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▶ ユーシービー バイオファルマ エスピーアールエルの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-01
(45)【発行日】2024-11-12
(54)【発明の名称】抗体を精製するための方法
(51)【国際特許分類】
C07K 1/22 20060101AFI20241105BHJP
C07K 16/18 20060101ALN20241105BHJP
【ＦＩ】
C07K1/22 ZNA
C07K16/18
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2022501242
(86)(22)【出願日】2020-07-30
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-11
(86)【国際出願番号】 EP2020071533
(87)【国際公開番号】W WO2021023619
(87)【国際公開日】2021-02-11
【審査請求日】2023-06-08
(31)【優先権主張番号】19189841.0
(32)【優先日】2019-08-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】514232085
【氏名又は名称】ユーシービー バイオファルマ エスアールエル
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ワトソン、ニール アラン
(72)【発明者】
【氏名】フィッペン、カーティス ウィリアム
【審査官】福間 信子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１１／１６２２１０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１５－０２０９５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許第０５７２６２９３（ＵＳ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００４／００６３１５３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１８／０１００００７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】ISHIHARA T. and HOSONO M.，Improving impurities clearance by amino acids addition to buffer solutions for chromatographic purifications of monoclonal antibodies，Journal of Chromatography B，2015年，vol. 995-996，pp. 107-114
【文献】Imidazole Elution Buffer Recipe，Cold Spring Harbor Protocol，2006年，doi: 10.1101/pdb.rec356
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗体を精製するための方法であって、ａ）精製しようとする該抗体を含む混合物を、親和性クロマトグラフィー樹脂上に装填するステップであって、該親和性クロマトグラフィー樹脂は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂、プロテインＧクロマトグラフィー樹脂及びプロテインＬクロマトグラフィー樹脂から選択される、ステップと、
ｂ）該クロマトグラフィー樹脂を洗浄緩衝剤で洗浄するステップと、
ｃ）０．０１Ｍ～１．０Ｍイミダゾール又はイミダゾールアナログを含み、３～５のｐＨである溶出緩衝剤で該抗体を溶出するステップ
とを含み、前記イミダゾールアナログは、４（５）－メチルイミダゾール、ピラゾール、１，５－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール、１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール及び１Ｈ－イミダゾール－１－イルメタノールから選択され、前記溶出緩衝剤は、アミノ酸を含まない、方法。
【請求項2】
前記溶出緩衝剤が、０．０１Ｍ～０．５Ｍの前記イミダゾール又はイミダゾールアナログを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記洗浄緩衝剤が、前記イミダゾール又はイミダゾールアナログを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記洗浄緩衝剤が、０．０１Ｍ～０．５Ｍの前記イミダゾール又はイミダゾールアナログを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記抗体を含む混合物の前記クロマトグラフィー樹脂上への装填前に、イミダゾール又はイミダゾールアナログを含む平衡化緩衝剤を用いて前記クロマトグラフィー樹脂を平衡化するさらなるステップを含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ステップａ）、ｂ）及びｃ）の１つ、２つ又は全部が、動的条件下で実行される、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記抗体が、ＩｇＧ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ－（Ｆｖ）２、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディから選択される、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、組換え抗体分子の製造の分野に関し、特に、そのような組換え抗体分子を、親和性クロマトグラフィーを使用して精製する方法及び特定の溶出条件の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
治療剤の分野では、特に、抗体及び抗体由来分子を含む、タンパク質などの生物学的実体の使用は、絶えず存在意義及び重要性を増してきており、それと共に、制御された大規模製造プロセスの必要性が同時に生じてきている。
【0003】
プロテインＡは、抗体分子のＦｃ領域に結合する黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のいくつかの株によって産生される細胞壁成分である。リガンドとして固定化されたプロテインＡを使用する親和性クロマトグラフィーは、抗体精製のために広く使用されてきており、今まで、多くの抗体精製プロセスにおける中核となる精製ステップであり、出発材料から不純物を高レベルで除去することを可能にする。さらに、プロテインＡはまた、抗体分子上に存在するＶＨ３領域に結合することも知られており、ＶＨ３領域とプロテインＡとの間の親和性相互作用に基づく、Ｆｃ領域を欠く代替的な抗体形式のためのある特定の精製戦略をもたらしている。
【0004】
プロテインＡは、中性ｐＨでＦｃドメインに対する高い親和性を有する。結果として、精製しようとする抗体を含有する出発材料は、典型的には、中性ｐＨでプロテインＡ樹脂上に装填される。典型的なプロセスに続き、できるだけ多くの不純物の除去を確保するために、これも中性ｐＨである緩衝剤でクロマトグラフィー材料を洗浄する１つ又は複数のステップが行われることになる。最後に、結合した抗体をプロテインＡから回収するために、溶出ステップが必要である。この溶出ステップは、抗体とプロテインＡとの相互作用を破壊すると予想される酸性ｐＨ（典型的には、約２．５～約４．０）を有する溶出緩衝剤の使用を含む。同様に、ＷＯ２０１６／１６９９９２は、プロテインＡからの溶出のためにｐＨの酸性化にも依拠するプロテインＡを介するＶＨ３領域の結合に基づくＦｃ領域を欠く抗体分子のための精製方法を記載する。
【0005】
典型的には、より低いｐＨはまた、より低い溶出容量を可能にし、全体のプロセス効率に直接影響する。より低い溶出容量に関する別の考慮は、それらが、高容量の溶出緩衝剤でのクロマトグラフィー樹脂の洗浄が行われる伝統的な動的結合条件とは対照的な、静的結合条件の使用を可能にし得ることである。
【0006】
しかしながら、抗体分子のプロテインＡへの結合を破壊するのに十分に低いｐＨでなければならないだけでなく、タンパク質の三次構造を破壊するほど低いものであってはならないことの間のバランスが見出されなければならない。さらに、凝集は、精製プロセスの間に除去しなければならないさらなる不純物をもたらし、最終的には、低いプロセス収率をもたらす酸性条件への曝露のよくある結果である。結果として、より不安定な一部の抗体分子については、より高いｐＨでプロテインＡからの溶出を可能にする条件を見出すことが有利であり得る。
【0007】
これらの課題を克服する試みにおいては、プロテインＡへの結合について抗体分子と競合することができる追加成分を溶出緩衝剤中に添加すること、及び／又は溶出ｐＨを増大させることによって、抗体分子のプロテインＡからの溶出を増強する異なる試みがなされている。
【0008】
Ａｒａｋａｗａら、「水性アルギニン溶液によるプロテインＡカラムからの抗体の溶出（Ｅｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ａ ｃｏｌｕｍｎ ｂｙ ａｑｕｅｏｕｓ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）」；２００４；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＆ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２４４～２４８頁及び米国特許第８，４７０，３２８号は、４．０～５．０のｐＨを有する溶出緩衝剤中でのアルギニン又はアルギニン誘導体の使用を記載している。しかしながら、高いｐＨは、樹脂からの抗体の弱い解離を引き起こすだけでなく、その後、容易に樹脂に再結合し得るため、溶出緩衝剤のｐＨが増大するにつれて、溶出容量も増大する。
【0009】
商業的な大規模製造プロセスに関するさらなる考慮は、順に、プロテインＡなどのクロマトグラフィー支持体の装填、洗浄及び溶出において使用される容量によって直接影響される、それぞれのクロマトグラフィーサイクルにかかる時間である。小規模でのこれらのパラメーターの最適化は、製造容量に拡大される場合に大きな影響をもたらし、廃棄しなければならない廃棄物に関する改善、より短い生産時間、及び結果として改善される費用プロファイルをもたらし得る。
【0010】
ヒスチジンタグを有する組換えタンパク質を発現させること、次いで、得られたタンパク質を、ニッケル親和性クロマトグラフィー（ヒスチジンタグに結合する）を使用して精製すること、及びイミダゾールの助けを借りてタンパク質を溶出させることを含む代替形態のタンパク質精製も使用されている。しかしながら、この方法の欠点は、多くの使用のために、タンパク質を使用することができる前に、精製後にタグをタンパク質分解的に除去する必要があるということである。
【0011】
上記に基づくと、製造プロセスの間に抗体を精製するための迅速且つ強健な方法、特に、親和性クロマトグラフィー樹脂から抗体を溶出させる改善された方法を提供することの継続的な要求が存在する。この要求は、本発明によって対処される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0012】
第１の態様では、本発明は、抗体を精製するための方法であって、
ａ）精製しようとする抗体を含む混合物を、親和性クロマトグラフィー樹脂上に装填するステップであって、親和性クロマトグラフィー樹脂は、ニッケルベース、亜鉛ベース又はコバルトベースの樹脂ではない、ステップ、
ｂ）クロマトグラフィー樹脂を洗浄緩衝剤で洗浄するステップ、
ｃ）０．０１Ｍ～１．０Ｍイミダゾール又はイミダゾールアナログを含み、３～５のｐＨである溶出緩衝剤で抗体を溶出するステップ
を含む、方法に関する。
ａ）精製しようとする抗体を含む混合物を、親和性クロマトグラフィー樹脂上に装填するステップであって、親和性クロマトグラフィー樹脂は、ニッケルベース、亜鉛ベース又はコバルトベースの樹脂ではない、ステップ、
ｂ）クロマトグラフィー樹脂を洗浄緩衝剤で洗浄するステップ、
ｃ）０．０１Ｍ～１．０Ｍイミダゾール又はイミダゾールアナログを含み、３～５のｐＨである溶出緩衝剤で抗体を溶出するステップ
を含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】静的結合試験の結果である。
【図2】ｐＨ３．６±イミダゾールでのＩｇＧ１クロマトグラム溶出プロファイルの重ね合わせである。
【図3】ｐＨ４．０±イミダゾールでのＩｇＧ１クロマトグラム溶出プロファイルの重ね合わせである。
【図4】ｐＨ３．６±イミダゾールでのＩｇＧ４クロマトグラム溶出プロファイルの重ね合わせである。
【図5】ｐＨ４．０±イミダゾールでのＴｒＹｂｅ（ＶＨ３）クロマトグラム溶出プロファイルの重ね合わせである。
【図6】動的結合試験の結果である。
【図7】ｐＨ３．６±１，３ジメチル－１Ｈ－ピラゾールでのＩｇＧ１クロマトグラム溶出プロファイルの重ね合わせである。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明は、溶出がイミダゾール又はイミダゾールアナログの存在下で実施される親和性クロマトグラフィーステップを含む、抗体を精製するための新規方法を提供することによって、上に概略された課題を解決する。いかなる理論によっても束縛されるものではないが、イミダゾール又はそのアナログは、溶出ステップ中にクロマトグラフィー樹脂から解離する抗体分子に結合すると考えられる。それによって、イミダゾール、又はそのアナログは、抗体分子の樹脂への再結合を防止する。これは、溶出速度を改善し、かくして、溶出容量を減少させるのに役立ち、本技術分野で記載されていた方法を超える利点である。
【0015】
本発明の方法は、静的条件および動的条件の両方の条件下で実施される親和性クロマトグラフィーステップを含む抗体精製方法に適合する。
【0016】
本発明の文脈では、動的条件は、親和性樹脂が典型的にはクロマトグラフィーカラム又は膜の中にあり、精製しようとする抗体を含む混合物、洗浄緩衝剤及び／又は溶出緩衝剤がカラム上に添加され、溶出液がカラムから回収されるものと考えられる。静的クロマトグラフィー条件は、クロマトグラフィー樹脂と、精製しようとする抗体を含む混合物との混合、次いで、インキュベーション期間、及び液相からのクロマトグラフィー樹脂のその後の分離及びクロマトグラフィー樹脂からの結合画分のその後の溶出を含むものである。
【0017】
本発明の方法の好ましい実施形態では、ステップａ）、ｂ）及びｃ）のうちの１つ、２つ又は全部が、動的条件下で実施される。
【0018】
第１の態様では、本発明は、抗体を精製するための方法であって、
ａ）精製しようとする抗体を含む混合物を、親和性クロマトグラフィー樹脂上に装填するステップであって、親和性クロマトグラフィー樹脂は、ニッケルベース、亜鉛ベース又はコバルトベースの樹脂ではない、ステップ
ｂ）クロマトグラフィー樹脂を洗浄緩衝剤で洗浄するステップ、及び
ｃ）０．０１Ｍ～１．０Ｍイミダゾール又はイミダゾールアナログを含み、３～５のｐＨである溶出緩衝剤で抗体を溶出するステップ
を含む、方法に関する。
ａ）精製しようとする抗体を含む混合物を、親和性クロマトグラフィー樹脂上に装填するステップであって、親和性クロマトグラフィー樹脂は、ニッケルベース、亜鉛ベース又はコバルトベースの樹脂ではない、ステップ
ｂ）クロマトグラフィー樹脂を洗浄緩衝剤で洗浄するステップ、及び
ｃ）０．０１Ｍ～１．０Ｍイミダゾール又はイミダゾールアナログを含み、３～５のｐＨである溶出緩衝剤で抗体を溶出するステップ
を含む、方法に関する。
【0019】
親和性クロマトグラフィー樹脂は、好ましくは、抗体のＦｃ領域又はＶＨ３ドメインを介して、抗体に結合することができる。一実施形態では、前記親和性クロマトグラフィー樹脂は、金属イオンベースの樹脂ではない。別の実施形態では、前記親和性クロマトグラフィー樹脂は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂、プロテインＧクロマトグラフィー樹脂及びプロテインＬクロマトグラフィー樹脂から選択される。
【0020】
例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ａｂｓｏｌｕｔｅ（登録商標）（Ｎｏｖａｓｅｐ）、ＣａｐｔｉｖＡ（登録商標）（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）、Ｐｒａｅｓｔｏ ＡＰ（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ）又はＡｍｓｐｈｅｒｅ（登録商標）（ＪＳＲ）などの、当業者には利用可能なプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬを含有する多くの親和性クロマトグラフィー材料が存在する。
【0021】
プロテインＡクロマトグラフィーにおける洗浄及び溶出緩衝剤としての使用にとって好適な緩衝剤は、当業界で容易に入手可能であり、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ、ヒスチジン、酢酸、ギ酸、クエン酸緩衝剤、又はＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸イミダゾール）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ－（ビス－２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）－プロパンスルホン酸）、又はＨＥＰＥＳ（Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸）緩衝剤から非限定例として選択することができる。
【0022】
一実施形態では、溶出緩衝剤は、０．０１Ｍ～０．７５Ｍのイミダゾール又はイミダゾールアナログを含み、例えば、０．１Ｍ～０．５Ｍ、例えば、０．２Ｍ～０．５Ｍ、例えば、０．２Ｍ～０．３Ｍ、例えば、０．２５Ｍの、０．０１Ｍ～０．５Ｍなどのイミダゾール又はイミダゾールアナログを含む。
【0023】
一実施形態では、溶出緩衝剤のｐＨは、３．５～４．５であり、例えば３．５～４．０又は４．０～４．５又は３．６～３．９（例えば、３．７～３．９）などである。
【0024】
一実施形態では、洗浄緩衝剤も、イミダゾール又はイミダゾールアナログを含む。一実施形態では、洗浄緩衝剤は、０．０１Ｍ～０．７５Ｍのイミダゾール又はイミダゾールアナログを含み、例えば、０．１Ｍ～０．５Ｍ、例えば、０．２Ｍ～０．５Ｍ、例えば、０．２Ｍ～０．３Ｍ、例えば、０．２５Ｍの、０．０１Ｍ～０．５Ｍなどのイミダゾール又はイミダゾールアナログを含む。
【0025】
イミダゾールは、式Ｃ３Ｎ２Ｈ４を有する有機化合物である。それは芳香族複素環であり、ジアゾールとして分類され、非隣接窒素原子を有する。
【0026】
本明細書で使用される用語「イミダゾールアナログ」とは、イミダゾール環構造、又はピラゾール及びトリアゾールなどの、少なくとも２個の窒素原子を含有する他の５員環構造（すなわち、ジアゾール若しくはトリアゾール）を指す。
【0027】
この環は置換されていても、置換されていなくてもよい。置換が存在する場合、それらは、一実施形態では、メチル、エチル、ヒドロキシ又はヒドロキシメチルから選択される。一実施形態では、１個のメチル基などの、ただ１つの置換が存在する。別の実施形態では、２個のメチル基などの、２つの置換が存在する。
【0028】
一実施形態では、環は、１又は２位で置換されておらず、例えば、１又は２位で置換されていないイミダゾール環（式Ｉ）などのである。
（式Ｉ－イミダゾール）
【化1】
（式Ｉ－イミダゾール）
【0029】
好ましいイミダゾールアナログとしては、４（５）－メチルイミダゾール、ピラゾール、１，５－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール、１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール及び１Ｈ－イミダゾール－１－イルメタノールが挙げられる。
【0030】
別の実施形態では、イミダゾールアナログは、ヒスチジン又はｎ－ｂｏｃ－Ｌ－ヒスチジン、ｎ－ベンジルオキシカルボニル－Ｄ－ヒスチジン若しくはＬ－ヒスチジンメチルエステル二水素塩化物などのヒスチジンアナログである。
【0031】
好ましい実施形態では、環は、非置換、好ましくは、非置換イミダゾール又はピラゾールである。
【0032】
一実施形態では、本発明の方法は、抗体を含む混合物のクロマトグラフィー樹脂上への装填前に、イミダゾール又はイミダゾールアナログを含む平衡化緩衝剤を用いてクロマトグラフィー樹脂を平衡化するさらなるステップを含む。
【0033】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、残存する不純物を除去するための１つ又は複数の追加のクロマトグラフィーステップを含むことになる。一般に、そのようなステップは、ゲル濾過クロマトグラフィー、陽イオンクロマトグラフィー、陰イオンクロマトグラフィー、混合様式クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー及び疎水性電荷誘導クロマトグラフィーにおける使用のための適切な機能を有する固相を使用する非親和性クロマトグラフィーステップを用いることになる。これらのものを、結合及び溶出様式で、又は流出様式で操作することができる。流出様式では、不純物は、固相に結合するか、又は固相中での移動度が低下するが、標的タンパク質は、溶出液又は流出液画分中に回収される。適切な機能を有するビーズ樹脂又は膜などのクロマトグラフィーにおける使用のための適切な固相は、当業者には容易に利用可能である。本発明の方法による特定の実施形態では、方法は、流出様式で操作される陰イオン交換クロマトグラフィーのステップをさらに含む。
【0034】
さらなる特定の実施形態では、本発明の方法は、プロテインＡクロマトグラフィーステップ、次いで、タンパク質を含有する流出液を産生する陰イオン交換クロマトグラフィーである第１のクロマトグラフィーステップ及びタンパク質を含有する溶出液が回収される陽イオン交換クロマトグラフィーである第２のクロマトグラフィーステップを含む。
【0035】
別の実施形態では、本発明の方法は、プロテインＡクロマトグラフィー、次いで、タンパク質を含有する溶出液が回収される陽イオン交換クロマトグラフィーである第１のクロマトグラフィーステップ及びタンパク質を含有する流出液を産生するための陰イオン交換クロマトグラフィーである第２のクロマトグラフィーステップを含む。
【0036】
抗体
本明細書で使用される用語「抗体」又は「複数の抗体」は、モノクローナル及びポリクローナル抗体を含む。さらに、本明細書で使用される用語「抗体」又は「複数の抗体」は、限定されるものではないが、当業界で公知の組換え技術によって生成される組換え抗体を含む。「抗体」又は「複数の抗体」は、任意の種の抗体、特に、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ並びにＩｇＧＡ１、ＩｇＧＡ２を含むこの基本構造の二量体若しくはＩｇＭ及びその改変バリアントなどの五量体として産生される抗体を含む、任意のアイソタイプのヒト抗体、例えば、チンパンジー、ヒヒ、アカゲザル若しくはカニクイザルに由来する非ヒト霊長類抗体；例えば、マウス若しくはラットに由来する齧歯類抗体；ウサギ、ヤギ若しくはウマ抗体；並びにラクダ科抗体（例えば、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）などのラクダ若しくはラマに由来する）及びその誘導体などの哺乳動物種の抗体；又はニワトリ抗体などの鳥類若しくはサメ抗体などの魚類の抗体を含む。用語「抗体」又は「複数の抗体」はまた、少なくとも１つの重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第１の部分が第１の種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第２の部分が第２の種に由来する「キメラ」抗体も指す。本明細書における目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界ザル）に由来する可変ドメイン抗原結合配列と、ヒト定常領域配列とを含む「霊長類化」抗体を含む。「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体に由来する配列を含有するキメラ抗体である。多くの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望の特異性、親和性、及び活性を有する、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域［又は相補性決定領域（ＣＤＲ）］に由来する残基で置き換えられた、ヒト抗体（レシピエント抗体）である。多くの例では、ＣＤＲの外部、すなわち、フレームワーク領域（ＦＲ）中のヒト（レシピエント）抗体の残基は、対応する非ヒト残基によってさらに置き換えられる。さらに、ヒト抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体中には見出されない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体特性をさらに精緻化するために為される。ヒト化は、ヒトにおける非ヒト抗体の免疫原性を低減し、かくして、ヒト疾患の処置への抗体の適用を容易にする。ヒト化抗体及びそれらを生成するためのいくつかの異なる技術は、当業界で周知である。用語「抗体」又は「複数の抗体」はまた、ヒト化の代替手段として生成することができるヒト抗体も指す。例えば、免疫化の際に、内因性マウス抗体の産生の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を生産することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト抗体／抗体断片を得るための他の方法は、少なくとも部分的に人工的に生成されるか、又はドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーに由来する組換えＤＮＡライブラリーが使用される、ファージディスプレイ又はリボソームディスプレイ技術などのディスプレイ技術に基づくものである。ヒト抗体を生成するためのファージ及びリボソームディスプレイ技術は、当業界で周知である。ヒト抗体を、目的の抗原を用いてｅｘ ｖｉｖｏで免疫された単離されたヒトＢ細胞から生成した後、融合させて、ハイブリドーマを生成することもでき、次いで、これらを最適なヒト抗体についてスクリーニングすることができる。本明細書で使用される用語「抗体」又は「複数の抗体」はまた、非グリコシル化抗体も指す。
本明細書で使用される用語「抗体」又は「複数の抗体」は、モノクローナル及びポリクローナル抗体を含む。さらに、本明細書で使用される用語「抗体」又は「複数の抗体」は、限定されるものではないが、当業界で公知の組換え技術によって生成される組換え抗体を含む。「抗体」又は「複数の抗体」は、任意の種の抗体、特に、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ並びにＩｇＧＡ１、ＩｇＧＡ２を含むこの基本構造の二量体若しくはＩｇＭ及びその改変バリアントなどの五量体として産生される抗体を含む、任意のアイソタイプのヒト抗体、例えば、チンパンジー、ヒヒ、アカゲザル若しくはカニクイザルに由来する非ヒト霊長類抗体；例えば、マウス若しくはラットに由来する齧歯類抗体；ウサギ、ヤギ若しくはウマ抗体；並びにラクダ科抗体（例えば、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）などのラクダ若しくはラマに由来する）及びその誘導体などの哺乳動物種の抗体；又はニワトリ抗体などの鳥類若しくはサメ抗体などの魚類の抗体を含む。用語「抗体」又は「複数の抗体」はまた、少なくとも１つの重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第１の部分が第１の種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第２の部分が第２の種に由来する「キメラ」抗体も指す。本明細書における目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界ザル）に由来する可変ドメイン抗原結合配列と、ヒト定常領域配列とを含む「霊長類化」抗体を含む。「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体に由来する配列を含有するキメラ抗体である。多くの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望の特異性、親和性、及び活性を有する、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域［又は相補性決定領域（ＣＤＲ）］に由来する残基で置き換えられた、ヒト抗体（レシピエント抗体）である。多くの例では、ＣＤＲの外部、すなわち、フレームワーク領域（ＦＲ）中のヒト（レシピエント）抗体の残基は、対応する非ヒト残基によってさらに置き換えられる。さらに、ヒト抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体中には見出されない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体特性をさらに精緻化するために為される。ヒト化は、ヒトにおける非ヒト抗体の免疫原性を低減し、かくして、ヒト疾患の処置への抗体の適用を容易にする。ヒト化抗体及びそれらを生成するためのいくつかの異なる技術は、当業界で周知である。用語「抗体」又は「複数の抗体」はまた、ヒト化の代替手段として生成することができるヒト抗体も指す。例えば、免疫化の際に、内因性マウス抗体の産生の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を生産することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト抗体／抗体断片を得るための他の方法は、少なくとも部分的に人工的に生成されるか、又はドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーに由来する組換えＤＮＡライブラリーが使用される、ファージディスプレイ又はリボソームディスプレイ技術などのディスプレイ技術に基づくものである。ヒト抗体を生成するためのファージ及びリボソームディスプレイ技術は、当業界で周知である。ヒト抗体を、目的の抗原を用いてｅｘ ｖｉｖｏで免疫された単離されたヒトＢ細胞から生成した後、融合させて、ハイブリドーマを生成することもでき、次いで、これらを最適なヒト抗体についてスクリーニングすることができる。本明細書で使用される用語「抗体」又は「複数の抗体」はまた、非グリコシル化抗体も指す。
【0037】
本明細書で使用される用語「抗体」又は「複数の抗体」とは、ヒト（例えば、ＩｇＧ）及び他の哺乳動物種に由来するものを含む任意の種の完全長抗体を指すだけでなく、抗体断片も指す。抗体の断片は、当業界で公知のように、少なくとも１つの重鎖又は軽鎖免疫グロブリンドメインを含み、１つ又は複数の抗原に結合する。本発明による抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ及びｓｃＦｖ断片；並びにダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ｓｄＡｂなどのドメイン抗体（ｄＡｂ）、ＶＨＨ及びＶＮＡＲ断片、一本鎖抗体、限定されるものではないが、Ｆａｂ－Ｆｖ又はＦａｂ－Ｆｖ－Ｆｖ構築物などの抗体断片又は抗体から形成される二重特異性、三重特異性、四重特異性又は多重特異性抗体が挙げられる。上で定義された抗体断片は、当業界で公知である。
【0038】
一実施形態では、本発明の方法を使用して精製される抗体は、以下のモチーフ：ポリヒスチジンモチーフ、ＨＱモチーフ、ＨＮモチーフ又はＨＡＴモチーフのいずれかを含まず、ここで、ポリヒスチジンモチーフは、５個以上の連続するヒスチジン残基の配列であり、ＨＱモチーフは、少なくとも３個交互のヒスチジン及びグルタミンを含む配列（ＨＱＨＱＨＱ（配列番号７））であり、ＨＮモチーフは、少なくとも３個交互のヒスチジン及びアスパラギンを含む配列（ＨＮＨＮＨＮ（配列番号８））であり、ＨＡＴモチーフは、配列ＫＤＨＬＩＨＮＶＨＫＥＥＨＡＨＡＨＮＫ（配列番号９）である。
【0039】
本発明の方法の一実施形態では、精製しようとする抗体は、Ｆｃ領域を含む抗体である。
【0040】
一実施形態では、精製しようとする抗体は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む抗体である。
【0041】
一実施形態では、精製しようとする抗体は、ＶＨ３領域を含有し、ＶＨ３領域を介して親和性クロマトグラフィー樹脂に結合する抗体である。
【0042】
別の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ－（Ｆｖ）２、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディから選択される。
【0043】
本発明の方法の一実施形態では、抗体は、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７４４０９に開示されたＦａｂＦｖ又はそのジスルフィド安定化形態である。
【0044】
一実施形態では、抗体は、特に、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／０６８５６３に開示されたＣＤＲ又は可変領域を有する、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインを含む。
【0045】
一実施形態では、Ｆａｂ－ｄｓＦｖ形式などの抗体は、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７４４０９又はＷＯ２０１４／０１９７２７に開示されたものである。
【0046】
別の実施形態では、抗体は、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／０６８５７１に開示されたＦａｂ－ｓｃＦｖ融合タンパク質形式である。
【0047】
別の実施形態では、抗体は、
ａ）式（Ｉ）：
ＶＨ－ＣＨ１－Ｘ－Ｖ１
のポリペプチド鎖；及び
ｂ）式（ＩＩ）：
ＶＬ－ＣＬ－Ｙ－Ｖ２
のポリペプチド鎖
（式中、
ＶＨは、重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン１を表し；
Ｘは、結合又はリンカーを表し；
Ｙは、結合又はリンカーを表し；
Ｖ１は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表し；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬは、Ｃカッパなどの軽鎖定常領域に由来するドメインを表し；
Ｖ２は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表し；
Ｖ１又はＶ２のうちの少なくとも一方は、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１５／１９７７７２に記載されたｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである）
を含むか、又はそれからなる多重特異性抗体分子である。
ａ）式（Ｉ）：
ＶＨ－ＣＨ１－Ｘ－Ｖ１
のポリペプチド鎖；及び
ｂ）式（ＩＩ）：
ＶＬ－ＣＬ－Ｙ－Ｖ２
のポリペプチド鎖
（式中、
ＶＨは、重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン１を表し；
Ｘは、結合又はリンカーを表し；
Ｙは、結合又はリンカーを表し；
Ｖ１は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表し；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬは、Ｃカッパなどの軽鎖定常領域に由来するドメインを表し；
Ｖ２は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表し；
Ｖ１又はＶ２のうちの少なくとも一方は、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１５／１９７７７２に記載されたｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである）
を含むか、又はそれからなる多重特異性抗体分子である。
【0048】
本明細書で用いられる場合、「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」とは、ＶＨとＶＬ可変ドメイン間のペプチドリンカーによって安定化された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含むか、又はそれからなる一本鎖可変断片を指す。ＶＨ及びＶＬ可変ドメインは、任意の好適な向きにあってよく、例えば、ＶＨのＣ末端を、ＶＬのＮ末端に連結するか、又はＶＬのＣ末端を、ＶＨのＮ末端に連結してもよい。
【0049】
「ジスルフィド安定化一本鎖可変断片」又は「ｄｓｓｃＦｖ」とは、ＶＨとＶＬ可変ドメイン間のペプチドリンカーによって安定化され、ＶＨとＶＬとの間にドメイン間ジスルフィド結合も含む一本鎖可変断片を指す。
【0050】
「ジスルフィド安定化可変断片」又は「ｄｓＦｖ」とは、ＶＨとＶＬ可変ドメイン間にペプチドリンカーを含まず、その代わりにＶＨとＶＬとの間のドメイン間ジスルフィド結合によって安定化された一本鎖可変断片を指す。
【0051】
１つの特定の実施形態では、抗体は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／１９７７７２に記載された形式Ｆａｂ－２ｘ ｄｓｓｃＦｖの多重特異性抗体である。
【0052】
さらに特定の実施形態では、形式Ｆａｂ－２ｘ ｄｓｓｃＦｖの多重特異性抗体は、三価抗体である、すなわち、それぞれのＦｖは異なるエピトープに結合する。
【0053】
さらに特定の実施形態では、多重特異性抗体は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／１９７７７２に記載されたＦａｂ－ｄｓｓｃＦｖ－ｄｓＦｖ形式を有する。
【0054】
一実施形態では、精製しようとする抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなる群から選択される配列を含む。
【0055】
配列番号１：（ａ）抗アルブミン抗体の重鎖可変ドメイン（ｄｓなし）
【化2】
【0056】
配列番号２：（ｂ）抗アルブミン抗体の重鎖可変ドメイン（ｄｓ）
【化3】
【0057】
配列番号３：（ｃ）抗アルブミン抗体の軽鎖可変ドメイン（ｄｓなし）
【化4】
【0058】
配列番号４：（ｄ）抗アルブミン抗体の軽鎖可変ドメイン（ｄｓ）
【化5】
【0059】
配列番号５：アルブミンに特異的な６４５ ｇＨ５ｇＬ４
【化6】
【0060】
配列番号６：アルブミンに特異的な６４５ ｇＨ５ｇＬ４ｄｓ
【化7】
【0061】
本発明の方法のステップａ）において親和性クロマトグラフィー樹脂上に装填される抗体を含む混合物は、多くの実施形態では、抗体が組換え産生される細胞培養物（例えば、哺乳動物又は細菌培養物）に直接又は間接に由来する。
【0062】
大規模商業目的で製造される、抗体断片などの組換え抗体又は抗体誘導体を、組換え抗体をコードする１つ又は複数の発現ベクターをトランスフェクトされた真核宿主細胞を培養することによって生産することができる。真核宿主細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【0063】
哺乳動物細胞を、その増殖及び抗体の発現を支援する任意の培地中で培養することができ、好ましくは、培地は、動物血清及びペプトンなどの動物由来生成物を含まない化学規定培地である。細胞増殖及びタンパク質産生を可能にする適切な濃度で存在する、様々な組合せのビタミン、アミノ酸、ホルモン、増殖因子、イオン、緩衝剤、ヌクレオシド、グルコース又は同等のエネルギー源を含む、当業者には利用可能な様々な細胞培養培地がある。追加の細胞培養培地成分を、当業者には公知である細胞培養サイクル中の異なる時間に適切な濃度で細胞培養培地中に含有させることができる。
【0064】
哺乳動物細胞培養は、必要とされる生産規模に応じて、フェドバッチ様式で操作しても、しなくてもよい、振とうフラスコ又はバイオリアクターなどの任意の好適な容器中で行うことができる。これらのバイオリアクターは、例えば、撹拌タンク又はエアリフトリアクターであってもよい。１，０００Ｌ～５０，０００Ｌを超える、好ましくは、５，０００Ｌ～２０，０００Ｌ、又は１０，０００Ｌまでの限度容量を有する種々の大規模バイオリアクターが利用可能である。或いは、２Ｌ～１００Ｌなどのより小規模のバイオリアクターを使用して、本発明の方法に従って精製しようとする抗体を製造することもできる。
【0065】
本発明の方法に従って製造することができる抗体又はその抗原結合断片は、典型的には、哺乳動物宿主細胞培養物、典型的には、ＣＨＯ細胞培養物の上清中に見出される。抗体又はその抗原結合断片などの目的のタンパク質が上清中に分泌されるＣＨＯ培養プロセスのために、前記上清は、当業界で公知の方法によって、典型的には、遠心分離によって収集される。疑いを避けるために、上清とは、細胞培養物の遠心分離から得られる沈降した細胞の上にある液体を指す。
【0066】
本発明の一実施形態では、方法は、目的の抗体を発現するＣＨＯ細胞を培養すること、上清を回収すること、及び混合物から前記抗体を精製することを含み、前記精製は、本発明の方法に従って実施される少なくとも１つの親和性クロマトグラフィーステップを含む。
【0067】
或いは、宿主細胞は、好ましくは、原核細胞、好ましくは、グラム陰性細菌である。より好ましくは、宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。タンパク質発現のための原核宿主細胞は、当業界で周知である（Ｔｅｒｐｅ，Ｋ．（２００６）「分子及び生化学的基礎から商業システムまでの、異種タンパク質生産のための細菌発現系の概説（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｔｏ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ）」、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７２、２１１～２２２頁）。宿主細胞は、抗体断片などの目的のタンパク質を産生するように遺伝子操作された組換え細胞である。組換え大腸菌宿主細胞は、ＭＣ４１００、ＴＧ１、ＴＧ２、ＤＨＢ４、ＤＨ５α、ＤＨ１、ＢＬ２１、Ｋ１２、ＸＬ１Ｂｌｕｅ及びＪＭ１０９を含む任意の好適な大腸菌株に由来してもよい。一例は、組換えタンパク質発酵のために一般的に使用される宿主株である大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）である。抗体断片を、改変された大腸菌株、例えば、代謝突然変異体又はプロテアーゼ欠損大腸菌株を培養することによって生産することもできる。
【0068】
本発明の方法に従って精製することができる抗体断片は、典型的には、タンパク質の性質、生産規模及び使用される大腸菌株に応じて、大腸菌宿主細胞のペリプラズム又は宿主細胞培養上清中に見出される。タンパク質をこれらの区画に標的化するための方法は、当業界で周知である（Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．（１９９６）「大腸菌中で遺伝子の高レベル発現を達成するための戦略（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ａｃｈｉｅｖｉｎｇ ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ６０、５１２～５３８頁）。大腸菌のペリプラズムにタンパク質を指向させる好適なシグナル配列の例としては、大腸菌ＰｈｏＡ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、ＬａｍＢ及びＯｍｐＦシグナル配列が挙げられる。天然の分泌経路に依拠することによって、又はタンパク質分泌を引き起こすための外膜の限定的漏出の誘導によって、タンパク質を上清に標的化することができ、それらの例は、ｐｅｌＢリーダー、プロテインＡリーダーの使用、培養培地へのグリシンの添加と一緒の、バクテリオシン放出タンパク質、マイトマイシン誘導バクテリオシン放出タンパク質の同時発現及び膜透過化のためのｋｉｌ遺伝子の同時発現である。最も好ましくは、本発明の方法では、抗体は、宿主大腸菌のペリプラズム中で発現される。
【0069】
大腸菌宿主細胞中での抗体の発現はまた、大腸菌中での組換え抗体の発現が誘導性プロモーターの制御下にある、誘導系の制御下にあってもよい。大腸菌中での使用にとって好適な多くの誘導性プロモーターが当業界で周知であり、プロモーターに応じて、組換えタンパク質の発現を、温度又は増殖培地中の特定の物質の濃度などの種々の因子によって誘導することができる。誘導性プロモーターの例としては、ラクトース又は非加水分解性ラクトースアナログ、イソプロピル－ｂ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導可能である大腸菌ｌａｃ、ｔａｃ、及びｔｒｃプロモーター並びにそれぞれ、ホスファート、トリプトファン及びＬ－アラビノースによって誘導されるｐｈｏＡ、ｔｒｐ及びａｒａＢＡＤプロモーターが挙げられる。例えば、誘導剤の添加又は誘導が温度依存性である場合、温度の変化によって、発現を誘導することができる。組換えタンパク質発現の誘導が、培養物への誘導剤の添加によって達成される場合、発酵システム及び誘導剤に応じて、誘導剤を任意の好適な方法によって添加することができる。
【0070】
大腸菌宿主細胞培養物（発酵物）を、大腸菌の増殖及び組換えタンパク質の発現を支援する任意の培地中で培養することができる。培地は、例えば、Ｄｕｒａｎｙ Ｏ、Ｃ．Ｇ．ｄ．Ｍ．Ｃ．Ｌ．－Ｓ．Ｊ．（２００４）「大腸菌における組換えフクロース－１－リン酸アルドラーゼの発現に関する研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｕｃｕｌｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」、Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３９、１６７７～１６８４頁などに記載された任意の化学規定培地であってもよい。
【0071】
大腸菌宿主細胞の培養は、必要とされる生産規模に応じて、振とうフラスコ又は発酵器などの任意の好適な容器中で行うことができる。１，０００リットルを超えて約１００，０００リットルまでの限度容量を有する種々の大規模発酵器が利用可能である。好ましくは、１，０００～５０，０００リットル、より好ましくは、１，０００～２５，０００、２０，０００、１５，０００、１２，０００又は１０，０００リットルの発酵器が使用される。０．５～１，０００リットルの限度容量を有するより小規模の発酵器を使用することもできる。
【0072】
大腸菌の発酵を、任意の好適な系、例えば、タンパク質及び必要とされる収量に応じて、連続様式、バッチ様式又はフェドバッチ様式で実施することができる。バッチ様式は、必要に応じて、栄養素又は誘導剤のショット添加と共に使用することができる。或いは、フェドバッチ培養を使用し、発酵器中に最初から存在する栄養素及び発酵が完了するまで増殖速度を制御するために使用される１つ又は複数の栄養素供給レジメンを使用して持続させることができる最大比増殖速度で誘導前にバッチ様式で培養物を増殖させることができる。フェドバッチ様式を誘導前に使用して、大腸菌宿主細胞の代謝を制御し、より高い細胞密度に到達させることもできる。
【0073】
必要に応じて、宿主細胞を、発酵培地からの収集にかけてもよく、例えば、宿主細胞を、遠心分離、濾過又は濃縮によって試料から収集することができる。
【0074】
一実施形態では、本発明によるプロセスは、遠心分離のステップと、抗体を抽出する前の細胞回収のステップとを含む。
【0075】
抗体断片などの目的のタンパク質が宿主細胞のペリプラズム空間中に見出される大腸菌発酵プロセスのためには、宿主細胞からタンパク質を放出させることが必要である。放出は、機械的若しくは圧力処理、凍結乾燥処理、浸透圧ショック、抽出剤又は熱処理による細胞溶解などの任意の好適な方法によって達成することができる。タンパク質放出のためのそのような抽出方法は、当業界で周知である。
【0076】
さらなる実施形態では、本発明による方法は、細胞培養培地から宿主細胞を回収すること、還元剤の存在下で実施されるタンパク質抽出ステップを使用してタンパク質を収獲すること、タンパク質抽出ステップから得られる抗体含有混合物を回収すること、及び混合物から前記抗体を精製することをさらに含み、前記精製は、本発明の方法に従って実施される少なくとも１つの親和性クロマトグラフィーステップを含む。
【実施例】
【0077】
（例１）
静的結合ＭＯＤＤＥ試験
方法
ＰｒＡ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂、ＧＥを、静的結合様式で使用した（ＣＶ＝１ｍＬ）。４つのイミダゾール溶出緩衝剤（Ｎ１～Ｎ４）を試験するＭＯＤＤＥ ＤｏＥ試験を設計し、第５の緩衝剤を、中心点のために三重に使用した（Ｎ５～Ｎ７）（表１）。樹脂を、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で平衡化させた。モノクローナルＩｇＧ１抗体を、４０ｇ／Ｌ樹脂で樹脂上に装填した。次いで、樹脂を、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で洗浄した。５つの緩衝剤のうちの１つで溶出を実施し、回収を最大化するために４つの連続溶出サイクルを実施した。次いで、溶出した総量を、それぞれの溶出サイクルについて算出した。
静的結合ＭＯＤＤＥ試験
方法
ＰｒＡ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂、ＧＥを、静的結合様式で使用した（ＣＶ＝１ｍＬ）。４つのイミダゾール溶出緩衝剤（Ｎ１～Ｎ４）を試験するＭＯＤＤＥ ＤｏＥ試験を設計し、第５の緩衝剤を、中心点のために三重に使用した（Ｎ５～Ｎ７）（表１）。樹脂を、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で平衡化させた。モノクローナルＩｇＧ１抗体を、４０ｇ／Ｌ樹脂で樹脂上に装填した。次いで、樹脂を、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で洗浄した。５つの緩衝剤のうちの１つで溶出を実施し、回収を最大化するために４つの連続溶出サイクルを実施した。次いで、溶出した総量を、それぞれの溶出サイクルについて算出した。
【表1】
【0078】
結果＆結論
図１は、ＭＯＤＤＥ分析ソフトウェアにおいて表１中のデータから生成された係数プロットである。それぞれのバーは、精査されたパラメーターの１つを表し、パラメーターの値が増大した時に測定因子に何が起こるかを表す。プラスのバーは、より高い値のパラメーターが測定因子の値を増加させることを示すが、マイナスのバーは、より高い値のパラメーターが測定因子を減少させることを示す。
図１は、ＭＯＤＤＥ分析ソフトウェアにおいて表１中のデータから生成された係数プロットである。それぞれのバーは、精査されたパラメーターの１つを表し、パラメーターの値が増大した時に測定因子に何が起こるかを表す。プラスのバーは、より高い値のパラメーターが測定因子の値を増加させることを示すが、マイナスのバーは、より高い値のパラメーターが測定因子を減少させることを示す。
【0079】
図１は、イミダゾールが、サイクル１及び２で回収された量に対する統計的に有意な効果を有することを示す。サイクル３及び４ではないが、イミダゾールが存在しない場合と同じぐらい多くの生成物が溶出し、これらのステップの間に同等の量をもたらした。高いｐＨは、溶出される量及び回収に負に影響するが、イミダゾールの添加はこの効果に対抗することができる。より早いサイクルではより多くのＩｇＧ１が回収されるため、イミダゾールは、そのより速い溶出速度のため、サイクル数、かくして、溶出容量の減少を可能にする。例えば、ｐＨ４．０＋イミダゾールでは、４サイクルについてイミダゾールがない場合と比較して、同じ量を達成するのにわずか３サイクルが必要である。
【0080】
（例２）
ＩｇＧクロマトグラム溶出プロファイル
方法
２つのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＨｉＳｃｒｅｅｎカラム、ＧＥ（９．４ｍＬのＣＶ）を、動的結合様式で使用した。樹脂を、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で平衡化させた。モノクローナル抗体ＩｇＧ１又はＩｇＧ４を、５０ｇ／Ｌ樹脂で樹脂上に装填した。次いで、樹脂を１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で洗浄した後、１００ｍＭリン酸ナトリウム及び５００ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ６．９で塩洗浄した。溶出を、１００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３．６若しくはｐＨ４．０（ＮａＯＨを用いて調整）又は１００ｍＭクエン酸ナトリウム＋３００ｍＭイミダゾールｐＨ３．６若しくはｐＨ４．０（ＨＣｌを用いて調整）のいずれかを用いて実施した。
ＩｇＧクロマトグラム溶出プロファイル
方法
２つのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＨｉＳｃｒｅｅｎカラム、ＧＥ（９．４ｍＬのＣＶ）を、動的結合様式で使用した。樹脂を、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で平衡化させた。モノクローナル抗体ＩｇＧ１又はＩｇＧ４を、５０ｇ／Ｌ樹脂で樹脂上に装填した。次いで、樹脂を１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で洗浄した後、１００ｍＭリン酸ナトリウム及び５００ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ６．９で塩洗浄した。溶出を、１００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３．６若しくはｐＨ４．０（ＮａＯＨを用いて調整）又は１００ｍＭクエン酸ナトリウム＋３００ｍＭイミダゾールｐＨ３．６若しくはｐＨ４．０（ＨＣｌを用いて調整）のいずれかを用いて実施した。
【0081】
結果＆結論
図２及び３は、ＩｇＧ１モノクローナル抗体について得られた結果を示す：クエン酸溶出は、ｐＨ３．６では８３％及びｐＨ４．０では３９％の生成物を回収した。しかしながら、イミダゾールを添加することによって、これらの収率は、それぞれ、９４％及び６５％まで上昇した。さらに、ｐＨ３．６で、溶出容量は、イミダゾールの添加と共に低下する。ｐＨ４．０＋イミダゾールでの溶出容量は、イミダゾールなしの緩衝剤よりも大きいが、これは、より多くの生成物が溶出したためであり、同じ回収率を達成するためのイミダゾールを用いない実行については、それがより遅い溶出速度を有するため、ほぼ無限の溶出容量が必要であると予想される。図４は、ＩｇＧ４についても同等の結果が得られたことを示す。
図２及び３は、ＩｇＧ１モノクローナル抗体について得られた結果を示す：クエン酸溶出は、ｐＨ３．６では８３％及びｐＨ４．０では３９％の生成物を回収した。しかしながら、イミダゾールを添加することによって、これらの収率は、それぞれ、９４％及び６５％まで上昇した。さらに、ｐＨ３．６で、溶出容量は、イミダゾールの添加と共に低下する。ｐＨ４．０＋イミダゾールでの溶出容量は、イミダゾールなしの緩衝剤よりも大きいが、これは、より多くの生成物が溶出したためであり、同じ回収率を達成するためのイミダゾールを用いない実行については、それがより遅い溶出速度を有するため、ほぼ無限の溶出容量が必要であると予想される。図４は、ＩｇＧ４についても同等の結果が得られたことを示す。
【0082】
（例３）
ＶＨ３クロマトグラム溶出プロファイル
方法
２つのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＨｉＳｃｒｅｅｎカラム、ＧＥ（９．４ｍＬのＣＶ）を、動的結合様式で使用した。樹脂を、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で平衡化させた。ＷＯ２０１５／１９７７７２に記載のような、形式Ｆａｂ－２ｘ ｄｓｓｃＦｖの多重特異性三価抗体分子（ＴｒＹｂｅ（登録商標））を、３０ｇ／Ｌ樹脂で樹脂上に装填した。次いで、樹脂を、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で洗浄した。溶出を、１００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ４．０（ＮａＯＨを用いて調整）又は１００ｍＭクエン酸ナトリウム＋３００ｍＭイミダゾールｐＨ４．０（ＨＣｌを用いて調整）のいずれかを用いて実施した。
ＶＨ３クロマトグラム溶出プロファイル
方法
２つのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＨｉＳｃｒｅｅｎカラム、ＧＥ（９．４ｍＬのＣＶ）を、動的結合様式で使用した。樹脂を、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で平衡化させた。ＷＯ２０１５／１９７７７２に記載のような、形式Ｆａｂ－２ｘ ｄｓｓｃＦｖの多重特異性三価抗体分子（ＴｒＹｂｅ（登録商標））を、３０ｇ／Ｌ樹脂で樹脂上に装填した。次いで、樹脂を、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で洗浄した。溶出を、１００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ４．０（ＮａＯＨを用いて調整）又は１００ｍＭクエン酸ナトリウム＋３００ｍＭイミダゾールｐＨ４．０（ＨＣｌを用いて調整）のいずれかを用いて実施した。
【0083】
結果＆結論
図５は、クエン酸溶出が、ｐＨ４．０で３６％の生成物を回収したことを示す。しかしながら、イミダゾールを添加することによって、この収率は、同じ容量の溶出緩衝剤中で４９％まで上昇した。したがって、イミダゾールの添加は、溶出速度を増加させ、より多くの生成物をより速く溶出させ、かくして、同じ回収率を達成するために必要とされる緩衝剤がより少ない。さらに、この実験は、イミダゾールが、Ｆｃ及びＶＨ３結合部位を介して樹脂リガンドへの生成物の再結合を防止することができることを示した。
図５は、クエン酸溶出が、ｐＨ４．０で３６％の生成物を回収したことを示す。しかしながら、イミダゾールを添加することによって、この収率は、同じ容量の溶出緩衝剤中で４９％まで上昇した。したがって、イミダゾールの添加は、溶出速度を増加させ、より多くの生成物をより速く溶出させ、かくして、同じ回収率を達成するために必要とされる緩衝剤がより少ない。さらに、この実験は、イミダゾールが、Ｆｃ及びＶＨ３結合部位を介して樹脂リガンドへの生成物の再結合を防止することができることを示した。
【0084】
（例４）
ＩｇＧ ＭＯＤＤＥ試験
方法
２つのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＨｉＳｃｒｅｅｎカラム、ＧＥ（９．４ｍＬのＣＶ）を、動的結合様式で使用した。樹脂を、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で平衡化させた。モノクローナル抗体ＩｇＧ１を、５０ｇ／Ｌ樹脂で樹脂上に装填した。次いで、樹脂を１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で洗浄した後、１００ｍＭリン酸ナトリウム及び５００ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ６．９で塩洗浄した。様々な異なる０．１Ｍクエン酸溶出緩衝剤を、イミダゾール濃度及びｐＨ値を変化させながら、ＤｏＥにおいて試験した（表２）。さらなるイミダゾール洗浄緩衝剤を試験し、最後の溶出前洗浄液を交換して、カラムにイミダゾールを予め装填することが溶出速度に対するより大きな効果を有するかどうかを精査した。
ＩｇＧ ＭＯＤＤＥ試験
方法
２つのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＨｉＳｃｒｅｅｎカラム、ＧＥ（９．４ｍＬのＣＶ）を、動的結合様式で使用した。樹脂を、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で平衡化させた。モノクローナル抗体ＩｇＧ１を、５０ｇ／Ｌ樹脂で樹脂上に装填した。次いで、樹脂を１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で洗浄した後、１００ｍＭリン酸ナトリウム及び５００ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ６．９で塩洗浄した。様々な異なる０．１Ｍクエン酸溶出緩衝剤を、イミダゾール濃度及びｐＨ値を変化させながら、ＤｏＥにおいて試験した（表２）。さらなるイミダゾール洗浄緩衝剤を試験し、最後の溶出前洗浄液を交換して、カラムにイミダゾールを予め装填することが溶出速度に対するより大きな効果を有するかどうかを精査した。
【表2】
【0085】
結果＆結論
図６は、図１と同じ方法であるが、表２中のデータを使用するＭＯＤＤＥ分析ソフトウェアにおいて生成された係数プロットである。「ＩｍＥ」は、溶出緩衝剤中のイミダゾール濃度であり、「ＩｍＷ」は、洗浄緩衝剤中のイミダゾール濃度である。「＊」は、項（単数又は複数）間の相互作用を示す。
図６は、図１と同じ方法であるが、表２中のデータを使用するＭＯＤＤＥ分析ソフトウェアにおいて生成された係数プロットである。「ＩｍＥ」は、溶出緩衝剤中のイミダゾール濃度であり、「ＩｍＷ」は、洗浄緩衝剤中のイミダゾール濃度である。「＊」は、項（単数又は複数）間の相互作用を示す。
【0086】
図６は、イミダゾールが溶出容量の減少に対する統計的に有意な効果を有し、かくして、溶出液中の生成物濃度を増加させることを決定したため、以前の実験をさらに支持するＭＯＤＤＥ試験の結果を示す。この試験はまた、イミダゾール濃度についての２次の項（ＩｍＥ＊ＩｍＥ）も決定したが、これは、使用するための最適濃度が存在し、この範囲からの逸脱が溶出容量の増加をもたらすであろうことを示す。さらに、溶出前にイミダゾール緩衝剤でカラムを洗浄することにより、溶出容量がさらに減少した。溶出ステップの前に、カラム上にイミダゾールを予め装填することにより、カラムを下方に移動している溶出前部がイミダゾールを含まない環境になることが防止される。かくして、イミダゾールの予備装填は、溶出ステップの全ての態様が樹脂への再結合の防止を可能にし、したがって、溶出速度を増大させる。
【0087】
（例５）
イミダゾールアナログ溶出プロファイル
方法
２つのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＨｉＳｃｒｅｅｎカラム、ＧＥ（９．４ｍＬのＣＶ）を、動的結合様式で使用した。樹脂を、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で平衡化させた。モノクローナル抗体ＩｇＧ１を、３５ｇ／Ｌ樹脂で樹脂上に装填した。次いで、樹脂を、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で洗浄した。溶出を、１００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３．６又は１００ｍＭクエン酸ナトリウム＋２５０ｍＭの１，３ジメチル－１Ｈ－ピラゾールｐＨ３．６のいずれかを用いて実施した。このアナログは、予備アナログ試験において溶出容量を減少させるのに有効であると考えられた。
イミダゾールアナログ溶出プロファイル
方法
２つのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＨｉＳｃｒｅｅｎカラム、ＧＥ（９．４ｍＬのＣＶ）を、動的結合様式で使用した。樹脂を、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で平衡化させた。モノクローナル抗体ＩｇＧ１を、３５ｇ／Ｌ樹脂で樹脂上に装填した。次いで、樹脂を、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で洗浄した。溶出を、１００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３．６又は１００ｍＭクエン酸ナトリウム＋２５０ｍＭの１，３ジメチル－１Ｈ－ピラゾールｐＨ３．６のいずれかを用いて実施した。このアナログは、予備アナログ試験において溶出容量を減少させるのに有効であると考えられた。
【0088】
結果＆結論
図７は、対照のクエン酸による溶出が、２．８５カラム容量で、ｐＨ３．６で生成物の９５％を回収したことを示す。しかしながら、１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾールを添加することにより、溶出容量は１．７６カラム容量に減少し、９４％の同等の回収率であった。したがって、１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾールの添加は、溶出速度を増大させ、生成物をより速く溶出させ、かくして、同様の回収率を達成するのに必要な緩衝剤をより少なくした。
図７は、対照のクエン酸による溶出が、２．８５カラム容量で、ｐＨ３．６で生成物の９５％を回収したことを示す。しかしながら、１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾールを添加することにより、溶出容量は１．７６カラム容量に減少し、９４％の同等の回収率であった。したがって、１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾールの添加は、溶出速度を増大させ、生成物をより速く溶出させ、かくして、同様の回収率を達成するのに必要な緩衝剤をより少なくした。
【配列表フリーテキスト】
【0089】
配列番号１：＜２２３＞抗アルブミン抗体の重鎖可変ドメイン（ｄｓなし）
配列番号２：＜２２３＞抗アルブミン抗体の重鎖可変ドメイン（ｄｓ）
配列番号３：＜２２３＞抗アルブミン抗体の軽鎖可変ドメイン（ｄｓなし）
配列番号４：＜２２３＞抗アルブミン抗体の軽鎖可変ドメイン（ｄｓ）
配列番号５：＜２２３＞アルブミンに特異的な６４５ ｇＨ５ｇＬ４
配列番号６：＜２２３＞アルブミンに特異的な６４５ ｇＨ５ｇＬ４ｄｓ
配列番号７：＜２２３＞ＨＱモチーフ
配列番号８：＜２２３＞ＨＮモチーフ
配列番号９：＜２２３＞ＨＡＴモチーフ
配列番号２：＜２２３＞抗アルブミン抗体の重鎖可変ドメイン（ｄｓ）
配列番号３：＜２２３＞抗アルブミン抗体の軽鎖可変ドメイン（ｄｓなし）
配列番号４：＜２２３＞抗アルブミン抗体の軽鎖可変ドメイン（ｄｓ）
配列番号５：＜２２３＞アルブミンに特異的な６４５ ｇＨ５ｇＬ４
配列番号６：＜２２３＞アルブミンに特異的な６４５ ｇＨ５ｇＬ４ｄｓ
配列番号７：＜２２３＞ＨＱモチーフ
配列番号８：＜２２３＞ＨＮモチーフ
配列番号９：＜２２３＞ＨＡＴモチーフ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】