子をコードする遺伝子の全体又は一部を欠失させるために改変されている。いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子をコードする遺伝子のプロモーター領域の全体又は一部を欠失させるために改変されている。

【0113】

いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現を減少させるために改変されている。Ｂ２Ｍは、全ての多型ＭＨＣクラスＩ重鎖の表面発現に必要となる共有のタンパク質サブユニットをコードする非多型遺伝子である。ＨＬＡ－Ｉタンパク質は、小胞体においてＢ２Ｍと直接的に会合し、これは機能性の細胞表面で発現されるＨＬＡ－Ｉ分子を形成するのに必須である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ３’配列（配列番号１）を含むＢ２Ｍ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’ＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧ３’配列（配列番号２）を含むＢ２Ｍ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’ＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡＡＧＧＣＣＡ３’配列（配列番号３）を含むＢ２Ｍ遺伝子内の部位を標的化する。代替的な実施形態では、ｇＲＮＡは、以下の配列のいずれかを含むＢ２Ｍ遺伝子内の部位を標的化する：５’－ＴＡＴＡＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣＧＣＧＣ－３’（配列番号３５）、５’－ＧＡＧＴＡＧＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡ－３’（配列番号３６）、５’－ＡＣＴＧＧＡＣＧＣＧＴＣＧＣＧＣＴＧＧＣ－３’（配列番号３７）、５’－ＡＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣＧＣＧＣＴＧＧ－３’（配列番号３８）、５－ＧＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡＴＣＴ－３’（配列番号３９）、５’－ＧＣＣＣＧＡＡＴＧＣＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣ－３’（配列番号４０）、５’－ＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣ－３’（配列番号４１）、５’－ＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣ－３’（配列番号４２）、５’－ＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴ－３’（配列番号４３）、又は５’－ＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧ－３’（配列番号４４）。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、又は配列番号４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体は、Ｂ２Ｍ座位中の標的部位を標的化し、且つ切断する。ＮＨＥＪによる二本鎖切断の修復は、少なくともヌクレオチド上の欠失及び／又は少なくとも１つのヌクレオチドの挿入をもたらす可能性があり、それによりＢ２Ｍの発現を破壊するか又は消失させる。或いは、Ｂ２Ｍ座位は、それぞれ異なるｇＲＮＡを含む少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲ系によって標的化される場合があり、その結果、Ｂ２Ｍ座位中の２つの部位での切断が、２つの切断の間の配列の欠失をもたらし、それによりＢ２Ｍの発現を消失させる。

【0114】

いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）の発現を減少させるために改変されている。ＣＩＩＴＡは、タンパク質のＬＲ又はヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのメンバーであり、ＭＨＣエンハンセオソームと会合することによってＭＨＣ－ＩＩの転写を調節する。ＣＩＩＴＡの発現は、発生段階に応じてＢ細胞及び樹状細胞において誘導され、大部分の細胞型においてＩＦＮ－γによって誘導可能である。

【0115】

いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、ＮＬＲファミリーであるＣＡＲＤドメイン含有５（ＮＬＲＣ５）の発現を減少させるために改変されている。ＮＬＲＣ５は、ＭＨＣ－Ｉ媒介性免疫応答の非常に重要な調節因子であり、ＣＩＩＴＡと同様に、ＮＬＲＣ５は、ＩＦＮ－γによって高度に誘導可能であり、核内に移動できる。ＮＬＲＣ５は、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子のプロモーターを活性化し、ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－Ｉ抗原提示に関与する関連遺伝子の転写を誘導する。

【0116】

いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子を、遺伝子改変細胞に挿入又は再挿入して、免疫特権のあるユニバーサルドナー細胞を作製することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるユニバーサルドナー細胞はさらに、１つ以上の免疫寛容原性因子を発現するために改変されている。例示的な免疫寛容原性因子としては、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、ＣＤ４７、ＣＩ－阻害剤、及びＩＬ－３５のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの遺伝子改変、例えば、挿入は、生着後に未改変細胞より少なくとも１．０５倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又は少なくとも５０倍高い率でユニバーサルドナー細胞が免疫拒絶を阻害するか又は回避することを可能にする。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ４７、及び／又はＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドの挿入は、宿主対象への移植又は生着後にユニバーサルドナー細胞が免疫拒絶を阻害するか又は回避することを可能にする。

【0117】

免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドは一般に、免疫寛容原性因子をコードする配列に隣接する左及び右ホモロジーアームを含む。ホモロジーアームは、標的化される挿入部位又はその近傍にあるゲノムＤＮＡと実質的な配列相同性を有する。例えば、左ホモロジーアームは、標的部位又は切断部位の左又は上流に位置する領域と相同なヌクレオチド配列であり得るし、右ホモロジーアームは、標的部位又は切断部位の右又は下流に位置する領域と相同なヌクレオチド配列であり得る。各ホモロジーアームの近位端は、切断部位に隣接するゲノムＤＮＡ配列と相同であり得る。或いは、各ホモロジーアームの近位端は、切断部位から最大約１０、２０、３０、４０、５０、６０、又は７０核酸塩基離れて位置するゲノムＤＮＡ配列と相同であり得る。そのため、免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドは、切断部位の約１０、２０、３０、４０、５０、６０、又は７０塩基対以内の標的化される遺伝子座位に挿入され得るし、且つ切断部位に隣接する（及びホモロジーアームと相同性を有しない）さらなるゲノムＤＮＡが、欠失され得る。ホモロジーアームは、約５０ヌクレオチドから数千ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ホモロジーアームは、約５００ヌクレオチドから約１０００ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。ホモロジーアームとゲノムＤＮＡの間の実質的な配列相同性は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％であり得る。

【0118】

いくつかの実施形態では、ホモロジーアームは、Ｂ２Ｍガイド（例えば、配列番号１～３又は３５～４４のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡ）とともに使用される。いくつかの実施形態では、ホモロジーアームは、Ｂ２Ｍ遺伝子の開始部位を除去することになる任意のＢ２Ｍガイドとともに使用されるように設計される。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍホモロジーアームは、配列番号１３若しくは１９のポリヌクレオチド配列、又は配列番号１３若しくは１９のものと少なくとも８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得るか又はそれから本質的になり得る。いくつかの実施形態では、左Ｂ２Ｍホモロジーアームは、配列番号１３、又は配列番号１３のものと少なくとも８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得るか又はそれから本質的になり得る。いくつかの実施形態では、右Ｂ２Ｍホモロジーアームは、配列番号１９、又は配列番号１９のものと少なくとも８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得るか又はそれから本質的になり得る。

【0119】

少なくとも１つの免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、外来プロモーターに作動可能に連結され得る。外来プロモーターは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、又は細胞型特異的プロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、外来プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦｌａ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、又はＵＢＣプロモーターである。

【0120】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、セーフハーバー座位、例えば、ＡＡＶＳ１座位に挿入される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子、又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子と部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される（すなわち、その中又は近傍にある）ゲノムＤＮＡの部位又は領域に挿入される。

【0121】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座位内又は近傍の部位で挿入される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子若しくはプロモーターの全て又は部分の欠失と一致するか、又はそれに続くＢ２Ｍ遺伝子座位内又は近傍にある部位で挿入される。ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、外来プロモーターに作動可能に連結される。外来プロモーターは、ＣＭＶプロモーターであり得る。

【0122】

いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座位内又は近傍の部位で挿入される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子若しくはプロモーターの全て又は部分の欠失と一致するか、又はそれに続くＢ２Ｍ遺伝子座位内又は近傍にある部位で挿入される。ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、外来プロモーターに作動可能に連結される。外来プロモーターは、ＣＭＶプロモーターであり得る。

【0123】

いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子座位内又は近傍にある部位で挿入される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、若しくはＨＬＡ－Ｃ遺伝子若しくはプロモーターの欠失と一致するか、又はそれに続くＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、若しくはＨＬＡ－Ｃ遺伝子座位内又は近傍にある部位で挿入される。

【0124】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、ＣＩＩＴＡ遺伝子座位内又は近傍の部位で挿入される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、ＣＩＩＴＡ遺伝子若しくはプロモーターの欠失と一致するか、又はそれに続くＣＩＩＴＡ遺伝子座位内又は近傍にある部位で挿入される。

【0125】

いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、ＣＩＩＴＡ遺伝子座位内若しくは近傍の部位にあるＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドの挿入と一致するＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、若しくはＨＬＡ－Ｃ遺伝子座位内又は近傍の部位で挿入される。

【0126】

いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の生存因子の発現の増加又は減少を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、生存因子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列の挿入を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、さらなる生存因子のうちの１つの欠失を含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変は、本明細書に記載される方法を含むが、それらに限定されない任意の遺伝子編集方法を使用して実施される。いくつかの実施形態では、細胞は、未改変細胞に対して、少なくとも１つの生存因子の発現の増加又は減少を含む。いくつかの実施形態では、生存因子は、細胞生存に関与するメンバー又は決定的な経路、例えば、低酸素、活性酸素種、栄養欠乏、及び／又は酸化ストレスである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの生存因子の遺伝子改変は、生着後に未改変細胞より長い期間、例えば、少なくとも１．０５倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又は少なくとも５０倍長い期間ユニバーサルドナー細胞が生存することを可能にする。いくつかの実施形態では、生存因子は、ＺＮＦ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１、ＪＮＫ、又はＭＡＮＦである。

【0127】

いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドの挿入を含み、未改変細胞に対して、宿主対象への移植又は生着の後にユニバーサルドナー細胞がより高い生存率で生存することを可能にする。いくつかの実施形態では、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドは、セーフハーバー座位に挿入される。いくつかの実施形態では、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドは、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子に属する遺伝子に挿入される。

【0128】

いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、ＺＮＦ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１、及び／又はＪＮＫ遺伝子の全体又は一部を欠失させるために改変されている。いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、ＺＮＦ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１、及び／又はＪＮＫ遺伝子のプロモーター領域の全体又は一部を欠失させるために改変されている。

【0129】

いくつかの実施形態では、２つ以上の生存因子が、細胞内で遺伝子改変される。

【0130】

ある種の実施形態では、ＭＨＣ－ＩＩ発現を有しない且つＭＨＣ－Ｉの中程度の発現を有する細胞は、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの表面発現を有しないように遺伝子改変される。別の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ／ＩＩの表面発現を有しない細胞はさらに、ＰＤ－Ｌ１の発現、例えば、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドの挿入を有するように編集される。さらに別の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ／ＩＩの表面発現を有しない細胞はさらに、ＰＤ－Ｌ１の発現、例えば、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドの挿入を有するように編集され、且つ未改変細胞に対して、生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させるか又は減少させるようにも遺伝子改変される。

【0131】

いくつかの実施形態では、細胞はさらに、例えば、遺伝子改変による、生着後の免疫回避又は細胞生存のいずれかに必ずしも関係づけられない１つ以上のさらなる遺伝子の発現の増加又は減少を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、未改変細胞に対して、１つ以上の安全スイッチタンパク質の発現の増加を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、安全スイッチタンパク質をコードする１つ以上のさらなる遺伝子の発現の増加を含む。いくつかの実施形態では、安全スイッチはまた、自殺遺伝子である。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、単純ヘルペスウイルス－１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）又は誘導性カスパーゼ－９である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの安全スイッチをコードするポリヌクレオチドは、ゲノムに、例えば、セーフハーバー座位に挿入される。いくつかの他の実施形態では、遺伝子改変される１つ以上のさらなる遺伝子は、コンストラクトとともに組み込まれた安全スイッチタンパク質；標的化モダリティー；受容体；シグナル伝達分子；転写因子；薬学的に活性なタンパク質又はペプチド；薬物標的候補；並びにその生着、輸送、回遊、生存率、自己再生、持続、及び／又は生存を促進するタンパク質のうちの１つ以上をコードする。

【0132】

本発明の一態様は、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞を作製する方法（ユニバーサルドナー細胞は、ゲノム中の１つ以上の選択された部位で少なくとも１つの標的化されたゲノム改変を含む）であって、選択された部位で標的化された改変を可能にする１つ以上のコンストラクトを前記細胞に導入することによって本明細書に記載されるとおりの細胞型を遺伝子操作すること；選択された部位認識ができる１つ以上のエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位で１つ以上の二本鎖切断を前記細胞に導入すること；及び選択された部位で標的化された挿入又は欠失を生成するための内在性ＤＮＡ修復を可能にするように編集された細胞を培養し；それによりゲノム改変されたユニバーサルドナー細胞を得ることを含む方法を提供する。この方法によって作製されたユニバーサルドナー細胞は、少なくとも１つの機能的な標的化されたゲノム改変を含むことになり、且つゲノム改変された細胞は、それらが幹細胞である場合、前駆細胞又は完全に分化した細胞に分化することができる。

【0133】

いくつかの他の実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、又はＤ－Ｌ１のうちの少なくとも１つにおける発現の導入又は増加を含む。いくつかの実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、ＨＬＡクラスＩ及び／又はクラスＩＩ欠損である。いくつかの実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、Ｂ２Ｍヌル又は不十分なＢ２Ｍを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、及びＰＤ－Ｌ１のうちの１つ以上をコードする組込み又は非組込み外来ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、導入された前記発現は、前記細胞中に含まれる発現されないか又は不十分に発現される遺伝子のいずれかにから発現が増加したものである。いくつかの実施形態では、非組込み外来ポリヌクレオチドは、センダイウイルス、ＡＡＶ、エピソーム、又はプラスミドを使用して導入される。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、Ｂ２Ｍヌルであり、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１のうちの１つ以上の発現の導入、及び少なくとも１つの安全スイッチタンパク質の発現の増加又は減少を伴う。別の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃヌルであり、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、及び少なくとも１つの安全スイッチタンパク質のうちの１つ以上の発現の導入を伴う。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、Ｂ２Ｍヌルであり、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１のうちの１つ以上の発現の導入、及び少なくとも１つの生存因子、例えば、ＭＡＮＦの発現の増加又は減少を伴う。本明細書に記載される遺伝子改変細胞のいずれかを作製する方法は、本明細書に記載される遺伝子編集方法のうちの少なくともいずれかを使用して実施されることが企図される。

【0134】

ＩＶ．細胞型
本明細書に記載されるとおりの細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞（及び対応する未改変細胞）は、任意の可能なクラスの細胞型に属してもよい。いくつかの実施形態では、細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞（及び対応する未改変細胞）は、哺乳動物細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞（及び対応する未改変細胞）は、ヒト細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞（及び対応する未改変細胞）は、幹細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞（及び対応する未改変細胞）は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞（及び対応する未改変細胞）は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞（及び対応する未改変細胞）は、分化細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞（及び対応する未改変細胞）は、体細胞、例えば、免疫系細胞又は収縮細胞、例えば、骨格筋細胞であってもよい。

【0135】

本明細書に記載される細胞、例えば、ユニバーサルドナー幹細胞は、ＨＬＡ発現、及びユニバーサル幹細胞株の免疫原性の評価を判断するために適切な細胞型に分化され得る。一般に、分化は、細胞が目的の分化細胞に分化するのに十分な期間及び条件下で目的の細胞を維持することを含む。例えば、本明細書で開示されるユニバーサルドナー細胞は、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）、低免疫原性心筋細胞、筋肉前駆細胞、芽球細胞、内皮細胞（ＥＣ）、マクロファージ、幹細胞、ベータ細胞（例えば、膵ベータ細胞）、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌前駆細胞、又は神経前駆細胞（ＮＰＣ）に分化され得る。

【0136】

幹細胞は、増殖及びさらなる前駆細胞を生じさせる能力の両方があり、これらは分化した娘細胞又は分化可能な娘細胞を生じさせることができる多数の母細胞を生成する能力を有する。娘細胞自体は、増殖し、引き続いて１つ以上の成熟細胞型に分化する後代を生成するように誘導され得るが、親の発生潜在力を有する１つ以上の細胞も保持する。次に、用語「幹細胞」は、特定の状況下でさらに特定的な表現型又は分化した表現型に分化する能力又は潜在力を有し、且つ一定の状況下で、実質的に分化することなく増殖する能力を保持する細胞を指す。一態様では、前駆細胞又は幹細胞という用語は、全般的な母細胞を指し、その子孫（後代）は、分化、例えば、胚細胞及び組織の漸進的な多様化に見られるとおり、完全に個別の特徴を獲得することによって、多くの場合異なる方向に特殊化する。細胞分化は、典型的には多くの細胞分裂を介して起こる複雑なプロセスである。分化細胞は、それ自体が多能性細胞などに由来する多能性細胞に由来し得る。これらの多能性細胞の各々は、幹細胞であると考えられ得るが、各々が生じさせることができる細胞型の範囲は、非常に変動し得る。一部の分化細胞はまた、より高い発生潜在力を有する細胞を生じさせる能力を有する。そのような能力は、天然であってもよいし、様々な因子による処理時に人工的に誘導されてもよい。多くの生物学的な例において、幹細胞はまた、それらが、２つ以上の異なる細胞型の後代を生成できるため「多能性」であり得るが、これは「幹細胞性」に必要ではない。

【0137】

「分化細胞」は、比較される細胞より発生経路がさらに進んだ細胞である。したがって、幹細胞は、系列限定前駆体細胞（筋細胞前駆細胞など）に分化することができ、これは、さらに進んだ経路の他の型の前駆細胞（筋細胞前駆体など）、続いて筋細胞などの最終段階の分化細胞に分化することができ、ある種の組織型において特徴的な役割を果たし、且つさらに増殖する能力を保持する場合があるか又は保持しない場合がある。

【0138】

胚性幹細胞
本明細書に記載される細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）であってもよい。ＥＳＣは、哺乳動物胚の未分化胚芽細胞に由来し、任意の細胞型に分化し、迅速に増殖することができる。ＥＳＣはまた、正常な核型を有すると考えられており、高いテロメラーゼ活性を維持し、且つ顕著な長期間の増殖ポテンシャルを呈し、これらの細胞をユニバーサルドナー細胞としての使用のための優れた候補にする。

【0139】

成体幹細胞
本明細書に記載される細胞は、成体幹細胞（ＡＳＣ）であってもよい。ＡＳＣは、哺乳動物、例えば、ヒトにおいて見出され得る未分化細胞である。ＡＳＣは、それらの自己再生する、例えば、未分化状態を維持しながら複数のラウンドの細胞複製を通して継代される能力、及び複数の異なる細胞型、例えば、グリア細胞に分化する能力によって定義される。成体幹細胞は、造血幹細胞、乳腺幹細胞、腸管幹細胞、間葉系幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経冠幹細胞、及び精巣細胞を包含し得る広範なクラスの幹細胞である。

【0140】

人工多能性幹細胞
本明細書に記載される細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。ｉＰＳＣは、多能性に関与する決定的な転写因子、例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、及びＫｌｆ４をコードする遺伝子を導入することによって成体ヒト細胞から直接的に作製され得る。ｉＰＳＣは、引き続く前駆細胞が投与されることになる同じ対象に由来し得る。すなわち、体細胞は、対象から得られ、人工多能性幹細胞に初期化され、続いて対象に投与されることになる前駆細胞（例えば、自己細胞）に再分化され得る。しかしながら、自己細胞の場合、生着後の免疫応答及び不十分な生存率のリスクは残存する。

【0141】

ヒト造血幹細胞・前駆細胞
本明細書に記載される細胞は、ヒト造血幹細胞・前駆細胞（ｈＨＳＰＣ）であってもよい。この幹細胞系列は、赤血球系（赤血球又は赤血球細胞（ＲＢＣ））、骨髄性（単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、巨核球／血小板、及び樹状細胞）、及びリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む全ての血液細胞型を生じさせる。血液細胞は、自己再生によってそれ自体を補充する能力を有する非常に少数の多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）の増殖及び分化によって産生される。分化の間、ＨＳＣの後代は、様々な中間の成熟段階を通って発達し、成熟に達する前に多分化能を有し且つ系列に関係付けられた前駆細胞を生成する。骨髄（ＢＭ）は、ヒトにおける造血発生の主要な部位であり、通常の条件下で、ほんの少数の造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）が、末梢血液（ＰＢ）中に見出され得る。サイトカイン、癌治療において使用されるいくつかの骨髄抑制性薬物、及び造血間質細胞とＢＭ間質細胞の間の相互作用を破壊する化合物による治療により、多数の幹細胞及び前駆細胞を血行へと迅速に動員できる。

【0142】

他の細胞型への細胞の分化
本開示の方法の別の工程は、分化細胞へと細胞を分化させることを含み得る。分化させる工程は、当該技術分野において知られる任意の方法に従って実施され得る。例えば、ヒトｉＰＳＣは、アクチビン及びＢ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む様々な処理を使用して胚体内胚葉に分化される。胚体内胚葉はさらに、肝細胞に分化され、処理は、ＦＧＦ４、ＨＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、オンコスタチンＭ、デキサメタゾンなどを含む。（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０１０；２８：６７４－６８６；Ｍａ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１３；２：４０９－４１９）。別の実施形態では、分化させる工程は、Ｓａｗｉｔｚａ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５；５：１３３２０に従って実施され得る。分化細胞は、哺乳動物、例えば、ヒトの任意の体細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、体細胞は、内分泌性上皮細胞（例えば、甲状腺ホルモン分泌細胞、副腎皮質細胞）、外分泌性上皮細胞（例えば、唾液腺粘液細胞、前立腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例えば、下垂体前葉細胞、膵島細胞）、角化上皮細胞（例えば、表皮角化細胞）、湿性重層化障壁上皮細胞、感覚変換細胞（例えば、光受容体）、自律神経性神経細胞、感覚器及び末梢ニューロン支持細胞（例えば、シュワン細胞）、中枢神経系ニューロン、グリア細胞（例えば、星状細胞、乏突起膠細胞）、レンズ細胞、脂肪細胞、腎細胞、バリア機能細胞（例えば、導管細胞）、細胞外マトリックス細胞、収縮細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞）、血液細胞（例えば、赤血球）、免疫系細胞（例えば、巨核球、ミクログリア細胞、好中球、マスト細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞）、生殖細胞（例えば、精子細胞）、ナース細胞、又は間質細胞であってもよい。

【0143】

Ｖ．製剤化及び投与
遺伝子編集のための製剤化及び送達
本明細書に記載されるとおりのガイドＲＮＡ、ポリヌクレオチド、例えば、免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチド又はエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、及びエンドヌクレアーゼは、当該技術分野において知られる任意の様式で製剤化され、細胞に送達され得る。

【0144】

ガイドＲＮＡ及び／又はポリヌクレオチドは、特定の投与様式及び剤形に依存して、担体、溶媒、安定剤、アジュバント、希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化され得る。ガイドＲＮＡ及び／又はポリヌクレオチド組成物は、製剤化及び投与経路に依存して、生理学的に適合性のｐＨ、及び約３のｐＨ～約１１のｐＨ、約３のｐＨ～約７のｐＨの範囲に達するように製剤化され得る。いくつかの場合において、ｐＨは、約ｐＨ５．０～約ｐＨ８の範囲に調整され得る。いくつかの場合において、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とともに、本明細書に記載されるとおりの治療有効量の少なくとも１つの化合物を含み得る。任意選択により、組成物は、本明細書に記載される化合物の組合せを含んでもよいし、細菌増殖の処置又は予防において有用な第２の活性成分（限定されないが、例えば、抗細菌剤又は抗微生物剤）を含んでもよいし、本開示の試薬の組合せを含んでもよい。

【0145】

好適な賦形剤としては、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性ウイルス粒子などの巨大でゆっくりと代謝される高分子を含む担体分子が挙げられる。他の例示的な賦形剤としては、抗酸化剤（限定されないが、例えば、アスコルビン酸）、キレート剤（限定されないが、例えば、ＥＤＴＡ）、炭水化物（限定されないが、例えば、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、及びヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（限定されないが、例えば、油、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノール）、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質などを挙げることができる。

【0146】

ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）及び／又はエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）は、当該技術分野において知られるウイルス性又は非ウイルス性送達ビヒクルによって送達され得る。或いは、エンドヌクレアーゼポリペプチドは、エレクトロポレーション又は脂質ナノ粒子などの当該技術分野において知られるウイルス性又は非ウイルス性送達ビヒクルによって送達され得る。さらなる代替的な態様では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つ以上のポリペプチドとして、単独で又は１つ以上のガイドＲＮＡ、若しくはｔｒａｃｒＲＮＡと合わせた１つ以上のｃｒＲＮＡと予め複合体を形成して送達され得る。

【0147】

ポリヌクレオチドは、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正に荷電したペプチド、小分子ＲＮＡコンジュゲート、アプタマー－ＲＮＡキメラ、及びＲＮＡ－融合タンパク質複合体を含むが、これらに限定されない非ウイルス性ビヒクルによって送達され得る。いくつかの例示的な非ウイルス性送達ビヒクルは、Ｐｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１１，１８：１１２７－１１３３（他のポリヌクレオチドの送達にも有用であるｓｉＲＮＡのための非ウイルス性送達ビヒクルに焦点を当てている）において記載される。

【0148】

本開示のポリヌクレオチドに関して、製剤化は、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０号パンフレットにおいて教示されるもののうちのいずれかから選択され得る。

【0149】

ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、及びエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって細胞又は対象に送達され得る。

【0150】

ＬＮＰは、１０００ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、２５０ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、７５ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、又は２５ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。或いは、ナノ粒子は、１～１０００ｎｍ、１～５００ｎｍ、１～２５０ｎｍ、２５～２００ｎｍ、２５～１００ｎｍ、３５～７５ｎｍ、又は２５～６０ｎｍのサイズの範囲であり得る。

【0151】

ＬＮＰは、カチオン性、アニオン性、又は中性脂質から作製され得る。膜融合リン脂質ＤＯＰＥ又は膜成分コレステロールなどの中性脂質は、トランスフェクション活性及びナノ粒子安定性を増強する「ヘルパー脂質」としてＬＮＰ中に含まれ得る。カチオン性脂質の制約としては、不十分な安定性及び迅速なクリアランス、並びに炎症性又は抗炎症性応答の発生に起因する低い有効性が挙げられる。

【0152】

ＬＮＰはまた、疎水性脂質、親水性脂質、又は疎水性脂質及び親水性脂質の両方で構成され得る。

【0153】

当該技術分野において知られる任意の脂質又は脂質の組合せを使用して、ＬＮＰを生成することができる。ＬＮＰを生成するために使用される脂質の例は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ－コレステロール、ＤＯＴＡＰ－コレステロール、ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ－ＤＰｙＰＥ、及びＧＬ６７Ａ－ＤＯＰＥ－ＤＭＰＥ－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。カチオン性脂質の例は、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、及び７Ｃ１である。中性脂質の例は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭである。ＰＥＧ修飾脂質の例は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４、及びＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０である。

【0154】

脂質は、ＬＮＰを生成するために任意の数のモル比において組み合わされ得る。加えて、ポリヌクレオチドは、ＬＮＰを生成するために広範なモル比において脂質と組み合わされ得る。

【0155】

組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、送達のために使用され得る。送達されることになるポリヌクレオチド、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能を含む、パッケージ化されることになるＡＡＶゲノムが細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子を生成するための手法は、当該技術分野において標準的なものである。ｒＡＡＶの生成は通常、次の成分が単一の細胞（本明細書でパッケージング細胞と表示される）内に存在することを必要とする：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離された（すなわち、その中にない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来することができ、本明細書に記載されるＡＡＶ血清型を含むが、これらに限定されないｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、国際特許出願公開番号国際公開第０１／８３６９２号パンフレットにおいて開示される。

【0156】

細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞の製剤化及び投与
本明細書に記載されるとおりの遺伝子改変細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞は、製剤化され、且つ当該技術分野において知られる任意の様式によって対象に投与され得る。

【0157】

用語「投与する」、「導入する」、「埋入する」、「生着する」及び「移植する」は、所望の部位での導入細胞の少なくとも部分的な局在をもたらす方法又は経路による細胞、例えば、前駆細胞の対象への留置の文脈において互換的に使用される。細胞、例えば、前駆細胞、又はそれらの分化した後代は、埋入された細胞又は細胞の構成要素の少なくとも一部が生存したままである対象における所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間、例えば、２４時間という短い期間、数日、数年もの間、或いは対象の寿命、すなわち、長期の生着であり得る。

【0158】

本明細書に記載されるとおりの遺伝子改変細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞は、対象への投与の後、未改変細胞のものより長い期間生存可能であり得る。

【0159】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるとおりの細胞を含む組成物は、例えば、一定期間かけた大量投与として又は持続注入による静脈内投与を含み得る好適な経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、又は髄腔内経路によって実施され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、固体形態、水性形態、又は液体形態であり得る。いくつかの実施形態では、水性又は液体形態は、噴霧され得るか、又は凍結乾燥され得る。いくつかの実施形態では、噴霧又は凍結乾燥形態は、水性又は液体溶液により再構成され得る。

【0160】

細胞組成物はまた、乳化手順が細胞生存率に悪影響を及ぼさないという条件で、リポソーム組成物として乳化され得るか又は提示され得る。細胞及び任意の他の活性成分は、薬学的に許容され、且つ活性成分と適合性である賦形剤とともに、且つ本明細書に記載される治療方法における使用のために好適な量で混合され得る。

【0161】

細胞組成物中に含まれる追加の薬剤は、その成分に薬学的に許容される塩を含み得る。薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸とともに形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基とともに形成される）を含む。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来し得る。

【0162】

生理学的に許容できる担体は、当該技術分野においてよく知られる。例示的な液体担体は、活性成分及び水に加えて材料を含有しないか、又はリン酸緩衝食塩水などの、生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウム、生理食塩水若しくはその両方などの緩衝液を含有する滅菌水溶液である。さらに、水性担体は、２つ以上の緩衝液塩、並びに塩化ナトリウム及び塩化カリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコール及び他の溶質を含有し得る。液体組成物はまた、水に加えて、及び水を除いて、液相を含有し得る。そのような追加の液相の例は、グリセリン、綿実油などの植物油、及び水－油エマルションである。特定の障害又は状態の治療において有効である細胞組成物において使用される活性化合物の量は、障害又は状態の性質に依存する可能性があり、標準的な臨床手法によって決定され得る。

【0163】

いくつかの実施形態では、細胞を含む組成物は、疾患を有するか、有することが疑われるか、又はそのリスクがある対象、例えば、ヒト対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、疾患を有しないか、有すると疑われないか、又はそのリスクがない対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、対象は、健康なヒトである。いくつかの実施形態では、遺伝的に受け継がれる疾患を有するか、有すると疑われるか、又はそのリスクがある対象、例えば、ヒト対象。いくつかの実施形態では、対象は、疾患の症状に罹患しているか、又はそれを発症するリスクがある。

【0164】

ＶＩ．本開示の特定の組成物及び方法
したがって、本開示は、特に、以下の非限定的な組成物及び方法に関する。

【0165】

第１の組成物、組成物１において、本開示は、（ｉ）１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の他の構成要素若しくは転写調節因子をコードする少なくとも１つの遺伝子内又は近傍での少なくとも１つの遺伝子改変；（ｉｉ）未改変細胞に対して、免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現を増加させる少なくとも１つの遺伝子改変；並びに（ｉｉｉ）未改変細胞に対して、生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させるか又は減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を含む細胞を含む組成物を提供する。

【0166】

別の組成物、組成物２において、本開示は、（ｉ）１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の他の構成要素若しくは転写調節因子をコードする少なくとも１つの遺伝子内又は近傍での少なくとも１つの塩基対の少なくとも１つの欠失及び／又は挿入；並びに（ｉｉ）（ｉ）の遺伝子欠失の部位に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位での少なくとも１つの免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つの挿入を含む細胞を含む組成物を提供する。

【0167】

別の組成物、組成物３において、本開示は、未改変細胞に対して、生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させるか又は減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を含む細胞を含む組成物を提供する。

【0168】

別の組成物、組成物４において、本開示は、（ｉ）の遺伝子改変が欠失である、組成物１において提供されるとおりの組成物を提供する。

【0169】

別の組成物、組成物５において、本開示は、（ｉｉ）の遺伝子改変が、セーフハーバー座位又は（ｉ）の遺伝子改変の部位に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位での免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドの挿入である、組成物１において提供されるとおりの組成物を提供する。

【0170】

別の組成物、組成物６において、本開示は、（ｉ）の遺伝子改変が、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の他の構成要素若しくは転写調節因子をコードする遺伝子の欠失であり；且つ（ｉｉ）の遺伝子改変が、（ｉ）の遺伝子改変の部位に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位での少なくとも１つの免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドの挿入である、組成物１において提供されるとおりの組成物を提供する。

【0171】

別の組成物、組成物７において、本開示は、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の他の構成要素若しくは転写調節因子をコードする少なくとも１つの遺伝子が、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ）、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子（例えば、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲ）、又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子又はＭＨＣ－Ｉ複合体の他の構成要素（例えば、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、及びＣＩＩＴＡ）をコードする遺伝子のうちの１つ以上である、組成物１、２、又は４～６のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。

【0172】

別の組成物、組成物８において、本開示は、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の他の構成要素若しくは転写調節因子をコードする少なくとも１つの遺伝子が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、又はＣＩＩＴＡのうちの１つ以上である、組成物１、２、又は４～６のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。

【0173】

別の組成物、組成物９において、本開示は、（ｉ）が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、又はＣＩＩＴＡのうちの１つ以上内又は近傍での欠失である、組成物１又は２において提供されるとおりの組成物を提供する。

【0174】

別の組成物、組成物１０において、本開示は、（ｉ）が、ＨＬＡ－Ａ内若しくは近傍での欠失、ＨＬＡ－Ｂ内若しくは近傍での欠失、ＨＬＡ－Ｃ内若しくは近傍での欠失、又はＢ２Ｍ内若しくは近傍での欠失である、組成物９において提供されるとおりの組成物を提供する。

【0175】

別の組成物、組成物１１において、本開示は、（ｉ）が、ＨＬＡ－Ａ内若しくは近傍での欠失、ＨＬＡ－Ｂ内若しくは近傍での欠失、ＨＬＡ－Ｃ内若しくは近傍での欠失、又はＣＩＩＴＡ内若しくは近傍での欠失である、組成物９において提供されるとおりの組成物を提供する。

【0176】

別の組成物、組成物１２において、本開示は、免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドが、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ４７、又はＰＤ－Ｌ１のうちの１つ以上をコードする１つ以上のポリヌクレオチドである、組成物１、２、又は４～１１のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。

【0177】

別の組成物、組成物１３において、本開示は、（ｉ）が、Ｂ２Ｍ内又は近傍で欠失であり、且つ（ｉｉ）が、（ｉ）における欠失に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位でのＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドの挿入である、組成物１２において提供されるとおりの組成物を提供する。

【0178】

別の組成物、組成物１４において、本開示は、（ｉ）が、ＨＬＡ－Ａ内若しくは近傍での欠失、ＨＬＡ－Ｂ内若しくは近傍での欠失、又はＨＬＡ－Ｃ内若しくは近傍での欠失であり、且つ（ｉｉ）が、（ｉ）における欠失（例えば、ＨＬＡ－Ａ欠失）に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位でのＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドの挿入である、組成物１２において提供されるとおりの組成物を提供する。

【0179】

別の組成物、組成物１５において、本開示は、（ｉ）が、ＨＬＡ－Ａ内若しくは近傍での欠失、ＨＬＡ－Ｂ内若しくは近傍での欠失、ＨＬＡ－Ｃ内若しくは近傍での欠失、又はＣＩＩＴＡ内若しくは近傍での欠失であり、且つ（ｉｉ）が、ＨＬＡ－Ａ内若しくは近傍における欠失に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位でのＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドの挿入及びＣＩＩＴＡ内若しくは近傍における欠失に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位でのＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドの挿入である、組成物１２において提供されるとおりの組成物を提供する。

【0180】

別の組成物、組成物１６において、本開示は、生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子が、ＺＮＦ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１、ＪＮＫ、又はＭＡＮＦのうちの１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子である、組成物１又は３～１５のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。

【0181】

別の組成物、組成物１７において、本開示は、未改変細胞に対して、生存因子をコードする遺伝子の発現を増加させるか又は減少させる遺伝子改変が、例えば、セーフハーバー座位での、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドの挿入である、組成物１又は３～１６のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。

【0182】

別の組成物、組成物１８において、本開示は、未改変細胞に対して、生存因子をコードする遺伝子の発現を増加させるか又は減少させる遺伝子改変が、未改変細胞に対して、ＺＮＦ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１、又はＪＮＫ遺伝子の発現を減少させるか又は消失させるＺＮＦ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１、又はＪＮＫ遺伝子内又は近傍での欠失である、組成物１又は３～１６のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。

【0183】

別の組成物、組成物１９において、本開示は、細胞がさらに、細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれない外来ポリヌクレオチドを含む、組成物１～１８のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。

【0184】

別の組成物、組成物２０において、本開示は、外来ポリヌクレオチドが、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ４７、ＭＡＮＦ、及び／又はＰＤ－Ｌ１をコードする、組成物１９において提供されるとおりの組成物を提供する。

【0185】

別の組成物、組成物２１において、本開示は、細胞がさらに、未改変細胞に対して、１つ以上の安全スイッチの発現の増加を含む、組成物１～２０のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。

【0186】

別の組成物、組成物２２において、本開示は、安全スイッチが、単純ヘルペスウイルス－１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）又は誘導性カスパーゼ－９である、組成物２１において提供されるとおりの組成物を提供する。

【0187】

別の組成物、組成物２３において、本開示は、１つ以上の安全スイッチの発現の増加が、安全スイッチタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、例えば、セーフハーバー座位への遺伝子挿入に起因する、組成物２１又は２２において提供されるとおりの組成物を提供する。

【0188】

別の組成物、組成物２４において、本開示は、セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１ Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲからなる群から選択される、組成物５、１７、又は２３のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。

【0189】

別の組成物、組成物２５において、本開示は、細胞がさらに、任意の追加の遺伝子の発現を減少させる追加の遺伝子改変を含む、組成物１～２４のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。

【0190】

別の組成物、組成物２６において、本開示は、遺伝子改変、遺伝子欠失、又は遺伝子挿入が、細胞にエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を送達することによって生成される、組成物１～２５のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。

【0191】

別の組成物、組成物２７において、本開示は、エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、若しくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；そのホモログ、その天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化、又はその改変バージョン、及びその組合せである、組成物２６において提供されるとおりの組成物を提供する。

【0192】

別の組成物、組成物２８において、本開示は、エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、任意選択により、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、又はＮ末端ＳＶ４０ ＮＬＳ及びＣ末端ＳＶ４０ ＮＬＳを含むそのバリアントである、組成物２７において提供されるとおりの組成物を提供する。

【0193】

別の組成物、組成物２９において、本開示は、前記ｇＲＮＡと前記エンドヌクレアーゼの重量比が、１：１である、組成物２６において提供されるとおりの組成物を提供する。

【0194】

別の組成物、組成物３０において、本開示は、ポリヌクレオチドが、外来プロモーターを含む、組成物２、５、６、１２～１５、１７、１９、又は２３のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。

【0195】

別の組成物、組成物３１において、本開示は、外来プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦｌａ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、又は他の構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、若しくは細胞型特異的プロモーターである、組成物３０において提供されるとおりの組成物を提供する。

【0196】

別の組成物、組成物３２において、本開示は、外来プロモーターがＣＡＧプロモーターである、組成物３１において提供されるとおりの組成物を提供する。

【0197】

別の組成物、組成物３３において、本開示は、細胞が、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）である、組成物１～３２のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。

【0198】

別の組成物、組成物３４において、本開示は、細胞が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、組成物１～３３のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。

【0199】

別の組成物、組成物３５において、本開示は、細胞が、分化細胞である、組成物１～３２のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。

【0200】

別の組成物、組成物３６において、本開示は、細胞が、体細胞である、組成物１～３２又は３５のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。

【0201】

第１の方法、方法１において、本開示は、改変細胞を作製する方法であって、（ｉ）１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の他の構成要素若しくは転写調節因子をコードする少なくとも１つの遺伝子内又は近傍での少なくとも１つの遺伝子改変を導入すること；（ｉｉ）細胞において免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現を増加させる少なくとも１つの遺伝子改変を導入すること；並びに（ｉｉｉ）ユニバーサルドナー細胞において生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させるか又は減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を導入することを含む方法を提供する。

【0202】

別の方法、方法２において、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を作製する方法であって、（ｉ）１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の他の構成要素若しくは転写調節因子をコードする少なくとも１つの遺伝子内又は近傍でゲノムＤＮＡの少なくとも１つの領域の少なくとも１つの欠失を導入すること；並びに（ｉｉ）（ｉ）の欠失の部位に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位で免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも１つの挿入を導入することを含む方法を提供する。

【0203】

別の方法、方法３において、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を作製する方法であって、生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させるか又は減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を導入することを含む方法を提供する。

【0204】

別の方法、方法４において、本開示は、（ｉ）の遺伝子改変が欠失である、方法１において提供されるとおりの方法を提供する。

【0205】

別の方法、方法５において、本開示は、（ｉｉ）の遺伝子改変が、セーフハーバー座位又は（ｉ）の遺伝子改変の部位に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位での免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドの挿入である、方法１において提供されるとおりの方法を提供する。

【0206】

別の方法、方法６において、本開示は、（ｉ）の遺伝子改変が、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の他の構成要素若しくは転写調節因子をコードする遺伝子の欠失であり；且つ（ｉｉ）の遺伝子改変が、（ｉ）の遺伝子改変の部位に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位での少なくとも１つの免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドの挿入である、方法１において提供されるとおりの方法を提供する。

【0207】

別の方法、方法７において、本開示は、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の他の構成要素若しくは転写調節因子をコードする少なくとも１つの遺伝子が、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ）、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子（例えば、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲ）、又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、及びＣＩＩＴＡ）をコードする遺伝子のうちの１つ以上である、方法１、２、又は４～６のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0208】

別の方法、方法８において、本開示は、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の他の構成要素若しくは転写調節因子をコードする少なくとも１つの遺伝子が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、又はＣＩＩＴＡのうちの１つ以上である、方法１、２、又は４～６のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0209】

別の方法、方法９において、本開示は、（ｉ）が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、又はＣＩＩＴＡのうちの１つ以上内又は近傍での欠失である、方法１又は２において提供されるとおりの方法を提供する。

【0210】

別の方法、方法１０において、本開示は、（ｉ）が、ＨＬＡ－Ａ内又は近傍での欠失、ＨＬＡ－Ｂ内又は近傍での欠失、ＨＬＡ－Ｃ内又は近傍での欠失、及びＢ２Ｍ内又は近傍での欠失である、方法９において提供されるとおりの方法を提供する。

【0211】

別の方法、方法１１において、本開示は、（ｉ）が、ＨＬＡ－Ａ内又は近傍での欠失、ＨＬＡ－Ｂ内又は近傍での欠失、ＨＬＡ－Ｃ内又は近傍での欠失、及びＣＩＩＴＡ内又は近傍での欠失である、方法９において提供されるとおりの方法を提供する。

【0212】

別の方法、方法１２において、本開示は、免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドが、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ４７、又はＰＤ－Ｌ１のうちの１つ以上をコードする１つ以上のポリヌクレオチドである、方法１、２、又は４～１１のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0213】

別の方法、方法１３において、本開示は、（ｉ）が、Ｂ２Ｍ内又は近傍で欠失であり、且つ（ｉｉ）が、（ｉ）における欠失に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位でのＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドの挿入である、方法１２において提供されるとおりの方法を提供する。

【0214】

別の方法、方法１４において、本開示は、（ｉ）が、ＨＬＡ－Ａ内又は近傍での欠失、ＨＬＡ－Ｂ内又は近傍での欠失、及びＨＬＡ－Ｃ内又は近傍での欠失であり、且つ（ｉｉ）が、（ｉ）における欠失（例えば、ＨＬＡ－Ａ欠失）に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位でのＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドの挿入である、方法１２において提供されるとおりの方法を提供する。

【0215】

別の方法、方法１５において、本開示は、（ｉ）が、ＨＬＡ－Ａ内又は近傍での欠失、ＨＬＡ－Ｂ内又は近傍での欠失、ＨＬＡ－Ｃ内又は近傍での欠失、及びＣＩＩＴＡ内又は近傍での欠失であり、且つ（ｉｉ）が、ＨＬＡ－Ａ内若しくは近傍における欠失に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位でのＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドの挿入及びＣＩＩＴＡ内若しくは近傍における欠失に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位でのＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドの挿入である、方法１２において提供されるとおりの方法を提供する。

【0216】

別の方法、方法１６において、本開示は、生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子が、ＺＮＦ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１、ＪＮＫ、又はＭＡＮＦのうちの１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子である、方法１又は３～１５のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0217】

別の方法、方法１７において、本開示は、生存因子をコードする遺伝子の発現を増加させるか又は減少させる遺伝子改変が、例えば、セーフハーバー座位での、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドの挿入である、方法１又は３～１６のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0218】

別の方法、方法１８において、本開示は、生存因子をコードする遺伝子の発現を増加させるか又は減少させる遺伝子改変が、未改変細胞に対して、ＺＮＦ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１、又はＪＮＫ遺伝子の発現を減少させるか又は消失させるＺＮＦ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１、又はＪＮＫ遺伝子内又は近傍での欠失である、方法１又は３～１６のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0219】

別の方法、方法１９において、本開示は、細胞が、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）である、方法１～１８のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0220】

別の方法、方法２０において、本開示は、細胞が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、方法１～１９のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0221】

別の方法、方法２１において、本開示は、細胞が、分化細胞である、方法１～１８のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0222】

別の方法、方法２２において、本開示は、細胞が、体細胞である、方法１～１８又は２１のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0223】

別の方法、方法２３において、本開示は、方法がさらに、細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれない細胞に外来ポリヌクレオチドを導入することを含む、方法１～２２のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0224】

別の方法、方法２４において、本開示は、外来ポリヌクレオチドが、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ４７、ＭＡＮＦ、及び／又はＰＤ－Ｌ１をコードする、方法２３において提供されるとおりの方法を提供する。

【0225】

別の方法、方法２５において、本開示は、方法がさらに、未改変細胞に対して、１つ以上の安全スイッチの発現を増加させることを含む、方法１～２４のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0226】

別の方法、方法２６において、本開示は、安全スイッチが、単純ヘルペスウイルス－１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）又は誘導性カスパーゼ－９である、方法２５において提供されるとおりの方法を提供する。

【0227】

別の方法、方法２７において、本開示は、１つ以上の安全スイッチの発現の増加が、安全スイッチをコードするポリヌクレオチドの、例えば、セーフハーバー座位への遺伝子挿入に起因する、方法２５又は２６において提供されるとおりの方法を提供する。

【0228】

別の方法、方法２８において、本開示は、セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１ Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲからなる群から選択される、方法５、１７、又は２７のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0229】

別の方法、方法２９において、本開示は、方法がさらに、任意の追加の遺伝子の発現を減少させる追加の遺伝子改変を導入することを含む、方法１～２８のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。

【0230】

別の方法、方法３０において、本開示は、遺伝子改変、欠失、又は挿入が、細胞にエンドヌクレアーゼ及び少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を送達することによって生成される、方法１～２９のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0231】

別の方法、方法３１において、本開示は、エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、若しくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；そのホモログ、その天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化、又はその改変バージョン、及びその組合せである、方法３０において提供されるとおりの方法を提供する。

【0232】

別の方法、方法３２において、本開示は、エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、任意選択により、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、又はＮ末端ＳＶ４０ ＮＬＳ及びＣ末端ＳＶ４０ ＮＬＳを含むそのバリアントである、方法３１において提供されるとおりの方法を提供する。

【0233】

別の方法、方法３３において、本開示は、前記ｇＲＮＡと前記エンドヌクレアーゼの重量比が、１：１である、方法３０において提供されるとおりの方法を提供する。

【0234】

別の方法、方法３４において、本開示は、ポリヌクレオチドが、外来プロモーターを含む、方法２、５、６、１２～１５、１７、２３、２５、又は２７のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0235】

別の方法、方法３５において、本開示は、外来プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦｌａ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、又は他の構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、若しくは細胞型特異的プロモーターである、方法３４において提供されるとおりの方法を提供する。

【0236】

別の方法、方法３６において、本開示は、外来プロモーターがＣＡＧプロモーターである、方法３５において提供されるとおりの方法を提供する。

【0237】

別の方法、方法３７において、本開示は、組成物１～３６のいずれか１つにおいて提供されるとおりの細胞の組成物又は方法１～３６のいずれか１つによって作製される複数の細胞を含む組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。

【0238】

別の方法、方法３８において、本開示は、（ｉ）組成物１～３４のいずれか１つにおいて提供されるとおりの細胞の組成物を得ること；（ｉｉ）細胞を系列限定細胞又は完全に分化した細胞に分化させること；及び（ｉｉｉ）系列限定細胞又は完全に分化した細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。

【0239】

別の方法、方法３９において、本開示は、対象が、疾患を有するか、有することが疑われるか、又はそのリスクがあるヒトである、方法３７又は３８において提供されるとおりの方法を提供する。

【0240】

別の方法、方法４０において、本開示は、疾患が遺伝的に受け継がれる疾患である、方法３９において提供されるとおりの方法を提供する。

【0241】

別の方法、方法４１において、本開示は、細胞がさらに、疾患と関連する遺伝子又はタンパク質の発現を減少させる遺伝子改変を含む、方法３９又は４０において提供されるとおりの方法を提供する。

【0242】

別の方法、方法４２において、本開示は、遺伝子改変が、疾患又は疾患の症状を治療することができる、方法３９～４１のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0243】

別の方法、方法４３において、本開示は、細胞が、対象以外の供給源から得られる、方法３７～４２のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0244】

別の方法、方法４４において、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を作製する方法であって、（ｉ）ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子のうちの１つ以上をコードする少なくとも１つの遺伝子内又は近傍の部位で細胞のゲノム中の少なくとも１つの塩基対の欠失及び／又は挿入を導入すること；並びに（ｉｉ）細胞のゲノムにおいて（ｉ）の部位に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位で免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの挿入を導入することによって、細胞を遺伝子改変し、それによりユニバーサルドナー細胞を作製することを含む方法を提供する。

【0245】

別の方法、方法４５において、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を作製する方法であって、（ｉ）ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子のうちの１つ以上をコードする少なくとも１つの遺伝子内又は近傍の部位で細胞のゲノム中の少なくとも１つの塩基対の欠失及び／又は挿入を導入すること；並びに（ｉｉ）細胞のゲノムにおいてセーフハーバー座位に免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの挿入を導入することによって、細胞を遺伝子改変し、それによりユニバーサルドナー細胞を作製することを含む方法を提供する。

【0246】

別の方法、方法４６において、本開示は、ユニバーサルドナー細胞が、未改変細胞と比較して、免疫回避及び／又は細胞生存の増加を有する、方法４４又は４５において提供されるとおりの方法を提供する。

【0247】

別の方法、方法４７において、本開示は、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子をコードする少なくとも１つの遺伝子が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、若しくはＨＬＡ－Ｃから選択されるＭＨＣ－Ｉ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、若しくはＨＬＡ－ＤＲから選択されるＭＨＣ－ＩＩ遺伝子、又はＢ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、若しくはＲＦＸＡＮＫから選択される遺伝子である、方法４４～４６のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0248】

別の方法、方法４８において、本開示は、免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドが、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４、又はＣＤ４７のうちの１つ以上をコードする１つ以上のポリヌクレオチドである、方法４４～４７のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0249】

別の方法、方法４９において、本開示は、免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドが、外来プロモーターに作動可能に連結される、方法４４～４８のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0250】

別の方法、方法５０において、本開示は、外来プロモーターが、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、若しくは細胞型特異的プロモーターであり、構成的プロモーターがＣＭＶ、ＥＦｌａ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、又はＵＢＣプロモーターである、方法４９において提供されるとおりの方法を提供する。

【0251】

別の方法、方法５１において、本開示は、（ｉ）の欠失及び／又は挿入が、Ｂ２Ｍ内又は近傍にあり、且つ（ｉｉ）の挿入が、ＰＤ－Ｌ１又はＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドである、方法４４～５０のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0252】

別の方法、方法５２において、本開示は、方法がさらに、未改変細胞に対して、少なくとも１つの生存因子の発現を増加させるか又は減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を導入することを含む、方法４４～５１のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0253】

別の方法、方法５３において、本開示は、少なくとも１つの生存因子の発現を増加させるか又は減少させる少なくとも１つの遺伝子改変が、未改変細胞に対してＭＡＮＦの発現を増加させる、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドの挿入；又は未改変細胞に対してＺＮＦ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１、若しくはＪＮＫの発現を減少させるか又は消失させる、ＺＮＦ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１、若しくはＪＮＫをコードする遺伝子内又は近傍での少なくとも１つの塩基対の欠失及び／若しくは挿入である、方法５２において提供されるとおりの方法を提供する。

【0254】

別の方法、方法５４において、本開示は、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドが、セーフハーバー座位、又はＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、若しくはＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子に属する遺伝子に挿入される、方法５３において提供されるとおりの方法を提供する。

【0255】

別の方法、方法５５において、本開示は、遺伝子改変が、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ系を細胞に送達することを含む、方法４４～５４のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0256】

別の方法、方法５６において、本開示は、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ系が、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系である、方法５５において提供されるとおりの方法を提供する。

【0257】

別の方法、方法５７において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、そのホモログ、その改変バージョン、そのコドン最適化バージョン、又はその任意の組合せである、方法５６において提供されるとおりの方法を提供する。

【0258】

別の方法、方法５８において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９である、方法５６又は５７において提供されるとおりの方法を提供する。

【0259】

別の方法、方法５９において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｎ末端核移行シグナル（ＮＬＳ）及び／又はＣ末端ＮＬＳを含む、方法５６～５８のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0260】

別の方法、方法６０において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡが、１：１の重量比で存在する、方法５６～５９のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0261】

別の方法、方法６１において、本開示は、（ｉ）の欠失及び／又は挿入が、Ｂ２Ｍ遺伝子座位内又は近傍にあり、且つ（ｉｉ）の挿入が、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドである、方法４４又は４６～６０のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0262】

別の方法、方法６２において、本開示は、（ｉ）及び（ｉｉ）のために使用されるガイドＲＮＡが、配列番号１～３又は３５～４４の少なくとも１つを含むヌクレオチド配列を含む、方法６１において提供されるとおりの方法を提供する。

【0263】

別の方法、方法６３において、本開示は、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドが、（ａ）（ｉ）における部位の左に位置する領域と配列相同性を有するヌクレオチド配列及び（ｂ）（ｉ）における部位の右に位置する領域と配列相同性を有するヌクレオチド配列と隣接する、方法６１又は６２において提供されるとおりの方法を提供する。

【0264】

別の方法、方法６４において、本開示は、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドが、（ｉ）における部位の５０塩基対内でＢ２Ｍ遺伝子座位に挿入される、方法６３において提供されるとおりの方法を提供する。

【0265】

別の方法、方法６５において、本開示は、（ａ）が配列番号１３のヌクレオチド配列から本質的になり、且つ（ｂ）が配列番号１９のヌクレオチド配列から本質的になる、方法６３又は６４において提供されるとおりの方法を提供する。

【0266】

別の方法、方法６６において、本開示は、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドが、外来プロモーターに作動可能に連結され、任意選択により、外来プロモーターが、ＣＡＧプロモーターである、方法６１～６５のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0267】

別の方法、方法６７において、本開示は、細胞が哺乳動物細胞であり、任意選択により、細胞がヒト細胞である、方法４４～６６のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0268】

別の方法、方法６８において、本開示は、細胞が、幹細胞である、方法４４～６７のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0269】

別の方法、方法６９において、本開示は、細胞が、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、方法４４～６８のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0270】

別の方法、方法７０において、本開示は、細胞が、分化細胞又は体細胞である、方法４４～６９のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0271】

別の方法、方法７１において、本開示は、ユニバーサルドナー細胞が、系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞に分化することができる、方法４４～６９のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0272】

別の方法、方法７２において、本開示は、系列限定前駆細胞が、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、間葉系前駆細胞、筋肉前駆細胞、芽球細胞、又は神経前駆細胞である、方法７１において提供されるとおりの方法を提供する。

【0273】

別の方法、方法７３において、本開示は、完全に分化した体細胞が、膵ベータ細胞などの内分泌性細胞、上皮細胞、内胚葉細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血液細胞、又は免疫系細胞である、方法７１において提供されるとおりの方法を提供する。

【0274】

別の組成物、組成物３７において、本開示は、方法４４～７３のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法によって作製される複数のユニバーサルドナー細胞を含む組成物を提供する。

【0275】

別の組成物、組成物３８において、本開示は、複数のユニバーサルドナー細胞が、細胞が分化を経るのに十分な時間及び条件下で維持され得る、組成物３７において提供されるとおりの方法を提供する。

【0276】

別の組成物、組成物３９において、本開示は、（ｉ）１つ以上のＭＨＣ－１及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子をコードする少なくとも１つの遺伝子内又は近傍での少なくとも１つの欠失；並びに（ｉｉ）（ｉ）の遺伝子欠失の部位に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位での少なくとも１つの免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つの挿入を含む細胞を含む組成物を提供する。

【0277】

別の方法、方法７４において、本開示は、対象に組成物３７又は３８の複数のユニバーサルドナー細胞を投与することを含む方法を提供する。

【0278】

別の方法、方法７５において、本開示は、必要とする対象を治療するための方法であって、（ｉ）系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞への分化後に組成物３７又は３８の複数のユニバーサルドナー細胞を得ること又は得たこと；及び（ｉｉ）対象に系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞を投与することを含む方法を提供する。

【0279】

別の方法、方法７６において、本開示は、必要とする対象への投与のための細胞を得る方法であって、（ｉ）組成物３７又は３８のユニバーサルドナー細胞を得ること又は得たこと；及び（ｉｉ）ユニバーサルドナー細胞を細胞が系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞に分化するのに十分な時間及び条件下で維持することを含む方法を提供する。

【0280】

別の方法、方法７７において、本開示は、系列限定前駆細胞が、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、間葉系前駆細胞、筋肉前駆細胞、芽球細胞、又は神経前駆細胞である、方法７５又は７６において提供されるとおりの方法を提供する。

【0281】

別の方法、方法７８において、本開示は、完全に分化した体細胞が、膵ベータ細胞などの内分泌性細胞、上皮細胞、内胚葉細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血液細胞、又は免疫系細胞である、方法７５又は７６において提供されるとおりの方法を提供する。

【0282】

別の方法、方法７９において、本開示は、対象が、疾患を有するか、有することが疑われるか、又はそのリスクがあるヒトである、方法７４～７８のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0283】

別の方法、方法８０において、本開示は、疾患が遺伝的に受け継がれる疾患である、方法７９において提供されるとおりの方法を提供する。

【0284】

別の方法、方法８１において、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を作製するための方法であって、多能性幹細胞（ＰＳＣ）に（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ；（ｂ）ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座位における標的部位を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；並びに（ｃ）（ｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座位における標的部位の左に位置する領域と相同であるヌクレオチド配列、（ｉｉ）免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座位における標的部位の右に位置する領域と相同であるヌクレオチド配列を含む核酸を含むベクターを送達することを含み、Ｂ２Ｍ遺伝子座位が標的部位で切断され、且つ核酸が、標的部位の５０塩基対以内でＢ２Ｍ遺伝子座位に挿入され、それによりユニバーサルドナー細胞を作製し、ユニバーサルドナー細胞が、Ｂ２Ｍ遺伝子座位に挿入される核酸を含まないＰＳＣと比較して、免疫回避及び／又は細胞生存の増加を有する方法を提供する。

【0285】

別の方法、方法８２において、本開示は、ｇＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３から選択されるヌクレオチド配列を含む、方法８１において提供されるとおりの方法を提供する。

【0286】

別の方法、方法８３において、本開示は、（ｉ）が配列番号１３のヌクレオチド配列から本質的になり、且つ（ｉｉｉ）が配列番号１９のヌクレオチド配列から本質的になる、方法８１又は８２において提供されるとおりの方法を提供する。

【0287】

別の方法、方法８４において、本開示は、免疫寛容原性因子が、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）又はヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）である、方法８１～８３のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0288】

別の方法、方法８５において、本開示は、免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列が、外来プロモーターに作動可能に連結される、方法８１～８４のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0289】

別の方法、方法８６において、本開示は、外来プロモーターが、構成的であるか、細胞型特異的であるか、組織型特異的であるか、又は時間的に調節される、方法８５において提供されるとおりの方法を提供する。

【0290】

別の方法、方法８７において、本開示は、外来プロモーターがＣＡＧプロモーターである、方法８５又は８６において提供されるとおりの方法を提供する。

【0291】

別の方法、方法８８において、本開示は、ベクターが、プラスミドベクターである、方法８１～８７のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0292】

別の方法、方法８９において、本開示は、プラスミドベクターが、配列番号３３又は配列番号３４のヌクレオチド配列を含む、方法８８において提供されるとおりの方法を提供する。

【0293】

別の方法、方法９０において、本開示は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、方法８１～８９のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0294】

別の方法、方法９１において、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、少なくとも１つの核移行シグナル（ＮＬＳ）に連結される、方法９０において提供されるとおりの方法を提供する。

【0295】

別の方法、方法９２において、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９である、方法９０又は９１において提供されるとおりの方法を提供する。

【0296】

別の方法、方法９３において、本開示は、ＰＳＣが、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、方法８１～９２のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0297】

別の方法、方法９４において、本開示は、ＰＳＣが、ヒトＰＳＣである、方法８１～９３のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0298】

別の方法、方法９５において、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を作製するための方法であって、多能性幹細胞（ＰＳＣ）に（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ；（ｂ）ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座位における標的部位を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（ｇＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む）；並びに（ｃ）（ｉ）配列番号１３から本質的になるＢ２Ｍ遺伝子座位における標的部位の左に位置する領域と相同であるヌクレオチド配列、（ｉｉ）免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）配列番号１９から本質的になるＢ２Ｍ遺伝子座位における標的部位の右に位置する領域と相同であるヌクレオチド配列を含む核酸を含むベクターを送達することを含み、Ｂ２Ｍ遺伝子座位が標的部位で切断され、且つ核酸が、標的部位の５０塩基対以内でＢ２Ｍ遺伝子座位に挿入され、それによりユニバーサルドナー細胞を作製し、ユニバーサルドナー細胞が、Ｂ２Ｍ遺伝子座位に挿入される核酸を含まないＰＳＣと比較して、免疫回避及び／又は細胞生存の増加を有する方法を提供する。

【0299】

別の方法、方法９６において、本開示は、免疫寛容原性因子が、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）又はヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）である、方法９５において提供されるとおりの方法を提供する。

【0300】

別の方法、方法９７において、本開示は、免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列が、外来プロモーターに作動可能に連結される、方法９５又は９６において提供されるとおりの方法を提供する。

【0301】

別の方法、方法９８において、本開示は、外来プロモーターが、構成的であるか、細胞型特異的であるか、組織型特異的であるか、又は時間的に調節される、方法９７において提供されるとおりの方法を提供する。

【0302】

別の方法、方法９９において、本開示は、外来プロモーターがＣＡＧプロモーターである、方法９７又は９８において提供されるとおりの方法を提供する。

【0303】

別の方法、方法１００において、本開示は、ベクターが、プラスミドベクターである、方法９５～９９のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0304】

別の方法、方法１０１において、本開示は、プラスミドベクターが、配列番号３３又は配列番号３４のヌクレオチド配列を含む、方法１００において提供されるとおりの方法を提供する。

【0305】

別の方法、方法１０２において、本開示は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、方法９５～１０１のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0306】

別の方法、方法１０３において、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、少なくとも１つの核移行シグナル（ＮＬＳ）に連結される、方法１０２において提供されるとおりの方法を提供する。

【0307】

別の方法、方法１０４において、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９である、方法１０２又は１０３において提供されるとおりの方法を提供する。

【0308】

別の方法、方法１０５において、本開示は、ＰＳＣが、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、方法９５～１０４のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【0309】

別の方法、方法１０６において、本開示は、ＰＳＣが、ヒトＰＳＣである、方法９５～１０５のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。

【実施例】

【0310】

ＶＩＩ．実施例
下の実施例は、本開示に従うユニバーサルドナー細胞の作製及び特徴付けを記載する。表１は免疫寛容原性因子を列挙し、表２は、前記細胞において遺伝子改変され得る生存因子を列挙する。図１Ａ～１Ｃは、免疫回避のために利用され得る様々な遺伝子編集戦略を示す。

【0311】

【表1】

【0312】

【表2】

【0313】

実施例１：Ｂ２ＭノックアウトＩＰＳＣの作製
Ｂ２ＭのためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）選択。Ｂ２Ｍ ＤＮＡ標的領域を編集できる非常に多様なｇＲＮＡを同定するため、インビトロで転写された（ＩＶＴ）ｇＲＮＡ選別が実施された。Ｂ２Ｍ標的化ｇＲＮＡは、Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン１を標的化するように設計された。Ｂ２Ｍゲノム配列は、ｇＲＮＡ設計ソフトウェアを使用して分析のために提示された。得られたｇＲＮＡのリストは、配列（ゲノム中のどこか他の位置と完全な適合を有しないｇＲＮＡのみが選別された）の特有性及び最小限の予測されるオフターゲットに基づいて、約２００個のｇＲＮＡのリストに絞られた。ｇＲＮＡのこのセットは、インビトロで転写され、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用してＣａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされた。細胞はトランスフェクションの４８時間後に収集され、ゲノムＤＮＡが単離され、切断効率は、ＴＩＤＥ分析を使用して評価された。高いインデル及び低い予測されるオフターゲット作用を有するガイドＲＮＡが、さらなる分析のために選択された。表３は、選択されたＢ２Ｍ ｇＲＮＡの標的配列を提示する。

【0314】

【表3】

【0315】

ＩＰＳＣにおけるＢ２Ｍ ｇＲＮＡの選別。３つのｇＲＮＡ（Ｂ２Ｍ－１、Ｂ２Ｍ－２、及びＢ２Ｍ－３）を使用して、ｉＰＳＣを編集した。これらのｇＲＮＡの各々の標的配列の位置は、図２において図示される。ＩＰＳＣ（ＴＣ－１１３３細胞株、ＲＵＤＣＲ、ＮＪ）細胞は、Ｌｏｎｚａ ４Ｄヌクレオフェクター並びに１２５ｐｍｏｌ Ｃａｓ９及び３７５ｐｍｏｌ ｇＲＮＡの最終濃度にて３：１（ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９）のモル比でＣａｓ９（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、ｃａｔ＃９２１２－５ＭＧ）及びｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）のＲＮＰ混合物を伴うＰ３初代細胞キット（Ｌｏｎｚａ、ｃａｔ＃Ｖ４ＸＰ－３０２４）を使用してヌクレオフェクションされた。細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍｐｒｏ、ｃａｔ＃Ａ１１１０５０１）を使用して解離され、続いてＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃１１３２００３３）中で再懸濁され、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｌｏｎ）を使用して計数され、遠心分離された。細胞は、２×１０³細胞／μＬの濃度で補給物１（４．５：１比）を伴うＰ３緩衝液中において再懸濁された。合計で２×１０⁵個の細胞が、ＲＮＰ複合体と合わせられ、ヌクレオフェクションキュベット（Ｌｏｎｚａキット）に移され、プログラムＣＡ－１３７を使用してヌクレオフェクションされた。各キュベットに関して、ＣｌｏｎｅＲ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ＃０５８８８）（１：１０比）を伴う２５０μＬのＳｔｅｍＦｌｅｘ培地（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃Ａ３３４９４０１）を使用して、ヌクレオフェクションされた細胞を再懸濁した。この細胞懸濁液を、ＣｌｏｎｅＲを伴う追加の２５０μＬのＳｔｅｍＦｌｅｘを有するビトロネクチン（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃Ａ１４７００）コーティングされた２４ウェルプレートの２つのウェルに分割した。細胞は、低酸素インキュベーター（３７℃、４％ Ｏ₂、８％ ＣＯ₂）中で４８時間回復された。４８時間後、ゲノムＤＮＡを、ｇＤＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ、ｃａｔ＃６９５０６）を使用してそれぞれの実用上の複製物のうちの１つのウェルから収集した。

【0316】

単離されたｇＤＮＡをＰＣＲにかけて、インデル頻度を決定した。関連している領域のためのＰＣＲは、Ｂ２ＭプライマーとともにＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃１２５３２０１７６及びＣａｔ＃１１４９５０１７）を使用して実施された。プライマー配列は表４において提供され、ｇＲＮＡ標的部位に対するＢ２Ｍプライマーの位置は、図２において示される。サイクル条件は、表５において提供される。

【0317】

【表4】

【0318】

【表5】

【0319】

得られた増幅産物をＰＣＲ精製及びサンガー配列決定にかけた。サンガー配列決定の結果は、ガイド配列とともにＴｓｕｎａｍｉに入力された。インデルのパーセンテージ及び同一性は、ソフトウェアによって計算された（図３Ａ）。Ｂ２Ｍ－１、Ｂ２Ｍ－２、及びＢ２Ｍ－３ ｇＲＮＡは、それぞれ２．５％±１．１％、８７．６％＋１４．１％、及び６３．９％＋０．９％のインデル頻度を有した（ｎ＝２）。図３Ｂ及び３Ｃは、Ｂ２Ｍ－２（図３Ｂ）及びＢ２Ｍ－３ ｇＲＮＡ（図３Ｃ）についてのインデル結果の分布を示す。

【0320】

複製ウェル中の細胞は、コンフルエントまで維持され、順次より大きい容器へと継代された。大部分の集団は、維持のためにＡｄｖａｎｃｅｄ ２０／１０／１０培地（表６を参照のこと）及びＬａｍｉｎｉｎ－５２１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ＃７７００４）に移行された。

【0321】

【表6】

【0322】

Ｂ２Ｍ ＫＯ ＩＰＳクローン作製及び特徴付け。配列が検証された一括編集された集団（図４Ａ）は、ＦＡＣＳ－ＡＲＩＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してビトロネクチンでコーティングされた９６ウェルプレート中にソーティングされた単一細胞であり、ＣｌｏｎｅＲを伴うＳｔｅｍＦｌｅｘ中に回収された。簡潔に述べると、細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して維持フラスコから解離し、ＣｌｏｎｅＲを伴うＳｔｅｍＦｌｅｘ中で再懸濁した。次に、細胞を、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒを使用して計数し、１×１０⁵／ｍＬに希釈した。２ｍＬのこれを、セルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ、＃３５２２３５）に通してＦＡＣＳチューブ中へと濾過し、オペレーターへと供給し、単一の細胞を個別のウェルにソーティングした。播種された単一細胞を、コロニーが単一細胞として再播種されるほど大きくなるまで、１日おきに培地を交換しながら低酸素インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ₂、４％Ｏ₂）中で増殖させた。コンフルエントになったとき、試料を、維持及びｇＤＮＡ抽出のために分割した（上を参照のこと）。クローンの同一性は、ＰＣＲ及びサンガー配列決定により確認された（詳細については下を参照のこと）。表７は、切断部位周囲の選択クローンの配列を提示する（欠失及び／又は挿入された配列は、太字で示される）。

【0323】

【表7】

【0324】

クローン配列は、インデル同一性及びホモ又はヘテロ接合性を決定するためにＳｎａｐｇｅｎｅソフトウェアにおいて整列させられた。図４Ｂにおいて示されるとおり、８個のクローンがＢ２Ｍ ＫＯに関してホモ接合性であり、７個のクローンがＢ２Ｍ ＫＯに関してヘテロ接合性であった。所望の編集を有するホモ接合性クローンを増殖させ、配列決定及びフローサイトメトリーによりさらに検証した。最初に、クローンは、ビトロネクチンでコーティングされたプレート上のＳｔｅｍＦｌｅｘ培地中で維持され、続いて最終的に、Ａｄｖａｎｃｅｄ ２０／１０／１０培地及びＬａｍｉｎｉｎ－５２１でコーティングされた容器に移された。

【0325】

細胞はさらに、Ａｄｖａｎｃｅｄ ２０／１０／１０とともにＬａｍｉｎｉｎ－５２１でコーティングされたフラスコ上で維持された。編集されたクローンは、Ｂ２Ｍ領域のＰＣＲ及びサンガー配列決定によりインデル同一性について検証された。ノックアウトは、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－Ａについてはフローサイトメトリー（利用された抗体のリストについては表８及び９を参照のこと）及び標準的なＴａｑｍａｎプロトコル（Ｔａｑｍａｎ ＦａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ｃａｔ＃４４４４５５６）を使用するＢ２Ｍ発現のＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲ分析により検証された。３つのＢ２Ｍ ＫＯクローン及び野生型（未改変）細胞に関するＢ２Ｍ発現のレベルは、図５において提示される。試験された３つ全てのＫＯクローンは、野生型細胞に対してＢ２ＭのｍＲＮＡ発現の減少を示した。

【0326】

【表8】

【0327】

【表9】

【0328】

ＲＮＡ抽出は、製造業者の指示書に従ってリボヌクレアーゼフリーデオキシリボヌクレアーゼを有するＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットを使用して実施された（Ｑｉａｇｅｎ、ｃａｔ＃７４１０４及び７９２５４）。ｃＤＮＡ合成は、製造業者の指示書に従ってＲＴ－ｑＰＣＲのためのＡｄｖａｎｃｅｄ ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（ＢｉｏＲａｄ、ｃａｔ＃１７２５０３７）を使用して実施された。クローンの核型状態は、核型サービス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）並びに５９℃のアニーリング温度及び基準アッセイとしてのＲＰＰ３０を用いて製造業者の指示書及びプローブのためのｄｄＰＣＲスーパーミックス（ｄＵＴＰなし）（ＢｉｏＲａｄ、ｃａｔ＃１８６３０２４；表１０におけるプライマー）を使用するｄｄＰＣＲによる既知の核型異常ＢＣＬ２Ｌ１の追跡によって評価された。

【0329】

【表10】

【0330】

得られた増幅産物は、プレキャスト２％アガロースゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ｃａｔ＃Ｇ５０１８０２）上でゲルにより確認され、ＰＣＲ精製及びサンガー配列決定のために提示された。得られた配列決定ファイルは、ｇＲＮＡ配列並びにインデル同一性及びパーセンテージを決定するための制御配列ファイルとともにＴｓｕｎａｍｉソフトウェアに入力された。

【0331】

クローンはまた、そのフローサイトメトリーを通して、インターフェロン－ガンマ処理（２５ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２８５－ＩＦ）の有無に関わらず、Ｂ２Ｍ及びＭＨＣクラスＩ抗原（ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ）の発現について陰性であることが確認された。図６Ａ～６Ｄを参照されたい。

【0332】

クローンは、多能性細胞表面マーカーのためのフローサイトメトリーにより多能性を保持することが確認された（図７Ａ～７Ｄ）。多能性の追加の確認は、Ｔａｑｍａｎ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ｃａｔ＃Ａ１５８７２）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｌｕｒｉｔｅｓｔサービス及び三血球系分化を含んだ（完全なプロトコルについては下を参照のこと）。

【0333】

細胞は、解離され、上のとおりに計数された後、遠心分離され、２μＭのＹ－２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ、ｃａｔ＃１２４５）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ ２０／１０／１０培地に１ｘ１０⁶／ｍＬまで再懸濁された。次に、再懸濁された細胞は、４０μＭフィルター（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ、ｃａｔ＃２２３６３５４７）に通して濾過され、５ｍＬの懸濁液は、超低接着６ウェルディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ｃａｔ＃３４７１）の単一のウェル中に播種された。次に、細胞は、オービタルシェーカー上に９８ＲＰＭで一晩置かれて、凝集体を形成した。１６時間後、使用済みの培地は、凝集体を回収するためにプレートを注意深く回旋することによって各ウェルから除去された。４ｍＬの新鮮なＡｄｖａｎｃｅｄ ２０／１０／１０が加えられた。

【0334】

さらに２４時間後、細胞は分化された。最初に、凝集体を５０ｍＬのコニカルチューブに回収し、１０００ＲＰＭで１分間遠心分離して凝集体を沈殿させた。培地を吸引し、凝集体をＤＭＥＭ／Ｆ１２で洗浄した。凝集体を遠心分離により再度回収し、４ｍＬのそれぞれの分化培地中で懸濁させた後、ディッシュ及び振盪機に戻した。全ての分化は、以下の基本培地を使用した：４８０ｍＬ ＩＭＤＭ ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃３１９８００３０）、４８０ｍＬ Ｆ１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃３１７６５０３５）、１０ｍＬの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃１１１４００７６）、５ｍＬの２０％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃Ａ７６３８－５Ｇ）、２ｍＬ 既知組成の脂質（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃１１９０５０３１）、１ｍＬの２００ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃Ａ４４０３－１００ＭＧ）、１ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬホロ－トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃Ｔ０６６５）、及び１００μＬの１４０μｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃Ｓ５２６１）。細胞を外胚葉細胞に分化させるために、４ｍｇ／ｍＬのインスリン（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃１２５８５０１４）、２μＭのＡ８３－０１、２μＭのドルソモルフィン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ｃａｔ＃８６６６４３０）及び２μＭのＰＮＵ－７４６５４の最終濃度を２日間使用した。細胞を中胚葉細胞に分化させるために、１μｇ／ｍＬのインスリン、０．１μＭのＰＩＫ－９０、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ｃａｔ＃２５２０６９１）及び０．５μＭのＬＤＮ１９３１８９（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ｃａｔ＃１０６２４４３）の最終濃度を２日間使用した。１日目の内胚葉分化のために、０．２μｇ／ｍＬのインスリン、０．１μＭのＰＩＫ－９０、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン－Ａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ｃａｔ＃１２０－００）、２μＭのＣＨＩＲ０００２１及び２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ塩基性（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ｃａｔ１０１－１８ｂ）の最終濃度を使用した。内胚葉のための分化の追加の２日間は、０．２μｇ／ｍＬのインスリン、０．１μＭのＰＩＫ－９０、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ及び０．２５μＭのＬＤＮ１９３１８９で実施された。培地は、全ての分化に関して毎日変えられた。全てが、３日目にＴａｑｍａｎ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄを使用してＲＮＡ分析のために回収された。

【0335】

実施例２：細胞維持及び増殖．
ｈＥＳＣ／ｈｉＰＳＣの維持。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株ＣｙＴ４９の細胞は、Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（５）：ｅ３７００４において記載されるとおりに維持され、培養され、継代され、増殖され、且つ播種された。ＣｙＴ４９細胞は、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ０７９２０又は等価物）を使用して解離された。

【0336】

ＴＣ１１３３細胞株（Ｌｏｎｚａ）などのヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）は、ＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧ（ＢｉｏＬａｍｉｎａ Ｃａｔ＃ＣＴ５２１）でコーティングされた組織培養プレート上でＳｔｅｍＦｌｅｘ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ３３４９４０１）中において維持された。プレートは、ＤＰＢＳ中のＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ、カルシウム、マグネシウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１４０４０１３３）の１：１０又は１：２０希釈物により３７℃で２時間予めコーティングされた。細胞はＳｔｅｍＦｌｅｘ培地を毎日供給された。細胞の継代に関して、ＣｙＴ４９のためのものと同じ細胞密度が使用された。単一細胞として細胞を播種するために、細胞は、ＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮでコーティングされたプレート上でＳｔｅｍＦｌｅｘ中において１％ ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）補給物（１００×）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃Ａ２６４４５０１）とともに播種された。

【0337】

ｈＰＳＣの単一細胞クローニング。単一細胞クローニングのために、ｈＰＳＣ（ｈＥＳＣ又はｈｉＰＳＣ）は、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）による解離の３～４時間前にＲｅｖｉｔａｃｅｌｌ（１×Ｒｅｖｉｔａｃｅｌｌの最終濃度）とともにＳｔｅｍＦｌｅｘ Ｃｏｍｐｌｅｔｅを供給された。解離の後、細胞は、ＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮでコーティングされた９６ウェル組織培養プレートのウェル当たり単一細胞としてソーティングされた。ＷＯＬＦ ＦＡＣＳソーター（Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ）を使用して、単一細胞をウェルにソーティングした。プレートは、Ｒｅｖｉｔａｃｅｌｌとともに１００～２００μＬのＳｔｅｍＦｌｅｘ Ｃｏｍｐｌｅｔｅで予め充填された。細胞播種の３日後、細胞は、新鮮なＳｔｅｍＦｌｅｘを供給され、１００～２００μＬの培地が１日おきに供給され続けた。増殖の１０日後、細胞は、１２～１４日目までＳｔｅｍＦｌｅｘを毎日供給された。この時点で、プレートはＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）で解離され、回収された細胞懸濁液は、１：２に分割され、半分は維持のために新しい９６ウェルプレートに入れられ、半分はＤＮＡ抽出溶液ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に入れられた。ＤＮＡ抽出の後、ＰＣＲを実施して、標的化されたＤＮＡ座位での所望の遺伝子編集の有無を評価した。サンガー配列決定を使用して所望の編集を検証した。

【0338】

単一細胞に由来するｈＰＳＣクローンの増殖。ＣｙＴ４９に関して、順調に標的化されたクローンは、純粋な１０％ ＸＦ ＫＳＲ Ａ１０Ｈ１０培地を含む２４ウェルプレートであるがＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮでコーティングされたプレート上に継代された。２４ウェルの段階の後、ＣｙＴ４９クローンは、Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（５）：ｅ３７００４において記載されるとおりに継代された。

【0339】

ｈｉＰＳＣ（ＴＣ１１３３）に関して、細胞は、クローニング及び継代段階でのＲｅｖｉｔａｃｅｌｌを含むＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮでコーティングされたプレート上での定期的な維持プロセス全体にわたってＳｔｅｍＦｌｅｘ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ中で維持された。

【0340】

実施例３：Ｂ２Ｍノックアウトヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の作製
ｈＰＳＣ中のＢ２ＭのためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）選択。上の実施例１において記載される３つのＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡを使用して、ｈＰＳＣ中のＢ２Ｍ遺伝子を標的化した。ｈＰＳＣにおけるそれらの切断効率を評価するために、ＣｙＴ４９細胞は、１２５ｐｍｏｌ Ｃａｓ９及び３７５ｐｍｏｌ ｇＲＮＡの絶対値を有する３：１（ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９）のモル比のＣａｓ９タンパク質（Ｂｉｏｍａｙ）及びガイドＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）混合物とともにＮｅｏｎエレクトロポレーター（Ｎｅｏｎトランスフェクションキット ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃ＭＰＫ５０００）を使用して電気穿孔された。ＲＮＰ複合体を形成するために、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９を、Ｒ－緩衝液（Ｎｅｏｎトランスフェクションキット）を含む１つの容器中で合わせて、２５μＬの合計体積にし、室温で１５分間インキュベートした。細胞は、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）を使用して解離され、続いてＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃１１３２００３３）中で再懸濁され、ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用して計数され、遠心分離された。合計で１×１０⁶個の細胞が、ＲＮＰ複合体とともに再懸濁され、Ｒ－緩衝液が加えられて、１２５μＬの合計体積になった。次に、この混合物は、１１００Ｖにて３０秒間２パルスで電気穿孔された。エレクトロポレーションの後、細胞は、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌを含むＳｔｅｍＦｌｅｘで充填されたＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにピペットで移された。次に、この細胞懸濁液は、１：２０の希釈度のＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧで予めコーティングされた組織培養ディッシュに播種された。細胞は、正常酸素圧インキュベーター（３７℃、８％ ＣＯ₂）中で４８時間培養された。４８時間後、ゲノムＤＮＡが、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ；Ｃａｔ＃ＱＥ０９０５０）を使用して細胞から収集された。

【0341】

標的Ｂ２Ｍ配列のためのＰＣＲが実施され、得られた増幅ＤＮＡは、ＴＩＤＥ分析によって切断効率について評価された。関連している領域のためのＰＣＲは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃１２５３２０１７６及びＣａｔ＃１１４９５０１７）を使用して実施された。ＰＣＲプライマーの配列は表４に示され；サイクル条件は表５にいおいて提供される。得られた増幅産物をＰＣＲ精製及びサンガー配列決定にかけた。サンガー配列決定の結果は、ガイド配列とともにＴｓｕｎａｍｉソフトウェアに入力された。インデルのパーセンテージ及び同一性は、ソフトウェアによって計算された。次に、特定のｇＲＮＡが、ｈＰＳＣにおけるそれらのインデル頻度に基づいて選択された。図８は、３つのＢ２Ｍ ｇＲＮＡに関する切断効率を示す。

【0342】

選択されたｇＲＮＡのオフターゲットは、配列類似性が予測される部位のハイブリッド捕捉分析を使用して幹細胞に由来するＤＮＡにおいて評価された。Ｂ２Ｍ－２及びＢ２Ｍ－３ガイドは、検出可能なオフターゲット作用を示さなかった。Ｂ２Ｍ－２ ｇＲＮＡは、その高いオンターゲット活性及び検出不可能なオフターゲット活性に起因してさらなるクローン作製について選択された。

【0343】

Ｂ２Ｍ ＫＯ ｈＰＳＣクローン作製及び特徴付け。Ｂ２Ｍ－２ ｇＲＮＡを使用して、ＣｙＴ４９ ｈＥＳＣは電気穿孔され、エレクトロポレーションの３日後に、単一細胞が、ＷＯＬＦ ＦＡＣＳ－ソーター（Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ）を使用してＳｔｅｍＦｌｅｘ及びＲｅｖｉｔａｃｅｌｌを含むＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧでコーティングされた９６ウェルプレートにソーティングされた。播種された単一細胞を、コロニーが単一細胞として再播種されるほど大きくなるまで、１日おきに培地を交換しながら正常酸素圧インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ₂）中で増殖させた。コンフルエントになったとき、試料を、維持及びゲノムＤＮＡ抽出のために分割した。

【0344】

クローンのＢ２Ｍ ＫＯ状態は、ＰＣＲ及びサンガー配列決定を介して確認された。標的Ｂ２Ｍ領域の得られたＤＮＡ配列は、インデル同一性及びホモ又はヘテロ接合性を決定するためにＳｎａｐｇｅｎｅソフトウェアにおいて整列させられた。所望の編集を有するクローンが増殖され、Ｂ２Ｍ発現についてのフローサイトメトリー評価を介してさらに検証された（利用される抗体のリストについては表１１を参照のこと）。クローンは、インターフェロン－ガンマ処理の有無で評価された（２５ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２８５－ＩＦ）。図９Ａは、野生型細胞におけるＢ２Ｍ発現を示し、図９Ｂは、ＫＯ細胞におけるＢ２Ｍ発現を示す。クローンの核型状態は、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓサービス（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を介して評価され、正常な核型が報告された。

【0345】

【表11】

【0346】

クローンは、多能性マーカーＯＣＴ４及びＳＯＸ２のための細胞内フローサイトメトリーにより多能性を保持することが確認された。確認された多能性クローンは、以前に確立された方法（Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（５）：ｅ３７００４）を使用して膵臓内分泌性前駆細胞に分化された。

【0347】

実施例４：Ｂ２ＭノックアウトＰＤ－Ｌ１ノックインヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の作製
Ｂ２Ｍ－ＫＯ ＰＤ－Ｌ１－ＫＩ戦略の設計。ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）をＢ２Ｍ座位に挿入するためのプラスミド設計は、Ｂ２Ｍの開始コドンが、相同組換え修復（ＨＤＲ）を経た後に除去されて、ＰＤ－Ｌ１を挿入して、部分的なＢ２Ｍ発現の機会を無効にするようになされた。図１０は、プラスミドの模式図を示し、表１２はその中の要素及び位置を特定する。ドナープラスミドは、エクソン１の周りのＢ２Ｍ座位と同一な配列を有する８００塩基対ホモロジーアームに隣接するＰＤ－Ｌ１のＣＡＧＧＳプロモーター駆動ｃＤＮＡを含有した。プラスミドの完全な配列は、配列番号３３において示される。

【0348】

【表12】

【0349】

Ｂ２Ｍ－２ ｇＲＮＡは、標的化されたＢ２Ｍ座位でのＰＤ－Ｌ１導入遺伝子の挿入を容易にするために使用された。ＰＤ－Ｌ１ドナープラスミドは、Ｂ２Ｍ標的化ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質で構成されるＲＮＰ複合体とともに導入された。１００万個のＣｙＴ４９細胞当たり、４μｇのプラスミドＤＮＡがＲＮＰとともに送達された。エレクトロポレーションは、実施例３において記載されるとおりに実施された。エレクトロポレーションの７日後に、細胞は、ＷＯＬＦ ＦＡＣＳ－ソーター（Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ）を使用して、ＰＤ－Ｌ１表面発現についてＲｅｖｉｔａｃｅｌｌとともにＳｔｅｍＦｌｅｘを含むＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧでコーティングされた９６ウェルプレートにソーティングされた。ＦＡＣＳ－ソーティングに関して、未編集の細胞は、陰性対照として機能した。ＰＤ－Ｌ１陽性細胞は、ソーティング及び単一細胞クローニングのために選択された。

【0350】

ＰＤ－Ｌ１表面発現を検出するために、抗ＰＤ－Ｌ１蛍光抗体が使用された（表１１を参照のこと）。播種された単一細胞を、コロニーが単一細胞として再播種されるほど大きくなるまで、１日おきに培地を交換しながら正常酸素圧インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ₂）中で増殖させた。コンフルエントになったとき、試料を、維持及びゲノムＤＮＡ抽出のために分割した。

【0351】

正確に標的化されたクローンは、プラスミドのホモロジーアームの外側からＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ挿入部までの領域を増幅するプライマーを使用して、ＰＤ－Ｌ１ノックイン（ＫＩ）挿入物のためにＫＩ組込みＤＮＡのみの増幅を可能にするＰＣＲを介して同定された。オンターゲット挿入物は、ＰＣＲによって接合状態について試験されて、ＫＩがヘテロ接合性又はホモ接合性様式において生じたかどうかが評価された。ヘテロ接合性クローンが同定された場合、ＫＩ陰性アレルをサンガー配列決定に送って、それがＢ２Ｍ－破壊インデルを含有したことを検証した。完全なＢ２Ｍ破壊を伴う正確なＫＩクローン（ＫＩ挿入物又はインデル形成のいずれかによる）は、３０００万個の細胞の集団サイズに達するまで、増加性の組織培養形式において増殖された。およそ１０個のクローンがこの様式で増殖され、細胞内フローサイトメトリーを介してＯＣＴ４及びＳＯＸ２について試験することによって多能性であると確認された（図１１）。次に、上の試験を通過したクローンは、下記のとおりの核型分析（Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）についてさらに試験された。さらに、クローンは、下記のとおりの確立されたプロトコル（Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（５）：ｅ３７００４）を介して膵臓内胚葉前駆細胞（ＰＥＣ）に分化するそれらの能力について試験された。Ｂ２Ｍの消失はさらに、フローサイトメトリーを介してインターフェロン－ガンマ処理（２５ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２８５－ＩＦ）の有無におけるＢ２Ｍの発現の欠如によって確認された。図１２Ａ及び１２Ｂは、それぞれ野生型及びＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ細胞においてＰＤ－Ｌ１発現を示す。

【0352】

実施例５：Ｂ２ＭノックアウトＨＬＡ－Ｅノックインヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の作製
Ｂ２Ｍ－ＫＯ ＨＬＡ－Ｅ－ＫＩ戦略の設計。ＨＬＡ－Ｅ三量体をＢ２Ｍ座位に挿入するためのプラスミド設計は、Ｂ２Ｍの開始コドンが、相同組換え修復（ＨＤＲ）を経た後に除去されて、ＨＬＡ－Ｅ三量体を挿入して、部分的なＢ２Ｍ発現の機会を無効にするようになされた。図１３は、プラスミドの模式図を示し、表１３はその中の要素及び位置を特定する。ＨＬＡ－Ｅ三量体ｃＤＮＡは、そのシグナルペプチドを伴わずにＨＬＡ－Ｅタンパク質に融合されたＢ２Ｍ膜タンパク質に融合されたＨＬＡ－Ｇ提示ペプチドに融合されたＢ２Ｍシグナルペプチドで構成された。この三量体設計は以前に公開されている（Ｇｏｒｎａｌｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５（８）：７６５－７７２）。ＨＬＡ－Ｅ送達のためのドナープラスミドは、エクソン１の周りのＢ２Ｍ座位と同一な配列を有する８００塩基対ホモロジーアームに隣接するＨＬＡ－Ｅ三量体のＣＡＧＧＳプロモーター駆動発現を含有する。プラスミドの完全な配列は、配列番号３４において示される。

【0353】

【表13】

【0354】

Ｂ２Ｍ－２ ｇＲＮＡは、標的化されたＢ２Ｍ座位でのＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子の挿入を容易にするために使用された。ＨＬＡ－Ｅドナープラスミドは、Ｂ２Ｍ標的化ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質で構成されるＲＮＰ複合体とともに導入された。１００万個のＣｙＴ４９細胞当たり、４μｇのプラスミドがＲＮＰとともに送達された。エレクトロポレーションは、実施例３において記載されるとおりに実施された。エレクトロポレーションの７日後に、細胞は、ＷＯＬＦ ＦＡＣＳ－ソーター（Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ）を使用して、ＨＬＡ－Ｅ表面発現についてＲｅｖｉｔａｃｅｌｌとともにＳｔｅｍＦｌｅｘを含むＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧでコーティングされた９６ウェルプレートにソーティングされた。ＦＡＣＳ－ソーティングに関して、未編集の細胞は、陰性対照として機能した。ＨＬＡ－Ｅ陽性細胞は、ソーティング及び単一細胞クローニングのために選択された。

【0355】

ＨＬＡ－Ｅ表面発現を検出するために、抗ＨＬＡ－Ｅ蛍光抗体が使用された（表１１）。播種された単一細胞を、コロニーが単一細胞として再播種されるほど大きくなるまで、１日おきに培地を交換しながら正常酸素圧インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ₂）中で増殖させた。コンフルエントになったとき、試料を、維持及びゲノムＤＮＡ抽出のために分割した。

【0356】

正確に標的化されたクローンは、プラスミドのホモロジーアームの外側からＨＬＡ－Ｅ ｃＤＮＡ挿入部までの領域を増幅するプライマーを使用して、ＨＬＡ－Ｅノックイン（ＫＩ）挿入物のためにＫＩ組込みＤＮＡのみの増幅を可能にするＰＣＲを介して同定された。オンターゲット挿入物は、ＰＣＲによって接合状態について試験されて、ＫＩがヘテロ接合性又はホモ接合性様式において生じたかどうかが評価された。ヘテロ接合性クローンが同定された場合、ＫＩ陰性アレルをサンガー配列決定に送って、それがＢ２Ｍ－破壊インデルを含有したことを検証した。完全なＢ２Ｍ破壊を伴う正確なＫＩクローン（ＫＩ挿入物又はインデル形成のいずれかによる）は、３０００万個の細胞の集団サイズに達するまで、増加性の組織培養形式において増殖された。およそ１０個のクローンがこの様式で増殖され、細胞内フローサイトメトリーを介してＯＣＴ４及びＳＯＸ２について試験することによって多能性であると確認された（図１４）。次に、上の試験を通過したクローンは、核型分析（Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）についてさらに試験された。さらに、クローンは、確立されたプロトコル（Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（５）：ｅ３７００４）を介して膵臓内胚葉前駆細胞（ＰＥＣ）に分化するそれらの能力について試験された。Ｂ２Ｍの消失はさらに、フローサイトメトリーを介してインターフェロン－ガンマ処理（５０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２８５－ＩＦ）の有無におけるＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃの発現の欠如によって確認された（図１５）。図１６は、ＨＬＡ－Ｅ発現を示す。

【0357】

実施例６：編集されたクローンの核型分析
編集された胚性幹（ＥＳ）細胞のＧ－バンド核型分析。１００万個の編集されたＥＳ細胞は、培養培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ ＸｅｎｏフリーＫＳＲと１０ｎｇ／ｍＬアクチビン及び１０ｎｇ／ｍＬヘレグリン）を含むＴ－２５培養フラスコ中に継代された。一晩培養した後、３つのＴ２５培養フラスコは、核型分析；染色体１、１２、１７、２０のためのＦＩＳＨ分析；及び標準的な８×６０Ｋアレイによるアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）分析のために細胞遺伝学研究室（Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）に送られた。非切断ガイド（「ＮＣＧ」）、Ｂ２Ｍ ＫＯクローン、Ｂ２Ｍ ＨＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＨＩクローン（「Ｖ１－Ａ」）、及びＢ２Ｍ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩクローン（「Ｖ２－Ａ」）とともに電気穿孔された、選択された細胞のＧ－バンディング結果は、表１４において示される。

【0358】

【表14】

【0359】

実施例７：編集されたヒト胚性幹細胞の膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）への分化
編集されたヒト胚性幹細胞（ＥＳ）の維持。様々な継代数（Ｐ３８～４２）の編集されたヒト胚性幹細胞は、ｈＥＳＭ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ ＫＳＲ＋ １０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ及び１０ｎｇ／ｍＬヘレグリン）及び最終１０％のヒトＡＢ血清とともに、４日間の継代のために３３，０００細胞／ｃｍ²又は３日間の継代のために５０，０００細胞／ｃｍ²で播種された。

【0360】

ＰＥＣ分化のための編集されたヒト胚性幹細胞の凝集。編集されたＥＳは、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）で単一細胞に解離され、続いて遠心分離され、１ｍｌ当たり１００万個の細胞でＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中の２％ ＳｔｅｍＰｒｏ（Ｃａｔ＃Ａ１０００７０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）中において再懸濁され、合計で３５０～４００万個の細胞が、８ＲＰＭ±０．５ＲＰＭの回転速度により１つの８５０ｃｍ²のローターボトル（Ｃａｔ＃４３１１９８、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）中に分化前の１８～２０時間播種された。編集されたヒト胚性幹細胞に由来するＥＳ凝集物は、Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（５）：ｅ３７００４において記載されるとおりにローターボトルを使用して膵臓系列に分化した。

【0361】

実施例８：分化した膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）の特徴付け
段階１（ＤＥ）のＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７並びにＰＥＣ段階のＣＨＧＡ、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１のためのフローサイトメトリー。ｈＥＳＣに由来する段階１の凝集物、又はｈＥＳＣに由来する膵性凝集物を、ＰＢＳで洗浄し、続いてＡＣＣＵＭＡＸ（商標）（カタログ＃Ａ７０８９、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）を使用して３７℃で酵素的に解離して、単一細胞懸濁液にした。ＭＡＣＳ分離緩衝液（Ｃａｔ＃１３０－０９１－２２１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｎｏｒｔｈ Ｒｈｉｎｅ－Ｗｅｓｔｐｈａｌｉａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を加え、懸濁液を、４０μｍフィルターに通過させ、ペレットにした。細胞内マーカーの染色のために、細胞を、４％（ｗｔ／ｖ）パラホルムアルデヒド中で３０分間固定し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．１％（ｗｔ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｗｔ／ｖ）ＮａＮ₃）中で洗浄し、続いて細胞を、氷上でＰｅｒｍ緩衝液（ＰＢＳ、０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｃａｔ＃Ａ１６０４６、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、ＭＡ）、５％（ｖ／ｖ）正常ロバ血清、０．１％（ｗｔ／ｖ）ＮａＮ３）により３０分間透過処理し、続いて洗浄緩衝液（ＰＢＳ、１％（ｗｔ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｗｔ／ｖ）ＮａＮ₃）で洗浄した。細胞を、ブロック緩衝液（ＰＢＳ、０．１％（ｖ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５％（ｖ／ｖ）正常ロバ血清、０．１％（ｗｔ／ｖ）ＮａＮ₃）で希釈された一次抗体（表１５）と４℃で一晩インキュベートした。細胞を、ＩＣ緩衝液中で洗浄し、続いて適切な二次抗体と４℃で６０分間インキュベートした。細胞をＩＣ緩衝液中で洗浄し、続いてＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄した。フローサイトメトリーデータは、ＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ）により得られた。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用して分析された。無処置の細胞は、前方（低角度）及び側方（直交性、９０°）光散乱に基づいて同定された。バックグラウンドは、抗体対照及び未分化細胞を使用して推定された。図面において、代表的なフローサイトメトリープロットは、亜集団のうちの１つについて示される。図面において報告される数は、無処置の細胞ゲートからの全細胞のパーセンテージを表す。

【0362】

【表15】

【0363】

ＤＥ段階では、ＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７二重陽性細胞の集団は、ＣｙＴ４９野生型分化細胞の全細胞の９０％を超えた。ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ、ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ、及びＢ２Ｍ ＫＯ細胞は、野生型細胞と比較して同等のＤＥのパーセンテージを示した（図１７Ａ～１７Ｂ及び図１８）。

【0364】

ＰＥＣ段階では、クロモグラニン（ＣＨＧＡ）、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１のためのフローサイトメトリーが実施された。ＰＥＣ段階の不均一な集団は、膵臓前駆細胞、初期内分泌を含む（図１９）。不均一な集団の円グラフから（図２０）、分化した編集細胞（ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ又はＢ２Ｍ ＫＯ）の細胞集団の分布は、野生型細胞と非常に類似していた。

【0365】

ターゲットＲＮＡｓｅｑ。遺伝子発現分析のためのターゲットＲＮＡｓｅｑは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ及び１１１個の遺伝子を標的化するオリゴのカスタムパネルを使用して実施された。パネルは主に、膵臓分化中の発生段階のマーカーである遺伝子を含有した。各分化段階の最後において、１０μＬのＡＰＶ（凝集したペレットの体積）が回収され、オンカラムデオキシリボヌクレアーゼ処理を含む、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ又はＲＮｅａｓｙ ９６スピンカラムプロトコルを使用して抽出された。定量化及び品質管理は、Ｑｕｂｉｔと合わせたＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ、又はＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｘｃｅｌのいずれかを使用して実施された。５０～２００ｎｇのＲＮＡは、Ｑｕｂｉｔと合わせたＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ、又はＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｘｃｅｌのいずれかを使用する得られたｄｓＤＮＡライブラリーの定量化及び品質管理の前に、ｃＤＮＡ合成、カスタムオリゴプールのハイブリダイゼーション、結合オリゴの洗浄、伸長、ライゲーション、ライブラリーのＰＣＲ増幅、及びライブラリーの精製からなるＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑライブラリー調製プロトコルに従って処理された。その後、ライブラリーは、４ｎＭの濃度に希釈され、プールされた後、変性、ＰｈｉＸ対照のスパイクイン、及びＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシークエンサー上への添加の前に１０～１２ｐＭへのさらなる希釈が行われた。配列決定の実行の後、最初のデータ分析は、ＢａｓｅＳｐａｃｅにより自動的に実施され、カスタムプローブの各々についての生のリードカウントを生成した。次に、各遺伝子に関して、これらのリードカウントは、１つのリードカウントを加えることにより（０による下流の除算を防ぐため）当該遺伝子に対応する全てのプローブについて合計された。正規化は遺伝子ＳＦ３Ｂ２に対して実施され、リードは通常、段階０に対する倍率変化として可視化された。データが主要な成分分析のために処理されたとき、正規化は、ＤＥｓｅｑ法を使用して実施された。選択された遺伝子発現は、図２１において示された。ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ又はＢ２Ｍ ＫＯ細胞からのＦＯＸＡ２、ＣＨＧＡ、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の動的発現パターンは、野生型細胞と類似していた。

【0366】

ＰＥＣ段階でのＢ２Ｍ及びＰＤ－Ｌ１発現の確認。ＰＥＣ段階では、分化した凝集物は、インターフェロン－ガンマ（５０ｎｇ／ｍｌ）の有無で４８時間刺激された。凝集物を、ＰＢＳで洗浄し、続いてＡＣＣＵＭＡＸ（商標）（カタログ＃Ａ７０８９、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）を使用して３７℃で酵素的に解離して、単一細胞懸濁液にした。ＭＡＣＳ分離緩衝液（Ｃａｔ＃１３０－０９１－２２１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｎｏｒｔｈ Ｒｈｉｎｅ－Ｗｅｓｔｐｈａｌｉａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を加え、懸濁液を、４０μｍフィルターに通過させ、ペレットにした。表面マーカーの染色のために、解離した細胞を、ＭＡＣＳ分離緩衝液中に希釈された蛍光コンジュゲート抗体とともに２０分間インキュベートし、続いてＭＡＣＳ分離緩衝液中で洗浄した。細胞を、フロー取得のためにＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。フローサイトメトリーデータは、ＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメーターにより得られた。図２２Ａ～２２Ｆで示されるとおり、Ｂ２Ｍ発現は、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ又はＢ２Ｍ ＫＯに由来する分化したＰＥＣにおいて検出限界未満であり、且つＰＤＬ１は、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞に由来する分化したＰＥＣにおいて発現された。

【0367】

ＰＥＣ細胞の免疫表現型。ＰＥＣ段階では、分化した凝集物は、インターフェロン－ガンマ（５０ｎｇ／ｍｌ）の有無で４８時間刺激された。凝集物は、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ染色のために収集された。野生型又は編集された細胞（ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ及びＢ２Ｍ ＫＯ細胞）に由来するＰＥＣ段階でＭＨＣクラスＩＩの発現はなかった（図２３Ｄ～２３Ｆ）。ＨＬＡ－ＡＢＣ（ＭＨＣクラスＩ）の発現は低く（野生型から１．３％）、それは、ＩＦＮ－γ刺激時に高度に調節された。しかしながら、ＨＬＡ－ＡＢＣは、編集された細胞（ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ及びＢ２Ｍ ＫＯ細胞）においてＩＦＮ－γ刺激下でさえ発現しなかった（図２３Ａ～２３Ｃ）。

【0368】

実施例９：Ｔ細胞活性化／増殖アッセイ
ＰＥＣ分化細胞は、インビトロヒトＴ細胞活性化／増殖アッセイを介して免疫応答を誘発するそれらの能力について試験された。新鮮なドナーＰＢＭＣは、Ｈｅｍａｃａｒｅから購入され、ＣＤ３＋Ｔ細胞は、汎Ｔ細胞単離キット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｃａｔ＃１３０－０９６－５３５）を使用して精製された。単離されたＴ細胞は、製造業者の指示書によりＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キットプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃３４５５４）で標識され、分化したＰＥＣとともに５日間共インキュベートされた。Ｔ細胞増殖及び活性化のためのＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ヒトＴ－アクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃１１１６１Ｄ）は、Ｔ細胞を活性化する陽性対照として使用された。Ｔ細胞単独でＣＦＳＥにより標識され、陰性対照として使用された。ＣＤ３＋ ＣＦＳＥ＋細胞のパーセントが、Ｔ細胞増殖のパーセントを評価するために測定された（図２４Ａ～２４Ｄ）。ＷＴ ＰＥＣは、Ｔ細胞単独の対照を超えてＴ細胞増殖を誘発した。Ｂ２Ｍ ＫＯ及びＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ ＣｙＴ４９に由来するＰＥＣは、Ｔ細胞のみの対照を超えてＴ細胞増殖を誘発しなかったが、これは編集された細胞の低免疫原性を示している。

【図1A】

【図1B-1C】

【図2】

【図3A-3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A-6B】

【図6C-6D】

【図7A-7B】

【図7C-7D】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図22D】

【図22E】

【図22F】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図23E】

【図23F】

【図24A】

【図24B】

【図24C】

【図24D】

【配列表】

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