(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-05
(45)【発行日】2024-11-13
(54)【発明の名称】遺伝子編集用細胞膜透過性コンジュゲート
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20241106BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20241106BHJP
A61K 38/46 20060101ALI20241106BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241106BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241106BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20241106BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
A61K38/16
A61K38/46
A61K31/7088
A61P43/00 105
C07K14/00 ZNA
C12N15/09 110
【請求項の数】
31
(21)【出願番号】P 2021550111
(86)(22)【出願日】2020-02-27
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-13
(86)【国際出願番号】 EP2020055201
(87)【国際公開番号】W WO2020174070
(87)【国際公開日】2020-09-03
【審査請求日】2023-02-16
(31)【優先権主張番号】1902648.3
(32)【優先日】2019-02-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】521378196
【氏名又は名称】サイジェニカ・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＹＧＥＮＩＣＡ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】ＵＮＩＴ ４ ＪＯＹＣＥ ＨＯＵＳＥ， ＢＡＲＲＡＣＫ ＳＱＵＡＲＥ， ＢＡＬＬＩＮＣＯＬＬＩＧ， ＣＯＲＫ Ｐ３１ＨＷ３５， ＩＲＥＬＡＮＤ
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】サンガミトラ，ヌスラット
【審査官】團野 克也
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００６／１１３８４１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００７／０３８６１９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００４／０３５７６０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】SANGHAMITRA, N. J. et al.，Plasma membrane translocation of a protein needle based on a triple-stranded beta-helix motif，Mol Biosyst ，10(10)，2014年10月，pp.2677-2683
【文献】INABA, H and UENO, T ，Artificial bio-nanomachines based on protein needles derived from bacteriophage T4，Biophys Rev，10(2)，2018年04月，pp.641-658
【文献】TUTTOLOMONDO, M et al.，Human DMBT1-derived cell-penetrating peptides for intracellular siRNA delivery，Mol Ther Nucleic Acids，8(1)，2017年09月15日，pp.264-276
【文献】INABA, H ，Structural design of cell-penetrating protein needles toward development of intracellular systems (Digest)，京都大学学術情報リポジトリＫＵＲＥＮＡＩ紅，2015年11月25日，Internet Archive: Wayback Machine [online], [検索日:2024/03/11], retrived from the Internet:<URL: https://web.archive.org/web/20181104084834/https://repository.kulib.kyoto-u.ac.jp/dspace/bitstream/2433/195979/1/gkogk03971.pdf>
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
ＩＰＣ Ｃ１２Ｎ、Ｃ０７Ｋ、Ａ６１Ｋ
ＤＢ名 ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡＰＬＵＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／
ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０
（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｅｓｅｑ
Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｇｅｎｅｓｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノム編集システムの１つ以上の分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む標的ポリヌクレオチドを改変するためのゲノム編集複合体であって、前記βらせんタンパク質の長さが、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲であり、幅が、１ｎｍ～５ｎｍの範囲である、ゲノム編集複合体。
【請求項2】
ゲノム編集システムの１つ以上の分子をコードするプラスミドに連結された組換えβらせんタンパク質を含む標的ポリヌクレオチドを改変するためのゲノム編集複合体であって、前記βらせんタンパク質の長さが、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲であり、幅が、１ｎｍ～５ｎｍの範囲である、ゲノム編集複合体。
【請求項3】
前記ゲノム編集システムの１つ以上の分子が、ａ．ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
ｂ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
ｃ．転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（登録商標））、
ｄ．ＤＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＤＮＡ、
ｅ．ホーミングエンドヌクレアーゼ、
ｆ．インテグラーゼ、からなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載のゲノム編集複合体。
【請求項4】
前記ゲノム編集システムの１つ以上の分子が、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、請求項３に記載のゲノム編集複合体。
【請求項5】
前記ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項３または請求項４に記載のゲノム編集複合体。
【請求項6】
前記ｇＲＮＡが、前記標的ポリヌクレオチド中の標的配列に相補的な配列を有する、請求項３または請求項４に記載のゲノム編集複合体。
【請求項7】
前記改変が、前記標的ポリヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換である、請求項１～６のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
【請求項8】
前記βらせんタンパク質が、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲の長さ、および１ｎｍ～５ｎｍの範囲の幅を有する概ね四角形の先端形状を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
【請求項9】
前記βらせんタンパク質が、アルギニンラダー、リジンラダー、アスパラギンラダー、アスパラギン酸ラダー、およびグルタミン酸ラダーからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸ラダー構造を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
【請求項10】
存在する場合、前記アルギニンラダーが、１０～２０個のアルギニン残基を含み、前記リジンラダーが、１０～３０個のリジン残基を含み、前記アスパラギンラダーが、１０～４０個のアスパラギン残基を含み、前記アスパラギン酸ラダーが、１０～４０個のアスパラギン酸残基を含み、前記グルタミン酸ラダーが、１０～４０個のグルタミン酸残基を含む、請求項９に記載のゲノム編集複合体。
【請求項11】
前記βらせんタンパク質が、ゼロ未満である総電荷を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
【請求項12】
前記βらせんタンパク質が、－２０～－６０の総電荷を有する、請求項１１に記載のゲノム編集複合体。
【請求項13】
前記βらせんタンパク質が、原子間力顕微鏡法によって測定された場合、０．２～１２Ｎ／ｍ２の硬さパラメータＫを有するβらせん構造（ベータヘリックス）を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
【請求項14】
前記βらせんタンパク質が、ペンタペプチドリピートタンパク質である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
【請求項15】
前記βらせんタンパク質が、コンセンサス配列（ＳＴＡＶ）１（ＤＮ）２（ＬＦ）３（ＳＴＲ）４（Ｇ）５を有するタンデムリピートペンタペプチドを含む、請求項１４に記載のゲノム編集複合体。
【請求項16】
前記βらせんタンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表される、請求項１～１３のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
【請求項17】
前記組換えβらせんタンパク質が、非共有相互作用によって、前記ゲノム編集システムの１つ以上の分子または前記プラスミドに連結されている、請求項１～１６のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
【請求項18】
前記非共有相互作用が、水素結合、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、またはこれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１７に記載のゲノム編集複合体。
【請求項19】
前記組換えβらせんタンパク質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレンジアミン、ペプチド、金属コンジュゲート、薬物－金属コンジュゲート、ＤＮＡ結合ドメイン、核酸挿入分子およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるリンカー分子を介して、前記ゲノム編集システムの１つ以上の分子または前記プラスミドに連結される、請求項１～１７のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
【請求項20】
前記リンカー分子がペプチドである場合、前記ペプチドが、脂肪族アミノ酸、芳香族アミノ酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸を含む、請求項１９に記載のゲノム編集複合体。
【請求項21】
前記リンカーが、共有結合、非共有結合、およびこれらの組み合わせによって前記組換えβらせんタンパク質に連結されている、請求項１９または２０に記載のゲノム編集複合体。
【請求項22】
前記組換えβらせんタンパク質が、エステル結合またはアミド結合を介して、前記ゲノム編集システムの１つ以上の分子、または前記プラスミドに連結されている、請求項１～２１のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
【請求項23】
前記ゲノム編集複合体が、シグナル配列をさらに含み、前記シグナル配列が、特定の細胞または細胞の一部に前記ゲノム編集複合体を向ける、請求項１～２２のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
【請求項24】
前記シグナル配列が、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７からなる群から選択される、請求項２３に記載のゲノム編集複合体。
【請求項25】
前記ゲノム編集複合体が、ホスファチジルコリン分子をさらに含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
【請求項26】
前記ゲノム編集複合体が、前記ゲノム編集システムの１つ以上の分子または前記プラスミドを、細胞小器官、核、およびＰ－カドヘリン過剰発現乳癌細胞からなる群から選択される位置へ移入させる、請求項２３～２５のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
【請求項27】
前記ゲノム編集複合体が、ゲノム編集に使用される、請求項１～２６のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
【請求項28】
請求項１に記載のゲノム編集複合体を調製する方法であって、組換えβらせんタンパク質を、１つ以上のゲノム編集システム分子と組み合わせることを含み、前記βらせんタンパク質の長さが、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲であり、幅が、１ｎｍ～５ｎｍの範囲である、方法。
【請求項29】
前記１つ以上のゲノム編集システム分子が、前記組換えβらせんタンパク質と１つ以上のゲノム編集システム分子との間の複合体形成を安定化する分子を含有する反応緩衝液中にある、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
請求項２に記載のゲノム編集複合体を調製する方法であって、組換えβらせんタンパク質を、プラスミドと組み合わせることを含み、前記βらせんタンパク質の長さが、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲であり、幅が、１ｎｍ～５ｎｍの範囲である、方法。
【請求項31】
請求項１～２７のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、細胞の細胞質への１つ以上の遺伝子編集分子の送達の分野に広く関係し、特に、細胞膜を透過するための１つ以上の遺伝子編集分子に連結された組換えタンパク質を含むコンジュゲート、該コンジュゲートを調製する方法、およびその使用を開示する。本開示はまた、細胞膜を透過するための１つ以上の遺伝子編集分子をコードする核酸またはプラスミドに連結された組換えタンパク質を含むコンジュゲート、該コンジュゲートを調製する方法、およびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞膜は、細胞の内部環境をその外部環境から分離する半透膜である。原核細胞および真核細胞の膜は、いくつかの特性および組成が異なるが、どちらもリン脂質の半透性二重層構造を構成している。細胞膜の半透性の性質が、細胞膜を透過することができる分子の種類に対して細胞膜を選択的にする。細胞膜を透過することができるこれらの分子は、細胞標識、細胞透過、細胞送達、薬物取り込み、遺伝子治療、および細胞膜の透過を伴う他の多くの用途での使用に有望である。
【0003】
細胞膜を透過して細胞質ゾルに転位することができる特定のペプチドがあり、このようなペプチドは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と呼ばれている。ＣＰＰが１つ以上の機能性分子に結合しているＣＰＰコンジュゲートは、膜を横切って様々な生物学的に活性な分子を輸送する手段として研究されてきた。例えば、インスリンの吸収は、ＣＰＰコンジュゲートであるＣＰＰ－インスリンで処置した場合、Ｃａｃｏ－２細胞で劇的に増加した（６～８倍）（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．；２００５；３３５（３）：７３４－７３８）。Ｔａｔペプチドを含むコンジュゲートについても同様の結果が見られた（同上）。別の研究では、膜を透過していくつかの細胞株に様々なペプチドおよびタンパク質を送達できる短い両親媒性ペプチド担体Ｐｅｐ－１の使用が報告されている（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，１１７３－１１７６）。
【0004】
ＣＰＰは、ＣＰＰの特性により、薬物単独よりも効率的に細胞膜を透過できる薬物－ＣＰＰコンジュゲートとして様々な抗癌剤の効率的な送達を研究するためにも使用されている。１つのこのような研究は、固形腫瘍を治療するための、ＣＫ２阻害剤（Ｐ１５）とコンジュゲートしたＴａｔタンパク質の使用を報告している（Ｐｅｒｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４，７１２７－７１２９）。
【0005】
細胞膜を横切って分子を送達できるいくつかの分子輸送体もある。ペプチド剤および非ペプチド剤を含むグアニジニウムリッチの分子輸送体（ＧＲ－ＭｏＴｒｓ）は、グアニジニウム基の数および空間配列により、細胞膜に浸透することが示されている。ＧＲ－ＭｏＴｒｓは、哺乳動物細胞内の小分子、金属、造影剤、鉄粒子、およびタンパク質など、様々なカーゴの送達を増強することができる（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００８，４５２－４７２；Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２，ｅ４９－ｅ５５）。
【0006】
ＵＳ２０１３／０１３７６４４は、細胞透過性ペプチドと、核酸と、細胞膜をより効率的に透過することができる親水性ポリマーと、から構成されるコンジュゲートを開示している。コンジュゲートで使用される核酸は、親水性ポリマーとしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を有する、好ましくはｓｉＲＮＡであると記載されている。
【0007】
ＵＳ２００４／０１７６２８２は、核酸、ポリペプチド、フルオロフォア、分子複合体の細胞送達のための組成物の方法および使用を開示している。細胞透過後の生物学的に活性な分子の細胞内放出は、複合体の光活性化分散によって刺激される。このシステムは、複合体の一部でありながら分子の生物学的機能を抑制するのに役立つが、細胞内に入り、光が活性化されると、分散して生物学的活性を回復することができる。
【0008】
すべての機能性分子の細胞への送達に加えて、かつそれに一般的なのは、細胞送達のために開発されたメカニズムのほとんどが、細胞内への侵入を得るためのエンドサイトーシス依存性メカニズムに依存しているということである。転位の効率は、例えば、薬物がエンドソームに閉じ込められたり、リソソームで分解されたりする可能性があるため、エンドサイトーシス依存性経路における主要な懸念分野である。したがって、より信頼性が高く、効果的であり得る、細胞膜を透過するための新規なメカニズムを考案する差し迫った必要性がある。
【0009】
細胞膜バリアを横切る機能性分子を伴う有望で広く使用されている技術の一例は、生体のゲノムでＤＮＡを編集する（すなわち、１つ以上のヌクレオチドを挿入、欠失、改変、または置換する）ゲノム工学である。
【0010】
ゲノム工学の１つのタイプは、遺伝子治療である。遺伝子治療は、遺伝子の異常な活性を補うため、または有益なタンパク質を提供するために、目的の遺伝子を細胞に送達することを伴う。遺伝子治療は、数ある中でも、慢性リンパ性白血病、Ｘ連鎖ＳＣＩＤ、多発性骨髄腫、血友病などの疾患の治療に有益であることが証明されている。多くの生命を脅かす疾患は、根底にある遺伝的原因を有しており、すなわち、疾患は、１つ以上の関連遺伝子によって示される機能不全または適切な機能の欠如によるものである。遺伝子治療は、このような病状の治療に有望であることが示されている。しかしながら、遺伝子治療は、細胞膜を横切って必要な遺伝子を送達するという点で依然として課題に直面している。現在まで、遺伝子を送達するための２つのアプローチが使用されており、これはウイルスベースおよび非ウイルスベースである。
【0011】
遺伝子治療のためのウイルスベースのアプローチは、所望の遺伝子がクローン化され、形質導入として知られるプロセスを介して必要な細胞に移入されるベクターとして弱毒化ウイルスを利用する。このアプローチには、送達された遺伝子が細胞のゲノムに適切に組み込まれるという利点があるが、他の欠点もあり、その１つは、不適切なゲノム組み込みの場合に癌を誘発する傾向である。非ウイルスベースのアプローチには、単離されたＤＮＡの細胞への注入の使用、およびプラスミドＤＮＡを取り囲むためのカチオン性脂質の使用（リポフェクション）が含まれる。非ウイルスアプローチは、遺伝子をゲノムに組み込む必要がなく、必要な遺伝子を組織内の他の細胞に移入するのに非効率的である。したがって、遺伝子治療は、多くの生命を脅かす障害を治療するための有望で優れた技術であるが、細胞への遺伝子の送達の問題に悩まされている。
【0012】
嚢胞性線維症または筋ジストロフィーなどの最も一般的な遺伝性疾患の場合、遺伝物質を細胞に送達することが難しいため、効果的な遺伝子治療は依然として課題である可能性がある。肺上皮または骨格筋などの組織の細胞のかなりの割合に遺伝子を送達する簡単な方法はまだない（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂ．Ｖｏｌ．２８２．Ｎｏ．１８２１．Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１５）。したがって、遺伝子治療の利点を大幅に増強し、多くの生命を脅かす疾患に有望な治療を提供するための道を広げることができる細胞送達の効果的なメカニズムが必要である。
【0013】
機能性分子が細胞膜バリアを横切る必要があるさらなるタイプのゲノム工学は、遺伝子またはゲノム編集である。ゲノム編集により、典型的には操作されたヌクレアーゼを使用して、ゲノム内の目的の位置に部位特異的な二本鎖切断を作成することができる。次に、これらの切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え（ＨＲ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復され、ゲノムの部位特異的変異または「編集」をもたらす。既知の操作されたヌクレアーゼには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（登録商標））、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＡＲＣヌクレアーゼ（商標）など）、またはＤＮＡガイド型エンドヌクレアーゼなどの核酸ガイド型エンドヌクレアーゼ、および限定されないが、エンドヌクレアーゼＣａｓ９に主に基づく、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムなどのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが挙げられる。
【0014】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ユーザーが指定した場所でＤＮＡに二本鎖切断を作成することにより、ゲノムの標的を絞った編集を容易にする、操作されたＤＮＡ結合タンパク質の部類である。各ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、２つの機能ドメインからなり、１つ目はａ）２本のフィンガーモジュールの鎖で構成されるＤＮＡ結合ドメインであり、それぞれがＤＮＡの固有の六量体（６ｂｐ）配列を認識する。２本のフィンガーモジュールをつなぎ合わせて、それぞれが≧２４ｂｐの特異性を有する、ジンクフィンガータンパク質を形成する。２つ目はｂ）ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメインから構成されるＤＮＡ切断ドメインである。ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインが一緒に融合すると、特異性の高い「ゲノムはさみ」の対が作成される。
【0015】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（登録商標））技術は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成された人工制限酵素を活用する。制限酵素は、特定の配列においてＤＮＡ鎖を切断する酵素である。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥＮ（登録商標））は、実質的に任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように迅速に操作することができる。このように操作されたＴＡＬＥＮ（登録商標）をＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断する）と組み合わせることにより、任意の所望のＤＮＡ配列を特異的に切断する制限酵素を操作することができる。これらの制限酵素が細胞に導入されると、遺伝子編集またはその場でのゲノム編集に使用することができる。
【0016】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集は、エンドヌクレアーゼ、典型的にはＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、および該ヌクレアーゼを特定のゲノム配列に向ける能力を有する１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子を含む多成分分子システムを利用する。ｇＲＮＡがゲノム配列をハイブリダイズする場合、エンドヌクレアーゼはＤＮＡ鎖を切断するように作用する。合成ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９ヌクレアーゼを細胞に送達することにより、細胞のゲノムを所望の位置で切断し、既存の遺伝子を除去し、かつ／または新しい遺伝子を追加することができる（Ｌｅｄｆｏｒｄ，Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５，５２２，７５５４；Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１５，１６３（３），７５９－７７１）。
【0017】
ＣＲＩＳＰＲ技術の重要な工程は、ｇＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）を標的細胞の細胞質および／または核に送達させることである。核酸の細胞への送達はトランスフェクションと呼ばれる。ｇＲＮＡおよびＣａｓ９が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または事前に複合体化されたＲＮＡおよびリボ核タンパク質（ＲＮＰ）と呼ばれるタンパク質のいずれかとして導入することができる。複数の細胞バリア（例えば、原形質膜、核膜）を横切って異物を輸送することは課題である。
【0018】
トランスフェクション法は、物理的、化学的、およびウイルス媒介のカテゴリーに大まかに分類することができる。それぞれの方法には、効率、スループット、機器、スキル、およびコストに関して、様々な長所および短所がある。トランスフェクション法の選択は、ＣＲＩＳＰＲ構成要素のフォーマットにも依存する。
【0019】
ＲＮＡを有するＣａｓ９酵素を含む事前に形成されたリボ核タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ）としてのＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集機構の転位は、遺伝子編集の前にさらなる転写または翻訳が必要ないことを意味する。これにより、必要な手順が少なくなるため、編集を迅速に行うことができる。これは、ＣＲＩＳＰＲ構成要素が細胞に導入されているが、ガイドＲＮＡまたはＣａｓ９をコードするＤＮＡが細胞のゲノムに組み込まれていない一過性トランスフェクションなど、いくつかの状況で役立つ場合がある。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９は、限られた期間だけ細胞のゲノムＤＮＡを切断することができる。しかしながら、細胞膜を横切るこのような大きく多様な高分子のセットの転位は、細胞膜を横切る移入の効率に関して特有の課題を提示する。
【0020】
アデノ随伴ウイルス粒子は一般に遺伝子送達剤として使用されてきたが、安全性の問題および積載容量の制限により、ウイルス担体は理想的ではない送達媒体である（Ｓｗｉｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１５，３３，１０２－１０６）。ゲノム編集システム分子を送達する非ウイルス性手段には、いくつか例を挙げると、脂質ベースのベクター、脂質ナノ粒子、ポリマーベクター、ポリエチレンイミン、およびポリ（Ｌ－リジン）が含まれるが、インビボでのゲノム編集の適用（ＣＲＩＳＰＲツールを使用することによるなど）は、現在使用されている送達アプローチの制限のため、依然として課題である（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５，２６（７），４５２－４６２、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１６，１１３（１１），２８６８－２８７３）。
【0021】
細胞透過性ペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集機構を細胞に輸送することも知られている。ＷＯ２０１７／２０５８４６は、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰのトランスフェクションを促進するための細胞透過性ペプチドＶＥＰＥＰ－３ａ／ｂおよびＡＤＧＮ－１００ａ／ｂの使用について記載している。しかしながら、細胞透過性ペプチドＶＥＰＥＰ－９およびＣＡＤＹは中程度の結合剤にすぎず、細胞透過性ペプチドＶＥＰＥＰ－６は標識Ｃａｓ９および標識Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体との相互作用が不十分であることが明らかになっている。したがって、ＣＰＰの選択が、遺伝子編集機構のトランスフェクションの効率にとって不可欠な決定要因であることは明らかである。遺伝子編集のために文献で使用されている細胞透過性ペプチドは、正に帯電したＣＰＰと負に帯電したＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体との間の強い静電相互作用によるＣａｓ９の免疫反応性および反応性の破壊により、インビボでは限られた使用の可能性を有する（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４５（２００５）５５－６５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１６，１７，６２６；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ１７０５０６２６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0022】
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１３７６４４号
【文献】米国特許出願公開第２００４／０１７６２８２号
【文献】国際公開第２０１７／２０５８４６号
【非特許文献】
【0023】
【文献】Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．；２００５；３３５（３）：７３４－７３８
【文献】Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，１１７３－１１７６
【文献】Ｐｅｒｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４，７１２７－７１２９
【文献】Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００８，４５２－４７２
【文献】Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２，ｅ４９－ｅ５５
【文献】Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂ．Ｖｏｌ．２８２．Ｎｏ．１８２１．Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１５
【文献】Ｌｅｄｆｏｒｄ，Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５，５２２，７５５４；Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１５，１６３（３），７５９－７７１
【文献】Ｓｗｉｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１５，３３，１０２－１０６
【文献】Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５，２６（７），４５２－４６２
【文献】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１６，１１３（１１），２８６８－２８７３
【文献】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４５（２００５）５５－６５
【文献】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１６，１７，６２６；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ１７０５０６２６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0024】
当該技術分野において、様々な細胞膜を介した遺伝子編集機構の移入を容易にするための改善されたまたは代替の効率的な手段が残っている。
【課題を解決するための手段】
【0025】
（発明の概要）
本主題のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明および添付の特許請求の範囲を参照することにより、よりよく理解されるであろう。この概要は、簡略化された形式で概念の選択を紹介するために提供されている。この概要は、主張された主題の主要な特徴または本質的な特徴を特定することを意図しておらず、主張された主題の範囲を制限するために使用されることも意図されていない。
本主題のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明および添付の特許請求の範囲を参照することにより、よりよく理解されるであろう。この概要は、簡略化された形式で概念の選択を紹介するために提供されている。この概要は、主張された主題の主要な特徴または本質的な特徴を特定することを意図しておらず、主張された主題の範囲を制限するために使用されることも意図されていない。
【0026】
第１の態様では、本発明は、ゲノム編集システムの１つ以上の分子に連結された組換えβらせん（ｈｅｌｉｃａｌ）タンパク質の部類を含む標的ポリヌクレオチドを改変するためのゲノム編集複合体を提供し、βらせんタンパク質の長さは、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲であり、幅は、１ｎｍ～５ｎｍの範囲である。
【0027】
第２の態様では、本発明は、ゲノム編集システムの１つ以上の分子をコードするプラスミドに連結された組換えβらせんタンパク質を含む標的ポリヌクレオチドを改変するためのゲノム編集複合体を提供し、βらせんタンパク質の長さは、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲であり、幅は、１ｎｍ～５ｎｍの範囲である。
【0028】
実施形態では、ゲノム編集システムの１つ以上の分子は、以下からなる群から選択される。
ａ．ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
ｂ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
ｃ．転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（登録商標））、
ｄ．ＤＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＤＮＡ、
ｅ．ホーミングエンドヌクレアーゼ、
ｆ．インテグラーゼ。
ａ．ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
ｂ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
ｃ．転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（登録商標））、
ｄ．ＤＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＤＮＡ、
ｅ．ホーミングエンドヌクレアーゼ、
ｆ．インテグラーゼ。
【0029】
好適には、ゲノム編集システムはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９である。
【0030】
実施形態では、ｇＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド中の標的配列に相補的な配列を有する。
【0031】
実施形態では、ゲノム編集から生じる改変は、標的ポリヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換である。
【0032】
実施形態では、βらせんタンパク質は、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲の長さ、および１ｎｍ～５ｎｍの範囲の幅を有する概ね四角形の先端形状を有する。
【0033】
実施形態では、βらせんタンパク質は、アルギニンラダー、リジンラダー、アスパラギンラダー、アスパラギン酸ラダー、およびグルタミン酸ラダーからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸ラダー構造を含む。
【0034】
実施形態では、アルギニンラダーは、１０～２０個のアルギニン残基を含み、リジンラダーは、１０～３０個のリジン残基を含み、アスパラギンラダーは、１０～４０個のアスパラギン残基を含み、アスパラギン酸ラダーは、１０～４０個のアスパラギン酸残基を含み、グルタミン酸ラダーは、１０～４０個のグルタミン酸残基を含む。
【0035】
実施形態では、βらせんタンパク質は、ゼロ未満の総電荷を有する。
【0036】
実施形態では、βらせんタンパク質は、－２０～－６０の総電荷を有する。
【0037】
実施形態では、βらせんタンパク質は、原子間力顕微鏡法によって測定された場合、硬さパラメータＫ（ベータヘリックス）０．２～１２Ｎ／ｍ２を有するβらせん構造を有する。
【0038】
実施形態では、βらせんタンパク質は、ペンタペプチドリピートタンパク質である。
【0039】
実施形態では、βらせんタンパク質は、コンセンサス配列（ＳＴＡＶ）１（ＤＮ）２（ＬＦ）３（ＳＴＲ）４（Ｇ）５を有するタンデムリピートペンタペプチドを含む。
【0040】
実施形態では、βらせんタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表される。
【0041】
実施形態では、組換えβらせんタンパク質は、非共有相互作用によって、ゲノム編集システムの１つ以上の分子またはプラスミドに連結されている。
【0042】
実施形態では、非共有相互作用は、水素結合、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、またはこれらの組み合わせを含む群から選択される。
【0043】
実施形態では、組換えβらせんタンパク質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレンジアミン、ペプチド、金属コンジュゲート、薬物－金属コンジュゲート、ＤＮＡ結合ドメイン、核酸挿入分子およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるリンカー分子を介して、ゲノム編集システムの１つ以上の分子またはプラスミドに連結される。
【0044】
実施形態では、リンカー分子がペプチドである場合、ペプチドは、脂肪族アミノ酸、芳香族アミノ酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸を含む。
【0045】
実施形態では、リンカーは、共有結合、非共有結合、およびこれらの組み合わせによって組換えβらせんタンパク質に連結されている。
【0046】
実施形態では、組換えβらせんタンパク質は、エステル結合またはアミド結合を介して、ゲノム編集システムの１つ以上の分子またはプラスミドに連結されている。
【0047】
実施形態では、ゲノム編集複合体は、シグナル配列をさらに含み、シグナル配列は、ゲノム編集複合体を特定の細胞または細胞の一部に向ける。
【0048】
実施形態では、シグナル配列は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７からなる群から選択される。
【0049】
実施形態では、ゲノム編集複合体は、ホスファチジルコリン分子をさらに含む。
【0050】
実施形態では、ゲノム編集複合体は、ゲノム編集システムの１つ以上の分子またはプラスミドを、細胞小器官、核、およびＰ－カドヘリン過剰発現乳癌細胞からなる群から選択される位置へ移入させる。
【0051】
実施形態では、ゲノム編集複合体は、ゲノム編集のために使用される。
【0052】
第３の態様では、本発明は、細胞透過性タンパク質を１つ以上のゲノム編集システム分子と組み合わせ、それによってゲノム編集複合体を形成することを含む、本発明の第１の態様のゲノム編集複合体を調製する方法を提供する。
【0053】
本発明の第３の態様の実施形態では、１つ以上のゲノム編集システム分子は、細胞透過性タンパク質とゲノム編集システムとの間の複合体形成を安定化する分子を含有する反応緩衝液中にある。反応緩衝液は、複合体の様々な成分間の静電相互作用を最適化するために、イオン強度に基づいて選択することができる。イオン強度は、緩衝液中の成分、例えば塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の選択によって変化させてもよい。
【0054】
あるいは、第４の態様では、本発明は、細胞透過性タンパク質をプラスミドと組み合わせ、それによってゲノム編集複合体を形成することを含む、本発明の第２の態様のゲノム編集複合体を調製する方法を提供する。
【0055】
第５の態様では、本発明は、ゲノム編集システムの１つ以上の分子を細胞に移入させるためのプロセスを提供し、該プロセスは、
ａ）ゲノム編集システムの１つ以上の分子を組換えβらせんタンパク質に連結して、コンジュゲートまたはゲノム編集複合体を得ることと、
ｂ）コンジュゲートまたはゲノム編集複合体を少なくとも１つの細胞と接触させることと、を含み、
工程（ｂ）のコンジュゲートまたはゲノム編集複合体を接触させることが、ゲノム編集システムの１つ以上の分子を細胞に移入させ、βらせんタンパク質の長さが、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲であり、幅が、１ｎｍ～５ｎｍの範囲である。好適には、このプロセスは、工程（ｂ）の後、細胞内のゲノム編集複合体の移入を検出することを含む。
ａ）ゲノム編集システムの１つ以上の分子を組換えβらせんタンパク質に連結して、コンジュゲートまたはゲノム編集複合体を得ることと、
ｂ）コンジュゲートまたはゲノム編集複合体を少なくとも１つの細胞と接触させることと、を含み、
工程（ｂ）のコンジュゲートまたはゲノム編集複合体を接触させることが、ゲノム編集システムの１つ以上の分子を細胞に移入させ、βらせんタンパク質の長さが、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲であり、幅が、１ｎｍ～５ｎｍの範囲である。好適には、このプロセスは、工程（ｂ）の後、細胞内のゲノム編集複合体の移入を検出することを含む。
【0056】
第６の態様では、本発明は、ゲノム編集システムの１つ以上の分子を細胞に移入させるためのプロセスを提供し、該プロセスは、
ｄ）プラスミドを組換えβらせんタンパク質に連結して、コンジュゲートまたはゲノム編集複合体を得ることと、
ｅ）コンジュゲートまたはゲノム編集複合体を少なくとも１つの細胞と接触させることと、を含み、
工程（ｄ）のコンジュゲートまたはゲノム編集複合体を接触させることが、プラスミドを細胞に移入させ、βらせんタンパク質の長さが、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲であり、幅が、１ｎｍ～５ｎｍの範囲である。好適には、このプロセスは、工程（ｄ）の後、細胞内のゲノム編集複合体の移入を検出することを含む。
ｄ）プラスミドを組換えβらせんタンパク質に連結して、コンジュゲートまたはゲノム編集複合体を得ることと、
ｅ）コンジュゲートまたはゲノム編集複合体を少なくとも１つの細胞と接触させることと、を含み、
工程（ｄ）のコンジュゲートまたはゲノム編集複合体を接触させることが、プラスミドを細胞に移入させ、βらせんタンパク質の長さが、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲であり、幅が、１ｎｍ～５ｎｍの範囲である。好適には、このプロセスは、工程（ｄ）の後、細胞内のゲノム編集複合体の移入を検出することを含む。
【0057】
第５および第６の態様の実施形態では、ゲノム編集システムの１つ以上の分子は、以下からなる群から選択される。
ａ．ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
ｂ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
ｃ．転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（登録商標））、
ｄ．ＤＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＤＮＡ、
ｅ．ホーミングエンドヌクレアーゼ、
ｆ．インテグラーゼ。
ａ．ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
ｂ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
ｃ．転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（登録商標））、
ｄ．ＤＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＤＮＡ、
ｅ．ホーミングエンドヌクレアーゼ、
ｆ．インテグラーゼ。
【0058】
実施形態では、ゲノム編集システムはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９である。
【0059】
実施形態では、ｇＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド中の標的配列に相補的な配列を有する。
【0060】
実施形態では、ゲノム編集から生じる改変は、標的ポリヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換である。
【0061】
実施形態では、工程ａ）においてゲノム編集複合体を得るために、ゲノム編集システムの１つ以上の分子を組換えβらせんタンパク質に連結することが、組換えβらせんタンパク質とゲノム編集システムの１つ以上の分子との間の複合体形成を安定化する分子を含有する反応緩衝液中で行われ、かつ／またはゲノム編集システムの１つ以上の分子の細胞への移入が、無血清培地中で行われる。
【0062】
実施形態では、βらせんタンパク質は、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲の長さ、および１ｎｍ～５ｎｍの範囲の幅を有する概ね四角形の先端形状を有する。
【0063】
実施形態では、βらせんタンパク質は、アルギニンラダー、リジンラダー、アスパラギンラダー、アスパラギン酸ラダー、およびグルタミン酸ラダーからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸ラダー構造を含む。
【0064】
実施形態では、存在する場合、アルギニンラダーは、１０～２０個のアルギニン残基を含み、リジンラダーは、１０～３０個のリジン残基を含み、アスパラギンラダーは、１０～４０個のアスパラギン残基を含み、アスパラギン酸ラダーは、１０～４０個のアスパラギン酸残基を含み、グルタミン酸ラダーは、１０～４０個のグルタミン酸残基を含む。
【0065】
実施形態では、βらせんタンパク質は、ゼロ未満の総電荷を有する。
【0066】
実施形態では、βらせんタンパク質は、－２０～－６０の総電荷を有する。
【0067】
実施形態では、βらせんタンパク質は、原子間力顕微鏡法によって測定された場合、０．２～１２Ｎ／ｍ２の硬さパラメータＫを有するβらせん構造（ベータヘリックス）を有する。
【0068】
実施形態では、βらせんタンパク質は、ペンタペプチドリピートタンパク質である。
【0069】
実施形態では、βらせんタンパク質は、コンセンサス配列（ＳＴＡＶ）１（ＤＮ）２（ＬＦ）３（ＳＴＲ）４（Ｇ）５を有するタンデムリピートペンタペプチドを含む。
【0070】
実施形態では、βらせんタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表される。
【0071】
実施形態では、ゲノム編集複合体は、本発明の第１または第２の態様のゲノム編集複合体である。
【0072】
実施形態では、細胞は、真核細胞、原核細胞、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0073】
実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、または魚類細胞である。
【0074】
第７の態様では、本発明は、細胞を第１または第２の態様のゲノム編集複合体と接触させることを含む、細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供し、ゲノム編集複合体は、標的ポリヌクレオチド中の配列を標的とする。
【0075】
第８の態様では、本発明は、本発明の第１または第２の態様のゲノム編集複合体を含む医薬組成物を提供する。
【0076】
第９の態様では、本発明は、有効量の本発明の第７の態様の医薬組成物を個体に投与することを含む、個体の疾患を治療する方法を提供する。
【0077】
第１０の態様では、本発明は、遺伝子編集のための本発明の第１または第２の態様のゲノム編集複合体の使用を提供する。
【0078】
第１１の態様では、本発明は、遺伝子治療のための本発明の第１または第２の態様のゲノム編集複合体の使用を提供する。
【0079】
また、機能性分子に連結された少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質分子を含む細胞透過性コンジュゲートが本明細書に開示され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲である。
【0080】
機能性分子を細胞に移入するためのプロセスがさらに開示され、該プロセスは、
（ａ）機能性分子を組換えβらせんタンパク質に連結させてコンジュゲートを得ることと、
（ｂ）細胞透過性コンジュゲートを少なくとも１つの細胞と接触させることと、を含み、コンジュゲートを少なくとも１つの細胞と接触させることが、核酸分子を細胞に移入させ、βらせんタンパク質の長さが５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅が１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲である。
（ａ）機能性分子を組換えβらせんタンパク質に連結させてコンジュゲートを得ることと、
（ｂ）細胞透過性コンジュゲートを少なくとも１つの細胞と接触させることと、を含み、コンジュゲートを少なくとも１つの細胞と接触させることが、核酸分子を細胞に移入させ、βらせんタンパク質の長さが５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅が１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲である。
【0081】
また、機能性分子を細胞に送達するための本発明の第１の態様の細胞透過性コンジュゲートの使用が本明細書に開示され、機能性分子は、染料、薬物、金属、薬物－金属、タンパク質、酵素、抗体、核酸、多糖類、核局在化シグナル、ナノ粒子およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0082】
細胞透過のための本発明の第１の態様の細胞透過性コンジュゲートの使用が、本明細書にさらに開示される。
【0083】
さらに、細胞標識のための本発明の第１の態様の細胞透過性コンジュゲートの使用が、本明細書に開示される。
【0084】
また、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが、本明細書に開示され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲である。
【0085】
核酸分子を細胞に移入させるためのプロセスが、本明細書にさらに開示され、該プロセスは、（ｉ）核酸分子を、少なくとも１つのリンカーを介して、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質に連結してコンジュゲートを得ることと、（ｉｉ）コンジュゲートを少なくとも１つの細胞と接触させることと、を含み、コンジュゲートを少なくとも１つの細胞と接触させることが、核酸分子を細胞に移入させ、組換えβらせんタンパク質の長さが５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅が１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲である。
【0086】
さらに、トランスフェクション剤としての本発明の第６の態様の細胞透過性コンジュゲートの使用が、本明細書に開示される。
【0087】
遺伝子治療のための本発明の第６の態様の細胞透過性コンジュゲートの使用が、本明細書にさらに開示される。
【図面の簡単な説明】
【0088】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の態様をさらに説明するために含まれている。本開示は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて図面を参照することによってよりよく理解され得る。
【図1】本開示による、単離されたＡｌｂＧタンパク質のＣＤ（円偏光二色性）スペクトルを示す。
【図2】本開示による、精製プラスミド（ＡｌｂＧおよびＥｆｓＱＮＲ遺伝子を含有する）を含有するアガロースゲルを示す。
【図3】本開示による、精製タンパク質（ＡｌｂＧおよびＥｆｓＱＮＲ）を含有するポリアクリルアミドゲルを示す。
【図4】ＥｆｓＱＮＲおよびＡｌｂＧタンパク質のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量スペクトル分析を示す。
【図5】本開示の一実施形態による、ＵＶ－可視分光光度法による標識タンパク質（ＡｌｂＧ－ＮＨＳＣおよびＥｆｓＱＮＲ－ＮＨＳＣ）の特性評価のグラフ表示を示す。
【図6】本開示の実施形態による、標識タンパク質（コンジュゲート）ＡｌｂＧ－ＮＨＳＣ、ＥｆｓＱＮＲ－ＮＨＳＣおよびＴｔＣｕＡ－ＮＨＳＣによるＨｅｌａ細胞の差次標識を示す。
【図7】本開示の一実施形態による、ＡＴＴＯ－５２０（市販の緑色蛍光染料）で標識されたＥｆｓＱＮＲによるＨｅｌａ細胞の標識を示す。
【図8】本開示の一実施形態による、ＡＴＴＯ－３９０（市販の青色蛍光染料）で標識されたＥｆｓＱＮＲによるＨｅｌａ細胞の標識を示す。
【図9】本開示の一実施形態による、ＡＴＴＯ－５２０（市販の緑色蛍光染料）で標識されたＥｆｓＱＮＲによるミクログリア細胞の標識を示し（パネルＡ）、かつＡＴＴＯ－５２０で標識されたＥｆｓＱＮＲによるミクログリア細胞の差次標識を示す（パネルＢ）。
【図10】本開示の一実施形態による、ＡＴＴＯ－５２０（市販の緑色蛍光染料）で標識されたＥｆｓＱＮＲによるケラチノサイト細胞の標識を示し（パネルＡ）、かつＡＴＴＯ－５２０で標識されたＥｆｓＱＮＲによるケラチノサイト細胞の差次標識を示す（パネルＢ）。
【図11】本開示の一実施形態による、ＡＴＴＯ－５２０（市販の緑色蛍光染料）で標識されたＥｆｓＱＮＲによるＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の標識を示す。
【図12】本開示の一実施形態による、ＡＴＴＯ－５２０（市販の緑色蛍光染料）で標識されたＥｆｓＱＮＲによるマウスＥＳ細胞の標識を示す。
【図13】本開示の一実施形態による、ＡＴＴＯ－５２０（市販の緑色蛍光染料）で標識されたＥｆｓＱＮＲによるＥ．ｃｏｌｉ細胞の標識を示す。
【図14】本開示の一実施形態による、ＡＴＴＯ－５２０（市販の緑色蛍光染料）で標識されたＥｆｓＱＮＲによる酵母（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）細胞の標識を示す。
【図15A】コンジュゲートＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－６４７Ｎで標識したコンジュゲートで１０分間（パネルＢ）、１時間（パネルＣ）、３時間（パネルＤ）処理したＨｅＬａ細胞の標準ＦＡＣＳソーティングの結果を未処理細胞（パネルＡ）と比較して示す。
【図15B】コンジュゲートＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－６４７Ｎで標識したコンジュゲートで１０分間（パネルＢ）、１時間（パネルＣ）、３時間（パネルＤ）処理したＨｅＬａ細胞の標準ＦＡＣＳソーティングの結果を未処理細胞（パネルＡ）と比較して示す。
【図15C】コンジュゲートＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－６４７Ｎで標識したコンジュゲートで１０分間（パネルＢ）、１時間（パネルＣ）、３時間（パネルＤ）処理したＨｅＬａ細胞の標準ＦＡＣＳソーティングの結果を未処理細胞（パネルＡ）と比較して示す。
【図15D】コンジュゲートＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－６４７Ｎで標識したコンジュゲートで１０分間（パネルＢ）、１時間（パネルＣ）、３時間（パネルＤ）処理したＨｅＬａ細胞の標準ＦＡＣＳソーティングの結果を未処理細胞（パネルＡ）と比較して示す。
【図16】非コンジュゲート薬物と比較した、本開示の一実施形態によるコンジュゲートの一部としての薬物の細胞取り込み率を示す。
【図17】非コンジュゲート薬物と比較した、本開示の一実施形態による、タンパク質ＥｆｓＱＮＲとのコンジュゲートの一部としてのシスプラチン（登録商標）化学療法薬（標識ＣＹＤＤ）での処理後の細胞（ＨｅｌａおよびＨｅｐＧ２）の生存率を示す。
【図18】本開示の一実施形態による、ｍｃｈｅｒｒｙ遺伝子を保有するプラスミドベクターを示す。
【図19】本開示の一実施形態による、コンジュゲートを調製するためのプロセスを示す。
【図20】本開示の一実施形態による、コンジュゲートを使用するトランスフェクションの表現を示す。
【図21】本発明によるコンジュゲートでトランスフェクションした後のＨｅＬａ細胞の共焦点顕微鏡画像を示し、このコンジュゲートは、銅［ＩＩ］フェナントロリンを介してＥｆｓＱＮＲタンパク質に連結したＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）をコードするｍｃｈｅｒｒｙ遺伝子を含む。
【図22】本発明による、ＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ５２０コンジュゲートによる細胞膜のリアルタイムの直接透過を示す。
【図23】本開示の一実施形態による、ＡＴＴＯ－５２０（市販の緑色蛍光染料）で標識されたＣＰＰによる植物シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）細胞の標識を示す。
【図23】本開示の一実施形態による、ＡＴＴＯ－５２０（市販の緑色蛍光染料）で標識されたＣＰＰによる植物シロイヌナズナ細胞の標識を示す。
【図24】本開示の一実施形態による、Ａ）ＡＴＴＯ－５２０（市販の緑色蛍光染料）で標識されたＣＰＰ、Ｂ）ＡＴＴＯ－５９４（市販の赤色蛍光染料）で標識されたＣＰＰ、およびＣ）ＡＴＴＯ－３９０（市販の青色蛍光染料）で標識されたＣＰＰによる植物シロイヌナズナ細胞の標識を示す。
【図25】本開示の一実施形態による、ＡＴＴＯ－５２０（市販の緑色蛍光染料）で標識されたＣＰＰによる酵母細胞の標識を示す。
【図26】本開示の一実施形態による、ＡＴＴＯ－５２０（市販の緑色蛍光染料）で標識されたＣＰＰによる細菌細胞の標識を示す。
【図27】本開示の一実施形態による、ＡＴＴＯ－５２０（市販の緑色蛍光染料）で標識されたＣＰＰによるショウジョウバエ胚細胞の標識を示す。
【図28】本開示の一実施形態による、ＡＴＴＯ－５２０（市販の緑色蛍光染料）で標識されたＣＰＰによるゼブラフィッシュ胚細胞の標識を示す。
【図29】ｅＧＦＰによる蛍光強度の低下（蛍光プレートリーダーで測定）により観察された、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９およびｅＧＦＰ特異的ｇＲＮＡのＣＰＰ支援送達後にｅＧＦＰを発現するＨＥＫ２９３細胞の遺伝子編集の結果を示す。
【図30】実施例１で得られたコンジュゲート（ＥｆｓＱＮＲ）（配列番号２）およびＭｉｒｕｓ Ｂｉｏから市販されている２．７ｋｂの赤色標識環状プラスミドＤＮＡ（製品コードＭＩＲ ７９０４）、および（Ｂ）コンジュゲートの非存在下で上記で使用した対照の赤色標識プラスミドを使用したＭＣＦ７細胞におけるトランスフェクションの結果は、（ｉ）はインキュベーション後の細胞の最大投射を示し、（ｉｉ）はインキュベーション後の細胞の強度プロットに対応する画像であり、（ｉｉｉ）はインキュベーション後の細胞の強度プロットを示す。
【図31】実施例１で得られたコンジュゲート（ＥｆｓＱＮＲ）および（ｉ）赤色蛍光タンパク質または（ｉｉ）緑色蛍光染料Ａｔｔｏ５２０のいずれかでタグ付けされたエンドヌクレアーゼＣａｓ９を使用したＭＣＦ－７細胞におけるトランスフェクション実験の結果を示す。（Ａ）はインキュベーション後の細胞の最大投射を示し、（Ｂ）はインキュベーション後の細胞の強度プロットを示し、（Ｃ）は細胞の３Ｄ深度画像を示している。
【図32】（Ａ）実施例１で得られたコンジュゲート（ＥｆｓＱＮＲ）および緑色蛍光染料ＭＦＰ４８８でタグ付けされたｇＲＮＡ、および（Ｂ）緑色蛍光染料ＭＦＰ４８８でタグ付けされた対照ｇＲＮＡを使用したＭＣＦ－７細胞におけるトランスフェクション実験の結果を示す。（ｉ）はインキュベーション後の細胞の最大投射を示し、（ｉｉ）は細胞の３Ｄ深度画像を示し、（ｉｉｉ）はインキュベーション後の細胞の強度プロットに対応する画像であり、（ｉｖ）はインキュベーション後の細胞の強度プロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【0089】
当業者は、本開示が、具体的に記載されたもの以外の変更および修正の対象となることに気付くであろう。本開示は、このようなすべての変更および修正を含むことを理解されたい。本開示はまた、本明細書において個別にまたは集合的に言及または示されるこのようなすべての工程、特徴、組成物、および化合物、ならびにこのような工程または特徴のいずれかまたは複数の任意およびすべての組み合わせを含む。
【0090】
定義
便宜上、本開示のさらなる説明の前に、本明細書で使用される特定の用語、および例がここに描かれている。これらの定義は、本開示の残りの部分に照らして読み、当業者によって理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、当技術分野の当業者に認識され、知られている意味を有するが、便宜上および完全を期すために、特定の用語およびそれらの意味を以下に示す。
便宜上、本開示のさらなる説明の前に、本明細書で使用される特定の用語、および例がここに描かれている。これらの定義は、本開示の残りの部分に照らして読み、当業者によって理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、当技術分野の当業者に認識され、知られている意味を有するが、便宜上および完全を期すために、特定の用語およびそれらの意味を以下に示す。
【0091】
別段の指示のない限り、本発明の実施は、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、および化学的方法の従来技術を使用するものであり、これらは当業者の能力の範囲内である。そのような技術は、例えば、Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ １－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ １６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）、Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ Ａ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ，１９９０，Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、およびＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどの文献においても説明されている。これらの一般的なテキストの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0092】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、冠詞の文法目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。
【0093】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、規定される要素のうちのいずれかが必ず含まれ、他の要素も同様に任意に含まれ得ることを意味する。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、任意の規定される要素が必ず含まれ、列挙される要素の基本的および新規の特性に実質的に影響を及ぼす要素が除外され、他の要素が任意に含まれ得ることを意味する。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、列挙される要素以外のすべての要素が除外されることを意味する。これらの用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【0094】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「含むがこれに限定されない」を意味するために使用される。「含む」と「含むがこれに限定されない」は同じ意味で使用される。
【0095】
本明細書で使用される場合、「細胞膜」という用語は、原核細胞および真核細胞の両方に存在し、細胞の内部環境と外部環境とを分離する生体膜である。これは、細胞内外への物質の輸送をチェックする半透性バリアとして機能し、典型的には、リン脂質二重層から形成されている。膜は支持体として機能し、細胞の形状および構造を維持するのに役立つ。
【0096】
本明細書で使用される場合、「βらせん（ｈｅｌｉｃａｌ）タンパク質」という用語は、βらせん二次構造を形成するタンパク質を意味する。βらせんタンパク質は、ペプチド鎖の隣接するβストランド間の一般的に平行対合から形成される。βらせんタンパク質は、ヘリックス構造のコイリングの方向に応じて、右巻きのβらせんまたは左巻きのβらせんになり得る。
【0097】
本明細書で使用される場合、「ペンタペプチドリピートタンパク質（ＰＲＰ）」という用語は、タンデムリピートペンタペプチドからなるβらせんタンパク質を意味する。実施形態では、タンデムリピートペンタペプチドは、コンセンサス配列（ＳＴＡＶ）１（ＤＮ）２（ＬＦ）３（ＳＴＲ）４（Ｇ）５を有する。ＰＲＰファミリーには、原核生物および真核生物界に５００をはるかに超えるメンバーを有する。
【0098】
本明細書で使用される場合、「機能性分子」という用語は、細胞内で有用性を有する任意の分子である。本発明での使用に適した機能性分子の例には、染料、薬物分子、タンパク質、酵素、抗体、および核酸が挙げられる。
【0099】
本明細書で使用される場合、「細胞透過性ペプチド」または「ＣＰＰ」という用語は、様々な機能性分子の細胞摂取／取り込みを促進するペプチド配列に関するものである。細胞透過性ペプチドは、一般に、細胞膜を介して機能性分子を直接送達し、細胞侵入のためのエンドサイトーシス媒介経路の必要性を回避する。
【0100】
本明細書で使用される場合、「Ｐ－カドヘリン」という用語は、正常組織において恒常性機能を有する細胞間接着分子を指す。この分子の過剰発現は、乳房、卵巣、前立腺、子宮内膜、皮膚、胃、膵臓、および結腸の新生物における重要な腫瘍促進効果に関連している。
【0101】
本明細書で使用される場合、「ＮＨＳ－クマリン」または「ＮＨＳＣ」という用語は、細胞生物学技術で広く使用されている蛍光染料を指す。これは、分子量３５８．３５ｇ／ｍｏｌの７－（ジエチルアミノ）クマリン－３－カルボン酸Ｎ－スクシンイミジルエステルの通称である。ＮＨＳ－クマリン（ＮＨＳＣ）は、４４５ｎｍの励起波長、および４８２ｎｍの発光波長を有する。蛍光顕微鏡下で観察すると、緑色の蛍光を発し、この染料とコンジュゲートした分子の位置および定量を示す。
【0102】
本明細書で使用される場合、「ホスファチジルコリン」という用語は、コリンをヘッド基として組み込むリン脂質分子の部類を定義する。ホスファチジルコリンは、細胞膜との選択的結合および付着を促進するシグナル伝達分子として使用することができる。
【0103】
本明細書で使用される場合、「ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２」という用語は、細胞撮像技術におけるＤＮＡおよび核の固定と生細胞染色との両方に使用される蛍光染料の溶液を指す。ヘキスト３３３４２は、４６０ｎｍの励起波長、４９０ｎｍの発光波長を有する細胞透過性ＤＮＡ染色剤であり、ＤＮＡのアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）領域に優先的に結合する。
【0104】
本明細書で使用される場合、「ＡＴＴＯ ５２０」または「Ａ－５２０」、「ＡＴＴＯ ３９０」または「Ａ－３９０」および「ＡＴＴＯ ６４７Ｎ」または「Ａ－６４７Ｎ」という用語は、それぞれ、ＡＴＴＯ－Ｔｅｃ ＧｍｂＨにより開発され、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている蛍光染料を指す。
【0105】
本明細書で使用される場合、「ルテニウム金属錯体」という用語は、抗癌活性を有することが知られているルテニウム金属の配位錯体を指す。八面体型ルテニウム（ＩＩＩ）およびルテニウム（ＩＩ）錯体は、多くの実験的腫瘍に対して抗新生物活性を示す。ルテニウム金属錯体は、白金ベースの化合物の副作用を回避するための優れた代替物とみなされている。本発明での使用が実証されているルテニウム金属錯体の非限定的な例は、トリカルボニルジクロロルテニウム（ＩＩ）（例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）である。
【0106】
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、各ヌクレオチドの３’および５’末端がホスホジエステル結合によって接合された、ヌクレオチドの一本鎖または二本鎖の共有結合配列である。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基で構成され得る。核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡを挙げることができ、典型的には合成的に製造されるが、天然の供給源から単離される場合もある。核酸は、改変されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、例えば、メチル化されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、または化学改変、例えば、７－メチルグアノシンによる５’キャッピング、切断およびポリアデニル化などの３’プロセシング、ならびにスプライシング、またはフルオロフォアもしくは他の化合物による標識を受けたＤＮＡもしくはＲＮＡをさらに含み得る。核酸はまた、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）などの合成核酸（ＸＮＡ）も含み得る。したがって、「ＤＮＡ」および「ＲＮＡ」という用語が本明細書で使用される場合、これらの用語は、天然に存在するヌクレオチドのみを含むことに限定されないことを理解されたい。本明細書で「ポリヌクレオチド」とも呼ばれる核酸のサイズは、典型的には、二本鎖ポリヌクレオチドの場合は、塩基対の数（ｂｐ）として、または一本鎖ポリヌクレオチドの場合は、ヌクレオチドの数（ｎｔ）として表される。１０００ｂｐまたはｎｔは、１キロベース（ｋｂ）に等しい。約１００ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチドは、典型的には「オリゴヌクレオチド」と称される。
【0107】
本明細書で使用される場合、「３」（「３プライム」）および「５」（「５プライム」）という用語は、当該技術分野においてそれらの通常の意味をとり、すなわち、ポリヌクレオチドの末端を区別するためである。ポリヌクレオチドは５’および３’末端を有し、ポリヌクレオチド配列は通常５’から３’方向に書かれている。
【0108】
本発明の文脈における「アミノ酸」という用語は、その最も広い意味で使用され、天然に存在するＬα－アミノ酸または残基を含むことを意味する。本明細書では、天然に存在するアミノ酸に対して一般的に使用される１文字および３文字の略語を使用する。Ａ＝Ａｌａ、Ｃ＝Ｃｙｓ、Ｄ＝Ａｓｐ、Ｅ＝Ｇｌｕ、Ｆ＝Ｐｈｅ、Ｇ＝Ｇｌｙ、Ｈ＝Ｈｉｓ、Ｉ＝Ｉｌｅ、Ｋ＝Ｌｙｓ、Ｌ＝Ｌｅｕ、Ｍ＝Ｍｅｔ、Ｎ＝Ａｓｎ、Ｐ＝Ｐｒｏ、Ｑ＝Ｇｌｎ、Ｒ＝Ａｒｇ、Ｓ＝Ｓｅｒ、Ｔ＝Ｔｈｒ、Ｖ＝Ｖａｌ、Ｗ＝Ｔｒｐ、およびＹ＝Ｔｙｒ（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｌ．，（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｄ ｅｄ．，ｐｐ．７１－９２，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。一般的な用語である「アミノ酸」には、Ｄ－アミノ酸、レトロインベルソアミノ酸、ならびにアミノ酸類似体などの化学的に改変されたアミノ酸、ノルロイシンなどのタンパク質には通常組み込まれない天然に存在するアミノ酸、およびβ－アミノ酸などのアミノ酸に特徴的な特性を有する化学的に合成された化合物がさらに含まれる。例えば、フェニルアラニンまたはプロリンの類似体または模倣体は、天然のＰｈｅまたはＰｒｏと同じペプチド化合物のコンホメーション制限を可能にし、アミノ酸の定義に含まれる。このような類似体および模倣物は、本明細書では、それぞれのアミノ酸の「機能的等価物」と呼ばれる。アミノ酸の他の例は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｖｅｌｌａｃｃｉｏ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．，Ｖｏｌ．５ｐ．３４１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．１９８３によって列挙されている。
【0109】
「ポリペプチド」は、天然に、または合成手段によってインビトロで生成されるかどうかにかかわらず、ペプチド結合によって接合されたアミノ酸残基のポリマーである。約１２個のアミノ酸残基長未満のポリペプチドは、典型的には、「ペプチド」と称され、約１２～約３０個のアミノ酸残基長のポリペプチドは、「オリゴペプチド」と称され得る。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、天然に存在するポリペプチド、前駆体形態、またはプロタンパク質の産物を示す。また、ポリペプチドは、グリコシル化、タンパク質分解切断、脂質化、シグナルペプチド切断、プロペプチド切断、リン酸化などを含み得るが、これらに限定されない、成熟または翻訳後改変プロセスを受ける可能性がある。「タンパク質」という用語は、１つ以上のポリペプチド鎖を含む高分子を指すために本明細書で使用される。
【0110】
「単離された」という用語は、ポリヌクレオチドまたはタンパク質配列に適用される場合、配列がその起源である天然生物から除去され、したがって、外来のまたは望ましくないコード配列または調節配列を含まないことを意味する。単離された配列は、本発明の組成物およびナノ構造の組み立てに使用するのに好適である。そのような単離された配列は、ｃＤＮＡおよびＲＮＡを含み得る。
【0111】
本発明によれば、本明細書に記載の核酸またはタンパク質配列に対する相同性は、単に１００％の配列同一性に限定されない。機能的および／または生化学的同等性を示す、本明細書で特定されたものに密接に関連する核酸またはタンパク質配列は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であるとみなされる。
【0112】
本発明の文脈における「シグナル配列」という用語は、異なる細胞小器官またはジンクフィンガー結合タンパク質などの核酸結合ドメインの核局在化配列または認識配列を意味する。
【0113】
本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、薬物の送達および有効性を改善するためのメカニズムとして役立つ物質を意味する。
【0114】
本明細書で使用される場合、「希釈剤」（充填剤、希釈剤、またはシンナーとも呼ばれる）という用語は、希釈剤を意味する。
【0115】
本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、薬物または他の活性物質のためのビヒクルまたは媒体として機能する不活性物質を指す。賦形剤には、着色剤、保湿剤、防腐剤、皮膚軟化剤、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【0116】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ」という用語は、エンドヌクレアーゼ活性および特異性が、少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子との結合に依存するポリペプチドを意味する。ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼの例は、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムの一部としてのＣａｓ９である。
【0117】
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ」（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）という用語は、細菌などの原核生物のゲノム内に見られるＤＮＡ配列のファミリーを指す。この用語は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の使用、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列に相補的であるＤＮＡの特異的鎖を認識して切断するために、ＣＲＩＳＰＲ配列と結合して、ＣＲＩＳＰＲ配列をガイドとして使用することができるＣａｓ－９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）の使用に依存する遺伝子編集の技術を指すために使用されてもよい。Ｃａｓ９ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ配列とともに、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術の基礎を形成する。
【0118】
本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ９」という用語は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼタンパク質を指す。Ｃｓｎ１（ＣＯＧ３５１３）とも呼ばれるＣａｓ９は、ｃｒＲＮＡの生合成および侵入するＤＮＡの破壊の両方に関与する大きなタンパク質である。「Ｃａｓ９」という用語はまた、標的核酸配列を処理することができる操作されたエンドヌクレアーゼまたはＣａｓ９の相同体を包含することを意味する。Ｃａｓ９は、二本鎖切断または一本鎖切断のいずれかに対応することができる核酸標的配列の切断を誘導することができる。Ｃａｓ９という用語は、自然界には自然に存在しないＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、タンパク質工学またはランダム変異誘発によって得られるバリアントを含むことを意図しているが、ただし、このようなＣａｓ９バリアントは機能し続け、すなわち、標的核酸配列を処理する能力を保持する。
【0119】
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼタンパク質および１つ以上のガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲリボヌクレオチドに関するものである。本明細書で使用される「ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ－ＣＰＰ」という用語は、本発明の実施形態の細胞透過性ペプチドとのＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ複合体のコンジュゲートに関するものである。
【0120】
本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は、ガイド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチド配列を指す。使用中、ガイドＲＮＡは、ｇＲＮＡによって決定された部位で二本鎖ＤＮＡを切断するように作用するエンドヌクレアーゼと関連付けることができる。「ガイド配列」という用語は、好ましくは８個の核酸塩基より長く、より好ましくは１０個の核酸塩基より長く、さらにより好ましくは１２個の核酸塩基より長い、ゲノム中の標的配列を特定する能力を有する配列を指す。一般に、このＲＮＡ分子は、該標的配列をハイブリダイズし、該エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼ活性を媒介する能力を有する。
【0121】
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、「変異体」または「バリアント」形態とは区別される、生物、株、遺伝子または総合特性の典型的または自然発生形態を指す。
【0122】
本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」または「操作された」という用語は交換可能に使用される。核酸分子またはポリペプチドを指す場合、この用語は、核酸分子またはポリペプチドが自然界に見られるものとは異なり、かつ／またはそれらが自然界に自然に関連する少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
【0123】
本明細書で使用される場合、「相補性」という用語は、例えば、水素結合を介した非共有相互作用と、従来のワトソン－クリック型塩基対または他の非従来のタイプのいずれかによる別の核酸配列と結合する核酸の能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（ワトソン－クリック型塩基対）を形成することができる核酸分子中の残基の比率を示す（例えば、１０個のうち５、６、７、８、９、１０個が、５０％、６０％、７０％、８０％／、９０％、および１００％の相補的）。
【0124】
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドがＤＮＡテンプレートから転写されるプロセス（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物）および／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。
【0125】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料を、本開示の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をここに記載する。本明細書に記載されているすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0126】
配列
配列番号１は、ＡｌｂＧタンパク質のアミノ酸配列を示す。
ＭＰＡＫＴＬＥＳＫＤＹＣＧＥＳＦＶＳＥＤＲＳＧＱＳＬＥＳＩＲＦＥＤＣＴＦＲＱＣＮＦＴＥＡＥＬＮＲＣＫＦＲＥＣＥＦＶＤＣＮＬＳＬＩＳＩＰＱＴＳＦＭＥＶＲＦＶＤＣＫＭＬＧＶＮＷＴＳＡＱＷＰＳＶＫＭＥＧＡＬＳＦＥＲＣＩＬＮＤＳＬＦＹＧＬＹＬＡＧＶＫＭＶＥＣＲＩＨＤＡＮＦＴＥＡＤＣＥＤＡＤＦＴＱＳＤＬＫＧＳＴＦＨＮＴＫＬＴＧＡＳＦＩＤＡＶＮＹＨＩＤＩＦＨＮＤＩＫＲＡＲＦＳＬＰＥＡＡＳＬＬＮＳＬＤＩＥＬＳＤ
配列番号１は、ＡｌｂＧタンパク質のアミノ酸配列を示す。
ＭＰＡＫＴＬＥＳＫＤＹＣＧＥＳＦＶＳＥＤＲＳＧＱＳＬＥＳＩＲＦＥＤＣＴＦＲＱＣＮＦＴＥＡＥＬＮＲＣＫＦＲＥＣＥＦＶＤＣＮＬＳＬＩＳＩＰＱＴＳＦＭＥＶＲＦＶＤＣＫＭＬＧＶＮＷＴＳＡＱＷＰＳＶＫＭＥＧＡＬＳＦＥＲＣＩＬＮＤＳＬＦＹＧＬＹＬＡＧＶＫＭＶＥＣＲＩＨＤＡＮＦＴＥＡＤＣＥＤＡＤＦＴＱＳＤＬＫＧＳＴＦＨＮＴＫＬＴＧＡＳＦＩＤＡＶＮＹＨＩＤＩＦＨＮＤＩＫＲＡＲＦＳＬＰＥＡＡＳＬＬＮＳＬＤＩＥＬＳＤ
【0127】
配列番号２は、ＥｆｓＱＮＲタンパク質のアミノ酸配列を示す。
ＧＳＨＭＫＩＴＹＰＬＰＰＮＬＰＥＱＬＰＬＬＴＮＣＱＬＥＤＥＡＩＬＥＮＨＬＹＱＱＩＤＬＰＮＱＥＶＲＮＬＶＦＲＤＡＶＦＤＨＬＳＬＡＮＧＱＦＡＳＦＤＣＳＮＶＲＦＥＡＣＤＦＳＮＶＥＷＬＳＧＳＦＨＲＶＴＦＬＲＣＮＬＴＧＴＮＦＡＤＳＹＬＫＤＣＬＦＥＤＣＫＡＤＹＡＳＦＲＦＡＮＦＮＬＶＨＦＮＱＴＲＬＶＥＳＥＦＦＥＶＴＷＫＫＬＬＬＥＡＣＤＬＴＥＳＮＷＬＮＴＳＬＫＧＬＤＦＳＱＮＴＦＥＲＬＴＦＳＰＮＹＬＳＧＬＫＶＴＰＥＱＡＩＹＬＡＳＡＬＧＬＶＩＴ
ＧＳＨＭＫＩＴＹＰＬＰＰＮＬＰＥＱＬＰＬＬＴＮＣＱＬＥＤＥＡＩＬＥＮＨＬＹＱＱＩＤＬＰＮＱＥＶＲＮＬＶＦＲＤＡＶＦＤＨＬＳＬＡＮＧＱＦＡＳＦＤＣＳＮＶＲＦＥＡＣＤＦＳＮＶＥＷＬＳＧＳＦＨＲＶＴＦＬＲＣＮＬＴＧＴＮＦＡＤＳＹＬＫＤＣＬＦＥＤＣＫＡＤＹＡＳＦＲＦＡＮＦＮＬＶＨＦＮＱＴＲＬＶＥＳＥＦＦＥＶＴＷＫＫＬＬＬＥＡＣＤＬＴＥＳＮＷＬＮＴＳＬＫＧＬＤＦＳＱＮＴＦＥＲＬＴＦＳＰＮＹＬＳＧＬＫＶＴＰＥＱＡＩＹＬＡＳＡＬＧＬＶＩＴ
【0128】
配列番号３は、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒからの不凍タンパク質のアミノ酸配列を示す。
ＱＣＴＧＧＡＤＣＴＳＣＴＧＡＣＴＧＣＧＮＣＰＮＡＶＴＣＴＮＳＱＨＣＶＫＡＮＴＣＴＧＳＴＤＣＮＴＡＱＴＣＴＮＳＫＤＣＦＥＡＮＴＣＴＤＳＴＮＣＹＫＡＴＡＣＴＮＳＳＧＣＰＧＨ
ＱＣＴＧＧＡＤＣＴＳＣＴＧＡＣＴＧＣＧＮＣＰＮＡＶＴＣＴＮＳＱＨＣＶＫＡＮＴＣＴＧＳＴＤＣＮＴＡＱＴＣＴＮＳＫＤＣＦＥＡＮＴＣＴＤＳＴＮＣＹＫＡＴＡＣＴＮＳＳＧＣＰＧＨ
【0129】
配列番号４は、 Ｒｈａｇｉｕｍ ｉｎｑｕｉｓｉｔｏｒからの不凍タンパク質のアミノ酸配列を示す。
ＧＹＳＣＲＡＶＧＶＤＧＲＡＶＴＤＩＱＧＴＣＨＡＫＡＴＧＡＧＡＭＡＳＧＴＳＥＰＧＳＴＳＴＡＴＡＴＧＲＧＡＴＡＲＳＴＳＴＧＲＧＴＡＴＴＴＡＴＧＴＡＳＡＴＳＮＡＩＧＱＧＴＡＴＴＴＡＴＧＳＡＧＧＲＡＴＧＳＡＴＴＳＳＳＡＳＱＰＴＱＴＱＴＩＴＧＰＧＦＱＴＡＫＳＦＡＲＮＴＡＴＴＴＶＴＡＳＨＨＨＨＨＨ
ＧＹＳＣＲＡＶＧＶＤＧＲＡＶＴＤＩＱＧＴＣＨＡＫＡＴＧＡＧＡＭＡＳＧＴＳＥＰＧＳＴＳＴＡＴＡＴＧＲＧＡＴＡＲＳＴＳＴＧＲＧＴＡＴＴＴＡＴＧＴＡＳＡＴＳＮＡＩＧＱＧＴＡＴＴＴＡＴＧＳＡＧＧＲＡＴＧＳＡＴＴＳＳＳＡＳＱＰＴＱＴＱＴＩＴＧＰＧＦＱＴＡＫＳＦＡＲＮＴＡＴＴＴＶＴＡＳＨＨＨＨＨＨ
【0130】
配列番号５は、Ｓｐｒｕｃｅ Ｂｕｄｗｏｒｍ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）からの不凍タンパク質のアミノ酸配列を示す。
ＤＧＳＣＴＮＴＮＳＱＬＳＡＮＳＫＣＥＫＳＴＬＴＮＣＹＶＤＫＳＥＶＹＧＴＴＣＴＧＳＲＦＤＧＶＴＩＴＴＳＴＳＴＧＳＲＩＳＧＰＧＣＫＩＳＴＣＩＩＴＧＧＶＰＡＰＳＡＡＣＫＩＳＧＣＴＦＳＡＮ
ＤＧＳＣＴＮＴＮＳＱＬＳＡＮＳＫＣＥＫＳＴＬＴＮＣＹＶＤＫＳＥＶＹＧＴＴＣＴＧＳＲＦＤＧＶＴＩＴＴＳＴＳＴＧＳＲＩＳＧＰＧＣＫＩＳＴＣＩＩＴＧＧＶＰＡＰＳＡＡＣＫＩＳＧＣＴＦＳＡＮ
【0131】
配列番号６は、ＱＮＲＢ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。
ＧＳＨＭＡＬＡＬＶＧＥＫＩＤＲＮＲＦＴＧＥＫＩＥＮＳＴＦＦＮＣＤＦＳＧＡＤＬＳＧＴＥＦＩＧＣＱＦＹＤＲＥＳＱＫＧＣＮＦＳＲＡＭＬＫＤＡＩＦＫＳＣＤＬＳＭＡＤＦＲＮＳＳＡＬＧＩＥＩＲＨＣＲＡＱＧＡＤＦＲＧＡＳＦＭＮＭＩＴＴＲＴＷＦＣＳＡＹＩＴＮＴＮＬＳＹＡＮＦＳＫＶＶＬＥＫＣＥＬＷＥＮＲＷＩＧＡＱＶＬＧＡＴＦＳＧＳＤＬＳＧＧＥＦＳＴＦＤＷＲＡＡＮＦＴＨＣＤＬＴＮＳＥＬＧＤＬＤＩＲＧＶＤＬＱＧＶＫＬＤＮＹＱＡＳＬＬＭＥＲＬＧＩＡＶＩＧ
ＧＳＨＭＡＬＡＬＶＧＥＫＩＤＲＮＲＦＴＧＥＫＩＥＮＳＴＦＦＮＣＤＦＳＧＡＤＬＳＧＴＥＦＩＧＣＱＦＹＤＲＥＳＱＫＧＣＮＦＳＲＡＭＬＫＤＡＩＦＫＳＣＤＬＳＭＡＤＦＲＮＳＳＡＬＧＩＥＩＲＨＣＲＡＱＧＡＤＦＲＧＡＳＦＭＮＭＩＴＴＲＴＷＦＣＳＡＹＩＴＮＴＮＬＳＹＡＮＦＳＫＶＶＬＥＫＣＥＬＷＥＮＲＷＩＧＡＱＶＬＧＡＴＦＳＧＳＤＬＳＧＧＥＦＳＴＦＤＷＲＡＡＮＦＴＨＣＤＬＴＮＳＥＬＧＤＬＤＩＲＧＶＤＬＱＧＶＫＬＤＮＹＱＡＳＬＬＭＥＲＬＧＩＡＶＩＧ
【0132】
配列番号７は、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンアシルトランスフェラーゼタンパク質のアミノ酸配列を示す。
ＭＩＤＫＳＡＦＶＨＰＴＡＩＶＥＥＧＡＳＩＧＡＮＡＨＩＧＰＦＣＩＶＧＰＨＶＥＩＧＥＧＴＶＬＫＳＨＶＶＶＮＧＨＴＫＩＧＲＤＮＥＩＹＱＦＡＳＩＧＥＶＮＱＤＬＫＹＡＧＥＰＴＲＶＥＩＧＤＲＮＲＩＲＥＳＶＴＩＨＲＧＴＶＱＧＧＧＬＴＫＶＧＳＤＮＬＬＭＩＮＡＨＩＡＨＤＣＴＶＧＮＲＣＩＬＡＮＮＡＴＬＡＧＨＶＳＶＤＤＦＡＩＩＧＧＭＴＡＶＨＱＦＣＩＩＧＡＨＶＭＶＧＧＣＳＧＶＡＱＤＶＰＰＹＶＩＡＱＧＮＨＡＴＰＦＧＶＮＩＥＧＬＫＲＲＧＦＳＲＥＡＩＴＡＩＲＮＡＹＫＬＩＹＲＳＧＫＴＬＤＥＶＫＰＥＩＡＥＬＡ ＥＴＹＰＥＶＫＡＦＴＤＦＦＡＲＳＴＲＧＬＩＲ
ＭＩＤＫＳＡＦＶＨＰＴＡＩＶＥＥＧＡＳＩＧＡＮＡＨＩＧＰＦＣＩＶＧＰＨＶＥＩＧＥＧＴＶＬＫＳＨＶＶＶＮＧＨＴＫＩＧＲＤＮＥＩＹＱＦＡＳＩＧＥＶＮＱＤＬＫＹＡＧＥＰＴＲＶＥＩＧＤＲＮＲＩＲＥＳＶＴＩＨＲＧＴＶＱＧＧＧＬＴＫＶＧＳＤＮＬＬＭＩＮＡＨＩＡＨＤＣＴＶＧＮＲＣＩＬＡＮＮＡＴＬＡＧＨＶＳＶＤＤＦＡＩＩＧＧＭＴＡＶＨＱＦＣＩＩＧＡＨＶＭＶＧＧＣＳＧＶＡＱＤＶＰＰＹＶＩＡＱＧＮＨＡＴＰＦＧＶＮＩＥＧＬＫＲＲＧＦＳＲＥＡＩＴＡＩＲＮＡＹＫＬＩＹＲＳＧＫＴＬＤＥＶＫＰＥＩＡＥＬＡ ＥＴＹＰＥＶＫＡＦＴＤＦＦＡＲＳＴＲＧＬＩＲ
【0133】
配列番号８は、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ由来のＮＰ２７５タンパク質のアミノ酸配列を示す。
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＤＶＥＫＬＲＱＬＹＡＡＧＥＲＤＦＳＩＶＤＬＲＧＡＶＬＥＮＩＮＬＳＧＡＩＬＨＧＡＭＬＤＥＡＮＬＱＱＡＮＬＳＲＡＤＬＳＧＡＴＬＮＧＡＤＬＲＧＡＮＬＳＫＡＤＬＳＤＡＩＬＤＮＡＩＬＥＧＡＩＬＤＥＡＶＬＮＱＡＮＬＫＡＡＮＬＥＱＡＩＬＳＨＡＮＩＲＥＡＤＬＳＥＡＮＬＥＡＡＤＬＳＧＡＤＬＡＩＡ ＤＬＨＱＡＮＬＨＱＡＡＬＥＲＡＮＬＴＧＡＮＬＥＤＡＮＬＥＧＴＩＬＥＧＧＮＮＮＬＡＴ
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＤＶＥＫＬＲＱＬＹＡＡＧＥＲＤＦＳＩＶＤＬＲＧＡＶＬＥＮＩＮＬＳＧＡＩＬＨＧＡＭＬＤＥＡＮＬＱＱＡＮＬＳＲＡＤＬＳＧＡＴＬＮＧＡＤＬＲＧＡＮＬＳＫＡＤＬＳＤＡＩＬＤＮＡＩＬＥＧＡＩＬＤＥＡＶＬＮＱＡＮＬＫＡＡＮＬＥＱＡＩＬＳＨＡＮＩＲＥＡＤＬＳＥＡＮＬＥＡＡＤＬＳＧＡＤＬＡＩＡ ＤＬＨＱＡＮＬＨＱＡＡＬＥＲＡＮＬＴＧＡＮＬＥＤＡＮＬＥＧＴＩＬＥＧＧＮＮＮＬＡＴ
【0134】
配列番号９は、ペクチン酸リアーゼＣのアミノ酸配列を示す。
ＡＴＤＴＧＧＹＡＡＴＡＧＧＮＶＴＧＡＶＳＫＴＡＴＳＭＱＤＩＶＮＩＩＤＡＡＲＬＤＡＮＧＫＫＶＫＧＧＡＹＰＬＶＩＴＹＴＧＮＥＤＳＬＩＮＡＡＡＡＮＩＣＧＱＷＳＫＤＰＲＧＶＥＩＫＥＦＴＫＧＩＴＩＩＧＡＮＧＳＳＡＮＦＧＩＷＩＫＫＳＳＤＶＶＶＱＮＭＲＩＧＹＬＰＧＧＡＫＤＧＤＭＩＲＶＤＤＳＰＮＶＷＶＤＨＮＥＬＦＡＡＮＨＥＣＤＧＴＰＤＮＤＴＴＦＥＳＡＶＤＩＫＧＡＳＮＴＶＴＶＳＹＮＹＩＨＧＶＫＫＶＧＬＤＧＳＳＳＳＤＴＧＲＮＩＴＹＨＨＮＹＹＮＤＶＮＡＲＬＰＬＱＲＧＧＬＶＨＡＹＮＮＬＹＴＮＩＴＧＳＧＬＮＶＲＱＮＧＱＡＬＩＥＮＮＷＦＥＫＡＩＮＰＶＴＳＲＹＤＧＫＮＦＧＴＷＶＬＫＧＮＮＩＴＫＰＡＤＦＳＴＹＳＩＴＷＴＡＤＴＫＰＹＶＮＡＤＳＷＴＳＴＧＴＦＰＴＶＡＹ ＮＹＳＰＶＳＡＱＣＶＫＤＫＬＰＧＹＡＧＶＧＫＮＬＡＴＬＴＳＴＡＣＫ
ＡＴＤＴＧＧＹＡＡＴＡＧＧＮＶＴＧＡＶＳＫＴＡＴＳＭＱＤＩＶＮＩＩＤＡＡＲＬＤＡＮＧＫＫＶＫＧＧＡＹＰＬＶＩＴＹＴＧＮＥＤＳＬＩＮＡＡＡＡＮＩＣＧＱＷＳＫＤＰＲＧＶＥＩＫＥＦＴＫＧＩＴＩＩＧＡＮＧＳＳＡＮＦＧＩＷＩＫＫＳＳＤＶＶＶＱＮＭＲＩＧＹＬＰＧＧＡＫＤＧＤＭＩＲＶＤＤＳＰＮＶＷＶＤＨＮＥＬＦＡＡＮＨＥＣＤＧＴＰＤＮＤＴＴＦＥＳＡＶＤＩＫＧＡＳＮＴＶＴＶＳＹＮＹＩＨＧＶＫＫＶＧＬＤＧＳＳＳＳＤＴＧＲＮＩＴＹＨＨＮＹＹＮＤＶＮＡＲＬＰＬＱＲＧＧＬＶＨＡＹＮＮＬＹＴＮＩＴＧＳＧＬＮＶＲＱＮＧＱＡＬＩＥＮＮＷＦＥＫＡＩＮＰＶＴＳＲＹＤＧＫＮＦＧＴＷＶＬＫＧＮＮＩＴＫＰＡＤＦＳＴＹＳＩＴＷＴＡＤＴＫＰＹＶＮＡＤＳＷＴＳＴＧＴＦＰＴＶＡＹ ＮＹＳＰＶＳＡＱＣＶＫＤＫＬＰＧＹＡＧＶＧＫＮＬＡＴＬＴＳＴＡＣＫ
【0135】
配列番号１０は、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｓｃｉｉ由来のペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列を示す。
ＶＧＴＮＴＧＧＶＬＶＩＴＤＴＩＩＶＫＳＧＱＴＹＤＧＫＧＩＫＩＩＡＱＧＭＧＤＧＳＱＳＥＮＱＫＰＩＦＫＬＥＫＧＡＮＬＫＮＶＩＩＧＡＰＧＣＤＧＩＨＣＹＧＤＮＶＶＥＮＶＶＷＥＤＶＧＥＤＡＬＴＶＫＳＥＧＶＶＥＶＩＧＧＳＡＫＥＡＡＤＫＶＦＱＬＮＡＰＣＴＦＫＶＫＮＦＴＡＴＮＩＧＫＬＶＲＱＮＧＮＴＴＦＫＶＶＩＹＬＥＤＶＴＬＮＮＶＫＳＣ ＶＡＫＳＤＳＰＶＳＥＬＷＹＨＮＬＮＶＮＮＣＫＴＬＦＥＦＰＳＱＳＱＩＨＱＹ
ＶＧＴＮＴＧＧＶＬＶＩＴＤＴＩＩＶＫＳＧＱＴＹＤＧＫＧＩＫＩＩＡＱＧＭＧＤＧＳＱＳＥＮＱＫＰＩＦＫＬＥＫＧＡＮＬＫＮＶＩＩＧＡＰＧＣＤＧＩＨＣＹＧＤＮＶＶＥＮＶＶＷＥＤＶＧＥＤＡＬＴＶＫＳＥＧＶＶＥＶＩＧＧＳＡＫＥＡＡＤＫＶＦＱＬＮＡＰＣＴＦＫＶＫＮＦＴＡＴＮＩＧＫＬＶＲＱＮＧＮＴＴＦＫＶＶＩＹＬＥＤＶＴＬＮＮＶＫＳＣ ＶＡＫＳＤＳＰＶＳＥＬＷＹＨＮＬＮＶＮＮＣＫＴＬＦＥＦＰＳＱＳＱＩＨＱＹ
【0136】
配列番号１１は、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ由来の炭酸脱水酵素のアミノ酸配列を示す。
ＱＥＩＴＶＤＥＦＳＮＩＲＥＮＰＶＴＰＷＮＰＥＰＳＡＰＶＩＤＰＴＡＹＩＤＰＱＡＳＶＩＧＥＶＴＩＧＡＮＶＭＶＳＰＭＡＳＩＲＳＤＥＧＭＰＩＦＶＧＤＲＳＮＶＱＤＧＶＶＬＨＡＬＥＴＩＮＥＥＧＥＰＩＥＤＮＩＶＥＶＤＧＫＥＹＡＶＹＩＧＮＮＶＳＬＡＨＱＳＱＶＨＧＰＡＡＶＧＤＤＴＦＩＧＭＱＡＦＶＦＫＳＫＶＧＮＮＣＶＬＥＰＲＳＡＡＩＧＶＴＩＰＤＧＲＹＩＰＡＧＭＶＶＴＳＱＡＥＡＤＫＬＰＥＶＴＤＤＹＡＹＳＨＴＮＥＡＶＶＹＶＮＶＨＬＡＥＧＹＫＥＴＳ
ＱＥＩＴＶＤＥＦＳＮＩＲＥＮＰＶＴＰＷＮＰＥＰＳＡＰＶＩＤＰＴＡＹＩＤＰＱＡＳＶＩＧＥＶＴＩＧＡＮＶＭＶＳＰＭＡＳＩＲＳＤＥＧＭＰＩＦＶＧＤＲＳＮＶＱＤＧＶＶＬＨＡＬＥＴＩＮＥＥＧＥＰＩＥＤＮＩＶＥＶＤＧＫＥＹＡＶＹＩＧＮＮＶＳＬＡＨＱＳＱＶＨＧＰＡＡＶＧＤＤＴＦＩＧＭＱＡＦＶＦＫＳＫＶＧＮＮＣＶＬＥＰＲＳＡＡＩＧＶＴＩＰＤＧＲＹＩＰＡＧＭＶＶＴＳＱＡＥＡＤＫＬＰＥＶＴＤＤＹＡＹＳＨＴＮＥＡＶＶＹＶＮＶＨＬＡＥＧＹＫＥＴＳ
【0137】
配列番号１２は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のペクチンリアーゼＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
ＶＧＶＳＧＳＡＥＧＦＡＫＧＶＴＧＧＧＳＡＴＰＶＹＰＤＴＩＤＥＬＶＳＹＬＧＤＤＥＡＲＶＩＶＬＴＫＴＦＤＦＴＤＳＥＧＴＴＴＧＴＧＣＡＰＷＧＴＡＳＡＣＱＶＡＩＤＱＤＤＷＣＥＮＹＥＰＤＡＰＳＶＳＶＥＹＹＮＡＧＴＬＧＩＴＶＴＳＮＫＳＬＩＧＥＧＳＳＧＡＩＫＧＫＧＬＲＩＶＳＧＡＥＮＩＩＩＱＮＩＡＶＴＤＩＮＰＫＹＶＷＧＧＤＡＩＴＬＤＤＣＤＬＶＷＩＤＨＶＴＴＡＲＩＧＲＱＨＹＶＬＧＴＳＡＤＮＲＶＳＬＴＮＮＹＩＤＧＶＳＤＹＳＡＴＣＤＧＹＨＹＷＡＩＹＬＤＧＤＡＤＬＶＴＭＫＧＮＹＩＹＨＴＳＧＲＳＰＫＶＱＤＮＴＬＬＨＡＶＮＮＹＷＹＤＩＳＧＨＡＦＥＩＧＥＧＧＹＶＬＡＥＧＮＶＦＱＮＶＤＴＶＬＥＴＹＥＧＥＡＦＴＶＰＳＳＴＡＧＥＶＣＳＴＹＬＧＲＤＣＶＩＮＧＦＧＳＳＧＴ ＦＳＥＤＳＴＳＦＬＳＤＦＥＧＫＮＩＡＳＡＳＡＹＴＳＶＡＳＲＶＶＡＮＡＧＱＧＮＬ
ＶＧＶＳＧＳＡＥＧＦＡＫＧＶＴＧＧＧＳＡＴＰＶＹＰＤＴＩＤＥＬＶＳＹＬＧＤＤＥＡＲＶＩＶＬＴＫＴＦＤＦＴＤＳＥＧＴＴＴＧＴＧＣＡＰＷＧＴＡＳＡＣＱＶＡＩＤＱＤＤＷＣＥＮＹＥＰＤＡＰＳＶＳＶＥＹＹＮＡＧＴＬＧＩＴＶＴＳＮＫＳＬＩＧＥＧＳＳＧＡＩＫＧＫＧＬＲＩＶＳＧＡＥＮＩＩＩＱＮＩＡＶＴＤＩＮＰＫＹＶＷＧＧＤＡＩＴＬＤＤＣＤＬＶＷＩＤＨＶＴＴＡＲＩＧＲＱＨＹＶＬＧＴＳＡＤＮＲＶＳＬＴＮＮＹＩＤＧＶＳＤＹＳＡＴＣＤＧＹＨＹＷＡＩＹＬＤＧＤＡＤＬＶＴＭＫＧＮＹＩＹＨＴＳＧＲＳＰＫＶＱＤＮＴＬＬＨＡＶＮＮＹＷＹＤＩＳＧＨＡＦＥＩＧＥＧＧＹＶＬＡＥＧＮＶＦＱＮＶＤＴＶＬＥＴＹＥＧＥＡＦＴＶＰＳＳＴＡＧＥＶＣＳＴＹＬＧＲＤＣＶＩＮＧＦＧＳＳＧＴ ＦＳＥＤＳＴＳＦＬＳＤＦＥＧＫＮＩＡＳＡＳＡＹＴＳＶＡＳＲＶＶＡＮＡＧＱＧＮＬ
【0138】
配列番号１３は、ＴｔＣｕＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
ＡＹＴＬＡＴＨＴＡＧＶＩＰＡＧＫＬＥＲＶＤＰＴＴＶＲＱＥＧＰＷＡＤＰＡＱＡＶＶＱＴＧＰＮＱＹＴＶＹＶＬＡＦＡＦＧＹＱＰＮＰＩＥＶＰＱＧＡＥＩＶＦＫＩＴＳＰＤＶＩＨＧＦＨＶＥＧＴＮＩＮＶＥＶＬＰＧＥＶＳＴＶＲＹＴＦＫＲＰＧＥＹＲＩＩＣＮＱＹＣＧＬＧＨＱＮＭＦＧＴＩＶＶＫＥ
ＡＹＴＬＡＴＨＴＡＧＶＩＰＡＧＫＬＥＲＶＤＰＴＴＶＲＱＥＧＰＷＡＤＰＡＱＡＶＶＱＴＧＰＮＱＹＴＶＹＶＬＡＦＡＦＧＹＱＰＮＰＩＥＶＰＱＧＡＥＩＶＦＫＩＴＳＰＤＶＩＨＧＦＨＶＥＧＴＮＩＮＶＥＶＬＰＧＥＶＳＴＶＲＹＴＦＫＲＰＧＥＹＲＩＩＣＮＱＹＣＧＬＧＨＱＮＭＦＧＴＩＶＶＫＥ
【0139】
配列番号１４は、細胞の核を標的とするためのシグナル配列を示す。
ＰＡＡＫＲＶＫＣＤ
ＰＡＡＫＲＶＫＣＤ
【0140】
配列番号１５は、細胞の小胞体を標的とするためのシグナル配列を示す。
ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＫＤＥＬ
ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＫＤＥＬ
【0141】
配列番号１６は、細胞のミトコンドリアを標的とするためのシグナル配列を示す。
ＭＬＳＬＲＱＳＩＲＦＦＫＰＡＴＲＴＬＣＳＳＲＹＬＬ
ＭＬＳＬＲＱＳＩＲＦＦＫＰＡＴＲＴＬＣＳＳＲＹＬＬ
【0142】
配列番号１７は、Ｐ－カドヘリン過剰発現乳癌細胞を標的とするためのシグナル配列を示す。
ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ
ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ
【0143】
配列番号１８は、ペンタペプチドリピートタンパク質のコンセンサス配列を示す。
（ＳＴＡＶ）１（ＤＮ）２（ＬＦ）３（ＳＴＲ）４（Ｇ）５
（ＳＴＡＶ）１（ＤＮ）２（ＬＦ）３（ＳＴＲ）４（Ｇ）５
【0144】
配列番号１９は、ＡｌｂＧ遺伝子の核酸配列を示す。
ＡＴＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＧＣＧＧＣＧＡＡＡＧＣＴＴＴＧＴＧＡＧＣＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＡＧＣＡＴＴＣＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＴＴＧＣＡＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＧＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＣＣＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣＴＧＡＡＣＣＧＣＴＧＣＡＡＡＴＴＴＣＧＣＧＡＡＴＧＣＧＡＡＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＴＴＡＧＣＡＴＴＣＣＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＴＴＴＡＴＧＧＡＡＧＴＧＣＧＣＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＧＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＧＣＧＣＧＣＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＡＣＧＣＴＧＣＡＴＴ ＣＴＧＡＡＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＴＴＴＴＡＴＧＧＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＧＣＧＧＧＣＧＴＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＧＡＡＴＧＣＣＧＣＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＣＧＡＡＣＴＴＴＡＣＣＧＡＡＧＣＧＧＡＴＴＧＣＧＡＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＴＴＴＡＣＣＣＡＧＡＧＣＧＡＴＣＴＧＡＡＡＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＴＴＣＡＴＡＡＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＧＧＣＧＣＧＡＧＣＴＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣＧＧＴＧＡＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴＴＧＡＴＡＴＴＴＴＴＣＡＴＡＡＣＧＡＴＡＴＴＡＡＡＣＧＣＧＣＧＣＧＣＴＴＴＡＧＣＣＴＧＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＡＴＴＧＡＡＣＴＧＡＧＣＧＡＴ
ＡＴＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＧＣＧＧＣＧＡＡＡＧＣＴＴＴＧＴＧＡＧＣＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＡＧＣＡＴＴＣＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＴＴＧＣＡＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＧＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＣＣＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣＴＧＡＡＣＣＧＣＴＧＣＡＡＡＴＴＴＣＧＣＧＡＡＴＧＣＧＡＡＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＴＴＡＧＣＡＴＴＣＣＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＴＴＴＡＴＧＧＡＡＧＴＧＣＧＣＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＧＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＧＣＧＣＧＣＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＡＣＧＣＴＧＣＡＴＴ ＣＴＧＡＡＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＴＴＴＴＡＴＧＧＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＧＣＧＧＧＣＧＴＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＧＡＡＴＧＣＣＧＣＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＣＧＡＡＣＴＴＴＡＣＣＧＡＡＧＣＧＧＡＴＴＧＣＧＡＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＴＴＴＡＣＣＣＡＧＡＧＣＧＡＴＣＴＧＡＡＡＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＴＴＣＡＴＡＡＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＧＧＣＧＣＧＡＧＣＴＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣＧＧＴＧＡＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴＴＧＡＴＡＴＴＴＴＴＣＡＴＡＡＣＧＡＴＡＴＴＡＡＡＣＧＣＧＣＧＣＧＣＴＴＴＡＧＣＣＴＧＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＡＴＴＧＡＡＣＴＧＡＧＣＧＡＴ
【0145】
配列番号２０は、ＥｆｓＱＮＲ遺伝子の核酸配列を示す。
ＧＧＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＡＡＣＣＴＧＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＣＴＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＡＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＴＧＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＣＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣＧＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＴＴＣＧＣＧＡＴＧＣＧＧＴＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＣＣＡＧＴＴＴＧＣＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＡＡＣＧＴＧＣＧＣＴＴＴＧＡＡＧＣＧＴＧＣＧＡＴＴＴＴＡＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＴＴＣＡＴＣＧＣＧＴＧＡＣＣＴＴＴＣＴＧＣＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＡＣＴＴＴＧＣＧＧＡＴＡＧＣＴＡＴＣＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＣＣＴＧＴＴＴＧＡＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＧＣＧＧＡＴＴＡＴＧＣＧＡＧＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＧＣＧＡＡＣＴＴＴＡＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＴＴＴＴＡＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＧＡＡＴＴＴＴＴＴＧＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＴＧＣＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＡＡＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＴＴＴＴＡＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＡＡＣＧＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＡＧＣＣＣＧＡＡＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＧＧＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＡＣＡＧＧＣＧＡＴＴＴＡＴＣＴＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＴＡＣＣ
ＧＧＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＡＡＣＣＴＧＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＣＴＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＡＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＴＧＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＣＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣＧＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＴＴＣＧＣＧＡＴＧＣＧＧＴＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＣＣＡＧＴＴＴＧＣＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＡＡＣＧＴＧＣＧＣＴＴＴＧＡＡＧＣＧＴＧＣＧＡＴＴＴＴＡＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＴＴＣＡＴＣＧＣＧＴＧＡＣＣＴＴＴＣＴＧＣＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＡＣＴＴＴＧＣＧＧＡＴＡＧＣＴＡＴＣＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＣＣＴＧＴＴＴＧＡＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＧＣＧＧＡＴＴＡＴＧＣＧＡＧＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＧＣＧＡＡＣＴＴＴＡＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＴＴＴＴＡＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＧＡＡＴＴＴＴＴＴＧＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＴＧＣＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＡＡＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＴＴＴＴＡＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＡＡＣＧＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＡＧＣＣＣＧＡＡＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＧＧＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＡＣＡＧＧＣＧＡＴＴＴＡＴＣＴＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＴＡＣＣ
【0146】
配列番号２１は、ＴｔＣｕＡ遺伝子の核酸配列を示す。
ＧＣＧＴＡＴＡＣＣＣＴＧＧＣＧＡＣＣＣＡＴＡＣＣＧＣＧＧＧＣＧＴＧＡＴＴＣＣＧＧＣＧＧＧＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＣＧＣＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＣＡＣＣＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＣＧＴＧＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＣＣＧＧＣＣＣＧＡＡＣＣＡＧＴＡＴＡＣＣＧＴＧＴＡＴＧＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＧＣＧＴＴＴＧＧＣＴＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＣＣＣＧＡＴＴＧＡＡＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＧＣＧＣＧＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＧＡＴＧＴＧＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＡＡＧＧＣＡＣＣＡＡＣＡＴＴＡＡＣＧＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＣＧＧＧＣＧＡＡＧＴＧＡＧＣＡＣＣＧＴＧＣＧＣＴＡＴＡＣＣＴＴＴＡＡＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＡＡＴＡＴＣＧＣＡＴＴＡＴＴＴＧＣＡＡＣＣＡＧＴＡＴＴＧＣＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＣＡＴＧＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＴＴＧＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＡ
ＧＣＧＴＡＴＡＣＣＣＴＧＧＣＧＡＣＣＣＡＴＡＣＣＧＣＧＧＧＣＧＴＧＡＴＴＣＣＧＧＣＧＧＧＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＣＧＣＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＣＡＣＣＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＣＧＴＧＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＣＣＧＧＣＣＣＧＡＡＣＣＡＧＴＡＴＡＣＣＧＴＧＴＡＴＧＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＧＣＧＴＴＴＧＧＣＴＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＣＣＣＧＡＴＴＧＡＡＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＧＣＧＣＧＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＧＡＴＧＴＧＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＡＡＧＧＣＡＣＣＡＡＣＡＴＴＡＡＣＧＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＣＧＧＧＣＧＡＡＧＴＧＡＧＣＡＣＣＧＴＧＣＧＣＴＡＴＡＣＣＴＴＴＡＡＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＡＡＴＡＴＣＧＣＡＴＴＡＴＴＴＧＣＡＡＣＣＡＧＴＡＴＴＧＣＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＣＡＴＧＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＴＴＧＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＡ
【0147】
配列番号２２は、細胞内のアクチンを標的とするためのシグナル配列を示す。
ＧＤＶＱＫＫＲＷＬＦＥＴＫＰＬＤ
ＧＤＶＱＫＫＲＷＬＦＥＴＫＰＬＤ
【0148】
配列番号２３は、細胞内のチューブリンを標的とするためのシグナル配列を示す。
ＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧ
ＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧ
【0149】
配列番号２４：ジンクフィンガータンパク質のアミノ酸配列を示す
ＭＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＤＳＳＮＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＨＬＴＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＤＥＲＫＲ ＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ
ＭＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＤＳＳＮＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＨＬＴＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＤＥＲＫＲ ＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ
【0150】
配列番号２５：ｍｃｈｅｒｒｙ遺伝子の核酸配列を示す。ＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＴＡＡＣＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣＧＣＴＴＣＡＡＧＧＴＧＣＡＣＡＴＧＧＡＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＣＡＣＧＡＧＴＴＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＡＣＧＡＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＡＴＧＴＡＣＧＧＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＧＴＧＡＡＧＣＡＣＣＣＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＣＣＣＧＡＣＴＡＣＴＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＴＴＣＡＡＧＴＧＧＧＡＧＣＧＣＧＴＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＧＧＣＧＡＧＴＴＣＡＴＣＴＡＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＣＣＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＡＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＣＧＧＡＴＧＴＡＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣＴＡＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＡＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＣＣＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＧＡＡＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＣＡＣＴＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＧＴＡＡＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＣＴＡＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣ．
【0151】
配列番号２６：ＡｌｂＧ遺伝子のＰＣＲ増幅のためのプライマーの核酸配列を示す。
ＡＴＣＣＣＧＣＴＣＡＴＡＴＧＣＣＧＧＣＣＡＡＧＡＣＣＣＴＴＧ
ＡＴＣＣＣＧＣＴＣＡＴＡＴＧＣＣＧＧＣＣＡＡＧＡＣＣＣＴＴＧ
【0152】
配列番号２７：ＡｌｂＧ遺伝子のＰＣＲ増幅のためのプライマーの核酸配列を示す。
ＡＴＣＣＣＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＴＣＧＧＡＣＡＧＣＴＣＧＡＴＡＴＣ
ＡＴＣＣＣＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＴＣＧＧＡＣＡＧＣＴＣＧＡＴＡＴＣ
【0153】
配列番号２８：ＥｆｓＱＮＲ遺伝子のＰＣＲ増幅のためのプライマーの核酸配列を示す。
ＡＴＣＣＣＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＣＴＴＡＴＣＣＣＴＴＧＣＣＡ
ＡＴＣＣＣＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＣＴＴＡＴＣＣＣＴＴＧＣＣＡ
【0154】
配列番号２９：ＥｆｓＱＮＲ遺伝子のＰＣＲ増幅のためのプライマーの核酸配列を示す。
ＡＴＣＣＣＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＧＴＡＡＴＣＡＣＣＡＡＡＣＣＡＡＧＴ
ＡＴＣＣＣＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＧＴＡＡＴＣＡＣＣＡＡＡＣＣＡＡＧＴ
【0155】
本発明はまた、細胞膜を透過するための組換えタンパク質および機能性分子を含むコンジュゲート、ならびに配列番号１～１２のものと実質的に類似の配列同一性または相同性を有するそれらの使用を提供する。「実質的に類似の配列同一性」という用語は、本明細書では、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％～約９９％の同一性の配列類似性のレベルを示すために使用される。配列同一性パーセントは、従来の方法、例えば、核酸については、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９２；８９：１０９１５、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７；２５：３３８９－３４０２に記載されるものを使用して、タンパク質については、ＢＬＡＳＴ（登録商標）などのシステムを使用するアライメント後の比較を介して決定することができる。
【0156】
機能性分子を有する細胞透過性コンジュゲート
生命を脅かす疾患を治癒または予防するための新規薬物を特定することは、依然として非常に活発な研究分野である。そのような薬物のほとんどは、細胞内に標的を有する傾向があり、標的に到達するために、それらは、多くの場合、簡単でも効率的でもない半透膜を横切らなければならないであろう。したがって、細胞膜を透過するための新規メカニズムを開発することは依然として望ましい。一方、様々な細胞メカニズムを解明することを目的とした科学的調査および研究は、細胞およびその様々な細胞小器官の標識に役立ち得る細胞膜を透過する新規の方法を見出すことも求めている。また、これは、科学実験のために細胞内に必要な材料を供給するのに非常に役立つであろう。最近の報告に記載されている細胞透過性分子のほとんどは、細胞侵入のエンドサイトーシスメカニズムに関係している。
生命を脅かす疾患を治癒または予防するための新規薬物を特定することは、依然として非常に活発な研究分野である。そのような薬物のほとんどは、細胞内に標的を有する傾向があり、標的に到達するために、それらは、多くの場合、簡単でも効率的でもない半透膜を横切らなければならないであろう。したがって、細胞膜を透過するための新規メカニズムを開発することは依然として望ましい。一方、様々な細胞メカニズムを解明することを目的とした科学的調査および研究は、細胞およびその様々な細胞小器官の標識に役立ち得る細胞膜を透過する新規の方法を見出すことも求めている。また、これは、科学実験のために細胞内に必要な材料を供給するのに非常に役立つであろう。最近の報告に記載されている細胞透過性分子のほとんどは、細胞侵入のエンドサイトーシスメカニズムに関係している。
【0157】
エンドサイトーシスによる分子の摂取の不利な点、例えば、最終的にリソソームなどの細胞の分解性区画と融合する異なるタイプのエンドソーム区画における薬物の捕捉および分解を回避するために、細胞膜透過性コンジュゲートが本明細書に開示され、これは、細胞膜を透過して細胞内へのアクセスを獲得することができ、細胞内の染料、薬物、タンパク質、酵素、抗体、および核酸を含む様々なカーゴを送達するためにも使用することができる。
【0158】
本開示は、例示のみを目的とする、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。機能的に同等の産物、組成物、および方法は、本明細書に記載されているように、明らかに本開示の範囲内にある。
【0159】
本発明は、細胞膜を透過することができるコンジュゲートを開示する。コンジュゲートは、機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質、または組換えβらせんタンパク質部分を含み、タンパク質は、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲でその長さとして定義される最長の寸法および１ｎｍ～５ｎｍの範囲の、その長さに対して実質的に垂直なタンパク質構造の寸法として定義される幅または直径を有する。タンパク質の寸法は、固体状態（Ｘ線結晶構造解析または原子間力顕微鏡法で特徴付けられる）または溶液状態（動的光散乱測定）で測定されたものとして定義される。
【0160】
本発明の実施形態では、コンジュゲートのタンパク質構造は、５ｎｍ、７．５ｎｍ、１０ｎｍ、１１ｎｍ、１２ｎｍ、１３ｎｍ、または１４ｎｍを超える最長の寸法または長さを有し得る。実施形態では、コンジュゲートのタンパク質構造は、２５ｎｍ、２０ｎｍ、１７．５ｎｍ、１５ｎｍ、１４ｎｍ、１３ｎｍ、１２ｎｍまたは１１ｎｍ未満の最長の寸法または長さを有し得る。好適には、長さは５ｎｍ～２５ｎｍの範囲であり、より好適には１０ｎｍ～１５ｎｍであり、さらにより好適には１１ｎｍ～１４ｎｍまたは１２ｎｍ～１３ｎｍの範囲である。実施形態では、コンジュゲートのタンパク質構造は、少なくとも１ｎｍ、１．１ｎｍ、１．２ｎｍ、１．３ｎｍ、１．４ｎｍ、１．５ｎｍ、１．６ｎｍ、１．７ｎｍ、１．８ｎｍ、１．９ｎｍまたは２．０ｎｍの、その長さに対して実質的に垂直な寸法の、幅または直径を有し得る。実施形態では、コンジュゲートのタンパク質構造は、５．０ｍｍ、４．５ｎｍ、４．０ｎｍ、３．５ｎｍ、３．０ｎｍ、２．９ｎｍ、２．８ｎｍ、２．７ｎｍ、２．６ｎｍ、２．５ｎｍ、２．４ｎｍ、２．３ｎｍ、２．２ｎｍ、２．１ｎｍまたは２．０ｎｍ未満の最長寸法または長さを有し得る。好適には、長さは１ｎｍ～５ｎｍの範囲であり、より好適には１ｎｍ～３ｎｍであり、さらにより好適には１．５ｎｍ～２．５ｎｍの範囲である。一実施形態では、本発明のコンジュゲートのタンパク質構造は、長手方向軸に沿った断面において概ね四角形（４つの辺）である先端形状を有し得る。好適には、形状は矩形である。好適には、四角形であるのはタンパク質構造の先端または末端である。先端は一般に矩形であり得、すなわち、正確な直角の角部がないか、角部がいくらか丸みを帯びている場合がある。好適には、先端は、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲の長さ、および１ｎｍ～５ｎｍの範囲の幅を有する。実施形態では、先端は、上記のタンパク質コンジュゲートについて定義された寸法を有し得る。
【0161】
本発明のコンジュゲートのタンパク質部分の物理的サイズの代用または代替の定義は、そのβ－らせん構造とその分子量との組み合わせである。その物理的寸法またはその分子量に基づくタンパク質のサイズの定義は、互換的に使用され得る。本発明の実施形態では、タンパク質部分の分子量は、少なくとも３０ｋＤａであり得る。好適には、タンパク質部分の分子量は、少なくとも３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａまたは５０ｋＤａであり得る。本発明の実施形態では、タンパク質部分の分子量は最大で１００ｋＤａであり得る。好適には、タンパク質部分の分子量は、最大で９０ｋＤａ、８０ｋＤａ、７０ｋＤａ、６０ｋＤａ、５５ｋＤａまたは５０ｋＤａであり得る。好適には、本発明のコンジュゲートのタンパク質部分の分子量範囲は、３０～１００ｋＤａ、より好適には４０～６０ｋＤａ、さらにより好適には４８～５５ｋＤａの範囲である。
【0162】
理論に束縛されるものではないが、本発明のコンジュゲートによって示される細胞透過における有益な特性は、上で概説した寸法または分子量によって定義されるタンパク質部分の物理的サイズによるものであると想定される。タンパク質のさらなる特徴は、主に珍しいβ－らせん二次構造に由来する剛性である。好適には、タンパク質は、透過される膜よりも剛性であってもよい。典型的な細胞膜は、細胞の種類に応じて、０．００５～０．０２Ｎ／ｍ２の剛性を有している（原子間力顕微鏡法で測定、Ｈａｙａｓｈｉ，「Ｔｅｎｓｉｌｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｌｏｃａｌ Ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ」；Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｉｓｓｕｅ，ｐｐ １３７－１５２）。好適には、本発明のタンパク質は、０．７～１２Ｎ／ｍ２のβらせんに典型的な剛性、または高硬さパラメータ（Ｋ）を有する（Ｋｅｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００９；２；６６－７４、これは、参照により本明細書に組み込まれる）。
【0163】
本発明のコンジュゲートの細胞透過の効率に影響を与えると考えられるさらなる特徴は、タンパク質のβらせん構造におけるアミノ酸の電荷プロファイルおよび配置である。具体的には、β－らせんタンパク質構造における帯電したリジン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸の「ラダー」の存在は、細胞膜の透過、およびタンパク質配列の総負電荷を促進する。
【0164】
βらせんタンパク質構造のアミノ酸残基に関する「ラダー」という用語は、タンパク質の表面の長さに沿って正に帯電した（リジン、アルギニンおよび／またはアスパラギン）および負に帯電した残基（アスパラギン酸および／またはグルタミン酸）の存在として定義される。
【0165】
理論に束縛されるものではないが、本発明によるタンパク質のβらせん構造における帯電した「ラダー」構造の存在は、タンパク質と細胞膜の脂質分子との相互作用（例えば、脂質分子のヒドロキシル基との水素結合の形成）、および／または負に帯電した細胞膜へのタンパク質の最初の付着を促進することができる。
【0166】
負に帯電した残基による本発明によるタンパク質の全負電荷は、タンパク質の角運動につながる反発を促進して、タンパク質を膜上に真っ直ぐに立たせ、膜に穴を開けることができる。
【0167】
本発明の実施形態では、コンジュゲートのタンパク質は、正および負に帯電したアミノ酸残基が露出した交互に配置された表面のラダーを含む。実施形態では、タンパク質は、アルギニンラダー（１０～３０個のＡｒｇ残基）、リジンラダー（１０～３０個のＬｙｓ残基）、アスパラギンラダー（１０～４０個のＡｓｎ残基）、アスパラギン酸（１０～４０個のＡｓｐ残基）およびグルタミン酸（１０～４０個のＧｌｕ残基）のうちの少なくとも１つを含む。
【0168】
本発明の実施形態では、タンパク質の総形式電荷はゼロであり得るか、またはそれはゼロ以外であり得る。好適には、総形式電荷はゼロ以外であり、より好適には、総形式電荷はゼロ未満（負）である。実施形態では、タンパク質の総形式電荷は、－１０を下回る（すなわち、－１０より負である）。好適には、タンパク質の総形式電荷は、－２０、－２５、－３０、－３５、－４０、－４５、または－５０を下回る。より好適には、総形式電荷は、－２０を下回る。実施形態では、タンパク質の総形式電荷は、－８０を上回る（すなわち、－８０より負ではない）。好適には、タンパク質の総形式電荷は、－７０、－６５、－６０、－５５、－５０、－４５、－４０、－３５、または－３０を上回る。より好適には、総形式電荷は、－６０を上回る。実施形態では、タンパク質の総形式電荷は、－１０～－８０の範囲であり、より好適には、－２０～－６０の範囲である。
【0169】
細胞透過の効率および細胞透過のメカニズムは、タンパク質の表面に沿って正に帯電した残基（例えば、アルギニン）の数を増やすことによってコンジュゲートの総形式電荷を最適化することによって調節することができ、配列は、細胞小器官の特異性または特定の癌細胞の特異性を達成するためのシグナル伝達配列（配列番号１４、１５、１６もしくは１７および／またはホスファチジルコリン）を用いてＮ末端で変異させることができる。
【0170】
一実施形態では、直接的な細胞透過（すなわち非エンドサイトーシス）に好適な本発明のコンジュゲートのタンパク質は、以下の構造パラメータのうちの１つ以上を有し得る。
－０．２～１２Ｎ／ｍ２の硬さパラメータを有するベータらせん構造（ベータヘリックス）、
－５ｎｍ～２５ｎｍの長さ、
－１ｎｍ～５ｎｍの直径
－２５ＫＤａ～１００ＫＤａの分子量、
－アルギニンラダー（１０～３０個のＡｒｇ残基）、リジンラダー（１０～３０個のＬｙｓ残基）、アスパラギンラダー（１０～４０個のＡｓｎ残基）、アスパラギン酸（１０～４０個のＡｓｐ残基）およびグルタミン酸（１０～４０個のＧｌｕ残基）の長さに沿ったタンパク質の表面上の表面露出した正および負の電荷の残基の交互に配置されたラダー、
－総形式電荷（－２０～－６０）。
－０．２～１２Ｎ／ｍ２の硬さパラメータを有するベータらせん構造（ベータヘリックス）、
－５ｎｍ～２５ｎｍの長さ、
－１ｎｍ～５ｎｍの直径
－２５ＫＤａ～１００ＫＤａの分子量、
－アルギニンラダー（１０～３０個のＡｒｇ残基）、リジンラダー（１０～３０個のＬｙｓ残基）、アスパラギンラダー（１０～４０個のＡｓｎ残基）、アスパラギン酸（１０～４０個のＡｓｐ残基）およびグルタミン酸（１０～４０個のＧｌｕ残基）の長さに沿ったタンパク質の表面上の表面露出した正および負の電荷の残基の交互に配置されたラダー、
－総形式電荷（－２０～－６０）。
【0171】
本発明の実施形態では、βらせんタンパク質と機能性分子との間のリンカーは、例えば、アミド（もしくはペプチド）、またはエステル共有結合を介した、または金属配位を介したβらせんタンパク質と機能性分子との間の直接リンクによって形成され得るか、あるいは、リンカーはリンカー分子の形態をとることができる。好適には、連結は共有結合もしくは非共有結合または相互作用によるものである。リンカーがリンカー分子である場合、リンカー分子は、β－らせんタンパク質と機能性分子とを可逆的に接続する任意の適切な形態をとることができる。いくつかの実施形態では、リンカー分子は、ペプチドまたはタンパク質、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）リンカー、有機分子、金属コンジュゲート、薬物－金属コンジュゲート、核酸結合ドメイン、および核酸挿入分子からなる群から選択され得る。
【0172】
一実施形態では、本発明は、５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲の長さ、および１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲の幅の組換えβらせんタンパク質を有するコンジュゲートを開示し、βらせんタンパク質は、機能性分子に連結された特定の配列を有している。好適には、特定の配列はペンタペプチドリピートである。実施形態では、機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質のコンセンサス配列は、（ＳＴＡＶ）１（ＤＮ）２（ＬＦ）３（ＳＴＲ）４（Ｇ）５である。ペンタペプチドリピートタンパク質の例は、配列番号１、２、６および８である。
【0173】
本開示の実施形態では、組換えβらせんタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群から選択される。
【0174】
本発明の実施形態では、機能性分子は、任意の有機分子（抗癌剤、抗生物質、ＮＳＡＩＤ、鎮痛剤または任意の他の薬物分子、蛍光染料、殺虫剤（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ）、駆除剤（ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ）など）、薬物－金属錯体、金属、抗体、タンパク質、多糖類、核酸、ペプチド、核局在化シグナル、量子ドットおよびナノ粒子であり得る。
【0175】
コンジュゲートは、コンジュゲートが細胞膜を透過する能力によって促進される機能性分子を細胞内に移入させるために使用することができる。コンジュゲートまたは機能性分子、あるいはその両方に関連する、またはそれらと統合される適切な局在化シグナルを用いて、本発明のコンジュゲートを使用して、機能性分子を細胞内部の特定の部分、例えば、細胞内部に存在する細胞小器官に標的化することができる。
【0176】
一実施形態では、本発明はまた、本発明の細胞透過性コンジュゲートを使用して、機能性分子を細胞内に移入させるためのプロセスを開示する。開示されたプロセスは、細胞標識、細胞透過、および任意の機能性分子の細胞小器官への標的化にさらに使用することができる。
【0177】
本開示の一実施形態では、機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲である。
【0178】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質は、ペンタペプチドリピートタンパク質である。
【0179】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質は、コンセンサス配列（ＳＴＡＶ）１（ＤＮ）２（ＬＦ）３（ＳＴＲ）４（Ｇ）５を有するタンデムリピートペンタペプチドを含む。
【0180】
本開示の一実施形態では、機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表される。
【0181】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号１に記載の配列を有するＡｌｂＧである。
【0182】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号２に記載の配列を有するＥｆｓＱＮＲである。
【0183】
本開示の一実施形態では、機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号３に記載の配列を有する不凍タンパク質である。
【0184】
本開示の一実施形態では、機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号４に記載の配列を有する不凍タンパク質である。
【0185】
本開示の一実施形態では、機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号５に記載の配列を有する不凍タンパク質である。
【0186】
本開示の一実施形態では、機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号６に記載の配列を有するＱＮＲＢ１である。
【0187】
本開示の一実施形態では、機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号７に記載の配列を有するＵＤＰ Ｎ－アセチルグルコサミンアシルトランスフェラーゼである。
【0188】
本開示の一実施形態では、機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号８に記載の配列を有するＮＰ２７５である。
【0189】
本開示の一実施形態では、機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号９に記載の配列を有するペクチン酸リアーゼＣである。
【0190】
本開示の一実施形態では、機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号１０に記載の配列を有するペクチン酸リアーゼである。
【0191】
本開示の一実施形態では、機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号１１に記載の配列を有する炭酸脱水酵素である。
【0192】
本開示の一実施形態では、機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号１２に記載の配列を有するペクチンリアーゼＡである。
【0193】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、染料、薬物、金属、薬物－金属錯体、タンパク質、酵素、抗体、核酸、多糖類、核局在化シグナル、ナノ粒子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0194】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、染料である。
【0195】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、薬物である。
【0196】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、金属である。
【0197】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、薬物－金属錯体である。
【0198】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、タンパク質である。
【0199】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、酵素である。
【0200】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、抗体である。
【0201】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、核酸である。
【0202】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、多糖類である。
【0203】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、核局在化シグナルである。
【0204】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、ナノ粒子である。
【0205】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載の細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、共有結合、非共有結合、およびこれらの組み合わせによって組換えβらせんタンパク質に連結されている。
【0206】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載の細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、共有結合によって組換えβらせんタンパク質に連結されている。
【0207】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載の細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、非共有結合によって組換えβらせんタンパク質に連結されている。
【0208】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載の機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、複合体は、シグナル配列をさらに含む。
【0209】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載の機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、コンジュゲートは、リン脂質分子をさらに含む。
【0210】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載の機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、コンジュゲートは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７からなる群から選択されるシグナル配列をさらに含む。
【0211】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載の機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、コンジュゲートは、ホスファチジルコリン分子をさらに含む。
【0212】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載の機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、コンジュゲートは、配列番号１４に記載のシグナル配列をさらに含む。
【0213】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載の機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、コンジュゲートは、配列番号１５に記載のシグナル配列をさらに含む。
【0214】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載の機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、コンジュゲートは、配列番号１６に記載のシグナル配列をさらに含む。
【0215】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載の機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、コンジュゲートは、配列番号１７に記載のシグナル配列をさらに含む。
【0216】
本開示の一実施形態では、機能性分子を細胞の核に移入させるための機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、コンジュゲートは、配列番号１４に記載のシグナル配列をさらに含む。
【0217】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞の核に移入させるための機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表され、コンジュゲートは、配列番号１４に記載のシグナル配列をさらに含む。
【0218】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞の核に移入させるための機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、染料、薬物、金属、薬物－金属錯体、タンパク質、酵素、抗体、核酸、多糖類、核局在化シグナル、ナノ粒子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0219】
本開示の一実施形態では、機能性分子を細胞の小胞体に移入させるための機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、コンジュゲートは、配列番号１５に記載のシグナル配列をさらに含む。
【0220】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞の小胞体に移入させるための機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表され、コンジュゲートは、配列番号１５に記載のシグナル配列をさらに含む。
【0221】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞の小胞体に移入させるための機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、染料、薬物、金属、薬物－金属錯体、タンパク質、酵素、抗体、核酸、多糖類、核局在化シグナル、ナノ粒子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0222】
本開示の一実施形態では、機能性分子を細胞のミトコンドリアに移入させるための機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、コンジュゲートは、配列番号１６に記載のシグナル配列をさらに含む。
【0223】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞のミトコンドリアに移入させるための機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表され、コンジュゲートは、配列番号１６に記載のシグナル配列をさらに含む。
【0224】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞のミトコンドリアに移入させるための機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、染料、薬物、金属、薬物－金属錯体、タンパク質、酵素、抗体、核酸、多糖類、核局在化シグナル、ナノ粒子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0225】
本開示の一実施形態では、機能性分子をＰ－カドヘリン過剰発現乳癌細胞に移入させるための機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、コンジュゲートは、配列番号１７に記載のシグナル配列をさらに含む。
【0226】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子をＰ－カドヘリン過剰発現乳癌細胞に移入させるための機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表され、コンジュゲートは、配列番号１７に記載のシグナル配列をさらに含む。
【0227】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子をＰ－カドヘリン過剰発現乳癌細胞に移入させるための機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、染料、薬物、金属、薬物－金属錯体、タンパク質、酵素、抗体、核酸、多糖類、核局在化シグナル、ナノ粒子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0228】
本開示の一実施形態では、機能性分子を細胞の膜に移入させるための機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、コンジュゲートは、ホスファチジルコリン分子をさらに含む。
【0229】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞の膜に移入させるための機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表され、コンジュゲートは、ホスファチジルコリン分子をさらに含む。
【0230】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞の膜に移入させるための機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが提供され、機能性分子は、染料、薬物、金属、薬物－金属錯体、タンパク質、酵素、抗体、核酸、多糖類、核局在化シグナル、ナノ粒子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0231】
本開示の一実施形態では、機能性分子を細胞に移入するためのプロセスが提供され、該プロセスは、（ａ）機能性分子を組換えβらせんタンパク質に連結させてコンジュゲートを得ることと、（ｂ）コンジュゲートを少なくとも１つの細胞と接触させることと、を含み、コンジュゲートを接触させることが、機能性分子を細胞に移入させ、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲である。一実施形態では、プロセスは、工程（ｃ）の後、工程（ｄ）の細胞内のコンジュゲートの移入を検出することをさらに含む。
【0232】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、ペンタペプチドリピートタンパク質である。
【0233】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、コンセンサス配列（ＳＴＡＶ）１（ＤＮ）２（ＬＦ）３（ＳＴＲ）４（Ｇ）５を有するタンデムリピートペンタペプチドを含む。
【0234】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表される。
【0235】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号１に記載の配列を有するＡｌｂＧである。
【0236】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号２に記載の配列を有するＥｆｓＱＮＲである。
【0237】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号３に記載の配列を有する不凍タンパク質である。
【0238】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号４に記載の配列を有する不凍タンパク質である。
【0239】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号５に記載の配列を有する不凍タンパク質である。
【0240】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号６に記載の配列を有するＱＮＲＢ１である。
【0241】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号７に記載の配列を有するＵＤＰ Ｎアセチルグルコサミンアシルトランスフェラーゼである。
【0242】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号８に記載の配列を有するＮＰ２７５である。
【0243】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号９に記載の配列を有するペクチン酸リアーゼＣである。
【0244】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号１０に記載の配列を有するペクチン酸リアーゼである。
【0245】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号１１に記載の配列を有する炭酸脱水酵素である。
【0246】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号１２に記載の配列を有する。
【0247】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、機能性分子は、染料、薬物、金属、薬物－金属錯体、タンパク質、酵素、抗体、核酸、多糖類、核局在化シグナル、ナノ粒子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0248】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、機能性分子は、染料である。
【0249】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、機能性分子は、薬物である。
【0250】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、機能性分子は、金属である。
【0251】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、機能性分子は、薬物－金属錯体である。
【0252】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、機能性分子は、タンパク質である。
【0253】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、機能性分子は、酵素である。
【0254】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、機能性分子は、抗体である。
【0255】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、機能性分子は、核酸である。
【0256】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、機能性分子は、多糖類である。
【0257】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、機能性分子は、核局在化シグナルである。
【0258】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、機能性分子は、ナノ粒子である。
【0259】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、機能性分子は、共有結合、非共有結合、およびこれらの組み合わせによって組換えβらせんタンパク質に連結されている。
【0260】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、細胞は、真核細胞、原核細胞、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0261】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、細胞は、原核細胞である。
【0262】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、細胞は、真核細胞である。
【0263】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号１に記載の配列によって表され、機能性分子は、ＮＨＳ－クマリン染料である。
【0264】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号２に記載の配列によって表され、機能性分子は、ＮＨＳ－クマリン染料である。
【0265】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号２に記載の配列によって表され、機能性分子は、ルテニウム金属錯体である。
【0266】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、このプロセスは、細胞標識のために使用される。
【0267】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、このプロセスは、機能性分子を細胞に送達させるために使用される。
【0268】
本開示の一実施形態では、機能性分子を細胞小器官に移入させるためのプロセスが提供され、該プロセスは、（ａ）機能性分子を組換えβらせんタンパク質に連結させてコンジュゲートを得ることと、（ｂ）配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択される任意の１つのシグナル配列をコンジュゲートにさらに組み込むことと、（ｃ）工程（ｂ）のコンジュゲートを少なくとも１つの細胞と接触させることと、を含み、工程（ｂ）のコンジュゲートを接触させることが、細胞内の細胞小器官に機能性分子を移入させ、細胞小器官が、核、小胞体、およびミトコンドリアからなる群から選択され、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲である。一実施形態では、プロセスは、工程（ｃ）の後、工程（ｄ）の細胞内のコンジュゲートの移入を検出することをさらに含む。
【0269】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞小器官に移入させるためのプロセスが提供され、組換えβらせんタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表される。
【0270】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞の核に移入させるためのプロセスが提供され、シグナル配列は、配列番号１４に記載される通りである。
【0271】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞の小胞体に移入させるためのプロセスが提供され、シグナル配列は、配列番号１５に記載される通りである。
【0272】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞のミトコンドリアに移入させるためのプロセスが提供され、シグナル配列は、配列番号１６に記載される通りである。
【0273】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子を細胞小器官に移入させるためのプロセスが提供され、機能性分子は、染料、薬物、金属、薬物－金属錯体、タンパク質、酵素、抗体、核酸、多糖類、核局在化シグナル、ナノ粒子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0274】
本開示の一実施形態では、機能性分子をＰ－カドヘリン過剰発現乳癌細胞に移入させるためのプロセスが提供され、該プロセスは、（ａ）機能性分子を組換えβらせんタンパク質に連結させて複合体を得ることと、（ｂ）配列番号１７に記載のシグナル配列を複合体にさらに組み込むことと、（ｃ）工程（ｂ）の複合体を少なくとも１つのＰ－カドヘリン過剰発現乳癌細胞と接触させることと、を含み、工程（ｂ）の複合体を接触させることが、機能性分子をＰ－カドヘリン過剰発現乳癌細胞に移入させ、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲である。一実施形態では、プロセスは、工程（ｃ）の後、工程（ｄ）の細胞内の複合体の移入を検出することをさらに含む。
【0275】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子をＰ－カドヘリン過剰発現乳癌細胞に移入させるためのプロセスが提供され、配列を有する組換えβらせんタンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群から選択される。
【0276】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される機能性分子をＰ－カドヘリン過剰発現乳癌細胞に移入させるためのプロセスが提供され、機能性分子は、染料、薬物、金属、薬物－金属錯体、タンパク質、酵素、抗体、核酸、多糖類、核局在化シグナル、ナノ粒子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0277】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるプロセスが提供され、このプロセスは、機能性分子の細胞への標的化送達のために使用される。
【0278】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるプロセスが提供され、このプロセスは、細胞の標識のために使用される。
【0279】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるプロセスが提供され、このプロセスは、細胞中の薬物の標的化送達のために使用される。
【0280】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性複合体が提供され、組換えβらせんタンパク質は、機能性分子を細胞に送達させるために使用され、機能性分子は、染料、薬物、金属、薬物－金属コンジュゲート、タンパク質、酵素、抗体、核酸、多糖類、核局在化シグナル、ナノ粒子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0281】
本開示の一実施形態では、機能性分子を細胞内に存在するアクチンタンパク質に移入させるためのプロセスが提供され、該プロセスは、（ａ）機能性分子を組換えβらせんタンパク質に連結させてコンジュゲートを得ることと、（ｂ）配列番号２２に記載のシグナル配列を複合体にさらに組み込むことと、（ｃ）工程（ｂ）のコンジュゲートを少なくとも１つの細胞と接触させることと、を含み、工程（ｂ）のコンジュゲートを接触させることが、機能性分子を細胞に移入させ、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲である。一実施形態では、プロセスは、工程（ｃ）の後、工程（ｄ）の細胞内のコンジュゲートの移入を検出することをさらに含む。
【0282】
本開示の一実施形態では、機能性分子を細胞内に存在するチューブリンタンパク質に移入させるためのプロセスが提供され、該プロセスは、（ａ）機能性分子を組換えβらせんタンパク質に連結させてコンジュゲートを得ることと、（ｂ）配列番号２３に記載のシグナル配列をコンジュゲートにさらに組み込むことと、（ｃ）工程（ｂ）のコンジュゲートを少なくとも１つの細胞と接触させることと、を含み、工程（ｂ）のコンジュゲートを接触させることが、機能性分子をＰ－カドヘリン過剰発現乳癌細胞に移入させ、βらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲である。一実施形態では、プロセスは、工程（ｃ）の後、工程（ｄ）の細胞内のコンジュゲートの移入を検出することをさらに含む。
【0283】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートが提供され、組換えβらせんタンパク質は、細胞透過のために使用される。
【0284】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートが提供され、組換えβらせんタンパク質は、細胞標識のために使用される。
【0285】
核酸を含む細胞透過性分子
一実施形態では、本発明は、遺伝子治療または遺伝子編集治療が直面する、機能性分子としての核酸フラグメントの送達の問題に対する解決策を提供する。本明細書は、核酸分子に連結された組換えβらせんタンパク質、例えば、細胞膜を透過することができる、ＲＮＡ－またはＤＮＡ－プラスミドなどのプラスミドを含むコンジュゲートを開示している。一実施形態では、連結された組換えβらせんタンパク質は、好適な相互作用力（静電力または疎水性力など）によって、またはリンカー要素、分子、一部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）または部分（ｍｏｉｅｔｙ）を介して、１つ以上の核酸分子、好適には単一の核酸分子またはプラスミドに連結され得る。
一実施形態では、本発明は、遺伝子治療または遺伝子編集治療が直面する、機能性分子としての核酸フラグメントの送達の問題に対する解決策を提供する。本明細書は、核酸分子に連結された組換えβらせんタンパク質、例えば、細胞膜を透過することができる、ＲＮＡ－またはＤＮＡ－プラスミドなどのプラスミドを含むコンジュゲートを開示している。一実施形態では、連結された組換えβらせんタンパク質は、好適な相互作用力（静電力または疎水性力など）によって、またはリンカー要素、分子、一部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）または部分（ｍｏｉｅｔｙ）を介して、１つ以上の核酸分子、好適には単一の核酸分子またはプラスミドに連結され得る。
【0286】
組換えβらせんタンパク質、リンカー、およびプラスミドを含むコンジュゲートは、細胞膜を首尾よく透過して、プラスミドの一部を形成する遺伝子の発現を確立することが示されている。コンジュゲートはエンドサイトーシスの経路を回避し、細胞膜を直接透過することによって細胞膜を横切る。したがって、コンジュゲートは、エンドサイトーシスを介した侵入が直面する問題を克服し、同時に細胞膜を効果的に透過する。
【0287】
一実施形態では、本発明は、細胞膜を透過することができるコンジュゲートを開示する。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、リンカーを介して核酸分子に連結された、５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲の長さ、および１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲の幅の組換えβらせんタンパク質を含む。一実施形態では、組換えβらせんタンパク質は、コンセンサス配列（ＳＴＡＶ）１（ＤＮ）２（ＬＦ）３（ＳＴＲ）４（Ｇ）５を有するペンタペプチドリピートタンパク質であり得る。本開示の別の実施形態では、組換えβらせんタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群から選択される。
【0288】
本開示によれば、一実施形態では、組換えβらせんタンパク質は、リンカー要素、分子、一部分または部分によって核酸分子に連結されている。実施形態では、リンカー要素は、共有結合または非共有結合による直接連結であり得る。リンカーがリンカー分子である場合、それは、タンパク質、金属コンジュゲート、薬物－金属コンジュゲート、ＤＮＡ結合ドメイン、および核酸挿入分子からなる群から選択され得る。一実施形態では、コンジュゲートの一部を含む核酸分子は、少なくとも１つの目的の遺伝子を含む。一実施形態では、核酸分子は、組換えβらせんタンパク質およびリンカーを含む複合体に連結されて、本発明に開示されるようなコンジュゲートを形成する。一実施形態では、コンジュゲートは、細胞膜を透過することによって細胞に入ることができ、核酸分子の一部を形成する遺伝子は、細胞内で発現することができる。
【0289】
本発明はまた、本発明のコンジュゲートを使用して、核酸分子を細胞内に移入させるためのプロセスを開示する。一実施形態では、開示されるプロセスは、細胞内で目的の遺伝子を送達させるための非ウイルスアプローチを容易にするための遺伝子治療技術または遺伝子編集技術にさらに使用することができ、それにより、欠陥遺伝子の編集を効果的に可能にするか、または細胞内部の欠陥遺伝子もしくはタンパク質を補う。
【0290】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲である。
【0291】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表される。
【0292】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、ペンタペプチドリピートタンパク質である。
【0293】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、コンセンサス配列（ＳＴＡＶ）１（ＤＮ）２（ＬＦ）３（ＳＴＲ）４（Ｇ）５を有するタンデムリピートペンタペプチドを含む。
【0294】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、リンカーは、タンパク質、金属コンジュゲート、薬物－金属コンジュゲート、ＤＮＡ結合ドメイン、核酸挿入分子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるリンカー分子である。
【0295】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表され、リンカーは、タンパク質、金属コンジュゲート、薬物－金属コンジュゲート、ＤＮＡ結合ドメイン、核酸挿入分子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるリンカー分子である。
【0296】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、リンカーは、共有結合、非共有結合、およびこれらの組み合わせによって、組換えβらせんタンパク質に連結されている。
【0297】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、リンカーは、タンパク質、金属コンジュゲート、薬物－金属コンジュゲート、ＤＮＡ結合ドメイン、核酸挿入分子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるリンカー分子であり、リンカーは、共有結合、非共有結合、およびこれらの組み合わせによって、組換えβらせんタンパク質に連結されている。
【0298】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、核酸分子は、少なくとも１つの目的の遺伝子を含む。
【0299】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表され、核酸分子は、少なくとも１つの目的の遺伝子を含む。
【0300】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表され、リンカーは、タンパク質、金属コンジュゲート、薬物－金属コンジュゲート、ＤＮＡ結合ドメイン、核酸挿入分子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるリンカー分子であり、核酸分子は、少なくとも１つの目的の遺伝子を含む。
【0301】
一実施形態では、本発明は、細胞膜を横切って、細胞および／またはその区画への遺伝子編集分子機構の送達の問題に対する解決策を、ゲノム編集システムの１つ以上の分子をコードするプラスミドまたは核酸を細胞にトランスフェクトする手段を提供することによって提供する。プラスミドまたは核酸が細胞内に入ると、細胞内のゲノム編集システムの１つ以上の分子を、細胞プロセスを使用して調製し、任意にゲノム編集システムの他の必要な構成要素と組み合わせて、細胞内に完全な遺伝子編集システムを提供することができる。
【0302】
本開示の一実施形態では、核酸またはプラスミド中の目的の遺伝子は、ゲノム編集システムの１つ以上の分子をコードする。好適には、ゲノム編集システムの１つ以上の分子は、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、例えば、Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（登録商標））、ＤＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＤＮＡ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるが、これらに限定されない。
【0303】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号１に記載の配列を有するＡｌｂＧである。
【0304】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号２に記載の配列を有するＥｆｓＱＮＲである。
【0305】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号３に記載される配列を有する不凍タンパク質である。
【0306】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号４に記載される配列を有する不凍タンパク質である。
【0307】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号５に記載される配列を有する不凍タンパク質である。
【0308】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号６に記載の配列を有するＱＮＲＢ１である。
【0309】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号７に記載の配列を有するＵＤＰ Ｎアセチルグルコサミンアシルトランスフェラーゼである。
【0310】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号８に記載の配列を有するＮＰ２７５である。
【0311】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号９に記載の配列を有するペクチン酸リアーゼＣである。
【0312】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号１０に記載の配列を有するペクチン酸リアーゼである。
【0313】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号１１に記載の配列を有する炭酸脱水酵素である。
【0314】
本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートが提供され、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さは５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅は１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲であり、βらせんタンパク質は、配列番号１２に記載の配列を有するペクチンリアーゼＡである。
【0315】
本開示の一実施形態では、核酸分子、またはプラスミドを細胞に移入させるためのプロセスが提供され、該プロセスは、（ｉ）核酸分子を、（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、を含む複合体に連結してコンジュゲートを得ることと、（ｉｉ）コンジュゲートを少なくとも１つの細胞と接触させることと、を含み、コンジュゲートを接触させることが、核酸分子を細胞に移入させ、組換えβらせんタンパク質の長さが５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅が１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲である。
【0316】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される核酸分子、またはプラスミドを細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表される。
【0317】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される核酸分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、ペンタペプチドリピートタンパク質である。
【0318】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される核酸分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、コンセンサス配列（ＳＴＡＶ）１（ＤＮ）２（ＬＦ）３（ＳＴＲ）４（Ｇ）５を有するタンデムリピートペンタペプチドを含む。
【0319】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される核酸分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、リンカーは、タンパク質、金属コンジュゲート、薬物－金属コンジュゲート、ＤＮＡ結合ドメイン、核酸挿入分子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるリンカー分子である。
【0320】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される核酸分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、βらせんタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表され、リンカーは、タンパク質、金属コンジュゲート、薬物－金属コンジュゲート、ＤＮＡ結合ドメイン、核酸挿入分子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるリンカー分子である。
【0321】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される核酸分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、リンカーは、共有結合、非共有結合、およびこれらの組み合わせによって組換えβらせんタンパク質に連結されている。
【0322】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される核酸分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、リンカーは、タンパク質、金属コンジュゲート、薬物－金属コンジュゲート、ＤＮＡ結合ドメイン、核酸挿入分子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるリンカー分子であり、リンカーは、共有結合、非共有結合、およびこれらの組み合わせによって組換えβらせんタンパク質に連結されている。
【0323】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される核酸分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれかである。
【0324】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載される核酸分子を細胞に移入させるためのプロセスが提供され、核酸、またはプラスミド中の目的の遺伝子は、ゲノム編集システムの１つ以上の分子をコードする。好適には、ゲノム編集システムの１つ以上の分子は、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、例えば、Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（登録商標））、ＤＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＤＮＡ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるが、これらに限定されない。
【0325】
細胞膜を横切って遺伝子編集分子を効率的に移入させるための細胞透過性ペプチド
本発明は、細胞膜を横切って、細胞および／またはその区画への遺伝子編集分子機構の送達の問題に対する解決策を提供する。本明細書は、細胞膜を効率的に透過することができる、少なくとも１つの遺伝子編集分子または遺伝子編集複合体に連結された組換えβらせんタンパク質を含むコンジュゲートを開示している。一実施形態では、組換えβらせんタンパク質は、非共有相互作用によってエンドヌクレアーゼおよび１つ以上のｇＲＮＡ分子に連結され得る。一実施形態では、組換えβらせんタンパク質は、非共有相互作用によって、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集分子、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはｇＲＮＡ、および／またはＣａｓ９と１つ以上のｇＲＮＡ分子との複合体に連結され得る。
本発明は、細胞膜を横切って、細胞および／またはその区画への遺伝子編集分子機構の送達の問題に対する解決策を提供する。本明細書は、細胞膜を効率的に透過することができる、少なくとも１つの遺伝子編集分子または遺伝子編集複合体に連結された組換えβらせんタンパク質を含むコンジュゲートを開示している。一実施形態では、組換えβらせんタンパク質は、非共有相互作用によってエンドヌクレアーゼおよび１つ以上のｇＲＮＡ分子に連結され得る。一実施形態では、組換えβらせんタンパク質は、非共有相互作用によって、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集分子、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはｇＲＮＡ、および／またはＣａｓ９と１つ以上のｇＲＮＡ分子との複合体に連結され得る。
【0326】
組換えβらせんタンパク質およびＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集分子を含むコンジュゲートは、細胞膜を首尾よく透過して、ゲノムの部位特異的編集を可能にすることが示されている。理論に束縛されるものではないが、コンジュゲートはエンドサイトーシスの経路を回避し、膜を直接透過することによって細胞膜を横切ると仮定されている。したがって、コンジュゲートは、エンドサイトーシスを介した侵入が直面する問題を克服し、同時に細胞膜を効果的に透過する。
【0327】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、リンカーを介して核酸分子に連結された、５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲の長さ、および１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲の幅の組換えβらせんタンパク質を含む。一実施形態では、組換えβらせんタンパク質は、コンセンサス配列（ＳＴＡＶ）１（ＤＮ）２（ＬＦ）３（ＳＴＲ）４（Ｇ）５を有するペンタペプチドリピートタンパク質であり得る。本開示の別の実施形態では、組換えβらせんタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群から選択される。
【0328】
本開示によれば、一実施形態では、組換えβらせんタンパク質は、リンカー要素、分子、一部分または部分によって核酸分子に連結されている。実施形態では、リンカー要素は、共有結合または非共有結合による直接連結であり得る。リンカーがリンカー分子である場合、それは、タンパク質、金属コンジュゲート、薬物－金属コンジュゲート、ＤＮＡ結合ドメイン、および核酸挿入分子からなる群から選択され得る。
【0329】
一実施形態では、コンジュゲートは、細胞膜を透過することによって細胞に入り、部位特異的編集を行うことができる関連するゲノムに移動することができる。
【0330】
本発明はまた、本発明のコンジュゲートを使用して細胞内にＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰを移入させるためのプロセスを開示する。一実施形態では、開示されるプロセスは、既存の遺伝子を編集、除去、および／または新しい遺伝子を付加することを可能にするための非ウイルスアプローチを容易にするための遺伝子編集技術にさらに使用することができる。
【0331】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰを細胞に移入させるためのプロセスが提供され、細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれかである。
【0332】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートが提供され、コンジュゲートはトランスフェクション剤として使用される。
【0333】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートが提供され、コンジュゲートは遺伝子治療に使用される。
【実施例】
【0334】
実施例－機能性分子を含む細胞透過性分子
ここで、本開示は、本開示の働きを例示することを意図し、本開示の範囲に対する制限を暗示することを限定的にとることを意図しない、実際の実施例で例示される。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を、開示されるプロセスおよび組成物の実施に使用することができるが、例示的なプロセス、デバイスおよび材料は、本明細書に記載される。この開示は、特定の方法、および記載された実験条件に限定されず、このようなプロセスおよび条件は変化し得ることを理解されたい。
ここで、本開示は、本開示の働きを例示することを意図し、本開示の範囲に対する制限を暗示することを限定的にとることを意図しない、実際の実施例で例示される。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を、開示されるプロセスおよび組成物の実施に使用することができるが、例示的なプロセス、デバイスおよび材料は、本明細書に記載される。この開示は、特定の方法、および記載された実験条件に限定されず、このようなプロセスおよび条件は変化し得ることを理解されたい。
【0335】
以下の実施例では、プラスミドおよびタンパク質の研究を実施するための方法およびプロトコルが提供されている。コンジュゲートを得るためのプロトコル、タンパク質の標識、ならびにタンパク質－薬物コンジュゲートおよびタンパク質－標識コンジュゲートを使用して細胞透過研究を実施する方法も提供される。結果のセクションは、本発明に開示されるコンジュゲートの細胞透過能力の概念実証を具体的に説明する。異なる細胞株のインビトロ標識は、開示された方法に従って、本発明のコンジュゲートを使用して実施した。細胞透過による薬物取り込みを増強するコンジュゲートの能力を研究するために、薬物－タンパク質コンジュゲートを用いたアッセイも実施した。
【0336】
材料および方法
染料ヘキスト３３３４２は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから調達し、ＮＨＳ－クマリン、ならびにＡＴＴＯ５２０－ＮＨＳ、ＡＴＴＯ３９０－ＮＨＳ、およびＡＴＴＯ６４７Ｎ－ＮＨＳはＳｉｇｍａから調達した。ＵＶ－可視分光光度法およびＣＤスペクトルに使用される有機溶媒ならびに試薬は、ＳｉｇｍａおよびＭｅｒｃｋから調達した。プラスミドの発現およびタンパク質の精製を研究するための試薬は、Ｓｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈおよびＭｅｒｃｋから調達した。ＭＴＴアッセイに必要な試薬は、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓから調達した。ルテニウム金属錯体は、Ｓｉｇｍａから調達した。
染料ヘキスト３３３４２は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから調達し、ＮＨＳ－クマリン、ならびにＡＴＴＯ５２０－ＮＨＳ、ＡＴＴＯ３９０－ＮＨＳ、およびＡＴＴＯ６４７Ｎ－ＮＨＳはＳｉｇｍａから調達した。ＵＶ－可視分光光度法およびＣＤスペクトルに使用される有機溶媒ならびに試薬は、ＳｉｇｍａおよびＭｅｒｃｋから調達した。プラスミドの発現およびタンパク質の精製を研究するための試薬は、Ｓｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈおよびＭｅｒｃｋから調達した。ＭＴＴアッセイに必要な試薬は、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓから調達した。ルテニウム金属錯体は、Ｓｉｇｍａから調達した。
【0337】
実施例１
プラスミド／タンパク質の研究－配列番号１９に示されるＡｌｂＧ遺伝子を含有するプラスミドは、以前に公開された方法により得た（Ｖｅｔｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｆ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１１：６７（３）：２９６－３０２、その内容は参照により本明細書に組み込まれ、特定の詳細は以下に提供される）。
プラスミド／タンパク質の研究－配列番号１９に示されるＡｌｂＧ遺伝子を含有するプラスミドは、以前に公開された方法により得た（Ｖｅｔｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｆ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１１：６７（３）：２９６－３０２、その内容は参照により本明細書に組み込まれ、特定の詳細は以下に提供される）。
【0338】
ＡｌｂＧのオープンリーディングフレームは、Ｘアルビリネアン（ＡＴＣＣ２９１８４；Ｐｉｅｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００９，１０：６１６，１－１５）染色体ＤＮＡをテンプレートとして使用する標準的なＰＣＲ技術によって増幅された。ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位をそれぞれ含有するオリゴヌクレオチドＡｌｂＧＦ（５’－ＡＴＣＣＣＧＣＴＣＡＴＡＴＧＣＣＧＧＣＣＡＡＧＡＣＣＣＴＴＧ－３’）およびＡｌｂＧＲ（５’－ＡＴＣＣＣＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＴＣＧＧＡＣＡＧＣＴＣＧＡＴＡＴＣ－３’）を使用した。ＰＣＲフラグメントをｐＥＴ－２８ａ（＋）にクローニングし、トロンビン切断可能なＮ－末端Ｈｉｓ６タグを担持する組換えＡｌｂＧをＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させた。振とうフラスコ増殖のために、カナマイシン（３５μｇ／ｍｌ）を補充した１リットルのルリアブロス培地に１０ｍｌの一晩培養物を接種し、３７℃でインキュベートした。培養物を対数増殖期中期（約０．８のＡ６００）まで増殖させ、２０℃に冷却し、０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、さらに２０℃で一晩インキュベートした。すべての精製手順は、４℃で実施した。細胞を３０００ｇでの遠心分離によって採集し、緩衝液Ａ［３００ｍＭのＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害剤、リゾチーム（５μｇ／ｍｌ）およびＤＮａｓｅ Ｉ（０．１μｇ／ｍｌ）を含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．８］に再懸濁し、２０分間撹拌した。次いで、細胞を超音波処理によって溶解し、細胞破片を１００００ｇで３０分間の遠心分離によって除去した。上清を緩衝液Ａで事前に平衡化したニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）カラムに充填し、１０カラム容量の同じ緩衝液で洗浄した。結合したタンパク質を０～０．３Ｍの直線的なイミダゾール勾配で溶出し、ピーク画分をプールして濃縮した。
【0339】
配列番号２に示されるようなＥｆｓＱＮＲ遺伝子を含有するプラスミドは、以前に公開された方法により得た（Ｈｅｇｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１１ Ｊａｎ；５５（１）：１１０－１１７であって、その内容は参照により本明細書に組み込まれ、詳細は以下に提供される）。
【0340】
ＥｆｓＱＮＲのオープンリーディングフレームは、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ Ｖ５８３（ＡＴＣＣ７００８０２；ＥＮＴＦＡ２２６１８５）染色体ＤＮＡをテンプレートとして使用する標準的なＰＣＲ技術によって増幅された。ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位をそれぞれ含有するオリゴヌクレオチド（５’－ＡＴＣＣＣＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＣＴＴＡＴＣＣＣＴＴＧＣＣＡ－３’）および（５’－ＡＴＣＣＣＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＧＴＡＡＴＣＡＣＣＡＡＡＣＣＡＡＧＴ－３’）を使用した。ＰＣＲフラグメントをｐＥＴ－２８ａ（＋）にクローニングし、トロンビン切断可能なＮ－末端Ｈｉｓ６タグを担持する組換えＥｆｓＱＮＲをＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させた。振とうフラスコ増殖のために、カナマイシン（３５μｇ／ｍｌ）を補充した１リットルのルリアブロス培地に１０ｍｌの一晩培養物を接種し、３７℃でインキュベートした。培養物を対数増殖期中期（約０．８のＡ６００）まで増殖させ、２０℃に冷却し、０．５ｍＭのイソプロピル－β－ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、さらに２０℃で一晩インキュベートした。
【0341】
細胞を１，２００ｇでの遠心分離によって採集し、プロテアーゼ阻害剤、リゾチーム（５μｇ／ｍｌ）、およびＤＮａｓｅ Ｉ（０．１μｇ／ｍｌ）を含有する緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．８］、３００ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁し、混合物を２０分間撹拌した。次いで、細胞を超音波処理によって溶解し、細胞破片を１０，０００ｇで３０分間の遠心分離によって除去した。上清を緩衝液Ａで事前に平衡化したＮｉ－ＮＴＡカラムに充填し、１０カラム容量の同じ緩衝液で洗浄した。結合したタンパク質を０～０．３Ｍの直線的なイミダゾール勾配で溶出し、画分をプールして濃縮した。
【0342】
比較例として、配列番号１３に示されるようなＴｔＣｕＡ遺伝子を含有するプラスミドを、参照により本明細書に組み込まれるＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，４７，１３０９～１３１８の方法によって得た。
【0343】
実施例２
毒性アッセイ－業界標準のＭＴＴアッセイ（例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を実行して、哺乳動物細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞に対するβ－らせんタンパク質－細胞毒性薬物コンジュゲートの毒性を分析した。標準的なプロトコルを使用して細胞を培養した。１００万個の細胞を共焦点プレート（１ｃｍの皿）に播種し、６～８時間増殖させた。細胞毒性薬物とＥｆｓＱＮＲタンパク質との混合物（２：１の比率で混合）を細胞に添加し、室温で１５分から２４時間～７２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＭＴＴで処理し、さらに２４時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、５７０ｎｍでの吸光度値を分析した。活発な代謝を有する生細胞は、ＭＴＴを５７０ｎｍ付近で最大吸光度を有する紫色のホルマザン産物に変換する。死細胞はＭＴＴをホルマザンに変換できないため、５７０ｎｍでの吸光度値を分析することにより、所与のタンパク質または任意の他の分子の生細胞の比率を計算することができる。
毒性アッセイ－業界標準のＭＴＴアッセイ（例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を実行して、哺乳動物細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞に対するβ－らせんタンパク質－細胞毒性薬物コンジュゲートの毒性を分析した。標準的なプロトコルを使用して細胞を培養した。１００万個の細胞を共焦点プレート（１ｃｍの皿）に播種し、６～８時間増殖させた。細胞毒性薬物とＥｆｓＱＮＲタンパク質との混合物（２：１の比率で混合）を細胞に添加し、室温で１５分から２４時間～７２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＭＴＴで処理し、さらに２４時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、５７０ｎｍでの吸光度値を分析した。活発な代謝を有する生細胞は、ＭＴＴを５７０ｎｍ付近で最大吸光度を有する紫色のホルマザン産物に変換する。死細胞はＭＴＴをホルマザンに変換できないため、５７０ｎｍでの吸光度値を分析することにより、所与のタンパク質または任意の他の分子の生細胞の比率を計算することができる。
【0344】
実施例３
蛍光染料によるタンパク質の標識－蛍光染料は、コンジュゲートの細胞膜透過能力を調査するための機能性分子の一例とみなされた。組換えタンパク質の染料による標識は、暗条件で一連の反応を実行することによって実施した。標識されるタンパク質をＰＢＳ緩衝液（１ＸおよびｐＨ７．３）に採集し、染料をタンパク質の２～３倍の濃度で採集した。タンパク質を０．１Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）に添加し、続いて染料を添加した。時々振とうしながら氷上に保持されたタンパク質を含有する緩衝液に染料を非常にゆっくりと（毎回３μｌ）添加した。得られた溶液をアルミホイルで包み、光を避けた。溶液を室温で１時間撹拌し、次いでゲル濾過によって精製し、すなわち、脱塩カラムまたは１ＸＰＢＳ緩衝液を用いてＰＤ１０カラムを通過させた。得られた標識タンパク質を、染料：タンパク質比を決定するために、ＵＶ－可視分光光度法を使用して特性評価した。
蛍光染料によるタンパク質の標識－蛍光染料は、コンジュゲートの細胞膜透過能力を調査するための機能性分子の一例とみなされた。組換えタンパク質の染料による標識は、暗条件で一連の反応を実行することによって実施した。標識されるタンパク質をＰＢＳ緩衝液（１ＸおよびｐＨ７．３）に採集し、染料をタンパク質の２～３倍の濃度で採集した。タンパク質を０．１Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）に添加し、続いて染料を添加した。時々振とうしながら氷上に保持されたタンパク質を含有する緩衝液に染料を非常にゆっくりと（毎回３μｌ）添加した。得られた溶液をアルミホイルで包み、光を避けた。溶液を室温で１時間撹拌し、次いでゲル濾過によって精製し、すなわち、脱塩カラムまたは１ＸＰＢＳ緩衝液を用いてＰＤ１０カラムを通過させた。得られた標識タンパク質を、染料：タンパク質比を決定するために、ＵＶ－可視分光光度法を使用して特性評価した。
【0345】
実施例４
標識タンパク質の細胞取り込み－哺乳動物細胞をＡｌｂＧ（配列番号１）、ＥｆｓＱＮＲ（配列番号２）、および比較例としてＴｔＣｕＡ（配列番号１３）などの異なる標識タンパク質で処理することによって、標識タンパク質の取り込みをチェックした。ＴｔＣｕＡは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓという生物からのチトクロームオキシダーゼｃタンパク質である。それは、配列番号１３に記載のアミノ酸配列によって表される。細胞を共焦点プレート（１ｃｍの皿）に１００万の濃度で播種し、６～８時間増殖させた。その後、標識タンパク質を、種々の濃度で細胞に添加し、５％のＣＯ２および３７℃の標準的条件下でインキュベートした。次いで、細胞をＨＢＳＳ（ハンクスブランク塩溶液）またはＰＢＳを用いて３時間および２４時間後に２回洗浄し、蛍光顕微鏡および／または共焦点レーザー走査型顕微鏡で観察した。
標識タンパク質の細胞取り込み－哺乳動物細胞をＡｌｂＧ（配列番号１）、ＥｆｓＱＮＲ（配列番号２）、および比較例としてＴｔＣｕＡ（配列番号１３）などの異なる標識タンパク質で処理することによって、標識タンパク質の取り込みをチェックした。ＴｔＣｕＡは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓという生物からのチトクロームオキシダーゼｃタンパク質である。それは、配列番号１３に記載のアミノ酸配列によって表される。細胞を共焦点プレート（１ｃｍの皿）に１００万の濃度で播種し、６～８時間増殖させた。その後、標識タンパク質を、種々の濃度で細胞に添加し、５％のＣＯ２および３７℃の標準的条件下でインキュベートした。次いで、細胞をＨＢＳＳ（ハンクスブランク塩溶液）またはＰＢＳを用いて３時間および２４時間後に２回洗浄し、蛍光顕微鏡および／または共焦点レーザー走査型顕微鏡で観察した。
【0346】
標識タンパク質の取り込みは、Ｅ－Ｃｏｌｉおよび酵母（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）細胞を、ＡｌｂＧ（配列番号１）、ＥｆｓＱＮＲ（配列番号２）などの異なる標識タンパク質で処理することによってチェックした。Ｅ ｃｏｌｉまたはＫｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ細胞に接種し、ＯＤが０．６に達するまで一晩増殖させた。細胞を５０倍に希釈し、３マイクロモルの標識タンパク質（コンジュゲート）を添加した。細胞をさらに、標準的増殖条件（３７℃の振とう条件）下で増殖させた。次いで、処理した細胞を遠心分離し、ＰＢＳで３～４回洗浄した。次いで、細胞を１００マイクロリットルのＰＢＳ中に分散させ、蛍光／共焦点顕微鏡で撮像した。
【0347】
さらに、緑色蛍光染料（Ａ－５２０）で標識されたＡｌｂＧ（配列番号１）、ＥｆｓＱＮＲ（配列番号２）などの異なるタンパク質が、共焦点レーザー走査顕微鏡法で観察されたような、細菌のいくつかの薬物耐性株（Ｐｓｅｕｄｏｖｉｂｒｉｏ種、Ａｄ３７／５／１３／１４およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒであり、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ株は、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ナリジクス酸、カナマイシン、およびペニシリンなどの抗生物質に耐性である）、酵母細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、およびｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、植物細胞（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ゼブラフィッシュ胚およびショウジョウバエ胚に取り込まれることが分かった。
【0348】
細菌および酵母細胞中の取り込みについてのプロトコル
・実験の前日にそれぞれの細菌株および酵母株を接種し、一晩増殖させ、
・細胞を遠心分離し、２ｍｌの新鮮な培地を添加し、
・１００～２００μＬの細胞を混合物に添加し、
・１０μＭの緑色標識ＣＰＰを添加し、
・新鮮な培地を添加して、容量を１ｍＬにもっていき、
・２４時間後、処理した細胞を遠心分離し、ＰＢＳで３～４回洗浄し、
・細胞を１００マイクロリットルのＰＢＳ中に分散させ、蛍光／共焦点顕微鏡で撮像した（図２５および２６）。
・実験の前日にそれぞれの細菌株および酵母株を接種し、一晩増殖させ、
・細胞を遠心分離し、２ｍｌの新鮮な培地を添加し、
・１００～２００μＬの細胞を混合物に添加し、
・１０μＭの緑色標識ＣＰＰを添加し、
・新鮮な培地を添加して、容量を１ｍＬにもっていき、
・２４時間後、処理した細胞を遠心分離し、ＰＢＳで３～４回洗浄し、
・細胞を１００マイクロリットルのＰＢＳ中に分散させ、蛍光／共焦点顕微鏡で撮像した（図２５および２６）。
【0349】
植物細胞（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）への取り込みについてのプロトコル
・植物は実験前に７日間成長させ、
・緑色蛍光染料（Ａ－５２０）で標識されたＡｌｂＧ（配列番号１）、ＥｆｓＱＮＲ（配列番号２）などの２０μＭの異なる細胞透過性タンパク質を、５００μＬのＰＢＳ中で緩衝液中の植物［７日間成長させた３つの植物］に添加し、
・混合物を標準的増殖条件下で、成長室に２４時間置き（連続光の供給および２３℃の温度で成長室を静的に保った）、
・植物をＰＢＳで３回洗浄した後、新鮮なＰＢＳを添加し、顕微鏡で細胞を可視化した。干渉を避けるために、根および茎の細胞などの着色されていない細胞を視覚化のために選択した（図２３および２４）。
・植物は実験前に７日間成長させ、
・緑色蛍光染料（Ａ－５２０）で標識されたＡｌｂＧ（配列番号１）、ＥｆｓＱＮＲ（配列番号２）などの２０μＭの異なる細胞透過性タンパク質を、５００μＬのＰＢＳ中で緩衝液中の植物［７日間成長させた３つの植物］に添加し、
・混合物を標準的増殖条件下で、成長室に２４時間置き（連続光の供給および２３℃の温度で成長室を静的に保った）、
・植物をＰＢＳで３回洗浄した後、新鮮なＰＢＳを添加し、顕微鏡で細胞を可視化した。干渉を避けるために、根および茎の細胞などの着色されていない細胞を視覚化のために選択した（図２３および２４）。
【0350】
ゼブラフィッシュ胚およびショウジョウバエ胚への取り込みについてのプロトコル
・ゼブラフィッシュおよびショウジョウバエの胚を採取し、ＰＢＳで洗浄し、
・緑色蛍光染料（Ａ－５２０）で標識されたＡｌｂＧ（配列番号１）、ＥｆｓＱＮＲ（配列番号２）などの１０μＭの異なる細胞透過性タンパク質を、胚を含有するバイアルに添加して、２時間インキュベートし、
・胚を採集し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中に分散させ、ガラスカバースリップ上に置き、顕微鏡下で可視化する（図２７、２８）。
・ゼブラフィッシュおよびショウジョウバエの胚を採取し、ＰＢＳで洗浄し、
・緑色蛍光染料（Ａ－５２０）で標識されたＡｌｂＧ（配列番号１）、ＥｆｓＱＮＲ（配列番号２）などの１０μＭの異なる細胞透過性タンパク質を、胚を含有するバイアルに添加して、２時間インキュベートし、
・胚を採集し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中に分散させ、ガラスカバースリップ上に置き、顕微鏡下で可視化する（図２７、２８）。
【0351】
これらの結果は、本発明のＣＰＰが、細胞膜および／または細胞壁を横切ることによって、多種多様な細胞型の細胞質にカーゴを移入させることができることを示している。これが、活性化酸カップリングケミストリー（ＥＤＣ／ＮＨＳ）を使用して、薬物のカルボン酸（－ＣＯＯＨ）基とＣＰＰのアミン基（リジン残基から）とをコンジュゲートすることにより、ＣＰＰをシプロフロキサンおよびペニシリンなどの抗生物質または任意の他の抗生物質とコンジュゲートする可能性を開く。これらの反応は、文献および教科書で周知である（参考文献：Ｇｒｅｇ Ｔ ＨｅｒｍａｎｓｅｎによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２６４－２６５ページ）。アジピン酸ジヒドラジド、スクシンイミジル６－ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラジン、Ｃ６－スクシンイミジル６－ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラジン、スクシンイミジルヒドラジニウムニコチネート塩酸塩などのリンカーの、ＣＰＰを抗生物質とコンジュゲートするための使用。これらのリンカーは、細胞内条件下で加水分解されて、細胞内に抗生物質を放出することが知られている。
【0352】
抗生物質－ＣＰＰコンジュゲートは、コンジュゲートされていない抗生物質と比較した場合、細胞取り込みの効率を改善し、糖タンパク質などの細胞メカニズムによる薬物排出を低減または排除する。糖タンパク質の結合部位は＜１ｋＤａの領域にあるが、ＣＰＰ－薬物コンジュゲートは、４８ＫＤａのサイズのものである。このことは、古い抗生物質の改善に役立ち、抗菌薬耐性の問題への対処に貢献することができる。同様に、この技術を使用して、魚および植物への抗生物質／駆除剤／栄養素の供給効率を向上させることができる。
【0353】
実施例５
薬物の細胞取り込み－ＨｅＬａ細胞を、本発明の細胞透過性コンジュゲートを使用して、薬物の増強された取り込みを決定するために使用した。ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートに１０，０００の濃度で播種し、６～８時間増殖させた。ルテニウム金属錯体とＥｆｓＱＮＲとを１：１、１：２、１：３の異なる比率で混合してコンジュゲートを形成し、その後細胞に添加した。ルテニウムとＥｆｓＱＮＲとを１：２の比率で形成したコンジュゲートは、向上した結果をもたらした。２４時間後の細胞死を、前述のようにＭＴＴアッセイによって監視し、ＨｅＬａ細胞によるルテニウム－ＥｆｓＱＮＲコンジュゲートの取り込み率と相関していた。
薬物の細胞取り込み－ＨｅＬａ細胞を、本発明の細胞透過性コンジュゲートを使用して、薬物の増強された取り込みを決定するために使用した。ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートに１０，０００の濃度で播種し、６～８時間増殖させた。ルテニウム金属錯体とＥｆｓＱＮＲとを１：１、１：２、１：３の異なる比率で混合してコンジュゲートを形成し、その後細胞に添加した。ルテニウムとＥｆｓＱＮＲとを１：２の比率で形成したコンジュゲートは、向上した結果をもたらした。２４時間後の細胞死を、前述のようにＭＴＴアッセイによって監視し、ＨｅＬａ細胞によるルテニウム－ＥｆｓＱＮＲコンジュゲートの取り込み率と相関していた。
【0354】
実施例１～５の結果
タンパク質およびコンジュゲートの特性評価
構造特異性－ＡｌｂＧタンパク質のサイズを、公開されている結晶構造ｐｄｂ ｉｄ：２ｘｔ２．ｐｄｂから決定した。Ｐｙｍｏｌ（登録商標）で二量体構造の端から端までの原子距離を測定することによって、長さを１０．７ｎｍ、幅（直径）を２．６ｎｍと決定した。総形式電荷は、－２７であった。正および負の電荷の残基が交互に配置されている：アルギニンラダー（合計２０個のＡｒｇ残基）、リジン（１４個の残基）およびアスパラギン酸（３０個のＡｓｐ残基）およびグルタミン酸（３１個のＧｌｕ残基）の存在。タンパク質の表面に沿ったアスパラギン（２０個のＡｓｎ残基）ラダー。
タンパク質およびコンジュゲートの特性評価
構造特異性－ＡｌｂＧタンパク質のサイズを、公開されている結晶構造ｐｄｂ ｉｄ：２ｘｔ２．ｐｄｂから決定した。Ｐｙｍｏｌ（登録商標）で二量体構造の端から端までの原子距離を測定することによって、長さを１０．７ｎｍ、幅（直径）を２．６ｎｍと決定した。総形式電荷は、－２７であった。正および負の電荷の残基が交互に配置されている：アルギニンラダー（合計２０個のＡｒｇ残基）、リジン（１４個の残基）およびアスパラギン酸（３０個のＡｓｐ残基）およびグルタミン酸（３１個のＧｌｕ残基）の存在。タンパク質の表面に沿ったアスパラギン（２０個のＡｓｎ残基）ラダー。
【0355】
ＥｆｓＱＮＲタンパク質のサイズを、公開されている結晶構造ｐｄｂ ｉｄ：２ｗ７ｚ．ｐｄｂから決定した。Ｐｙｍｏｌ（登録商標）で二量体構造の端から端までの原子距離を測定することによって、タンパク質の長さを１０．９ｎｍ、幅（直径）を２．８ｎｍと決定した。総形式電荷－４１。交互に配置された正および負の電荷の残基：アルギニンラダー（合計１６個のＡｒｇ残基）、リジン（１２個の残基）およびアスパラギン酸（２５個のＡｓｐ残基）およびグルタミン酸（３３個のＧｌｕ残基）の存在。タンパク質の表面に沿ったアスパラギン（３３個のＡｓｎ残基）ラダー。
【0356】
比較のために、ＴｔＣｕＡタンパク質のサイズを、公開されている結晶構造ｐｄｂ ｉｄ：２ＣｕＡ．ｐｄｂから決定した。Ｐｙｍｏｌ（登録商標）で構造の端から端までの原子距離を測定することによって、長さを３．３ｎｍ、幅（直径）を１．９ｎｍと決定した。本構造は、５個のアルギニン残基、４個のリジン残基、９個のグルタミン酸残基、および６個のアスパラギン残基を含み、総電荷は－３である。
【0357】
図１は、研究に使用した精製ＡｌｂＧタンパク質（配列番号１）のＣＤスペクトルを示している。タンパク質をＰＢＳで透析し、１～５マイクロモル濃度を使用して２００～３００ｎｍ領域のＣＤ分光法を行った。必要に応じて、ＰＢＳでさらに希釈した。このタンパク質の２２０ｎｍでのＣＤの負の値は、βシート（βバレルまたはβらせん構造）の配置を示す。
【0358】
図２は、βらせんタンパク質ＡｌｂＧおよびＥｆｓＱＮＲの発現に使用される精製プラスミドを示しており、それぞれ３回（ＡｌｂＧ－１からＡｌｂＧ－３まで、およびＥｆｓＱＮＲ－１からＥｆｓＱＮＲ－３まで）で同じ結果を示している。
【0359】
図３は、ポリアクリルアミドゲルでのＡｌｂＧおよびＥｆｓＱＮＲタンパク質の精製タンパク質バンドを示している。ＳＤＳ－ゲル電気泳動を実行した後、単量体形態の両方のタンパク質の分子量が約３０ｋＤａであることが注目された。ＡｌｂＧおよびＥｆｓＱＮＲの二量体形態のおおよその分子量は約４８ｋＤａである。タンパク質、ＡｌｂＧおよびＥｆｓＱＮＲを使用して機能性分子とコンジュゲートを形成し、次いでこれを使用して細胞透過性効果を研究した。研究過程を決定するためにＨｅＬａ細胞を使用して、タンパク質をなんらかの細胞障害性についてさらにテストした（以下の「細胞障害性試験」を参照）。
【0360】
図４は、ＥｆｓＱＮＲタンパク質およびＡｌｂＧタンパク質のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析の結果を示している。この実験では、タンパク質を水中で透析し、０．１％ＴＦＡおよびアセトニトリルを含むマトリックスとしてシナピン酸を使用してサンプルを調製した。１～１０マイクロモルのタンパク質を使用した。結果は、約２６．５ｋＤａの分子量を有するＥｆｓＱＮＲタンパク質、および約２３ｋＤａの分子量を有するＡｌｂＧタンパク質を示している。
【0361】
細胞毒性試験
前述のＭＴＴアッセイを使用して、ＨｅＬａ細胞に対するＡｌｂＧおよびＥｆｓＱＮＲタンパク質の毒性を試験した。毒性アッセイでは、プラセボ、対照、ＡｌｂＧ（３０μＭ）およびＥｆｓＱＮＲ（３０μＭ）のサンプルを３通りで使用した。表１は、ＭＴＴ処理後の各サンプルの５７０ｎｍでの吸光度値を示している。値を観察すると、３０μＭのＡｌｂＧおよび３０μＭのＥｆｓＱＮＲで処理された細胞は、対照細胞と比較して９５％の生存率を示すことが理解できる。これは、テストされた濃度でテストされたタンパク質がＨｅＬａ細胞に対して毒性がなく、したがって、さらなる実験で使用するのに安全な濃度であることを明確に示唆している。
前述のＭＴＴアッセイを使用して、ＨｅＬａ細胞に対するＡｌｂＧおよびＥｆｓＱＮＲタンパク質の毒性を試験した。毒性アッセイでは、プラセボ、対照、ＡｌｂＧ（３０μＭ）およびＥｆｓＱＮＲ（３０μＭ）のサンプルを３通りで使用した。表１は、ＭＴＴ処理後の各サンプルの５７０ｎｍでの吸光度値を示している。値を観察すると、３０μＭのＡｌｂＧおよび３０μＭのＥｆｓＱＮＲで処理された細胞は、対照細胞と比較して９５％の生存率を示すことが理解できる。これは、テストされた濃度でテストされたタンパク質がＨｅＬａ細胞に対して毒性がなく、したがって、さらなる実験で使用するのに安全な濃度であることを明確に示唆している。
【0362】
ここに示す表１は、タンパク質の毒性を評価するためのＭＴＴアッセイにおける５７０ｎｍでの吸光度値を表示している。
【0363】
【表1】
【0364】
この実験のプラセボは、ｐＨ８．０の２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液であったが、検討した対照は、いずれのタンパク質またはその他の基質も添加していないＨｅＬａ細胞のみであった。
【0365】
標識試験
図４は、前述の手順による、標識されたＡｌｂＧおよびＥｆｓＱＮＲコンジュゲートのＵＶ－可視分光光度法を示している（上記の「蛍光染料によるタンパク質の標識」を参照）。ＵＶ－可視スペクトルを分析して、両方のコンジュゲートの標識比を計算した。標識比は、タンパク質分子当たりに付着した染料の数を意味する。これは、染料の吸光度値（標識に使用される染料に応じた波長で）と２８０ｎｍでのタンパク質の吸光度との間の比率を測定することによって計算する。この実験で標識に使用した染料は、ＮＨＳ－クマリンであった。ＡｌｂＧタンパク質の場合、染料：タンパク質分子比は１．９５であることが観察される。ＥｆｓＱＮＲの場合、染料：タンパク質分子比は５．５であることがわかる。ＵＶ－ｖｉｓスペクトルにより、ＡｌｂＧタンパク質とＥｆｓＱＮＲタンパク質との両方が、ＮＨＳ－クマリン染料で標識されていることが確認された。この試験では、標識タンパク質をさらに使用して細胞透過を確立した。
図４は、前述の手順による、標識されたＡｌｂＧおよびＥｆｓＱＮＲコンジュゲートのＵＶ－可視分光光度法を示している（上記の「蛍光染料によるタンパク質の標識」を参照）。ＵＶ－可視スペクトルを分析して、両方のコンジュゲートの標識比を計算した。標識比は、タンパク質分子当たりに付着した染料の数を意味する。これは、染料の吸光度値（標識に使用される染料に応じた波長で）と２８０ｎｍでのタンパク質の吸光度との間の比率を測定することによって計算する。この実験で標識に使用した染料は、ＮＨＳ－クマリンであった。ＡｌｂＧタンパク質の場合、染料：タンパク質分子比は１．９５であることが観察される。ＥｆｓＱＮＲの場合、染料：タンパク質分子比は５．５であることがわかる。ＵＶ－ｖｉｓスペクトルにより、ＡｌｂＧタンパク質とＥｆｓＱＮＲタンパク質との両方が、ＮＨＳ－クマリン染料で標識されていることが確認された。この試験では、標識タンパク質をさらに使用して細胞透過を確立した。
【0366】
細胞透過試験
図５は、ＮＨＳ－Ｃで標識されたＡｌｂＧ、ＥｆｓＱＮＲ、およびＴｔＣｕＡタンパク質（コンジュゲート）で処理されたＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡画像を示している。標識タンパク質（コンジュゲート）の摂取量を、この試験の対照セットとみなされた未処理のＨｅＬａ細胞と比較した。ヘキストブルーは、タンパク質の標識に使用されるＮＨＳ－Ｃ染料とともに使用される核標識染料である。タンパク質ＡｌｂＧおよびＥｆｓＱＮＲは、５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲の長さ、および１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲の幅のβらせんタンパク質であり、本発明の組換えβらせんタンパク質を表す。しかしながら、ＴｔＣｕＡは、約４ｎｍの長さのタンパク質であり、βバレルを形成するβストランドから構成され、それにより、本発明の組換えβらせんタンパク質の比較例を表す。これらの２つの異なるカテゴリーのタンパク質は、異なるタイプのβらせんタンパク質と比較して、本発明のコンジュゲートの優れた細胞透過能力を確立するために、この試験のために考慮された。
図５は、ＮＨＳ－Ｃで標識されたＡｌｂＧ、ＥｆｓＱＮＲ、およびＴｔＣｕＡタンパク質（コンジュゲート）で処理されたＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡画像を示している。標識タンパク質（コンジュゲート）の摂取量を、この試験の対照セットとみなされた未処理のＨｅＬａ細胞と比較した。ヘキストブルーは、タンパク質の標識に使用されるＮＨＳ－Ｃ染料とともに使用される核標識染料である。タンパク質ＡｌｂＧおよびＥｆｓＱＮＲは、５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲の長さ、および１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲の幅のβらせんタンパク質であり、本発明の組換えβらせんタンパク質を表す。しかしながら、ＴｔＣｕＡは、約４ｎｍの長さのタンパク質であり、βバレルを形成するβストランドから構成され、それにより、本発明の組換えβらせんタンパク質の比較例を表す。これらの２つの異なるカテゴリーのタンパク質は、異なるタイプのβらせんタンパク質と比較して、本発明のコンジュゲートの優れた細胞透過能力を確立するために、この試験のために考慮された。
【0367】
図５では、パネルＡは、より明るい染料がないことを意味する核標識染料（ヘキストブルー）のみで処理された対照細胞を表し、パネルＢは、ヘキストブルー染料およびＴｔＣｕＡ－ＮＨＳＣ標識タンパク質（コンジュゲート）で処理された細胞を表し、パネルＣはヘキストブルー染料およびＡｌｂＧ－ＮＨＳＣ標識タンパク質（コンジュゲート）で処理された細胞を表し、パネルＤはヘキストブルー染料およびＥｆｓＱＮＲ－ＮＨＳＣ標識タンパク質（コンジュゲート）で処理された細胞を表す。図を観察すると、パネルＢに示すように、細胞内に見られる蛍光が大幅に少なく、これらの細胞内にＴｔＣｕＡ－ＮＨＳＣコンジュゲートがより少なく存在することを示しているが、パネルＣおよびパネルＤは、細胞内にＡｌｂＧ－ＮＨＳＣコンジュゲートおよびＥｆｓＱＮＲ－ＮＨＳＣコンジュゲートがより多く存在することを示している。したがって、ＴｔＣｕＡ－ＮＨＳＣコンジュゲートは、ＡｌｂＧ－ＮＨＳＣコンジュゲートおよびＥｆｓＱＮＲ－ＮＨＳＣコンジュゲートと比較して、細胞膜を効果的に透過して細胞内に侵入することができないことが理解できる。
【0368】
パネルＣおよびＤを比較すると、ＥｆｓＱＮＲ－ＮＨＳＣコンジュゲートはＡｌｂＧ－ＮＨＳＣコンジュゲートと比較してより効率的に膜を透過することができることを観察できる。したがって、３つのコンジュゲートの細胞透過能力は、ＴｔＣｕＡ－ＮＨＳＣ＜ＡｌｂＧ－ＮＨＳＣ＜ＥｆｓＱＮＲ－ＮＨＳＣのように細胞取り込みが増加する順で要約することができる。これはさらに、縦長さおよび横長さが５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅がそれぞれ１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲である組換えβらせんタンパク質を含むコンジュゲートの細胞透過能力を証明する。ＡｌｂＧおよびＥｆｓＱＮＲを独立して含むコンジュゲートは、ＴｔＣｕＡを含むコンジュゲートと比較して細胞透過性の向上を示すことができる。
【0369】
ＥｆｓＱＮＲタンパク質を含むコンジュゲートは細胞膜を透過する最高の能力を示したため、ＥｆｓＱＮＲタンパク質を、哺乳動物細胞の標識を増強するために様々な染料でさらに試験した。
【0370】
図２２は、コンジュゲートと細胞膜との直接相互作用を介して進行するリアルタイムの細胞侵入を示している。蛍光顕微鏡下で細胞を可視化するために、核に結合する染料ヘキスト３３３４２（青、図２２では暗く表示）および原形質膜に結合する染料Ａｌｅｘａ ５９４－ＷＧＡ（赤、図２２では明るく表示）で細胞を処理し、これは、ＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－５２０ＮＨＳ（緑色、図２２で明るい円として表示）が、エンドサイトーシスメカニズムを回避する直接メカニズムによって細胞内に効率的に透過することを示している。
【0371】
哺乳動物細胞の標識
図７は、ＨｅＬａ細胞の標識において染料とコンジュゲートしたＥｆｓＱＮＲを含むコンジュゲートの能力を示している。図６は、上記の標識方法に従って調製されたＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－５２０ＮＨＳで標識された細胞を示している。染料ヘキスト３３３４２（青、図７で暗く表示）は核に結合し、染料Ａｌｅｘａ ５９４－ＷＧＡ（赤、図７で明るく表示）は原形質膜に結合する。コンジュゲートは、ＥｆｓＱＮＲタンパク質を緑色蛍光染料ＡＴＴＯ－５２０ＮＨＳ（図７で最も明るい染料として表示）と連結することによって形成される。ＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－５２０ＮＨＳコンジュゲートがＨｅＬａ細胞を透過し、コンジュゲートで処理されていないＨｅＬａ細胞を示す対照パネルＡと比較した場合、細胞の効率的な標識（パネルＢ）につながることがはっきりと観察できる。
図７は、ＨｅＬａ細胞の標識において染料とコンジュゲートしたＥｆｓＱＮＲを含むコンジュゲートの能力を示している。図６は、上記の標識方法に従って調製されたＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－５２０ＮＨＳで標識された細胞を示している。染料ヘキスト３３３４２（青、図７で暗く表示）は核に結合し、染料Ａｌｅｘａ ５９４－ＷＧＡ（赤、図７で明るく表示）は原形質膜に結合する。コンジュゲートは、ＥｆｓＱＮＲタンパク質を緑色蛍光染料ＡＴＴＯ－５２０ＮＨＳ（図７で最も明るい染料として表示）と連結することによって形成される。ＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－５２０ＮＨＳコンジュゲートがＨｅＬａ細胞を透過し、コンジュゲートで処理されていないＨｅＬａ細胞を示す対照パネルＡと比較した場合、細胞の効率的な標識（パネルＢ）につながることがはっきりと観察できる。
【0372】
【0373】
図９は、上記の標識方法に従って調製されたＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－５２０ＮＨＳで標識されたミクログリア細胞についての同様の結果を示している。パネルＡは、細胞内部からの染料の有意な蛍光を示している。パネルＢは、核に結合する染料ヘキスト３３３４２（青、図９では暗く表示）および原形質膜に結合する染料Ａｌｅｘａ ５９４－ＷＧＡ（赤、図９では明るく表示）でさらに処理されたミクログリア細胞を示しており、これは、ＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－５２０ＮＨＳが細胞内に効率的に透過したことを示している。
【0374】
図１０は、上記の標識方法に従って調製されたコンジュゲートＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－５２０ＮＨＳで標識されたケラチノサイト細胞についての同様の結果を示している。パネルＡは、細胞内部からの染料の有意な蛍光を示している。パネルＢは、核に結合する染料ヘキスト３３３４２（青色、図１０では暗く表示）でさらに処理されたケラチノサイト細胞を示しており、これは、ＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－５２０ＮＨＳが細胞内に効率的に透過して核の近くに存在することを示している。
【0375】
図１１は、上記の標識方法に従って調製されたコンジュゲートＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－５２０ＮＨＳで標識されたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞についての同様の結果を示している。
【0376】
図１２は、上記の標識方法に従って調製されたＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－５２０ＮＨＳで標識されたマウスＥＳ細胞についての同様の結果を示している。図１２は、核に結合する染料ヘキスト３３３４２（青、図１２では暗く表示）および原形質膜に結合する染料Ａｌｅｘａ ５９４－ＷＧＡ（赤、図１２では明るく表示）で処理されたマウスＥＳ細胞を示しており、これは、ＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－５２０ＮＨＳが細胞内に効率的に透過したことを示している。
【0377】
非哺乳動物細胞の標識
図１３～１４および２１～２８は、細菌細胞（Ｅ ｃｏｌｉおよびＰｓｅｕｄｏｖｉｂｒｉｏ ＡＤ３７）、酵母細胞（ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓおよびＳａｃｈｒｏｍｙｃｅｓ種）、植物細胞（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種）、昆虫細胞（ショウジョウバエ胚）および魚類細胞（ゼブラフィッシュ胚）の標識において染料とコンジュゲートしたＥｆｓＱＮＲを含むコンジュゲートの能力を示している。図１３～１４および２１～２８は、それぞれ、上記の標識方法に従って調製したＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－５２０ＮＨＳで標識したＥ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｖｉｂｒｉｏ ＡＤ３７、ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｈｒｏｍｙｃｅｓ種、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種、ショウジョウバエ胚およびゼブラフィッシュ胚をそれぞれ示している。
図１３～１４および２１～２８は、細菌細胞（Ｅ ｃｏｌｉおよびＰｓｅｕｄｏｖｉｂｒｉｏ ＡＤ３７）、酵母細胞（ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓおよびＳａｃｈｒｏｍｙｃｅｓ種）、植物細胞（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種）、昆虫細胞（ショウジョウバエ胚）および魚類細胞（ゼブラフィッシュ胚）の標識において染料とコンジュゲートしたＥｆｓＱＮＲを含むコンジュゲートの能力を示している。図１３～１４および２１～２８は、それぞれ、上記の標識方法に従って調製したＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－５２０ＮＨＳで標識したＥ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｖｉｂｒｉｏ ＡＤ３７、ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｈｒｏｍｙｃｅｓ種、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種、ショウジョウバエ胚およびゼブラフィッシュ胚をそれぞれ示している。
【0378】
コンジュゲートで処理されたＨｅＬａ細胞のＦＡＣＳソーティング
図１５は、コンジュゲートＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－６４７Ｎで標識されたコンジュゲートで処理されたＨｅＬａ細胞の標準的なＦＡＣＳソーティングの結果を示している。細胞をわずか１０分間処理するだけで、（パネルＢ）は、対照（パネルＡ）と比較して染料の有意な取り込みをもたらし、これは１時間（パネルＣ）から測定された３時間の最大値（パネルＤ）まで増加し続ける。
図１５は、コンジュゲートＥｆｓＱＮＲ－ＡＴＴＯ－６４７Ｎで標識されたコンジュゲートで処理されたＨｅＬａ細胞の標準的なＦＡＣＳソーティングの結果を示している。細胞をわずか１０分間処理するだけで、（パネルＢ）は、対照（パネルＡ）と比較して染料の有意な取り込みをもたらし、これは１時間（パネルＣ）から測定された３時間の最大値（パネルＤ）まで増加し続ける。
【0379】
薬物取り込み試験
図１６は、ＨｅＬａ細胞におけるルテニウム金属錯体Ｒｕ（ＣＯ）３Ｃｌグリシネートの細胞取り込みを示している。ルテニウム金属錯体は、ＥｆｓＱＮＲタンパク質とコンジュゲートして、ルテニウム金属錯体－ＥｆｓＱＮＲからなるコンジュゲートを形成した。ＨｅＬａ細胞を上記のようにルテニウム金属錯体－ＥｆｓＱＮＲコンジュゲートで処理し（上記の「細胞透過試験」を参照）、前述のようにＭＴＴアッセイを実行して細胞の生存率をチェックすることにより、錯体の取り込みを検出した。グラフ（図１４）を観察すると、ルテニウム金属錯体のみで処理した場合、細胞取り込みはわずか０．５％であるのに対し、ルテニウム金属錯体－ＥｆｓＱＮＲタンパク質コンジュゲートで処理した場合、錯体の細胞取り込みは２４．４％に増加することがわかった。したがって、ＥｆｓＱＮＲタンパク質を含むコンジュゲートは、ルテニウム金属錯体単独と比較して、５０倍高い細胞取り込みを促進したことを確認することができる。この増強された取り込みは、本発明のコンジュゲートを使用して多くの命を救う薬物を標的に送達し、それによって薬物の用量を低減させ、続いて副作用を減少させることによってさらに活用することができる。
図１６は、ＨｅＬａ細胞におけるルテニウム金属錯体Ｒｕ（ＣＯ）３Ｃｌグリシネートの細胞取り込みを示している。ルテニウム金属錯体は、ＥｆｓＱＮＲタンパク質とコンジュゲートして、ルテニウム金属錯体－ＥｆｓＱＮＲからなるコンジュゲートを形成した。ＨｅＬａ細胞を上記のようにルテニウム金属錯体－ＥｆｓＱＮＲコンジュゲートで処理し（上記の「細胞透過試験」を参照）、前述のようにＭＴＴアッセイを実行して細胞の生存率をチェックすることにより、錯体の取り込みを検出した。グラフ（図１４）を観察すると、ルテニウム金属錯体のみで処理した場合、細胞取り込みはわずか０．５％であるのに対し、ルテニウム金属錯体－ＥｆｓＱＮＲタンパク質コンジュゲートで処理した場合、錯体の細胞取り込みは２４．４％に増加することがわかった。したがって、ＥｆｓＱＮＲタンパク質を含むコンジュゲートは、ルテニウム金属錯体単独と比較して、５０倍高い細胞取り込みを促進したことを確認することができる。この増強された取り込みは、本発明のコンジュゲートを使用して多くの命を救う薬物を標的に送達し、それによって薬物の用量を低減させ、続いて副作用を減少させることによってさらに活用することができる。
【0380】
図１７は、図１７に「ＣＹＤＤ」と表示された、化学療法薬であるシスプラチン（登録商標）（シスプラチンまたはシス－ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ））に連結したＥｆｓＱＮＲタンパク質を含むコンジュゲートで培養した哺乳動物細胞（ＨｅＬａおよびＨｅｐＧ２）の生存率試験の結果を示している。哺乳動物細胞（ＨｅＬａ：パネルＡ、またはＨｅｐＧ２：パネルＢ）を、標準的なプロトコルを使用して培養した。１００万個の細胞を共焦点プレート（１ｃｍの皿）に播種し、８時間増殖させた。次に、シスプラチン（登録商標）およびＥｆｓＱＮＲ（２：１のモル比で上記の方法に従って調製）を含むコンジュゲートを添加し、培養物を室温で１５分間維持した。細胞を標準的増殖条件下で２４時間および７２時間維持した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＭＴＴ溶液を添加した。ホルマザン染料が形成された後、ＤＭＳＯ中に溶解し、５５０ｎｍでの吸光度を測定した。テストした両方の細胞型において、本発明に従って薬物がコンジュゲートとして送達される場合、シスプラチン（登録商標）の同様の細胞毒性効果がより低い用量で示されることが結果から明らかである。
【0381】
テストしたすべての実験で、ＥｆｓＱＮＲタンパク質をＡｌｂＧタンパク質に置き換えたときに同様の結果が得られたことが留意される。
【0382】
利点
全体として、特定の長さおよび幅の組換えβらせんタンパク質と、機能性分子とを含むコンジュゲートが、非常に効率的な細胞膜透過性コンジュゲートとして作用することができると結論付けることができる。コンジュゲートが細胞膜を直接透過する能力は、エンドサイトーシスの侵入メカニズムと比較して利点を提供する。ＡｌｂＧ－ＮＨＳＣおよびＥｆｓＱＮＲ－ＮＨＳＣコンジュゲートの実用的な例は、細胞膜を透過するそれらの能力を実証する本開示において提供される。ＥｆｓＱＮＲ－染料コンジュゲートは、細胞膜を効果的に透過する能力があるため、様々な哺乳動物および非哺乳動物細胞の標識能力を向上させることが示されている。ＥｆｓＱＮＲおよび／またはＡｌｂＧを含むコンジュゲートは、ＨｅＬａおよびＨｅｐＧ２細胞におけるルテニウム金属錯体およびシスプラチン（登録商標）を含む薬物の細胞取り込みを増加させることが示されている。この能力をさらに活用して、癌細胞による様々な抗癌剤の取り込みを高めることができ、これは、効率的な方法で、同時に薬物の必要量を低減して癌細胞を選択的に標的化することにより、治療を容易にすることができる。抗癌剤の用量を低減することで、このような薬物の投与に伴う副作用を回避することもできる。
全体として、特定の長さおよび幅の組換えβらせんタンパク質と、機能性分子とを含むコンジュゲートが、非常に効率的な細胞膜透過性コンジュゲートとして作用することができると結論付けることができる。コンジュゲートが細胞膜を直接透過する能力は、エンドサイトーシスの侵入メカニズムと比較して利点を提供する。ＡｌｂＧ－ＮＨＳＣおよびＥｆｓＱＮＲ－ＮＨＳＣコンジュゲートの実用的な例は、細胞膜を透過するそれらの能力を実証する本開示において提供される。ＥｆｓＱＮＲ－染料コンジュゲートは、細胞膜を効果的に透過する能力があるため、様々な哺乳動物および非哺乳動物細胞の標識能力を向上させることが示されている。ＥｆｓＱＮＲおよび／またはＡｌｂＧを含むコンジュゲートは、ＨｅＬａおよびＨｅｐＧ２細胞におけるルテニウム金属錯体およびシスプラチン（登録商標）を含む薬物の細胞取り込みを増加させることが示されている。この能力をさらに活用して、癌細胞による様々な抗癌剤の取り込みを高めることができ、これは、効率的な方法で、同時に薬物の必要量を低減して癌細胞を選択的に標的化することにより、治療を容易にすることができる。抗癌剤の用量を低減することで、このような薬物の投与に伴う副作用を回避することもできる。
【0383】
実施例－核酸を含む細胞透過性分子
以下の段落では、細胞膜を透過することにより、細胞内に目的の遺伝子を有するプラスミドなどの核酸を送達するための実用的な例が提供されている。核酸分子またはプラスミドをさらに含むコンジュゲート（本明細書に記載の細胞透過性ペプチド）を使用することにより、送達が可能になる。実施例はまた、細胞膜を透過して細胞内に入る後の目的の遺伝子の発現を描写している。
以下の段落では、細胞膜を透過することにより、細胞内に目的の遺伝子を有するプラスミドなどの核酸を送達するための実用的な例が提供されている。核酸分子またはプラスミドをさらに含むコンジュゲート（本明細書に記載の細胞透過性ペプチド）を使用することにより、送達が可能になる。実施例はまた、細胞膜を透過して細胞内に入る後の目的の遺伝子の発現を描写している。
【0384】
第１の実施例は、本発明のコンジュゲートの実施形態を使用する、目的の遺伝子の細胞へのトランスフェクションを記載し、ここで、目的の遺伝子は、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）をコードするｍｃｈｅｒｒｙである。ｍｃｈｅｒｒｙ遺伝子を含有するプラスミドはタンパク質に連結してコンジュゲートを形成し、コンジュゲートはＥｆｓＱＮＲタンパク質および銅［ＩＩ］フェナントロリンを含む。コンジュゲートは、ＨｅＬａ細胞をトランスフェクトするために使用される。ＨｅＬａ細胞でのｍｃｈｅｒｒｙ遺伝子の発現の成功は、コンジュゲートが細胞膜を透過して細胞をトランスフェクトする能力を確立するための概念実証として示されている。
【0385】
材料および方法
銅フェナントロリン錯体は、商業的に調達した。
銅フェナントロリン錯体は、商業的に調達した。
【0386】
実施例６
タンパク質試験－ＥｆｓＱＮＲプラスミドの発現、インキュベーション条件、および精製を管理する試験は、以前に公開されたものに従い（Ｈｅｇｄｅ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１１：５５（１）：１１０－７、これは参照により本明細書に組み込まれる）、ＥｆｓＱＮＲタンパク質を得た。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）はＢｉｏ－Ｒａｄキットを使用して行い、タンパク質バンドは１２％ポリアクリルアミドゲルを使用して視覚化した。
タンパク質試験－ＥｆｓＱＮＲプラスミドの発現、インキュベーション条件、および精製を管理する試験は、以前に公開されたものに従い（Ｈｅｇｄｅ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１１：５５（１）：１１０－７、これは参照により本明細書に組み込まれる）、ＥｆｓＱＮＲタンパク質を得た。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）はＢｉｏ－Ｒａｄキットを使用して行い、タンパク質バンドは１２％ポリアクリルアミドゲルを使用して視覚化した。
【0387】
実施例７
プラスミドコンジュゲートの調製－銅［ＩＩ］フェナントロリン結合
本発明に開示されるように、コンジュゲートは、細胞をトランスフェクトするために調製され、コンジュゲートは、ＥｆｓＱＮＲ（配列番号２）、銅［ＩＩ］フェナントロリン、および目的の遺伝子を有するプラスミドを含む。
プラスミドコンジュゲートの調製－銅［ＩＩ］フェナントロリン結合
本発明に開示されるように、コンジュゲートは、細胞をトランスフェクトするために調製され、コンジュゲートは、ＥｆｓＱＮＲ（配列番号２）、銅［ＩＩ］フェナントロリン、および目的の遺伝子を有するプラスミドを含む。
【0388】
図１８は、本実施例においてコンジュゲートの調製に使用される、ｍｃｈｅｒｒｙ遺伝子（配列番号２５）を保有するプラスミドのベクターマップを示す。ＥｆｓＱＮＲタンパク質（配列番号２）は、５ｎｍ～２５ｎｍ、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲の長さおよび１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの幅を有するペンタペプチドリピート（配列番号１８で表示されるような）を有するβらせんタンパク質である。銅［ＩＩ］フェナントロリンは、本実施例においてリンカーとして使用される核酸挿入剤である。
【0389】
ＥｆｓＱＮＲプラスミドの発現を支配することによって得られたＥｆｓＱＮＲタンパク質を、銅［ＩＩ］フェナントロリン錯体と複合体化して、ＥｆｓＱＮＲおよび銅［ＩＩ］フェナントロリンを含む複合体を得た。得られた複合体を、ｍｃｈｅｒｒｙ遺伝子を有するプラスミドとさらに反応させて、本発明の実施形態によるコンジュゲートを得た。得られたコンジュゲートを使用して、ＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした。
【0390】
図１９は、トランスフェクションに使用できるコンジュゲートを調製するための２つのスキームを示している。スキーム１は、タンパク質と複合体を形成するリンカーとして銅［ＩＩ］フェナントロリンを使用することを示唆している。得られた複合体を、目的の遺伝子を有するプラスミドとさらに反応させて、トランスフェクションに使用されるコンジュゲートを得る。
【0391】
スキーム２は、タンパク質と複合体を形成するリンカーとしてＤＮＡ結合タンパク質を使用することを示唆している。得られた複合体を、目的の遺伝子を有するプラスミドとさらに反応させて、トランスフェクションに使用されるコンジュゲートを得る。
【0392】
この実施例では、銅［ＩＩ］フェナントロリンをリンカーとして使用して複合体を形成し、組換えβらせんタンパク質－ＥｆｓＱＮＲ（配列番号２）をｍｃｈｅｒｒｙ遺伝子を含有するプラスミドとともに使用する。複合体およびコンジュゲートの調製には、次のプロトコルを使用した。
【0393】
タンパク質ＥｆｓＱＮＲを銅［ＩＩ］フェナントロリンと１：２のモル比で混合し、室温で３０分間インキュベートして、複合体を得た。ｍｃｈｅｒｒｙ遺伝子を含有するプラスミドを前の工程で得られた複合体と混合し、４℃で３０分間インキュベートしてコンジュゲートを得た。このようにして得られたコンジュゲートを使用して、ＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした。
【0394】
実施例８
実施例７のコンジュゲートを使用したＨｅＬａ細胞のトランスフェクション
図２０は、実施例７で得られたコンジュゲートを使用したトランスフェクション実験のスキームを示している。この実施例では、トランスフェクション実験を実行するために以下の条件を使用した。
実施例７のコンジュゲートを使用したＨｅＬａ細胞のトランスフェクション
図２０は、実施例７で得られたコンジュゲートを使用したトランスフェクション実験のスキームを示している。この実施例では、トランスフェクション実験を実行するために以下の条件を使用した。
【0395】
実施例７（Ａ）で得られたｍｃｈｅｒｒｙプラスミドを含むコンジュゲートをＨｅＬａ細胞に添加した（播種後８時間）。３７℃および５％のＣＯ２条件で４８時間インキュベートすることにより、細胞を増殖させた。インキュベーション後、細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
【0396】
図２１は、トランスフェクション実験後のＨｅＬａ細胞の共焦点顕微鏡画像を示している。ＲＦＰの発現は、ＨｅＬａ細胞内の明るい（赤）ドットとして観察でき、これにより、本書に開示されているコンジュゲートの細胞透過性およびトランスフェクション能力が証明される。
【0397】
実施例９
プラスミドコンジュゲートの調製－エチレンジアミン結合
本発明でさらに開示されるように、コンジュゲートを、１つ以上の遺伝子編集分子をコードするのに典型的なプラスミドで細胞をトランスフェクトするために調製した。コンジュゲートは、ＥｆｓＱＮＲ（配列番号２）、エチレンジアミンリンカー、およびプラスミドを含んでいた。コンジュゲートは、既知のプロトコル（参照：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｅｎ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ；２０１３；ｐｐ２６４－２６５、これは参照により本明細書に組み込まれる）に従って調製した。使用したプラスミドは、２．７ｋｂの赤色標識環状プラスミドＤＮＡ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏから得られたＬａｂｅｌ ＩＴ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｙ（登録商標）３（製品コードＭＩＲ ７９０４））であった。
プラスミドコンジュゲートの調製－エチレンジアミン結合
本発明でさらに開示されるように、コンジュゲートを、１つ以上の遺伝子編集分子をコードするのに典型的なプラスミドで細胞をトランスフェクトするために調製した。コンジュゲートは、ＥｆｓＱＮＲ（配列番号２）、エチレンジアミンリンカー、およびプラスミドを含んでいた。コンジュゲートは、既知のプロトコル（参照：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｅｎ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ；２０１３；ｐｐ２６４－２６５、これは参照により本明細書に組み込まれる）に従って調製した。使用したプラスミドは、２．７ｋｂの赤色標識環状プラスミドＤＮＡ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏから得られたＬａｂｅｌ ＩＴ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｙ（登録商標）３（製品コードＭＩＲ ７９０４））であった。
【0398】
実施例１０
実施例９のコンジュゲートを使用したＭＣＦ７細胞のトランスフェクション
実施例９で得られたプラスミド［Ｌａｂｅｌ ＩＴ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｙ（登録商標）３（製品コードＭＩＲ ７９０４）］を含むコンジュゲートをＭＣＦ－７細胞に添加した（播種後８時間）。３７℃および５％のＣＯ２条件で１２～１６時間インキュベートすることにより、細胞を増殖させた。インキュベーション後、細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
実施例９のコンジュゲートを使用したＭＣＦ７細胞のトランスフェクション
実施例９で得られたプラスミド［Ｌａｂｅｌ ＩＴ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｙ（登録商標）３（製品コードＭＩＲ ７９０４）］を含むコンジュゲートをＭＣＦ－７細胞に添加した（播種後８時間）。３７℃および５％のＣＯ２条件で１２～１６時間インキュベートすることにより、細胞を増殖させた。インキュベーション後、細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
【0399】
図３０は、（Ａ）実施例１で得られたコンジュゲート（ＥｆｓＱＮＲ）（配列番号２）およびＭｉｒｕｓ Ｂｉｏから市販されている２．７ｋｂの赤色標識環状プラスミドＤＮＡ（製品コードＭＩＲ ７９０４）を使用したＭＣＦ７細胞でのトランスフェクション実験の結果、および（Ｂ）コンジュゲートの非存在下での上記で使用した赤色標識プラスミドの対照を使用したＭＣＦ７細胞でのトランスフェクション実験の結果を示す。（ｉ）はインキュベーション後の細胞の最大投射を示し、（ｉｉ）はインキュベーション後の細胞の強度プロットに対応する画像であり、（ｉｉｉ）はインキュベーション後の細胞の強度プロットを示す。
【0400】
最大投射画像（ｉ）では、ＥｆｓＱＮＲタンパク質にコンジュゲートされると、プラスミドが細胞全体にはるかによく広がることがはっきりと見ることができる。これは、プラスミドなどの標的核酸を細胞内に運び、局在化させるコンジュゲートの効率を示している。
【0401】
強度プロット（ｉｉｉ）から、プラスミドがタンパク質の助けを借りて細胞に入ることができ、広がりが均一かつ広範囲に及んでいることが明らかである。
【0402】
本明細書に提示される実施例は、トランスフェクションのためのコンジュゲートの調製におけるタンパク質ＥｆｓＱＮＲ（配列番号２）の使用を示すが、配列番号１および配列番号３から配列番号１２までに示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質もまた、コンジュゲートを形成するために効果的に使用することができる。また、配列番号１８に示されるようなペンタペプチドリピート配列を有し、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲、好適には１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲の長さ、および１ｎｍ～５ｎｍ、好適には１ｎｍ～３ｎｍの範囲の幅を有する組換えβらせんタンパク質は、本開示に記載されるコンジュゲートを調製するために使用することができる。同様に、本実施例は、リンカーとしての銅［ＩＩ］フェナントロリンまたはエチレンジアミンの使用を示しているが、ＤＮＡ結合タンパク質、金属コンジュゲート、薬物金属コンジュゲート、および他の核酸挿入分子のような他の分子もまた、トランスフェクション剤として効果的に使用されるコンジュゲートの形成において使用され得る。１つの部類のＤＮＡ結合タンパク質、すなわち、１２ｋＤａ未満の分子量を有するジンクフィンガータンパク質もまた、コンジュゲートを形成するために使用され得る。リンカーとして使用することができるそのようなジンクフィンガータンパク質の１つは、配列番号２４に示されている。本開示では、ｍｃｈｅｒｒｙ遺伝子を保有するプラスミド（図１８）、および２．７ｋｂの赤色標識環状プラスミドＤＮＡをトランスフェクション用のコンジュゲートの調製に使用し、ｍｃｈｅｒｒｙ遺伝子の発現を概念証明として示した。トランスフェクションの目的で、目的の遺伝子を含む本質的に任意の核酸またはプラスミドを、本明細書に開示される複合体と複合体化して、遺伝子治療または遺伝子編集で使用するためのコンジュゲートを形成し得ることが企図される。
【0403】
利点
本開示は、細胞膜を透過し、目的の遺伝子を発現する能力を有する目的の遺伝子を含む核酸またはプラスミドを含むコンジュゲートを提供する。したがって、コンジュゲートはトランスフェクションに使用することができ、遺伝子治療および遺伝子編集に使用できる非常に大きな可能性がある。遺伝子を構成する核酸およびプラスミドの細胞への送達が遺伝子治療および遺伝子編集の分野における主要な課題であることが知られているため、開示されたコンジュゲートはこの分野に新たな道を開く。開示されたコンジュゲートは、調製が容易であり、遺伝子治療および遺伝子編集に使用される遺伝子を構成する多種多様な核酸およびプラスミドと複合体化することができる。
本開示は、細胞膜を透過し、目的の遺伝子を発現する能力を有する目的の遺伝子を含む核酸またはプラスミドを含むコンジュゲートを提供する。したがって、コンジュゲートはトランスフェクションに使用することができ、遺伝子治療および遺伝子編集に使用できる非常に大きな可能性がある。遺伝子を構成する核酸およびプラスミドの細胞への送達が遺伝子治療および遺伝子編集の分野における主要な課題であることが知られているため、開示されたコンジュゲートはこの分野に新たな道を開く。開示されたコンジュゲートは、調製が容易であり、遺伝子治療および遺伝子編集に使用される遺伝子を構成する多種多様な核酸およびプラスミドと複合体化することができる。
【0404】
実施例１１
本発明のＣＰＰによる遺伝子編集分子機構のトランスフェクション
トランスフェクション実験を、実施例１で得られたコンジュゲート（ＥｆｓＱＮＲ：配列番号２）およびエンドヌクレアーゼＣａｓ９に基づく遺伝子編集複合体、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰを使用して哺乳動物細胞で実施した。表２に示されている結果を、図２９に示す。上記の実施例４の結果に基づいて、この技術の適用は、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞および魚類細胞を含む多種多様な細胞に適用可能であることが企図される。
本発明のＣＰＰによる遺伝子編集分子機構のトランスフェクション
トランスフェクション実験を、実施例１で得られたコンジュゲート（ＥｆｓＱＮＲ：配列番号２）およびエンドヌクレアーゼＣａｓ９に基づく遺伝子編集複合体、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰを使用して哺乳動物細胞で実施した。表２に示されている結果を、図２９に示す。上記の実施例４の結果に基づいて、この技術の適用は、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞および魚類細胞を含む多種多様な細胞に適用可能であることが企図される。
【0405】
【表2】
【0406】
本発明の一実施形態では、トランスフェクション実験を行うために以下の条件を使用した。
【0407】
ストラテジー：
細胞内の遺伝子編集は、様々な方法で報告された。特に関連性のある実施例の１つは、Ｃａｓ９などのエンドヌクレアーゼのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体およびｇＲＮＡを細胞に送達する。この方法論は、遺伝子編集機構の中間的な細胞内合成を必要としないため、特に魅力的である。
細胞内の遺伝子編集は、様々な方法で報告された。特に関連性のある実施例の１つは、Ｃａｓ９などのエンドヌクレアーゼのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体およびｇＲＮＡを細胞に送達する。この方法論は、遺伝子編集機構の中間的な細胞内合成を必要としないため、特に魅力的である。
【0408】
現在、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ナノ粒子、およびカチオン性脂質を介した送達などのいくつかの方法が、遺伝子編集機構を細胞の細胞質に導入し、そこからゲノムに移動できるようにするために使用されている。
【0409】
一実施形態では、本発明は、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、およびＣＰＰ間の静電相互作用を使用して、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ ＲＮＰ（ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ）を細胞に運ぶ。様々な成分が共有および／または非共有相互作用によって連結されているコンジュゲートの使用も企図されている。
【0410】
ｅＧＦＰを発現する細胞（ＨＥＫ２９３）は、ｅＧＦＰに特異的なｇＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰでトランスフェクトされる。ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰの取り込みは、本発明のＣＰＰによって媒介され、これは、カーゴを効率的に細胞に輸送することができる（実施例４）。ＣＰＰから解離するか、ＣＰＰによって阻害されない細胞への取り込みに続いて、Ｃａｓ９はｇＲＮＡによってその標的ＤＮＡ配列ｅＧＦＰに向けられる。この遺伝子のノックアウト、したがって細胞内の蛍光の喪失は、遺伝子編集複合体の効率的かつ効果的な送達方法の証拠である。
【0411】
安定したｅＧＦＰ発現細胞株を得るために、Ｇ４１８抗生物質を使用した選択プロセスが使用される。ｅＧＦＰを発現し、したがってｅＧＦＰプラスミドを取り込んだ細胞も、Ｇ４１８抗生物質耐性を付与することになる。ｅＧＦＰプラスミドを取り込んでいない細胞は、Ｇ４１８に対する耐性がないため、選択培地に保存すると、一定期間で死滅するであろう。
【0412】
実験：ｅＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）を発現する細胞（ＨＥＫ２９３）は、リポフェクタミンベースの市販試薬を使用してＨＥＫ２９３細胞をｅＧＦＰでトランスフェクトすることにより得られる。細胞を４８時間増殖させて、ｅＧＦＰでトランスフェクトされた７０～８０％の細胞を得る。細胞を二次培養し、Ｇ４１８抗生物質を含む選択培地で増殖させて、ＨＥＫ２９３細胞がｅＧＦＰを安定して発現するようにしてから遺伝子編集実験に使用する。
【0413】
約５０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、１日目に一晩増殖させる。
【0414】
２日目に、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ－ＣＰＰ（ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ－ＣＰＰ）複合体を、二工程で形成した。
【0415】
工程１：Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡとｉ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中またはｉｉ）市販のＣａｓ９を供給した反応緩衝液中（Ｇｅｎａｘｘｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：Ｃａｓ９－ＮＬＳ－ｔａｇＲＦＰ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｓ．）ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質ＮＬＳ、続いてＣ－末端赤色蛍光タンパク質（ｔａｇＲＦＰ）タグ配列；製品番号：Ｓ５３０６．００１０、ＨＳ－Ｎｏ．：３５０４００９０）で混合した。反応緩衝液は、Ｃａｓ９とＲＮＰとの複合体を安定化させるように作用する。次いで、混合物を室温で２５分間インキュベートして、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ複合体を形成した。
【0416】
工程２：工程１で得られたＣａｓ９－ｇＲＮＡ混合物にＰＢＳ中の１マイクロＭのＣＰＰを添加し、室温でさらに３０分間インキュベートして、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ－ＣＰＰ複合体を形成した。
【0417】
工程３：工程２で得られたＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ－ＣＰＰ複合体を培地（血清ありまたはなしのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、例えば、Ｓｉｇｍａ）中の細胞に添加し、細胞を４時間培養する。４時間後、培地（血清を含むＤＭＥＭ）を細胞に添加し、４８時間の標準的な細胞増殖条件（温度３７℃および５％のＣＯ２下で増殖させたままにした。４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、新鮮な培地（血清を含むＤＭＥＭ）を添加し、ｅＧＦＰによる蛍光強度を蛍光プレートリーダーで測定した。
【0418】
哺乳動物の腎臓ＨＥＫ２９３細胞での結果
本発明のＣＰＰは、細胞へのＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰの効率的な送達を支援する。細胞への取り込みに続いて、Ｃａｓ９はｇＲＮＡによってｅＧＦＰのその標的ＤＮＡ配列に向けられる。Ｃａｓ９によるこの遺伝子のノックアウトは、細胞内の蛍光の喪失につながる。
本発明のＣＰＰは、細胞へのＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰの効率的な送達を支援する。細胞への取り込みに続いて、Ｃａｓ９はｇＲＮＡによってｅＧＦＰのその標的ＤＮＡ配列に向けられる。Ｃａｓ９によるこの遺伝子のノックアウトは、細胞内の蛍光の喪失につながる。
【0419】
工程３で無血清培地を使用し、工程１で反応緩衝液（Ｇｅｎａｘｘｏｎ Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを溶解するための商用供給源で提供されている、製品番号Ｓ５３０６．００１０）を使用すると、蛍光が３０％低減し、細胞内部へのＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰの効率的な移入を示している。
【0420】
ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を使用してＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ複合体を溶解した場合、蛍光強度に有意な変化は観察されなかった。
【0421】
理論に束縛されるものではないが、ＰＢＳはＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰとＣＰＰとの間の複合体形成を安定化させることができないと仮定される。
【0422】
実施例１２
本発明の組換えβ－らせんタンパク質による蛍光標識エンドヌクレアーゼＣａｓ９のトランスフェクション
図３１は、実施例１で得られたコンジュゲート（ＥｆｓＱＮＲ：配列番号２）および（ｉ）赤色蛍光タンパク質、または（ｉｉ）緑色蛍光染料Ａｔｔｏ５２０のいずれかでタグ付けされたエンドヌクレアーゼｃａｓ９を使用したＭＣＦ－７細胞におけるトランスフェクション実験の結果を示す。
本発明の組換えβ－らせんタンパク質による蛍光標識エンドヌクレアーゼＣａｓ９のトランスフェクション
図３１は、実施例１で得られたコンジュゲート（ＥｆｓＱＮＲ：配列番号２）および（ｉ）赤色蛍光タンパク質、または（ｉｉ）緑色蛍光染料Ａｔｔｏ５２０のいずれかでタグ付けされたエンドヌクレアーゼｃａｓ９を使用したＭＣＦ－７細胞におけるトランスフェクション実験の結果を示す。
【0423】
実施例１で得られたコンジュゲート（ＥｆｓＱＮＲ：配列番号２）を、赤色蛍光タンパク質または緑色蛍光染料ＡＴＴＯ５２０（Ｓｉｇｍａ製品７７８１０）のいずれかとコンジュゲートしたｃａｓ９（例えば、Ｅｕｐｈｅｒｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と１：１の比率で混合し、室温で３０分間インキュベートした。
【0424】
得られた溶液を細胞に添加し、細胞とともに１２～１６時間インキュベートした。
【0425】
図３１は、（Ａ）インキュベーション後の細胞の最大投射、（Ｂ）インキュベーション後の細胞の強度プロット、および（Ｃ）インキュベーション後の細胞の３Ｄ深度画像を示している。
【0426】
両方の最大投射画像（Ａ）で、ｃａｓ９が成功裏にトランスフェクトされ、標識染料に関係なく細胞全体に広がることができることをはっきりと見ることができる。これは、標的タンパク質を運び、細胞内で局在化させるための本発明のコンジュゲートの効率を示している。
【0427】
強度プロット（Ｂ）から、コンパニオン染料に関係なく、ｃａｓ９がコンジュゲートを使用して細胞に入ることができたことが明らかである。広がりは細胞全体にあり、かつ均一である。
【0428】
３Ｄ深度画像（Ｃ）は、Ｃａｓ９カーゴが細胞全体に広がっていることを示している。深度分析および３Ｄ表現は、それがすべての平面に存在することを示している。
【0429】
実施例１３
本発明の組換えβ－らせんタンパク質による蛍光標識ｇＲＮＡのトランスフェクション
本発明でさらに開示されるように、コンジュゲートを、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９遺伝子編集システムを用いる遺伝子編集で使用するのに典型的なｇＲＮＡで細胞をトランスフェクトするために調製した。コンジュゲートは、ＥｆｓＱＮＲ（配列番号２）、エチレンジアミンリンカー、および緑色蛍光染料ＭＦＰ４８８でタグ付けされたｇＲＮＡ（例えば、Ｅｕｐｈｅｒｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ：ｅｓｉＣＲＩＳＰＲ Ｋｉｔ－ｗｔ）で構成されていた。コンジュゲートは、既知のプロトコル（参照：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｅｎ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ；２０１３；ｐｐ２６４－２６５、これは参照により本明細書に組み込まれる）に従って調製した。
本発明の組換えβ－らせんタンパク質による蛍光標識ｇＲＮＡのトランスフェクション
本発明でさらに開示されるように、コンジュゲートを、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９遺伝子編集システムを用いる遺伝子編集で使用するのに典型的なｇＲＮＡで細胞をトランスフェクトするために調製した。コンジュゲートは、ＥｆｓＱＮＲ（配列番号２）、エチレンジアミンリンカー、および緑色蛍光染料ＭＦＰ４８８でタグ付けされたｇＲＮＡ（例えば、Ｅｕｐｈｅｒｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ：ｅｓｉＣＲＩＳＰＲ Ｋｉｔ－ｗｔ）で構成されていた。コンジュゲートは、既知のプロトコル（参照：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｅｎ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ；２０１３；ｐｐ２６４－２６５、これは参照により本明細書に組み込まれる）に従って調製した。
【0430】
図３２は、（Ａ）実施例１で得られたコンジュゲート（ＥｆｓＱＮＲ）および緑色蛍光染料ＭＦＰ４８８でタグ付けされたｇＲＮＡ、および（Ｂ）コンジュゲートの非存在下で緑色蛍光染料ＭＦＰ４８８でタグ付けされた対照ｇＲＮＡを使用したＭＣＦ－７細胞におけるトランスフェクション実験の結果を示す。（ｉ）はインキュベーション後の細胞の最大投射を示し、（ｉｉ）は細胞の３Ｄ深度画像を示し、（ｉｉｉ）はインキュベーション後の細胞の強度プロットに対応する画像であり、（ｉｖ）はインキュベーション後の細胞の強度プロットを示す。
【0431】
画像は、細胞内のｇＲＮＡの強度および均一性が、ｇＲＮＡおよびコンジュゲートとインキュベートした細胞と比較して、対照の方が有意に低いことを明確に示している。これは、コンジュゲートがｇＲＮＡを細胞に運ぶことができることを示唆している。対照についての最大投射画像、強度プロット、および３Ｄ深度画像は、ｇＲＮＡのほとんどが細胞膜に局在しているのに対し、コンジュゲートでは、分布が主に細胞質にはっきりと観察されていることを示している。
【0432】
ＣＲＩＳＰＲ構成要素は、Ｅｕｐｈｅｒｉａ ＢｉｏｔｅｃｈおよびＧｅｎａｘｘｏｎという２つの異なる商用供給源から入手した。
【0433】
Ｇｅｎａｘｘｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：ＣＲＩＳＰＲ用のＧＦＰ標的化ガイドＲＮＡ；製品番号：Ｐ２００８．００１０、精製されたｇＲＮＡは高感度ＧＦＰをコードする配列を標的とする、ＨＳ－Ｎｏ．：２９３４９９９０）。
【0434】
Ｇｅｎａｘｘｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：Ｃａｓ９－ＮＬＳ－ｔａｇＲＦＰ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｓ．）ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質ＮＬＳ、続いてＣ－末端赤色蛍光タンパク質（ｔａｇＲＦＰ）タグ配列；製品番号：Ｓ５３０６．００１０、ＨＳ－Ｎｏ．：３５０４００９０）。
【0435】
Ｅｕｐｈｅｒｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ：ｅｓｉＣＲＩＳＰＲ Ｋｉｔ－ｗｔ、以下を含むキット
・２０μｇのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９－ＮＬＳ（６５０ｎｇ／μｌ）
・１５μｇのカスタムガイド（ｇ）ＲＮＡ（４００ｎｇ／μｌ）
・３５μｌのＣＲＩＳＰＲｆｅｃｔｉｏｎ（商標）トランスフェクション試薬（一本鎖ガイド（ｇ）ＲＮＡをロードしたＣａｓ９タンパク質をほとんどの接着細胞に送達するのに好適な独自の脂質ベースのトランスフェクション試薬）
・１ｍｌのＣＲＩＳＰＲｆｅｃｔｉｏｎ緩衝液（ＣＲＩＳＰＲｆｅｃｔｉｏｎ用希釈剤）
・陰性対照としての、５μｇのＮｏＴａｒｇｅｔ ｇＲＮＡ（ヒト、マウス、ラット）
・トランスフェクトされた細胞から単離されたＤＮＡに由来するＰＣＲ産物のインデル分析を実行するための反応緩衝液
・Ｃａｓ９－ＮＬＳタンパク質およびｇＲＮＡの性能を確認するための陽性対照試薬：対照標的ＤＮＡ、対照ｇＲＮＡ、反応緩衝液
・トランスフェクション、インデル分析、Ｃａｓ９活性アッセイについてのプロトコルが記載された応用マニュアル
［ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｕｐｈｅｒｉａ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃｒｉｓｐｒｃａｓ９／ｅｓｉｃｒｉｓｐｒ－ｋｉｔｓ／；２０１９年２月２５日にアクセス］
・２０μｇのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９－ＮＬＳ（６５０ｎｇ／μｌ）
・１５μｇのカスタムガイド（ｇ）ＲＮＡ（４００ｎｇ／μｌ）
・３５μｌのＣＲＩＳＰＲｆｅｃｔｉｏｎ（商標）トランスフェクション試薬（一本鎖ガイド（ｇ）ＲＮＡをロードしたＣａｓ９タンパク質をほとんどの接着細胞に送達するのに好適な独自の脂質ベースのトランスフェクション試薬）
・１ｍｌのＣＲＩＳＰＲｆｅｃｔｉｏｎ緩衝液（ＣＲＩＳＰＲｆｅｃｔｉｏｎ用希釈剤）
・陰性対照としての、５μｇのＮｏＴａｒｇｅｔ ｇＲＮＡ（ヒト、マウス、ラット）
・トランスフェクトされた細胞から単離されたＤＮＡに由来するＰＣＲ産物のインデル分析を実行するための反応緩衝液
・Ｃａｓ９－ＮＬＳタンパク質およびｇＲＮＡの性能を確認するための陽性対照試薬：対照標的ＤＮＡ、対照ｇＲＮＡ、反応緩衝液
・トランスフェクション、インデル分析、Ｃａｓ９活性アッセイについてのプロトコルが記載された応用マニュアル
［ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｕｐｈｅｒｉａ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃｒｉｓｐｒｃａｓ９／ｅｓｉｃｒｉｓｐｒ－ｋｉｔｓ／；２０１９年２月２５日にアクセス］
【0436】
細胞がまだプラスミドを保持しているが、編集された非蛍光ｅＧＦＰを使用していることを確認するためのストラテジー
ｅＧＦＰおよびＲＦＰ－緑色および赤色蛍光の両方を発現する「ｍ－ｃｈｅｒｒｙ」構築物。このプラスミドによる哺乳動物細胞のトランスフェクションにより、細胞がｅＧＦＰを発現しており、正常に送達されたかどうかを判定することができる。緑色ではなく赤色蛍光を発する細胞は、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ－ＣＰＰ送達後の遺伝子編集によって付与されたｅＧＦＰ欠失を示す。
ｅＧＦＰおよびＲＦＰ－緑色および赤色蛍光の両方を発現する「ｍ－ｃｈｅｒｒｙ」構築物。このプラスミドによる哺乳動物細胞のトランスフェクションにより、細胞がｅＧＦＰを発現しており、正常に送達されたかどうかを判定することができる。緑色ではなく赤色蛍光を発する細胞は、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ－ＣＰＰ送達後の遺伝子編集によって付与されたｅＧＦＰ欠失を示す。
【0437】
細胞の取り込みおよび遺伝子編集を改善するためのストラテジー（欠失、置換、または変異誘発）
ＣＰＰ－Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体の送達を成功させるための条件の最適化は、いくつかのストラテジーによって達成することができる。
ＣＰＰ－Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体の送達を成功させるための条件の最適化は、いくつかのストラテジーによって達成することができる。
【0438】
ストラテジー１：
特定の調整された緩衝液がＣＰＰとＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰとの間の相互作用を増強する可能性があると仮定される。以下のバリエーションは、細胞内送達の効率を高めるために企図されている。
ｉ）ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ－ＣＰＰの複合体形成を促進するための密集剤（ｃｒｏｗｄｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）（ＰＥＧ ４０００、コレステロール）の添加、
ｉｉ）疎水性相互作用を促進することによりＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ－ＣＰＰの複合体形成を促進するための特定の小さな脂質（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）の添加、
ｉｉｉ）ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートのような小分子（細胞内のマイクロピノサイトーシス（ｍｉｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）プロセスを増強するため）
ｉｖ）ｐＨおよびイオン強度の変化（ＣＰＰ－Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ間の静電相互作用を促進するため）
特定の調整された緩衝液がＣＰＰとＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰとの間の相互作用を増強する可能性があると仮定される。以下のバリエーションは、細胞内送達の効率を高めるために企図されている。
ｉ）ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ－ＣＰＰの複合体形成を促進するための密集剤（ｃｒｏｗｄｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）（ＰＥＧ ４０００、コレステロール）の添加、
ｉｉ）疎水性相互作用を促進することによりＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ－ＣＰＰの複合体形成を促進するための特定の小さな脂質（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）の添加、
ｉｉｉ）ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートのような小分子（細胞内のマイクロピノサイトーシス（ｍｉｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）プロセスを増強するため）
ｉｖ）ｐＨおよびイオン強度の変化（ＣＰＰ－Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ間の静電相互作用を促進するため）
【0439】
ストラテジー２：
ＣＰＰは、３－（Ｎ－スクシンイミジルオキシグルタリル）アミノプロピル、ポリエチレングリコール－カルバミルジステアロイルホスファチジル－エタノールアミンおよび／またはＮ－（アミノプロピルポリエチレングリコール）カルバミル－ジステアロイルホスファチジル－エタノールアミンで官能化できる。この官能化は、ＣＰＰと細胞膜の脂質分子との相互作用を増強し、本発明の実施形態のＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ－ＣＰＰ複合体の細胞侵入を容易にし得る。
ＣＰＰは、３－（Ｎ－スクシンイミジルオキシグルタリル）アミノプロピル、ポリエチレングリコール－カルバミルジステアロイルホスファチジル－エタノールアミンおよび／またはＮ－（アミノプロピルポリエチレングリコール）カルバミル－ジステアロイルホスファチジル－エタノールアミンで官能化できる。この官能化は、ＣＰＰと細胞膜の脂質分子との相互作用を増強し、本発明の実施形態のＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ－ＣＰＰ複合体の細胞侵入を容易にし得る。
【0440】
ストラテジー３：
ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼで使用されているのと同じアプローチが、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ（登録商標）などの他の遺伝子編集エンドヌクレアーゼシステムでも使用できると仮定される。
ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼで使用されているのと同じアプローチが、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ（登録商標）などの他の遺伝子編集エンドヌクレアーゼシステムでも使用できると仮定される。
【0441】
本明細書に記載の本発明の異なる実施形態は、適切な場合に組み合わせることができ、本発明の実施形態の特徴は、適切な場合に、他の実施形態と互換的に使用できることを理解されたい。
【0442】
本発明の特定の実施形態を本明細書において詳細に開示してきたが、これは例として、かつ例示のみを目的として行われたものである。前述の実施形態は、添付の特許請求の範囲の範疇を制限することを意図するものではない。本発明者は、特許請求の範囲によって定義される本発明の主旨および範囲から逸脱することなく、本発明に対して様々な置換、変更、および修正が行われてもよいことを企図する。
【0443】
【表3】
１．機能性分子に連結された組換えβらせんタンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートであって、βらせんタンパク質の長さが、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲であり、幅が、１ｎｍ～５ｎｍの範囲である、コンジュゲート。
２．βらせんタンパク質の長さが、１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅が、１ｎｍ～３ｎｍの範囲である、第１項に記載のコンジュゲート。
３．βらせんタンパク質が、アルギニンラダー、リジンラダー、アスパラギンラダー、アスパラギン酸ラダー、およびグルタミン酸ラダーからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸ラダー構造を含む、第１項または第２項に記載のコンジュゲート。
４．存在する場合、アルギニンラダーが、１０～２０個のアルギニン残基を含み、リジンラダーが、１０～３０個のリジン残基を含み、アスパラギンラダーが、１０～４０個のアスパラギン残基を含み、アスパラギン酸ラダーが、１０～４０個のアスパラギン酸残基を含み、グルタミン酸ラダーが、１０～４０個のグルタミン酸残基を含む、第３項に記載のコンジュゲート。
５．βらせんタンパク質が、ゼロ未満である総電荷を有する、第１項１～第４項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
６．βらせんタンパク質が、－２０～－６０の総電荷を有する、第５項に記載のコンジュゲート。
７．βらせんタンパク質が、原子間力顕微鏡法によって測定された場合、０．２～１２Ｎ／ｍ２の硬さパラメータＫを有するβらせん構造（ベータヘリックス）を有する、第１項～第６項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
８．βらせんタンパク質が、ペンタペプチドリピートタンパク質である、第１項～第７項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
９．βらせんタンパク質が、コンセンサス配列（ＳＴＡＶ）１（ＤＮ）２（ＬＦ）３（ＳＴＲ）４（Ｇ）５を有するタンデムリピートペンタペプチドを含む、第８項に記載のコンジュゲート。
１０．βらせんタンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表される、第１項～第７項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
１１．組換えβらせんタンパク質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ペプチド、金属コンジュゲート、薬物－金属コンジュゲート、ＤＮＡ結合ドメイン、核酸挿入分子およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるリンカー分子を介して機能性分子に連結されている、第１項～第１０項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
１２．リンカー分子がペプチドである場合、ペプチドが、脂肪族アミノ酸、芳香族アミノ酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸を含む、第１１項に記載のコンジュゲート。
１３．リンカーが、共有結合、非共有結合、およびこれらの組み合わせによって組換えβらせんタンパク質に連結されている、第１項～第１２項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
１４．組換えβらせんタンパク質が、エステル結合またはアミド結合を介して機能性分子に連結されている、第１項～第１３項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
１５．機能性分子が、染料、薬物、金属、薬物－金属コンジュゲート、タンパク質、酵素、抗体、核酸、多糖類、核局在化シグナル、ナノ粒子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、第１項～第１４項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
１６．コンジュゲートが、シグナル配列をさらに含み、このシグナル配列が、特定の細胞または細胞の一部にコンジュゲートを向ける、第１項～第１５項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
１７．シグナル配列が、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７からなる群から選択される、第１６項に記載のコンジュゲート。
１８．コンジュゲートが、ホスファチジルコリン分子をさらに含む、第１項～第１７項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
１９．コンジュゲートが、細胞小器官、核、小胞体、ミトコンドリア、細胞膜、およびＰ－カドヘリン過剰発現乳癌細胞からなる群から選択される位置に機能性分子を移入させる、第１６項～第１８項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
２０．細胞小器官が、アクチンフィラメント、ゴルジ体、細胞膜、微小管を含む群から選択される、第１９項に記載のコンジュゲート。
２１．コンジュゲートが、細胞標識剤として使用される、第１項～第２０項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
２２．コンジュゲートが、機能性分子を細胞に移入させるために使用される、第１項～第２０項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
２３．機能性分子を細胞に移入させるプロセスであって、該プロセスが、
ａ）機能性分子を組換えβらせんタンパク質に連結させてコンジュゲートを得ることと、
ｂ）コンジュゲートを少なくとも１つの細胞と接触させることと、を含み、
工程（ｂ）のコンジュゲートを接触させることが、機能性分子を細胞に移入させ、βらせんタンパク質の長さが、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲であり、幅が、１ｎｍ～５ｎｍの範囲である、プロセス。
２４．プロセスが、工程（ｂ）の後に、
ｃ）細胞内のコンジュゲートの移入を検出することを含む、第２３項に記載のプロセス。
２５．βらせんタンパク質の長さが、１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅が、１ｎｍ～３ｎｍの範囲である、第２３項または第２４項に記載のプロセス。
２６．βらせんタンパク質が、アルギニンラダー、リジンラダー、アスパラギンラダー、アスパラギン酸ラダー、およびグルタミン酸ラダーからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸ラダー構造を含む、第２３項～第２５項のいずれか一項に記載のプロセス。
２７．存在する場合、アルギニンラダーが、１０～２０個のアルギニン残基を含み、リジンラダーが、１０～３０個のリジン残基を含み、アスパラギンラダーが、１０～４０個のアスパラギン残基を含み、アスパラギン酸ラダーが、１０～４０個のアスパラギン酸残基を含み、グルタミン酸ラダーが、１０～４０個のグルタミン酸残基を含む、第２６項に記載のプロセス。
２８．βらせんタンパク質が、ゼロ未満である総電荷を有する、第２３項～第２７項のいずれか一項に記載のプロセス。
２９．βらせんタンパク質が、－２０～－６０の総電荷を有する、第２８項に記載のプロセス。
３０．βらせんタンパク質が、原子間力顕微鏡法によって測定された場合、０．２～１２Ｎ／ｍ２の硬さパラメータＫを有するβらせん構造（ベータヘリックス）を有する、第２３項～第２９項のいずれか一項に記載のプロセス。
３１．βらせんタンパク質が、ペンタペプチドリピートタンパク質である、第２３項～第３０項のいずれか一項に記載のプロセス。
３２．βらせんタンパク質が、コンセンサス配列（ＳＴＡＶ）１（ＤＮ）２（ＬＦ）３（ＳＴＲ）４（Ｇ）５を有するタンデムリピートペンタペプチドを含む、第３１項に記載のプロセス。
３３．βらせんタンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表される、第２３項～第３０項のいずれか一項に記載のプロセス。
３４．機能性分子が、染料、薬物、金属、薬物－金属、タンパク質、酵素、抗体、核酸、多糖類、核局在化シグナル、ナノ粒子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、第２３項～第３３項のいずれか一項に記載のプロセス。
３５．機能性分子が、共有結合、非共有結合、およびこれらの組み合わせによって組換えβらせんタンパク質に連結されている、第２３項～第３４項のいずれか一項に記載のプロセス。
３６．細胞が、真核細胞、原核細胞、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、第２３項～第３５項のいずれか一項に記載のプロセス。
３７．該プロセスが、細胞標識のために使用される、第２３項～第３６項のいずれか一項に記載のプロセス。
３８．機能性分子を細胞に送達するための第１項～第２０項のいずれか一項に記載の細胞透過性コンジュゲートの使用であって、機能性分子が、染料、薬物、金属、薬物－金属、タンパク質、酵素、抗体、核酸、多糖類、核局在化シグナル、ナノ粒子およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、使用。
３９．細胞透過のための第１項～第２０項のいずれか一項に記載の細胞透過性コンジュゲートの使用。
４０．細胞標識のための第１項～第２０項のいずれか一項に記載の細胞透過性コンジュゲートの使用。
４１．（ａ）少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つのリンカーと、（ｃ）少なくとも１つの核酸分子と、を含むコンジュゲートであって、少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さが、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲であり、幅が、１ｎｍ～５ｎｍの範囲である、コンジュゲート。
４２．少なくとも１つの組換えβらせんタンパク質の長さが、１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅が、１ｎｍ～３ｎｍの範囲である、第４１項に記載のコンジュゲート。
４３．βらせんタンパク質が、アルギニンラダー、リジンラダー、アスパラギンラダー、アスパラギン酸ラダー、およびグルタミン酸ラダーからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸ラダー構造を含む、第４１項または第４２項に記載のコンジュゲート。
４４．存在する場合、アルギニンラダーが、１０～２０個のアルギニン残基を含み、リジンラダーが、１０～３０個のリジン残基を含み、アスパラギンラダーが、１０～４０個のアスパラギン残基を含み、アスパラギン酸ラダーが、１０～４０個のアスパラギン酸残基を含み、グルタミン酸ラダーが、１０～４０個のグルタミン酸残基を含む、第４３項に記載のコンジュゲート。
４５．βらせんタンパク質が、ゼロ未満である総電荷を有する、第４１項～第４４項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
４６．βらせんタンパク質が、－２０～－６０の総電荷を有する、第４５項に記載のコンジュゲート。
４７．βらせんタンパク質が、原子間力顕微鏡法によって測定された場合、０．２～１２Ｎ／ｍ２の硬さパラメータＫを有するβらせん構造（ベータヘリックス）を有する、第４１項～第４６項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
４８．βらせんタンパク質が、ペンタペプチドリピートタンパク質である、第４１項～第４７項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
４９．βらせんタンパク質が、コンセンサス配列（ＳＴＡＶ）１（ＤＮ）２（ＬＦ）３（ＳＴＲ）４（Ｇ）５を有するタンデムリピートペンタペプチドを含む、第４８項に記載のコンジュゲート。
５０．βらせんタンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表される、第４１項～第４７項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
５１．リンカーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ペプチド、金属コンジュゲート、薬物－金属コンジュゲート、ＤＮＡ結合ドメイン、核酸挿入分子およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるリンカー分子である、第４１項～第５０項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
５２．リンカー分子がペプチドである場合、ペプチドが、脂肪族アミノ酸、芳香族アミノ酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸を含む、第５１項に記載のコンジュゲート。
５３．リンカーが、共有結合、非共有結合、およびこれらの組み合わせによって組換えβらせんタンパク質に連結されている、第４１項～第５２項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
５４．リンカーが、エステル結合またはアミド結合によって組換えβらせんタンパク質に連結されている、第５３項に記載のコンジュゲート。
５５．核酸分子が、少なくとも１つの目的の遺伝子を含む、第４１項～第５４項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
５６．核酸分子が、プラスミドである、第５５項に記載のコンジュゲート。
５７．プラスミドが、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミドである、第５６項に記載のコンジュゲート。
５８．目的の遺伝子が、ゲノム編集システムの１つ以上の分子をコードする、第５５項～第５７項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
５９．ゲノム編集システムが、
ａ．ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
ｂ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
ｃ．転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（登録商標））、
ｄ．ＤＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＤＮＡ、
ｅ．ホーミングエンドヌクレアーゼ、
ｆ．インテグラーゼからなる群から選択される、第５８項に記載のコンジュゲート。
６０．目的の遺伝子が、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする、第５５項～第５９項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
６１．ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、第６０項に記載のコンジュゲート。
６２．核酸分子を細胞に移入させるプロセスであって、該プロセスが、
ａ）核酸分子を、少なくとも１つのリンカーを介して、少なくとも１つの 組換えβらせんタンパク質に連結させて、コンジュゲートを得ることと、
ｂ）コンジュゲートを少なくとも１つの細胞と接触させることと、を含み、
コンジュゲートを接触させることが、核酸分子を細胞に移入させ、組換えβらせんタンパク質の長さが、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲であり、幅が、１ｎｍ～５ｎｍの範囲である、プロセス。
６３．プロセスが、工程（ｂ）の後に、
ｃ）細胞内のコンジュゲートの移入を検出することを含む、第６２項に記載のプロセス。
６４．組換えβらせんタンパク質の長さが、１０ｎｍ～１５ｎｍの範囲であり、幅が、１ｎｍ～３ｎｍの範囲である、第６２項または第６３項に記載のプロセス。
６５．βらせんタンパク質が、アルギニンラダー、リジンラダー、アスパラギンラダー、アスパラギン酸ラダー、およびグルタミン酸ラダーからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸ラダー構造を含む、第６２項～第６４項のいずれか一項に記載のプロセス。
６６．存在する場合、アルギニンラダーが、１０～２０個のアルギニン残基を含み、リジンラダーが、１０～３０個のリジン残基を含み、アスパラギンラダーが、１０～４０個のアスパラギン残基を含み、アスパラギン酸ラダーが、１０～４０個のアスパラギン酸残基を含み、グルタミン酸ラダーが、１０～４０個のグルタミン酸残基を含む、第６５項に記載のプロセス。
６７．βらせんタンパク質が、ゼロ未満である総電荷を有する、第６２項～第６６項のいずれか一項に記載のプロセス。
６８．βらせんタンパク質が、－２０～－６０の総電荷を有する、第６７項に記載のプロセス。
６９．βらせんタンパク質が、原子間力顕微鏡法によって測定された場合、０．２～１２Ｎ／ｍ２の硬さパラメータＫを有するβらせん構造（ベータヘリックス）を有する、第６２項～第６８項のいずれか一項に記載のプロセス。
７０．βらせんタンパク質が、ペンタペプチドリピートタンパク質である、第６２項～第６９項のいずれか一項に記載のプロセス。
７１．βらせんタンパク質が、コンセンサス配列（ＳＴＡＶ）１（ＤＮ）２（ＬＦ）３（ＳＴＲ）４（Ｇ）５を有するタンデムリピートペンタペプチドを含む、第７０項に記載のプロセス。
７２．βらせんタンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表される、第６２項～第７０項のいずれか一項に記載のプロセス。
７３．リンカーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ペプチド、金属コンジュゲート、薬物－金属コンジュゲート、ＤＮＡ結合ドメイン、核酸挿入分子およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、第６２項～第７２項のいずれか一項に記載のプロセス。
７４．リンカー分子がペプチドである場合、ペプチドが、脂肪族アミノ酸、芳香族アミノ酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸を含む、第７３項に記載のプロセス。
７５．リンカーが、共有結合、非共有結合、およびこれらの組み合わせによって組換えβらせんタンパク質に連結されている、第６２項～第７４項のいずれか一項に記載のプロセス。
７６．リンカーが、エステル結合またはアミド結合によって組換えβらせんタンパク質に連結されている、第７５項に記載のプロセス。
７７．細胞が、真核細胞または原核細胞からなる群から選択される、第６２項～第７６項のいずれか一項に記載のプロセス。
７８．核酸分子が、少なくとも１つの目的の遺伝子を含む、第６２項～第７７項のいずれか一項に記載のプロセス。
７９．核酸分子が、プラスミドである、第７８項に記載のプロセス。
８０．プラスミドが、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミドである、第７９項に記載のプロセス。
８１．目的の遺伝子が、ゲノム編集システムの１つ以上の分子をコードする、第７８項～第８０項のいずれか一項に記載のプロセス。
８２．ゲノム編集システムが、
ａ．ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
ｂ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
ｃ．転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（登録商標））、
ｄ．ＤＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＤＮＡ、
ｅ．ホーミングエンドヌクレアーゼ、
ｆ．インテグラーゼからなる群から選択される、第８１項に記載のプロセス。
８３．目的の遺伝子が、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする、第７８項～第８２項のいずれか一項に記載のプロセス。
８４．ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、第８３項に記載のプロセス。
８５．ゲノム編集システムの１つ以上の分子をコードするプラスミドに連結された組換えβらせんタンパク質を含む標的ポリヌクレオチドを改変するためのゲノム編集複合体であって、βらせんタンパク質の長さが、５ｎｍ～２５ｎｍの範囲であり、幅が、１ｎｍ～５ｎｍの範囲である、ゲノム編集複合体。
８６．組換えβらせんタンパク質が、コンセンサス配列（ＳＴＡＶ）１（ＤＮ）２（ＬＦ）３（ＳＴＲ）４（Ｇ）５を有するタンデムリピートペンタペプチドを含む、第８５項に記載のゲノム編集複合体。
８７．組換えβらせんタンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列によって表される、第８５項に記載のゲノム編集複合体。
８８．プラスミドが、少なくとも１つの目的の遺伝子を含む、第８５項～第８７項のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
８９．プラスミドが、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミドである、第８５項～第８８項のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
９０．ゲノム編集システムが、
ａ．ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
ｂ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
ｃ．転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（登録商標））、
ｄ．ＤＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＤＮＡ、
ｅ．ホーミングエンドヌクレアーゼ、
ｆ．インテグラーゼからなる群から選択される、第８５項～第８９項のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
９１．ゲノム編集システムの１つ以上の分子が、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、第８５項～第９０項のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
９２．ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、第９１項に記載のゲノム編集複合体。
９３．トランスフェクション剤としての、第４１項～第６１項のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは第８５項～約９２項のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体の使用。
９４．遺伝子治療のための、第４１項～第６１項のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは第８５項～約９２項のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体の使用。
９５．遺伝子編集のための、第４１項～第６１項のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは第８５項～約９２項のいずれか一項に記載のゲノム編集複合体の使用。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30-1】
【図30-2】
【図31A)】
【図31B)】
【図31C)】
【図32-1】
【図32-2】
【配列表】