特許 7582941 連結分子を介した基材への生体分子のプラズマ固定化のための改良された方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-05

(45)【発行日】2024-11-13

(54)【発明の名称】連結分子を介した基材への生体分子のプラズマ固定化のための改良された方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20241106BHJP

   A61L 15/44 20060101ALI20241106BHJP

   A61L 15/40 20060101ALI20241106BHJP

   G01N 33/531 20060101ALI20241106BHJP

   G01N 33/547 20060101ALI20241106BHJP

   G01N 33/552 20060101ALI20241106BHJP

【ＦＩ】

G01N33/543 525G

A61L15/44 100

A61L15/40 100

G01N33/531 B

G01N33/547

G01N33/552

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2021525611

(86)(22)【出願日】2019-11-12

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-18

(86)【国際出願番号】 EP2019081069

(87)【国際公開番号】W WO2020099434

(87)【国際公開日】2020-05-22

【審査請求日】2022-10-17

(31)【優先権主張番号】18205781.0

(32)【優先日】2018-11-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】520061701

【氏名又は名称】モレキュラー・プラズマ・グループ・ソシエテ・アノニム

【氏名又は名称原語表記】ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＬＡＳＭＡ ＧＲＯＵＰ ＳＡ

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】シェルジェンス，ギル

(72)【発明者】

【氏名】エベルジェ，レジス

【審査官】高田 亜希

(56)【参考文献】

【文献】特表２００７－５１５９７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１９－５１０５９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００９－２９３１２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１３６３３４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／００５８８５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００６／００３４８８３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１４／０２８８５９２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００５／１０６４７７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】米国特許出願公開第２００８／０１１８７３４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０１０６９９３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００７／０１１８２１１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００９／０２９８２５１（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ －３３／９８

Ｂ０５Ｄ １／００

Ｈ０５Ｈ １／３４

Ａ６１Ｌ １５／４０ －１５／４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

非熱的大気圧プラズマを生成し、室温から６０℃の間の温度で維持することによって、基材の試料表面に連結分子を介して生体分子を固定化するための２ステップの方法であって、
－ 第１のステップにおいて、前記連結分子は、前記試料表面を第１のプラズマジェットおよび前記連結分子に露出することによって前記試料表面に堆積され、前記試料表面に連結層を生成すること、および
－ 連続的に、第２のステップにおいて、前記連結層を第２のプラズマジェットおよび前記生体分子に露出することによって前記生体分子を前記連結層に堆積させること
である２つのステップを含み、
前記第１のプラズマジェットは第１の電極出力で生成され、前記第２のプラズマジェットは第２の電極出力で生成され、前記第１の電極出力は前記第２の電極出力よりも高く、
前記第１のプラズマジェットは第１の電極出力で生成され、前記第２のプラズマジェットは第２の電極出力で生成され、前記第１の電極出力は少なくとも１．０Ｗ／ｃｍ ^２ であり、前記第２の電極出力は最大１．５Ｗ／ｃｍ ^２ であることを特徴とする、方法。

【請求項2】

前記プラズマジェットは、ヘリウム、アルゴン、窒素、空気、二酸化炭素、アンモニウムまたはそれらの組み合わせを含む群から選択されるプラズマガスを使用して生成することができる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記基材が、生物学的材料、複合材料、結晶性固体、織物、金属、プラスチック、ポリマー、セラミック、ガラスまたはそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記連結分子が少なくとも１つの部分を含む分子である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

少なくとも１つの部分が、アルカン、アルケン、アルキン、ベンゼン誘導体、ハロアルカン、フルオロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカン、ヨードアルカン、アルコール、ケトン、アルデヒド、ハロゲン化アシル、カーボネート、カルボキシレート、カルボン酸、エステル、メトキシ、ヒドロペルオキシド、ペルオキシド、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、複素環、オルトカルボネートエステル、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アゾ化合物、シアネート、硝酸塩、ニトリル、亜硝酸塩、ニトロ化合物、ニトロソ化合物、オキシム、ピリジン誘導体、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルフィン酸、スルホン酸、スルホン酸エステル、チオシアネート、チオケトン、チアール、チオエステル、ホスフィン、ホスホン酸、ホスフェート、ホスホジエステル、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボリン酸、ボリン酸エステルまたはそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

前記生体分子が生物学的または薬学的に活性な分子である、請求項１～５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記生体分子が、タンパク質、ポリヌクレオチド、糖、脂質、成長因子、ホルモンおよび生理活性物質またはそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１～６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

前記生体分子が水性エアロゾル中の前記第２のプラズマジェットに投与される、請求項１～７のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

－ ジェット出口（１２）を備えるプラズマジェット発生器（１）と、
－ アダプタ（３）と交換可能なシールド（２）とを備えるノズルであって、前記シールドが、ジェット入口（２２）と、ノズル出口（２４）と、前記ジェット入口から前記ノズル出口まで延在する側壁（２１）とを備えるノズルと
を備え、
前記アダプタは、前記シールドを前記プラズマジェット発生器に着脱可能に取り付け、それによって前記ジェット出口と前記ジェット入口とを連通可能に結合するように構成され、
－ 連結ジェット出口を備える連結プラズマジェット発生器と、
－ 生体分子ジェット出口を含む生体分子プラズマジェット発生器と
を備え、
前記アダプタが、前記シールドを前記連結プラズマジェット発生器、前記生体分子プラズマジェット発生器、またはその両方に着脱可能に取り付け、それによって前記アダプタは前記連結ジェット出口、生体分子ジェット出口、またはその両方と前記ジェット入口とを選択的かつ連通可能に結合するように構成される、請求項１～８のいずれかに記載の方法を達成するのに適した装置。

【請求項10】

－ ジェット出口（１２）を備えるプラズマジェット発生器（１）と、
－ アダプタ（３）と交換可能なシールド（２）とを備えるノズルであって、前記シールドが、ジェット入口（２２）と、ノズル出口（２４）と、前記ジェット入口から前記ノズル出口まで延在する側壁（２１）とを備えるノズルと
を備え、
前記アダプタが、前記シールドを前記プラズマジェット発生器に着脱可能に取り付け、それによって前記ジェット出口と前記ジェット入口とを連通可能に結合するように構成され、複数の放出前駆体チャネルが前記ジェット出口の上流に配置される、請求項１～８のいずれかに記載の方法を達成するのに適した装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、プラズマ技術に関し、特に、生物学的分子をプラズマ堆積層に含めることを伴う。

【背景技術】

【0002】

国際公開第２０１７／１３６３３４号（Ａ１）パンフレットは、生体分子、医薬品、および他の治療活性剤を表面に堆積させる方法を開示している。この方法は、１つ以上の電極を有するプラズマ装置と、ガス供給入口と、周囲圧力に曝されるプラズマ出口と、プラズマチャンバの内部に非熱的平衡プラズマを供給するために、電極に動作可能に接続された点火システムとを含む。粒子送達システムを使用して、活性剤を乾燥粉末としてプラズマの中またはプラズマの下流に導入し、プラズマ処理された活性剤を堆積させて表面にコーティングを生成することができる。コーティングは、活性剤の活性を保持することができる。本発明では、非熱的大気のプラズマを使用して、基材上に少なくとも２層の生物学的コーティングを得るために、何らかの湿式化学ステップを排除することの問題を解決しようと試みる。しかし、この方法は、生体分子が曝される厳しいプラズマ条件のために、多くの基材と生体分子の組み合わせにとって適したものになっていない。

【0003】

国際公開第２００５／１０６４７７号パンフレットには、大気圧プラズマを発生させ維持することによって生体分子を表面に固定化する方法が開示されている。固定化は、２つの電極間の空間に試料を導入することによって達成され、電極に交流電圧を印加することによってプラズマが生成され、コーティングが堆積される。混合されている本雰囲気は、反応性前駆体を含むエアロゾルと、生体分子を含むエアロゾルとを含み、両方とも堆積ステップの最中に堆積および固定される。この方法も、基材と生体分子の多くの組み合わせに適していない。この方法の別の欠点は、生体分子の固定化の効率である。連結分子と生体分子の両方を同時に堆積することは、立体的障害をもたらし、堆積する生体分子の量を制限する可能性がある。さらに、第１の連結層の堆積は、表面上に固定化された生体分子の量を増加させることができる。

【0004】

米国特許出願公開第２００７／１１８２１１号（Ａ１）明細書の文献は、生物学的分子を化学的に結合することができる官能基を有するポリマーのステントへの適用を含む薬物溶出医療機器を作成するための方法を開示しており、前記適用が冷式プラズマ法によって単一ステップで行われることを特徴とする。さらに、本発明はまた、それから得られる医療機器に関する。

【0005】

国際公開第２０１７／１３６３３４号（Ａ１）パンフレットの文献は、生体分子、医薬品、および他の治療活性剤を表面に堆積させるプラズマシステムを開示している。システムは、１つ以上の電極を有するプラズマ装置と、ガス供給入口と、周囲圧力に曝されるプラズマ出口と、プラズマチャンバの内部に非熱的平衡プラズマを供給するために、電極に動作可能に接続された点火システムとを含むことができる。粒子送達システムを使用して、活性剤を乾燥粉末としてプラズマの中またはプラズマの下流に導入し、プラズマ処理された活性剤を堆積させて、表面にコーティングを生成することができる。コーティングは、活性剤の活性を保持することができる。

【0006】

米国特許出願公開第２００９／２９８２５１号（Ａ１）明細書の文献は、エアロゾルスプレー装置、およびエアロゾルスプレー装置を使用してフィルムを形成する方法を開示している。本発明の実施形態によるエアロゾルスプレー装置は、液化ガスを気化させてキャリアガスを形成し、キャリアガスを昇圧するキャリアガス噴射部；キャリアガスと粉末とを混合してエアロゾルを形成するエアロゾル形成部；および基板の表面に膜が形成されるように、常圧環境下でエアロゾルをスプレーする成膜部を含む。この装置は、粉体の種類や大きさを制限することなくコーティング処理を行うことができ、常温常圧環境下で成膜することができることからプロセスを簡略化することができ、短時間で広範囲の膜厚を制御することができる。

【0007】

米国特許出願公開第２００８／１１８７３４号（Ａ１）明細書の文献は、基材にコーティングを含有する活物質を形成するための方法を開示しており、この方法は、ｉ）プラズマ環境の内部で化学結合形成反応を受ける１つ以上の気体または霧化液体および／または固体コーティング形成材料、ならびにプラズマ環境の内部で化学結合形成反応を実質的に受けない１つ以上の活物質を、大気圧または低圧の非熱的平衡プラズマ放出および／またはそれから生じる励起ガス流に導入するステップと、ｉｉ）基材を、基材表面上に堆積されてコーティングを形成する霧化コーティング形成物質および少なくとも１つの活物質の得られた混合物に露出するステップとを含み、基材は、家庭用ケアまたは脱毛ケア用のワイプ、布、またはスポンジ、または水溶性家庭用洗浄ユニット用量製品ではない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、上記の問題および欠点の少なくとも一部を解決することを目的とする。本発明の目的は、これらの欠点を排除する方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

発明の概要
第１の態様では、本発明は、請求項１に記載の、非熱的大気圧プラズマを生成し、維持することによって、基材の試料表面に連結分子を介して生体分子を固定化するための２ステップの方法を提供する。

【0010】

本発明による方法は、基材および生体分子の組み合わせのはるかに広範な選択を可能にする。特に、比較的不活性な基材と、生体分子が結合するのが困難であると判明した基材との組み合わせ、およびプラズマ感受性である生体分子を、本発明によって有利に固定化することができる。これは、適切な連結層および両方のステップの対応するプラズマ条件の選択によって行うことができる。

【0011】

連結層が存在していることは、結合した生体分子の量、生体分子の固定化の配向を制御する能力、またはその両方に関して、より効率的な生体分子の固定化を可能にする。さらに、プラズマ技術の使用による連結層を介した固定化は、時間がかかる複雑な多段階の湿式化学プロセスを必要とせず、単純な２ステップの方法をもたらす。これはまた、高額で環境に有害な溶媒の使用を排除する。

【0012】

第２の態様では、本発明は、請求項１０または１１に記載の、連結分子を介した基材の試料表面へ生体分子を２ステップで固定化するのに適した装置を提供する。

【0013】

装置は、有利には、本発明による２ステッププロセスに適合される。この装置は、通常の大気の非熱的プラズマに適している。しかし、装置は、プラズマ感受性生体分子に特に適している。

【0014】

装置は、ノズルに起因して、基材の表面に沿って比較的均一なプラズマを生成するように適合される。さらに、ノズルは、環境に対してわずかな過圧を生成し、それにより、環境の酸素が大幅に排除される。前記分子が表面に到達する前に酸素がイオン化分子を不活性化することなく、はるかに均一なプラズマが生成される。これはまた、表面または連結層上に分子を堆積させるのに十分なエネルギーを依然として保持しながら、ジェットに沿ったより穏やかなプラズマ条件を可能にする。

【0015】

第３の態様では、本発明は、請求項１３に記載の、連結分子を介した基材の試料表面への生体分子の２ステップの固定化を使用して得ることができるデバイスを開示する。

【0016】

本発明の方法によって組み合わせることができる基材および生体分子のより広範な組み合わせは、新規または改善された用途または製品を可能にする。これらの用途は、医療、化学、環境、食品、材料産業において見出すことができるが、これらに限定されない。特定の製品には、バイオセンサ、ラボオンチップ、バイオミメティック材料、太陽電池、非汚染表面、抗菌コーティング、体外もしくはインビボでの成長や機能性組織の両方のためのテンプレート、生体誘導結晶形態、伝導コーティング、または生体触媒用途が含まれるが、これらに限定されない。

【0017】

有利には、本発明は、医療機器、創傷ケア製品、バイオセンサ、ラボオンチップ、非汚染表面および抗菌性コーティングの製造における湿式化学ステップを使用することによって生じる工業化の限界に対して、解決策を提供する。１つの特定の例は、研究および診断のためのガラス、石英またはシリコンウェハでの生体分子の固定化を含む。もう１つは、特に抗菌特性または抗真菌特性を有する生体分子の、創傷被覆材用の織物への固定化である。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】サンドイッチＥＬＩＳＡにおける試薬間の相互作用を示す。

【図2】従来式の湿式化学方法によって堆積されたものに対するプラズマ堆積抗体の機能性の比較を示す。

【図3】試料が空の状態と陽性試料との間の関係を示す（Ａｂ＋ＡＡ、インキュベーションなし、４ｓｌｍ、９秒）。

【図4】試料が空の状態と陽性試料との関係（Ａｂのみ、インキュベーションなし、２ｓｌｍ、異なる露出時間）、および捕捉抗体を含まない対照試料と陽性試料との関係を示す。

【図5】試料が空の状態と陽性試料との間の関係を示す（Ａｂのみ、インキュベーションなし、異なる吸引流、１０秒）。

【図6】大気圧プラズマ（Ａｂ＋ＡＡ）を使用した固定化後の抗体の機能性に対する異なるインキュベーション方法の効果の比較を示す。

【図7】大気圧プラズマ（Ａｂのみ）を使用した固定化後の抗体の機能性に対する異なるインキュベーション方法の効果の比較を示す。

【図8】固定化された抗体の機能性の、アクリル酸の同時プラズマ重合の有無での比較を示す。

【図9】ＥＬＩＳＡのエンドポイントに対する吸引流の効果を示す。

【図10】ＥＬＩＳＡのエンドポイント（インキュベーションなし）に対する露出時間の影響を示す。

【図11】ＥＬＩＳＡのエンドポイント（湿式インキュベーション）に対する露出時間の影響を示す。

【図12】ＥＬＩＳＡのエンドポイント（１ｓｌｍ、インキュベーションなし、Ａｂ＋ＡＡ）に対する露出時間の影響を示す。

【図13】ＥＬＩＳＡのエンドポイント（４ｓｌｍ、インキュベーションなし、Ａｂ＋ＡＡ）に対する露出時間の影響を示す。

【図14】本発明による装置の実施形態の正面図を示す。

【図15a】本発明によるシールドの実施形態の縦方向の見え方を示す。

【図15b】本発明によるシールドの実施形態の側面の見え方を示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明は、非熱的大気圧プラズマを介して基材の試料表面に連結分子を介して生体分子を固定化するための２ステップの方法および装置に関する。本発明は、上記の対応する節に要約されている。以下では、本発明を詳細に説明し、好ましい実施形態を論じ、本発明を実施例によって例示する。

【0020】

別段の定義がない限り、技術用語および科学用語を含む、本発明の開示に使用されるすべての用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらなる指針によって、本発明の教示をよりよく理解するために、用語の定義が含まれる。

【0021】

本明細書で使用される場合、以下の用語は以下の意味を有する。
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、単数および複数の指示対象の両方を指す。例として、「ａ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ（区画）」は、１つ以上の区画を指す。

【0022】

パラメータ、量、一時的な持続時間などの測定可能な値を指す、本明細書で使用される場合の「約」は、指定された値の＋／－２０％以下、好ましくは＋／－１０％以下、より好ましくは＋／－５％以下、さらにより好ましくは＋／－１％以下、さらにより好ましくは＋／－０．１％以下などの変動を包含することを意味し、そのような変動は開示された発明で実行するのに適している。しかし、修飾語「約」が指す値自体が具体的に開示されていることも理解されたい。

【0023】

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、例えば構成要素などの後に続くものの存在を指定する包括的または非限定的な用語であり、当技術分野で知られているか、それに開示されている追加の列挙されていない構成要素、特徴、要素、部材、ステップが存在していることを排除または除外しない。

【0024】

さらに、明細書および特許請求の範囲における第１、第２、第３などの用語は、特定されない限り、同様の要素を区別するために使用され、必ずしも連続的または時系列的な順序を説明するためのものではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書に記載される本発明の実施形態は、本明細書に記載または例示されている以外の順序で動作することができることを理解されたい。

【0025】

エンドポイントによる数値範囲の列挙は、その範囲内に包含されるすべての数および分数、ならびに列挙されたエンドポイントを含む。

【0026】

一群のメンバーの１つ以上または少なくとも１つのメンバーなどの「１つ以上」または「少なくとも１つ」という用語は、さらなる例示によってそれ自体明確であるが、この用語は、特に、前記メンバーのいずれか１つ、または前記メンバーのいずれか２つ以上、例えば前記メンバーのいずれか≧３、≧４、≧５、≧６または≧７など、および前記メンバーのすべてまでへの言及を包含する。

【0027】

本明細書で使用される場合、「試料表面」は、基材の表面の一部または全体を意味する。好ましくは、試料表面は少なくとも１μｍ^２の表面を有する。

【0028】

本明細書で使用される場合、「連結層」は、重合を受けるか、または堆積時に表面にモノマーとして残ることができる連結分子を含む層を意味する。

【0029】

本明細書で使用される場合、「プラズマジェット」は、プラズマジェットおよび／またはプラズマジェットの残光を指す。例えば、シールド内部の「プラズマジェット」に注入されるコーティング前駆体は、シールド内部のプラズマジェットおよび／またはプラズマジェットの残光に注入されるコーティング前駆体を指し得る。

【0030】

本明細書で使用される場合、「部分」は、他の種類の分子の内部にも見出され得るように名称が付けられた分子の一部を意味する。本明細書で定義される部分は、少なくとも１つの官能基または少なくとも１つのより小さい部分またはそれらの組み合わせを含む。

【0031】

本明細書で使用される場合、「生体分子」は、生物において存在する分子またはイオン、特にいくつかの典型的な生物学的プロセスに不可欠なもの、ならびに生物学的および薬学的に活性なあらゆる分子を示す。これは、たとえそれらが「自然界」に存在しなくても、生物学的または薬学的な活性を示す合成化学物質を含んでいる。

【0032】

本明細書に記載されている場合の「生物学的または薬学的に活性な分子」は、生体に対して生物学的活性または薬理学的な活性を有する分子に関する。すなわち、分子は、生体物質に対して有益または有害であるいずれかの効果に関する。

【0033】

第１の態様では、本発明は、非熱的大気圧プラズマを生成し、室温から６０℃の温度に維持することによって、基材の試料表面上に連結分子を介して生体分子を固定化するための２ステップの方法を提供する。好ましいプラズマ温度は室温である。室温は、５℃～２５℃、より好ましくは１５℃～２５℃、最も好ましくは約２０℃であると理解される。この方法は、連続的に実行される第１のステップおよび第２のステップを含む。本方法の第１のステップでは、試料表面を第１のプラズマジェットおよび連結分子に曝すことによって連結分子を試料表面に堆積させ、試料表面に連結層を生成する。本方法の第２の連続ステップでは、連結層を第２のプラズマジェットおよび生体分子に曝すことによって、生体分子を連結層に堆積させる。

【0034】

基材の表面と生体分子との間の接着性を改善するために、連結層が頻繁に必要とされている。２ステップのプロセスは、連結層の生成および生体分子の固定化のための異なるプラズマ条件の使用を可能にするので有利である。これは、過酷なプラズマの処理を必要とする表面を使用する場合、またはプラズマに感受性がある生体分子を固定化する場合に特に有利である。

【0035】

本明細書で使用される場合、「大気圧」は、圧力が周囲環境の圧力とほぼ一致していることを示す。この用語は、環境との実質的な圧力差を維持するために反応容器を必要とする低圧および高圧プラズマ技術と本プラズマ技術を区別する。したがって、プラズマ技術の当業者は、本明細書で使用される場合の「大気圧」が、１０１３２５Ｐａとして定義される圧力単位「ａｔｍ」として解釈されるべきではないことを理解する。好ましくは、プラズマは０．６～５．０バールの間の圧力を維持し、より好ましくはプラズマは０．７～４．５バールの間の圧力を維持し、より好ましくはプラズマは０．８～３．０バールの間の圧力を維持し、より好ましくはプラズマは０．９～２．５バールの間の圧力を維持し、より好ましくはプラズマは１．０バール～２．５バールの間の圧力を維持し、最も好ましくは１．０バール超および２．５バール未満の圧力を維持する。最も好ましくは、プラズマは、環境の圧力と比較してわずかに高い圧力を維持する。これは、環境からプラズマへの酸素流入を大幅に減少させるので、特に本発明による装置と組み合わせて有利である。その結果、より安定した均質なプラズマが得られる。プラズマジェットと基材の表面との間の均一性の増加により、連結層を生成するかまたは生体分子を固定化するのに十分な活性を保持しながら、より穏やかなプラズマジェット条件を使用することができる。これは、プラズマ感受性分子において特に有利である。タンパク質などのほとんどの生物学的に活性な分子は、プラズマ感受性である。

【0036】

好ましい実施形態では、両方の前記プラズマジェットを生成するために使用されるプラズマガスは、ヘリウム、アルゴン、窒素、空気、二酸化炭素、アンモニウムまたはそれらの組み合わせを含む群から選択される。プロセスの各ステップに２つの異なるプラズマガスを使用することが可能である。より好ましくは、第２のプラズマジェットを生成するために、プラズマガスとしてアルゴンが使用される。アルゴンは、低攻撃性の気候をもたらし、エピトープの完全性を維持する。これにより、別段であればプラズマの存在下で変性する多くの生体分子などのプラズマ感受性分子を、それらの生物学的機能性を保持しながら表面に固定化することが可能になる。より好ましくは、前記両方のプラズマジェットを生成するために、アルゴンがプラズマガスとして使用される。これにより、有利には、同じプラズマガスを使用して両方のプラズマジェットを生成することが可能になる。これはまた、資本のコストがより低く、動作のコストがより低い、単一のプラズマジェットおよび複数の放出前駆体チャネルを有するプラズマ装置の使用を可能にする。好ましくは、複数の放出前駆体チャネルは、ジェット出口の上流、より好ましくはプラズマジェット発生器内に配置される。実施形態では、装置は、２、３、４、５またはそれより多くの放出前駆体チャネルを含む。装置が意図されるプロセスに応じて、プロセスで使用される異なる前駆体の数を考慮して放出前駆体チャネルの数を選択することができ、より好ましくは、放出前駆体チャネルの数は、少なくとも異なる前駆体の数である。

【0037】

好ましい実施形態では、第１のプラズマジェットが第１の電極出力で生成され、第２のプラズマジェットが第２の電極出力で生成され、第１の電極出力が第２の電極出力よりも高い。より低い第２の電極出力は、よりエネルギーの低いプラズマの生成を可能にし、これはプラズマ感受性生体分子を固定化するのに好ましいが、エネルギー的により高次のプラズマは、連結層の堆積に有益である。

【0038】

プラズマジェットは、電極出力で作動する電極を使用して生成されることが理解される。第１のプラズマジェットは、第１の電極出力で生成される。第２のプラズマジェットは、第２の電極出力で生成される。本明細書で使用される場合、「電極出力」は、ノズルのプラズマの出口の面積の関数として定義される。これは、影響を受けた基材の表面積あたりの電力の入力をより正確に表す。

【0039】

好ましい実施形態では、第１の電極出力は、少なくとも１．０Ｗ／ｃｍ^２、好ましくは少なくとも１．１Ｗ／ｃｍ^２、より好ましくは少なくとも１．２Ｗ／ｃｍ^２、より好ましくは少なくとも１．３Ｗ／ｃｍ^２、より好ましくは少なくとも１．４Ｗ／ｃｍ^２、より好ましくは約１．５Ｗ／ｃｍ^２である。これらの電極出力は、連結分子と基材、特に比較的不活性な基材の表面との幅広い組み合わせに適している。

【0040】

好ましい実施形態では、第２の電極出力は、最大１．５Ｗ／ｃｍ^２、好ましくは最大１．４Ｗ／ｃｍ^２、より好ましくは最大１．３Ｗ／ｃｍ^２、より好ましくは最大１．２Ｗ／ｃｍ^２、より好ましくは最大１．１Ｗ／ｃｍ^２、より好ましくは最大１．０Ｗ／ｃｍ^２、より好ましくは最大０．９Ｗ／ｃｍ^２、より好ましくは最大０．８Ｗ／ｃｍ^２、より好ましくは約０．７Ｗ／ｃｍ^２である。生体分子の断片化、または生体分子活性の低下をもたらし得る任意の他の効果を制限するために、第２の電極出力を可能な限り低く保つことが好ましい。

【0041】

好ましい実施形態では、第１の電極出力は少なくとも１．０Ｗ／ｃｍ^２であり、第２の電極出力は最大で１．５Ｗ／ｃｍ^２であり、より好ましくは、第１の電極出力は少なくとも１．１Ｗ／ｃｍ^２であり、第２の電極出力は最大で１．４Ｗ／ｃｍ^２であり、より好ましくは第１の電極出力は少なくとも１．２Ｗ／ｃｍ^２であり、第２の電極出力は最大で１．３Ｗ／ｃｍ^２であり、より好ましくは第１の電極出力は少なくとも１．２Ｗ／ｃｍ^２であり、第２の電極出力は最大で１．２Ｗ／ｃｍ^２であり、より好ましくは第１の電極出力は少なくとも１．３Ｗ／ｃｍ^２であり、第２の電極出力は最大で１．１Ｗ／ｃｍ^２であり、より好ましくは第１の電極出力は少なくとも１．４Ｗ／ｃｍ^２であり、第２の電極出力は最大で１．０Ｗ／ｃｍ^２であり、より好ましくは第１の電極出力は少なくとも１．５Ｗ／ｃｍ^２であり、第２の電極出力は最大で１．０Ｗ／ｃｍ^２であり、より好ましくは第１の電極出力は少なくとも１．６Ｗ／ｃｍ^２であり、第２の電極出力は最大で０．９Ｗ／ｃｍ^２であり、より好ましくは第１の電極出力は少なくとも１．７Ｗ／ｃｍ^２であり、第２の電極出力は最大で０．８Ｗ／ｃｍ^２であり、最も好ましくは、第１の電極出力は約１．８Ｗ／ｃｍ^２であり、第２の電極出力は約０．７Ｗ／ｃｍ^２である。

【0042】

好ましい実施形態では、基材は、生物学的材料、複合材料、結晶性固体、織物、金属、プラスチック、ポリマー、セラミック、ガラスまたはそれらの組み合わせを含む群から選択される。好ましくは、試料表面は、ガラス、石英、プラスチック、ポリマー、織物、シリコン、皮膚、組織またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。ガラス、石英およびシリコンは、研究および診断の環境において特に有利である。これらは再利用可能であり、比較的安価で不活性であり、業界の標準として既に使用されている。

【0043】

組織、織物および皮膚は、創傷被覆材などの生体物質に使用される医療および診断用の製品にとって特に有利である。表面への生物学的活性の固定化は、生体分子のより標的化された使用を可能にする。生体物質への適用後に生体分子を分散または吸収することを防止することができる。生体分子は、表面を除去することによって除去することができる。

【0044】

好ましい実施形態では、連結分子は、少なくとも１つの部分を含む分子である。好ましくは、連結分子は２つの部分を含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つの部分は、生体分子への連結層の付着に適している。よく選択された部分は、生体分子が連結層へのより良好で、より容易で、より強力に付着することを可能にする。これは、有利には、より多くの生体分子、特に感受性のある分子の使用を可能にする。これはまた、連結層の生体分子の配向を標的化し、操作することを可能にする。有益な配向は、生体物質に対する生体分子の利用可能性を高める。別の好ましい実施形態では、部分は、連結分子の試料への結合に適している。これにより、連結層と基材の表面との結合の強度が向上する。別の好ましい実施形態において、部分は、連結分子の重合に適している。これにより、連結層は、基材の表面と生体分子との間の結合の強度を改善するポリマーネットワークを形成することができる。また、表面の化学的および機械的特性、例えば硬度の増加および反応性の低下を改善することもできる。さらに好ましい実施形態では、連結分子は少なくとも２つの部分を含み、１つは連結分子を基材の表面に結合させるのに適しており、少なくとも１つは生体分子を連結層に結合させるのに適している。最も好ましい実施形態では、立体障害の発生を最小限に抑えるために、これらの部分は互いに並んで配置されていない。

【0045】

好ましい実施形態において、少なくとも１つの部分は、アルカン、アルケン、アルキン、ベンゼン誘導体、ハロアルカン、フルオロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカン、ヨードアルカン、アルコール、ケトン、アルデヒド、ハロゲン化アシル、カーボネート、カルボキシレート、カルボン酸、エステル、メトキシ、ヒドロペルオキシド、ペルオキシド、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、複素環、オルトカルボネートエステル、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アゾ化合物、シアネート、硝酸塩、ニトリル、亜硝酸塩、ニトロ化合物、ニトロソ化合物、オキシム、ピリジン誘導体、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルフィン酸、スルホン酸、スルホン酸エステル、チオシアネート、チオケトン、チアール、チオエステル、ホスフィン、ホスホン酸、ホスフェート、ホスホジエステル、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボリン酸、ボリン酸エステルまたはそれらの組み合わせを含む群から選択される。好ましくは、部分は、カルボン酸、チオール、ヒドロキシル、アミンまたはトリアルコキシシランを含む群から選択される。これらの部分は、プラズマ感受性生体分子、特に抗体の結合に特によく適している。これにより、ガラス、石英、プラスチック、ポリマー、織物、シリコン、皮膚、組織またはそれらの組み合わせなどの、別段であれば接着することが困難な基材へのこれらの分子の固定化が可能になる。

【0046】

好ましい実施形態では、生体分子は、生物学的または薬学的に活性な分子である。
好ましい実施形態では、生体分子は、タンパク質、ポリヌクレオチド、糖、脂質、成長因子、ホルモンおよび生理活性物質またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。好ましくは、前記生体分子は抗体であるか、または抗菌および／もしくは抗真菌活性を含む。生物学的または薬学的に活性な分子を固定化することは、制御された環境が望まれる研究および診断に有利である。標的化した薬剤の適用にも有利である。表面に結合した生物学的または薬学的な活性は、非常に制御された方法で特定の時間に特定の場所に適用することができる。したがって、本発明は、診断装置または創傷治癒用製品の製造における使用に特に適している。最も好ましくは、生体分子は抗体である。抗体は一般に非常にプラズマ感受性がある。本発明は、プラズマ感受性分子を固定化するのに特に有利である。

【0047】

好ましい実施形態では、生体分子は溶解状態で投与される。より好ましい実施形態では、生体分子は水性の溶媒に溶解される。別の好ましい実施形態では、生体分子はエアロゾルとしてプラズマジェットに挿入される。さらに好ましい実施形態では、生体分子は、水性エアロゾルとしてプラズマジェットに挿入される。理論に束縛されるものではないが、これにより、生体分子は、その生物学的活性を保持するのに役立つ、プラズマジェットへの挿入時に水様性シェルによって保護されることが可能になると考えられる。エアロゾルがクラスタリングを制限するので、水性エアロゾルを介した生体分子の投与はまた、生体分子の均一的な分布を促進する。これにより、基材の表面での生体分子の利用可能性が改善される。

【0048】

一実施形態では、連結層を設けるステップは、連結層として機能する複数の層を作成する複数のステップを含む。例えば、第１のリンカーは、基材の表面に対するリンカーの接着性を改善することができる。第２のリンカーは、第１のリンカーに連結し、生体分子の固定化を改善することができる。

【0049】

別の実施形態では、生体分子を連結層に固定化するステップは、複数のステップを含む。例えば、生体分子のいくつかの層を複数の層として堆積させることができる。あるいは、異なる生体分子が基材の表面上に分布していてもよい。これは、複数のまたは相乗的な効果をもたらすのに有利であり得る。

【0050】

一実施形態では、連結層と基材の表面との間の結合は恒久的なものではない。別の実施形態では、連結層と生体分子との間の結合は恒久的ではない。生体分子の非恒久的な固定化は、標的位置における生体分子の制御された放出を可能にする。

【0051】

第２の態様では、本発明は、連結分子を介した基材の試料表面へ生体分子を２ステップで固定化するのに適した装置を提供する。装置は、ジェット出口を備えるプラズマジェット発生器を備える。装置は、アダプタおよび交換可能なシールドをさらに備える。シールドは、ジェット入口と、ノズル出口と、ジェット入口からノズル出口まで延在する側壁とを備える。アダプタは、シールドをプラズマジェット発生器に着脱可能に取り付け、それによってジェット出口とジェット入口とを連通可能に結合するように構成される。

【0052】

本明細書で使用される場合、「連通可能に結合された」とは、集まりの流れ、すなわち流体、ガスおよび／またはプラズマの流れを指す。したがって、プラズマジェット発生器の連通可能に結合されたジェット出口、およびシールドのジェット入口は、前記ジェット出口から出るプラズマジェットが、ジェット入口を介してシールドに入るように構成される。

【0053】

好ましい実施形態では、プラズマジェット発生器のジェット出口が開口部を備え、シールドのジェット入口が開口部を備え、それによって、ジェット入口の開口部は、ジェット出口の開口部よりも大きくなる。これは、拡大が速度の低下および圧力の上昇をもたらし、それによって、環境に対するシールド内側での過圧の発生を補助するので、有利である。これは、急激な拡大が乱流および／または再循環を引き起こし、したがってシールドの対応する部分に存在する成分の混合を引き起こす可能性があるため、さらに有利である。好ましくは、シールドは、ジェット入口とノズル出口との間の長さを含み、前記少なくとも１つの前駆体入口は、前記長さの最大５０％、好ましくは前記長さの最大４０％、より好ましくは前記長さの最大３０％に等しいジェット入口の距離の範囲内で、シールドの内側と連通可能に結合される。これは、再循環も起こる領域で前駆体の流入が起こるので、有利である。これは、前駆体の流入が、ジェット入口でのプラズマジェットの流入と実質的に平行ではない、好ましくは本質的に垂直な方向、好ましくは本質的に長さ方向に平行な方向に起こり、それによって乱流をさらに増大させるので、さらに有利である。

【0054】

好ましい実施形態では、ノズルは均質化手段を含む。好ましくは、シールドは、好ましくは内側に前記均質化手段を備える。均質化手段は、流れ撹乱要素を備えてもよい。流れ撹乱要素は、複数の傾斜面を含むことができる。流れ撹乱要素は、各々が多数の傾斜面を含む複数の層を含むことができる。流れ撹乱要素は、シールドの長さ方向に対して、少なくとも２０°、最大で７０°の角度を含む表面を含むことができる。

【0055】

好ましくは、シールドはモノリシックである。シールドは、射出成形によって製造することができる。シールドは、３Ｄ印刷によって製造することができる。好ましくは、シールドは、絶縁材料、より好ましくはプラスチックを含む。シールドのノズル出口は、縁部を備える。シールドのノズル出口は、平坦な縁部を含むことができる、すなわち、ノズル出口は平坦である。シールドのノズル出口は、平面ではない縁部を含むことができる、すなわち、ノズル出口は平坦ではない。これにより、平面ではない表面のインラインコーティングが可能になり、それによって縁部の各部分と表面との間に短い距離が維持される。

【0056】

好ましい実施形態では、ノズルは冷却するように適合される。好ましくは、シールドの側壁は、冷却流体を通過させるためのチャネルを備える。チャネルは、好ましくは、シールドの長さの最大６０％、より好ましくは最大５０％、さらにより好ましくは最大４５％のノズル出口からの距離に配置される。

【0057】

好ましい実施形態では、シールドの側壁は、少なくとも１つの前駆体入口、好ましくは少なくとも２つの前駆体入口、例えば２つ、３つ、４つまたはそれより多くの前駆体入口を含む。前駆体入口は、シールドの内側と連通可能に結合された第１の外側端部と、前駆体源と連通可能に結合するための第２の外側端部とを含む管状中空体を含むことができる。管状体は円筒形であってもよい。管状体は、１つ以上の屈曲部を含むことができる。コーティング前駆体は、シールドのプラズマジェットの前記少なくとも１つの前駆体入口を介して注入されてもよい。

【0058】

さらに好ましい実施形態では、１つの前駆体入口は連結分子前駆体入口であり、別の前駆体入口は生体分子前駆体入口である。さらに好ましい実施形態では、前記生体分子前駆体入口は、好ましくは水性媒体に溶解した生体分子である前記生体分子前駆体をエアロゾル化するのに適している。この装置は、単一のプラズマジェットを２ステップの方法の両方のステップに使用することができるので、特に有利である。この装置は、同じプラズマガスが使用される２ステップのプロセスに、使用することができる。これにより、２つの別個のプラズマジェットを使用するよりも迅速かつ低い資本のコストで、プロセスを実行することが可能になる。

【0059】

好ましい実施形態では、装置は、連結ジェット出口を備える連結プラズマジェット発生器を備える。さらに、装置は、生体分子ジェット出口を含む生体分子プラズマジェット発生器を含む。さらに、装置は、アダプタおよび交換可能なシールドを備える。アダプタは、シールドを連結プラズマジェット発生器、生体分子プラズマジェット発生器、またはその両方に着脱可能に取り付けるように構成される。それにより、アダプタは、連結ジェット出口、生体分子ジェット出口、またはその両方と、ジェット入口とを、選択的かつ連通可能に結合する。

【0060】

第３の態様では、本発明は、連結分子を介した基材の試料表面への生体分子の２ステップの固定化を使用して得ることができるデバイスを開示する。

【0061】

好ましい実施形態では、製品は、診断目的に適したガラス、石英またはシリコンウェハ上に固定化されたリンカー支援抗体である。

【0062】

好ましい実施形態では、製品は、抗菌特性、抗真菌特性またはその両方を有する、生体分子で機能能化されたテキスタイルパッチを含む創傷被覆用パッチである。

【0063】

本発明は、本発明をさらに説明する以下の非限定的な例によってさらに説明され、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、解釈されるべきでもない。

【0064】

これより、本発明を、限定的ではない実施例を参照して、さらに詳細に説明する。
実施例
方法
この実験では、以下の緩衝液を使用した。２５ｍＬのＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、Ｇｉｂｃｏ）および０．２５ｇのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）からなるブロッキング緩衝液を作成し、振とうして、すべてが溶解したことを確認した。２５ｍＬのＩ型超純水（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＵＶ Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ｗａｔｅｒ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、２．５ｇのマンニトール（Ｄ－マンニトール≧９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．５ｇのスクロース（Ｄ（＋）－スクロース９９．７％、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）を含む保存緩衝液。１５０ｍＬのＰＢＳおよび３μｌのＴｗｅｅｎ ８０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む洗浄緩衝液。Ｔｗｅｅｎ ８０の粘度に注意した。１５０ｍＬのＰＢＳ、０．１５ｇのＢＳＡ、および３μｌのＴｗｅｅｎ ８０を含むＰＴＡ緩衝液。分析用の天秤を使用して成分の質量を判定した。

【0065】

この実験のために、すべてのノズルを具体的に３Ｄ印刷した。ガラス瓶（ＰｌａｓｍａＳｐｏｔ（登録商標））にＰＢＳ １０ｍＬを加え、そこへヤギ由来抗ヒトＩｇＥ抗体（Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）（Ａｂ）１９６μｌをピペッティングすることにより、抗体溶液（４８μｇ／ｍｌ）を調製した。溶液を上下にピペッティングすることによって混合した。体積を増加させるために、液体と同じ高さに達するまでガラスビーズ（３ｍｍ、メルク）を添加した。

【0066】

溶液を含むボトルに、テープで氷パックを固定して、堆積中に溶液の温度を４℃に維持し、その後冷蔵庫に保存した。４ｓｌｍの吸引流を使用して、「洗浄アトマイザー」プログラムを５分間実行することによって、２つの清浄な注入器を濡らした。脱イオン（ＤＩ）水を抗体注入器（Ａｂ注入器）に使用し、アクリル酸（ＣＡＳ ７９－１０－７、ａｂｃｒ）（ＡＡ）をアクリル酸注入器（ＡＡ注入器）に使用した。ガラススライドを、エタノールで湿らせたＮｏｎｗｏｖｅｎ Ｗｉｐｅ（ＴＸ ６０９、ＴｅｃｈｎｉＣｌｏｔｈ（登録商標）、Ｔｅｘｗｉｐｅ、米国）で拭き取ることによって洗浄した。

【0067】

次いで、ＰｌａｓｍａＳｐｏｔ（登録商標）装置および「スポットアルゴン」プログラムを使用して、スライドをアルゴンプラズマエッチングした。ＰｌａｓｍａＳｐｏｔ（登録商標）の頭部の動きは、７５ｍｍ×２５ｍｍの表面全体に均一な堆積を有するように設定された。エッチングは、大型円形ノズル、０ｓｌｍ吸引ガス、０ｓｌｍ希釈ガス、１００Ｗ、８０ｓｌｍアルゴン（Ａｉｒ Ｌｉｑｕｉｄｅ）および頭部の２つのパスを使用して完了した。エッチングが完了したら、３０ｍＬのＡＡを含有するＰｌａｓｍａＳｐｏｔ（登録商標）ボトルを、ＡＡインジェクタに取り付けた。頭部の動きは以前に設定されたままであった。ＡＡのリンカー層を、大きな円形ノズル、１ｓｌｍの吸引ガス、４ｓｌｍの希釈ガス、１００Ｗ、８０ｓｌｍのアルゴンおよび各ウェル上の頭部の２つのパスを使用して適用した。ガラスのＰｒｏＰｌａｔｅ（登録商標）（Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ）を組み立てた。

【0068】

無関係な変数を特定した：吸引ガス、希釈ガス、電極出力、電極の周波数、プラズマに使用されるガス、抗体溶液の濃度、ノズルの形状、ノズルと基材の分離、反応性前駆体として使用される化学物質、リンカー単層、基材、基材堆積前エッチング処理であった。この試験では、これらの変数はすべて一定に保たれた。

【0069】

この調査で変更された変数は、吸引流、希釈流、露出時間、インキュベーションの存在および種類、ＡＡの共堆積の有無であった。ＰｌａｓｍａＳｐｏｔ（登録商標）の頭部の移動を無効にし、ノズルを取り付けた。ＡＡボトルをＡＡインジェクタに取り付けたままにし、パラメータを堆積前の方法（１ｓｌｍ吸引ガス、４ｓｌｍ希釈ガス）と同一に保った。予め調製した１０ｍＬの抗ＩｇＥ＋ＰＢＳ溶液を含むガラス製ＰｌａｓｍａＳｐｏｔ（登録商標）ボトルを、Ａｂインジェクタに取り付け、吸引流および希釈流を以下の表に従って設定した。

【0070】

吸引流と希釈流の４つの異なる組み合わせを試験した。第１の組み合わせは、１ｓｌｍの吸引流および４ｓｌｍの希釈流を含む。第２の組み合わせは、２ｓｌｍの沈降流および３ｓｌｍの希釈流を含む。第３の組み合わせは、３ｓｌｍの吸引流および２ｓｌｍの希釈流を含む。第４の組み合わせは、４ｓｌｍの吸引流および１ｓｌｍの希釈流を含む。

【0071】

電極出力を６０Ｗに設定し、周波数を３８ｋＨｚで一定に保ち、アルゴンプラズマガスの流量を８０ｓｌｍに設定した。Ａｂのみの条件では、Ａｂインジェクタのみを使用し、ＡＡインジェクタを無効にし、Ａｂ＋ＡＡの条件では、両方のインジェクタを作動させた。処理するウェルにノズルを２ｍｍ挿入した。５～４０秒の露出時間を使用し、５秒刻みで増加させた。各堆積後、頭部を移動させてノズルをウェルから取り外し、ノズルを次のものに挿入した。各条件を３つのウェルで繰り返した。すべてのウェルを処理したら、プレートを除去し、適切なインキュベーション手順に従った。

【0072】

３つの異なるインキュベーション条件、湿式インキュベーション、乾式インキュベーションおよびインキュベーションなしを試験した。ピペット（マルチピペットＭ４ １μｌ～１０ｍＬ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）およびチップ（Ｃｏｍｂｉｔｉｐｓ ａｄｖａｎｃｅｄ ２．５ｍＬ ＰＣＲクリーン、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して１７５μｌのＰＢＳ緩衝液を各ウェルに添加することによって湿式インキュベーションを作成し、プレートを４℃で２４時間保存した。次いで、さらなる残渣が現れなくなるまでＮｗＷをタップすることによってウェルを空にした。１７５μｌのＰＢＳおよび１％のＢＳＡブロッキング緩衝液を各ウェルにピペットで入れた。次いで、プレートを室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした後、ＮｗＷをタップすることによってウェルを空にした。プレートを４℃で２４時間保存することによって乾式インキュベーションを作成した。１７５μｌのＰＢＳおよび１％のＢＳＡブロッキング緩衝液を各ウェルにピペットで入れた。次いで、プレートを室温で２時間インキュベートし、ＮｗＷをタップすることによってウェルを空にした。１７５μｌのＰＢＳおよび１％のＢＳＡブロッキング緩衝液を各ウェルにピペッティングすることによって、インキュベーション条件を作成しなかった。プレートを室温で２時間インキュベートした。次いで、ＮｗＷをタップすることによってウェルを空にした。

【0073】

インキュベーション後、ウェルを、１７５μｌのＰＢＳおよび０．００２％ Ｔｗｅｅｎ ８０溶液をそれらにピペッティングし、それらをＮｗＷで空にすることによって洗浄した。このプロセスを４回繰り返した。１７５μＬ／ウェルのＤ－マンニトール（１００ｇ／Ｌ）およびスクロース（２０ｇ／Ｌ）の貯蔵緩衝液を各ウェルに添加し、プレートを室温で３分間インキュベートした。次いで、ＮｗＷをタップすることによってウェルを空にした。最後に、プレートを錫箔で包み、冷凍庫で－２０℃で保存した。

【0074】

プレートを冷凍庫から取り出した。１５０μｌのＰＢＳおよび０．００２％のＴｗｅｅｎ ８０をウェルにピペッティングすることによって、プレートを４回洗浄し、次いで、ＮｗＷをタップすることによって空にした。ＰＴＡ中の１０ｎｇ／ｍｌのＩｇＥ溶液の１７５μＬ／ウェル（免疫グロブリンＥ骨髄腫κ、Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。トリプリケートウェルのうちの１つは、空として作用するために常に空っぽのままであった。各ウェルをＰＢＳ＋０．００２％ Ｔｗｅｅｎ ８０で４回洗浄し、次いで、ＮｗＷをタップすることによって空にした。１７５μＬ／ウェルの検出抗体、ＰＴＡ中の１μｇ／ｍｌビオチン－抗ＩｇＥコンジュゲート（ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体、ビオチン結合、交差吸着、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各ウェルに添加した。プレートを室温で２時間インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ＋および０．００２％ Ｔｗｅｅｎ ８０で４回洗浄し、次いで、ＮｗＷをタップすることによって空にした。１７５μＬ／ウェルの分割酵素、ＰＴＡ溶液中１００ｎｇ／ｍｌストレプトアビジン－ＨＲＰ（ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を各ウェルに添加した。次いで、プレートを室温で１時間放置した。各ウェルをＰＢＳ＋および０．００２％ Ｔｗｅｅｎ ８０で４回洗浄し、次いで、ＮｗＷをタップすることによって空にした。１００μＬ／ウェルのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を加えた。注：第２の実験の場合、ウェルあたり１５０μｌのＴＭＢを添加した。基材添加直後に、プレートを分光光度計に挿入した。分光光度計は、開始前にプレートを振り、標準を「コースターコーニングプレートの黒の透明な底部」と設定した。３７０ｎｍおよび６５２ｎｍの波長の光の吸光度を、ＴＭＢ添加後１時間にわたって５分ごとに測定した。

【0075】

実施例およびそれらの参照符号を以下の表に示す。実施例７および８は、露出時間が０秒であったため、吸引時間もインキュベーション時間も有していなかった。

【0076】

【表1】

【0077】

結果
露出時間、吸引流および希釈流、インキュベーション手順および堆積方法を操作して、サンドイッチＥＬＩＳＡによって実証される機能性を最適化するために、ＭＰＧの大気プラズマ技術を使用して、抗体の堆積の最適条件を同定した（図１）。反応の速度論は、以下に示す吸収曲線によって推定することができる。これらは、標的抗体に対する捕捉抗体の親和性を示し、捕捉抗体によって保持される機能性の尺度が得られる。反応が安定化し、約４０分後に吸収のプラトーに達したので、すべてのエンドポイントを６０分で測定した。

【0078】

捕捉抗体（ヤギＩｇＧ抗ヒトＩｇＥ）は、図２に示すように、その機能性を保持することが示された。このグラフは、ポリスチレンマイクロタイタープレートの従来式の湿式化学堆積法に由来する標準を使用して得られた、ＫＵ Ｌｅｕｖｅｎによってもたらされた基準曲線と比較した、試行からの最良の結果を示す。各反応の反応速度は異なり、１回の試行のみが基準より速い反応を示すシグナルを生成した（実施例２：「Ａｂのみ、４ｓｌｍ、１０秒、湿式インキュベーション」）。第２の試行からの反応（「Ａｂのみ、４ｓｌｍ、１０秒、湿式インキュベーション」、「Ａｂのみ、４ｓｌｍ、１０秒、インキュベーションなし」および「Ａｂのみ、２ｓｌｍ、２０秒、インキュベーションなし」）は、より早く飽和するより強いシグナルを生成したことにも留意すべきである。これは、２回目の試行で添加されたＴＭＢの体積の増加（１００μｌではなく１５０μｌ）によって説明することができる。すべてのエンドポイントが３～４の任意単位（ａｒｂ．ｕ）の間にあったので、それらはすべて基準に匹敵すると考えることができる。これは、大気圧プラズマ堆積法が機能性保持に関して現在の方法に匹敵し、低エネルギーのプラズマへの露出が構造的な変化に起因する変性をもたらさないことを示している。

【0079】

抗体の特異性は、試験した各条件に対する空の試料の試験によって判定した。捕捉抗体が堆積していないものを除いて、ＥＬＩＳＡプロトコルで標的ＩｇＥを添加しないことによって空にした。図３～図５は、空の状態と陽性試料との比較を示しており、これは、非選択的結合が生じておらず、したがって、生成されたシグナルが標的抗体への捕捉抗体の結合に起因することを示している。

【0080】

空の状態によって生成されたシグナルは、ＡｂとＡＡが同時に堆積された場合（図３）、およびＡｂが単独で堆積された場合（図４）の両方で、それぞれの陽性試料によって生成されたシグナルよりも十分に低い。これは、図４に見られるように捕捉抗体が堆積しなかった場合にも当てはまる。この試験では、捕捉抗体は存在せず、したがって標的ＩｇＥはポリアクリル酸リンカー層のカルボキシル基とのみ相互作用することができた。生成されたシグナルは非常に低く、標的ＩｇＥを欠く試行によって生成されたものに匹敵するので、ポリアクリル酸層と標的ＩｇＥまたはアッセイの他の要素との間で交差反応は起こらないと結論付けることができる。図５は、吸引流が１ｓｌｍから４ｓｌｍに増加した場合、交差反応の増加もないことを示しており、これは、この要因が測定されるＡｂの特異性に影響を与えないことを示している。

【0081】

これは、大気圧プラズマ堆積が特異的バイオアッセイを作り出すことができ、そのプロセスが抗体の立体配座を妨害せず、したがってその特異性に影響を及ぼさないことを示している。

【0082】

インキュベーションの効果は、他のすべてのパラメータを同じに保ちながら、３つの異なるインキュベーションのプロトコルに従って、反応速度に対する反応の効果を比較することによって測定した。インキュベーションの期間は湿式化学法にとって重要であるため、大気プラズマ堆積に関するその必要性を判定することは、時間を節約することができる別の方法を示し、プロセスを工業化することを容易にする。

【0083】

図６および図７に示すように、ＡＡの共堆積がある場合とない場合の試行について、異なるインキュベーションステップを完了した。両方の場合において、データは、インキュベーションステップが吸収のエンドポイントの値を顕著に増加させないことを示しており、このことは、大気圧プラズマを使用して抗体を堆積させる場合、インキュベーションステップが必要でないことを示唆している。図６の曲線は、すべての反応の反応速度が類似していることを示しているが、図７に示すように、湿式インキュベーション試行の反応速度は、より速かった。これは、「唯一のＡｂ、４ｓｌｍ、１０秒、湿式インキュベーション」（図７）が第２の試行で完了したため、ＨＲＰをより速く飽和させ、吸光度のより速い変化およびより早い飽和をもたらすより多くのＴＢＭを有したという事実によって、説明することができる。

【0084】

Ｈｅｙｓｅら２０１１は、化学物質の同時プラズマ重合およびタンパク質の堆積として定義される共堆積は、タンパク質がポリマーメッシュに捕捉され、堆積の強度を増加させると主張した。この理論を検証するために、他のすべてのパラメータを同一に保ちながら、ＡＡがある場合とない場合で、Ａｂを堆積させた。

【0085】

図８に見られるように、ＡＡの共堆積を伴わない試行の吸収および反応速度がより高いため、データはＨｅｙｓｅらの理論と矛盾する。これは、抗体の固定化が共有の前駆体の添加なしで依然として成功しているか、または共堆積が抗体結合部位の立体的な障害をもたらし、ＩｇＥ標的コンジュゲーションを減少させることを示唆している。

【0086】

堆積条件がウェルに固定化された捕捉抗体の量に影響を及ぼすことは理にかなっている。これは、捕捉Ａｂに結合するＩｇＥの量、したがって測定される吸収度に影響を及ぼす。これを調査するために、いくつかの堆積パラメータを変更して、理想的な堆積条件を試行および特定した。

【0087】

図９は、１０秒の露出時間でＡＢ堆積のみを使用し、インキュベーションなしのサンプルについて、堆積に使用した吸引流に対してプロットした反応のエンドポイントを示す。吸引流が高いほど、堆積した抗体が多くなり、したがってＥＬＩＳＡで生成されるシグナルが強くなると考えられたが、今回は当てはまっていない。エンドポイントが３ｓｌｍまでしか増加せず、その後減少している。これは、過剰な抗体によって引き起こされる立体的障害に起因し得る。

【0088】

図１０は、インキュベーションなしで２ｓｌｍの一定の吸引を行い、６０分後の吸収度を露出時間（秒）の関数として示す。図１１は、湿式インキュベーションのために２ｓｌｍの一定の吸引を行いながら、６０分後の吸収度を露出時間（秒）の関数として示す。露出時間はまた、堆積した抗体の量と相関すると考えられ、そのため、ＥＬＩＳＡで生成されるシグナルはより強くなる。この場合も、図１０および図１１に見られるように、これは当てはまらないことが分かった。ここで、エンドポイントのシグナルは、増加するが、その後１０秒～２０秒の間でプラトーになることが示されており（それぞれ図１１および図１０）、存在している相対的に多くの抗体の存在が、必ずしもより効果的な試験に至らしめないことを示している。図１２および図１３は、ある時点で、露出時間が長くなると信号が減少を開始することを示している（図１３では２３秒、図１２では４０秒）。このことから、短い露出時間を同様の効果で使用することができ、抗体を固定化するのに必要な時間をさらに短縮することができると判断することができる。

【0089】

大気圧プラズマ技術を用いた抗体固定化は、抗体の機能性が従来式の湿式化学法と同じレベルで維持されたため、実行可能な方法であることが示されている。試料が空の状態では交差反応または非特異的結合が起こらないことが見られたため、抗体活性部位の特異性が維持されたことも示された。湿式または乾式のインキュベーションはＥＬＩＳＡのシグナルを顕著に増加させないので、インキュベーションステップはこの抗体固定化方法では陳腐化していると結論付けられた。さらに、ＡＡを含まないＡｂの堆積は、共堆積で形成されたＡＡのメッシュによって生成される立体的障害のために、ＥＬＩＳＡのシグナルを増加させることが見出された。堆積の最適なパラメータも調査し、吸引流および露出時間が過度に高次である場合、抗体の機能性が妨げられると結論付けられた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15a】

【図15b】