特許 7582964 分裂した光活動性黄色タンパク質の相補体化系およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-05

(45)【発行日】2024-11-13

(54)【発明の名称】分裂した光活動性黄色タンパク質の相補体化系およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/195 20060101AFI20241106BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20241106BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241106BHJP

   G01N 33/542 20060101ALI20241106BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20241106BHJP

【ＦＩ】

C07K14/195

C07K7/06

C07K19/00

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

G01N33/542 A

G01N33/68

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2021559308

(86)(22)【出願日】2020-04-03

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-23

(86)【国際出願番号】 EP2020059635

(87)【国際公開番号】W WO2020201538

(87)【国際公開日】2020-10-08

【審査請求日】2023-03-22

(31)【優先権主張番号】19305449.1

(32)【優先日】2019-04-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】518436250

【氏名又は名称】パリ シアンス エ レットル

(73)【特許権者】

【識別番号】510073202

【氏名又は名称】セントレ ナショナル デ ラ リシェルシェ サイエンティフィック（セ・エン・エル・エス）

(73)【特許権者】

【識別番号】518170446

【氏名又は名称】ソルボンヌ ウニベルシテ

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ゴーティエ，アーノード

(72)【発明者】

【氏名】テボ，アリソン

【審査官】西澤 龍彦

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／００１４３７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１８／２１１０９０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１０－２０７１３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】KERPPOLA, TK，Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Analysis as a Probe of Protein Interactions in Living Cells，Annual Review of Biophysics，2008年，Vol. 37，pp. 465-487

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

Ｇ０１Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントと第２の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントとを含む、相補体化系であって、
前記第１のＰＹＰフラグメントが、
配列番号２３～２９のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または
配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
を含み、
前記第２のＰＹＰフラグメントが、
配列番号３４～４０のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または
配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
を含む、
相補体化系。

【請求項2】

前記第１のＰＹＰフラグメントが、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の相補体化系。

【請求項3】

前記第２のＰＹＰフラグメントが、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の相補体化系。

【請求項4】

前記第１のＰＹＰフラグメントが、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含み、前記第２のＰＹＰフラグメントが、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の相補体化系。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか１項で定義される第１の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントをコードする、第１の核酸配列と、
請求項１～４のいずれか１項で定義される第２の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントをコードする、第２の核酸配列と、
を含む少なくとも１つのベクターを含む、キット。

【請求項6】

請求項１～４のいずれか１項で定義される第１の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントをコードする核酸配列を含む、第１のベクターと、
請求項１～４のいずれか１項で定義される第２の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントをコードする核酸配列を含む、第２のベクターと、
を含む、請求項５に記載のキット。

【請求項7】

式（Ｉ）：

【化1】

の蛍光発生ヒドロキシベンジリデンロダニン（ＨＢＲ）類縁体であって、式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、任意選択でハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、およびハロアルキルから選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい、Ｈ、ハロ、ヒドロキシル、アリール、飽和または不飽和のアルキル、飽和または不飽和のシクロアルキル、飽和または不飽和のヘテロアルキル、または飽和または不飽和のヘテロシクロアルキル基を表し；
Ｒ３は、非結合性のダブレット（すなわち、電子の遊離対）であるか、あるいは任意選択でハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、およびハロアルキルから選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい、Ｈ、ハロ、ヒドロキシル、アリール、飽和または不飽和のアルキル、飽和または不飽和のシクロアルキル、飽和または不飽和のヘテロアルキル、または飽和または不飽和のヘテロシクロアルキル基を表し、
Ｒ４は、任意選択でハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、およびハロアルキルから選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい、Ｈ、ヒドロキシル、アリール、飽和または不飽和のアルキル、飽和または不飽和のシクロアルキル、飽和または不飽和のヘテロアルキル、または飽和または不飽和のヘテロシクロアルキル基から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよいＳ、Ｏ、またはＮ原子により中断または終結した単結合または二重結合であり、
Ｘは、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨＲ７、またはＮ（Ｒ７）_２であり、Ｒ７は、任意選択でハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、およびハロアルキルから選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい、Ｈ、ハロ、ヒドロキシル、アリール、飽和または不飽和のアルキル、飽和または不飽和のシクロアルキル、飽和または不飽和のヘテロアルキル、または飽和または不飽和のヘテロシクロアルキル基であり、
Ｙは、Ｏ、ＮＨ、またはＳである、
蛍光発生ヒドロキシベンジリデンロダニン（ＨＢＲ）類縁体をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の相補体化系または請求項５もしくは６に記載のキット。

【請求項8】

蛍光発生ヒドロキシベンジリデンロダニン（ＨＢＲ）類縁体が、４－ヒドロキシ－３－メチルベンジリデンロダニン（ＨＭＢＲ）、（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－３－メトキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲ－３ＯＭ）、（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－３，５－ジメチルベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲ－３，５ＤＭ）、および（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－３，５－ジメトキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲ－３，５ＤＯＭ）から選択される、請求項７に記載の相補体化系またはキット。

【請求項9】

サンプル中の２つの目的の生体分子間の相互作用を検出するための方法であって、
第１の目的の生体分子に、請求項１～４のいずれか１項で定義される第１の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントを融合し、それにより前記第１のＰＹＰフラグメントで前記第１の目的の生体分子をタグ付けするステップと、
第２の目的の生体分子に、請求項１～４のいずれか１項で定義される第２の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントを融合し、それにより前記第２のＰＹＰフラグメントで前記第２の目的の生体分子をタグ付けするステップと、
前記サンプルを蛍光発生ヒドロキシベンジリデンロダニン（ＨＢＲ）類縁体と接触させるステップと、
２つの目的の生体分子の相互作用時に再構成される機能的なＰＹＰへの前記蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を検出するステップと、
を含み、
それにより２つの目的の生体分子の相互作用時に再構成される機能的なＰＹＰへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合を介して前記サンプル中に存在する２つの目的の生体分子の相互作用を検出する、方法。

【請求項10】

２つの目的の生体分子の結合および解離を、前記目的の生体分子間の相互作用の検出を介して経時的にモニタリングするための、および／または２つの目的の生体分子の結合および解離のサンプル中の局在を、前記目的の生体分子間の相互作用の検出を介してモニタリングするための、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記２つの目的の生体分子が、２つの目的のタンパク質である、請求項９または１０に記載の方法。

【請求項12】

サンプル中の２つの目的のタンパク質候補の間での新規のタンパク質間相互作用を同定するためのスクリーニング方法であって、
第１の目的のタンパク質候補に、請求項１～４のいずれか１項で定義される第１の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントを融合し、それにより前記第１のＰＹＰフラグメントで前記第１の目的のタンパク質候補をタグ付けするステップと、
第２の目的のタンパク質候補に、請求項１～４のいずれか１項で定義される第２の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントを融合し、それにより前記第２のＰＹＰフラグメントで前記第２の目的のタンパク質候補をタグ付けするステップと、
前記サンプルを蛍光発生ヒドロキシベンジリデンロダニン（ＨＢＲ）類縁体と接触させるステップと、
２つの目的のタンパク質候補の相互作用時に再構成される機能的なＰＹＰへの前記蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を検出するステップと、
を含み、
それにより２つの目的のタンパク質候補の相互作用時に再構成される機能的なＰＹＰへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合を介して、前記サンプル中に存在する２つの目的のタンパク質候補の間の新規のタンパク質間相互作用を同定する、方法。

【請求項13】

サンプル中の２つのタンパク質間の相互作用の検出に依存するアッセイであって、
第１のタグ付けされたタンパク質を得るステップであって、前記タンパク質が、請求項１～４のいずれか１項で定義される第１の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントでタグ付けされる、ステップと、
第２のタグ付けされたタンパク質を得るステップであって、前記タンパク質が、請求項１～４のいずれか１項で定義される第２の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントでタグ付けされる、ステップと、
前記サンプルを蛍光発生ヒドロキシベンジリデンロダニン（ＨＢＲ）類縁体と接触させるステップと、
前記２つのタンパク質の相互作用時に再構成される機能的なＰＹＰへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を検出するステップと、
を含み、
それにより前記２つのタンパク質の相互作用時に再構成される機能的なＰＹＰへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合を介して、前記サンプル中に存在する２つのタンパク質の相互作用を検出する、アッセイ。

【請求項14】

タンパク質間相互作用を安定化または阻害する目的の分子の能力を評価するための、請求項１３に記載のアッセイ。

【請求項15】

目的のシグナリング経路の活性化に依存する２つのタンパク質の相互作用により、目的のシグナリング経路を評価するための、または前記目的のシグナリング経路を調節する目的の分子の能力を評価するための、請求項１３に記載のアッセイ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、タンパク質の検出、特には蛍光標識を介したタンパク質間相互作用の検出の分野に関する。特に本発明は、２つの光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）のフラグメントを含む相補体化系、および目的の生体分子間の、特に目的のタンパク質間の、相互作用を検出するためのフルオロゲンを伴うその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

タンパク質間の相互作用は、代謝経路およびシグナリング経路、細胞プロセス、ならびに生命体の系に重要な役割を果たしている。生体機能におけるその中枢的な役割のため、タンパク質の相互作用は、生物に健康状態および疾患状態をもたらす機構を制御する。疾患は多くの場合、タンパク質において結合面に影響するかまたはアロステリックな機能障害の変化をもたらす変異からもたらされる。タンパク質相互作用のネットワークを解読することは従って、疾患の分子学的な基礎の理解を可能にし、それは今度は予防、診断、および処置のための方法をもたらし得る。

【0003】

タンパク質の相互作用のネットワークを解読するために、生細胞のタンパク質間相互作用をモニタリングすることが重要であるだけでなく、さらに、相互作用の細胞内での局在およびタイミングもまた重要なパラメータである。空間および時間においてタンパク質間相互作用に関して報告できる蛍光レポーターは従って、（ｉ）生細胞中のタンパク質間相互作用のモニタリング、（ｉｉ）複合体相互作用のネットワークの精査、ならびに（ｉｉｉ）薬物の開発および生物学的な試験のためのタンパク質間相互作用の阻害剤または安定化剤の高スループットスクリーニングの開発、のために最も重要である。

【0004】

生細胞におけるタンパク質間相互作用の可視化は一般に、蛍光共鳴エネルギー移動とも呼ばれるフェルスター共鳴エネルギー移動（Ｆｏｒｓｔｅｒ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）（Ｐｉｓｔｏｎ ＤＷ ＆ Ｋｒｅｍｅｒｓ ＧＪ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２００７ Ｓｅｐ；３２（９）：４０７－１４）、またはＢｉＦＣ（ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（Ｋｅｒｐｐｏｌａ ＴＫ， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２００８；３７：４６５－８７）により達成される。

【0005】

ＦＲＥＴによりタンパク質間相互作用を可視化することは、それぞれがＦＲＥＴドナーおよびＦＲＥＴアクセプターとして作用する、２つの蛍光タンパク質（フルオロフォアとも呼ばれる）への２つの相互作用するタンパク質（多くの場合ｂａｉｔタンパク質およびｐｒｅｙタンパク質と呼ばれる）の融合を必要とする。ＦＲＥＴドナーは、ＦＲＥＴアクセプターに、後者が十分に近い場合、その励起エネルギーを移すことができる。よってＦＲＥＴは、どのようにＦＲＥＴの効率が経時的に変化するかのモニタリングを介して、複合体の結合および解離のリアルタイムでのモニタリングを可能にする。しかしながら、ＦＲＥＴは、実行することが困難である。これは多くの場合、ＦＲＥＴドナーとＦＲＥＴアクセプターの間のエネルギー移動を検出するために、高い発現レベルのｂａｉｔタンパク質およびｐｒｅｙタンパク質を必要とする。さらに、エネルギー移動が効率的である距離の範囲内に２つのフルオロフォアを配置するための構造上の情報が必要である。ＦＲＥＴはまた、ｂａｉｔタンパク質およびｐｒｅｙタンパク質の大部分がドナーおよびアクセプターの蛍光強度の十分な変化をもたらすように相互作用することを必要とする。さらに、ＦＲＥＴベースの相互作用の精確な定量化は理想的には、専用のシステムにより達成される。最後に、多くの対照および著しい定量的な正確性が、別の解釈を除外するために必要とされる。

【0006】

ＢｉＦＣ（Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）ベースのアッセイは多くの場合、実施することが容易であり、解釈することが容易であり、２つの相互作用するタンパク質の相対的なレベルに対する感受性が少ないため、ＦＲＥＴよりも好まれる。ＢｉＦＣアッセイでは、ｂａｉｔタンパク質およびｐｒｅｙタンパク質は、蛍光タンパク質（ＦＰ）の２つの相補的なフラグメント（いわゆるｓｐｌｉｔ－ＦＰ）に融合され、これはｂａｉｔタンパク質およびｐｒｅｙタンパク質が相互作用する場合に機能的なレポーターへと集合する。この２つの相補的なフラグメントは、別々に採取される場合は蛍光性ではないため、高いコントラストが、２つの相互作用するタンパク質の相対的な比率とは無関係に得られる。しかしながら、ＢｉＦＣでタンパク質間相互作用をモニタリングすることには、独自の課題がある。第１に、２つの相補的なフラグメントの自然発生的な自己集合は、非特異的な蛍光バックグラウンドをもたらし得る。さらに、ＧＦＰファミリーのタンパク質に基づくＢｉＦＣでは、相補体化に続き発色団の成熟が起こり、これは不可逆的な複合体の形成をもたらす（Ｍａｇｌｉｅｒｙ ＴＪ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． ２００５ Ｊａｎ １２；１２７（１）：１４６－５７）。フィトクロムベースの赤外線を受容する（ｉｎｆｒａｒｅｄ）タンパク質に基づくＢｉＦＣでは、ビリベルジン発色団の結合はゆっくりであり、また多くの場合、不可逆性をもたらす（Ｆｉｌｏｎｏｖ ＧＳ ＆ Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ ＶＶ， Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２０１３ Ａｕｇ ２２；２０（８）：１０７８－８６）。蛍光複合体のゆっくりとした形成は、一時的なタンパク質間相互作用のモニタリング、ならびに活性状態および不活性状態を含む動的な試験の実行を妨げ、ドミナントネガティブまたはポジティブな作用を誘導し得る。

【0007】

よって、タンパク質間相互作用を検出するための動的なシステムを提供する改良された蛍光ベースの相補体化系が必要とされる。特に、コントラストを増強するための低い自己集合により、および試験されるタンパク質の解離を検出し試験される細胞での有害作用を阻止するための可逆的な複合体形成により特徴付けられる、改良された蛍光ベースの相補体化系が必要とされる。

【0008】

国際特許公開公報第２０１６００１４３７号およびＰｌａｍｏｎｔら（Ｐｌａｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕｓａ ２０１６， １１３ （３）， ４９７－５０２）は、光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）に由来する新規のペプチドタグを開示する。特に、国際特許公開公報第２０１６００１４３７号およびＰｌａｍｏｎｔら（Ｐｌａｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕｓａ ２０１６， １１３ （３）， ４９７－５０２）は、Ｙ－ＦＡＳＴ（ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｓｈｉｆｔｉｎｇ ｔａｇ）（本明細書中以下で「ＦＡＳＴ」）を開示し、これは、出願人が開発したフルオロゲンベースの蛍光レポーターである。ＦＡＳＴは、様々なフルオロゲンと複合体を形成し得る光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）に由来する１４ｋＤａのタンパク質のタグである。ＦＡＳＴによる検出は、フルオロゲンの活性化に関する２つの分光学的な変化：蛍光の量子収率および赤方偏移した吸収の増大に、依存する。ＦＡＳＴとの結合時のフルオロゲンにより経た赤方偏移した吸収は、結合していないまたは非特異的に結合したフルオロゲンが励起波長の選択を介して区別され得るため、高いイメージングの選択性およびコントラストを確実にする。特に、ＦＡＳＴは、たとえばＨＭＢＲ（緑色－黄色の蛍光を提供する）およびＨＢＲ－３，５－ＤＯＭ（橙色－赤色の蛍光を提供する）などの、様々なスペクトルの性質を提示する蛍光発生ヒドロキシベンジリデンロダニン（ＨＢＲ）類縁体を結合する。蛍光発生ＨＢＲ類縁体は、溶液中では弱く蛍光を発するが、ＦＡＳＴの結合キャビティ中に固定化された場合、強力に蛍光を発する。

【0009】

ここで、本出願人は、ＰＹＰベースの蛍光相補体化系であって、２つのフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントが、フルオロゲンを結合しよってＰＹＰフラグメントが結合する目的のタンパク質が相互作用する場合にその蛍光をオンにする、機能的なレポーターまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへと、可逆的にアセンブルする、ＰＹＰベースの蛍光相補体化系を開発した。特に、本出願人らは、ＦＡＳＴタンパク質タグの２つのフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントを含むＰＹＰベースの蛍光相補体化系（ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ）が、２つのＦＡＳＴフラグメントの低い自己集合のおかげで低い非特異的蛍光バックグラウンドを呈することを示した。本出願人らはまた、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴが、空間および時間において高い解像度で、細胞におけるタンパク質の結合および解離の両方の検出を可能にすることを示した。本出願人らはさらに、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴが、タンパク質ベースのセンサーおよび細胞ベースのセンサーの開発を可能にすることを示した。本出願人らはまた、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ相補体化系のものと同等の性質を有する、ＦＡＳＴのオルソログに由来するＰＹＰフラグメントを含むＰＹＰベースの蛍光相補体化系を開発した。

【0010】

本発明はよって、第１の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントと、第２の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントとを含む相補体化系であって、第１および第２のＰＹＰフラグメントが、蛍光発生発色団、特に蛍光発生ヒドロキシベンジリデンロダニン（ＨＢＲ）類縁体を可逆的に結合する、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントを再構成できる、相補体化系に関する。本発明はまた、目的の分子間の、特に目的のタンパク質間の、相互作用を検出するための方法、およびサンプル中の２つのタンパク質間の相互作用の検出に依存するアッセイに関する。

【発明の概要】

【0011】

本発明は、第１の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントと第２の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントとを含む相補体化系であって、
上記第１のＰＹＰフラグメントが、配列番号２３に記載のアミノ酸配列、またはそのトランケートされたフラグメント、または配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列もしくはそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなり、上記トランケートされたフラグメントが、配列番号２３に記載のアミノ酸配列または配列番号２３と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端からの少なくとも８９個の連続したアミノ酸を含み、
上記第２のＰＹＰフラグメントが、配列番号３４に記載のアミノ酸配列、またはそのトランケートされたフラグメント、または配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列もしくはそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなり、上記トランケートされたフラグメントが、配列番号３４に記載のアミノ酸配列または配列番号３４と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列の、好ましくはＮ末端からの、少なくとも８個の連続したアミノ酸を含む、
相補体化系に関する。

【0012】

一実施形態では、第１のＰＹＰフラグメントは、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９に記載のアミノ酸配列、ならびに上記アミノ酸配列のＣ末端からの少なくとも８９個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメント、を含むかまたはそれらからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、第２のＰＹＰフラグメントは、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４０に記載のアミノ酸配列、ならびに上記アミノ酸配列の、好ましくはＮ末端からの、少なくとも８個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメント、を含むかまたはそれらからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

【0013】

一実施形態では、
第１のＰＹＰフラグメントは、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、または配列番号２９に記載のアミノ酸配列、または上記アミノ酸配列のＣ末端からの少なくとも８９個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなり、
第２のＰＹＰフラグメントは、それぞれ配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０に記載のアミノ酸配列、または上記アミノ酸配列の、好ましくはＮ末端からの、少なくとも８個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる。

【0014】

よって、一実施形態では、
第１のＰＹＰフラグメントは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列、もしくは上記アミノ酸配列のＣ末端からの少なくとも８９個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントを含むかもしくはそれからなり、第２のＰＹＰフラグメントは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列、もしくは上記アミノ酸配列の、好ましくはＮ末端からの、少なくとも８個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントを含むかもしくはそれからなるか、または
第１のＰＹＰフラグメントは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列、もしくは上記アミノ酸配列のＣ末端からの少なくとも８９個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントを含むかもしくはそれからなり、第２のＰＹＰフラグメントは、配列番号３５に記載のアミノ酸配列、もしくは上記アミノ酸配列の、好ましくはＮ末端からの、少なくとも８個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントを含むかもしくはそれからなるか、または
第１のＰＹＰフラグメントは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列、もしくは上記アミノ酸配列のＣ末端からの少なくとも８９個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントを含むかもしくはそれからなり、第２のＰＹＰフラグメントは、配列番号３６に記載のアミノ酸配列、もしくは上記アミノ酸配列の、好ましくはＮ末端からの、少なくとも８個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントを含むかもしくはそれからなるか、または
第１のＰＹＰフラグメントは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列、もしくは上記アミノ酸配列のＣ末端からの少なくとも８９個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントを含むかもしくはそれからなり、第２のＰＹＰフラグメントは、配列番号３７に記載のアミノ酸配列、もしくは上記アミノ酸配列の、好ましくはＮ末端からの、少なくとも８個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントを含むかもしくはそれからなるか、または
第１のＰＹＰフラグメントは、配列番号２７に記載のアミノ酸配列、もしくは上記アミノ酸配列のＣ末端からの少なくとも８９個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントを含むかもしくはそれからなり、第２のＰＹＰフラグメントは、配列番号３８に記載のアミノ酸配列、もしくは上記アミノ酸配列の、好ましくはＮ末端からの、少なくとも８個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントを含むかもしくはそれからなるか、または
第１のＰＹＰフラグメントは、配列番号２８に記載のアミノ酸配列、もしくは上記アミノ酸配列のＣ末端からの少なくとも８９個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントを含むかもしくはそれからなり、第２のＰＹＰフラグメントは、配列番号３９に記載のアミノ酸配列、もしくは上記アミノ酸配列の、好ましくはＮ末端からの、少なくとも８個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントを含むかもしくはそれからなるか、または
第１のＰＹＰフラグメントは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列、もしくは上記アミノ酸配列のＣ末端からの少なくとも８９個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントを含むかもしくはそれからなり、第２のＰＹＰフラグメントは、配列番号４０に記載のアミノ酸配列、もしくは上記アミノ酸配列の、好ましくはＮ末端からの、少なくとも８個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントを含むかもしくはそれからなる。

【0015】

一実施形態では、第１のＰＹＰフラグメントは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列、または上記アミノ酸配列のＣ末端からの少なくとも８９個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなり、第２のＰＹＰフラグメントは、配列番号３４、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

【0016】

一実施形態では、第１のＰＹＰフラグメントのアミノ酸配列、または上記アミノ酸配列のＣ末端からの少なくとも８９個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントは、配列番号２３に準拠して以下のアミノ酸置換：１９位のアスパラギン、６２位のロイシン、６８位のシステインもしくはグルタミン酸、７１位のアルギニン、７３位のセリン、および／もしくは１０７位のイソロイシンのうちの少なくとも１つをさらに含み、かつ／または第２のＰＹＰフラグメント、または上記アミノ酸配列の少なくとも８個の連続したアミノ酸を含むそのトランケートされたフラグメントは、配列番号３４に準拠して以下のアミノ酸置換：８位のイソロイシンをさらに含む。

【0017】

本発明はまた、
本明細書中の上で定義される第１の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントをコードする第１の核酸配列と、
本明細書中の上で定義される第２の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントをコードする第２の核酸配列と
を含む少なくとも１つのベクターを含む、キットに関する。

【0018】

一実施形態では、本発明のキットは、
本明細書中の上で定義される第１の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントをコードする核酸配列を含む第１のベクターと、
本明細書中の上で定義される第２の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントをコードする核酸配列を含む第２のベクターと
を含む。

【0019】

一実施形態では、本発明の相補体化系および本発明のキットは、式（Ｉ）の蛍光発生ヒドロキシベンジリデンロダニン（ＨＢＲ）類縁体：

【化1】

（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、飽和または不飽和であり、直鎖状または分岐状であり、任意選択でハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい、Ｈ、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基を表し；
Ｒ３は、非結合性のダブレット（すなわち、電子の遊離対）または、飽和または不飽和であり、直鎖状または分岐状であり、任意選択でハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい、Ｈ、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基を表し、
Ｒ４は、飽和または不飽和であり、直鎖状または分岐状であり、任意選択でハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい、Ｈ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい、Ｓ、Ｏ、またはＮ原子により中断または終結した、単結合または二重結合であり、
Ｘは、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨＲ７、またはＮ（Ｒ７）_２であり、Ｒ７は、飽和または不飽和であり、直鎖状または分岐状であり、任意選択でハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい、Ｈ、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基であり、
Ｙは、Ｏ、ＮＨ、またはＳである）
をさらに含む。

【0020】

一実施形態では、蛍光発生ＨＢＲ類縁体は、４－ヒドロキシ－３－メチルベンジリデンロダニン（ＨＭＢＲ）、（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－３－メトキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲ－３ＯＭ）、（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－３，５－ジメチルベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲ－３，５ＤＭ）、および（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－３，５－ジメトキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲ－３，５ＤＯＭ）を含むかまたはそれらからなる群から選択される。

【0021】

本発明はまた、サンプル中の２つの目的の生体分子間の、好ましくは２つの目的のタンパク質間の、相互作用を検出するための方法であって、
本明細書中上記に定義される第１の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントを、第１の目的の生体分子に融合し、それにより、上記第１の目的の生体分子を上記第１のＰＹＰフラグメントでタグ付けするステップと、
本明細書中上記に定義される第２の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントを、第２の目的の生体分子に融合し、それにより上記第２の目的の生体分子を上記第２のＰＹＰフラグメントでタグ付けするステップと、
上記サンプルを蛍光発生ヒドロキシベンジリデンロダニン（ＨＢＲ）類縁体と接触させるステップと、
２つの目的の生体分子の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を検出するステップ
を含み、
それにより２つの目的の生体分子の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合を介して、上記サンプル中に存在する２つの目的の生体分子の相互作用を検出する、方法に関する。

【0022】

一実施形態では、本発明の方法は、上記目的の生体分子間の相互作用の検出を介して、２つの目的の生体分子、好ましくは２つの目的のタンパク質、の結合および解離を、時間および空間にわたりモニタリングするためのものである。

【0023】

本発明はまた、サンプル中の２つの目的のタンパク質候補の間での新規のタンパク質間相互作用を同定するためのスクリーニング方法であって、
本明細書中上記に定義される第１の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントを、第１の目的のタンパク質候補に融合し、それにより上記第１の目的のタンパク質候補を上記第１のＰＹＰフラグメントでタグ付けするステップと、
本明細書中上記に定義される第２の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントを、第２の目的のタンパク質候補に融合し、それにより上記第２の目的のタンパク質候補を上記第２のＰＹＰフラグメントでタグ付けするステップと、
上記サンプルを蛍光発生ヒドロキシベンジリデンロダニン（ＨＢＲ）類縁体と接触させるステップと、
２つの目的のタンパク質候補の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を検出するステップ、
を含み、
それにより２つの目的のタンパク質候補の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合を介して、上記サンプル中に存在する２つの目的のタンパク質候補の間での新規のタンパク質間相互作用を同定する、方法に関する。

【0024】

本発明はまた、サンプル中の２つのタンパク質間の相互作用の検出に依存するアッセイであって、
本明細書中で上に定義される第１の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントでタグ付けされた、第１のタグ付けされたタンパク質を得るステップと、
本明細書中で上に定義される第２の光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントでタグ付けされた、第２のタグ付けされたタンパク質を得るステップと、
上記サンプルを蛍光発生ヒドロキシベンジリデンロダニン（ＨＢＲ）類縁体と接触させるステップと、
上記２つのタンパク質の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を検出するステップ、
を含み、
それにより上記２つのタンパク質の相互作用時に再構成される、上記機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合を介して、上記サンプル中に存在する２つのタンパク質の相互作用を検出する、アッセイに関する。

【0025】

一実施形態では、本発明のアッセイは、タンパク質間相互作用を安定化または阻害する目的の分子の特性を評価するためのものである。一実施形態では、本発明のアッセイは、目的のシグナリング経路の活性化に依存する２つのタンパク質の相互作用により、目的のシグナリング経路を評価するための、または上記目的のシグナリング経路を調節する目的の分子の能力を評価するためのものである。

【発明を実施するための形態】

【0026】

定義
本明細書中使用される場合、数字に先行する用語「約」は、上記数値の±１０％以下を意味する。用語「約」が表す値は、それ自体が具体的に、好ましくは開示されている。

【0027】

本明細書中使用される場合、用語「アルコキシ」は、いずれかのＯ－アルキル基を指す。適切なアルコキシ基としては、エトキシおよびメトキシが挙げられる。

【0028】

本明細書中使用される場合、用語「アルキル」は、式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１（式中、ｎは１以上の数字である）のヒドロカルビルラジカルを指す。全般的に、本発明のアルキル基は、１～１２個の炭素原子、好ましくは１～６個の炭素原子を含む。アルキル基は、直鎖状または分岐状であってよく、本明細書中記載されるように置換され得る。適切なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル（ｎ－プロピル、ｉ－プロピル）、ブチル（ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、ｓ－ブチル、およびｔ－ブチル）、ペンチルおよびその異性体（たとえばｎ－ペンチル、イソ－ペンチル）、ならびにヘキシルおよびその異性体（たとえばｎ－ヘキシル、イソ－ヘキシル）が挙げられる。

【0029】

本明細書中使用される場合、用語「アミド」は、－ＮＲ－ＣＯ－官能基（式中Ｒは、－Ｈまたはアルキル基であり得る）を指す。

【0030】

本明細書中使用される場合、用語「アミノ」は、－ＮＨ_２基または有機脂肪族基もしくは芳香族基での１つもしくは２つの水素原子の置換によるそれに由来するいずれかの基を指す。好ましくは、－ＮＨ_２に由来する基は、アルキルアミノ基、すなわちモノアルキルアミノおよびジアルキルアミノ基を含む、Ｎ－アルキル基である。特定の実施形態では、用語「アミノ」は、ＮＨ_２、ＮＨＭｅ、またはＮＭｅ_２を指す。

【0031】

本明細書中使用される場合、用語「アミノ酸」は、天然のアミノ酸および合成のアミノ酸の両方、ならびにＤ－アミノ酸およびＬ－アミノ酸の両方を指す。これらは、当該分野でよく知られているその完全名、その３文字表記、またはその１文字表記により表される。よって、ペプチドのアミノ酸残基は、以下のように略される：フェニルアラニンはＰｈｅまたはＦであり；ロイシンはＬｅｕまたはＬであり；イソロイシンはＩｌｅまたはＩであり；メチオニンはＭｅｔまたはＭであり；バリンはＶａｌまたはＶであり；セリンはＳｅｒまたはＳであり；プロリンはＰｒｏまたはＰであり；スレオニンはＴｈｒまたはＴであり；アラニンはＡｌａまたはＡであり；チロシンはＴｙｒまたはＹであり；ヒスチジンはＨｉｓまたはＨであり；グルタミンはＧｌｎまたはＱであり；アスパラギンはＡｓｎまたはＮであり；リジンはＬｙｓまたはＫであり；アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤであり；グルタミン酸はＧｌｕまたはＥであり；システインはＣｙｓまたはＣであり；トリプトファンはＴｒｐまたはＷであり；アルギニンはＡｒｇまたはＲであり；グリシンはＧｌｙまたはＧである。「標準的なアミノ酸」または「天然に存在するアミノ酸」は、天然に存在するペプチドで一般に見出される２０の標準的なＬ－アミノ酸のいずれかを意味する。「非標準的なアミノ酸」は、合成して調製されるか天然の供給源に由来するかどうかにかかわらず、標準的なアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を意味する。たとえば、ナフチルアラニンは、合成を容易にするために、トリプトファンで置換され得る。置換され得る他の合成アミノ酸としては、限定するものではないが、Ｌ－ヒドロキシプロピル、Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニル、αアミノ酸、たとえばＬ－α－ヒドロキシリシルおよびＤ－α－メチルアラニル、Ｌ－α－メチルアラニル、βアミノ酸、およびイソキノリルが挙げられる。本発明のＰＹＰフラグメントは、標準的なアミノ酸または非標準的なアミノ酸を含み得る。また用語「アミノ酸」は、限定するものではないが、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）および置換を含む、化学的に修飾されたアミノ酸を包有する。よって、本発明のポリペプチド（すなわち本発明のＰＹＰフラグメントおよび融合タンパク質）の中に含まれるアミノ酸、特にカルボキシ末端またはアミノ末端のアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、またはその活性に有害な影響を与えることなくポリペプチドの循環半減期を変えることができる化学基により、修飾され得る。さらに、ジスルフィド結合が、本発明のポリペプチドに存在してもよく、または存在しなくてもよい。本明細書中包有される他のポリペプチドミメティックは、以下の修飾を有する本発明のポリペプチド（すなわち本発明のＰＹＰフラグメントおよび融合タンパク質）：ｉ）１つ以上のペプチジル－Ｃ（Ｏ）ＮＲ結合（ｌｉｎｋａｇｅ、ｂｏｕｎｄｓ）が、非ペプチジル結合、たとえば－ＣＨ_２－カルバメート結合（－ＣＨ_２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ－）、ホスホネート結合、－ＣＨ_２－スルホンアミド（－ＣＨ_２－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ－）結合、尿素（－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ－）結合、－ＣＨ_２－二級アミン結合、またはアルキル化ペプチジル結合（－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－）（式中、Ｒは、Ｃ_１－Ｃ_４アルキルである）で置き換えられているポリペプチド；（ｉｉ）Ｎ末端が、－ＮＲＲ^１基、－ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基、－ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ基、－ＮＲＳ（Ｏ）_２Ｒ基、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ基（式中、ＲおよびＲ^１は、水素またはＣ_１－Ｃ_４アルキルであるが、ただしＲおよびＲ^１は、両方が水素ではない）に誘導体化されている、ポリペプチド；（ｉｉｉ）Ｃ末端が、－Ｃ（Ｏ）Ｒ^２（式中、Ｒ^２は、Ｃ_１－Ｃ_４アルコキシ、および－ＮＲ^３Ｒ^４からなる群から選択され、Ｒ^３およびＲ^４は、独立して、水素およびＣ_１－Ｃ_４アルキルから選択される）に誘導体化されているポリペプチド、を含む。

【0032】

本明細書中使用される場合、用語「アリール」は、通常５～１２個の原子、好ましくは６～１０個の原子を含み、少なくとも１つの環が芳香族である、単環（すなわちフェニル）または共に縮合（たとえばナフチル）もしくは共有結合した複数の芳香環を有する、ポリ不飽和の芳香族ヒドロカルビル基を指す。芳香環は任意選択で、それに縮合された１～２つのさらなる環（シクロアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリール）を含み得る。またアリールは、本明細書中列挙される炭素環系の部分的に水素付加された誘導体を含むように意図される。アリールの非限定的な例は、フェニル、ビフェニルイル、ビフェニレニル、５－または６－テトラリニル、ナフタレン－１－または－２－イル、４－、５－、６、または７－インデニル、１－２－、３－、４－、または５－アセナフチレニル（ａｃｅｎａｐｈｔｙｌｅｎｙｌ）、３－、４－、または５－アセナフテニル（ａｃｅｎａｐｈｔｅｎｙｌ）、１－、または２－ペンタレニル、４－または５－インダニル、５－、６－、７－、または８－テトラヒドロナフチル、１，２，３，４－テトラヒドロナフチル、１，４－ジヒドロナフチル、１－、２－、３－、４－、または５－ピレニルを含む。

【0033】

本明細書中使用される場合、用語「カルボキシ」は、ＣＯＯ^－またはその塩を含む－ＣＯＯＨ官能基を指す。

【0034】

本明細書中使用される場合、用語「シアノ」は、－Ｃ≡Ｎ官能基を指す。

【0035】

本明細書中使用される場合、用語「シクロアルキル」は、環状のアルキル基、すなわち、１または２つの環状構造を有する一価の飽和または不飽和のヒドロカルビル基を指す。シクロアルキルとしては、単環式または二環式のヒドロカルビル基が挙げられる。シクロアルキル基は、その環に３つ以上の炭素原子を含み得、全般的に本発明では、３～１０個の炭素原子、好ましくは３～８個の炭素原子、より好ましくは３～６個の炭素原子を含む。シクロアルキル基の例としては、限定するものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。

【0036】

本明細書中使用される場合、用語「相補体化系（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）」は、少なくとも２つの相補体、たとえば目的の性質、たとえば蛍光発生発色団に結合する特性ではあるが、別々に採取された各相補体、たとえば各ポリペプチドフラグメントはこの性質を有しない、性質を有する構造を共に形成する、ポリペプチドまたはタンパク質の２つのフラグメントを含む系を指す。よって用語「相補体化（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」は、目的の性質、たとえば蛍光発生発色団に結合する特性を有する構造の再構成を指す。たとえば、用語「相補体化」は、上記ポリペプチド（またはタンパク質）の２つのフラグメントが近接している場合のポリペプチド（またはタンパク質）スキャフォールドの再構成を指し、その後再構成されたポリペプチド（またはタンパク質）は、蛍光発生発色団を結合する能力を有する。

【0037】

本明細書中使用される場合、用語「機能的なＰＹＰ」は、好ましくは可逆的に、蛍光発生ＨＢＲ類縁体に結合できる光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）を指す。よって、本明細書中使用される場合、用語「ＰＹＰの機能的にトランケートされたフラグメント」は、好ましくは可逆的に、蛍光発生ＨＢＲ類縁体に結合できる光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）のトランケートされたフラグメントを指す。

【0038】

本明細書中使用される場合、用語「蛍光発生発色団」または「フルオロゲン」は、その輝度が環境の変化により有意に増強され得る、発色団を指す。蛍光発生発色団は、その遊離形態下では溶液中で実質的に非蛍光性であるが、その立体構造を制限し非放射性経路によりその励起した状態の脱励起を排除する環境に置いた場合に、輝く。本発明の一実施形態では、蛍光発生発色団、たとえば蛍光発生４－ヒドロキシベンジリデン－ロダニン（ＨＢＲ）類縁体は、溶液中でほとんど不可視であるが、本発明のＰＹＰフラグメントの相補体化により形成されるものなどの、タンパク質スキャフォールドの結合時に蛍光性になる。

【0039】

本明細書中使用される場合、「蛍光発生ＨＢＲ類縁体」は、特定の周波数で光を吸収し、これにより色づき、蛍光発生発色団の性質を有する、蛍光発生４－ヒドロキシベンジリデン－ロダニン（ＨＢＲ）類縁体（蛍光発生ヒドロキシベンジリデンロダニン（ＨＢＲ）類縁体とも呼ばれる）を指す。一実施形態では、本明細書中以下で記載されるように、蛍光発生ＨＢＲ類縁体は、式（Ｉ）の化合物である。

【0040】

本明細書中使用される場合、用語「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを意味する。好ましいハロ基は、フルオロおよびクロロである。

【0041】

本明細書中使用される場合、用語「ハロアルキル」は、１つ以上のハロ基で置換されたいずれかのアルキル基を指す。好ましいハロアルキル基の例は、ＣＦ_３、ＣＨＦ_２、およびＣＨ_２Ｆである。

【0042】

本明細書中使用される場合、用語「ハロアルコキシ」は、１つ以上のハロ基で置換されたいずれかのアルコキシ基を指す。

【0043】

本明細書中使用される場合、用語「ヘテロアルキル」は、少なくとも１つの炭素原子が、ヘテロ原子に置き換えられ；好ましくは上記ヘテロ原子が、Ｎ、Ｓ、Ｐ、またはＯから選択される、アルキル基を指す。ヘテロアルキル基では、ヘテロ原子は、炭素原子のみにアルキル鎖に沿って結合し、すなわち各ヘテロ原子は、少なくとも１つの炭素原子により、他のいずれかのヘテロ原子と離れている。しかしながら、窒素、硫黄、およびリンのヘテロ原子は、任意選択で酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子は、任意選択で四級化されてもよい。ヘテロアルキル基は、特にアルコキシ基を含む。

【0044】

本明細書中使用される場合、用語「ヘテロシクロアルキル」は、少なくとも１つの炭素原子が、ヘテロ原子により置き換えられ、好ましくは上記ヘテロ原子が、Ｎ、Ｓ、Ｐ、またはＯから選択される、シクロアルキル基を指す。ヘテロシクロアルキル基では、ヘテロ原子は、アルキル基に沿って炭素原子にのみ、結合し、すなわち各ヘテロ原子は、少なくとも１つの炭素原子により、他のいずれかのヘテロ原子と離れている。しかしながら、窒素、硫黄、およびリンのヘテロ原子は、任意選択で酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子は、任意選択で四級化されてもよい。

【0045】

本明細書中使用される場合、用語「ヒドロキシル」は、－ＯＨ官能基を指す。

【0046】

本明細書中使用される場合、用語「同一性」は、２つ以上のポリペプチドまたは２つ以上の核酸の配列間の関係で使用される場合、２つ以上のアミノ酸残基または２つ以上のヌクレオチドのそれぞれの鎖間の一致数により決定される、ポリペプチドまたは核酸（それぞれ）の間の配列の関連性の度合いを指す。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）により提示される（存在する場合は）ギャップアライメントを伴う２つ以上の配列の小さい配列に合わせた配列間の同一の一致のパーセントを測定する。関連するポリペプチドまたは核酸配列の同一性は、既知の方法により容易に計算される。このような方法としては、限定するものではないが、Ａｒｔｈｕｒ Ｍ． Ｌｅｓｋ， Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｎｅｗ－Ｙｏｒｋ： Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８）；Ｄｏｕｇｌａｓ Ｗ． Ｓｍｉｔｈ， Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ （Ｎｅｗ－Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９３）； Ｈｕｇｈ Ｇ． Ｇｒｉｆｆｉｎ ａｎｄ Ａｎｎｅｔｔｅ Ｍ． Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ １ （Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ： Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９４）； Ｇｕｎｎａｒ ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｔｒｅａｓｕｒｅ Ｔｒｏｖｅ または Ｔｒｉｖｉａｌ Ｐｕｒｓｕｉｔ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７）； Ｍｉｃｈａｅｌ Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ （Ｎｅｗ－Ｙｏｒｋ： Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， １９９１）；およびＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， １９８８． ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ４８（５）：１０７３－１０８２に記載されるものが挙げられる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最大の一致を提供するように設計される。同一性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムで記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．， １９８４． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． １２（１ Ｐｔ １）：３８７－３９５； Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＴＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５（３）：４０３－４１０）を含む、ＧＣＧプログラムが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５（３）：４０３－４１０）から公開されている。よく知られているＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。

【0047】

本明細書中使用される場合、用語「ニトロ」は、－ＮＯ_２官能基を指す。

【0048】

本明細書中使用される場合、用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの、ホスホジエステル結合により共有結合したヌクレオチドのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有しかつ天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される、天然のヌクレオチドの既知の類縁体を含む核酸を包有する。他の意味が記載されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾されたバリアント（縮重コドン置換（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｃｏｄｏｎ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、アレル、オルソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）、および相補的な配列、ならびに明記された配列をも暗に包有する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合された塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を作製することにより、達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９：５０８１ （１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８ （１９９４））。他の意味が明記されない限り、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、互いが変性バージョンである、および同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という文言はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が一部のバージョンでイントロンを含み得る程度にイントロンを含み得る。

【0049】

本明細書中使用される場合、用語「オキソ」は、－Ｃ＝Ｏ官能基を指す。

【0050】

本明細書中使用される場合、用語「ＰＹＰフラグメント」は、機能的な光活動性黄色タンパク質ＰＹＰから生じるが、それ自体が機能的な光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）を含まない、ペプチドまたはポリペプチドを指す（機能的な光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）のみが蛍光発生ＨＢＲ類縁体を結合できる）。言い換えると、本明細書中使用される場合、用語「ＰＹＰフラグメント」は、機能的な光活動性黄色タンパク質ＰＹＰから生じるが、自身は蛍光発生ＨＢＲ類縁体を結合できない、ペプチドまたはポリペプチドを指す。よって、自身では蛍光発生ＨＢＲ類縁体を結合できないため、本明細書中記載のＰＹＰフラグメント（たとえば第１のＰＹＰフラグメントまたは第２のＰＹＰフラグメント）は、自身で蛍光を誘導または作製できない。

【0051】

本明細書中使用される場合、用語「レポータータンパク質」は、目的の標的または目的の機構を間接的に評価するための方法として、その相互作用が検出、局在化、または定量化され得るタンパク質を指す。

【0052】

本明細書中使用される場合、用語「サンプル」は、全般的に固体または液体である、検体または少量の物質、特に生体物質を指す。よって「サンプル」は、目的の細胞または組織または生物を指し得る。

【0053】

詳細な説明
本発明は、本明細書中記載の２つの光活動性黄色タンパク質（ＰＹＰ）フラグメントである、第１のＰＹＰフラグメントおよび第２のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントを含む相補体化系に関する。

【0054】

本発明では、相補体化系は、第１のフラグメントおよび第２のフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントを含み、第１および第２のＰＹＰフラグメントは、互いに結合でき、よって好ましくは可逆的に、蛍光発生ヒドロキシベンジリデンロダニン（ＨＢＲ）類縁体を結合する、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントを再構成できる。本明細書中上述されるように、再構成された機能的なＰＹＰまたは再構成されたその機能的なフラグメントなどの、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントのみが、蛍光発生ＨＢＲ類縁体を結合できる。本発明の第１のＰＹＰフラグメントおよび本発明の第２のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントは、自身で蛍光発生ＨＢＲ類縁体を結合できず、よって、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントへの結合時に蛍光発生ＨＢＲ類縁体により放出される蛍光を、自身で誘導または作製できない。

【0055】

「光活動性黄色タンパク質」または「ＰＹＰ」は、たとえば、紅色光合成細菌のエクトチオロドスピラ・ハロフィラ（Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ ｈａｌｏｐｈｉｌａ）（ハロロドスピラ・ハロフィラ（Ｈａｌｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ ｈａｌｏｐｈｉｌａ））から、単離された光受容体タンパク質である。野生型のＰＹＰは、比較的小さなタンパク質（１４ｋＤａ）であり、それは６９番目のシステイン残基とのチオエステル共有結合を介して、ｐ－クマル酸、発色団を結合できる。

【0056】

本発明では、相補体化系の２つのＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントは、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートの構造を、それらが近接している場合に再構成でき、ここで機能的なＰＹＰは、蛍光発生ヒドロキシベンジリデンロダニン（ＨＢＲ）類縁体を結合できる。本明細書中上述されるように、本発明の相補体化系の２つのＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントは、それらが近接している場合に互いに結合できる。

【0057】

一実施形態では、近接は、約２０ｎｍ未満、好ましくは約１０ｎｍ未満、より好ましくは約５ｎｍ未満の距離を意味する。

【0058】

よって、本発明では、再構成された機能的なＰＹＰ、または再構成されたその機能的なトランケートされたフラグメントは、蛍光発生ＨＢＲ類縁体を結合できる。好ましくは、一実施形態では、再構成された機能的なＰＹＰ、または再構成されたその機能的なトランケートされたフラグメントは、蛍光発生ＨＢＲ類縁体を可逆的に結合できる。

【0059】

本発明では、機能的なＰＹＰの再構成（または手短に述べるとＰＹＰの再構成）は、再構成された機能的なＰＹＰへの、または再構成されたその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ヒドロキシベンジリデン－ロダニン（ＨＢＲ）類縁体の結合を可能にする、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントの構造の再構成を意味する。

【0060】

よって、本発明では、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントの再構成は、再構成された機能的なＰＹＰ、または再構成されたその機能的なトランケートされたフラグメントへの結合時に蛍光発生ヒドロキシベンジリデン－ロダニン（ＨＢＲ）類縁体により放出される蛍光の検出を介して検出され得る。

【0061】

一実施形態では、機能的なＰＹＰは、配列番号１に記載のアミノ酸配列、または配列番号１に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列に由来する。

【0062】

一実施形態では、機能的なＰＹＰは、ハロロドスピラ・ハロフィラ（Ｈａｌｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ ｈａｌｏｐｈｉｌａ）（配列番号１）、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ ＬＣ１（配列番号２）、ハロモナス種 ＧＦＡＪ－１（配列番号３）、Ｒｈｅｉｎｈｅｉｍｅｒａ種 Ａ１３Ｌ（配列番号４）、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ（配列番号５）、Ｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ ｓｉｂｉｒｉｃａ ＡＴＣＣ ７００５８８（配列番号６）、およびＲｈｏｄｏｔｈａｌａｓｓｉｕｍ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ（配列番号７）を含むかまたはからなる群から選択される細菌種のＰＹＰに由来する。

【0063】

本発明では、機能的なＰＹＰは、配列番号１に記載の配列を準拠することにより６９位、または配列番号２～７に記載の配列の対応する位にシステイン、および配列番号１を準拠して９４位～１０１位のアミノ酸領域、または配列番号２～７に記載の配列の対応するアミノ酸領域に１つ以上のアミノ酸置換を含み、上記置換の１つは、配列番号１を準拠した９７位または配列番号２～７に記載の配列の対応する位のプロリンである。

【0064】

一実施形態では、機能的なＰＹＰは、配列番号８に記載のアミノ酸配列、またはその機能的なトランケートされたフラグメント、または配列番号８に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくはその機能的なトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなり、上記アミノ酸配列は、配列番号８を準拠して９４位～１０１位のアミノ酸領域に１つ以上のアミノ酸置換を含み、上記置換の１つは、配列番号８を準拠して９７位のプロリンである。

【0065】

一実施形態では、上記機能的なＰＹＰは、配列番号８に準拠して９４位～１０１位のアミノ酸領域に少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのアミノ酸置換をさらに含み、上記アミノ酸置換は、９４位のトリプトファン；９６位のイソロイシン、バリン、またはイソロイシン；および９８位のスレオニンを含むかまたはそれからなる群から選択される。

【0066】

一実施形態では、上記機能的なＰＹＰは、配列番号８に準拠して９４位～１０１位のアミノ酸領域に以下のアミノ酸置換をさらに含む：９４位のトリプトファン、９５位のメチオニン、９６位のイソロイシン、９８位のスレオニン、９９位のセリン、１００位のアルギニン、および１０１位のグリシン。

【0067】

一実施形態では、機能的なＰＹＰは、配列番号９に記載のアミノ酸、またはその機能的なトランケートされたフラグメント、または配列番号９に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくはその機能的なトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる。

【0068】

一実施形態では、機能的なＰＹＰは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、またはその機能的なトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる。

【0069】

配列番号１０～１５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列は、配列番号９に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する。

【0070】

一実施形態では、本明細書中上述される機能的なＰＹＰは、配列番号９に準拠して定義される位置に以下のアミノ酸置換の少なくとも１つをさらに含む：１９位のアスパラギン、６２位のロイシン、６８位のシステインもしくはグルタミン酸、７１位のアルギニン、７３位のセリン、１０７位のイソロイシン、および／または１２２位のイソロイシン。

【0071】

一実施形態では、機能的なＰＹＰは、以下の置換の組み合わせの１つをさらに含む、配列番号８に記載のアミノ酸配列、またはその機能的なトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる：
Ｙ９４Ｗ、Ｔ９５Ｍ、Ｆ９６Ｉ、Ｄ９７Ｐ、Ｙ９８Ｔ、Ｑ９９Ｓ、Ｍ１００Ｒ、およびＴ１０１Ｇ（配列番号９）；
Ｙ９４Ｗ、Ｔ９５Ｍ、Ｆ９６Ｉ、Ｄ９７Ｐ、Ｙ９８Ｔ、Ｑ９９Ｓ、Ｍ１００Ｒ、Ｔ１０１Ｇ、および１０７Ｉ（配列番号１６）；
Ｙ９４Ｗ、Ｔ９５Ｍ、Ｆ９６Ｉ、Ｄ９７Ｐ、Ｙ９８Ｔ、Ｑ９９Ｓ、Ｍ１００Ｒ、Ｔ１０１Ｇ、およびＶ１２２Ｉ（配列番号１７）；
Ｙ９４Ｗ、Ｔ９５Ｍ、Ｆ９６Ｉ、Ｄ９７Ｐ、Ｙ９８Ｔ、Ｑ９９Ｓ、Ｍ１００Ｒ、Ｔ１０１Ｇ、Ｖ１０７Ｉ、およびＶ１２２Ｉ（配列番号１８）；
Ｆ６２Ｌ、Ｐ６８Ｃ、Ｄ７１Ｒ、Ｐ７３Ｓ、Ｙ９４Ｗ、Ｔ９５Ｍ、Ｆ９６Ｉ、Ｄ９７Ｐ、Ｙ９８Ｔ、Ｑ９９Ｓ、Ｍ１００Ｒ、およびＴ１０１Ｇ（配列番号１９）；
Ｄ１９Ｎ、Ｆ６２Ｌ、Ｐ６８Ｃ、Ｄ７１Ｒ、Ｐ７３Ｓ、Ｙ９４Ｗ、Ｆ９６Ｉ、Ｄ９７Ｐ、Ｙ９８Ｔ、Ｑ９９Ｋ、Ｍ１００Ｒ、およびＴ１０１Ｇ（配列番号２０）；または
Ｆ６２Ｌ、Ｐ６８Ｅ、Ｃ６９Ｇ、Ｄ７１Ｒ、Ｐ７３Ｓ、Ｙ９４Ｗ、Ｆ９６Ｉ、Ｄ９７Ｐ、Ｙ９８Ｔ、Ｑ９９Ｋ、Ｍ１００Ｒ、およびＴ１０１Ｇ（配列番号２１）（ここで、置換は、参照として配列８を使用して定義されいる）。

【0072】

一実施形態では、機能的なＰＹＰは、配列番号９、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、または配列番号２１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、またはその機能的なトランケートされたフラグメント、または配列番号９；配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１を含むかもしくはそれからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくはその機能的なトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる。

【0073】

一実施形態では、機能的なＰＹＰは、配列番号９～２１に記載のアミノ酸配列、またはその機能的なトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる。

【0074】

一実施形態では、本発明の第１のＰＹＰフラグメントは、配列番号８に準拠して１１４位で終了する本明細書中上述される機能的なＰＹＰ、またはそのトランケートされたフラグメントのＮ末端側のフラグメントを含むかまたはそれからなる。

【0075】

一実施形態では、本発明の第１のＰＹＰフラグメントは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列またはそのトランケートされたフラグメント、または配列番号２２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくはそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなり、上記アミノ酸配列は、配列番号２２に準拠して９４位～１０１位のアミノ酸領域に１つ以上のアミノ酸置換をさらに含み、上記置換の１つは、配列番号２２に準拠して９７位のプロリンである。

【0076】

一実施形態では、上記本発明の第１のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントは、配列番号２２に準拠して９４位～１０１位のアミノ酸領域に少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのアミノ酸置換をさらに含み、上記アミノ酸置換は、９４位のトリプトファン；９６位のイソロイシン、バリン、またはイソロイシン；および９８位のスレオニンを含むかまたはそれからなる群から選択される。

【0077】

一実施形態では、本明細書中上述される本発明の第１のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントは、配列番号２２に準拠して９４位～１０１位のアミノ酸領域に以下のアミノ酸置換を含む：９４位のトリプトファン、９５位のメチオニン、９６位のイソロイシン、９８位のスレオニン、９９位のセリン、１００位のアルギニン、および１０１位のグリシン。

【0078】

一実施形態では、本発明の第１のＰＹＰフラグメントは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列（ＭＥＨＶＡＦＧＳＥＤＩＥＮＴＬＡＫＭＤＤＧＱＬＤＧＬＡＦＧＡＩＱＬＤＧＤＧＮＩＬＱＹＮＡＡＥＧＤＩＴＧＲＤＰＫＱＶＩＧＫＮＦＦＫＤＶＡＰＧＴＤＳＰＥＦＹＧＫＦＫＥＧＶＡＳＧＮＬＮＴＭＦＥＷＭＩＰＴＳＲＧＰＴＫＶＫＶＨＭＫＫＡＬＳ）、またはそのトランケートされたフラグメント、または配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくはそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる。

【0079】

よって、一実施形態では、本発明の第１のＰＹＰフラグメントは、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、または配列番号２９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、またはそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる。

【0080】

配列番号２４～２９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列は、配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約７０％の同一性を有する。

【0081】

一実施形態では、本明細書中上述される本発明の第１のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントは、配列番号２３に準拠して定義した位置に以下のアミノ酸置換の少なくとも１つをさらに含む：１９位のアスパラギン、６２位のロイシン、６８位のシステインもしくはグルタミン酸、７１位のアルギニン、７３位のセリン、および／または１０７位のイソロイシン。

【0082】

一実施形態では、本明細書中上述される本発明の第１のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントは、配列番号２３に準拠して定義した位置に以下のアミノ酸置換をさらに含む：１０７位のイソロイシン。

【0083】

一実施形態では、本明細書中上述される本発明の第１のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントは、配列番号２３に準拠して定義した位置に以下のアミノ酸置換の少なくとも１つをさらに含む：１９位のアスパラギン、６２位のロイシン、６８位のシステインもしくはグルタミン酸、７１位のアルギニン、および／または７３位のセリン。

【0084】

一実施形態では、本明細書中上述される本発明の第１のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントは、配列番号２３に準拠して定義した位置に以下のアミノ酸置換の少なくとも１つをさらに含む：６２位のロイシン、７１位のアルギニン、および／または７３位のセリン。

【0085】

一実施形態では、本発明の第１のＰＹＰフラグメントは、以下の置換の組み合わせの少なくとも１つをさらに含む、配列番号２２に記載のアミノ酸配列、またはそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる：
Ｙ９４Ｗ、Ｔ９５Ｍ、Ｆ９６Ｉ、Ｄ９７Ｐ、Ｙ９８Ｔ、Ｑ９９Ｓ、Ｍ１００Ｒ、およびＴ１０１Ｇ（配列番号２３）；
Ｙ９４Ｗ、Ｔ９５Ｍ、Ｆ９６Ｉ、Ｄ９７Ｐ、Ｙ９８Ｔ、Ｑ９９Ｓ、Ｍ１００Ｒ、Ｔ１０１Ｇ、およびＶ１０７Ｉ（配列番号３０）；
Ｆ６２Ｌ、Ｐ６８Ｃ、Ｄ７１Ｒ、Ｐ７３Ｓ、Ｙ９４Ｗ、Ｔ９５Ｍ、Ｆ９６Ｉ、Ｄ９７Ｐ、Ｙ９８Ｔ、Ｑ９９Ｓ、Ｍ１００Ｒ、およびＴ１０１Ｇ（配列番号３１）；
Ｄ１９Ｎ、Ｆ６２Ｌ、Ｐ６８Ｃ、Ｄ７１Ｒ、Ｐ７３Ｓ、Ｙ９４Ｗ、Ｆ９６Ｉ、Ｄ９７Ｐ、Ｙ９８Ｔ、Ｑ９９Ｋ、Ｍ１００Ｒ、およびＴ１０１Ｇ（配列番号３２）；または
Ｆ６２Ｌ、Ｐ６８Ｅ、Ｃ６９Ｇ、Ｄ７１Ｒ、Ｐ７３Ｓ、Ｙ９４Ｗ、Ｆ９６Ｉ、Ｄ９７Ｐ、Ｙ９８Ｔ、Ｑ９９Ｋ、Ｍ１００Ｒ、およびＴ１０１Ｇ（配列番号３３）
（ここで置換は、参照として配列番号２２を使用して定義される）。

【0086】

一実施形態では、本発明の第１のＰＹＰフラグメントは、配列番号２３、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、または配列番号３３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、またはそのトランケートされたフラグメント、または配列番号２３、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３を含むかまたはそれらからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくはそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる。

【0087】

一実施形態では、本発明の第１のＰＹＰフラグメントは、配列番号２３～３３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列またはそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる。

【0088】

一実施形態では、本発明の第１のＰＹＰフラグメントのトランケートされたフラグメントは、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントのＮ末端から開始するアミノ酸の欠失、好ましくは１アミノ酸～５０アミノ酸の範囲、より好ましくは１アミノ酸～４０アミノ酸、１アミノ酸～３５アミノ酸、１アミノ酸～３０アミノ酸、さらにより好ましくは１アミノ酸～２５アミノ酸の範囲の数のアミノ酸の欠失を含む。

【0089】

一実施形態では、本発明の第１のＰＹＰフラグメントのトランケートされたフラグメントは、配列番号２２に準拠して（または配列番号２３～３３のいずれか１つなどの同じ長さの他のいずれかのアミノ酸配列に準拠して）１位～最大２５位のアミノ酸がトランケートされる。よって、一実施形態では、本発明の第１のＰＹＰフラグメントのトランケートされたフラグメントは、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントの２６位～１１４位の少なくとも８９個の連続したアミノ酸を含む。

【0090】

言い換えると、本発明の第１のＰＹＰフラグメントのトランケートされたフラグメントは、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントのＣ末端からの少なくとも８９個の連続したアミノ酸を含む。

【0091】

一実施形態では、本発明の第１のＰＹＰフラグメントのトランケートされたフラグメントは、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントのＮ末端（Ｎ－ｔｅｒとも呼ばれる）から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸がトランケートされる。

【0092】

一実施形態では、本発明の第１のＰＹＰフラグメントのトランケートされたフラグメントは、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントのＣ末端からの８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、または１１３個の連続したアミノ酸を含む。

【0093】

一実施形態では、本発明の第２のＰＹＰフラグメントは、配列番号８に準拠して１１５位から開始する本明細書中上述される機能的なＰＹＰまたはそのトランケートされたフラグメントのＣ末端側のフラグメントを含むかまたはそれからなる。

【0094】

一実施形態では、本発明の第２のＰＹＰフラグメントはよって、配列番号３４（ＧＤＳＹＷＶＦＶＫＲＶ）に記載のアミノ酸配列、またはそのトランケートされたフラグメント、または配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくはそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる。

【0095】

一実施形態では、本発明の第２のＰＹＰフラグメントは、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、またはそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる。

【0096】

配列番号３５～４０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列は、配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約７０％の同一性を有する。

【0097】

一実施形態では、本明細書中上述される本発明の第２のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントは、配列番号３４に準拠して以下のアミノ酸置換をさらに含む：８位のイソロイシン。

【0098】

一実施形態では、本発明の第２のＰＹＰフラグメントは、配列番号４１に記載のアミノ酸配列、またはそのトランケートされたフラグメント、または配列番号４１に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくはそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる。

【0099】

一実施形態では、本発明の第２のＰＹＰフラグメントは、配列番号３４～４１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、またはそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる。

【0100】

一実施形態では、本発明の第２のＰＹＰフラグメントのトランケートされたフラグメントは、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントの少なくとも８個の連続したアミノ酸を含む。

【0101】

一実施形態では、本発明の第２のＰＹＰフラグメントのトランケートされたフラグメントは、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントの８、９、または１０個の連続したアミノ酸を含む。

【0102】

一実施形態では、本発明の第２のＰＹＰフラグメントのトランケートされたフラグメントは、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントのＮ末端および／またはＣ末端から開始するアミノ酸の欠失、好ましくは１、２、または３つのアミノ酸の欠失を含む。

【0103】

一実施形態では、本発明の第２のＰＹＰフラグメントのトランケートされたフラグメントは、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントのＮ末端から開始したアミノ酸の欠失、好ましくは１、２、または３つのアミノ酸の欠失を含む。

【0104】

一実施形態では、本発明の第２のＰＹＰフラグメントのトランケートされたフラグメントは、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントのＣ末端から開始するアミノ酸の欠失、好ましくは１、２、または３つのアミノ酸の欠失を含む。

【0105】

一実施形態では、本発明の第２のＰＹＰフラグメントのトランケートされたフラグメントは、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントのＮ末端からの８、９、または１０個の連続したアミノ酸を含む。

【0106】

一実施形態では、本発明の第２のＰＹＰフラグメントのトランケートされたフラグメントは、配列番号４２（ＧＤＳＹＷＶＦＶＫＲ）、配列番号４３（ＧＤＳＹＷＶＦＶＫ）、または配列番号４４（ＧＤＳＹＷＶＦＶ）に記載のアミノ酸配列、または配列番号４２、配列番号４３、もしくは配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、もしくは６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、もしくは９０％の、もしくはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

【0107】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメント、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメント、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントとを含む。

【0108】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号２３に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメント、または配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第１のＰＹＰフラグメントと、
配列番号３４に記載のアミノ酸配列、またはそのトランケートされたフラグメント、または配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメント
を含む。

【0109】

上記実施形態では、第１および第２のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントはよって、配列番号９に記載のアミノ酸配列、またはその機能的なトランケートされたフラグメント、または配列番号９に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくはその機能的なトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる機能的なＰＹＰを再構成できる。

【0110】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、または配列番号２９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第１のＰＹＰフラグメントと、
配列番号３４に記載のアミノ酸配列、またはそのトランケートされたフラグメント、または配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメント
を含む。

【0111】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号２３に記載のアミノ酸配列または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメント、または配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第１のＰＹＰフラグメントと、
配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメント
を含む。

【0112】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、または配列番号２９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第１のＰＹＰフラグメントと、
配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメント
を含む。

【0113】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、または配列番号２９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第１のＰＹＰフラグメントと、
それぞれ配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメント
を含む。

【0114】

よって、一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号２３に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントおよび配列番号３４に記載のアミノ酸配列または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメント；
配列番号２４に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントおよび配列番号３５に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメント；
配列番号２５に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントおよび配列番号３６に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメント；
配列番号２６に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントおよび配列番号３７に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメント；
配列番号２７に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントおよび配列番号３８に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメント；
配列番号２８に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントおよび配列番号３９に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメント；または
配列番号２９に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントおよび配列番号４０に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメント
を含む。

【0115】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号２４に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントと、
配列番号３５に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメント
を含む。

【0116】

上記実施形態では、第１および第２のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントはよって、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、またはその機能的なトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる機能的なＰＹＰを再構成できる。

【0117】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号２５に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第１のＰＹＰフラグメントと、
配列番号３６に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメント
を含む。

【0118】

上記実施形態では、第１および第２のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントはよって、配列番号１１に記載のアミノ酸配列、またはその機能的なトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる機能的なＰＹＰを再構成できる。

【0119】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号２６に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第１のＰＹＰフラグメントと、
配列番号３７に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメント
を含む。

【0120】

上記実施形態では、第１および第２のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントはよって、配列番号１２に記載のアミノ酸配列、またはその機能的なトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる機能的なＰＹＰを再構成できる。

【0121】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号２７に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第１のＰＹＰフラグメントと、
配列番号３８に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメント
を含む。

【0122】

上記実施形態では、第１および第２のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントはよって、配列番号１３に記載のアミノ酸配列、またはその機能的なトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる機能的なＰＹＰを再構成できる。

【0123】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号２８に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第１のＰＹＰフラグメントと、
配列番号３９に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメント
を含む。

【0124】

上記実施形態では、第１および第２のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントはよって、配列番号１４に記載のアミノ酸配列、またはその機能的なトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる機能的なＰＹＰを再構成できる。

【0125】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号２９に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第１のＰＹＰフラグメントと、
配列番号４０に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメント
を含む。

【0126】

上記実施形態では、第１および第２のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントはよって、配列番号１５に記載のアミノ酸配列、またはその機能的なトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる機能的なＰＹＰを再構成できる。

【0127】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号２３に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメント、または配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第１のＰＹＰフラグメントと、
配列番号３４、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４に記載のアミノ酸配列、または配列番号３４、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４に記載のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメント
を含む。

【0128】

一実施形態では、本明細書中上述される本発明の相補体化アッセイの第１のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントは、配列番号２３に準拠して定義した位置に以下のアミノ酸置換：１９位のアスパラギン、６２位のロイシン、６８位のシステインもしくはグルタミン酸、７１位のアルギニン、７３位のセリン、および／または１０７位のイソロイシンの少なくとも１つをさらに含み、かつ／または本明細書中上述される本発明の相補体化アッセイの第２のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントは、配列番号３４に準拠して以下のアミノ酸置換：８位のイソロイシンをさらに含む。

【0129】

一実施形態では、本明細書中上述される本発明の相補体化アッセイの第１のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントは、配列番号２３に準拠して定義した位置に以下のアミノ酸置換の少なくとも１つをさらに含む：１９位のアスパラギン、６２位のロイシン、６８位のシステインもしくはグルタミン酸、７１位のアルギニン、７３位のセリン、および／または１０７位のイソロイシン。

【0130】

一実施形態では、本明細書中上述される本発明の相補体化アッセイの第１のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントは、配列番号２３に準拠して定義した位置に以下のアミノ酸置換をさらに含む：１０７位のイソロイシン。

【0131】

一実施形態では、本明細書中上述される本発明の相補体化アッセイの第１のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントは、配列番号２３に準拠して定義した位置に以下のアミノ酸置換の少なくとも１つをさらに含む：１９位のアスパラギン、６２位のロイシン、６８位のシステインもしくはグルタミン酸、７１位のアルギニン、および／または７３位のセリン。

【0132】

一実施形態では、本明細書中上述される本発明の相補体化アッセイの第１のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントは、配列番号２３に準拠して定義した位置に以下のアミノ酸置換の少なくとも１つをさらに含む：６２位のロイシン、７１位のアルギニン、および／または７３位のセリン。

【0133】

一実施形態では、本明細書中上述される本発明の相補体化アッセイの第２のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントは、配列番号３４に準拠して以下のアミノ酸置換をさらに含む：８位のイソロイシン。

【0134】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号３０に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第１のＰＹＰフラグメントと、
配列番号３４に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメント
を含む。

【0135】

上記実施形態では、第１および第２のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントはよって、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、またはその機能的なトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる機能的なＰＹＰを再構成できる。

【0136】

一実施形態では、本明細書中上述される本発明の相補体化アッセイの第１のＰＹＰフラグメントのトランケートされたフラグメントは、上記第１のＰＹＰフラグメントのＣ末端からの少なくとも８９個の連続したアミノ酸を含む。

【0137】

一実施形態では、本明細書中上述される本発明の相補体化アッセイの第２のＰＹＰフラグメントのトランケートされたフラグメントは、上記第２のＰＹＰフラグメントの少なくとも８個の連続したアミノ酸、好ましくは上記第２のＰＹＰフラグメントのＮ末端からの少なくとも８個の連続したアミノ酸を含む。

【0138】

本明細書中上述されるように、本発明では、相補体化系は、第２のＰＹＰフラグメントおよび第２のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントを含み、ここで第１および第２のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントは、好ましくは可逆的に、蛍光発生ヒドロキシベンジリデンロダニン（ＨＢＲ）類縁体を結合する、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントを再構成できる。

【0139】

本発明では、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントの再構成は、本発明の相補体化系の２つのＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントを、協同して相互作用する分子にカップリングまたは融合することにより入手でき、ここで第１のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントは、第１の分子にカップリングまたは融合され、第２のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントは、第２の分子にカップリングまたは融合される。それらの相互作用を介して、これらの分子は、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントが再構成されるように、本発明の相補体化系の２つのＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントを、互いに十分に近接させる。

【0140】

上述されるように、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントの再構成は、再構成された機能的なＰＹＰへの、または再構成されたその機能的なトランケートされたフラグメントへの結合時に蛍光発生ヒドロキシベンジリデンロダニン（ＨＢＲ）類縁体により放出される蛍光の検出を介して、検出され得る。

【0141】

実際に、本発明の相補体化系の２つのＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントから再構成された、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントと蛍光発生ＨＢＲ類縁体によりその後形成される複合体は、蛍光性であり、すなわち光励起を受けて光を発することができる。

【0142】

一実施形態では、本発明の相補体化系の２つのＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントから再構成された、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントは、可逆的に、すなわち非共有相互作用を介して、蛍光発生ＨＢＲ類縁体を結合する。よって、一実施形態では、本発明の相補体化系の２つのＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントから再構成された、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントに対する蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合は、可逆的である。

【0143】

ポリペプチドへの蛍光発生発色団の結合を評価するための方法は、当該分野でよく知られている。このような方法は特に、ポリペプチドへの結合時に蛍光発生発色団により放出される蛍光の評価に依存し、分光蛍光分析を含む。

【0144】

一実施形態では、本発明の相補体化系の２つのＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントから再構成された、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントは、
約２５℃の温度で測定された場合、約０．０１～約２０μＭの範囲、好ましくは約０．０５～約１０μＭ、より好ましくは約０．１～約５μＭの範囲のＫ_Ｄ；および／または
約２５℃の温度で測定された場合、約０．５～約５０ｓ^－１の範囲、好ましくは約１～約２５ｓ^－１、より好ましくは約５～約２０ｓ^－１の範囲のｋ_ｏｆｆ；および／または
約２５℃の温度で測定された場合、約０．０５×１０^７～約５０×１０^７Ｍ^－１ｓ^－１の範囲、好ましくは約０．１×１０^７～約２５×１０^７Ｍ^－１ｓ^－１、より好ましくは約１×１０^７～約１５×１０^７Ｍ^－１ｓ^－１の範囲のｋ_ｏｎ
で、蛍光発生ＨＢＲ類縁体を可逆的に結合する。

【0145】

Ｋ_Ｄ、ｋ_ｏｎ、およびｋ_ｏｆｆの定数を測定するための方法は、当該分野でよく知られており、たとえば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ５１：６６０ （１９４９））に記載されるものを含む。特に、熱力学的な解離定数ＫＤを測定するための方法は、当該分野でよく知られており、たとえばＰｌａｍｏｎｔら（Ｐｌａｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕｓａ ２０１６， １１３ （３）， ４９７－５０２）により記載されるものを含む。

【0146】

一実施形態では、本発明の相補体化系の２つのＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントから再構成された、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントに結合した蛍光発生ＨＢＲ類縁体のモル吸光係数（ｍｏｌａｒ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）（ε）は、その最大吸収の波長（λ_ａｂｓ）で測定した場合に、約１～約１００ｍＭ^－１ｃｍ^－１の範囲にある。一実施形態では、モル吸光係数（ε）は、λ_ａｂｓで約１０～約２００ｍＭ^－１ｃｍ^－１の範囲にある。特定の実施形態では、モル吸光係数（ε）は、λ_ａｂｓで約２０～約１００ｍＭ^－１ｃｍ^－１の範囲にある。

【0147】

モル吸光係数（ε）を測定するための方法は、当該分野で知られており、たとえばＰｌａｍｏｎｔ， Ｍ．－Ａら（Ｐｌａｍｏｎｔ， Ｍ．－Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕｓａ ２０１６， １１３ （３）， ４９７－５０２）に記載されるものを含む。

【0148】

一実施形態では、本発明の相補体化系の２つのＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントから再構成された、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントに結合した蛍光発生ＨＢＲ類縁体の蛍光量子収率（φ）は、その最大吸収の波長（λ_ａｂｓ）で測定した場合に、約０．１％超である。一実施形態では、φは、λ_ａｂｓで約０．２５％超、約０．７５％超、または約１％超である。特定の実施形態では、φは、λ_ａｂｓで約２％超である。

【0149】

蛍光量子収率（φ）を測定するための方法は、当該分野で知られており、たとえば、Ｐｌａｍｏｎｔ， Ｍ．－Ａら（Ｐｌａｍｏｎｔ， Ｍ．－Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕｓａ ２０１６， １１３ （３）， ４９７－５０２）に記載されるものを含む。一実施形態では、一光子の励起後の蛍光量子収率φは、関係

【数1】

（式中、下付き文字のｒｅｆは、標準的なサンプルを表し、Ａ（λ_ｅｘｃ）は、励起波長λ_ｅｘｃでの吸光度であり、Ｄは、積分した発光スペクトルであり、ｎは、溶媒の屈折率である）
から計算される。

【0150】

一実施形態では、蛍光発生ＨＢＲ類縁体に結合時に、本発明の相補体化系の２つのＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントから再構成された、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントは、上記蛍光発生ＨＢＲ類縁体の輝度を高める。

【0151】

一実施形態では、本発明の相補体化系の２つのＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントから再構成された、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントに結合した蛍光発生ＨＢＲ類縁体の輝度は、約５０超である。一実施形態では、輝度は、約２００超である。特定の実施形態では、輝度は、約１０００超である。

【0152】

輝度を測定するための方法は、当該分野でよく知られている。輝度は、エミッターあたりの蛍光出力に対応し、モル吸光係数（励起波長時）および蛍光量子収率の積である。

【0153】

一実施形態では、本明細書中上述される第１および第２のＰＹＰフラグメント、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントは、低い親和性で、機能的なＰＹＰ、またはその機能的なトランケートされたフラグメントを再構成できる。

【0154】

よって、一実施形態では、本明細書中上述される第１および第２のＰＹＰフラグメント、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントは、上記第１および第２のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントの低い自己集合により、蛍光発生ＨＢＲ類縁体の存在下で低い非特異的な蛍光バックグラウンドを呈する。

【0155】

一実施形態では、本発明の第１および第２のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントは、約０．１μＭ超、好ましくは約０．２μＭ超、より好ましくは約０．５μＭ超、さらにより好ましくは１μＭ超の解離定数（Ｋ_Ｄ）で互いに結合する（ここで上記Ｋ_Ｄは、約２５℃の温度、蛍光発生ＨＢＲ類縁体の存在下で、好ましくは１０μＭの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の存在下で測定される）。

【0156】

一実施形態では、本発明の第１および第２のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントは、約０．２μＭ超、好ましくは約０．５μＭ超、より好ましくは約１μＭ超、さらにより好ましくは５μＭ超の解離定数（Ｋ_Ｄ）で互いに結合する（ここで上記Ｋ_Ｄは、約２５℃の温度、蛍光発生ＨＢＲ類縁体の存在下、好ましくは１０μＭの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の存在下で測定される）。

【0157】

一実施形態では、本発明の第１および第２のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントは、約０．２μＭ超、好ましくは約０．７５μＭ超、より好ましくは約１μＭ超、さらにより好ましくは５μＭ超の解離定数（Ｋ_Ｄ）で互いに結合する（ここで上記Ｋ_Ｄは、約２５℃の温度で、ＨＭＢＲの存在下、好ましくは１０μＭのＨＭＢＲの存在下で測定される）。

【0158】

一実施形態では、本発明の第１および第２のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントは、約１μＭ超、好ましくは約２μＭ超、より好ましくは約５μＭ超、さらにより好ましくは１０μＭ超の解離定数（Ｋ_Ｄ）で互いに結合する（ここで上記Ｋ_Ｄは、約２５℃の温度で、ＨＢＲ－３，５－ＤＯＭの存在下、好ましくは１０μＭのＨＢＲ－３，５－ＤＯＭの存在下で測定される）。

【0159】

上述されるように、熱力学的な解離定数Ｋ_Ｄを測定するための方法は、当該分野でよく知られており、たとえば、Ｐｌａｍｏｎｔ， Ｍ．－Ａら（Ｐｌａｍｏｎｔ， Ｍ．－Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕｓａ ２０１６， １１３ （３）， ４９７－５０２）により記載されるものを含む。一実施形態では、熱力学的な解離定数Ｋ_Ｄは、実施例に記載される分光蛍光分析の滴定により決定される。

【0160】

本発明の相補体化系はよって、２つの分子間の相互作用を試験するために、特に上記分子の結合および解離のいずれかまたは両方を試験するために、使用され得る。

【0161】

本発明はまた、本明細書中上述される第１または第２のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含む目的の生体分子に関する。一実施形態では、第１または第２のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントを含む目的の生体分子は、第１または第２のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントが、共有結合または非共有結合により付着される、目的の生体分子である。

【0162】

本明細書中使用される場合、用語「目的の生体分子」は、生きている生物の中に存在する全ての分子を包有する。特に、この用語は、限定するものではないが、アミノ酸、単糖、ヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、多糖、核酸、脂質、脂肪酸、糖脂質、ステロール、ビタミン、ホルモン、神経伝達物質、および代謝物を含む。

【0163】

目的の生体分子にペプチドまたはポリペプチドを非共有結合的に付着させるための方法は、よく知られている。目的の生体分子にペプチドまたはポリペプチドを共有結合的に付着させるための方法は、よく知られている。

【0164】

本発明はまた、本明細書中上述される第１および第２のＰＹＰフラグメント、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含む目的の生体分子の対であって、１つの目的の生体分子が、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含み、他の目的の生体分子が、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含む、目的の生体分子の対に関する。

【0165】

一実施形態では、目的の生体分子は、タンパク質である。

【0166】

よって、本発明は、本明細書中上述される第１または第２のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含む融合タンパク質に関する。

【0167】

実際に、本明細書中上述されるＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるトランケートされたフラグメントは、結果得られる融合タンパク質をコードする核酸配列を（たとえば形質転換またはトランスフェクションを介して）挿入することにより宿主細胞内でいずれかの目的のタンパク質との融合で発現され得る。

【0168】

目的のタンパク質にペプチドまたはポリペプチドを融合するための方法は、よく知られている。簡潔に述べると、このような方法は、ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸とインフレームで目的のタンパク質をコードする核酸配列を挿入することを含む。目的のタンパク質をコードする核酸配列は、コードされたタンパク質が、適宜、目的のタンパク質のＮ末端または目的のタンパク質のＣ末端、または内部に位置付けられるように挿入され得る。さらに、リンカーまたはスペーサーをコードする短い核酸配列が、目的のペプチドおよびタンパク質をコードする配列の間に存在し得る。

【0169】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、目的のタンパク質とを含む。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、目的のタンパク質とを含む。

【0170】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、本発明のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメント以外の少なくとも１つのさらなるエレメントと、目的のタンパク質とを含む。

【0171】

本発明の融合タンパク質で考慮され得るさらなるエレメントの例としては、限定するものではないが、リンカー、標的化シグナル、プロテアーゼ標的部位、抗体結晶化可能領域（Ｆｃ）、酵素（アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなど）、ヘマグルチニンタグ、ポリアルギニンタグ、ポリヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、ｓｔｒｅｐタグ、Ｓ－タグ、ＨＡＴタグ、３×ｆｌａｇタグ、カルモジュリン結合ペプチドタグ、ＳＢＰタグ、キチン結合ドメインタグ、ＧＳＴタグ、マルトース結合タンパク質タグ、蛍光タンパク質タグ（好ましくは、その蛍光は、本発明の相補体化系に関連した蛍光とはスペクトル的に別であり得る）、Ｔ７タグ、Ｖ５タグ、およびＸ－ｐｒｅｓｓタグが挙げられる。

【0172】

一実施形態では、本明細書中上述される融合タンパク質は、リンカーを含む。

【0173】

リンカーを設計または選択するための方法は、当業者によく知られている。

【0174】

リンカーの例としては、限定するものではないが、配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含むかまたはからなるリンカーが挙げられる。

【0175】

本発明はまた、本明細書中上述される第１および第２のＰＹＰフラグメント、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含む融合タンパク質の対であって、１つの融合タンパク質が、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含み、他の融合タンパク質が、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含む、融合タンパク質の対に関する。

【0176】

一実施形態では、対の融合タンパク質の両方は、同じ目的のタンパク質を含む。言い換えると、一実施形態では、１つの融合タンパク質は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、目的のタンパク質とを含み、他の融合タンパク質は、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、同じ目的のタンパク質とを含む。

【0177】

一実施形態では、対の各融合タンパク質は、明確に異なる目的のタンパク質を含む。言い換えると、一実施形態では、１つの融合タンパク質は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、第１の目的のタンパク質とを含み、他の融合タンパク質は、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、第２の、異なる目的のタンパク質とを含む。

【0178】

一実施形態では、第１および第２の目的のタンパク質は、互いに相互作用できる２つのレポータータンパク質である。

【0179】

本発明はまた、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントおよび／または第２のＰＹＰフラグメント、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントをコードする核酸、ならびに本明細書中上述される本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列に関する。

【0180】

本発明では、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントおよび／または第２のＰＹＰフラグメント、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントをコードする本発明の核酸配列は、互いが変性バージョンであり、および同じ第１のＰＹＰフラグメントおよび／または第２のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントをコードする、全ての核酸配列を含む。

【0181】

当業者は、遺伝子コードに基づきコード配列を適応させるための方法、たとえば限定するものではないが、サイレント変異を導入するためにコドンの縮重を使用する方法、および企図される宿主細胞に関連する標準的な遺伝子コードのコドン使用のバイアスおよび変化を考慮する方法、に精通している。

【0182】

一実施形態では、本発明の核酸配列は、配列番号２３に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントをコードするか、または配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントをコードする。

【0183】

配列番号２３に記載のアミノ酸配列または配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントをコードする核酸配列の例としては、限定するものではないが、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２に記載の核酸配列が挙げられる。

【0184】

配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントをコードする核酸配列の例としては、限定するものではないが、配列番号４６に記載の核酸配列が挙げられる。

【0185】

配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列の例としては、限定するものではないが、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２に記載の核酸配列が挙げられる。

【0186】

一実施形態では、本発明の核酸配列は、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメントをコードするか、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメント、または配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントをコードする。

【0187】

配列番号３４に記載のアミノ酸配列または配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメントをコードする核酸配列の例としては、限定するものではないが、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、および配列番号５９に記載の核酸配列が挙げられる。

【0188】

配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメントをコードする核酸配列の例としては、限定するものではないが、配列番号５３に記載の核酸配列が挙げられる。

【0189】

配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列の例としては、限定するものではないが、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、および配列番号５９に記載の核酸配列が挙げられる。

【0190】

一実施形態では、本発明の核酸配列は、配列番号３４、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメントをコードするか、または配列番号３４、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列をコードする。

【0191】

配列番号３４、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメントをコードする核酸配列の例としては、限定するものではないが、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６１、および配列番号６２にそれぞれ記載の核酸配列が挙げられる。

【0192】

本発明はまた、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントおよび第２のＰＹＰフラグメント、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントをコードする核酸配列の対であって、１つの核酸配列が、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントをコードし、他の核酸配列が、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントをコードする、核酸配列の対に関する。

【0193】

本発明はまた、本明細書中上述される第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質をコードする核酸配列の対であって、１つの融合タンパク質が本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含み、第２の融合タンパク質が、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含む、核酸配列の対に関する。

【0194】

本発明はまた、本明細書中上述される少なくとも１つの核酸配列を含むベクターに関する。

【0195】

一実施形態では、本発明のベクターは、
本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントをコードする第１の核酸配列と、
本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントをコードする第２の核酸配列
を含む。

【0196】

一実施形態では、本発明のベクターは、
配列番号２３に記載のアミノ酸配列または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメント、または配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントをコードする第１の核酸配列と、
配列番号３４に記載のアミノ酸配列または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメント、または配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメントをコードする第２の核酸配列
を含む。

【0197】

一実施形態では、本発明のベクターは、
配列番号２３に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメント、または配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントをコードする第１の核酸配列と、
配列番号３４、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４に記載のアミノ酸配列、または配列番号３４、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメントをコードする第２の核酸配列
を含む。

【0198】

本発明はまた、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントおよび第２のＰＹＰフラグメント、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントをコードする核酸配列を含むベクターの対であって、１つのベクターが、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントをコードする核酸配列を含み、他のベクターが、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントをコードする核酸配列を含む、ベクターの対に関する。

【0199】

一実施形態では、第１のベクターは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメント、または配列番号２３に記載のアミノ酸と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントをコードする核酸配列を含む。

【0200】

一実施形態では、第２のベクターは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメント、または配列番号３４に記載のアミノ酸と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメントをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、第２のベクターは、配列番号３４、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４に記載のアミノ酸配列、または配列番号３４、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメントをコードする核酸配列を含む。

【0201】

本明細書中使用される場合、用語「ベクター」は、そこでそれが複製および／または発現され得る細胞中に外来性遺伝子物質を人工的に輸送するためのビヒクルとして分子クローニングで使用される核酸分子を指す。ベクターの例としては、限定するものではないが、プラスミド、ウイルスベクター、および人工染色体が挙げられる。

【0202】

特に、本発明の文脈では、ベクターは、本明細書中上述されるＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントをコードする配列とインフレームで目的のタンパク質をコードする配列の融合のための必要とされる核酸配列を含み得る。

【0203】

本発明はまた、本明細書中上述されるＰＹＰフラグメント、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメント、または本明細書中上述される融合タンパク質の少なくとも１つを発現する細胞に関する。

【0204】

一実施形態では、本発明の細胞は、本明細書中上述される第１および第２のＰＹＰフラグメントの両方、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを発現する。

【0205】

一実施形態では、本発明の細胞は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含む本明細書中上述される第１の生体分子と、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含む本明細書中上述される第２の生体分子とを発現する。

【0206】

一実施形態では、目的の生体分子の１つは、タンパク質である。一実施形態では、目的の生体分子の両方は、タンパク質である。

【0207】

よって、一実施形態では、本発明の細胞は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含む第１の融合タンパク質と、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含む第２の融合タンパク質とを発現する。

【0208】

一実施形態では、融合タンパク質は、レポータータンパク質を含む。

【0209】

よって、一実施形態では、本発明の細胞は、
本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、レポータータンパク質とを含む第１の融合タンパク質；および
本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、レポータータンパク質とを含む第２の融合タンパク質
を発現する（ここでレポータータンパク質は、同一であるまたは異なる）。

【0210】

一実施形態では、本発明の細胞は、
本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、レポータータンパク質とを含む第１の融合タンパク質；および
本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、レポータータンパク質とを含む第２の融合タンパク質
を発現し、ここでレポータータンパク質は、同一であるまたは異なり、それらの相互作用は、目的の標的または目的の機構を間接的に評価するための方法として、検出、局在化、または定量化され得る。

【0211】

よって、一実施形態では、本発明の細胞は、目的の標的または目的の生理的な機構を評価するための細胞性センサーとして使用され得る。

【0212】

目的の標的または機構の例としては、限定するものではないが、カルシウムなどの分析物の細胞での存在の評価、およびアポトーシスなどの生理的な機構の評価が挙げられる。

【0213】

よって、本発明の細胞は、カルシウムなどの目的の分析物の細胞中の存在を評価するための細胞性センサーとして使用され得る。本発明の細胞は、アポトーシスなどの細胞中の生理的な機構を評価するための細胞性センサーとして使用され得る。本発明の細胞はまた、目的の標的または機構を制御する薬物を同定するための化学的なライブラリーをスクリーニングするための細胞性センサーとして使用され得る。

【0214】

一実施形態では、本明細書中上述される相補体化系は、蛍光発生ＨＢＲ類縁体をさらに含む。

【0215】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、式（Ｉ）の蛍光発生ＨＢＲ類縁体：

【化2】

（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は、同一であっても異っていてもよく、それぞれ、飽和または不飽和であり、直鎖状または分岐状であり、任意選択でハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルで置換されていてもよい、Ｈ、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル（例えば、アルコキシ）、またはヘテロシクロアルキル基を表し；
Ｒ３は、非結合性のダブレット（すなわち、電子の遊離対）であるか、あるいは、飽和または不飽和であり、直鎖状または分岐状であり、任意選択でハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい、Ｈ、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基を表し、
Ｒ４は、飽和または不飽和であり、直鎖状または分岐状であり、任意選択でハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい、Ｈ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよいＳ、Ｏ、またはＮ原子により中断または終結した、単結合または二重結合であり、
Ｘは、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨＲ７、またはＮ（Ｒ７）_２であり、Ｒ７は、飽和または不飽和であり、直鎖状または分岐状であり、任意選択でハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい、Ｈ、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基であり、
Ｙは、Ｏ、ＮＨ、またはＳである）
をさらに含む。

【0216】

一実施形態では、蛍光発生ＨＢＲ類縁体は、（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシベンジリデン）－２－チオキソ－１，３－チアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ）；（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－３－メチルベンジリデン）－２－チオキソ－１，３－チアゾリジン－４－オン（ＨＭＢＲ）；（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－３，５－ジメトキシベンジリデン）－２－チオキソチアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ－３，５ＤＯＭ）；（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－３－メトキシベンジリデン）－２－チオキソ－１，３－チアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ－３ＯＭ）；（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－３，５－ジメチルベンジリデン）－２－チオキソチアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ－３，５ＤＭ）；（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－２，５－ジメチルベンジリデン）－２－チオキソ－１，３－チアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ－２，５ＤＭ）；（Ｚ）－５－（３－エチル－４－ヒドロキシベンジリデン）－２－チオキソチアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ－３Ｅ）；（Ｚ）－５－（３－エトキシ－４－ヒドロキシベンジリデン）－２－チオキソチアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ－３ＯＥ）；（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシベンジリデン）－３－メチル－２－チオキソチアゾリジン－４－オン（ＨＢＭＲ）；（Ｚ）－５－（２，４－ジヒドロキシベンジリデン）－２－チオキソ－１，３－チアゾリジン－４－オン（ＤＨＢＲ） （Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－３－メトキシベンジリデン）－２－チオキソ－１，３－チアゾリジン－４－オン（ＨＭＯＢＲ）；（Ｚ）－２－（５－（３－エチル－４－ヒドロキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ－３Ｅ）；（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－３－エトキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ－３ＯＥ）；（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－２－メトキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ－２ＯＭ）；（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ）；（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－３－メチルベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ－３Ｍ）；（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－３－メトキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ－３ＯＭ）；（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－２－メトキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ－２ＯＭ）；（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－２，５－ジメチルベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ－２，５ＤＭ）；（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－３，５－ジメチルベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ－３，５ＤＭ）、および（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－３，５－ジメトキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ－３，５ＤＯＭ）を含むかまたはそれらからなる群から選択される。

【0217】

一実施形態では、蛍光発生ＨＢＲ類縁体は、（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－３－メチルベンジリデン）－２－チオキソ－１，３－チアゾリジン－４－オン（ＨＭＢＲ）；（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－３，５－ジメトキシベンジリデン）－２－チオキソチアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ－３，５ＤＯＭ）；（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－３－メトキシベンジリデン）－２－チオキソ－１，３－チアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ－３ＯＭ）、および（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－３，５－ジメチルベンジリデン）－２－チオキソチアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ－３，５ＤＭ）を含むかまたはそれらからなる群から選択される。

【0218】

一実施形態では、蛍光発生ＨＢＲ類縁体は、膜浸透性である。

【0219】

本明細書中使用される場合、用語「膜浸透性」は、生体膜（すなわち極性脂質層、好ましくは極性脂質二重層からなる膜）を通過できる化合物の性質を指す。用語「膜非浸透性」は、反対に、生体膜を通過できない化合物を指す。

【0220】

一実施形態では、蛍光発生ＨＢＲ類縁体は、膜浸透性であり、（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシベンジリデン）－２－チオキソ－１，３－チアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ）；（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－３－メチルベンジリデン）－２－チオキソ－１，３－チアゾリジン－４－オン（ＨＭＢＲ）；（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－３，５－ジメトキシベンジリデン）－２－チオキソチアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ－３，５ＤＯＭ）；（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－３－メトキシベンジリデン）－２－チオキソ－１，３－チアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ－３ＯＭ）；（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－３，５－ジメチルベンジリデン）－２－チオキソチアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ－３，５ＤＭ）；（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－２，５－ジメチルベンジリデン）－２－チオキソ－１，３－チアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ－２，５ＤＭ）；（Ｚ）－５－（３－エチル－４－ヒドロキシベンジリデン）－２－チオキソチアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ－３Ｅ）；（Ｚ）－５－（３－エトキシ－４－ヒドロキシベンジリデン）－２－チオキソチアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ－３ＯＥ）；（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシベンジリデン）－３－メチル－２－チオキソチアゾリジン－４－オン（ＨＢＭＲ）；（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＡＡＲ）；（Ｚ）－５－（２，４－ジヒドロキシベンジリデン）－２－チオキソ－１，３－チアゾリジン－４－オン（ＤＨＢＲ）、および（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－３－メトキシベンジリデン）－２－チオキソ－１，３－チアゾリジン－４－オン（ＨＭＯＢＲ）を含むかまたはそれらからなる群から選択される。

【0221】

一実施形態では、蛍光発生ＨＢＲ類縁体は、膜浸透性であり、（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－３－メチルベンジリデン）－２－チオキソ－１，３－チアゾリジン－４－オン（ＨＭＢＲ）；（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－３，５－ジメトキシベンジリデン）－２－チオキソチアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ－３，５ＤＯＭ）；（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－３－メトキシベンジリデン）－２－チオキソ－１，３－チアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ－３ＯＭ）、および（Ｚ）－５－（４－ヒドロキシ－３，５－ジメチルベンジリデン）－２－チオキソチアゾリジン－４－オン（ＨＢＲ－３，５ＤＭ）を含むかまたはそれらからなる群から選択される。

【0222】

一実施形態では、蛍光発生ＨＢＲ類縁体は、膜非浸透性である。

【0223】

一実施形態では、蛍光発生ＨＢＲ類縁体は、膜非浸透性であり、（Ｚ）－２－（５－（３－エチル－４－ヒドロキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ－３Ｅ）；（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－３－エトキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ－３ＯＥ）；（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－２－メトキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ－２ＯＭ）；（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ）；（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－３－メチルベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ－３Ｍ）；（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－３－メトキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ－３ＯＭ）；（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－２－メトキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ－２ＯＭ）；（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－２，５－ジメチルベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ－２，５ＤＭ）；（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－３，５－ジメチルベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ－３，５ＤＭ）、および（Ｚ）－２－（５－（４－ヒドロキシ－３，５－ジメトキシベンジリデン）－４－オキソ－２－チオキソチアゾリジン－３－イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ－３，５ＤＯＭ）を含むかまたはそれらからなる群から選択される。

【0224】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、
配列番号３４に記載のアミノ酸配列または配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、
ＨＭＢＲ、ＨＢＲ－３，５ＤＯＭ、ＨＢＲ－３ＯＭ、およびＨＢＲ－３，５ＤＭを含むかまたはそれらからなるリストから選択される蛍光発生ＨＢＲ類縁体
を含む。

【0225】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号３４に記載のアミノ酸配列または配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＭＢＲまたはＨＢＲ－３，５ＤＯＭとを含む。

【0226】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号３４に記載のアミノ酸配列または配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＭＢＲとを含む。

【0227】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号３４に記載のアミノ酸配列または配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＢＲ－３，５ＤＯＭとを含む。

【0228】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号３４に記載のアミノ酸配列または配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＢＲ－３ＯＭとを含む。

【0229】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号３４に記載のアミノ酸配列または配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＢＲ－３，５ＤＭとを含む。

【0230】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、配列番号２３または配列番号３０に記載のアミノ酸配列、またはそのトランケートされたフラグメント、または配列番号２３または配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくはそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントと、
配列番号３４に記載のアミノ酸配列、または配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、
ＨＭＢＲ、ＨＢＲ－３，５ＤＯＭ、ＨＢＲ－３ＯＭ、およびＨＢＲ－３，５ＤＭを含むかまたはそれらからなるリストから選択される蛍光発生ＨＢＲ類縁体（好ましくは、蛍光発生類縁体は、ＨＭＢＲまたはＨＢＲ－３，５ＤＯＭである）
を含む。

【0231】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、
配列番号４２に記載のアミノ酸配列または配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、
ＨＭＢＲ、ＨＢＲ－３，５ＤＯＭ、ＨＢＲ－３ＯＭ、およびＨＢＲ－３，５ＤＭを含むかまたはそれらからなるリストから選択される蛍光発生ＨＢＲ類縁体
を含む。

【0232】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号４２に記載のアミノ酸配列または配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＭＢＲまたはＨＢＲ－３，５ＤＯＭとを含む。

【0233】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号４２に記載のアミノ酸配列または配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＭＢＲとを含む。

【0234】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号４２に記載のアミノ酸配列または配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＢＲ－３，５ＤＯＭとを含む。

【0235】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号４２に記載のアミノ酸配列または配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＢＲ－３ＯＭとを含む。

【0236】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号４２に記載のアミノ酸配列または配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＢＲ－３，５ＤＭとを含む。

【0237】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号２３または配列番号３０に記載のアミノ酸配列、またはそのトランケートされたフラグメント、または配列番号２３または配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列、またはそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる本発明の第１のＰＹＰフラグメントと、
配列番号４２に記載のアミノ酸配列、または配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、
ＨＭＢＲ、ＨＢＲ－３，５ＤＯＭ、ＨＢＲ－３ＯＭ、およびＨＢＲ－３，５ＤＭを含むかまたはそれらからなるリストから選択される蛍光発生ＨＢＲ類縁体（好ましくは、蛍光発生ＨＢＲ類縁体は、ＨＭＢＲまたはＨＢＲ－３，５ＤＯＭである）
を含む。

【0238】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、
配列番号４３に記載のアミノ酸配列、または配列番号４３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、
ＨＭＢＲ、ＨＢＲ－３，５ＤＯＭ、ＨＢＲ－３ＯＭ、およびＨＢＲ－３，５ＤＭを含むかまたはそれらからなるリストから選択される蛍光発生ＨＢＲ類縁体
を含む。

【0239】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号４３に記載のアミノ酸配列、または配列番号４３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＭＢＲまたはＨＢＲ－３，５ＤＯＭとを含む。

【0240】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号４３に記載のアミノ酸配列、または配列番号４３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＭＢＲとを含む。

【0241】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号４３に記載のアミノ酸配列、または配列番号４３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＢＲ－３，５ＤＯＭとを含む。

【0242】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号４３に記載のアミノ酸配列、または配列番号４３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＢＲ－３ＯＭとを含む。

【0243】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号４３に記載のアミノ酸配列、または配列番号４３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＢＲ－３，５ＤＭとを含む。

【0244】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号２３または配列番号３０に記載のアミノ酸配列、またはそのトランケートされたフラグメント、または配列番号２３または配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列、またはそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントと、
配列番号４３に記載のアミノ酸配列、または配列番号４３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、
ＨＭＢＲ、ＨＢＲ－３，５ＤＯＭ、ＨＢＲ－３ＯＭ、およびＨＢＲ－３，５ＤＭを含むかまたはそれらからなるリストから選択される蛍光発生ＨＢＲ類縁体（好ましくは、蛍光発生ＨＢＲ類縁体は、ＨＭＢＲまたはＨＢＲ－３，５ＤＯＭである）
を含む。

【0245】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、
配列番号４４に記載のアミノ酸配列、または配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、
ＨＭＢＲ、ＨＢＲ－３，５ＤＯＭ、ＨＢＲ－３ＯＭ、およびＨＢＲ－３，５ＤＭを含むかまたはそれらからなるリストから選択される蛍光発生ＨＢＲ類縁体
を含む。

【0246】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号４４に記載のアミノ酸配列、または配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＭＢＲまたはＨＢＲ－３，５ＤＯＭとを含む。

【0247】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号４４に記載のアミノ酸配列、または配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＭＢＲとを含む。

【0248】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号４４に記載のアミノ酸配列、または配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＢＲ－３，５ＤＯＭとを含む。

【0249】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号４４に記載のアミノ酸配列、または配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＢＲ－３ＯＭとを含む。

【0250】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントと、配列番号４４に記載のアミノ酸配列、または配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、ＨＢＲ－３，５ＤＭとを含む。

【0251】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号２３または配列番号３０に記載のアミノ酸配列、またはそのトランケートされたフラグメント、または配列番号２３または配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列、またはそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントと、
配列番号４４に記載のアミノ酸配列または配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる本発明の第２のＰＹＰフラグメントと、
ＨＭＢＲ、ＨＢＲ－３，５ＤＯＭ、ＨＢＲ－３ＯＭ、およびＨＢＲ－３，５ＤＭを含むかまたはそれらからなるリストから選択される蛍光発生ＨＢＲ類縁体（好ましくは、蛍光発生ＨＢＲ類縁体は、ＨＭＢＲまたはＨＢＲ－３，５ＤＯＭである）
を含む。

【0252】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、または配列番号２９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントと、
配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメントと、
ＨＭＢＲ、ＨＢＲ－３，５ＤＯＭ、ＨＢＲ－３ＯＭ、およびＨＢＲ－３，５ＤＭを含むかまたはそれらからなるリストから選択される蛍光発生ＨＢＲ類縁体（好ましくは、蛍光発生ＨＢＲ類縁体は、ＨＭＢＲまたはＨＢＲ－３，５ＤＯＭである）
を含む。

【0253】

一実施形態では、本発明の相補体化系は、
配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、または配列番号２９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントと、
配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメントと、
ＨＭＢＲ、ＨＢＲ－３，５ＤＯＭ、ＨＢＲ－３ＯＭ、およびＨＢＲ－３，５ＤＭを含むかまたはそれらからなるリストから選択される蛍光発生ＨＢＲ類縁体（好ましくは、蛍光発生ＨＢＲ類縁体は、ＨＭＢＲまたはＨＢＲ－３，５ＤＯＭである）
を含む。

【0254】

また本発明は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントをコードする第１の核酸配列と、
本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントをコードする第２の核酸配列
を含む少なくとも１つのベクターを含むキットに関する。

【0255】

一実施形態では、本発明のキットは、
配列番号２３に記載のアミノ酸配列または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメント、または配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントをコードする第１の核酸配列と、
配列番号３４に記載のアミノ酸配列または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメント、または配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメントをコードする第２の核酸配列と
を含む少なくとも１つのベクターを含む。

【0256】

一実施形態では、本発明のキットは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメント、または配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントをコードする第１の核酸配列と、
配列番号３４、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４に記載のアミノ酸配列、または配列番号３４、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメントをコードする第２の核酸配列
を含む少なくとも１つのベクターを含む。

【0257】

本発明はまた、
本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントをコードする核酸配列を含む第１のベクターと、
本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントをコードする核酸配列を含む第２のベクター
を含む、キットに関する。

【0258】

一実施形態では、本発明のキットは、
配列番号２３に記載のアミノ酸配列または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメント、または配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントをコードする核酸配列を含む第１のベクターと、
配列番号３４に記載のアミノ酸配列または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメント、または配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメントをコードする核酸配列を含む第２のベクター
を含む。

【0259】

一実施形態では、本発明のキットは、
配列番号２３に記載のアミノ酸配列または本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメント、または配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列もしくは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを含むかまたはそれからなる第１のＰＹＰフラグメントをコードする核酸配列を含む第１のベクターと、
配列番号３４、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４に記載のアミノ酸配列、または配列番号３４、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる第２のＰＹＰフラグメントをコードする核酸配列を含む第２のベクター
を含む。

【0260】

本発明はまた、
本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントを含む、本明細書中上述される第１の目的の生体分子と、
本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントを含む、本明細書中上述される第２の目的の生体分子
を含むキットに関する。

【0261】

本発明はまた、
本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントを含む第１の融合タンパク質と、
本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントを含む第２の融合タンパク質
を含むキットに関する。

【0262】

本発明はまた、
本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメント、およびレポータータンパク質を含む第１の融合タンパク質と、
本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメント、およびレポータータンパク質を含む第２の融合タンパク質
を含むキットであって、
レポータータンパク質は、同一であるまたは異なる、
キットに関する。

【0263】

本発明はまた、本明細書中上述される細胞または細胞集団を含むキットに関する。

【0264】

一実施形態では、本発明のキットは、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメント、およびレポータータンパク質を含む第１の融合タンパク質と、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメント、およびレポータータンパク質を含む第２の融合タンパク質とを発現する細胞または細胞集団を含む。

【0265】

一実施形態では、本明細書中上述されるキットは、本明細書中上述される少なくとも１つの蛍光発生ＨＢＲ類縁体をさらに含む。

【0266】

また本発明は、サンプル中の２つの目的の生体分子、好ましくは２つの目的のタンパク質の間の相互作用を検出するための方法であって、
本明細書中上述されるＰＹＰの第１のフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを、第１の目的の生体分子に付着させるステップと、
本明細書中上述されるＰＹＰの第２のフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを、第２の目的の生体分子に付着させるステップと、
上記サンプルを本明細書中上述される蛍光発生ＨＢＲ類縁体と接触させるステップと、
２つの目的の生体分子の相互作用の後に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を検出するステップ、
を含み、
それにより２つの目的の生体分子の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合を介して、上記サンプルに存在する２つの目的の生体分子の相互作用を検出する、方法に関する。

【0267】

一実施形態では、第１の目的の生体分子は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントに付着され、第２の目的の生体分子は、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントに付着される。

【0268】

よって、一実施形態では、本発明の方法は、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントに付着された第１の目的の生体分子と、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントに付着された第２の目的の生体分子の間でのサンプル中の相互作用を検出するためのものであり、
上記サンプルを本明細書中上述される蛍光発生ＨＢＲ類縁体と接触させるステップと、
２つの目的の生体分子の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を検出するステップ、
を含み、
それにより２つの目的の生体分子の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合を介して、上記サンプルに存在する２つの目的の生体分子の相互作用を検出する。

【0269】

一実施形態では、第１および第２の目的の生体分子は、同一である。

【0270】

一実施形態では、第１および第２の目的の生体分子は、異なる。

【0271】

好ましい実施形態では、目的の生体分子の少なくとも１つは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質などのアミノ酸鎖、好ましくはタンパク質である。このような実施形態では、本発明のＰＹＰフラグメントまたはそのフラグメントの少なくとも１つは、上記少なくとも１つの生体分子と融合タンパク質またはタグ付けされたタンパク質を形成し得る。

【0272】

一実施形態では、両方の第１および第２の目的の生体分子は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質などのアミノ酸鎖、好ましくはタンパク質である。

【0273】

目的のタンパク質は、天然のタンパク質、様々なタンパク質ドメインの融合からもたらされるキメラタンパク質、または合成タンパク質であり得る。

【0274】

一実施形態では、目的のタンパク質は、細胞内タンパク質、膜タンパク質、膜外表面に少なくとも部分的に存在する細胞表面タンパク質、または分泌タンパク質である。

【0275】

一実施形態では、２つの目的の生体分子は、レポータータンパク質である。

【0276】

本明細書中使用される場合、用語レポータータンパク質は、その相互作用がサンプルの変化を反映する、２つのタンパク質を指す。レポータータンパク質を使用してその後起こり得る変化の例としては、限定するものではないが、細胞シグナリング、遺伝子発現、カルシウムの濃度、細胞間相互作用、細胞の移動、細胞死、細胞内輸送、分泌、細胞周期、および概日リズムが挙げられる。

【0277】

一実施形態では、サンプルは、生体サンプルである。一実施形態では、サンプルは、生物である。一実施形態では、生物は、人体ではない。一実施形態では、サンプルは、細胞培養物である。細胞の例として、酵母細胞、細菌細胞、植物細胞、動物細胞が挙げられる。一実施形態では、サンプル中の細胞は、生きている。一実施形態では、サンプル中の細胞は、顕微鏡観察およびイメージングのため固定されている。

【0278】

本発明の文脈で考慮される生物は、たとえば、限定するものではないが、生物医学的な研究で使用されるモデル生物、たとえば細菌、酵母、ショウジョウバエ、線形動物、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、およびイヌなどである。

【0279】

一実施形態では、予め産生され、任意選択で精製された、目的の生体分子、好ましくは目的のタンパク質に結合した本発明のＰＹＰフラグメント、またはそのトランケートされたフラグメントは、生物または細胞の中に注入される。

【0280】

好ましい実施形態では、サンプル中のモデル生物もしくは細胞、またはそのサブセットは、目的の生体分子、好ましくは目的のタンパク質に付着された、本発明のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントを発現するように修飾される。

【0281】

当業者は、目的のタンパク質を発現させるために培養物中のモデル生物または細胞を修飾することを可能にする方法に精通している。このような方法の例としては、限定するものではないが、核酸配列、たとえば本明細書中上述される核酸配列のトランスフェクション、エレクトロポレーション、注射、および遺伝子組換えが挙げられる。上記方法はまた、限定するものではないが、目的のタンパク質を発現するように修飾された細胞の移植、注射、および共培養を含む。

【0282】

一実施形態では、サンプルは、目的の生体分子、好ましくは目的のタンパク質に付着された、本発明のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントを発現するように修飾された細胞から抽出される。

【0283】

一実施形態では、サンプルは、目的の生体分子、好ましくは目的のタンパク質に付着された、本発明のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントを補充した細胞抽出物である。

【0284】

一実施形態では、サンプルは、無細胞であるか、または目的の生体分子に付着された、本発明のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントを産生する細胞を含まない。このような実施形態では、以前に産生され、任意選択で精製された目的の生体分子、好ましくは目的のタンパク質に付着された、本発明のＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントが、サンプルに添加される。

【0285】

一実施形態では、サンプル中の２つの目的の生体分子、好ましくは２つの目的のタンパク質の間の相互作用を検出するための方法は、
本明細書中上述されるＰＹＰの第１のフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを、第１の目的の生体分子、好ましくは第１の目的のタンパク質に融合するステップと、
本明細書中上述されるＰＹＰの第２のフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを、第２の目的の生体分子、好ましくは第２の目的のタンパク質に融合するステップと、
上記サンプルを本明細書中上述される蛍光発生ＨＢＲ類縁体と接触させるステップと、
２つの目的の生体分子、好ましくは２つの目的のタンパク質の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を検出するステップ、
を含み、
それにより２つの目的の生体分子、好ましくは２つの目的のタンパク質の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合を介して、サンプル中の２つの目的の生体分子、好ましくは２つの目的のタンパク質の相互作用を検出する。

【0286】

上述されるように、ペプチドまたはポリペプチド、すなわち本発明に係るＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントを目的のタンパク質に融合させるための方法は、よく知られている。

【0287】

一実施形態では、蛍光発生ＨＢＲ類縁体は、約０．１μＭ～約５０μＭ、好ましくは約１μＭ～約２５μＭの範囲、より好ましくは約１μＭ～約１５μＭの範囲の濃度でサンプルに添加される。

【0288】

本明細書中使用される場合、用語「相互作用」は、２つの目的の生体分子、好ましくは２つの目的のタンパク質が、互いに結合し、その結果蛍光発生ＨＢＲ類縁体を結合できる機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントを形成するように、本発明の相補体化系の２つのＰＹＰフラグメントまたはそのトランケートされたフラグメントに十分に近いことを意味する。

【0289】

一実施形態では、相互作用は、２つの目的の生体分子、好ましくは２つの目的のタンパク質の互いの直接の結合により媒介される。

【0290】

一実施形態では、相互作用は、間接的であり、すなわち、少なくとも１つの他の生体分子への、２つの目的の生体分子、好ましくは２つの目的のタンパク質の結合により媒介される。

【0291】

２つの目的の生体分子、好ましくは２つの目的のタンパク質の相互作用を誘導し得る生体分子の例としては、限定するものではないが、陽イオン、陰イオン、ペプチド、代謝物、二次的なメッセンジャー、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびタンパク質が挙げられる。

【0292】

よって、一実施形態では、本発明の方法は、
本明細書中上述されるＰＹＰの第１のフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを第１の目的の生体分子に付着させるステップと、
本明細書中上述されるＰＹＰの第２のフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを第２の目的の生体分子に付着させるステップと、
上記サンプルを本明細書中上述される蛍光発生ＨＢＲ類縁体と接触させるステップと、
２つの目的の生体分子の相互作用の生体分子による誘導時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を検出するステップ、
を含み、
それにより２つの目的の生体分子の相互作用の生体分子による誘導時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合を介して、サンプルに存在する２つの目的の生体分子の相互作用を検出する。

【0293】

一実施形態では、相互作用は、一過性である。

【0294】

一実施形態では、本発明の方法は、２つの目的の生体分子の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光の変化を検出するステップを含む。

【0295】

一実施形態では、本発明の方法は、２つの目的の生体分子の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光の増大を検出するステップを含む。

【0296】

一実施形態では、本発明の方法は、２つの目的の生体分子間の相互作用の破壊からもたらされる、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントの分解時の蛍光発生ＨＢＲ類縁体の非結合からもたらされる蛍光の減少を検出するステップを含む。

【0297】

当業者は、サンプル中の蛍光を検出するために利用可能な技術に精通しており、サンプル、フルオロフォアの励起スペクトルおよび発光スペクトル、ならびに望ましい読み取りに応じて選択できる。

【0298】

このような技術としては、限定するものではないが、直接的な観察、蛍光分光法、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、および蛍光トモグラフィーが挙げられる。

【0299】

一実施形態では、本発明の方法は、サンプル中の目的の生体分子、好ましくは目的のタンパク質の間の相互作用を空間においてモニタリングするためのものである。

【0300】

たとえば、目的の生体分子、好ましくは目的のタンパク質の間の相互作用のサンプル中の局在は、
（ｉ）蛍光トモグラフィーまたは蛍光顕微鏡（レーザー走査型共焦点顕微鏡－およびスピニングディスクベースの共焦点顕微鏡、多光子顕微鏡、超解像顕微鏡を含む）などの、サンプルにおける蛍光発光の供給源の局在を決定することを可能にする蛍光検出技術を使用することにより、
（ｉｉ）目的の生体分子、好ましくは目的のタンパク質に、特定の細胞集団に、および／または細胞内区画に付着される本発明のＰＹＰフラグメントを標的化することにより、かつ／または
（ｉｉｉ）特に本明細書中上述される膜浸透性または膜非浸透性ＨＢＲ類縁体を使用することにより、サンプル中のＨＢＲ類縁体の拡散を制御することにより、
決定され得る。

【0301】

一実施形態では、本発明の方法は、蛍光強度を測定することにより、参照値と比較して相互作用する目的の生体分子の量を測定することをさらに可能にする。一実施形態では、上記参照値は、対照サンプル中の蛍光強度の値に対応する。一実施形態では、上記参照値は、同じサンプル中の異なる位置および／または時点での蛍光強度の値に対応する。

【0302】

一実施形態では、本発明の方法は、本明細書中上述されるサンプル中の、目的の生体分子、好ましくは目的のタンパク質の間の相互作用を経時的にモニタリングするためのものである。

【0303】

一実施形態では、本発明の方法は、本明細書中上述されるサンプル中の、目的の生体分子、好ましくは目的のタンパク質の間の相互作用を時間および／または空間にわたりモニタリングするためのものである。

【0304】

また本発明は、サンプル中の新規のタンパク質間相互作用を同定するためのスクリーニング方法であって、
本明細書中上述されるＰＹＰの第１のフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを第１のタンパク質に融合すること、それにより第１のＰＹＰフラグメントで第１のタンパク質をタグ付けするステップと、
本明細書中上述されるＰＹＰの第２のフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントを第２のタンパク質に融合すること、それにより第２のＰＹＰフラグメントで第２のタンパク質をタグ付けするステップと、
上記サンプルを本明細書中上述される蛍光発生ＨＢＲ類縁体と接触させるステップと、
２つのタンパク質の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を検出するステップ、
を含み、
それにより２つのタンパク質の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合を介して、サンプルに存在する２つのタンパク質間の新規のタンパク質間相互作用を同定する、方法に関する。

【0305】

一実施形態では、本発明の方法は、目的のタンパク質と上記目的のタンパク質と相互作用し得るタンパク質候補の間の新規のタンパク質間相互作用をスクリーニングするためのものである。

【0306】

一実施形態では、本発明の方法は、本明細書中上述される生体分子により誘導されるタンパク質間相互作用をスクリーニングするためのものであり、上記生体分子の例としては、限定するものではないが、陽イオン、陰イオン、ペプチド、代謝物、二次的なメッセンジャー、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびタンパク質が挙げられる。

【0307】

また本発明は、サンプル中の２つのタンパク質間の相互作用の検出に依存するアッセイであって、
本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントでタグ付けされた、第１のタグ付けされたタンパク質を得るステップと、
本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントでタグ付けされた、第２のタグ付けされたタンパク質を得るステップと、
上記サンプルを蛍光発生ＨＢＲ類縁体と接触させるステップと、
２つのタグ付けされたタンパク質の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を検出するステップ、
を含み、
それにより２つのタグ付けされたタンパク質の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合を介して、サンプルに存在する２つのタグ付けされたタンパク質の相互作用を検出する、アッセイに関する。

【0308】

一実施形態では、２つのタンパク質は、レポータータンパク質である。

【0309】

一実施形態では、本発明のアッセイは、タンパク質間相互作用を安定化または阻害する目的の分子の能力を評価するためのものである。

【0310】

よって、一実施形態では、本発明のアッセイは、
サンプルを目的の分子と接触させるステップと、
上記目的の分子の存在下での２つのタンパク質の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を検出するステップと、
目的の分子の非存在下および存在下で検出される２つのタンパク質の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を比較するステップ
を含み、
それにより２つのタンパク質の相互作用に及ぼす上記目的の分子の作用を評価する。

【0311】

一実施形態では、目的の分子の非存在下で検出される蛍光と比較した、目的の分子の存在下で検出される蛍光の減少は、目的の分子による２つのタンパク質の相互作用の阻害または不安定化を表す。

【0312】

一実施形態では、目的の分子の非存在下で検出される蛍光と比較した、目的の分子の存在下で検出される蛍光の増大は、目的の分子による２つのタンパク質の相互作用の誘導または安定化を表す。

【0313】

一実施形態では、「蛍光の減少または増大」は、蛍光強度の減少または増大を表す。

【0314】

一実施形態では、本発明のアッセイは、目的のシグナリング経路の活性化または不活性化に依存する２つのタンパク質の相互作用を用いて、目的のシグナリング経路を評価するためのものである。

【0315】

一実施形態では、本発明のアッセイは、シグナリング経路の活性化を検出するためのものである。よって、一実施形態では、２つのタンパク質の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光の変化の検出は、目的のシグナリング経路の活性化を表す。

【0316】

一実施形態では、本発明のアッセイは、シグナリング経路の不活性化を検出するためのものである。よって、一実施形態では、２つのタンパク質の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光の変化の検出は、目的のシグナリング経路の不活性化を表す。

【0317】

一実施形態では、「蛍光の変化」は、蛍光強度の減少または増加を意味する。

【0318】

一実施形態では、本発明のアッセイは、シグナリング経路の調節を検出するためのものである。一実施形態では、本発明のアッセイは、目的のシグナリング経路を調節する目的の分子の能力を評価するためのものである。一実施形態では、本発明のアッセイは、目的のシグナリングアッセイを活性化または不活性化する目的の分子の能力を評価するためのものである。

【0319】

よって、一実施形態では、本発明のアッセイは、
サンプルを目的の分子と接触させるステップと、
上記目的の分子の存在下での２つのタンパク質の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を検出するステップと、
目的の分子の非存在下および存在下で検出された２つのタンパク質の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を比較するステップ、
を含み、
それにより２つのタンパク質の相互作用に依存する目的のシグナリング経路に及ぼす上記目的の分子の作用を評価する。

【0320】

本発明はまた、細胞または細胞集団における２つのタンパク質間の相互作用の検出に依存するアッセイであって、
細胞または細胞集団中で、本明細書中上述される第１のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントでタグ付けされた第１のタグ付けされたタンパク質を発現させるステップと、
細胞または細胞集団中で、本明細書中上述される第２のＰＹＰフラグメントまたは本明細書中上述されるそのトランケートされたフラグメントでタグ付けされた第２のタグ付けされたタンパク質を発現させるステップと、
上記細胞または細胞集団を蛍光発生ＨＢＲ類縁体と接触させるステップと、
細胞または細胞集団中で２つのタグ付けされたタンパク質の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を検出するステップ、
を含み、
それにより２つのタグ付けされたタンパク質の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合を介して、細胞または細胞集団に存在する２つのタグ付けされたタンパク質の相互作用を検出する、アッセイに関する。

【0321】

一実施形態では、本発明のアッセイは、目的の分析物の細胞または細胞集団中の存在に依存する２つのタンパク質の相互作用を用いて、細胞または細胞集団中の目的の分析物の存在を評価するためのものである。

【0322】

よって、一実施形態では、細胞または細胞集団中の２つのタンパク質の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を検出することは、細胞または細胞集団中の目的の分析物の存在を表す。

【0323】

一実施形態では、本発明のアッセイは、細胞または細胞集団中のカルシウム濃度の変化を検出するためのものである。

【0324】

一実施形態では、本発明のアッセイは、細胞または細胞集団中の目的のシグナリング経路の活性化または不活性化に依存する２つのタンパク質の相互作用を用いて、細胞または細胞集団中の目的のシグナリング経路を評価するためのものである。

【0325】

よって、一実施形態では、細胞または細胞集団中の２つのタンパク質の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を検出することは、細胞または細胞集団中の目的のシグナリング経路の活性化または不活性化を表す。

【0326】

一実施形態では、本発明のアッセイは、細胞または細胞集団中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼの調節を検出するためのものである。

【0327】

一実施形態では、本発明のアッセイは、細胞または細胞集団の目的の生理的な機構に依存する２つのタンパク質の相互作用を用いて、細胞または細胞集団の目的の生理的機構を評価するためのものである。

【0328】

よって、一実施形態では、細胞または細胞集団中の２つのタンパク質の相互作用時に再構成される、機能的なＰＹＰまたはその機能的なトランケートされたフラグメントへの蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合からもたらされる蛍光を検出することは、細胞または細胞集団の目的の生理的機構の活性化または不活性化を表す。

【0329】

一実施形態では、本発明のアッセイは、たとえば細胞または細胞集団中のカスパーゼ－３の活性化の検出を介して、細胞または細胞集団中のアポトーシスを検出するためのものである。

【図面の簡単な説明】

【0330】

【図1】図１Ａ～Ｂは、本発明の蛍光相補体化系の作用の原理（図１Ａ）および設計（図１Ｂ）の概略図である。ＮおよびＣは、それぞれ、相互作用でき、よってフルオロゲンを可逆的に結合しその蛍光をオンにできる機能的なＰＹＰを再構成できる、本発明に係る第１および第２のＰＹＰフラグメントを表す；ＸおよびＹは、潜在的に相互作用する目的のタンパク質を表し、それにＰＹＰフラグメントが融合される。ＦＡＳＴは、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＰＹＰに対応する。ＮＦＡＳＴは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなる本発明に係る第１のＰＹＰフラグメントに対応する。ＣＦＡＳＴ１１は、配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなる本発明に係る第２のＰＹＰフラグメントに対応する。ＣＦＡＳＴ１０は、配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなる本発明に係る第２のＰＹＰフラグメントに対応する。Ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴは、再構成された機能的なＰＹＰ、すなわち、２つのＦＡＳＴフラグメント、ＮＦＡＳＴとＣＦＡＳＴ１１またはＣＦＡＳＴ１０のいずれかの相補体化からもたらされる、ＦＡＳＴに対応する。

【図2】図２Ａ～Ｃは、ＦＡＳＴまたはｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴのいずれかと、蛍光発生ＨＢＲ類縁体とから形成される複合体：ＦＡＳＴ：ＨＭＢＲ（図２Ａ）、ｓｐｌｉｔＦＡＳＴ１１：ＨＭＢＲ（図２Ｂ）、およびｓｐｌｉｔＦＡＳＴ１０：ＨＭＢＲ（図２Ｃ）の正規化された励起スペクトルおよび発光スペクトルを示すグラフのセットである。ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ１１は、ＮＦＡＳＴとＣＦＡＳＴ１１の相補体化に由来し；ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ１は、ＮＦＡＳＴとＣＦＡＳＴ１０の相補体化に由来する。

【図3】図３Ａ～Ｄは、蛍光発生ＨＢＲ類縁体の非存在下または存在下で示された融合タンパク質：ＨＭＢＲ：Ｅ３－ＣＦＡＳＴ（６５－１２５）＋ＮＦＡＳＴ（１－６４）－Ｋ３（図３Ａ）、Ｅ３－ＣＦＡＳＴ（１１５－１２５）＋ＮＦＡＳＴ（１－１１４）－Ｋ３（図３Ｂ）、Ｋ３－ＮＦＡＳＴ（１－６４）＋ＣＦＡＳＴ（６５－１２５）－Ｅ３（図３Ｃ）、およびＫ３－ＮＦＡＳＴ（１－１１４）＋ＣＦＡＳＴ（１１５－１２５）－Ｅ３（図３Ｄ）を発現する大腸菌細胞のフローサイトメトリー分析を示すグラフのセットである。Ｋ３およびＥ３は、高親和性で相互作用する２つのタンパク質である。

【図4】図４Ａ～Ｄは、使用されるＣ末端側のフラグメントＣＦＡＳＴｎ（ｎ＝１１、１０、または９）およびＮ末端側のフラグメントの機能において示された異なる蛍光発生ＨＢＲ類縁体（図４Ａ：ＨＭＢＲ、図４Ｂ：ＨＢＲ－３，５ＤＭ、図４Ｃ：ＨＢＲ－３ＯＭ、および図４Ｄ：ＨＢＲ－３，５ＤＯＭ）での様々なｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの相対的な細胞内（ｉｎ－ｃｅｌｌ）輝度を示すヒストグラムのセットである。ｉＦＡＳＴ標識は、ｉＦＡＳＴ由来のＮＦＡＳＴ（すなわち、配列番号３０に記載のバリンの代わりに１０７位にイソロイシンを有するアミノ酸配列ＮＦＡＳＴからなる本発明に係る第１のＰＹＰフラグメント）が使用される場合を表す。存在しない場合、ＦＡＳＴ由来のＮＦＡＳＴ（すなわち、配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなる本発明に係る第１のＰＹＰフラグメント）が使用された。ＣＦＡＳＴ１１、ＣＦＡＳＴ１０およびＣＦＡＳＴ９は、それぞれ、配列番号３４、配列番号４２、および配列番号４３に記載のアミノ酸配列からなる本発明に係る第２のＰＹＰフラグメントに対応する。ＮＦＡＳＴフラグメントは、ＦＲＢに融合され、ＣＦＡＳＴフラグメントは、ＦＫＢＰに融合された。相補体化は、ラパマイシンの添加により誘導された。Ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの蛍光は、同時発現した蛍光タンパク質の蛍光を使用して発現レベルにより正規化された。

【図5-1】図５Ａ～Ｇは、本発明の相補体化系でのラパマイシン誘導性ＦＲＢ－ＦＫＢＰ二量体形成の検出を示す。図５Ａ～Ｂは、５μＭのＨＭＢＲ（図５Ａ）または１０μＭのＨＢＲ－３，５ＤＯＭ（図５Ｂ）で標識し、１００ｎＭのラパマイシンの添加の前後にイメージングしたＦＫＢＰ－ＮＦＡＳＴおよびＦＲＢ－ＣＦＡＳＴｎ（ｎ＝１０または１１）を共発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示す。スケールバー １０μＭ。図５Ｃは、ＦＫＢＰ－ＦＲＢの結合の後の蛍光倍数の増加を示す（平均値±ｓｅｍ、ｎ＝８４、８３、１０７、１１２個の細胞、それぞれ３～４回の実験に由来）。図５Ｄは、ＦＫＢＰ－ＮＦＡＳＴおよびＦＲＢ－ＣＦＡＳＴ１１を共発現するＨＭＢＲで処置した細胞中のラパマイシン添加後の蛍光強度の経時的な展開（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を示す（ｎ＝１１個の細胞）。図５Ｅは、共焦点顕微鏡によるイメージング時のＦＡＳＴ、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ１１（ＮＦＡＳＴおよびＣＦＡＳＴ１１の相補体化からもたらされる）およびｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ１０（ＮＦＡＳＴおよびＣＦＡＳＴ１０の相補体化からもたらされる）を発現するＨＭＢＲで標識したＨＥＫ２９３細胞の細胞蛍光の展開を示す。ＦＲＢ－ＮＦＡＳＴおよびＦＫＢＰ－ＣＦＡＳＴｎ（ｎ＝１０または１１）を発現する細胞を、ラパマイシンで処置して、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ１１およびｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ１０を形成した。ＦＡＳＴを発現する細胞を、対照として使用した。ＨＭＢＲの濃度は、１０μＭであった。４８８ｎｍ、６．３ｋＷ／ｃｍ^２での励起。条件あたり６個の細胞を分析した。図５Ｆは、１００ｎＭのラパマイシンの添加時の（５μＭのＨＭＢＲで標識した）ＦＫＢＰ－ＮＦＡＳＴおよびＦＲＢ－ＣＦＡＳＴｎ（ｎ＝１０または１１）を共発現する代表的なＨＥＫ２９３細胞の選択された低速度撮影のフレームを示す。図５Ｇは、１００ｎＭのラパマイシンの添加時の（１０μＭのＨＢＲ－３，５ＤＯＭで標識した）ＦＫＢＰ－ＮＦＡＳＴおよびＦＲＢ－ＣＦＡＳＴ１１を共時発現する代表的なＨＥＫ２９３細胞の選択されたフレームを示す。スケールバー ２０μＭ。

【図5-2】同上。

【図6-1】図６Ａ～Ｆは、本発明の相補体化系でのＡＰ１５１０誘導性ＦＫＢＰホモダイマーのラパマイシン誘導性の解離の検出を示す。図６Ａ～Ｂは、５μＭのＨＭＢＲ（図６Ａ）または１０μＭのＨＢＲ－３，５ＤＯＭ（図６Ｂ）で標識し１μＭのラパマイシンの添加の前後にイメージングした、ＦＫＢＰ－ＮＦＡＳＴおよびＦＫＢＰ－ＣＦＡＳＴｎ（ｎ＝１０または１１）を共発現するＡＰ１５１０で処置したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示す。スケールバー １０μＭ。図６Ｃは、ＦＫＢＰ－ＦＫＢＰの解離時の蛍光倍数の減少を示す（平均値±ｓｅｍ、ｎ＝１４２、１７５、２１９、１２５個の細胞、それぞれ３～４回の実験由来）。図６Ｄは、ＦＫＢＰ－ＮＦＡＳＴおよびＦＫＢＰ－ＣＦＡＳＴ１１を共発現するＨＭＢＲで標識し、ＡＰ１５１０で処置した細胞（ｎ＝８個の細胞）中のラパマイシン添加後の蛍光強度の経時的な展開を示す。図６Ｅは、１μＭのラパマイシンの添加時のＦＫＢＰ－ＮＦＡＳＴおよびＦＫＢＰ－ＣＦＡＳＴｎ（ｎ＝１０または１１）を共発現するＡＰ１５１０で処置した代表的なＨＥＫ２９３細胞（５μＭのＨＭＢＲで標識した）の選択された低速度撮影のフレームを示す。図６Ｆは、１μＭのラパマイシンの添加時のＦＫＢＰ－ＮＦＡＳＴおよびＦＫＢＰ－ＣＦＡＳＴ１１を共発現するＡＰ１５１０で処置した代表的なＨＥＫ２９３細胞（１０μＭのＨＢＲ－３，５ＤＯＭで標識した）の選択された低速度撮影のフレームを示す。スケールバー ２０μＭ。

【図6-2】同上。

【図7-1】図７Ａ～Ｄは、本発明の相補体化系でのＦＫＢＰ－ＦＫＢＰホモダイマーの二量体形成および上記ＦＫＢＰ－ＦＫＢＰホモダイマーの解離の検出を示す。図７Ａは、最初に１００ｎＭのＡＰ１５１０で１６０分間処置し、次にＡＰ１５１０を除去し、１μＭのラパマイシンを添加した、ＦＫＢＰ－ＮＦＡＳＴおよびＦＫＢＰ－ＣＦＡＳＴｎ（ｎ＝１１または１０）を共発現するＨＭＢＲで標識した細胞を示す。選択したフレームが示される。スケールバー：３０μＭ。図７Ｂは、ＡＰ１５１０、次にラパマイシンでのＦＫＢＰ－ＮＦＡＳＴおよびＦＫＢＰ－ＣＦＡＳＴ１１を共発現するＨＭＢＲで標識した細胞（ｎ＝８個の細胞）の順次の処置時の蛍光強度の経時的な展開を示す。図７Ｃ～Ｄは、最初に１００ｎＭのＡＰ１５１０で１６０分間（結合期）、次にＡＰ１５１０を除去し、１μＭのラパマイシンを添加した（解離期）、ＦＫＢＰ－ＮＦＡＳＴおよびＦＫＢＰ－ＣＦＡＳＴｎ（ｎ＝１１（図７Ｃ）またはｎ＝１０（図７Ｄ））を共発現するＨＭＢＲで標識した細胞を示す。選択したフレームが示される。スケールバー ３０μＭ。

【図7-2】同上。

【図8】図８Ａ～Ｂは、本発明の相補体化系での膜タンパク質と細胞質タンパク質の間の相互作用の検出を示す。図８Ａは、５μＭのＨＭＢＲで標識し、１００ｎＭのラパマイシンの添加の前後にイメージングした、Ｌｙｎ１１－ＦＲＢ－ＮＦＡＳＴおよびＦＫＢＰ－ＣＦＡＳＴｎ（ｎ＝１０または１１）を共発現するＨＥＫ２９３細胞を示す。スケールバー １０μＭ。図８Ｂは、Ｌｙｎ１１－ＦＲＢ－ＮＦＡＳＴおよびＦＫＢＰ－ＣＦＡＳＴ１１を共発現するＨＭＢＲで処置した細胞中のラパマイシン添加後の蛍光強度の経時的な展開を示す。

【図9-1】図９Ａ～Ｄは、Ｋ Ｒａｓ／Ｒａｆ１（図９Ａ）、ＭＥＫ１／ＥＲＫ２（図９Ｂ）とＥＲＫ２／ＭＫＰ１（図９Ｃ）の相互作用をイメージングするためのｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの使用を示す画像のセットである。示されたコンストラクトを共発現する細胞の代表的な画像は、１０μＭのＨＭＢＲの存在下でイメージングされた。スケールバー ２０μＭ。図９Ｄは、Ｋ－Ｒａｓ／Ｒａｆ１、ＭＥＫ１／ＥＲＫ２、およびＥＲＫ２／ＭＫＰ１の相互作用をイメージングするためのｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの使用に関連する対照を示す。示されたコンストラクトを共発現する代表的な細胞は、１０μＭのＨＭＢＲの存在下でイメージングされた。陽性対照および陰性対照が示される。スケールバー １０μＭ。Ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴは、再構成された機能的なＰＹＰ、すなわち、２つのフラグメント、ＮＦＡＳＴおよびＣＦＡＳＴ１０の相補体化からもたらされるＦＡＳＴに対応する。

【図9-2】同上。

【図10】図１０Ａ～Ｂは、ＥＧＦで刺激時のＭＥＫ１／ＥＲＫ２の相互作用の展開をイメージングするためのｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの使用を示す。ＭＥＫ１ ＮＦＡＳＴおよびｍＣｈｅｒｒｙ－ＥＲＫ２－ＣＦＡＳＴ１０を共発現するＨＭＢＲで標識したＨｅｌａ細胞を、ＥＧＦでの刺激の後にイメージングした。図１０Ａは、実験の設計を表す。ＮおよびＣは、それぞれ、相互作用でき、よってフルオロゲンを可逆的に結合しその蛍光をオンにできる機能的なＰＹＰを再構成できる、本発明に係る第１および第２のＰＹＰフラグメントを表す。図１０Ｂは、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの蛍光、細胞質のｍＣｈｅｒｒｙの蛍光、および核のｍＣｈｅｒｒｙの蛍光の強度（平均値±ｓｅｍ、ｎ＝６個の細胞、５回の実験）の経時的な展開を示す。データは、参照としてｍＣｈｅｒｒｙ－ＥＲＫ２－ＣＦＡＳＴ１０の核の移入の開始を使用して同期された。

【図11】図１１Ａ～Ｂは、カルモジュリン（ＣａＭ）およびＣａ^２＋－ＣａＭと相互作用するペプチドＭ１３のＣａ^２＋依存的相互作用のイメージングのためのｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの使用を示す。図１１Ａは、実験設計を表す。ＮおよびＣは、相互作用でき、よってフルオロゲンを可逆的に結合しその蛍光をオンにできる機能的なＰＹＰを再構成できる、本発明に係る第１および第２のＰＹＰフラグメント（それぞれＮＦＡＳＴおよびＣＦＡＳＴ１０）を表す。センサーは、Ｍ１３－ＮＦＡＳＴおよびＣＦＡＳＴ１０－ＣａＭから構成される。図１１Ｂは、ヒスタミンで処置した（ヒスタミンの添加は矢印により示される）代表的なＨＭＢＲで処置したＨｅＬａ細胞（ｎ＝２つの実験からの１４個の細胞）の細胞内蛍光強度の経時的な展開を示す。

【図12】図１２Ａ～Ｂは、カスパーゼ－３の活性を検出するためのｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの使用を示す。図１２Ａは、実験設計を表す。ＮおよびＣは、相互作用でき、よってフルオロゲンを可逆的に結合しその蛍光をオンにできる機能的なＰＹＰを再構成できる、本発明に係る第１および第２のＰＹＰフラグメント（それぞれＮＦＡＳＴおよびＣＦＡＳＴ１０）を表す。センサーは、ｂＦｏｓ－ＣＦＡＳＴ１１およびｂＪｕｎ－ＮＦＡＳＴ－ＮＬＳ３－ＤＥＶＤＧ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＮＥＳからなる。図１２Ｂは、ＨＭＢＲで処置した細胞（ｎ＝９個の細胞）中のスタウロスポリンでの処置後の核のｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの蛍光強度の経時的な展開を示す。

【図13-1】図１３Ａ～Ｉは、ＦＲＢおよびＦＫＢＰのラパマイシン誘導性二量体形成を検出するためのＦＡＳＴのＰＹＰフラグメントまたはＦＡＳＴのオルソログを含む相補体化系の使用を示すグラフの組み合わせである。本発明に係る異なる相補体化系のＮ末端側のＰＹＰフラグメント（すなわち本発明の第１のＰＹＰフラグメント）に融合されたＦＲＢおよびＣ末端側のＰＹＰフラグメント（すなわち本発明の第２のＰＹＰフラグメント）に融合されたＦＫＢＰを発現するヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を、以下の濃度：０、１、５、１０、２５、５０μＭのフルオロゲンＨＭＢＲとインキュベートした。細胞の蛍光を、フローサイトメトリーにより５００ｎＭのラパマイシンの非存在下および存在下で分析した。これらのグラフは、ラパマイシンの存在下および非存在下にて表記のＨＭＢＲ濃度で、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ（ＣＦＡＳＴ１１を含む）（図１３Ａ）、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ（ＣＦＡＳＴ１０を含む）（図１３Ｂ）、ｓｐｌｉｔ－ｉＦＡＳＴ（図１３Ｃ）、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ ＬＣ１ ＰＹＰ由来のＯ_１－ｓｐｌｉｔＦＡＳＴ（図１３Ｄ）、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ種 ＧＦＡＪ－１ ＰＹＰ由来のＯ_２ ｓｐｌｉｔＦＡＳＴ（図１３Ｅ）、Ｒｈｅｉｎｈｅｉｍｅｒａ種 Ａ１３Ｌ ＰＹＰ由来のＯ_３－ｓｐｌｉｔＦＡＳＴ（図１３Ｆ）、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ ＰＹＰ由来のＯ４－ｓｐｌｉｔＦＡＳ（図１３Ｇ）、Ｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ ｓｉｂｉｒｉｃａ ＡＴＣＣ ７００５８８ ＰＹＰ由来のＯ_５－ｓｐｌｉｔＦＡＳＴ（図１３Ｈ）、およびＲｈｏｄｏｔｈａｌａｓｓｉｕｍ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ ＰＹＰ由来のＯ_６－ｓｐｌｉｔＦＡＳＴの平均蛍光を示す。

【図13-2】同上。

【図13-3】同上。

【実施例】

【0331】

本発明をさらに、以下の実施例により示す。

【0332】

材料および方法
クローニングに使用した合成オリゴヌクレオチドを、Ｓｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈまたはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。この試験で使用したオリゴヌクレオチドの配列を、表１に提供する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、提供されたバッファー中でＱ５ポリメラーゼにより行った。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。制限酵素の消化の産物を、調製ゲル電気泳動（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈまたはｅｓｉｓ）、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４リガーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、Ｔａｑリガーゼ、およびＴａｑエキソヌクレアーゼを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入し、製造社のプロトコルによりそれらに付随するバッファーと共に使用した。等温アセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ）を、Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｔｈ． ６， ３４３－３４５ （２００９）により調製された手製の混合物を使用して行った。プラスミドＤＮＡの小規模の単離を、２ｍＬの一晩の培養物からＱＩＡｐｒｅｐ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。プラスミドＤＮＡの大規模な分離を、１５０ｍＬの一晩の培養物からＱＩＡｐｒｅｐ ｍａｘｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。全てのプラスミド配列を、適切なシーケンシングプライマー（ＧＡＴＣ－Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてサンガーシーケンシングにより確認した。表２は、この試験で使用したプラスミドを列挙する。ＣＦＡＳＴ１１－８に対応するペプチドを、９８％の純度でＣｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、Ｎ末端およびＣ末端でアセチル化およびアミド化した。ラパマイシンを、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、３ｍＭの濃度へとＤＭＳＯに溶解した。ＡＰ１５１０を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入し、０．５ｍＭの濃度へとエタールに溶解した。ヒト組み換えＥＧＦを、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、１００μｇ／ｍＬの濃度への０．１％のＢＳＡに溶解した。スタウロスポリンを、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、１ｍＭの濃度へとエタノールに溶解した。ＨＭＢＲ（４－ヒドロキシ－３－メチルベンジリデンロダニン）およびＨＢＲ－３，５ＤＯＭ（４－ヒドロキシ－３，５－ジメトキシベンジリデン ロダニン）は、参照名^ＴＦＬｉｍｅおよび^ＴＦＣｏｒａｌ（ｔｈｅｔｗｉｎｋｌｅｆａｃｔｏｒｙ．ｃｏｍ）の下でＴｈｅ Ｔｗｉｎｋｌｅ Ｆａｃｔｏｒｙにより提供された。

【0333】

【表1】

【0334】

【表2】

【0335】

分子のクローニング
細菌の発現プラスミド
プラスミドｐＡＧ２０９を、制限酵素Ｎｈｅ ＩおよびＸｈｏ Ｉを使用して、ＮＦＡＳＴをコードする遺伝子（プライマーａｇ１２６およびａｇ２１６を使用して増幅）をプラスミドｐＥＴ２８ａに挿入することにより得た。

【0336】

哺乳類での発現のためのＦＲＢ－ＦＫＢＰ融合タンパク質
全般的に、融合タンパク質は、ＰＣＲアセンブリにより構築され、２つのタンパク質の間に１１アミノ酸のリンカー、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４５）を含む。プラスミドｐＡＧ１４８を、ＦＲＢ－ＮＦＡＳＴをコードする遺伝子（ＦＲＢ－ＮＦＡＳＴをコードする配列は、プライマーａｇ１８１／ａｇ１８２およびａｇ１７５／ａｇ１７６で増幅したｍＴＯＲのＦＫＢＰ－ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）およびＮＦＡＳＴをコードする配列から、ＰＣＲによりアセンブリされた）をプラスミドｐＡＧ１０４２中に、制限酵素Ｂｇｌ ＩＩおよびＮｏｔ Ｉを使用して挿入することによりアセンブリした。プラスミドｐＡＧ１４９を、ＦＫＢＰ－ＮＦＡＳＴをコードする遺伝子（ＦＫＢＰ－ＮＦＡＳＴをコードする配列は、プライマーａｇ１８３／ａｇ１８４およびａｇ１７５／ａｇ１７６で増幅したＦＫ５６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）およびＮＦＡＳＴをコードする配列からＰＣＲによりアセンブリされた）をプラスミドｐＡＧ１０４中に、制限酵素Ｂｇｌ ＩＩおよびＮｏｔ Ｉを使用して挿入することにより作製した。プラスミドｐＡＧ１５２を、ＦＲＢ－ＣＦＡＳＴ１１をコードする遺伝子（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにより合成された）をｐＡＧ１０４中に、制限酵素Ｂｇｌ ＩＩおよびＮｏｔ Ｉを使用して挿入することにより入手した。プラスミドｐＡＧ１５３を、ＦＫＢＰをコードする遺伝子（プライマーａｇ１８３およびａｇ１８４を使用して増幅された）をｐＡＧ１５２中に、制限酵素Ｂｇｌ ＩＩおよびＢｓｐＥ Ｉを使用して挿入することにより作製した。

【0337】

プラスミドｐＡＧ２４１を、プライマーａｇ３４５／ａｇ３１３およびａｇ３４７／ａｇ３１４でのプラスミドｐＡＧ１５３の増幅により得た２つのフラグメントのギブソンアセンブリにより構築した。プラスミドｐＡＧ３３６を、プライマーａｇ４６８／３１３およびａｇ４６９／３１４でのプラスミドｐＡＧ１４８の増幅により得た２つのフラグメントのギブソンアセンブリによりクローニングした。細胞におけるｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの光安定性を決定するために、ＦＲＢ－ＮＦＡＳＴ－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙをコードするプラスミドｐＡＧ４３９を、ｐＡＧ１０４（プライマーおよびａｇ３４７およびａｇ３１４を使用して増幅）のプラスミド骨格とアセンブリしたＦＲＢ－ＮＦＡＳＴ（プライマーａｇ３０８およびａｇ３１３でｐＡＧ１４８から増幅）およびｍＣｈｅｒｒｙ（ａｇ４１２およびａｇ５５０でｐＡＧ９６２から増幅）の配列のギブソンアセンブリにより作製した。ＦＫＢＰ－ＣＦＡＳＴ１０－ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙをコードする配列を、プラスミドｐＡＧ２４１（ａｇ７００およびａｇ３１３を使用して増幅）、ｍＣｈｅｒｒｙ（ａｇ７０１およびａｇ３１４を使用して増幅）、およびプラスミドｐＩＲＥＳから（プライマーａｇ６９４およびａｇ６９５を使用して）増幅したＩＲＥＳ配列から、ギブソンアセンブリを介してクローニングした。ＦＲＢ－ＮＦＡＳＴ－ＩＲＥＳ－ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２をコードするプラスミドｐＡＧ４９０を、プラスミドｐＡＧ１４８（ａｇ６９７およびａｇ３１３を使用して増幅）、プラスミドｐＩＲＥＳから（ａｇ６９４およびａｇ６９５を使用して）増幅したＩＲＥＳ配列、およびｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２をコードするｇ－ｂｌｏｃｋ（ＩＤＴ）からクローニングした。ｌｙｎ１１－ＦＲＢ－ＮＦＡＳＴ－ＩＲＥＳ－ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２をコードするプラスミドｐＡＧ４９１を、プラスミドｐＡＧ３３６（ａｇ６９７およびａｇ３１３を使用して増幅）、プラスミドｐＩＲＥＳから（ａｇ６９４およびａｇ６９５を使用して）増幅したＩＲＥＳ配列、およびｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２をコードするｇ－ｂｌｏｃｋ（ＩＤＴ）からクローニングした。

【0338】

シグナリング経路のプラスミド
ＮＦＡＳＴ－ＭＫＰ１コードする遺伝子（ＭＫＰ１ ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００４４１７．３）、ＮＦＡＳＴ－ＫＲａｓコードする遺伝子（Ｋ－Ｒａｓ ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００４９８５．４）、およびＣＦＡＳＴ１０－Ｒａｆ１－ｍＣｈｅｒｒｙコードする遺伝子（Ｒａｆ１ ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００１３５４６８９．１）は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ｇｅｎｏｍｉｃｓにより合成された。プラスミドｐＡＧ３０１、ｐＡＧ３４１およびｐＡＧ３４０を、ＮＦＡＳＴ－ＭＫＰ１（ａｇ３５７／ａｇ４１２を使用して増幅）、ＮＦＡＳＴ－ＫＲａｓ（ａｇ３５７／ａｇ４７５を使用して増幅）、およびＣＦＡＳＴ１０－Ｒａｆ１－ｍＣｈｅｒｒｙ（ａｇ４７４／ａｇ４１２を使用して増幅）、ならびにプライマーａｇ３１１／ａｇ３１４およびａｇ３５８／ａｇ３１３を使用して２つのフラグメントで増幅したｐＡＧ１０４の骨格の配列のギブソンアセンブリを介して作製した。ＭＥＫ１コードする遺伝子、ＥＲＫ２コードする遺伝子、およびｍＣｈｅｒｒｙをコードする遺伝子を、それぞれプライマーａｇ４１８／４１９、ａｇ４１６／４１７、およびａｇ４１４／４１５を使用して増幅し、ＮＦＡＳＴ（プライマー３７４／３１３で増幅）およびＣＦＡＳＴ１０（プライマー４１３／３１４で増幅）の対応するフラグメントでギブソンアセンブリを介してアセンブリして、それぞれＮＦＡＳＴ－ＭＥＫ１およびｍＣｈｅｒｒｙ－ＥＲＫ２－ＣＦＡＳＴ１０をコードするプラスミドｐＡＧ２９８およびｐＡＧ２９６を作製した。プラスミドｐＡＧ４９２、ｐＡＧ４９３、およびｐＡＧ４９４を、シグナリング経路のパートナーｐＡＧ２９８、ｐＡＧ３０１、ｐＡＧ３４１（プライマー６９７／３１３、６９６／３１４、６９９／３１３、６９８／３１３で増幅）をコードするプラスミド、ＩＲＥＳ配列（ａｇ６９４およびａｇ６９５を使用してプラスミドｐＩＲＥＳから増幅）、およびｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２をコードするｇ－ｂｌｏｃｋ（ＩＤＴ）からギブソンアセンブリにより構築した。

【0339】

センサーの作製
プラスミドｐＡＧ３３４を、コードされたＭ１３を伴うプライマーａｇ４５５／ａｇ４５６を使用してＮＦＡＳＴを増幅し、プライマーａｇ３１３／ａｇ３１４でｐＡＧ１４８の骨格を増幅することによるギブソンアセンブリによりプラスミドｐＡＧ１４８から作製した。プラスミドｐＡＧ３３５を、プライマーａｇ４６５およびａｇ４６６を使用するカルモジュリンの増幅によるギブソンアセンブリにより作製し、プライマーａｇ４６７およびａｇ３１３でＣＦＡＳＴ１０を増幅し、ａｇ３１１およびａｇ３１４で増幅したプラスミドとアセンブリすることによりプラスミドｐＡＧ１４４に挿入した。ｂＪｕｎ－ＮＦＡＳＴをコードする遺伝子（ｂＪｕｎ ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿０２１８３５．３）およびｂＦｏｓ－ＣＦＡＳＴ１１をコードする遺伝子（ｂＦｏｓ ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｍ３４００１．１）を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ｇｅｎｏｍｉｃｓにより合成した。プラスミドｐＡＧ３８４を、ｂＦｏｓ－ＣＦＡＳＴ１１をコードする遺伝子（プライマーａｇ５４１／５４２を使用して）、およびｐＡＧ１０４の骨格（プライマーａｇ３５８／ａｇ３１３およびａｇ３４７／３１４を使用して）の増幅によるギブソンアセンブリによりクローニングした。プラスミドｐＡＧ３８５を、プライマーａｇ５４３／５４４を使用してｂＪｕｎ－ＮＦＡＳＴをコードする遺伝子を増幅し、次に、ａｇ５４５／５４６で増幅したｍＣｈｅｒｒｙ、ＮＬＳｘ３のためのプライマーａｇ５３５、ならびにプライマーａｇ３５８／３１３およびａｇ５３９／ａｇ３１４を使用して増幅したｐＡＧ１０４の骨格とのギブソンアセンブリを行うことにより作製した。

【0340】

タンパク質の発現および精製
発現ベクターを、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌおよび Ｂｉｏｌａｂｓ）で形質転換した。細胞を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充したＬＢ培地において３７℃で、ＯＤ６００ｎｍ ０．６に増殖させた。発現を、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、１ｍＭの最終濃度に添加することにより、４時間誘導した。細胞を、遠心分離（４，０００×ｇ、４℃、２０分間）により回収し、凍結した。細胞のペレットを、溶解バッファー（リン酸塩バッファー５０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ２．５ｍＭ、プロテアーゼ阻害剤、ＤＮａｓｅ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、超音波処理した（２０分間、２０％の振幅、３秒間オン、１秒間オフ）。ライセートを、４℃で２時間インキュベートし、ＤＮａｓｅによりＤＮＡ消化させた。細胞フラグメントを、遠心分離（９２００×ｇ、４℃で１時間）により除去した。この上清を、１０ｍＭのイミダゾールを補充したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（リン酸ナトリウム５０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ｐＨ７．４）中でＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズと共にゆっくりと撹拌しながら４℃で一晩インキュベートした。ビーズを、２０ｍＭのイミダゾールを含む２０容量のＰＢＳ、および４０ｍＭのイミダゾールを補充した５容量のＰＢＳで洗浄した。ヒスタグ付けしたタンパク質を、０．５ｍＭのイミダゾールを補充した５容量のＰＢＳで溶出した。バッファーを、ＰＤ－１０脱塩カラムを使用してＰＢＳ（５０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に交換した。

【0341】

物理化学的な測定
定常状態のＵＶ－Ｖｉｓの吸収スペクトルを、Ｖｅｒｓａ２０ Ｐｅｌｔｉｅｒ－ｂａｓｅｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｕｖｅｔｔｅ ｃｈａｍｂｅｒ（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ）を搭載したＣａｒｙ ３００ ＵＶ－Ｖｉｓ分光計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して記録し、蛍光データを、ＴＬＣ５０ＴＭ Ｌｅｇａｃｙ／ＰＴＩ Ｐｅｌｔｉｅｒ－ｂａｓｅｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｕｖｅｔｔｅ ｃｈａｍｂｅｒ（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ）を搭載したＬＰＳ ２２０分光蛍光光度計（ＰＴＩ， Ｍｏｎｍｏｕｔｈ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ， ＮＪ）を使用して記録した。

【0342】

ＮＦＡＳＴ：ＣＦＡＳＴｎ（ｎ＝８～１１）の結合体（ｃｏｕｐｌｅｓ）の熱力学的な解離定数を、ＣＦＡＳＴｎ（ｎ＝８～１１）および組み換え技術により精製したＮＦＡＳＴのために合成したペプチドを使用して決定した。１０μＭのＨＭＢＲの存在下でのＮＦＡＳＴ：ＣＦＡＳＴ１１の親和性を、ＮＦＡＳＴの最低３つの異なる精製物から別々に決定した。ＮＦＡＳＴ：ＣＦＡＳＴ１１を次に、他のＮＦＡＳＴ－ＣＦＡＳＴの組み合わせの決定のための内部対照として並行して実験を行い、これらを全てＮＡＳＴの同じ調製で同日に行った。熱力学的な解離定数を、Ｓｐａｒｋ １０Ｍ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）で決定し、１部位に特異的な結合モデルにＰｒｉｓｍ ６で適合させた。

【0343】

哺乳類細胞の培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、フェノールレッド、Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ、および１０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、３７℃、５％のＣＯ２雰囲気で培養した。ＨｅＬａ細胞を、フェノールレッド、１×の非必須アミノ酸、１×のピルビン酸ナトリウム、および１０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充した変法イーグル培地（ＭＥＭ）中で、３７℃、５％のＣＯ２雰囲気で培養した。イメージングのため、細胞を、ポリ－Ｌ－リジンでコーティングしたμＤｉｓｈ ＩＢＩＤＩ（Ｂｉｏｖａｌｌｅｙ）に播種した。細胞を、イメージングの前に２４時間、製造社のプロトコルに従いＧｅｎｅｊｕｉｃｅ（Ｍｅｒｃｋ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して一時的にトランスフェクトした。

【0344】

蛍光顕微鏡
共焦点の顕微鏡写真を、Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ６３×／１．４ ＮＡ ｏｉｌ ＤＩＣ Ｍ２７液浸対物レンズ、温められた試料台、ならびに温度およびＣＯ２の制御のためのＸＬ－ＬＳＭ ７１０ Ｓ１インキュベーションチャンバーを搭載したＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅで取得した。画像を、Ｚｅｎソフトウェアを使用して獲得し、Ｆｉｊｉ（ＩｍａｇｅＪ）で処理した。

【0345】

ＨＭＢＲに関する光退色の測定を、４８８ｎｍの励起の１０μＭのフルオロゲンで行った（４．６ｋＷ／ｃｍ２、１．２７ μｓｅｃ ｐｉｘｅｌ ｄｗｅｌｌ）；ＦＡＳＴを、対照として使用した。サンプルを、第２の周波数あたり１つのフレームで、１００枚の画像で連続的にイメージングした。

【0346】

ＦＲＢとＦＫＢＰの間のラパマイシン介在性相互作用をイメージングするために、５μＭのＨＭＢＲまたは１０μＭのＨＢＲ－３，５ＤＯＭを補充したフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ中で細胞を、イメージングした。タイル画像（Ｔｉｌｅ ｉｍａｇｅ）を、ラパマイシン添加の前に撮影した。フルオロゲン含有ＤＭＥＭ中で調製したラパマイシンの溶液を、フルオロゲンの濃度を一定に維持するために添加して、１００ｎＭの最終的なラパマイシン濃度を得、画像を、毎分撮影した。最終的なタイル画像を、蛍光飽和の後に撮影した。

【0347】

ＡＰ１５１０が介在する相互作用をイメージングするために、ＡＰ１５１０を、イメージング前に２時間細胞に、１００ｎＭの最終濃度に添加した。細胞をすすぎ、培地を、５μＭのＨＭＢＲまたは１０μＭのＨＢＲ－３，５ＤＯＭを補充したフェノールレッドを含まないＤＭＥＭと交換した。タイル画像を、ラパマイシン添加前に撮影した。（フルオロゲンの濃度を一定に維持するためにフルオロゲンを補充したＤＭＥＭ中で調製した）ラパマイシンの溶液を添加し、１μＭの最終的なラパマイシン濃度を得、画像を３０秒ごとに撮影した。最終的なタイル画像を、蛍光の変化が止まった後に撮影した。

【0348】

同じサンプル中のＦＫＢＰ－ＦＫＢＰの結合および解離をイメージングするために、ｏｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に５μＭのＨＭＢＲを補充し、ＡＰ１５１０をイメージングの開始の直前に１００ｎＭの最終的な濃度に添加した。細胞を、実験期間にわたり３７℃および５％のＣＯ２で維持した。画像を、蛍光シグナルが飽和するまで５分ごとに撮影した。獲得を次いで休止し、サンプルを、１×ＤＰＢＳ（フルオロゲンの濃度を一定に維持するためにＨＭＢＲを補充した）で洗浄し、イメージング溶液を、交換した。獲得頻度を、１分あたり２つの画像に減らし、７～１０枚の画像を、獲得した後、ｏｐｔｉＭＥＭ（フルオロゲン濃度を一定に維持するためにＨＭＢＲを補充）中で調製したラパマイシンの溶液を添加して、１μＭの最終的なラパマイシンの濃度を得た。

【0349】

Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＥＲＫ経路における相互作用をイメージングするために、細胞を、トランスフェクションの後のイメージング前に２４時間、血清飢餓させた。細胞を、１０μＭのＨＭＢＲを補充したフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ中でイメージングした。経時変化の実験では、経路を、２００ｎｇ／ｍＬの最終的な濃度に添加された精製されたＥＧＦを使用して活性化した。

【0350】

カルシウムイメージングを、５μＭのＨＭＢＲを補充したＨＨＢＳＳ（ＨＥＰＥＳ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で行った。カルシウム振動を、ＨＨＢＳＳ（フルオロゲン濃度を一定に維持するためにＨＭＢＲを補充した）中の５０μＭのヒスタミンを使用して誘発し、画像を、５００ｍｓごとに獲得した。

【0351】

カスパーゼ活性をイメージングするために、細胞を、５μＭのＨＭＢＲを補充したｏｐｔｉＭＥＭ中で、３７℃にて、５％のＣＯ２でイメージングした、獲得開始の直前に、スタウロスポリンを、２μＭの最終濃度に添加した。画像を、３時間にわたり５分ごとに獲得した。

【0352】

複合体の細胞内輝度に及ぼすＣＦＡＳＴの長さの影響
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｉｂｉｄｉ μＤｉｓｈ顕微鏡ディッシュに播種し、イメージングの２４時間前に、ＣＭＶ－ＦＲＢ－ＮＦＡＳＴ（またはＮＦＡＳＴ（Ｖ１０７Ｉ））－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ（またはＥＧＦＰ））およびＣＭＶ－ＦＫＢＰ－ＣＦＡＳＴｎ（ｎ＝１１、１０、または９）をコードするプラスミドと共トランスフェクトした。細胞を、５００ｎＭのラパマイシンの添加の前後にイメージングした。

【0353】

大腸菌における分裂した部位の効率の評価
ｄｅ ｎｏｖｏで設計したペプチドＩＡＡＬ－Ｅ３およびＩＡＡＬ－Ｋ３は、７０ｎＭの親和性で構成的に相互作用する逆平行αヘリックスのコイルドコイルを形成する。相互作用する系を、大腸菌での同時発現のための２つのＴ７プロモーターによりバイシストロニックベクター中で発現した。ＩＡＡＬ－Ｅ３－ＣＦＡＳＴ（６５－１２５）－Ｔ７ｐ－ＮＦＡＳＴ（１－６４）－ＩＡＡＬ－Ｋ３、ＩＡＡＬ－Ｋ３＿ＮＦＡＳＴ（１－６４）－Ｔ７ｐ－ＣＦＡＳＴ（６５－１２５）－ＩＡＡＬ－Ｅ３、ＩＡＡＬ－Ｅ３－ＣＦＡＳＴ（１１５－１２５）－Ｔ７ｐ－ＮＦＡＳＴ（１－１１４）－ＩＡＡＬ－Ｋ３、ＩＡＡＬ－Ｋ３＿ＮＦＡＳＴ（１－１１４）－Ｔ７ｐ－ＣＦＡＳＴ（１１５－１２５）－ＩＡＡＬ－Ｅ３をコードする遺伝子を、購入し（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、制限酵素Ｎｃｏ ＩおよびＸｈｏ Ｉを使用してプラスミドｐＥＴ２８ａ中に挿入した。

【0354】

結果的に得られるプラスミドを、大腸菌のＢＬ２１ Ｒｏｓｅｔｔａ細胞中に形質転換した。一晩の前培養物を、５ｍＬの培養物中に使用し、それを次に、ＯＤ約０．６に増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧで２時間誘導した。１．５ｍＬの培養物をペレット化してから１Ｘ ＰＢＳ＋ＢＳＡ（１ｇ／Ｌ）で洗浄したものを用いて、サイトメトリーのサンプルを調製した。サンプルを次に、ＨＭＢＲを含む１．５ｍＬのＰＢＳ＋ＢＳＡに再懸濁し、５０，０００のイベントを、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ ｃ６血球計算器で分析した。

【0355】

実施例１：ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの蛍光相補体化系の形成
相補体化系のｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ（図１Ａ）を、様々なスペクトルの性質を呈する蛍光発生ヒドロキシベンジリデンロダニン（ＨＢＲ）類縁体を特異的かつ可逆的に結合する、１４ｋＤａの小さなタンパク質である、ＰＹＰに由来するＦＡＳＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｓｈｉｆｔｉｎｇ Ｔａｇ－アミノ酸配列 配列番号９）から設計した。蛍光発生ＨＢＲ類縁体は、溶液中では弱く蛍光するが、ＦＡＳＴの結合キャビティに固定された場合、強力に蛍光する。この設計は、アミノ酸１１４および１１５の間の２つのフラグメントでのＦＡＳＴの分裂に基づく（図１Ｂ）。２つのフラグメント１～１１４（本明細書中以下でＮＦＡＳＴと呼ばれる－配列番号２３）および１１５～１２５（本明細書中以下でＣＦＡＳＴ１１と呼ばれる－配列番号３４）は、ＨＭＢＲ（緑色－黄色の蛍光を提供する）またはＨＢＲ－３，５ＤＯＭ（橙色－赤色の蛍光を提供する）の存在下で中程度の親和性を示した。２つのフラグメントの見かけの親和性は、ＣＦＡＳＴ１１のＣ末端で残基を連続して除去することによりさらに減少され得、ＣＦＡＳＴ１０－配列番号４２；ＣＦＡＳＴ９－配列番号４３およびＣＦＡＳＴ８、配列番号４４をもたらす（表３）。

【0356】

【表3】

【0357】

図２に示されるように、（ＮＦＡＳＴおよびＣＦＡＳＴ１１（図２Ｂ）、ならびにＮＦＡＳＴおよびＣＦＡＳＴ１０（図２Ｃ）の相補体化からもたらされる）相補体化されたｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ：フルオロゲンアセンブリの励起スペクトルおよび発光スペクトルは、通常のＦＡＳＴ：フルオロゲン複合体のスペクトル（図２Ａ）と同一であった。

【0358】

図２の結果はよって、相補体化されると、本発明の相補体化系は、蛍光発生ＨＢＲ類縁体の結合、上記結合による蛍光の誘導、および光物理学的な性質の観点から、完全長のＦＡＳＴとして挙動することを示す。本発明の相補体化系はよって、機能的なＰＹＰ（たとえばｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ１１）またはその機能的なトランケートされたフラグメント（たとえばｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ１０）の再構成を可能にする。

【0359】

本発明の蛍光相補体化系の設計を、高い親和性で相互作用するタンパク質の対（すなわちＥ３およびＫ３）をＰＹＰ由来のＦＡＳＴの異なるフラグメントに融合した際に大腸菌細胞で得た蛍光強度を比較することにより、検証した（図３）。第１のＰＹＰフラグメント、すなわちＮＦＡＳＴを、Ｋ３に融合し、第２のＰＹＰフラグメント、すなわちＣＦＡＳＴを、Ｅ３に融合した。ＦＡＳＴは、アミノ酸１１４および１１５の間で２つのフラグメントに分裂され、結果的に得られるフラグメント ＦＡＳＴ１－１１４（すなわちＮＦＡＳＴ）およびＦＡＳＴ１１５－１２５（すなわちＣＦＡＳＴ１１）を、それぞれＫ３およびＥ３に融合した（ＮＦＡＳＴ－Ｋ３またはＫ３－ＮＦＡＳＴ、およびＥ３－ＣＦＡＳＴまたはＣＦＡＳＴ－Ｅ３のいずれか）。ＮＦＡＳＴ－Ｋ３およびＥ３－ＣＦＡＳＴ１１（図３Ｂ）またはＫ３－ＮＦＡＳＴおよびＣＦＡＳＴ１１－Ｅ３（図３Ｄ）のいずれかの組み合わせは、ＨＭＢＲを含まずに得られた蛍光強度と比較して、ＨＭＢＲの存在下での蛍光強度の増大をもたらした。対照的に、ＦＡＤＳＴをアミノ酸６４および６５の間で２つのフラグメントに分裂し、かつ結果的に得られたフラグメントＦＡＳＴ１－６４およびＦＡＳＴ６５－１２５をＫ３またはＥ３に融合した場合、このような増大は、試験した組み合わせのいずれでも観察されなかった（図３Ａおよび３Ｃ）。

【0360】

別のＮ末端のフラグメントをまた、ＦＡＳＴのバリアント（改善したＦＡＳＴまたはｉＦＡＳＴと呼ばれる－アミノ酸配列 配列番号１６）を使用して開発した（ここで１０７位のバリンが、イソロイシンで置き換えられている）。異なる蛍光発生ＨＢＲ類縁体を使用して、様々なｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの相対的な細胞内輝度を、評価した（図４）。

【0361】

図４に示されるように、試験した蛍光発生ＨＢＲ類縁体のいずれか：ＨＭＢＲ（図４Ａ）、ＨＢＲ－３，５ＤＭ（図４Ｂ）、ＨＢＲ－３ＯＭ（図４Ｃ）およびＨＢＲ－３，５ＤＯＭ（図４Ｄ）で、観察された蛍光は、ＣＦＡＳＴ１１で最も高く、ＣＦＡＳＴ１０でそれよりも低く、ＣＦＡＳＴ９で最も低かった。２つのフラグメント間の低い親和性（上記の表３を参照）は、低い細胞内輝度と一致する。

【0362】

図４に示されるように、ＮＦＡＳＴ（配列番号２３）およびＣＦＡＳＴを含む系で観察された蛍光は、対応するｉＦＡＳＴ（配列番号３０）およびＣＦＡＳＴのＮｔｅｒフラグメントを含む系で観察されるものと類似する。これらのデータはよって、本発明に係る相補体化系におけるｉＦＡＳＴの適合性を示している。

【0363】

実施例２：ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴは、動的かつ可逆的なタンパク質相互作用の特徴を可能にする。
哺乳類細胞（蛍光発生ＨＢＲ類縁体で前処置した）においてタンパク質相互作用を検出するためのｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの能力を試験するために、ＮＦＡＳＴおよびＣＦＡＳＴｎ（ｎ＝１０または１１）をＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）におよびｍＴＯＲのＦＫＢＰ－ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）に、それぞれ融合した。ＦＫＢＰおよびＦＲＢは、ラパマイシンの存在下で共に相互作用する。

【0364】

図５に示されるように、ラパマイシン誘導性ＦＲＢ－ＦＫＢＰ二量体形成は、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの相互作用に依存する相補体化に一致して、大規模な蛍光の増大をもたらした。ＨＭＢＲまたはＨＢＲ－３，５ＤＯＭのいずれかの使用は、同様の結果を提供し（図５Ａ～Ｃ）、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの色が添加されたフルオロゲンの性質を変えることにより調節され得ることを示す。

【0365】

ラパマイシン添加後の低速度撮影イメージングは、ＦＲＢ－ＦＫＢＰラパマイシン複合体の迅速な形成と一致して、数分以内に蛍光の飽和を示した（図５Ｄ、Ｆ、およびＧ）。これらの結果はよって、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴが、リアルタイムでタンパク質複合体の形成をモニタリングできることを示す。細胞中で、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ：フルオロゲンアセンブリ（ＣＦＡＳＴ１１またはＣＦＡＳＴ１０のいずれかを伴う）は、通常のＦＡＳＴ：フルオロゲンとして光安定性であることがさらに示された（図５Ｅ）。

【0366】

ＡＰ１５１０誘導性ＦＫＢＰホモダイマーを解離するラパマイシンの能力を使用して、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの可逆性を試験した。ＦＫＢＰ－ＮＦＡＳＴおよびＦＫＢＰ－ＣＦＡＳＴｎ（ｎ＝１０または１１）を共発現する細胞を、ＡＰ１５１０と２時間インキュベートして、ＦＫＢＰホモダイマーをあらかじめ形成し、ＨＭＢＲで処置した。ラパマイシンの添加は、ＦＫＢＰホモダイマーの解離と一致して、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ：フルオロゲンの蛍光の顕著な喪失をもたらした（図６Ａ～Ｃ）。これらの結果はよって、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ：フルオロゲンアセンブリが可逆性であることを示す。数分以内での蛍光の迅速な喪失が、ラパマイシン添加後に観察され、２つのタンパク質が解離した際のｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの迅速な分解を示す（図６Ｄ、Ｅ、およびＦ）。動的かつ可逆的なタンパク質の相互作用をイメージングするｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの能力は、単一の実験において、最初にＡＰ１５１０の添加後のＦＫＢＰ－ＮＦＡＳＴおよびＦＫＢＰ－ＣＦＡＳＴｎ（ｎ＝１１または１０）の結合、次いでＡＰ１５１０の除去およびラパマイシンの添加によるＦＫＢＰ－ＦＫＢＰホモダイマーの解離をモニタリングすることにより、さらに示された（図７Ａ～Ｄ）。

【0367】

結論として、本明細書中で上に提示されたデータは、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴが、目的のタンパク質の結合および解離の両方のリアルタイムのモニタリングを可能にする可逆的な相補体化系であることを示す。さらに、ＮＦＡＳＴフラグメントおよびＣＦＡＳＴフラグメントは、低い親和性を特徴とし、限定された自己集合、よって低い非特異的な蛍光バックグラウンドをもたらす。

【0368】

実施例３：ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴは、膜タンパク質と細胞質タンパク質の間の相互作用の検出を可能にする。
多くのタンパク質の相互作用は細胞膜で起こるため、膜タンパク質と細胞質タンパク質の間の相互作用を検出するためのｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの使用を次に試験した。ＦＫＢＰ－ＣＦＡＳＴｎ（ｎ＝１１または１０）を、細胞質で、およびＦＲＢ－ＮＦＡＳＴを、Ｌｙｎ１１膜固定配列（Ｌｙｎ１１－ＦＲＢ－ＮＦＡＳＴ）を使用して細胞膜において発現させた。ラパマイシンの添加は、ＨＭＢＲで処置した細胞中の細胞膜で蛍光性ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ：フルオロゲンアセンブリの迅速な形成をもたらし（図８Ａ～Ｂ）、リアルタイムで細胞膜でのタンパク質相互作用を検出するｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの能力を示した。

【0369】

実施例４
ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴは、リアルタイムでシグナリング経路における動的なタンパク質相互作用の観察を可能にする。
ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴを次に、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナリング経路からの既知の生理的に関連するタンパク質相互作用により基準に従い評価した。ＮＦＡＳＴを、増殖因子受容体の下流にある小さなＧＴＰａｓｅである、Ｋ－Ｒａｓに融合し、ＣＦＡＳＴ１０を、Ｋ－Ｒａｓとの相互作用により膜に動員されることが知られている、Ｒａｆ１のｍＣｈｅｒｒｙ融合物に融合した。ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ：ＨＭＢＲの蛍光は、Ｋ－Ｒａｓによる細胞膜でのＲａｆ１の特異的な動員と一致して、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光と共局在され、膜で濃縮された（図９Ａ）。次に、ＭＡＰキナーゼ キナーゼＭＥＫ１と、下流の細胞外シグナル制御タンパク質キナーゼＥＲＫ２との間の相互作用（Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナリング経路における中心的な相互作用の１つ）を、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴを使用して評価した。ＭＥＫ１をＮＦＡＳＴに融合し（ＭＥＫ１－ＮＦＡＳＴ）、ＥＲＫ２のｍＣｈｅｒｒｙ融合物をＣＦＡＳＴ１０に融合した（ｍＣｈｅｒｒｙ－ＥＲＫ２－ＣＦＡＳＴ１０）場合、特異的な細胞質のｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ：ＨＭＢＲ蛍光が、細胞質中にＭＥＫ１を固定するＥＲＫ２と一致して観察された（図９Ｂ）。最終的に、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴは、ＥＲＫ２とＭＫＰ１（ＤＵＳＰ１）の間の核の相互作用を検出することを可能にし、これは、その活性化およびその後の核への転位の後のＥＲＫ２の不活性化に寄与する核に局在するホスファターゼである（図９Ｃ）。Ｋ－Ｒａｓ／Ｒａｆ１、ＭＥＫ１／ＥＲＫ２、およびＥＲＫ２／ＭＫＰ１の相互作用をイメージングするためのｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの使用に関連する対照は、図９Ｄに示される。

【0370】

動的なタンパク質相互作用を試験するためのｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの適用性を探索するために、ＭＡＰＫシグナリング経路の活性化時のＭＥＫ１とＥＲＫ２の間の相互作用を経過観察した。細胞の刺激時に、ＭＥＫ１はＥＲＫ２をリン酸化し、それはＭＥＫ１から離れ、核に転位し、ここでそれは転写因子の活性を制御する。核ホスファターゼによる脱リン酸化は、ＥＲＫ２を不活性化し、これを細胞質に戻す。ＭＥＫ１－ＮＦＡＳＴおよびｍＣｈｅｒｒｙ－ＥＲＫ２－ＣＦＡＳＴ１０を発現する残りのＨＭＢＲで処置した細胞において、ｍＣｈｅｒｒｙおよびｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ：ＨＭＢＲの蛍光は、細胞質中でＭＥＫ１を固定するＥＲＫ２と一致して、細胞質であった。上皮増殖因子（ＥＧＦ）での細胞刺激時に、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＥＲＫ２－ＣＦＡＳＴ１０は、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ：ＨＭＢＲ蛍光の同時に起こる喪失およびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の核での集積により示されるように、ＭＥＫ１－ＮＦＡＳＴから解離し核に転位した。ｍＣｈｅｒｒｙ－ＥＲＫ２－ＣＦＡＳＴ１０の核での集積は、一過性であり：脱感作されたｍＣｈｅｒｒｙ－ＥＲＫ２－ＣＦＡＳＴ１０は、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ：ＨＭＢＲの蛍光および細胞質のｍＣｈｅｒｒｙの蛍光の同時の増大により明らかにされるように、細胞質に戻りＭＥＫ１ ＮＦＡＳＴと再度アセンブリした（図１０Ａ～Ｂ）。この実験は、どのようにｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴがリアルタイムでシグナリング経路の動的なタンパク質相互作用を観察するために使用できるかを示す。

【0371】

実施例５：ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴは、一時的かつ短期間の相互作用の観察を可能にする。
迅速かつ一時的な相互作用の検出のためのｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの使用をさらに例証するために、カルモジュリン（ＣａＭ）とＣａ^２＋ＣａＭ－相互作用ペプチドＭ１３の間のＣａ^２＋依存性相互作用をモニタリングした。ＣＦＡＳＴ１０－ＣａＭおよびＭ１３－ＮＦＡＳＴを発現するＨＭＢＲで処置したＨｅＬａ細胞において、ヒスタミンの添加は、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ－ＨＭＢＲの蛍光の大規模な増大、次いで蛍光シグナルの迅速な振動、および結果的に脱感作をもたらした（図１１Ａ～Ｂ）。この応答は、ヒスタミン刺激時の哺乳類細胞中のＣａ^２＋濃度の既知の変化と一致しており、一時的な短期間の相互作用をイメージングするｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの能力を示した。

【0372】

実施例６：ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴは、細胞性センサーの作製を可能にする。
他のシグナリングプロセスをイメージングするためのｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの有用性を試験するために、カスパーゼバイオセンサーを作製した。転写制御因子ｂＦｏｓを、ＣＦＡＳＴ（ｂＦｏｓ－ＣＦＡＳＴ１１）に融合し、ｂＪｕｎ－ＮＦＡＳＴ－ＮＬＳ３－ＤＥＶＤＧ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＮＥＳをコードする遺伝子を、構築した。ここでＮＥＳは、遺伝子学的に融合された核移行シグナルであり、ＤＥＶＤは、カスパーゼ－３基質配列Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ａｓｐであり、ＮＬＳは、核局在シグナルであり、ｂＪｕｎは、ｂＦｏｓとヘテロダイマーを形成することが知られているペプチドである（図１２Ａ）。スタウロスポリンでの処置によるアポトーシス（よってカスパーゼ－３の活性）の誘導は、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＮＥＳからｂＪｕｎ－ＮＦＡＳＴを放出し、核へのｂＪｕｎ－ＮＦＡＳＴの転位、およびｂＪｕｎおよびｂＦｏｓの相互作用によるその後のｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの相補体化をもたらした。アポトーシスの誘導後約１～２時間に、ｍＣｈｅｒｒｙの赤色の蛍光が、細胞質中で分離し、相補体化されたｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ：ＨＭＢＲの鮮やかな緑色蛍光が核中に出現した（図１２Ｂ）。リアルタイムでタンパク質相互作用の形成をモニタリングするためのｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの可能性をさらに表す域を超えて、この実験は、細胞性センサーの設計に関するｐｌｉｔ－ＦＡＳＴの大きな可能性を示した。

【0373】

結論として、本明細書中で上に提示されたデータは、迅速かつ可逆的な相補体化を呈する分裂したレポーターである、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴが、リアルタイムで一時的なタンパク質相互作用を観察することを可能にすることを示す。Ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ：フルオロゲンは、使用されるフルオロゲンに応じて、緑色－黄色または橙色－赤色の蛍光を発し、よって多色イメージングに適応可能な系を提供する。ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴは、様々な細胞区画（サイトゾル、核、細胞膜）中のタンパク質の相互作用の観察を可能にし、従来のＢｉＦＣ系とは対照的に、リアルタイムでタンパク質アセンブリの形成および解離の両方のモニタリングを可能にする。この予想外な挙動を利用して、様々な細胞プロセスにおけるタンパク質相互作用の役割および機能を試験し、複合体相互作用のネットワークを精査できる。

【0374】

実施例７：ＦＡＳＴのオルソログによる相補体化系
ＦＡＳＴ、ｉＦＡＳＴ、およびオルソログＯ_ｎ（ｎ＝１－６）に由来する６つの機能的なＰＹＰを、上述のように残基１１４および１１５の間のそれらの最後のループで２つの相補的なフラグメントに分裂させた。オルソログＯ_１－６に由来する６つの機能的なＰＹＰは、ＦＡＳＴ（配列番号９）のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

【0375】

本明細書中以下で使用される場合、
Ｏ_１は、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ ＬＣ１ ＰＹＰに由来し配列番号１０に記載の配列を有する機能的なＰＹＰを指し、；
Ｏ_２は、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ種 ＧＦＡＪ－１ ＰＹＰに由来し配列番号１１に記載の配列を有する機能的なＰＹＰを指し、；
Ｏ_３は、Ｒｈｅｉｎｈｅｉｍｅｒａ種 Ａ１３Ｌ ＰＹＰに由来し配列番号１２に記載の配列を有する機能的なＰＹＰを指し、；
Ｏ_４は、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ ＰＹＰに由来し配列番号１３に記載の配列を有する機能的なＰＹＰを指し、；
Ｏ_５は、Ｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ ｓｉｂｉｒｉｃａ ＡＴＣＣ ７００５８８ ＰＹＰに由来し配列番号１４に記載の配列を有する機能的なＰＹＰを指し、；
Ｏ_６は、Ｒｈｏｄｏｔｈａｌａｓｓｉｕｍ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ ＰＹＰに由来し配列番号１５に記載の配列を有する機能的なＰＹＰを指す。

【0376】

ＦＡＳＴ、ｉＦＡＳＴ、および６つのオルソログＯ_１－６から得たＮ末端側のフラグメント（残基１～１１４に対応）を、それぞれＮＦＡＳＴ、Ｎ－ｉＦＡＳＴ、およびＯ_１－６ＮＦＡＳＴと呼んだ。上述されるように、ＮＦＡＳＴフラグメントおよびＮ－ｉＦＡＳＴフラグメントは、それぞれ配列番号２３および配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する。Ｏ_１－６ＮＦＡＳＴは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列（Ｏ_１ＮＦＡＳＴ）、配列番号２５に記載のアミノ酸配列（Ｏ_２ＮＦＡＳＴ）、配列番号２６に記載のアミノ酸配列（Ｏ_３ＮＦＡＳＴ）、配列番号２７に記載のアミノ酸配列（Ｏ_４ＮＦＡＳＴ）、配列番号２８に記載のアミノ酸配列（Ｏ_５ＮＦＡＳＴ）、および配列番号２９に記載のアミノ酸配列（Ｏ_６ＮＦＡＳＴ）を有する。

【0377】

ＦＡＳＴおよびｉＦＡＳＴから得たＣ末端側のフラグメント（残基１１５～１２５に対応）は、同一であり、ＣＦＡＳＴ１１と呼ばれ、６つのオルソログＯ_１－６から得たＣ末端側のフラグメント（残基１１５～１２５に対応）は、Ｏ_１－６ＣＦＡＳＴと呼ばれた。ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴについて、トランケートされたＣ末端側のフラグメント（残基１１５～１２４、ＣＦＡＳＴ１０と称される）も試験した。上述されるように、ＣＦＡＳＴ１１フラグメントおよびＣＦＡＳＴ１０フラグメントは、それぞれ配列番号３４および配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する。Ｏ_１－６ＣＦＡＳＴは、配列番号３５に記載のアミノ酸配列（Ｏ_１ＣＦＡＳＴ）、配列番号３６に記載のアミノ酸配列（Ｏ_２ＣＦＡＳＴ）、配列番号３７に記載のアミノ酸配列（Ｏ_３ＣＦＡＳＴ）、配列番号３８に記載のアミノ酸配列（Ｏ_４ＣＦＡＳＴ）、配列番号３９に記載のアミノ酸配列（Ｏ_５ＣＦＡＳＴ）、および配列番号４０に記載のアミノ酸配列（Ｏ_６ＣＦＡＳＴ）を有する。

【0378】

哺乳類細胞でのタンパク質間相互作用を検出するｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ、ｓｐｌｉｔ－ｉＦＡＳＴ、およびｓｐｌｉｔ－Ｏ_１－６ＦＡＳＴの相補体化系の能力を試験するために、それらのＮ末端側のフラグメント（すなわち本発明に係る第１のＰＹＰフラグメント）を、ラパマイシンの哺乳類標的のＦＫＢＰ－ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）のＣ末端に融合し、それらのＣ末端側のフラグメント（すなわち本発明に係る第２のＰＹＰフラグメント）を、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）のＣ末端に融合した。ＦＫＢＰおよびＦＲＢは、ラパマイシンの添加時に共に相互作用することが知られている。ラパマイシンの添加はよって、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ、ｓｐｌｉｔ－ｉＦＡＳＴ、およびｓｐｌｉｔ－Ｏ_１－６ＦＡＳＴの系の相補体化を誘導すると予測される。

【0379】

以下のトランスフェクションレポーターを使用して、二重にトランスフェクトした細胞を容易に検出した：ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２（シアン蛍光を提供）およびｉＲＦＰ６７０（近赤外蛍光を提供）。単一のＲＮＡ転写物から別々にＦＫＢＰ融合物およびｉＲＦＰ６７０の同時発現を可能にする、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）含有バイシストロニックベクターを作製した。単一のＲＮＡ転写物から別々にＦＲＢ融合物およびｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の同時発現を可能にする、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）含有バイシストロニックベクターを作製した。

【0380】

ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を、２つのバイシストロニックベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、以下の濃度：０、１、５、１０、２５、および５０μＭのフルオロゲンＨＭＢＲとインキュベートした。細胞の蛍光を、フローサイトメトリーにより、５００ｎＭのラパマイシンの非存在下および存在下で分析した。二重にトランスフェクトした細胞の平均蛍光を、異なる条件で抽出した。

【0381】

図１３に示されるように、所定のＨＭＢＲ濃度にて、試験した相補体化系のそれぞれにより、平均細胞蛍光の増大が、ＰＹＰフラグメントの相互作用依存的相補体化と一致して、ラパマイシンの添加時に観察された。このデータはよって、ｓｐｌｉｔ－ＦＡＳＴ（図１３Ａ－Ｂ）、ｓｐｌｉｔ－ｉＦＡＳＴ（図１３Ｃ）、およびｓｐｌｉｔ－Ｏ_１－６ＦＡＳＴ（図１３Ｄ－Ｉ）の相補体化系が、タンパク質間相互作用を検出するためにうまく利用できることを示す。図１３はまた、増大するＨＭＢＲ濃度が、ＰＹＰフラグメントの自己集合（すなわちラパマイシンの非存在下で検出される蛍光）を増大させたことを示す。しかしながら、ＰＹＰフラグメントの自己集合は、依然として少なく、蛍光は、低いＨＭＢＲの濃度で、特には２５μＭ以下のＨＭＢＲ濃度で、特に１０μＭ以下のＨＭＢＲ濃度では、ラパマイシンの非存在下でほとんど観察されない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【配列表】

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