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▶ シャンハイ・チージョウ・ズユェ・バイオテクノロジー・カンパニー・リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-05
(45)【発行日】2024-11-13
(54)【発明の名称】Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体及びその応用
(51)【国際特許分類】
C12N 9/06 20060101AFI20241106BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20241106BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20241106BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241106BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241106BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241106BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241106BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241106BHJP
C12P 13/04 20060101ALI20241106BHJP
【ＦＩ】
C12N9/06 Z ZNA
C12N15/53
C12N15/10 200Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P13/04
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2021569424
(86)(22)【出願日】2020-05-12
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-22
(86)【国際出願番号】 CN2020089775
(87)【国際公開番号】W WO2020233451
(87)【国際公開日】2020-11-26
【審査請求日】2023-04-14
(31)【優先権主張番号】201910434350.1
(32)【優先日】2019-05-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】523212656
【氏名又は名称】シャンハイ・チージョウ・ズユェ・バイオテクノロジー・カンパニー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＱＩＺＨＯＵ ＺＩＹＵＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】ＲＯＯＭ ０８２９， ２ＮＤ ＦＬＯＯＲ， ＢＵＩＬＤＩＮＧ Ｆ， ＮＯ． ５５５ ＤＯＮＧＣＨＵＡＮ ＲＯＡＤ， ＭＩＮＨＡＮＧ ＤＩＳＴＲＩＣＴ， ＳＨＡＮＧＨＡＩ ２０１１００， ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】ティアン，ゼンホア
(72)【発明者】
【氏名】チェン，チャンビン
(72)【発明者】
【氏名】ディン，シャオナン
(72)【発明者】
【氏名】ジァオ，チー
(72)【発明者】
【氏名】シュウ，ウェンシュアン
(72)【発明者】
【氏名】ファン，ヤオ
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，フェン
【審査官】伊達 利奈
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０８５８８０４５（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０７５０２６４７（ＣＮ，Ａ）
【文献】Applied Microbiology and Biotechnology，2018, Vol.102, pp.4425-2233
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体であって、
前記Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体のアミノ酸配列は配列表の配列番号７又は配列番号９に示される通りであることを特徴とするＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体。
【請求項2】
請求項１に記載のＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体をコードすることを特徴とする単離された核酸。
【請求項3】
前記単離された核酸の配列が、配列表の配列番号８又は配列番号１０に示される通りであることを特徴とする請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項4】
請求項２又は３に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項5】
請求項２若しくは３に記載の核酸又は請求項４に記載の組換え発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項6】
反応溶媒、請求項１に記載のＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体、無機アミノ供与体、及び還元型補酵素ＮＡＤＰＨの存在下で、２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩をアミノ化反応させて、Ｌ－グルホシネート塩を得るステップを含むことを特徴とするＬ－グルホシネート塩の調製方法。
【請求項7】
Ｄ－アミノ酸オキシダーゼの存在下で、Ｄ－グルホシネート塩を酸化反応させて、前記２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩を得るステップをさらに含む請求項６に記載のＬ－グルホシネート塩の調製方法。
【請求項8】
前記Ｄ－グルホシネート塩は単独で存在するか、Ｌ－グルホシネート塩とともに存在し、前記Ｌ－グルホシネート塩とともに存在する形態は、Ｄ型に富むグルホシネート塩、Ｌ型に富むグルホシネート塩又はラセミ体のグルホシネート塩であり、及び／又は、
前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼの濃度は０．６～６Ｕ／ｍｌであり、及び／又は、
前記酸化反応は通気の条件下で行われ、及び／又は、
前記酸化反応はカタラーゼの存在下で行われ、及び／又は、
前記Ｄ－グルホシネート塩の濃度は１００～６００ｍＭであり、及び／又は、
前記酸化反応の反応系のｐＨは７～９であり、及び／又は、
前記酸化反応の反応系の温度は２０～５０℃であることを特徴とする請求項７に記載の調製方法。
【請求項9】
前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼの濃度は１．８Ｕ／ｍｌであり、及び／又は、
前記通気は空気又は酸素の導入であり、及び／又は、前記通気の速度は０．５～１ＶＶＭであり、及び／又は、
前記Ｄ－グルホシネート塩の濃度は２００ｍMであり、及び／又は、
前記酸化反応の反応系のｐＨは８．０であり、及び／又は、
前記酸化反応の反応系の温度は２０℃であることを特徴とする請求項８に記載の調製方法。
【請求項10】
前記Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体の濃度は０．０５～３Ｕ／ｍｌであり、及び／又は、前記無機アミノ供与体の濃度は１００～２０００ｍＭであり、及び／又は、
前記２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩の濃度は１００～６００ｍＭであり、及び／又は、
前記還元型補酵素ＮＡＤＰＨと前記２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩との質量比は１:１００～１:２００００であり、及び／又は、
前記無機アミノ供与体は、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、及び重炭酸アンモニウムのうちの一種又は複数種であり、及び／又は、
前記反応溶媒は水であり、及び／又は、
前記アミノ化反応の反応系のｐＨは７～９であり、及び／又は、
前記アミノ化反応の反応系の温度は２０～５０℃であることを特徴とする請求項６～９のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項11】
デヒドロゲナーゼ及び水素供与体の存在下で、酸化型補酵素ＮＡＤＰ＋を還元反応させ、前記還元型補酵素ＮＡＤＰＨを得るステップをさらに含むことを特徴とする、請求項６～１０のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項12】
前記デヒドロゲナーゼは、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、又はギ酸デヒドロゲナーゼであり、及び／又は、前記水素供与体は、グルコース、イソプロパノール、又はギ酸塩であることを特徴とする請求項１１に記載の調製方法。
【請求項13】
前記デヒドロゲナーゼがアルコールデヒドロゲナーゼであるとき、前記水素供与体はイソプロパノールであり、前記デヒドロゲナーゼがグルコースデヒドロゲナーゼであるとき、前記水素供与体はグルコースであり、前記デヒドロゲナーゼがギ酸デヒドロゲナーゼであるとき、前記水素供与体はギ酸塩であることを特徴とする請求項１２に記載の調製方法。
【請求項14】
前記デヒドロゲナーゼの濃度は０．６～６Ｕ／ｍｌであり、及び／又は、前記酸化型補酵素ＮＡＤＰ＋と前記２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩との質量比は１:１００～１:２００００であり、及び／又は、
前記水素供与体の濃度は１００～１０００ｍＭであり、及び／又は、
前記還元反応の反応系のｐＨは７～９であり、及び／又は、
前記還元反応の反応系の温度は２０～５０℃であることを特徴とする請求項１１～１３のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項15】
（１）請求項６～１４のいずれか一項に記載の調製方法により、Ｌ－グルホシネート塩を調製するステップ、及び（２）ステップ（１）で得られたＬ－グルホシネート塩を酸化反応させて、Ｌ－グルホシネートを得るステップ、を含むことを特徴とするＬ－グルホシネートの調製方法。
【請求項16】
Ｌ－グルホシネート又はその塩の調製において使用するための請求項１に記載のＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、出願日が２０１９年５月２３日である中国特許出願ＣＮ２０１９１０４３４３５０．１の優先権を主張する。本願では、当該中国特許出願を全文引用する。
【0002】
（技術分野）
本発明は、生物技術分野に属し、具体的にＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体及びその応用に関する。
本発明は、生物技術分野に属し、具体的にＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体及びその応用に関する。
【背景技術】
【0003】
グルホシネート（２－アミノ－４－[ヒドロキシ(メチル)ホスホノ]酪酸）は、Ｈｅａｒｓｔ社が８０年代に開発したスペクトラムの広い接触型除草剤である。現在世界の三大除草剤はグリホサート、グルホシネート、パラコートであり、グリホサートやパラコートに比べて、グルホシネートは優れた除草性能及び比較的小さい副作用を有する。グルホシネートにはＤ－グルホシネートとＬ－グルホシネートの２つの光学異性体があるが、除草活性を有するのはＬ－グルホシネートだけなので、Ｌ－グルホシネートの開発は原子経済性の向上、コストの低下、環境負荷の軽減に重要な意義がある。
【0004】
現在、Ｌ－グルホシネートを調製する方法としては、主にキラル分割法、化学合成法、生体触媒法がある。
【0005】
キラル分割法、例えばＣＮ１０５３６６９Ｃには、キニーネアルカロイドを分割剤として利用する方法が開示され、Ｌ－グルホシネートのキニン塩を再結晶し、そして酸で塩を中和してＬ－グルホシネートを得る。同時に、５－ニトロサリチルアルデヒド又は３，５－ジニトロサリチルアルデヒドをラセミ化試薬として未反応のＤ－グルホシネートをラセミ化し、ＤＬ－グルホシネートを得て、そして分割反応に供する。しかし、この方法では、高価なキラル分割試薬、及び多段階の再結晶が必要であり、操作が複雑であり、理想的な方法ではない。
【化1】
【0006】
化学合成法、例えばＵＳ６９３６４４４には、２－アセチルアミノ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）－２－ブテン酸をルテニウム触媒で不斉水素化してＬ－２－アセチルアミノ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）－２－酪酸を得て、さらに脱アセチルしてＬ－グルホシネートを得ることが開示されている。この方法では、高価な金属触媒が必要であり、コストがかかるだけでなく、重金属が残留して、環境汚染が深刻であることが開示されている。
【化2】
【0007】
キラル分割法や化学合成法に比べて、生体触媒法は特異性が強く、反応条件が穏やかであるなどのメリットを有し、Ｌ－グルホシネートを生産する優れた方法である。
【0008】
現在、ＵＳ４３８９４８８（Ａ）に記載されているように、Ｎ－フェニルアセチル－ＤＬ－グルホシネートを基質とし、大腸菌由来のペニシリン－Ｇ－アシルトランスフェラーゼを触媒としてＬ－グルホシネートを得る方法があるが、フェニルアセチルグルホシネートの合成コストは比較的高く、反応終了後にＬ－グルホシネート、Ｎ－フェニルアセチル－Ｄ－グルホシネート、フェニル酢酸の混合溶液を得て、強酸カチオン交換樹脂でＬ－グルホシネートを分離する必要があり、操作が複雑である。
【化3】
【0009】
ＥＰ０３８２１１３Ａには、アシルトランスフェラーゼでＮ－アセチル－グルホシネートのカルボン酸エステルを触媒的に分解してＬ－グルホシネートを得る方法が記載されているが、この方法における酵素は遊離のＮ－アセチル－グルホシネートに対して特異性がないため、Ｎ－アセチル－グルホシネートをエステル化する必要があり、反応ステップが増加し、それに応じて生産コストも増加する。
【0010】
また、２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸（ＰＰＯ）を基質とし、トランスアミナーゼ触媒でＬ－グルホシネートを調製する方法があり、ＵＳ５２２１７３７ＡとＥＰ０３４４６８３Ａには、グルタミン酸をアミノ供与体とし、対応するケト酸４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）－２－オキソ酪酸から大腸菌由来のアミノトランスアミナーゼの作用によりＬ－グルホシネートを得る方法が記載されており、反応系に同量又は過剰のアミノ供与体であるグルタミン酸が必要であり、生成物の精製が難しい。ＣＮ１２８４８５８Ｃは、上記の方法を改善し、アスパラギン酸をアミノ供与体とし、対応するケト酸４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）－２－オキソ酪酸からアスパラギン酸トランスアミナーゼの作用によりＬ－グルホシネートを得る方法であって、この方法では、アスパラギン酸はオキサリル酢酸に変換されるが、オキサリル酢酸は水含有媒体に不安定であるため、自発的にピルビン酸に脱炭酸され、ピルビン酸は酵素反応により除去できるため、逆反応は不可能であり、反応には等モル量のアミノ供与体とアミノアクセプターだけが必要である。しかし、トランスアミナーゼを用いる方法で使用されるアミノ供与体はアミノ酸であることが多く、コストが高い。
【化4】
【0011】
また、２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸（ＰＰＯ）を基質とし、アミノ酸デヒドロゲナーゼ触媒により、Ｌ－グルホシネートを調製する方法もあり、例えばＣＮ１０６９７８４５３Ａのように、無機アミノ供与体を採用することで、生成物の分離が簡単であり、コストが低下する。しかし、ＣＮ１０６９７８４５３Ａでは酵素触媒の基質濃度範囲は１０～１００ｍＭしかなく、酵素の触媒効率は高くない。
【化5】
【0012】
ＣＮ１０８５８８０４５Ａでは、Ｌ－グルホシネートの調製におけるいくつかのグルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体の応用が開示され、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｐｕｔｉｄａ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＰ＿７４２８３６．１）は、１６７位のアラニンをグリシンに突然変異するか、３７８位のバリンをアラニンに突然変異すると、いずれも酵素のＰＰＯに対する触媒能力を向上させること見出し、そして他の由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼの１６７と３７８位の相同部位の突然変異体を研究したところ、このような突然変異体は同様にグルタミン酸デヒドロゲナーゼのＰＰＯに対する触媒能力を向上させることができること見出したが、これらの他の由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼの相同部位の突然変異体の組み合わせた突然変異については研究しなかった。さらに、この特許出願では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｐｕｔｉｄａのグルタミン酸デヒドロゲナーゼの前記２部位を同時に突然変異させたが、得られた二重突然変異体の酵素活性の増加倍数は単一突然変異の突然変異体に相当するに過ぎず、かつ生物分野の予測不可能性から、二重突然変異部位の突然変異体の効果は必ずしもそれぞれの単一突然変異の突然変異体よりも優れているとは言えない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0013】
【文献】中国特許第１０５３６６９号
【文献】米国特許第６９３６４４４号
【文献】米国特許第４３８９４８８号
【文献】欧州特許出願公開第３８２１１３号
【文献】米国特許第５２２１７３７号
【文献】欧州特許出願公開第３４４６８３号
【文献】中国特許出願公開第１０６９７８４５３号
【文献】中国特許出願公開第１０６９７８４５３号
【文献】中国特許出願公開第１０８５８８０４５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
本発明が解決しようとする技術的課題は、従来のＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼがＬ－グルホシネート又はその塩の調製において触媒効率が低いなどの欠点であるため、本発明は、Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体、及びＬ－グルホシネート又はその塩の調製におけるＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体の応用を提供する。本発明のＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体でＬ－グルホシネート又はその塩を調製する場合、単一突然変異部位（１７５又は３８６位）のグルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体よりも比酵素活性が高いため、酵素の作用効率が向上し、反応コストが低減し、工業的生産に有利である。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明で用いられる野生型Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼはＬｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓのグルタミン酸デヒドロゲナーゼに由来し、アミノ酸配列は配列番号１に示され、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号はＷＰ＿０１２２９３８１２．１である。従来技術では、このグルタミン酸デヒドロゲナーゼを２部位で同時に二重突然変異させておらず、かつ生物分野の予測不可能性から、二重突然変異部位の突然変異体の効果は必ずしもそれぞれの単一突然変異の突然変異体よりも優れているとは言えない。本発明者は、この基質である２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸（ＰＰＯ）に対して、前記野生型酵素の１７５位と３８６位を組み合わせて突然変異させたところ、１７５位のアミノ酸残基ＡがＧに突然変異し、かつ３８６位のアミノ酸残基Ｖが立体障害のより小さいアミノ酸残基に突然変異した後、得られた突然変異体の基質ＰＰＯに対する比酵素活性は大幅に上昇したという意外な見解を得た。
【0016】
本発明の上記の技術的課題を解決するための技術形態の一は、配列番号１に記載されている配列の１７５位のアミノ酸残基ＡをＧに突然変異し、及び、３８６位のアミノ酸残基Ｖを立体障害のより小さいアミノ酸残基に突然変異した配列であり、２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸又はその塩を触媒する活性を有するＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体である。
【0017】
好ましくは、前記Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体のアミノ酸配列は配列表における配列番号７又は配列番号９に示される通りである。
【0018】
好ましくは、前記Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体のヌクレオチド配列は配列表における配列番号８又は配列番号１０に示される通りである。
【0019】
本発明によれば、前記立体障害のより小さいとは、突然変異したアミノ酸残基は野生配列におけるアミノ酸残基よりも立体障害が小さいことである。前記アミノ酸は修飾された又は修飾されていない天然アミノ酸である。本発明は天然アミノ酸を例に挙げている。
【0020】
本発明の上記の技術的課題を解決するための技術形態の二は、前記Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体をコードする単離された核酸である。
【0021】
好ましくは、前記核酸をコードするヌクレオチド配列は配列番号８又は配列番号１０に示される通りである。
【0022】
本発明の上記の技術的課題を解決するための技術形態の三は、前記核酸を含む組換え発現ベクターである。
【0023】
本発明の上記の技術的課題を解決するための技術形態の四は、前記核酸又は前記組換え発現ベクターを含む形質転換体である。
【0024】
本発明の上記の技術的課題を解決するための技術形態の五は、反応溶媒、Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体、無機アミノ供与体、及び還元型補酵素ＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）の存在下で、２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩をアンモニア化反応させ、Ｌ－グルホシネート塩を得るステップを含むＬ－グルホシネート塩の調製方法である。
【0025】
前記調製方法において、Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体が本発明により得られた以外、他の原料、反応ステップ及び条件はいずれも本分野の従来のものであり、具体的に前記ＣＮ１０６９７８４５３Ａ及び本出願者の出願番号がＣＮ２０１８１０１６２６２９．４である特許出願を参照できる。
【0026】
前記Ｌ－グルホシネート塩の調製方法は、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）の存在下で、Ｄ－グルホシネート塩を酸化反応させて、前記２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩を得るステップをさらに含む。
【0027】
前記酸化反応において、前記Ｄ－グルホシネート塩のカチオンは本分野の従来のカチオンであり、例えば、アンモニウムイオン、ナトリウムイオン、及び／又はカリウムイオンなどであってもよい。使用される緩衝液のカチオンであってもよい。
【0028】
前記酸化反応において、前記Ｄ－グルホシネート塩は単独で存在してもよいし、Ｌ－グルホシネート塩とともに存在してもよく（この場合、Ｌ－グルホシネート塩が反応しなくてもよい）、例えば、Ｄ型に富むグルホシネート塩（即ち、Ｄ型エナンチオマーの含有量＞５０％、ひいては純Ｄ－グルホシネート塩）、Ｌ型に富むグルホシネート塩（即ち、Ｌ－グルホシネートの含有量＞５０％、純Ｌ－グルホシネート塩の場合を含まない）又はラセミグルホシネート塩などであってもよい。
【0029】
前記酸化反応において、前記Ｄアミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）の濃度は本分野の従来のものであってもよく、好ましくは０．６～６Ｕ／ｍｌであり、より好ましくは１．８Ｕ／ｍｌである。
【0030】
前記酸化反応において、前記Ｄ－グルホシネート塩の濃度は本分野の従来のものであってもよく、好ましくは１００～６００ｍＭであり、より好ましくは２００ｍＭである。
前記酸化反応はカタラーゼの存在下で行ってもよい。
前記酸化反応はカタラーゼの存在下で行ってもよい。
【0031】
前記酸化反応は通気の条件下で行ってもよい。前記通気は空気又は酸素の導入であることが好ましい。前記通気の速度は０．５～１ＶＶＭであることが好ましい。
【0032】
本発明では、前記空気は本分野の従来の空気であってもよく、一般的に酸素を含み、含まれる酸素の含有量も本分野の従来の含有量である。反応する時に反応に関与するのは空気中の酸素である。
【0033】
前記酸化反応が通気の条件下で行われる場合、前記酸化反応は消泡剤の存在下で行われてもよい。
【0034】
前記酸化反応において、前記反応系のｐＨは好ましくは７～９であり、より好ましくは８である。前記ｐＨは緩衝液によって実現できる。前記ｐＨはアルカリ（又はアルカリ溶液）で調節することによっても実現できる。前記緩衝液は好ましくはリン酸塩緩衝液又はＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液であり、前記リン酸塩緩衝液は好ましくはリン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム緩衝液又はリン酸水素二カリウム－リン酸二水素カリウム緩衝液である。前記アルカリ溶液は好ましくはアンモニアである。
【0035】
前記酸化反応において、前記反応系の温度は本分野の従来のものであってもよく、好ましくは２０～５０℃であり、より好ましくは２０℃である。
【0036】
前記酸化反応と前記アンモニア化反応は別々に進行してもよいし、同時に（同一反応系で）行ってもよい。前記同時進行は、例えば、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）、Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体、無機アミノ供与体、及び還元型補酵素ＮＡＤＰＨの存在下で、Ｄ－グルホシネート塩を酸化反応とアンモニア化反応させて、Ｌ－グルホシネート塩が得られればよい。
【0037】
前記アンモニア化反応において、前記Ｌ－グルホシネート塩のカチオンは本分野の従来のカチオンであり、例えば、アンモニウムイオン、ナトリウムイオン、及び／又はカリウムイオンなどであってもよい。使用される緩衝液のカチオンであってもよい。
【0038】
前記アンモニア化反応において、前記２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩のカチオンは本分野の従来のカチオンであり、例えば、アンモニウムイオン、ナトリウムイオン、及び／又はカリウムイオンなどであってもよい。使用される緩衝液のカチオンであってもよい。
【0039】
前記アミノ化反応において、前記Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体の用量は本分野の従来のものであってもよく、前記Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体の濃度は好ましくは０．０５～３Ｕ／ｍｌであり、より好ましくは０．１～１Ｕ／ｍｌであり、例えば０．２３Ｕ／ｍｌである。
【0040】
前記アンモニア化反応において、前記無機アミノ供与体の用量は本分野の従来のものであってもよく、前記無機アミノ供与体の濃度は好ましくは１００～２０００ｍＭであり、より好ましくは２００ｍＭである。
【0041】
前記アンモニア化反応において、前記２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩の濃度は好ましくは１００～６００ｍＭであり、より好ましくは２００ｍＭである。
【0042】
前記アンモニア化反応において、前記２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩の用量は本分野の従来のものであってもよく、前記還元型補酵素ＮＡＤＰＨと前記２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩との質量比は、好ましくは１:１００～１:２００００であり、より好ましくは１:１０００～１:１５０００であり、さらに好ましくは１:５０００である。
【0043】
前記アンモニア化反応において、前記無機アミノ供与体は、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、及び重炭酸アンモニウムのうちの１種又は複数種である。
【0044】
前記アンモニア化反応において、前記反応の温度は本分野の従来のものであってもよく、前記Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体の触媒効率を保証するために、前記アンモニア化反応を行う温度は好ましくは２０～５０℃であり、より好ましくは３７℃であり、前記アンモニア化反応の温度が２０℃未満である場合、アンモニア化反応は遅く、前記アンモニア化反応の温度が５０℃を超える場合、酵素は不可逆的に変性して失活する。
【0045】
前記アンモニア化反応において、前記反応溶媒は水である。
【0046】
前記調製方法において、前記アンモニア化反応を行うｐＨは好ましくは７～９であり、より好ましくは８．５である。前記ｐＨは緩衝液によって実現できる。前記ｐＨはアルカリ（又はアルカリ溶液）で調節することによっても実現できる。前記緩衝液は好ましくはリン酸塩緩衝液又はＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液などであり、前記リン酸塩緩衝液は好ましくはリン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム緩衝液又はリン酸水素二カリウム－リン酸二水素カリウム緩衝液などである。前記アルカリ溶液は好ましくはアンモニアである。
【0047】
前記Ｌ－グルホシネート塩の調製方法は、デヒドロゲナーゼ（例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ又はギ酸デヒドロゲナーゼなど）及び水素供与体（例えば、グルコース、イソプロパノール又はギ酸塩など）の存在下で、酸化型補酵素ＮＡＤＰ＋を還元反応させて、前記還元型補酵素ＮＡＤＰＨを得るステップをさらに含む。
【0048】
前記還元反応において、前記デヒドロゲナーゼと前記水素供与体は一対一で対応し、
例えば、前記デヒドロゲナーゼがアルコールデヒドロゲナーゼである場合、前記水素供与体はイソプロパノールであり、
前記デヒドロゲナーゼがグルコースデヒドロゲナーゼである場合、前記水素供与体はグルコースであり、
前記デヒドロゲナーゼがギ酸デヒドロゲナーゼである場合、前記水素供与体はギ酸塩である。
例えば、前記デヒドロゲナーゼがアルコールデヒドロゲナーゼである場合、前記水素供与体はイソプロパノールであり、
前記デヒドロゲナーゼがグルコースデヒドロゲナーゼである場合、前記水素供与体はグルコースであり、
前記デヒドロゲナーゼがギ酸デヒドロゲナーゼである場合、前記水素供与体はギ酸塩である。
【0049】
前記還元反応において、前記デヒドロゲナーゼの濃度は本分野の従来のものであってもよく、好ましくは０．６～６Ｕ／ｍｌであり、より好ましくは２Ｕ／ｍｌである。
【0050】
前記還元反応において、前記水素供与体の濃度は本分野の従来のものであってもよく、好ましくは１００～１０００ｍＭであり、より好ましくは２４０ｍＭである。
【0051】
前記還元反応において、前記酸化型補酵素ＮＡＤＰ＋の濃度は本分野の従来のものであってもよい。
【0052】
前記還元反応において、前記還元反応を行うｐＨは好ましくは７～９であり、より好ましくは８．５である。前記ｐＨは緩衝液によって実現できる。前記ｐＨはアルカリ（又はアルカリ溶液）で調節することによっても実現できる。前記緩衝液は好ましくはリン酸塩緩衝液又はＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液等であり、前記リン酸塩緩衝液は好ましくはリン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム緩衝液又はリン酸水素二カリウム－リン酸二水素カリウム緩衝液などである。前記アルカリ溶液は好ましくはアンモニアである。
【0053】
前記還元反応において、前記反応系の温度は本分野の従来のものであってもよく、好ましくは２０～５０℃であり、より好ましくは３７℃である。
【0054】
前記還元反応と前記アンモニア化反応は別々に進行してもよいし、同時に（同一反応系で）に進行してもよい。前記同時進行は、例えば、本発明の好ましい実施例に示されるように、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース、酸化型補酵素ＮＡＤＰ＋、Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体、及び無機アミノ供与体の存在下で、２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩をアンモニア化反応（同時に存在しているＮＡＤＰ＋の還元反応）させて、Ｌ－グルホシネート塩が得られればよい。
【0055】
前記還元反応と前記アンモニア化反応が同時に進行する場合、前記アンモニア化反応に用いるＮＡＤＰＨは前記還元反応により繰り返し生成される。前記酸化型補酵素ＮＡＤＰ＋の濃度は本分野の従来のものであってもよく、前記反応が正常に進行できることを保証するために、それと前記２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩との質量比は１:１００～１:２００００であり、好ましくは１:１０００～１:１５０００であり、より好ましくは１:５０００である。
【0056】
還元反応、前記酸化反応、前記アンモニア化反応は別々に進行してもよいし、同時に（同一反応系で）進行してもよい。前記同時進行は、例えば、本発明の好ましい実施例に示されるように、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）、デヒドロゲナーゼ、水素供与体、酸化型補酵素ＮＡＤＰ＋、Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体、及び無機アミノ供与体の存在下で、Ｄ－グルホシネート塩を酸化反応とアンモニア化反応（同時に存在しているＮＡＤＰ＋の還元反応）させて、Ｌ－グルホシネート塩が得られればよい。
【0057】
前記還元反応、前記酸化反応、前記アンモニア化反応が同時に進行する場合、前記アンモニア化反応に用いるＮＡＤＰＨは前記還元反応により繰り返し生成される。前記酸化型補酵素ＮＡＤＰ＋の濃度は本分野の従来のものであってもよく、前記反応が正常に進行できることを保証するために、ＮＡＤＰ＋と前記２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩との質量比は１:１００～１:２００００であり、好ましくは１:１０００～１:１５０００であり、より好ましくは１:５０００である。
【0058】
前記調製方法の反応時間は、従来の方法で検出する場合、原料の終濃度又は生成物の終濃度又は転換率が所望の目的に達したら終了すればよい。前記従来の方法は、プレカラム誘導体化高速液体クロマトグラフィー又はイオンペアクロマトグラフィーなどを含む。
【0059】
本発明の上記の技術的課題を解決するための技術形態の六は、以下のステップを含むＬ－グルホシネートの調製方法である。
（１）上記のＬ－グルホシネート塩の調製方法により、Ｌ－グルホシネート塩を調製する。
（２）ステップ（１）で得られたＬ－グルホシネート塩を酸化反応させて、Ｌ－グルホシネートを得る。
（１）上記のＬ－グルホシネート塩の調製方法により、Ｌ－グルホシネート塩を調製する。
（２）ステップ（１）で得られたＬ－グルホシネート塩を酸化反応させて、Ｌ－グルホシネートを得る。
【0060】
本発明の上記の技術的課題を解決するための技術形態の七は、Ｌ－グルホシネート又はその塩の調製における上記で調製されたＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体の応用である。
【0061】
前記応用は、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ、無機アミノ供与体、及び還元型補酵素の存在下で、２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩を反応させて、Ｌ－グルホシネート塩を得るステップを含んでもよい。
【0062】
又は、前記応用は、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ、無機アミノ供与体、及び還元型補酵素の存在下で、２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸を反応させて、Ｌ－グルホシネートを得るステップを含んでもよい。
【0063】
又は、前記応用は、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ、無機アミノ供与体、及び還元型補酵素の存在下で、２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩を反応させて、Ｌ－グルホシネート塩を得て、さらに酸化反応を行い、Ｌ－グルホシネートを得るステップを含んでもよい。
【0064】
本発明では、前記Ｌ－グルホシネート塩は一般的にＬ－グルホシネートアンモニウム塩の形態で存在してもよい。
【0065】
以上の化合物について記載されている濃度は、特に説明しなければ、いずれも反応前の前記化合物が全反応系に占める濃度である。
【0066】
本分野の常識に基づいて、上記各好ましい条件を任意に組み合わせて、本発明の各好ましい実施例を得ることができる。
【0067】
本発明で用いられる試薬と原料はいずれも市販のものである。
【発明の効果】
【0068】
本発明の積極的な進歩的な効果は、
本発明のＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体でＬ－グルホシネート又はその塩を調製する場合、単一突然変異部位（１７５位又は３８６位）のグルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体よりも、比酵素活性が高いため、酵素の作用効率が向上し（例えば、反応に関与する場合、転換率がより高い、立体選択性がより強い）、反応のコストが低減し、工業化生産に有利である。
本発明のＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体でＬ－グルホシネート又はその塩を調製する場合、単一突然変異部位（１７５位又は３８６位）のグルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体よりも、比酵素活性が高いため、酵素の作用効率が向上し（例えば、反応に関与する場合、転換率がより高い、立体選択性がより強い）、反応のコストが低減し、工業化生産に有利である。
【図面の簡単な説明】
【0069】
【発明を実施するための形態】
【0070】
以下、本発明を実施例の形態によりさらに説明するが、本発明は前記実施例の範囲内に制限されるものではない。下記の実施例では、具体的な条件が記載されていない実験方法は、従来の方法や条件に従って、又は商品説明書に従って選択される。
【0071】
本発明における実験方法は、特に説明しなければ、従来の方法であり、遺伝子クローン操作は具体的にＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋらが編集した「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」を参照できる。
【0072】
本発明におけるアミノ酸の略号は、特に明記されていなければ、本分野の従来のものであり、具体的な略号に対応するアミノ酸は表１に示されている。
【0073】
【表1】
【0074】
前記アミノ酸に対応するコドンも本分野の従来のものであり、具体的なアミノ酸とコドンの対応関係は表２に示される。
【0075】
【表2】
【0076】
ｐＥＴ２８ａはＮｏｖａｇｅｎ社から購入され、ＮｄｅI酵素、ＨｉｎｄＩＩＩ酵素はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社から購入され、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換受容性細胞は北京鼎国昌盛生物技術株式会社から購入され、カタラーゼは山東豊泰生物科技株式会社から購入され、ＮＡＤＰＨは深セン邦泰生物工程株式会社から購入され、ＮＨ４Ｃｌは上海泰坦科技株式会社から購入される。
【0077】
生成物のキラル分析は、プレカラム誘導体化高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）で行われ、具体的な分析方法は以下の通りである。
（１）クロマトグラフィーの条件：
Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ｐｌｕｓ Ｃ１８、３．５μｍ、１５０＊４．６ｍｍ。移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ＋Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ＋ＣＡＮ。検出波長：３４０ｎｍ、流速：１．０ｍｌ／分、カラム温度：３０℃。
（２）誘導体化試薬：
Ｍａｒｆｅｙ試薬。５０ｍｇのＮ－α－(２、４－ジニトロ－５－フルオロフェニル)－Ｌ－アラニンアミドを正確に秤量し、アセトニトリルで溶解して２５ｍｌの溶液を作っておいた。
（３）誘導体化反応：
反応液を１００倍希釈し、同体積のＭａｒｆｅｙ試薬を加えて誘導体化する。１０μｌのサンプルを注入して分析した。
（１）クロマトグラフィーの条件：
Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ｐｌｕｓ Ｃ１８、３．５μｍ、１５０＊４．６ｍｍ。移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ＋Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ＋ＣＡＮ。検出波長：３４０ｎｍ、流速：１．０ｍｌ／分、カラム温度：３０℃。
（２）誘導体化試薬：
Ｍａｒｆｅｙ試薬。５０ｍｇのＮ－α－(２、４－ジニトロ－５－フルオロフェニル)－Ｌ－アラニンアミドを正確に秤量し、アセトニトリルで溶解して２５ｍｌの溶液を作っておいた。
（３）誘導体化反応：
反応液を１００倍希釈し、同体積のＭａｒｆｅｙ試薬を加えて誘導体化する。１０μｌのサンプルを注入して分析した。
【0078】
転換率＝（反応物－残留反応物）／反応物×１００％
【0079】
２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸（ＰＰＯと略称する）をイオンペア高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）で分析し、具体的な分析方法は以下の通りである。
【0080】
クロマトグラフィー条件：
ＵＬｔｉｍａｔｅ ＡＱ－Ｃ１８、５μｍ、４．６＊２５０ｍｍ；移動相：０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二アンモニウムｐＨ＝３．６ : １０％テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液 ：アセトニトリル ＝ ９１:１:８；検出波長：２０５ｎｍ；流速：１．０ｍｌ／分；カラム温度：２５℃。
ＵＬｔｉｍａｔｅ ＡＱ－Ｃ１８、５μｍ、４．６＊２５０ｍｍ；移動相：０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二アンモニウムｐＨ＝３．６ : １０％テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液 ：アセトニトリル ＝ ９１:１:８；検出波長：２０５ｎｍ；流速：１．０ｍｌ／分；カラム温度：２５℃。
【0081】
以下の実施例では、すべて「グルホシネート」と記載されているが、「グルホシネート」が反応系に入っているから、当業者は「グルホシネートアンモニウム塩」を「グルホシネート」と称するため、「グルホシネート」は実際に「グルホシネートアンモニウム塩」を指し、対応するグルホシネート標準品もいずれもグルホシネートアンモニウム塩標準品であり、対応する生成されたＰＰＯもＰＰＯアンモニウム塩である。得られた生成物グルホシネートの旋光度を検出する時、グルホシネートアンモニウム塩を酸化反応させた後、グルホシネートを得てから検出を行った。
【実施例】
【0082】
（実施例１）Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体酵素の取得
【0083】
ＮＣＢＩからＬｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＬｓＧｌｕＤＨと略称する）配列：配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＷＰ＿０１２２９３８１２．１を検索し、表３の突然変異体遺伝子のヌクレオチド配列：配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０に基づいて遺伝子を合成し、遺伝子の合成会社は蘇州金唯智生物科技株式会社（蘇州工業園区星湖街２１８号生物納米科技園Ｃ３階）である。
【0084】
そして、突然変異体遺伝子をそれぞれｐＥＴ２８ａに酵素的に連結し、酵素切断部位はＮＤＥＩ ＆ ＨＩＮＤＩＩＩである。酵素的に連結されたベクターを、宿主である大腸菌ＢＬ２１形質転換受容性細胞に形質転換した。構築された菌種をＴＢ培地に接種して３７℃で、２００ｒｐｍで振とうし、ＩＰＴＧ濃度０．１ｍＭで一晩誘導し、菌を集め、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む操作された菌株（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ）を得た。
【0085】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む操作された菌株をストリークプレート（ｐｌａｔｅ－ｓｔｒｅａｋｉｎｇ）により活性化した後、シングルコロニーを、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ液体培地５ｍｌに接種し、３７℃で１２時間振とう培養した。２％の接種量で１５０ｍｌの同様に５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む新鮮ＬＢ液体培地に接種し、３７℃でＯＤ６００が０．８程度に達するまで振とうし、終濃度が０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、１８℃で１６時間誘導培養した。培養終了後、培養液を１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄み液を捨て、菌を集め、－８０℃の超低温冷蔵庫に保存しておいた。
【0086】
上記の集めた菌５ｇを、５０ｍｍ ｐＨ８．５のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で２回洗浄し、そして３０ｍｌ ｐＨ８．５のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液に懸濁し、均一に破砕し、破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿を除去し、組換えグルタミン酸デヒドロゲナーゼを含む上澄み液である粗酵素液を得た。
【0087】
【表3】
【0088】
基質溶液の調製：
３５５μｌ ２．２５Ｍ ＰＰＯ（終濃度２０ｍＭ）（発明者自作、調製方法はＵＳ８０１７７９７Ｂに参照し、図６は対応するマススペクトルである）と０．４ｇ ＮＨ４Ｃｌ（終濃度２００ｍＭ）を加え、アンモニアでｐＨを８．５に調節し、５０ｍｍ ｐＨ８．５のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で４０ｍｌになるように定容した。
３５５μｌ ２．２５Ｍ ＰＰＯ（終濃度２０ｍＭ）（発明者自作、調製方法はＵＳ８０１７７９７Ｂに参照し、図６は対応するマススペクトルである）と０．４ｇ ＮＨ４Ｃｌ（終濃度２００ｍＭ）を加え、アンモニアでｐＨを８．５に調節し、５０ｍｍ ｐＨ８．５のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で４０ｍｌになるように定容した。
【0089】
酵素活性の検出方法：
全反応系は１ｍｌであり、ＯＤ３４０ｎｍでの吸光値を測定し、順に１ｍｌのセルに９４０μｌの基質溶液を加え、ゼロにした後、１０μｌの２５ｍｍ ＮＡＤＰＨを加え、最後に５０μｌの粗酵素液を加え、０～１０分間の数値変化を記録し、３０秒毎に値を読み取り、反応時間を横座標とし、３４０ｎｍ波長での吸収値を縦座標としてプロットし、傾きを測り、ＮＡＤＰＨの減少速度を計算し、酵素活性を計算した。
全反応系は１ｍｌであり、ＯＤ３４０ｎｍでの吸光値を測定し、順に１ｍｌのセルに９４０μｌの基質溶液を加え、ゼロにした後、１０μｌの２５ｍｍ ＮＡＤＰＨを加え、最後に５０μｌの粗酵素液を加え、０～１０分間の数値変化を記録し、３０秒毎に値を読み取り、反応時間を横座標とし、３４０ｎｍ波長での吸収値を縦座標としてプロットし、傾きを測り、ＮＡＤＰＨの減少速度を計算し、酵素活性を計算した。
【0090】
単位酵素活性の定義：
特定の反応条件（３０℃）下で、１分間あたり１μｍｏｌのＮＡＤＰＨが減少するのに必要な酵素量。
特定の反応条件（３０℃）下で、１分間あたり１μｍｏｌのＮＡＤＰＨが減少するのに必要な酵素量。
【0091】
比酵素活性とは、酵素タンパク質１ｍｇあたりに含まれる活性の単位であり、計算式：酵素活性／タンパク質含有量、単位はＵ／ｍｇ又はＵ／ｇである。結果は表４に示される。
【0092】
ＣＮ１０８５８８０４５Ａからわかるように、野生型ＬｓＧｌｕＤＨ－ＷＴ（ＷＰ＿０１２２９３８１２．１）の酵素活性は単一部位突然変異体の酵素活性よりも遥かに低く、当業者は、野生型ＬｓＧｌｕＤＨ－ＷＴ（ＷＰ＿０１２２９３８１２．１）の比酵素活性も突然変異体よりも遥かに低いと結論づけることができるので、本発明では野生型ＬｓＧｌｕＤＨ－ＷＴ（ＷＰ＿０１２２９３８１２．１）に対して検出しなかった。
【0093】
【表4】
【0094】
以下の実施例で使用されるＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼ粗酵素液の調製方法はいずれも上記の方法を採用する。
【0095】
（実施例３）Ｄアミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）遺伝子の取得
【0096】
特許ＵＳ９８３４８０２Ｂ２に記載されているＡＣ３０２ ＤＡＡＯ酵素の遺伝子配列に従ってＤＡＡＯ酵素遺伝子を完全合成した。合成会社は蘇州金唯智生物科技株式会社、江蘇省南京市江北新区研創園浦浜路２１１号である。
【0097】
（実施例４）Ｄアミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）遺伝子の発現
【0098】
ＬＢ液体培地の組成：
ペプトン１０ ｇ／Ｌ、イーストパウダー５ ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ ｇ／Ｌを脱イオン水で溶解した後に定容し、１２１℃で２０分間滅菌しておいた。
ペプトン１０ ｇ／Ｌ、イーストパウダー５ ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ ｇ／Ｌを脱イオン水で溶解した後に定容し、１２１℃で２０分間滅菌しておいた。
【0099】
実施例３で合成されたＤＡＡＯ酵素遺伝子をｐＥＴ２８ａに連結し、酵素切断部位はＤｎｅＩ ＆ ＨｉｎｄＩＩＩであり、酵素が連結されたベクターを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換受容性細胞に形質転換し、ＤＡＡＯ酵素を含む操作された菌株を得た。
【0100】
ＤＡＡＯ酵素遺伝子を含む操作された菌株をストリークプレートにより活性化した後、シングルコロニーを５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む５ ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃で１２時間振とう培養した。２％の接種量で５０ｍｌの同様に５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む新鮮ＬＢ液体培地に接種し、３７℃でＯＤ６００値が０．８程度に達するまで振とうし、ＩＰＴＧを終濃度が０．５ｍＭになるように加え、１８℃で１６時間誘導培養した。培養終了後、培養液を１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄み液を捨て、菌を集め、－２０℃の超低温冷蔵庫に保存しておいた。
【0101】
（実施例５）Ｄアミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）粗酵素液の調製及び酵素活性測定
【0102】
実施例４で集めた菌体を、５０ｍｍ ｐＨ ８．０リン酸緩衝液で菌を２回洗浄した後、菌をｐＨ ８．０のリン酸緩衝液に懸濁し、低温高圧で均一に破砕し、破砕液を遠心して沈殿を除去し、得られた上澄み液は組換えＤＡＡＯ酵素を含む粗酵素液であった。
【0103】
酵素活性の検出方法：
１００μｌｐＨ ８．０リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム緩衝液（Ｄ－グルホシネート５０ｍｍｏｌ／Ｌと過酸化物酵素０．１ｍｇ／ｍｌを含む）、５０μｌ発色剤（６０μｇ／ｍｌ ２，４，６－トリブロモ－３－ヒドロキシ安息香酸と１ｍｇ／ｍｌ ４－アミノアンチピリン）、５０μｌのＤＡＡＯ酵素を加え、５１０ｎｍにおいて紫外吸収を検出してＨ２Ｏ２濃度を測定し、ＰＰＯの濃度を計算し、酵素活性を計算した。
１００μｌｐＨ ８．０リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム緩衝液（Ｄ－グルホシネート５０ｍｍｏｌ／Ｌと過酸化物酵素０．１ｍｇ／ｍｌを含む）、５０μｌ発色剤（６０μｇ／ｍｌ ２，４，６－トリブロモ－３－ヒドロキシ安息香酸と１ｍｇ／ｍｌ ４－アミノアンチピリン）、５０μｌのＤＡＡＯ酵素を加え、５１０ｎｍにおいて紫外吸収を検出してＨ２Ｏ２濃度を測定し、ＰＰＯの濃度を計算し、酵素活性を計算した。
【0104】
単位酵素活性の定義：
特定の反応条件（３０℃）で、１分間あたり１μｍｏｌ ＰＰＯを生成するのに必要な酵素量である。
特定の反応条件（３０℃）で、１分間あたり１μｍｏｌ ＰＰＯを生成するのに必要な酵素量である。
【0105】
以下の実施例で使用されるＤＡＡＯ酵素粗酵素液の調製方法はいずれも以上の方法を採用する。
【0106】
（実施例６）アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得と発現
【0107】
枯草菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＫＢ２９０）（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＢＡＮ０５９９２．１）由来のシクロペンタノール デヒドロゲナーゼ（Ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子配列に従って、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を完全合成した。
【0108】
ＬＢ液体培地の組成：
ペプトン１０ ｇ／Ｌ、イーストパウダー５ ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ ｇ／Ｌを脱イオン水で溶解した後に定容し、１２１℃で２０分間滅菌しておいた。
ペプトン１０ ｇ／Ｌ、イーストパウダー５ ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ ｇ／Ｌを脱イオン水で溶解した後に定容し、１２１℃で２０分間滅菌しておいた。
【0109】
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子をｐＥＴ２８ａに連結し、酵素切断部位はＮｄｅＩ ＆ ＨｉｎｄＩＩＩであり、酵素が連結されたベクターを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換受容性細胞に形質転換し、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む操作された菌株を得た。アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する操作された菌株をストリークプレートにより活性化した後、シングルコロニーを５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む５ ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃で１２時間振とう培養した。２％の接種量で５０ ｍｌの同様に５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む新鮮ＬＢ液体培地に接種し、３７℃でＯＤ６００が０．８程度に達するまで振とうし、ＩＰＴＧを終濃度が０．５ｍＭになるまで加え、１８℃で１６時間誘導培養した。培養終了後、培養液を１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄み液を捨て、菌を集め、－２０℃の超低温冷蔵庫に保存しておいた。
【0110】
（実施例７）アルコールデヒドロゲナーゼ粗酵素液の調製及び酵素活性測定
【0111】
実施例６で集めた菌は、１０ｇの菌スラリーを５０ ｍｌ １００ｍｍ ｐＨ７．５リン酸アンモニウム緩衝液に加えて均一に撹拌し、５００ｂａｒで均一に破砕して粗酵素液とし、攪拌しながら１０％の凝集剤（終濃度２～２．５‰）を滴下し、５分間攪拌した後、４０００ｒｐｍで１０分間遠心して上澄み酵素液を得て、上澄みを取り酵素活性を測定した。
【0112】
酵素活性の検出方法：
３ｍｌの反応系で、２５℃条件下で、先に２８５０μｌ ｐＨ８．０の４００ｍｍイソプロパノール（１００ｍｍリン酸緩衝液調製）を加え、さらに５０μｌ ＮＡＤＰ＋（２５ｍｍ）を加え、紫外分光光度計をゼロにし、さらに１００μｌの１００倍に希釈した酵素液を加え、紫外分光光度計で３４０ｎｍでのＯＤ値を測定した。
３ｍｌの反応系で、２５℃条件下で、先に２８５０μｌ ｐＨ８．０の４００ｍｍイソプロパノール（１００ｍｍリン酸緩衝液調製）を加え、さらに５０μｌ ＮＡＤＰ＋（２５ｍｍ）を加え、紫外分光光度計をゼロにし、さらに１００μｌの１００倍に希釈した酵素液を加え、紫外分光光度計で３４０ｎｍでのＯＤ値を測定した。
【0113】
単位酵素活性の定義：
特定の反応条件（２５℃、ｐＨ７．０）で、１分間あたり１μｍｏｌ ＮＡＤＰＨを生成するのに必要な酵素量であり、１Ｕと定義される。
特定の反応条件（２５℃、ｐＨ７．０）で、１分間あたり１μｍｏｌ ＮＡＤＰＨを生成するのに必要な酵素量であり、１Ｕと定義される。
【0114】
以下の実施例で使用されるアルコールデヒドロゲナーゼ粗酵素液の調製方法はいずれも以上の方法を採用する。
【0115】
（実施例８）ＤＡＡＯ酵素とＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体を触媒とするＬ－グルホシネートの調製
【0116】
２００ｇ Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体菌（実施例１により調製された）をｐＨが８．０の５０ｍｍリン酸塩緩衝液に懸濁し、１Ｌになるまで定容し、低温高圧で均一に破砕し、遠心して沈殿を捨て、上澄みを残し、Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体粗酵素液を得た。
【0117】
Ｄ、Ｌ－グルホシネート８０ｇを秤量し、５０ｍｍ ｐＨ８．０のリン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム緩衝液で完全に溶解させ、２．５ｇ ４０万Ｕ／ｇのカタラーゼを加え、１５０ ｍｌの実施例５の方法で調製されたＤＡＡＯ酵素粗酵素液（１２Ｕ／ｍｌ）を加え、アンモニアでｐＨを８．０に調節し、５０ｍｍ ｐＨが８．０のリン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム緩衝液で１Lに定容した。２０℃の水浴で機械的に反応を攪拌し、１ＶＶＭで空気を通過させ（１分間あたり１倍反応体積の空気を通す）、１ｍｌ消泡剤を加えて泡立ちを防止し、イオンペアＨＰＬＣでＰＰＯの生成濃度を検出し、同時にプレカラム誘導体化高速液体クロマトグラフィーで残りのＬ－グルホシネートの量及びｅｅ値を検出し、ｅｅ値が９９％を超えた時点で反応を止めた。
【0118】
４等分した上記の反応液５０ｍｌを取り、それぞれ塩化アンモニウム０．５４ｇ、ＮＡＤＰ＋０．４ｍｇ、イソプロパノール０．７３ｇを加え、実施例７の方法で調製されたアルコールデヒドロゲナーゼ（３００Ｕ／ｍｌ）１ｍｌを加え、それぞれＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体粗酵素液１ｍｌを加え、アンモニア水でｐＨを８．５に調節し、水浴中で磁気攪拌しながら反応温度を３７℃に制御し、イオンペアＨＰＬＣでＰＰＯの残留濃度を検出し、同時にプレカラム誘導体化高速液体クロマトグラフィーで系内のＬ－グルホシネートの量とｅｅ値を検出した。反応終了時のデータは表５に示される。
【0119】
反応終了後（１８時間）の生成物におけるＤ－グルホシネートとＬ－グルホシネートのＨＰＬＣ分析結果は図２（図面ではＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体１－４（ＬｓＧｌｕＤＨ－Ａ１６６Ｇ－Ｖ３７６Ａ）を例にして図示）に示され、ただし、保持時間が１３．８２０分であるのはＬ－グルホシネートであり、保持時間が１２．４６９分であるＤ－グルホシネートはほぼ検出されなかった。ラセミ体のグルホシネート標準品（上海阿拉丁生化科技株式会社から購入）のＭａｒｆｅｙ試薬プレカラム誘導体化ＨＰＬＣは図１に示されている（Ｌ－グルホシネートの保持時間は１３．６８３分であり、Ｄ－グルホシネートの保持時間は１２．０１６分である）。この実施例で調製された生成物の成分と標準品におけるＬ－グルホシネートのピークが現れる時間はほぼ一致する。また、得られた製品を酸化処理し、濃縮し、カラムで精製し、再結晶して純Ｌ－グルホシネートを得て、旋光度測定により［ａ］Ｄ２５＝＋２８．２°（Ｃ＝１、１Ｎ ＨＣｌ）（従来技術においてＵＳ４３８９４８８にＬ－グルホシネート旋光度が記載されている）、この実施例ではＬ－グルホシネートが得られたことを示す。
【0120】
反応終了後（１８時間）の反応液のイオンペアＨＰＬＣ分析結果は図５に示され、ただし、ＰＰＯのピーク位置にはピークが見られず、３．８２８分はグルホシネートのピーク位置である。ＰＰＯ標準品（本標準品は発明者の自作品であり、調製方法は文献ＵＳ８０１７７９７Ｂに参照し、図６は対応するマススペクトルである）のイオンペアＨＰＬＣは図４に示され、ただし、ＰＰＯ標準品の保持時間は９．５２０分であった。ラセミ体のグルホシネート標準品（上海阿拉丁生化科技株式会社から購入）のイオンペアＨＰＬＣは図３に示され、ただし、ラセミ体のグルホシネート標準品の保持時間は３．８２９分であった。このように、この実施例ではＰＰＯは最終的に反応して完全に転換され、その生成物であるグルホシネートのピークが現れる時間は標準品のピークが現れる時間とほぼ一致している。
【0121】
上記の結果図は、いずれもＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼの突然変異体１－４（ＬｓＧｌｕＤＨ－Ａ１６６Ｇ－Ｖ３７６Ａ）を例に挙げているが、発明者は他の全ての突然変異について実験を行い、いずれも本発明のこれらの突然変異が上記反応に関与する際に基質を触媒でき、かついずれも正確な産物を生成することを検証した。
【0122】
【表5】
【0123】
（比較例）
【0124】
実施例１と同様な方法により、ＣＮ１０８５８８０４５Ａに開示されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｐｕｔｉｄａ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿７４２８３６．１）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＰｐＧｌｕＤＨと略称する）の突然変異体酵素を得て、実施例２に記載されている方法により比酵素活性を測定し、結果は表６に示される。
【0125】
【表6】
【0126】
表６から、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｐｕｔｉｄａ由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼの相同部位を突然変異させた突然変異体は、本発明で得られた突然変異体よりも比酵素活性が著しく低く、全ての二重部位突然変異体の効果が単一突然変異の突然変異体の効果よりも優れているわけではないことがわかる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】