▶ モハラム ベンチャーズ インコーポレイテッド．の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-05
(45)【発行日】2024-11-13
(54)【発明の名称】生分解性ポリマー組成物及びその製造法
(51)【国際特許分類】
C12P 7/44 20060101AFI20241106BHJP
C08L 101/16 20060101ALI20241106BHJP
C08L 67/04 20060101ALI20241106BHJP
C08L 3/00 20060101ALI20241106BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20241106BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20241106BHJP
C12N 15/60 20060101ALN20241106BHJP
【ＦＩ】
C12P7/44
C08L101/16 ZBP
C08L67/04
C08L3/00
C12N15/53
C12N15/54
C12N15/60
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2021534400
(86)(22)【出願日】2019-08-23
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-12-16
(86)【国際出願番号】 CA2019000120
(87)【国際公開番号】W WO2020037394
(87)【国際公開日】2020-02-27
【審査請求日】2022-08-16
(31)【優先権主張番号】62/722,535
(32)【優先日】2018-08-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】521077163
【氏名又は名称】モハラム ベンチャーズ インコーポレイテッド．
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100135079
【弁理士】
【氏名又は名称】宮崎 修
(72)【発明者】
【氏名】モハラム，タレク
(72)【発明者】
【氏名】ハミード，ファイサル サフル
(72)【発明者】
【氏名】シン，アーシュディープ
(72)【発明者】
【氏名】パテール，パティーク ダクセシュクマール
(72)【発明者】
【氏名】グレイ，デヴォン ブライアン
(72)【発明者】
【氏名】コッハー，ニコル リンジィ
(72)【発明者】
【氏名】ハーティン，マシュー ダグラス チャールズ
(72)【発明者】
【氏名】ゼビアン，ナジュア
【審査官】野村 英雄
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０３５７１８９４（ＣＮ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０２５１４７４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００６／０１０５４３９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００５／０００３４９８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００７－５１２００７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００５－５１４９５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００５－３４８６４０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５２３７８９（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００１／００３１４８９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１６－５１９１８９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５２７５９７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１２－１９３３４５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１４－０７４１２６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１７－０７７１８４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／１１５６１９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１３－５２１８０２（ＪＰ，Ａ）
【文献】ヘンプ・マテリアルシリーズの新発売～グリーンコンポジットの巻～，ふぁーみんぐ通信０３年１１月号，麻の総合利用研究センター，2003年11月，http://www.hemp-revo.net/report/0311.htm
【文献】GANDOLFI, S., et al.，"Hemp hurds biorefining: a path to green L-(+)-lactic acid production."，Bioresource Technology，2015年，Vol.191，pp.59-65
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ｃ０８Ｌ １０１／１６
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アサ属廃棄物を炭素源として用いる、ポリヒドロキシブチレートを含む生分解性ポリマーの製造方法であって、以下の：ａ．アサ属廃棄物の機械的破壊処理工程；
ｂ．前記アサ属廃棄物を無機酸溶液中で少なくとも１２１℃の温度で２５分間加熱してアサ属／酸溶液を生成する工程；
ｃ．前記アサ属／酸溶液を冷却、中和、及び濾過して濾液を生成する工程；
ｄ．前記濾液を無機塩媒体と１：１～１：２の比で混合して調製培地を生成する工程；
ｅ．前記調製培地を、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、ブレビス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｅｎｔｕｓ）、バチルス・スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・サーキュランド（Ｂａｃｉｌｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｄｓ）、バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ミクロラナツス・ホスホボラス（Ｍｉｃｒｏｌａｎａｔｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｒｏｕｓ）、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、ヘアリーベッチ根粒菌ビキアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｃｉａｅ）、ダイズ根粒菌ジャポニカム（Ｂｒｅｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、ブルクホルデリア・サッカリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｃｔｏｒ）、ネプトゥナモナス・アンタークティカ（Ｎｅｐｔｕｎａｍｏｎａｓ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、アゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エアロモナス・キャビアエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、エアロモナス・パンクテート（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｃｔａｔｅ）、アルカリゲネス・レータス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ）、ハロモナス・ボリビエンシス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、及びフィルミクテス門（Ｆｅｒｍｉｃｕｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の天然株及び遺伝子操作された株からなる群から選択される微生物の開始培養物に接種し、かつ、少なくとも３０℃で４８～７２時間培養して培養物を産生する工程；かつ
ｆ．前記培養物から生分解性ポリマーを抽出する工程；
を含む、方法。
【請求項2】
前記培養物から生分解性ポリマーを抽出する工程は、以下の：ａ．孔径約１ｍｍのメンブレンを通して前記培養物を濾過する工程；
ｂ．前記濾過された培養物から前記微生物の細胞を分離する工程；
ｃ．前記細胞をＮａＯＨ溶液中に懸濁させ、かつ、少なくとも３０℃の温度で少なくとも１．５時間インキュベートして、前記細胞から生分解性ポリマーを放出させる工程；
ｄ．前記生分解性ポリマーをＮａＯＨ溶液から分離して、水中に再懸濁する工程；
ｅ．前記生分解性ポリマーを前記水から分離して、エタノール溶液中に再懸濁する工程；かつ、
ｆ．前記生分解性ポリマーを前記エタノール溶液から分離する工程；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記微生物は、ポリヒドロキシブチレートを分解しうるデポリメラーゼをコードする遺伝子を発現しない、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記微生物は、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、アセチルＣｏＡレダクターゼ、及びポリヒドロキシブチレートポリメラーゼをコードする１又はそれ以上の遺伝子を発現する枯草菌の遺伝子操作株である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記１又はそれ以上の遺伝子は、ｐｈａＡ、ｐｈａＢ、ｐｈａＣ、ｐｈａＪ、ｐｈａＰからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記微生物は、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、アセチルＣｏＡレダクターゼ、及びポリヒドロキシブチレートポリメラーゼをコードする１又はそれ以上の遺伝子を発現するカプリアビダス・ネカトールの遺伝子操作株である、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
前記１又はそれ以上の遺伝子は、ｐｈａＡ、ｐｈａＢ、ｐｈａＣ、ｐｈａＪ、ｐｈａＰからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
請求項１に記載の方法により作製されたポリヒドロキシブチレートを含む生分解性ポリマーの製造用炭素源としてのアサ属廃棄物の使用。
【請求項9】
前記アサ属廃棄物は、アサ属植物の、根、トリミング、葉、柄（ｓｔａｌｋｓ）及び茎（ｓｔｅｍｓ）の１又はそれ以上からなる、請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［０００１］本発明は、生分解性ポリマー、特に、生分解性ポリマー組成物及び炭素源としてアサ属廃棄物を用いて生分解性ポリマーを製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
［０００２］プラスチックは軽く、耐久性があり、汎用性のある素材であり、建設から医療、消費財から包装材まで、多くの産業に欠かせない要素である。プラスチック材料の生産の多くは、再生不能な資源に依存しており、経済的、環境的、長期的に持続不能である。また、当該問題は、多くの種類のプラスチックが環境破壊をもたらす時間により悪化している。一般に、プラスチックストロー等の消費財に用いられるプラスチックは、環境中で分解されるのに約２００年かかる。漁場で用いられるような耐久性の高いプラスチックは、破損に６００年もかかる場合がある。
【0003】
［０００３］その結果、プラスチック廃棄物の環境への負荷は高まり、ストローを含むプラスチックの単回使用品目の禁止等、プラスチック廃棄物の削減に向けた取り組みが急務となっている。プラスチックの再利用プログラムの増加等の他の取組みは、コストの問題や、ほとんどのプラスチックは、物理的特性がそれ以上の使用に適さなくなる前に、限られた回数しか再利用できず、制限されている。プラスチック廃棄物の環境への蓄積の問題に取り組む、もう一つの選択肢は、環境中でより速く分解するプラスチックの製造である。
【0004】
［０００４］生分解性プラスチックは、微生物によって水、二酸化炭素、メタン等の単分子に分解され、バイオマスになる時間が、一般的なプラスチックに必要な時間よりもはるかに短い。多くの生分解性プラスチックは、再生不能な石油化学的資源でなく、再生可能な資源から生産されうる。しかしながら、生分解性プラスチックは、脆弱であるか、熱安定性が低い等、多くの望ましくない特性が知られている。他の既知の生分解性プラスチックは、製造コストが法外に高く、そのため、広範な適用が阻害される。
【0005】
［０００５］従って、機械的特性が改良された新規な生分解性プラスチックの要望がある。さらに、生産コストを下げるための、再生可能な原料から生分解性プラスチックを製造する新規な方法の要望がある。
【0006】
［０００６］アサ属（Cannabis）廃棄物とその処分は、様々な法域でアサ属の嗜好使用が合法化され始めていることから、当業界の重要な課題となると予測される。消費者用にアサ属を１キログラム生産する場合、８キログラムの廃棄物が生じる。アサ属廃棄物の現行の処分方法は、アサ属廃棄物を化学薬品やその他の廃棄材料と混合することを含め、厳格に規制されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
［０００７］従って、この新産業における生成量が増加するアサ属廃棄物の有用な用途を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
［０００８］ 本発明による生分解性ポリマー組成物は、ポリヒドロキシブチレートかつ、熱可塑性デンプン、ジヘキシルスルホコハク酸ナトリウム及び無水マレイン酸からなる群から選択される１又はそれ以上の相容化剤、並びに微結晶性セルロース及びセルロースからなる群から選択される１又はそれ以上の添加剤とブレンドされた、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を含む。
【0009】
［０００９］他の実施形態では、当該生分解性ポリマー組成物は、５質量％～７０質量％のポリヒドロキシブチレート、５質量％～７０質量％のポリ（３-ヒドロキシブチレート-コ-３-ヒドロキシヘキサノエート）、５質量％～４５質量％の熱可塑性デンプン、０．５質量％～３５質量％の１又はそれ以上の相容化剤、及び０．５質量％～１５質量％の１又はそれ以上の添加剤を含む。
【0010】
［００１０］他の実施形態では、当該生分解性ポリマー組成物は、１０質量％～３０質量％のポリヒドロキシブチレート、２０質量％～６０質量％のポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシヘキサノエート）、１０質量％～３０質量％の熱可塑性デンプン、１０質量％～２０質量％の１又はそれ以上の相容化剤、及び１質量％～１０質量％の１又はそれ以上の添加剤を含む。
【0011】
［００１１］他の実施形態では、当該生分解性ポリマー組成物は、２０質量％のポリヒドロキシブチレート、４０質量％のポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシヘキサノエート）、２０質量％の熱可塑性デンプン、１又はそれ以上の相容化剤の１５質量％、及び１又はそれ以上の添加剤の５質量％を含む。
【0012】
［００１２］本発明の他の態様では、アサ属廃棄物を炭素源として用いる生分解性ポリマーの製造方法であって、以下の：ａ）アサ属廃棄物の機械的破壊処理工程；ｂ）前記アサ属廃棄物を無機酸溶液中で少なくとも１２１℃の温度で２５分間加熱してアサ属／酸溶液を生成する工程；ｃ）前記アサ属／酸溶液を冷却、中和、及び濾過して濾液を生成する工程；ｄ）前記濾液を無機塩媒体と１：１～１：２の比で混合して調製培地を生成する工程；ｅ）前記調製培地を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（カプリアビダス・ネカトール）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｄｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｍｉｃｒｏｌａｎａｔｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｒｏｕｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｃｉａｅ、Ｂｒｅｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｃｔｏｒ、Ｎｅｐｔｕｎａｍｏｎａｓ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｃｔａｔｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、及びＦｅｒｍｉｃｕｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍの天然株及び遺伝子操作された株からなる群から選択される微生物の開始培養物に接種し、かつ、少なくとも３０℃で４８～７２時間培養して培養物を産生する工程；かつｆ）前記培養物から生分解性ポリマーを抽出する工程；を含む。
【0013】
［００１３］他の実施形態では、前記生分解性ポリマーを培養物から抽出する工程は、以下の：ａ）孔径約１ｍｍのメンブレンを通して培養物を濾過する工程；ｂ）前記濾過された培養物から前記微生物の細胞を分離する工程；ｃ）前記細胞をＮａＯＨ溶液中に懸濁させ、かつ、少なくとも３０℃の温度で少なくとも１．５時間インキュベートして、前記細胞から生分解性ポリマーを放出させる工程；ｄ）前記生分解性ポリマーをＮａＯＨ溶液から分離して、水中に再懸濁する工程；ｅ）前記生分解性ポリマーを前記水から分離して、エタノール溶液中に再懸濁する工程；かつ、ｆ）前記生分解性ポリマーを前記エタノール溶液から分離する工程；を含む。
【0014】
［００１４］本発明の他の態様では、生分解性ポリマーの産生に用いられるアサ属廃棄物から調製培地を製造する方法であって、以下の：ａ）アサ属廃棄物の機械的破壊処理工程；ｂ）前記アサ属廃棄物を無機酸溶液中で少なくとも１２１℃の温度で２５分間加熱してアサ属／酸溶液を生成する工程；ｃ）前記アサ属／酸溶液を冷却、中和、及び濾過して濾液を生成する工程；かつ、ｄ）前記濾液を無機塩媒体と１：１～１：２の比で混合して調製培地を生成する工程；を含む。
【0015】
［００１５］他の実施形態では、本方法は、さらに、処理済みアサ属廃棄物を水中で撹拌し、当該アサ属廃棄物を分解する工程を含む。得られた混合物をろ過し、その後、当該ろ液を水酸化ナトリウム及び過酸化水素中で加熱及び攪拌する。得られたスラリーをろ過し、ｐＨを中和し、乾燥バイオマスを生成させ、当該アサ属廃棄物を鉱酸溶液中で加熱する工程の前に行う。
【0016】
［００１６］他の実施形態では、アサ属／酸溶液を冷却、中和、及び濾過する工程は、冷脱イオン水を添加して反応を停止させる工程を含む。得られた混合物を遠心分離し、中性ｐＨに達するまで脱イオン水で沈殿を洗浄する。０．５Ｍ、７０℃、６７％塩化亜鉛中で酸加水分解によりセルロースを加水分解し、最終生成物を滅菌リン酸緩衝生理食塩水で希釈する。
【0017】
［００１７］本発明の他の態様では、生分解性ポリマーの製造方法であって、以下の：ａ）処理された植物性廃棄物を炭素源として含む窒素制限調製培地に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（カプリアビダス・ネカトール）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｄｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｍｉｃｒｏｌａｎａｔｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｒｏｕｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｃｉａｅ、Ｂｒｅｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｃｔｏｒ、Ｎｅｐｔｕｎａｍｏｎａｓ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｃｔａｔｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、及びＦｅｒｍｉｃｕｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍの天然株及び遺伝子操作された株からなる群から選択される微生物の開始培養物に接種し、かつ、少なくとも３０℃で４８～７２時間培養して培養物を産生する工程；ｂ）孔径約１ｍｍのメンブレンを通して培養物を濾過する工程；ｃ）前記濾過された培養物から前記微生物の細胞を分離する工程；ｄ）前記細胞をＮａＯＨ溶液中に懸濁させ、少なくとも３０℃の温度で少なくとも１．５時間インキュベートして、前記細胞から生分解性ポリマーを放出させる工程；ｅ）前記生分解性ポリマーをＮａＯＨ溶液から分離して、水中に再懸濁する工程；ｆ）前記生分解性ポリマーを前記水から分離して、エタノール溶液中に再懸濁する工程；ｇ）前記生分解性ポリマーを前記エタノール溶液から分離する工程；を含む。
【0018】
［００１８］他の実施形態では、本方法は、アサ属廃棄物から製造された調製培地を用いてＰＨＢを製造し、ストックから栄養培地中でＰＨＢを製造しうる、１又はそれ以上の微生物を増殖させる工程を含む。当該調製培地に１又はそれ以上の微生物を接種する工程。当該調製培地に制限された窒素源を補充し、１又はそれ以上の微生物を調製培地中で増殖させる工程。当該調製培地を遠心分離して、１又はそれ以上の微生物の細胞を当該調製培地から分離し、細胞を乾燥させる工程。乾燥細胞を再度蒸留水に懸濁し、水酸化ナトリウムを加えて当該細胞からＰＨＢを抽出する工程。ｐＨを７．０に調整し、得られた混合物を遠心分離してＰＨＢ顆粒を懸濁液から分離し、反応を停止させる工程。必要に応じて、蒸留水で顆粒をすすぎ、得られた混合物を再度遠心分離する工程。鉱酸を加えて顆粒を分離し、混合物を遠心分離する工程。液相を捨て、アルカリ浴で製品を洗浄して、ＰＨＢを精製する工程。必要に応じて、ＰＨＢを水ですすぎ遠心する工程。
【発明を実施するための形態】
【0019】
［００１９］本発明は、生分解性ポリマー組成物及びその製造方法に関する。当該生分解性ポリマー組成物は、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）並びに、熱可塑性デンプン（ＴＰＳ）、１又はそれ以上の相容化剤、及び１又はそれ以上の添加剤とブレンドされた、ポリ（３-ヒドロキシブチレート-コ-３-ヒドロキシヘキサノエート）（ＰＨＢＨｘ）を含む。
【0020】
［００２０］本願明細書に記載される生分解性ポリマー組成物で用いられるＰＨＢ及びＰＨＢＨｘのいずれか又はいずれも、好ましくは、ＰＨＢ及び／又はＰＨＢＨｘを生成するように天然存在するか又は遺伝子操作された微生物により、産生される。当該ＰＨＢＨｘは、ＰＨＢ及びＨＨｘモノマーのランダム又は非ランダム共ポリマーでありうる。好ましくは、生合成されたＰＨＢＨｘ共ポリマーの３ヒドロキシヘキサン酸単位は、半結晶性ＰＨＢＨｘの非晶質相に留まる。
【0021】
［００２１］ＰＨＢ及び／又はＰＨＢＨＨｘを含む、生分解性ポリマーの産生に適する微生物としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（カプリアビダス・ネカトール）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｄｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｍｉｃｒｏｌａｎａｔｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｒｏｕｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｃｉａｅ、Ｂｒｅｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｃｔｏｒ、Ｎｅｐｔｕｎａｍｏｎａｓ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｃｔａｔｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、及びＦｅｒｍｉｃｕｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍがあげられる。好ましくは、枯草菌、カプリアビダス・ネカトール、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、又はＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓの遺伝子操作された菌株は、本明細書中に記載される、生分解性ポリマー組成物用のＰＨＢ及びＰＨＢＨｘの産生に用いられる。枯草菌は、グラム陽性細菌であり、したがって、グラム陰性細菌に存在する毒性リピドＡを含まず、好ましい。リピドＡによる生分解性ポリマーの汚染は、食品包装、医療機器又は包装、衛生的包装、及び幼児用製品等の特定の用途では望ましくない。
【0022】
［００２２］本願明細書に記載される方法で用いられる遺伝子組換え微生物は、１又はそれ以上の生分解性ポリマーの生産に必要な、導入遺伝子を含む遺伝子を発現するように遺伝子改変される。好ましくは、製造される生分解性ポリマーはＰＨＢである。適当な遺伝子としては、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、アセチルＣｏＡレダクターゼ、及びＰＨＢポリメラーゼをコードするｐｈａＡ、ｐｈａＢ、ｐｈａＣ、ｐｈａＪ、及びｐｈａＰ遺伝子の１又はそれ以上があげられる。多くの微生物は、当該遺伝子の１又はそれ以上を自然に発現する。ある微生物はまた、ＰＨＢを含む１又はそれ以上の生分解性ポリマーを分解する１又はそれ以上のデポリメラーゼをコードする遺伝子を発現しうる。好ましくは、本願明細書に記載される方法で用いられる遺伝子操作された微生物は、ＰＨＢの産生に必要な遺伝子を発現し、選択された微生物によって産生されるＰＨＢ又は他のいかなる所望の生分解性ポリマーを分解しうるデポリメラーゼをコードする遺伝子を発現しない。
【0023】
［００２３］例えば、本明細書に記載された方法の１つにより、ひとたび合成及び抽出されると、ＰＨＢは、ＰＨＢＨｘ、熱可塑性デンプン、１又はそれ以上の相容化剤、及び１又はそれ以上の添加剤とブレンドされる。本発明の生分解性プラスチック組成物に用いられる熱可塑性デンプンは、好ましくは低濃度のアスコルビン酸及びクエン酸、可塑剤としての３０％グリセロール、及びデンプンに対して約２０質量％の水を有する可塑化天然ポリマーである。当該熱可塑性デンプンは、生分解性ポリマー組成物の４５質量％までの量で存在しうる。
【0024】
［００２４］熱可塑性デンプンは、天然デンプンを可塑剤と混合し、約３０℃～約２００℃の高温で、二軸スクリュー押出機中で可塑剤を調製する等、可塑化された天然ポリマーを調製するいかなる適当な方法でも調製しうる。好ましくは、水とグリセロールの混合物が可塑剤として用いられる。熱可塑性デンプンの可塑化は、熱可塑性デンプンを生分解性ポリマー組成物中に混合する前に、又は全ての成分（すなわち、デンプン、グリセロール、水、生分解性ポリマー組成物の他の成分）を一度に添加して最終ブレンドを生成することによって達成しうる。
【0025】
［００２５］相容化剤としては、コハク酸ジヘキシル、スルホコハク酸ジヘキシルナトリウム、無水マレイン酸、メチレンジフェニルイソシアネート及びフマル酸ジオクチル又は他の極性モノマーグラフト化ポリオレフィンの１又はそれ以上があげられうる。好ましくは、スルホコハク酸ジヘキシルナトリウム及び無水マレイン酸がともに０．５～３５質量％の量で存在する。
【0026】
［００２６］添加剤としては、１又はそれ以上の微結晶性セルロース又はセルロースがあげられうる。好ましくは、微結晶性セルロース及びセルロースがともに０．５～３５質量％の量で存在する。
【0027】
［００２７］生分解性ポリマー組成物の分解に必要な時間は、組成物中の熱可塑性デンプン、微結晶性セルロース、及び／又はセルロースの量を操作して選択的に増加又は減少させうる。熱可塑性デンプン、微結晶性セルロース、及び／又はセルロースの相対量が高まるにつれて、組成物の分解に必要な時間は低下する。好ましくは、熱可塑性デンプンの相対量は、微結晶性セルロース又はセルロースの相対量でなく、組成物の分解時間を選択的に増加又は減少させるために調整される。さらに、生分解性ポリマー組成物の分解に必要な時間は、組成物中のＰＨＢＨｘ量を操作して選択的に増加又は減少させうる。ＰＨＢＨｘの相対量が高まるにつれて、組成物の分解に必要な時間が高まる。
【0028】
［００２８］生分解性ポリマーの産生に用いられる炭素源としては、アサ属廃棄物、葉、魚固形廃棄物、メープル液、カボチャ種子、ブドウ搾り場又はブドウマルク、又はワイン製造／醸造／蒸留の廃棄物があげられる。好ましくは、アサ属廃棄物材料は、ＰＨＢ製造の炭素源として用いられる。アサ属廃棄物は、植物の根、トリミング、葉及び茎からなり、本質的には、Cannabis sativa L. plantの花芽を除くすべての部分である。
【0029】
［００２９］ アサ属廃棄物は特に微生物によるＰＨＢの生産における炭素源としての使用に適する。なぜなら、アサ属植物はバイオマス含量が高く、適度な水と肥料しか必要でなく、ほとんどの気候で急速に生育するからである。アサ属廃棄物には、農業バイオマス、森林バイオマス、石炭、石油残渣、骨等の他の潜在的な炭素源と比較して、独特の階層的な孔構造と連結したマクロ孔がある。その結果、アサ属廃棄物には、その多孔性、吸着容量、及び表面反応性の程度を含む、炭素源として用いるのに望ましい特性がある。他の潜在的な炭素源と比較して、アサ属廃棄物は炭素濃度が高く、窒素、カリウム、リンの含有量が低く、これは微生物によるＰＨＢの生産に適する。
【0030】
［００３０］アサ属廃棄物は、機械的破壊によるＰＨＢの製造に用いるため、以下の方法により最初に処理される。未加工のアサ属廃棄物は、細断、粉砕、プレス、又は他の適当な機械的破壊手段により処理されて、セルロース及び脂肪酸の除去に利用可能な表面積を高めうる。その後、加工されたアサ属廃棄物から脂肪酸を分離し、ＰＨＢ合成用の炭素源を提供する。
【実施例1】
【0031】
［００３１］
〔調製培地１〕
処理されたアサ属廃棄物は、酸性溶液１００ｍＬ当たり１０ｇの割合で１％硫酸溶液に混合される。溶液を、好ましくはオートクレーブ中で、１２１℃で２５分間加熱した後、室温に冷却する。その後、溶液を２Ｍ ＮａＯＨ溶液で中和し、ふるいを通して濾過し、植物性廃棄物のより大きな粒子を除去する。その後、溶液を１５００ｇで２０分間遠心分離し、上清を孔径約１ｍｍのメンブレンを通して濾過する。得られた濾液、すなわちアサ属廃棄物加水分解物は、直ちに用いるか、又は必要になるまで４℃で保存しうる。
〔調製培地１〕
処理されたアサ属廃棄物は、酸性溶液１００ｍＬ当たり１０ｇの割合で１％硫酸溶液に混合される。溶液を、好ましくはオートクレーブ中で、１２１℃で２５分間加熱した後、室温に冷却する。その後、溶液を２Ｍ ＮａＯＨ溶液で中和し、ふるいを通して濾過し、植物性廃棄物のより大きな粒子を除去する。その後、溶液を１５００ｇで２０分間遠心分離し、上清を孔径約１ｍｍのメンブレンを通して濾過する。得られた濾液、すなわちアサ属廃棄物加水分解物は、直ちに用いるか、又は必要になるまで４℃で保存しうる。
【0032】
［００３２］調製培地１は、濾液を２Ｘ無機塩培地（０．９ｇの（ＮＨ４）２Ｓ０４、０．３ｇのＫＨ２Ｐ０４、１．３２ｇのＮａ２ＨＰ０４、０．０６ｇのＭｇＳ０４・７Ｈ２０、３００ｕＬの微量元素溶液（０．１Ｍ ＨＣ１ １００ｍＬ中、０．９７ｇのＦｅＣｌ３、０．７８ｇのＣａＣｌ２、０．０１５６ｇのＣｕＳ０４・５Ｈ２０、０．３２６ｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２０））と、１：１の比で混合することによって調製される。培地を直ちに１２１℃で１０分間高圧蒸気滅菌する。
【実施例2】
【0033】
［００３３］
〔抽出１〕
生分解性ポリマーの合成及び抽出は、以下の方法により行ってよい。３０℃、毎分１５０回転で７２時間振盪したストックから、適当な微生物を栄養培地中で増殖させ、開始培養物を作製する。７２時間後、開始培養物を調製培地１に１／１０（ｖ／ｖ）で接種し、１５０ｒｐｍで７２時間、３０℃で振盪して培養物を作製する。
〔抽出１〕
生分解性ポリマーの合成及び抽出は、以下の方法により行ってよい。３０℃、毎分１５０回転で７２時間振盪したストックから、適当な微生物を栄養培地中で増殖させ、開始培養物を作製する。７２時間後、開始培養物を調製培地１に１／１０（ｖ／ｖ）で接種し、１５０ｒｐｍで７２時間、３０℃で振盪して培養物を作製する。
【0034】
［００３４］その後、培養物を、孔径が約１ｍｍの膜を通して濾過し、不溶性の植物性物質を除去する。その後、微生物細胞を、１５００ｇで２０分間遠心分離することにより、濾過された培養物から分離する。上清を除去した後、無機塩培地中に細胞を再懸濁し、遠心を繰り返し、再び上清を除去することにより、細胞を洗浄する。
【0035】
［００３５］その後、細胞を１５０ｍＬの０．２Ｍ ＮａＯＨ溶液に再懸濁し、溶液を激しくボルテックスしてホモジナイズした後、３０℃で１．５時間インキュベートした。これにより、細胞は溶解し、生分解性プラスチックをＮａＯＨ溶液中に放出する。その後、生分解性ポリマーを、１５００ｇで２０分間遠心分離し、上清を除去することにより、ＮａＯＨ溶液から分離する。
【0036】
［００３６］生分解性ポリマーを１５０ｍＬのミリＱ水中に再懸濁した後、１５００ｇで２０分間遠心分離して、水から分離する。上清を除去して不純物を除去する。その後、生分解性ポリマーを１５０ｍＬの１％エタノール溶液中に再懸濁し、１５００ｇで２０分間遠心分離することによりエタノール溶液から分離する。上清を再度廃棄し、さらに不純物を除去する。
【実施例3】
【0037】
［００３７］
〔調製培地２〕
工場廃棄物５ｇに脱イオン水３００ｍＬを加え、室温で音波処理する。ＷｈａｔｍａｎＮｏ．１ろ紙でろ過し、水酸化ナトリウム（５％、ｗ／ｖ）と過酸化水素（１．１％、ｖ／ｖ）の溶液１００ｍＬを用いて５５℃で９０分間激しく撹拌する。スラリーをろ過し、ｐＨを中和し、５０℃で乾燥させる。乾燥したバイオマス５ｇを、６Ｍ硫酸１００ｍＬに加えて、３０分間激しく攪拌し、５００ｍＬの冷脱イオン水を加えて反応を停止させる。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、中性ｐＨに達するまで脱イオン水で洗浄する。６７％の塩化亜鉛と０．５Ｍ及び７０℃での酸加水分解により、セルロースから単モノマーを獲得し、これは理想的には可溶性糖の収率は＞８０％となる。その後、最終グルコース生成物を１Ｌの滅菌リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ ７．０中で希釈し、それにより、調製培地２（最終濃度：８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ ＫＣ１、１．４４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰ０４、０．２４ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰ０４）を製造する。
〔調製培地２〕
工場廃棄物５ｇに脱イオン水３００ｍＬを加え、室温で音波処理する。ＷｈａｔｍａｎＮｏ．１ろ紙でろ過し、水酸化ナトリウム（５％、ｗ／ｖ）と過酸化水素（１．１％、ｖ／ｖ）の溶液１００ｍＬを用いて５５℃で９０分間激しく撹拌する。スラリーをろ過し、ｐＨを中和し、５０℃で乾燥させる。乾燥したバイオマス５ｇを、６Ｍ硫酸１００ｍＬに加えて、３０分間激しく攪拌し、５００ｍＬの冷脱イオン水を加えて反応を停止させる。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、中性ｐＨに達するまで脱イオン水で洗浄する。６７％の塩化亜鉛と０．５Ｍ及び７０℃での酸加水分解により、セルロースから単モノマーを獲得し、これは理想的には可溶性糖の収率は＞８０％となる。その後、最終グルコース生成物を１Ｌの滅菌リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ ７．０中で希釈し、それにより、調製培地２（最終濃度：８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ ＫＣ１、１．４４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰ０４、０．２４ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰ０４）を製造する。
【実施例4】
【0038】
［００３８］
〔抽出２〕
本発明の生分解性ポリマー組成物に用いるＰＨＢの合成及び抽出は、以下の方法により行ってよい。適当なバシラス種を、１２０ｒｐｍで３７℃で振盪しながら、一晩、ストックから栄養培地中で増殖させる。１．５×１０８細胞／ｍＬの密度を、Ｃｏｍ Ｓｔｅｅｐ Ｌｉｑｕｏｒ（ＣＳＬ）又はアンモニウム塩等の限定窒素源が補足された調製培地２に、０．０５％ ＮＨ４Ｃ１に相当する濃度で１／１０ ｖ／ｖで添加し、１２０ｒｐｍで７２時間振盪しながら３７℃で増殖させうる。その後、細胞を６５００ｇで１０分間遠心分離し、５０℃で乾燥させる。
〔抽出２〕
本発明の生分解性ポリマー組成物に用いるＰＨＢの合成及び抽出は、以下の方法により行ってよい。適当なバシラス種を、１２０ｒｐｍで３７℃で振盪しながら、一晩、ストックから栄養培地中で増殖させる。１．５×１０８細胞／ｍＬの密度を、Ｃｏｍ Ｓｔｅｅｐ Ｌｉｑｕｏｒ（ＣＳＬ）又はアンモニウム塩等の限定窒素源が補足された調製培地２に、０．０５％ ＮＨ４Ｃ１に相当する濃度で１／１０ ｖ／ｖで添加し、１２０ｒｐｍで７２時間振盪しながら３７℃で増殖させうる。その後、細胞を６５００ｇで１０分間遠心分離し、５０℃で乾燥させる。
【0039】
［００３９］乾細胞量を測定し、水酸化ナトリウム抽出、選択的溶解によりＰＨＢを抽出しうる。細胞を蒸留水に再懸濁し、ＮａＯＨ（０．２Ｎ ＮａＯＨ、３０℃、１～５時間）を添加して水酸化ナトリウム抽出を行う。ＨＣ１でｐＨを７．０に調整し、反応を停止させる。２５００ｇで２０分間遠心分離する。ＰＨＢ顆粒を蒸留水で穏やかにすすぎ、再度遠心分離し、風乾する。
【0040】
［００４０］選択的溶解は、混合物に硫酸等の鉱酸を加えて達成され、その結果、顆粒が固相中で分離し、一方、望ましくない物質が液相中で分離される。これらの相は、５０００ｇでの遠心分離によってさらに分離しうる。不要な上清（液相）は、処理中に固相の進行中に廃棄される。無機酸は混合物からＰＨＢをうまく単離するが、純度は使用前に改善されるのが好ましい。これは、生成物をＮａＯＨ（ｐＨ １０）等のアルカリ性の浴中で洗浄することにより達成される。洗浄後、得られる収率と純度は高い（＞９７％）。製品の脱色には、市販の漂白剤を用いることができる。最終的な遠心分離及び水ですすぎの後、ＰＨＢ生成物を用いる準備が整う。
【0041】
［００４１］ＰＨＢの産生を測定するため、ペレットを遠心分離し、アルコールで洗浄する。ペレットをクロロホルムに溶解し、予め秤量した清潔な血清チューブに移す。クロロホルムを蒸発させ、チューブの質量を測定し、ＰＨＢ量を算出する。本方法は、７～９ｇ／Ｌの細胞塊から収率で２～５ｇ／ＬのＰＨＢを生成しうる。この増殖方法は、培養培地の容量が少なく、時間も短いため、バシラス種を用いたＰＨＢの大量産生にも適用できる。あるいは、かわりに、同様に遺伝子操作したカプリアビダス・ネカトール株を用いうる。
【実施例5】
【0042】
［００４２］
〔抽出３〕
他の実施形態では、以下の方法でＰＨＢを合成及び抽出しうる。次の方法に従い、微生物としてのカプリアビダス・ネカトールと炭素源としてのアサ属廃棄物を用いて、ＰＨＢを産生しうる。カプリアビダス・ネカトールはＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓＨ１６（カプリアビダス・ネカトールは、以前、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓとして知られていた）という。Ａ．ｅｕｔｈｒｏｐｈｕｓＨ１６を、１％（ｖ／ｖ）アサ属油及び０．０５％（ｗ／ｖ）ＮＨ４Ｃｌを含む窒素制限無機塩培地中で３０℃７２時間培養する。カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を添加して、Ａ．ｅｕｔｈｒｏｐｈｕｓＨ１６に挿入された広宿主域プラスミドを維持する。増殖後、細胞を回収し、蒸留水で２回洗浄し、凍結乾燥する。ＰＨＢはソックスレー装置中の熱クロロホルムを用いて抽出され、メタノール再沈殿によって精製される。
［００４３］ＰＨＢは、１時間当たりの麻油１ｇ当たりのＰＨＢ約０．０１２８ｇの速度で抽出３の方法により製造しうる。
〔抽出３〕
他の実施形態では、以下の方法でＰＨＢを合成及び抽出しうる。次の方法に従い、微生物としてのカプリアビダス・ネカトールと炭素源としてのアサ属廃棄物を用いて、ＰＨＢを産生しうる。カプリアビダス・ネカトールはＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓＨ１６（カプリアビダス・ネカトールは、以前、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓとして知られていた）という。Ａ．ｅｕｔｈｒｏｐｈｕｓＨ１６を、１％（ｖ／ｖ）アサ属油及び０．０５％（ｗ／ｖ）ＮＨ４Ｃｌを含む窒素制限無機塩培地中で３０℃７２時間培養する。カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を添加して、Ａ．ｅｕｔｈｒｏｐｈｕｓＨ１６に挿入された広宿主域プラスミドを維持する。増殖後、細胞を回収し、蒸留水で２回洗浄し、凍結乾燥する。ＰＨＢはソックスレー装置中の熱クロロホルムを用いて抽出され、メタノール再沈殿によって精製される。
［００４３］ＰＨＢは、１時間当たりの麻油１ｇ当たりのＰＨＢ約０．０１２８ｇの速度で抽出３の方法により製造しうる。
【実施例6】
【0043】
［００４４］
〔抽出４〕
他の実施形態では、カプリアビダス・ネカトールを微生物、アサ属廃棄物を炭素源として用いて、以下の方法により、ＰＨＢを合成及び抽出しうる。場合によっては、界面活性剤アラビアゴムを反応媒体に添加して、アサ属油と相互作用／利用するカプリアビダス・ネカトールの能力を高めうる。なぜなら、アサ属油は毒性がなく、カプリアビダス・ネカトールの増殖を阻害しないからである。カプリアビダス・ネカトールは、２％フルクトース及び０．１％ ＮＨ４Ｃｌ（１６ｇ／Ｌ）、ＮａＨ２Ｐ０４（４ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＨＰ０（４．６ｇ／Ｌ）、Ｋ２Ｓ０４（０．４５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳ０４（０．３９ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２（６２ｍｇ／Ｌ）、及び１ｍｌ／Ｌの微量元素溶液（１５ｇ／Ｌ ＦｅＳ０４・７Ｈ２０、２．４ｇ／Ｌ ＭｎＳ０４・Ｈ２０、２．４ｇ／Ｌ ＺｎＳ０４・７Ｈ２０、及び０．１Ｍ塩酸に溶解した０．４８ｇ／Ｌ ＣｕＳ０４・５Ｈ２０）を含む最小培地中で増殖させうる。最小培地由来の細胞を用いて、各発酵槽に接種し、ＯＤ６００が０．１に達するようにする。各反応容器は、４００ｍＬの乳化アサ属油培地を含有する。０．１％のＮＨ４Ｃｌを含む最小培地では、約２％のアサ属油を用いる。培地調製には、水に混和したアラビアゴムの１０倍溶液を用いて、急速攪拌する。１０，５００ｇで遠心分離し、不溶性粒子を分離する。水、アラビアゴム透明液、アサ属油をリン酸ナトリウム（４．０ｇ／Ｌ）及びＫ２Ｓ０４（０．４５ｇ／Ｌ）と混合する。均質化又は超音波処理により混合物を乳化する。乳化前に添加される水の量は、エマルジョン製造に用いられる特定の装置に依存する。乳化後、高圧蒸気滅菌し、冷却後、ＭｇＳ０４（０．３９ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２（６２ｍｇ／Ｌ）、微量元素（１５ｇ／Ｌ ＦｅＳ０４・７Ｈ２０、２．４ｇ／Ｌ ＭｎＳ０４・Ｈ２０、２．４ｇ／Ｌ ＺｎＳ０４・７Ｈ２０、及び０．１Ｍ塩酸に溶解した０．４８ｇ／Ｌ ＣｕＳ０４・５Ｈ２０）、及びゲンタマイシン（１０ｐｇ／ｍＬ）を添加する。各反応容器をｐＨ６．８（２Ｍ ＮａＯＨで制御）で３０℃に維持し、溶存酸素濃度４０％で５００～９００ｒｐｍの速度で７２時間撹拌する。好ましくは、ＰＨＢ生産を増加させるため、過剰炭素を維持するために、供給バッチ培養技術が用いられる。
［００４５］ ＰＨＢは、アサ属油１ｇ当たりＰＨＢを約０．２４１５ｇの速度で抽出４の方法により製造しうる。
〔抽出４〕
他の実施形態では、カプリアビダス・ネカトールを微生物、アサ属廃棄物を炭素源として用いて、以下の方法により、ＰＨＢを合成及び抽出しうる。場合によっては、界面活性剤アラビアゴムを反応媒体に添加して、アサ属油と相互作用／利用するカプリアビダス・ネカトールの能力を高めうる。なぜなら、アサ属油は毒性がなく、カプリアビダス・ネカトールの増殖を阻害しないからである。カプリアビダス・ネカトールは、２％フルクトース及び０．１％ ＮＨ４Ｃｌ（１６ｇ／Ｌ）、ＮａＨ２Ｐ０４（４ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＨＰ０（４．６ｇ／Ｌ）、Ｋ２Ｓ０４（０．４５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳ０４（０．３９ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２（６２ｍｇ／Ｌ）、及び１ｍｌ／Ｌの微量元素溶液（１５ｇ／Ｌ ＦｅＳ０４・７Ｈ２０、２．４ｇ／Ｌ ＭｎＳ０４・Ｈ２０、２．４ｇ／Ｌ ＺｎＳ０４・７Ｈ２０、及び０．１Ｍ塩酸に溶解した０．４８ｇ／Ｌ ＣｕＳ０４・５Ｈ２０）を含む最小培地中で増殖させうる。最小培地由来の細胞を用いて、各発酵槽に接種し、ＯＤ６００が０．１に達するようにする。各反応容器は、４００ｍＬの乳化アサ属油培地を含有する。０．１％のＮＨ４Ｃｌを含む最小培地では、約２％のアサ属油を用いる。培地調製には、水に混和したアラビアゴムの１０倍溶液を用いて、急速攪拌する。１０，５００ｇで遠心分離し、不溶性粒子を分離する。水、アラビアゴム透明液、アサ属油をリン酸ナトリウム（４．０ｇ／Ｌ）及びＫ２Ｓ０４（０．４５ｇ／Ｌ）と混合する。均質化又は超音波処理により混合物を乳化する。乳化前に添加される水の量は、エマルジョン製造に用いられる特定の装置に依存する。乳化後、高圧蒸気滅菌し、冷却後、ＭｇＳ０４（０．３９ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２（６２ｍｇ／Ｌ）、微量元素（１５ｇ／Ｌ ＦｅＳ０４・７Ｈ２０、２．４ｇ／Ｌ ＭｎＳ０４・Ｈ２０、２．４ｇ／Ｌ ＺｎＳ０４・７Ｈ２０、及び０．１Ｍ塩酸に溶解した０．４８ｇ／Ｌ ＣｕＳ０４・５Ｈ２０）、及びゲンタマイシン（１０ｐｇ／ｍＬ）を添加する。各反応容器をｐＨ６．８（２Ｍ ＮａＯＨで制御）で３０℃に維持し、溶存酸素濃度４０％で５００～９００ｒｐｍの速度で７２時間撹拌する。好ましくは、ＰＨＢ生産を増加させるため、過剰炭素を維持するために、供給バッチ培養技術が用いられる。
［００４５］ ＰＨＢは、アサ属油１ｇ当たりＰＨＢを約０．２４１５ｇの速度で抽出４の方法により製造しうる。
【実施例7】
【0044】
［００４６］
〔抽出５〕
他の実施形態では、次の方法により、微生物及びアサ属廃棄物として、カプリアビダス・ネカトール及び大腸菌の遺伝子操作株、及び場合によっては、ｐｈｂＡ及びｐｈｂＢ遺伝子を有するＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａの遺伝子操作株を用いて、ＰＨＢを合成及び抽出しうる。まず、アサ属廃棄物を破砕し、約２％（ｗ／ｖ）及び約３０℃の温度で水中に投入する。アサ属－水混合物にカプリアビダス・ネカトールと大腸菌の混合培養物を接種し、場合によっては、Ａ． ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａと肥料、例えば米ぬか抽出物を０．１％添加する。
その後、反応培地を２０時間撹拌し、増殖させる。初回増殖期間の後、反応培地をさらに１５時間撹拌するが、窒素欠乏状態を誘導し、ＰＨＢの産生を促進するために、それ以上の肥料は添加しない。
〔抽出５〕
他の実施形態では、次の方法により、微生物及びアサ属廃棄物として、カプリアビダス・ネカトール及び大腸菌の遺伝子操作株、及び場合によっては、ｐｈｂＡ及びｐｈｂＢ遺伝子を有するＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａの遺伝子操作株を用いて、ＰＨＢを合成及び抽出しうる。まず、アサ属廃棄物を破砕し、約２％（ｗ／ｖ）及び約３０℃の温度で水中に投入する。アサ属－水混合物にカプリアビダス・ネカトールと大腸菌の混合培養物を接種し、場合によっては、Ａ． ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａと肥料、例えば米ぬか抽出物を０．１％添加する。
その後、反応培地を２０時間撹拌し、増殖させる。初回増殖期間の後、反応培地をさらに１５時間撹拌するが、窒素欠乏状態を誘導し、ＰＨＢの産生を促進するために、それ以上の肥料は添加しない。
【0045】
［００４７］ＰＨＢの抽出は、約３５時間後に反応媒体に硫酸等の無機酸を添加して、達成される。ＰＨＢ顆粒を、５０００ｇで遠心分離して分離する。不要な上清（液相）は、処理中の固相進行中に廃棄される。無機酸により混合物からＰＨＢが単離される。化合物の純度は、ＮａＯＨ（ｐＨ １０）等のアルカリ性浴中で洗浄後、最終的な遠心分離及び水ですすぐことによって改善しうる。この方法により、得られるＰＨＢの収率と純度は高い（＞９７％）。場合によっては、市販の漂白剤を用いて生成物を脱色しうる。
【実施例8】
【0046】
［００４８］
〔調製培地３〕
他の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＧＰｐｌ０４を微生物、アサ属廃棄物を炭素源とし、以下の方法により、ＰＨＢを合成及び抽出しうる。Ｐ．ｐｕｔｉｄａは、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地中、３０℃、２００ｒｐｍで振盪しながら一晩増殖させる。この菌株を培養するためのリン酸塩緩衝生理食塩液は、９．０ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰ０４・１２Ｈ２０、１．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２Ｓ０４、０．４ｇ／Ｌ ＭｇＳ０４・７Ｈ２０からなり、ｐＨは７．０である。
〔調製培地３〕
他の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＧＰｐｌ０４を微生物、アサ属廃棄物を炭素源とし、以下の方法により、ＰＨＢを合成及び抽出しうる。Ｐ．ｐｕｔｉｄａは、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地中、３０℃、２００ｒｐｍで振盪しながら一晩増殖させる。この菌株を培養するためのリン酸塩緩衝生理食塩液は、９．０ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰ０４・１２Ｈ２０、１．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２Ｓ０４、０．４ｇ／Ｌ ＭｇＳ０４・７Ｈ２０からなり、ｐＨは７．０である。
【実施例9】
【0047】
［００４９］
〔抽出６〕
密度１．５×１０８ 細胞／ｍＬの一晩培養したＰ． ｐｕｔｉｄａを、１／１０ ｖ／ｖ～１Ｌの調製培地３に添加し、２００ｒｐｍで７２時間振盪しながら３０℃で増殖させた。ＰＨＢは次亜塩素酸ナトリウムを用いて以下のように抽出しうる。バイオマス８ｇに次亜塩素酸ナトリウム１００ｍＬ（３０％）を加え、３７℃で９０分間インキュベートする。ペレットを遠心分離し、アルコールで洗浄する。ペレットをクロロホルムに溶解し、必要に応じて、予め秤量した清潔な血清チューブに移す。クロロホルムを蒸発させ、チューブの質量を量り、ＰＨＢの量を算出する。
〔抽出６〕
密度１．５×１０８ 細胞／ｍＬの一晩培養したＰ． ｐｕｔｉｄａを、１／１０ ｖ／ｖ～１Ｌの調製培地３に添加し、２００ｒｐｍで７２時間振盪しながら３０℃で増殖させた。ＰＨＢは次亜塩素酸ナトリウムを用いて以下のように抽出しうる。バイオマス８ｇに次亜塩素酸ナトリウム１００ｍＬ（３０％）を加え、３７℃で９０分間インキュベートする。ペレットを遠心分離し、アルコールで洗浄する。ペレットをクロロホルムに溶解し、必要に応じて、予め秤量した清潔な血清チューブに移す。クロロホルムを蒸発させ、チューブの質量を量り、ＰＨＢの量を算出する。
【0048】
［００５０］ 本発明を、例示的な実施形態を参照して説明してきたが、当業者であれば、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲から逸脱することなく、様々な改変を行うことができ、その要素を等価物で置換しうることができることが理解されるであろう。すなわち、本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態に限定されないことが意図される。