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特許7583413間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法、間葉系幹細胞、細胞集団、並びに医薬組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-06
(45)【発行日】2024-11-14
(54)【発明の名称】間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法、間葉系幹細胞、細胞集団、並びに医薬組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20241107BHJP
C12N 1/04 20060101ALI20241107BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775 ZNA
C12N1/04
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2022027560
(22)【出願日】2022-02-25
(62)【分割の表示】P 2017547848の分割
【原出願日】2016-10-27
(65)【公開番号】P2022060520
(43)【公開日】2022-04-14
【審査請求日】2022-03-28
(31)【優先権主張番号】P 2015211051
(32)【優先日】2015-10-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２６年度、国立研究開発法人科学技術振興機構（Ｊ１３－１２）「羊膜間葉系幹細胞の細胞製剤化と治療応用」に係る委託事業、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】510094724
【氏名又は名称】国立研究開発法人国立循環器病研究センター
(73)【特許権者】
【識別番号】000000941
【氏名又は名称】株式会社カネカ
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】山原 研一
(72)【発明者】
【氏名】喜田 悠太
(72)【発明者】
【氏名】稲生 渓太
(72)【発明者】
【氏名】小林 明
【審査官】小田 浩代
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／０２５８１０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１４－５０１１１０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／０３４２１２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００８－２２０３３４（ＪＰ，Ａ）
【文献】Yang ZX. et al.，CD106 identifies a subpopulation of mesenchymal stem cells with unique immunomodulatory properties，PLoS One，2013年，Vol. 8:e59354，pp. 1-12
【文献】Moon, J. H. et al.，Successful vitrification of human amnion-derived mesenchymal stem cells，Hum. Reprod.，2008年，Vol. 23(8)，pp. 1760-1770
【文献】Li Q. et al.，Cancer stem cells and cell size: A causal link?，Semin Cancer Biol，2015年，Vol. 35，pp. 191-199
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００－ ５／２８
Ａ６１Ｋ３５／００－３５／７６８
Ａ６１Ｐ １／００－３７／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を凍結保存液に懸濁し、得られた懸濁液を２℃／分以下の凍結速度で－３０℃以下の温度になるまで下げて凍結し、その後－３０℃以下の温度にて凍結状態を３０日間以上維持した後、解凍することによって、間葉系幹細胞を選別する選別工程、及び
前記選別工程で得られた間葉系幹細胞を含む細胞集団を、培養及び継代する工程
を含み、
前記懸濁液は、４質量％～１０質量％のジメチルスルホキシド、及び２質量％～１３質量％のヒドロキシルエチルデンプン及び３質量％～９質量％のアルブミンを含有し、
前記培養及び継代する工程を経た間葉系幹細胞において、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が前記凍結前よりも増加しており、
前記培養及び継代する工程を経た間葉系幹細胞が、ＣＤ１０６陰性であることを特徴とする、
前記細胞集団の製造方法。
【請求項2】
前記凍結状態を－１３０℃以下の温度にて維持する、請求項１に記載の細胞集団の製造方法。
【請求項3】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで胎児付属物を酵素処理することにより、増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を取得する細胞集団取得工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の細胞集団の製造方法。
【請求項4】
前記細胞集団取得工程で得られた細胞集団を培養する工程をさらに含む、請求項３に記載の細胞集団の製造方法。
【請求項5】
前記メタロチオネインファミリー遺伝子が、ＭＴ１Ｅ、ＭＴ１Ｆ、ＭＴ１Ｇ、ＭＴ１Ｈ、ＭＴ１Ｘ及びＭＴ２Ａからなる群から少なくとも１種選択される、請求項１から４の何れか一項に記載の細胞集団の製造方法。
【請求項6】
前記選別された間葉系幹細胞が、ＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である、請求項１から５の何れか一項に記載の細胞集団の製造方法。
【請求項7】
前記細胞集団において、ＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である前記間葉系幹細胞の平均比率が９０％以上である、請求項６に記載の細胞集団の製造方法。
【請求項8】
前記選別された間葉系幹細胞が、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１ｂ陰性、ＣＤ７９ａｌｐｈａ陰性、及びＨＬＡ－ＤＲ陰性である、請求項１から７の何れか一項に記載の細胞集団の製造方法。
【請求項9】
前記選別された間葉系幹細胞の比増殖速度が、０．３０（１／ｄａｙ）以上である、請求項１から８の何れか一項に記載の細胞集団の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞治療応用に適した間葉系幹細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ)を調製することを含む間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞集団の製造方法に関する。さらに本発明は、間葉系幹細胞、間葉系幹細胞を含む細胞集団（間葉系幹細胞集団）、並びに上記間葉系幹細胞又は上記細胞集団を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
間葉系間質細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ）ともよばれる間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織などに存在することが報告されている体性幹細胞であり、骨、軟骨及び脂肪などに分化する能力を有する。間葉系幹細胞は、細胞治療における有望な細胞ソースとして注目され、最近では、胎盤、臍帯、卵膜などの胎児付属物にも存在することが明らかになっている。
【0003】
間葉系幹細胞は、分化能以外に免疫抑制能を有することで注目されており、骨髄間葉系幹細胞を用いた、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、及び炎症性腸疾患であるクローン病に対する実用化が進んでいる。間葉系幹細胞として種々の細胞が知られており、なかでも、羊膜間葉系幹細胞は免疫抑制効果が高く、また細胞ソースである羊膜が非侵襲的に採取可能であることから、様々な免疫関連疾患を対象とした細胞治療への応用が期待されている（特許文献１）。
【0004】
特許文献１には、羊膜間葉系細胞組成物の製造方法及び凍結保存方法、並びに治療剤について記載されている。また、特許文献２には、サイトカインの産生能が高いシート状細胞培養物の製造方法が記載されており、その中で、シート状細胞培養物を製造する際に、細胞を凍結及び解凍するステップを設けることでシート状細胞培養物のサイトカイン産生能が高まることが述べられている。また、特許文献３には、多能性間葉系幹細胞の中から、フローサイトメトリーを用いて、高い増殖能力（継代数、コロニー形成効率）を有する多能性間葉系幹細胞を選別する方法が記載されている。また、特許文献４には、（Ａ）哺乳動物の羊膜から間葉系細胞の細胞集団を採取するステップと、（Ｂ）前記間葉系細胞の細胞集団について、（ｂ１）フローサイトメーターを用いて前方散乱光及び側方散乱光を検出し、二次元分布図を作成し、（ｂ２）前記二次元分布図上に、四角形の３分割ゲートを設定することにより選択された細胞を分取するステップと、（Ｃ）前記分取された細胞を継代培養するステップとを含む、羊膜間葉系幹細胞集団を調製する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２０１５－６１５２０号公報
【文献】特開２０１５－１５９６３号公報
【文献】特表２０１４－５０１１１０号公報
【文献】国際公開ＷＯ２０１３／０７７４２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明者らの予備的な検討において、間葉系幹細胞はその増殖性が低い（比増殖速度が低い）ために、細胞製剤化に必要な細胞を大量かつ迅速に調製・製造することが必ずしも容易ではないことが分かった。しかしながら、特許文献１には、間葉系幹細胞の中から特定の優れた特長を有する間葉系幹細胞を選択的に調製すること、具体的には、細胞製剤を大量かつ迅速に製造するために有用な、比増殖速度が高い間葉系幹細胞を取得することについて、一切記載されていない。また、特許文献２及び３には、細胞製剤を大量かつ迅速に製造するために有用な、比増殖速度が高い間葉系幹細胞を取得することについても、一切記載されていない。特許文献４には羊膜間葉系細胞の細胞集団から高い増殖能と分化能を有する羊膜間葉系幹細胞集団を調製することが記載されているが、フローサイトメトリーにより細胞を分取する方法である。特許文献４には、羊膜間葉系幹細胞集団中に長軸・短軸の大きな細胞集団と長軸・短軸の小さな細胞集団が存在すること、並びに上記２種類の細胞の物理的刺激又は化学的刺激に対する耐性が異なることについては記載も示唆もない。
【0007】
以上のように、これまで、特定の細胞集団の中からサイトカイン産性能や継代数、コロニー形成効率が優れた細胞を取得する試みは行われている。しかしながら、間葉系幹細胞の中から、間葉系幹細胞の物理的刺激又は化学的刺激による処理を経て、細胞製剤を大量かつ迅速に製造するために有用である比増殖速度が高い間葉系幹細胞を大量かつ迅速に製造するという発想や試みはこれまでなされていない。
【0008】
本発明は、細胞製剤を大量かつ迅速に製造するために有用な、比増殖速度が高い間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞集団の製造方法、上記間葉系幹細胞、上記間葉系幹細胞を含む細胞集団（間葉系幹細胞集団）、並びに上記間葉系幹細胞又は上記細胞集団を含む医薬組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、間葉系幹細胞には、増殖速度が相違する２種類以上の細胞が存在すること、これらの細胞は、物理的刺激又は化学的刺激に対する耐性が異なること、そして上記の２種類以上の間葉系幹細胞を含む細胞集団を物理的刺激又は化学的刺激により処理することによって、増殖速度が低い間葉系幹細胞を淘汰しうること、換言すれば、増殖速度が低い間葉系幹細胞を死滅させるか、又はその増殖性（比増殖速度）を著しく低下させうる（すなわち、その細胞を増えにくくすることができる）ことを見出した。さらに、本発明者らは、増殖性が高い間葉系幹細胞の特性として、ＣＤ１０６陰性であり、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加していることを特定した。
【0010】
これらの知見に基づいて、本発明者らは、増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を物理的刺激又は化学的刺激により処理することによって、相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞の生細胞を選別・取得できること、相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞の特性が、ＣＤ１０６陰性であり、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加していること、或いは、その相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞の含有率を高めうることを見出した。しかも、その相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞を多く含有する細胞集団は、比増殖速度が高く、細胞の大量かつ迅速な生産に極めて好適であること、そして、その細胞（細胞集団）を培養・増幅することにより、細胞製剤を大量かつ迅速に製造しうることを見出した。
本発明は、上述した着眼点や発想、及び上述の得られた知見に基づき、完成したものである。
本発明は、上述した着眼点や発想、及び上述の得られた知見に基づき、完成したものである。
【0011】
すなわち、本明細書によれば、以下の発明が提供される。
［１］ 間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、
増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を物理的刺激又は化学的刺激により処理することによって、相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞を選別する選別工程を含み、
選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞が、ＣＤ１０６陰性であり、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が前記物理的刺激又は化学的刺激による処理前よりも増加していることを特徴とする、前記細胞集団の製造方法。
［２］ 前記増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を物理的刺激により処理することが、前記細胞集団を凍結した後に解凍することである、［１］に記載の細胞集団の製造方法。
［３］ 前記増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を物理的刺激により処理することが、前記細胞集団を凍結保存液に懸濁し、得られた懸濁液を凍結して凍結状態を維持し、解凍する工程を含む、［１］又は［２］に記載の細胞集団の製造方法。
［４］ 前記凍結状態を２日間以上維持する、［３］に記載の細胞集団の製造方法。
［５］ 前記選別工程で得られた間葉系幹細胞を含む細胞集団を、培養及び／又は継代する工程をさらに含む、［１］から［４］の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
［６］ 胎児付属物を酵素処理することにより、増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を取得する細胞集団取得工程をさらに含む、［１］から［５］の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
［７］ 前記細胞集団取得工程で得られた細胞集団を培養する工程をさらに含む、［６］に記載の細胞集団の製造方法。
［８］ 前記メタロチオネインファミリー遺伝子が、ＭＴ１Ｅ、ＭＴ１Ｆ、ＭＴ１Ｇ、ＭＴ１Ｈ、ＭＴ１Ｘ及びＭＴ２Ａからなる群から少なくとも１種選択される、［１］から［７］の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
［９］ 前記選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞が、ＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である、［１］から［８］の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
［１０］ 前記細胞集団において、ＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である前記間葉系幹細胞の平均比率が９０％以上である［９］に記載の細胞集団の製造方法。
［１１］ 前記選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞が、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１ｂ陰性、ＣＤ７９ａｌｐｈａ陰性、及びＨＬＡ－ＤＲ陰性である、［１］から［１０］の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
［１２］ 前記選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞の比増殖速度が、０．１４（１／ｄａｙ）以上である、［１］から［１１］の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
［１３］ 前記選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞の浮遊状態での平均直径が、相対的に増殖能が低い間葉系幹細胞の浮遊状態での平均直径の８０％以下である、［１］から［１１］の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
［１４］ ＣＤ１０６陰性であり、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加している、間葉系幹細胞。
［１５］ 前記メタロチオネインファミリー遺伝子が、ＭＴ１Ｅ、ＭＴ１Ｆ、ＭＴ１Ｇ、ＭＴ１Ｈ、ＭＴ１Ｘ及びＭＴ２Ａからなる群から少なくとも１種選択される、［１４］に記載の間葉系幹細胞。
［１６］ 前記間葉系幹細胞が、ＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である、［１４］又は［１５］に記載の間葉系幹細胞。
［１７］ 前記間葉系幹細胞が、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１ｂ陰性、ＣＤ７９ａｌｐｈａ陰性、及びＨＬＡ－ＤＲ陰性である、［１４］から［１６］の何れか一に記載の間葉系幹細胞。
［１８］ 前記間葉系幹細胞の比増殖速度が、０．１４（１／ｄａｙ）以上である、［１４］から［１７］の何れか一に記載の間葉系幹細胞。
［１９］ 前記間葉系幹細胞の浮遊状態での平均直径が、相対的に増殖能が低い間葉系幹細胞の浮遊状態での平均直径の８０％以下である、［１４］から［１８］の何れか一に記載の間葉系幹細胞。
［２０］ 間葉系幹細胞を含む細胞集団であって、
前記間葉系幹細胞が、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加しており、且つ、ＣＤ１０６陰性である、前記細胞集団。
［２１］ 前記細胞集団において、ＣＤ１０６陽性である前記間葉系幹細胞の比率が５％未満である、［２０］に記載の細胞集団。
［２２］ 前記細胞集団において、ＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である前記間葉系幹細胞の平均比率が９０％以上である、［２０］又は［２１］に記載の細胞集団。
［２３］ ［１４］から［１９］の何れか一に記載の間葉系幹細胞あるいは［２０］から［２２］の何れか一に記載の細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物。
［２４］ ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量が１０９個／ｋｇ体重以下である、［２３］に記載の医薬組成物。
［２５］ 免疫関連疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、膠原病、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、又はアトピー性皮膚炎から選択される疾患の治療剤である、［２３］又は［２４］に記載の医薬組成物。
［１］ 間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、
増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を物理的刺激又は化学的刺激により処理することによって、相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞を選別する選別工程を含み、
選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞が、ＣＤ１０６陰性であり、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が前記物理的刺激又は化学的刺激による処理前よりも増加していることを特徴とする、前記細胞集団の製造方法。
［２］ 前記増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を物理的刺激により処理することが、前記細胞集団を凍結した後に解凍することである、［１］に記載の細胞集団の製造方法。
［３］ 前記増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を物理的刺激により処理することが、前記細胞集団を凍結保存液に懸濁し、得られた懸濁液を凍結して凍結状態を維持し、解凍する工程を含む、［１］又は［２］に記載の細胞集団の製造方法。
［４］ 前記凍結状態を２日間以上維持する、［３］に記載の細胞集団の製造方法。
［５］ 前記選別工程で得られた間葉系幹細胞を含む細胞集団を、培養及び／又は継代する工程をさらに含む、［１］から［４］の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
［６］ 胎児付属物を酵素処理することにより、増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を取得する細胞集団取得工程をさらに含む、［１］から［５］の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
［７］ 前記細胞集団取得工程で得られた細胞集団を培養する工程をさらに含む、［６］に記載の細胞集団の製造方法。
［８］ 前記メタロチオネインファミリー遺伝子が、ＭＴ１Ｅ、ＭＴ１Ｆ、ＭＴ１Ｇ、ＭＴ１Ｈ、ＭＴ１Ｘ及びＭＴ２Ａからなる群から少なくとも１種選択される、［１］から［７］の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
［９］ 前記選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞が、ＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である、［１］から［８］の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
［１０］ 前記細胞集団において、ＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である前記間葉系幹細胞の平均比率が９０％以上である［９］に記載の細胞集団の製造方法。
［１１］ 前記選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞が、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１ｂ陰性、ＣＤ７９ａｌｐｈａ陰性、及びＨＬＡ－ＤＲ陰性である、［１］から［１０］の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
［１２］ 前記選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞の比増殖速度が、０．１４（１／ｄａｙ）以上である、［１］から［１１］の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
［１３］ 前記選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞の浮遊状態での平均直径が、相対的に増殖能が低い間葉系幹細胞の浮遊状態での平均直径の８０％以下である、［１］から［１１］の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
［１４］ ＣＤ１０６陰性であり、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加している、間葉系幹細胞。
［１５］ 前記メタロチオネインファミリー遺伝子が、ＭＴ１Ｅ、ＭＴ１Ｆ、ＭＴ１Ｇ、ＭＴ１Ｈ、ＭＴ１Ｘ及びＭＴ２Ａからなる群から少なくとも１種選択される、［１４］に記載の間葉系幹細胞。
［１６］ 前記間葉系幹細胞が、ＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である、［１４］又は［１５］に記載の間葉系幹細胞。
［１７］ 前記間葉系幹細胞が、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１ｂ陰性、ＣＤ７９ａｌｐｈａ陰性、及びＨＬＡ－ＤＲ陰性である、［１４］から［１６］の何れか一に記載の間葉系幹細胞。
［１８］ 前記間葉系幹細胞の比増殖速度が、０．１４（１／ｄａｙ）以上である、［１４］から［１７］の何れか一に記載の間葉系幹細胞。
［１９］ 前記間葉系幹細胞の浮遊状態での平均直径が、相対的に増殖能が低い間葉系幹細胞の浮遊状態での平均直径の８０％以下である、［１４］から［１８］の何れか一に記載の間葉系幹細胞。
［２０］ 間葉系幹細胞を含む細胞集団であって、
前記間葉系幹細胞が、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加しており、且つ、ＣＤ１０６陰性である、前記細胞集団。
［２１］ 前記細胞集団において、ＣＤ１０６陽性である前記間葉系幹細胞の比率が５％未満である、［２０］に記載の細胞集団。
［２２］ 前記細胞集団において、ＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である前記間葉系幹細胞の平均比率が９０％以上である、［２０］又は［２１］に記載の細胞集団。
［２３］ ［１４］から［１９］の何れか一に記載の間葉系幹細胞あるいは［２０］から［２２］の何れか一に記載の細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物。
［２４］ ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量が１０９個／ｋｇ体重以下である、［２３］に記載の医薬組成物。
［２５］ 免疫関連疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、膠原病、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、又はアトピー性皮膚炎から選択される疾患の治療剤である、［２３］又は［２４］に記載の医薬組成物。
【0012】
［２６］ ［１］から［１３］の何れか一に記載の製造方法により得られる、間葉系幹細胞。
［２７］ 医薬組成物の製造のための、［１４］から［１９］の何れか一に記載の間葉系幹細胞あるいは［２０］から［２２］の何れか一に記載の細胞集団の使用。
［２８］ 医薬組成物が、ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量が１０９個／ｋｇ体重以下である医薬組成物である、［２７］に記載の使用。
［２９］ 医薬組成物が、免疫関連疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、膠原病、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、又はアトピー性皮膚炎から選択される疾患の治療剤である、［２７］又は［２８］に記載の使用。
［３０］ 疾患の治療において使用するための、［１４］から［１９］の何れか一に記載の間葉系幹細胞あるいは［２０］から［２２］の何れか一に記載の細胞集団。
［３１］ ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量が１０９個／ｋｇ体重以下である、［３０］に記載の間葉系幹細胞あるいは細胞集団。
［３２］ 疾患が、免疫関連疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、膠原病、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、又はアトピー性皮膚炎から選択される疾患である、［３０］又は［３１］に記載の間葉系幹細胞あるいは細胞集団。
［３３］ ［１４］から［１９］の何れか一に記載の間葉系幹細胞あるいは［２０］から［２２］の何れか一に記載の細胞集団を、治療を必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療方法。
［３４］ ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量が１０９個／ｋｇ体重以下である、［３３］に記載の疾患の治療法。
［３５］ 疾患が、免疫関連疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、膠原病、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、又はアトピー性皮膚炎から選択される疾患である、［３３］又は［３４］に記載の疾患の治療方法。
［３６］ ［１４］から［１９］の何れか一に記載の間葉系幹細胞と、媒体とを含む、組成物。
［３７］ ［２０］から［２２］の何れか一に記載の細胞集団と、媒体とを含む、組成物。
［２７］ 医薬組成物の製造のための、［１４］から［１９］の何れか一に記載の間葉系幹細胞あるいは［２０］から［２２］の何れか一に記載の細胞集団の使用。
［２８］ 医薬組成物が、ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量が１０９個／ｋｇ体重以下である医薬組成物である、［２７］に記載の使用。
［２９］ 医薬組成物が、免疫関連疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、膠原病、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、又はアトピー性皮膚炎から選択される疾患の治療剤である、［２７］又は［２８］に記載の使用。
［３０］ 疾患の治療において使用するための、［１４］から［１９］の何れか一に記載の間葉系幹細胞あるいは［２０］から［２２］の何れか一に記載の細胞集団。
［３１］ ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量が１０９個／ｋｇ体重以下である、［３０］に記載の間葉系幹細胞あるいは細胞集団。
［３２］ 疾患が、免疫関連疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、膠原病、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、又はアトピー性皮膚炎から選択される疾患である、［３０］又は［３１］に記載の間葉系幹細胞あるいは細胞集団。
［３３］ ［１４］から［１９］の何れか一に記載の間葉系幹細胞あるいは［２０］から［２２］の何れか一に記載の細胞集団を、治療を必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療方法。
［３４］ ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量が１０９個／ｋｇ体重以下である、［３３］に記載の疾患の治療法。
［３５］ 疾患が、免疫関連疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、膠原病、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、又はアトピー性皮膚炎から選択される疾患である、［３３］又は［３４］に記載の疾患の治療方法。
［３６］ ［１４］から［１９］の何れか一に記載の間葉系幹細胞と、媒体とを含む、組成物。
［３７］ ［２０］から［２２］の何れか一に記載の細胞集団と、媒体とを含む、組成物。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、比増殖速度が高い間葉系幹細胞（細胞集団）を得ることができ、これにより細胞製剤（医薬組成物）を大量かつ迅速に製造することができる。例えば、培養１バッチあたり２．３×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上の細胞を調製・製造しうる。さらに本発明によれば、凍結－解凍に対する耐性が向上した間葉系幹細胞（細胞集団）を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明するが、下記の説明は本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が下記の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も本発明の範囲に含まれる。
【0016】
［１］用語の説明
本明細書における「胎児付属物」は、卵膜、胎盤、臍帯及び羊水を指す。さらに「卵膜」は、胎児の羊水を含む胎嚢であり、内側から羊膜、絨毛膜及び脱落膜からなる。このうち、羊膜と絨毛膜は胎児を起源とする。「羊膜」は、卵膜の最内層にある血管に乏しい透明薄膜を指す。羊膜の内層（上皮細胞層ともよばれる）は分泌機能のある一層の上皮細胞で覆われ羊水を分泌し、羊膜の外層（細胞外基質層ともよばれ、間質に相当する）は間葉系幹細胞を含む。
本明細書における「胎児付属物」は、卵膜、胎盤、臍帯及び羊水を指す。さらに「卵膜」は、胎児の羊水を含む胎嚢であり、内側から羊膜、絨毛膜及び脱落膜からなる。このうち、羊膜と絨毛膜は胎児を起源とする。「羊膜」は、卵膜の最内層にある血管に乏しい透明薄膜を指す。羊膜の内層（上皮細胞層ともよばれる）は分泌機能のある一層の上皮細胞で覆われ羊水を分泌し、羊膜の外層（細胞外基質層ともよばれ、間質に相当する）は間葉系幹細胞を含む。
【0017】
本明細書における「間葉系幹細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ)」は、下記の定義を満たす幹細胞を指し、「間葉系間質細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ)」と区別なく用いられる。本明細書において、「間葉系幹細胞」は「ＭＳＣ」と記載されることがある。
【0018】
間葉系幹細胞の定義
i)標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す。
ii)表面抗原ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９ａｌｐｈａ、ＨＬＡ－ＤＲが陰性。
i)標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す。
ii)表面抗原ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９ａｌｐｈａ、ＨＬＡ－ＤＲが陰性。
【0019】
本明細書における「羊膜間葉系幹細胞」は、羊膜に由来する間葉系幹細胞を指し、「羊膜間葉系間質細胞」と区別なく用いられる。本明細書において、「羊膜間葉系幹細胞」は「羊膜ＭＳＣ」と記載されることがある。
【0020】
本明細書における「間葉系幹細胞集団」は、間葉系幹細胞を含む細胞集団を意味し、その形態は特に限定されず、例えば、細胞ペレット、細胞凝集塊、細胞浮遊液又は細胞懸濁液などが挙げられる。
【0021】
増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団とは、少なくとも、相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞及び相対的に増殖能が低い間葉系幹細胞を含む細胞集団を意味する。本発明者らは、上記の相対的に増殖能が低い間葉系幹細胞が、物理的刺激又は化学的刺激に対する耐性が相対的に低く、一方、上記の相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞が、物理的刺激又は化学的刺激に対する耐性が相対的に高いことを見出している。増殖能が異なる２種類の間葉系幹細胞が存在する場合において、相対的に増殖能が高い細胞のことを「相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞」と言い、相対的に増殖能が低い細胞のことを「相対的に増殖能が低い間葉系幹細胞」と言う。
【0022】
本明細書における「培養１バッチあたりの取得細胞数」は、１回の培養における、培養容器の単位表面積あたり、単位培養日数あたりの得られる細胞数を意味する。したがって、「培養１バッチあたりの取得細胞数」の単位は、（個／ｃｍ２／ｄａｙ）である。
【0023】
本明細書における「相対的に」とは、対応する相手と比べた場合の高低又は大小を意味する。例えば、増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団について、細胞を、増殖能を指標にして、増殖能が高い間葉系幹細胞と、増殖能が低い間葉系幹細胞とに分類する場合、前者の増殖能が高い間葉系幹細胞を、「相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞」と称し、後者の増殖能が低い間葉系幹細胞を、「相対的に増殖能が低い間葉系幹細胞」と称する。
【0024】
同様に、サイズが異なる細胞を含む細胞集団について、細胞を、サイズを指標にして、サイズが大きい細胞とサイズが小さい細胞とに分類する場合、前者のサイズが大きい細胞を、「相対的にサイズが大きい細胞」と称し、後者のサイズが小さい細胞を、「相対的にサイズが小さい細胞」と称する。
【0025】
本明細書における「増殖能」とは、細胞が細胞分裂を行うことにより、細胞数が増加する能力のことをいう。間葉系幹細胞集団における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖能は、比増殖速度を用いて評価することができる。比増殖速度の測定方法は本明細書中後記の通りである。
【0026】
［２］間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法
本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法は、増殖能が異なる間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞集団を物理的刺激又は化学的刺激により処理することによって、相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞を選別する選別工程を含む方法である。
本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法は、増殖能が異なる間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞集団を物理的刺激又は化学的刺激により処理することによって、相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞を選別する選別工程を含む方法である。
【0027】
「相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞を選別する」とは、相対的に増殖速度が低い間葉系幹細胞を淘汰すること、即ち、相対的に増殖速度が低い間葉系幹細胞を死滅させるか、又はその増殖性（比増殖速度）を著しく低下させることにより、間葉系幹細胞を含む細胞集団における相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞の比率が高まるというような状態が意図されるが、特にこの状態に限定されるものではない。
【0028】
増殖能が異なるＭＳＣを含む細胞集団とは、相対的に増殖能が高いＭＳＣと、相対的に増殖能が低いＭＳＣとを少なくとも含む細胞集団である。
【0029】
本発明の製造方法は、試料（例えば、羊膜などの胎児付属物など）を酵素処理することにより、増殖能が異なるＭＳＣを含む細胞集団を取得する細胞集団取得工程を含むものでもよい。
【0030】
羊膜は、上皮細胞層と細胞外基質層からなり、後者には羊膜ＭＳＣが含まれている。羊膜上皮細胞は、他の上皮細胞同様、特徴として上皮カドヘリン（Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ：ＣＤ３２４）及び上皮接着因子（ＥｐＣＡＭ：ＣＤ３２６）を発現しているのに対し、羊膜ＭＳＣはこれら上皮特異的表面抗原マーカーを発現しておらず、フローサイトメトリーで容易に区別可能である。上記の細胞集団取得工程は、羊膜を帝王切開により得る工程を含む工程でもよい。
【0031】
試料（例えば、羊膜などの胎児付属物など）の酵素処理は、好ましくは、試料の細胞外基質層に含まれるＭＳＣを遊離することができ、かつ試料の上皮細胞層を分解しない酵素（又はその組み合わせ）による処理である。かかる酵素としては、特に限定されないが、例えば、コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼを挙げることができる。金属プロテイナーゼとしては、非極性アミノ酸のＮ末端側を切断する金属プロテイナーゼであるサーモリシン及び／又はディスパーゼを挙げることができるが、特に限定されない。
【0032】
コラゲナーゼの濃度は、好ましくは５０ＣＤＵ／ｍｌ以上、より好ましくは７５ＣＤＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１００ＣＤＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１２５ＣＤＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１５０ＣＤＵ／ｍｌ以上である。また、コラゲナーゼの濃度は、特に限定されないが、例えば、１０００ＣＤＵ／ｍｌ以下、９００ＣＤＵ／ｍｌ以下、８００ＣＤＵ／ｍｌ以下、７００ＣＤＵ／ｍｌ以下、６００ＣＤＵ／ｍｌ以下、５００ＣＤＵ／ｍｌ以下、４００ＣＤＵ／ｍｌ以下、３００ＣＤＵ／ｍｌ以下である。ここで、ＣＤＵ（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）は、コラーゲンを基質として、３７℃、ｐＨ７．５において５時間に１μｍｏｌのロイシンに相当するアミノ酸及びペプチドを生成する酵素量と定義される。金属プロテイナーゼ（例えば、サーモリシン及び／又はディスパーゼ）の濃度は、好ましくは１００ＰＵ／ｍｌ以上、より好ましくは１２５ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１５０ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１７５ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは２００ＰＵ／ｍｌ以上である。また、金属プロテイナーゼの濃度は、好ましくは８００ＰＵ／ｍｌ以下、より好ましくは７００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは６００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは５００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは４００ＰＵ／ｍｌ以下である。ここで、ＰＵ（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｕｎｉｔ）は、乳酸カゼインを基質として３５℃、ｐＨ７．２において１分間に１μｇのチロシンに相当するアミノ酸及びペプチドを生成する酵素量と定義される。上記の酵素濃度の範囲において、試料の上皮細胞層に含まれる上皮細胞の混入を防止しながら、細胞外基質層に含まれるＭＳＣを効率よく遊離させることができる。コラゲナーゼの濃度を５０ＣＤＵ／ｍｌ未満、又は金属プロテイナーゼの濃度を１００ＣＤＵ／ｍｌ未満とすると、細胞外基質層の消化が不十分となり、ＭＳＣの回収率が著しく低下することがある。金属プロテイナーゼの濃度を８００ＣＤＵ／ｍｌより大きくすると、上皮細胞層の分解に伴い消化液に上皮細胞が混入するため、相対的にＭＳＣの回収率が低下することがある。コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼの好ましい濃度の組み合わせは、酵素処理後の試料の顕微鏡観察や、取得した細胞のフローサイトメトリーにより決定することができる。また、上皮細胞をほとんど含まないＭＳＣを、後述する物理的刺激又は化学的刺激により処理することが好ましい。
【0033】
生細胞を効率的に回収する観点から、コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼを組み合わせて試料を同時一括に処理することが好ましい。この場合の金属プロテイナーゼとしては、サーモリシン及び／又はディスパーゼを使用することができるが、これらに限定されない。コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼを含有する酵素液を用いて試料を一回のみ処理することにより、ＭＳＣを簡便に取得することができる。また、同時一括に処理することにより、細菌やウィルス等のコンタミネーションのリスクを低減することができる。
【0034】
試料の酵素処理は、生理食塩水やハンクス平衡塩溶液等の洗浄液を用いて洗浄した試料を酵素液に浸漬し、撹拌手段によって撹拌しながら処理することが好ましい。かかる撹拌手段としては、試料の細胞外基質層に含まれるＭＳＣを効率よく遊離させる観点から、例えば、スターラー又はシェーカーを使用することができるが、これらに限定されない。撹拌速度は、特に限定されないが、スターラー又はシェーカーを用いた場合、例えば、５ｒｐｍ以上、１０ｒｐｍ以上、２０ｒｐｍ以上、３０ｒｐｍ以上、４０ｒｐｍ以上又は５０ｒｐｍ以上である。また、撹拌速度は、特に限定されないが、スターラー又はシェーカーを用いた場合、例えば、１００ｒｐｍ以下、９０ｒｐｍ以下、８０ｒｐｍ以下、７０ｒｐｍ以下又は６０ｒｐｍ以下である。酵素処理時間は、特に限定されないが、例えば、１０分以上、２０分以上、３０分以上、４０分以上、５０分以上又は６０分以上である。また、酵素処理時間は、特に限定されないが、例えば、６時間以下、５時間以下、４時間以下、３時間以下、２時間以下、１１０分以下、１００分以下、９０分以下、８０分以下又は７０分以下である。酵素処理温度は、特に限定されないが、例えば、１５℃以上、１６℃以上、１７℃以上、１８℃以上、１９℃以上、２０℃以上、２１℃以上、２２℃以上、２３℃以上、２４℃以上、２５℃以上、２６℃以上、２７℃以上、２８℃以上、２９℃以上、３０℃以上、３１℃以上、３２℃以上、３３℃以上、３４℃以上、３５℃以上又は３６℃以上である。また、酵素処理温度は、特に限定されないが、例えば、４０℃以下、３９℃以下、３８℃以下又は３７℃以下である。
【0035】
本発明の製造方法において、所望により、遊離したＭＳＣを含む酵素溶液をフィルターにより濾過することができる。遊離した細胞のみがフィルターを通過し、分解されなかった上皮細胞層はフィルターを通過できずにフィルター上に残るため、遊離したＭＳＣを容易に回収することができるだけでなく、細菌やウィルス等のコンタミネーションのリスクも低減することができる。フィルターとしては、特に限定されないが、例えば、メッシュフィルターを挙げることができる。メッシュフィルターのポアサイズ（メッシュの大きさ）は、特に限定されないが、例えば、４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上、１００μｍ以上、１１０μｍ以上、１２０μｍ以上、１３０μｍ以上又は１４０μｍ以上である。また、メッシュフィルターのポアサイズは、特に限定されないが、例えば、２００μｍ以下、１９０μｍ以下、１８０μｍ以下、１７０μｍ以下、１６０μｍ以下又は１５０μｍ以下である。濾過速度に関しては特に限定されないが、メッシュフィルターのポアサイズを上記の範囲とすることにより、ＭＳＣを含む酵素溶液を自然落下により濾過することができ、これにより細胞生存率の低下を防止することができる。
【0036】
メッシュフィルターの材質としては、ナイロンが好ましく用いられる。研究用として汎用されるＦａｌｃｏｎセルストレーナーなどの４０μｍ、７０μｍ又は１００μｍのナイロンメッシュフィルターを含有するチューブが利用可能である。また、血液透析などで使用されている医療用メッシュクロス（ナイロン及びポリエステル）が利用できる。さらに、体外循環時に使用される動脈フィルター（ポリエステルメッシュフィルター、ポアサイズ：４０μｍ以上１２０μｍ以下）も利用可能である。他の材質、例えば、ステンレスメッシュフィルター等も用いることが可能である。
【0037】
ＭＳＣをフィルター通過させる場合、自然落下（自由落下）が好ましい。ポンプ等を用いた吸引など強制的なフィルター通過も可能であるが、細胞に損傷を与えることを避けるため、できるだけ弱い圧力とすることが望ましい。
【0038】
フィルターを通したＭＳＣは、倍量又はそれ以上の培地又は平衡塩緩衝液で濾液を希釈した後、遠心分離により回収することができる。平衡塩緩衝液としては、ダルベッコリン酸バッファー（ＤＰＢＳ）、アール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸バッファー（ＰＢＳ）等を用いることができるが、これらに限定されない。
【0039】
上記の細胞集団取得工程で得られた細胞集団は、所望により、前記選別工程の前に、培養により増殖させることができる。すなわち、本発明の製造方法は、前記細胞集団取得工程で得られた細胞集団を培養する工程をさらに含む製造方法でもよい。かかる培養（前培養）は、プラスチックデッシュ又はフラスコにて、３％以上５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境にて行うことが好ましい。また、細胞集団取得工程で得られた細胞集団を培養する工程においては、細胞を１回以上継代してもよい。
【0040】
上記の培養に用いる培地は、特に限定されないが、例えば、αＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＤＭＥＭ、ＢＭＥ、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ１０６６、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｍ１９９、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）、無血清培地、或いはこれらを基礎とする培地を挙げることができる。無血清培地としては、例えば、ＳＴＫ１、ＳＴＫ２（ＤＳファーマバイオメディカル社）、ＥＸＰＲＥＰ ＭＳＣ Ｍｅｄｉｕｍ（バイオミメティクスシンパシーズ社）、Ｃｏｒｎｉｎｇ ｓｔｅｍｇｒo ヒト間葉系幹細胞培地（コーニング社）などが挙げられるが、特に限定されない。これらの培地には、特に限定されないが、必要に応じて、アルブミン、血清、血清代替試薬、増殖因子、増殖因子の安定化試薬（ヘパリンなど）等、他の成分を添加してもよい。アルブミンの場合、０．０５％より多く５％以下の濃度が好ましい。血清の場合、５％以上の濃度が好ましい。
【0041】
本発明の製造方法は、増殖能が異なるＭＳＣを含む細胞集団を物理的刺激又は化学的刺激（好ましくは、物理的刺激）により処理することによって、相対的に増殖能が高いＭＳＣを選別する選別工程を含む。
【0042】
物理的刺激又は化学的刺激の種類は、相対的に増殖能が高いＭＳＣと、相対的に増殖能が低いＭＳＣとを分離できるものであれば特に限定されない。例えば、相対的に増殖能が高いＭＳＣの当該刺激に対する耐性の方が、相対的に増殖能が低いＭＳＣの当該刺激に対する耐性よりも高い刺激を挙げることができるが、特に限定されない。
【0043】
物理的刺激としては、凍結及び解凍、加熱、濾過、遠心分離、電気泳動、電圧印加、加圧、減圧、浸透圧変化、紫外線照射、超音波照射などを挙げることができるが、特に限定されない。複数の物理的刺激を個々に又は組み合わせて適用することができるが、これに限定されない。
【0044】
化学的刺激としては、遺伝子導入、細胞毒性化合物による処理、酸又は塩基によるｐＨ変化処理などを挙げることができるが、特に限定されない。複数の化学的刺激を個々に又は組み合わせて適用することができるが、これに限定されない。
【0045】
物理的刺激の好ましい一例としては、増殖能が異なるＭＳＣを含む細胞集団を凍結した後に解凍することが挙げられる。また、物理的刺激のより好ましい態様としては、増殖能が異なるＭＳＣを含む細胞集団を凍結保存液に懸濁し、得られた懸濁液を凍結して凍結状態を維持し、解凍することが挙げられる。
【0046】
化学的刺激の好ましい一例としては、ＣＤ１０６陰性であるＭＳＣを含む細胞集団に、メタロチオネインファミリー遺伝子の塩基配列を含むベクターを用いて遺伝子導入することが挙げられる。遺伝子導入のより具体的な態様としては、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等）、或いは非ウイルスベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ、人工染色体ベクター等）を用いた遺伝子導入が挙げられるが、これらに限定されない。
【0047】
上記の凍結用保存液は、相対的に増殖能が高いＭＳＣの生存率を高める観点から、所定濃度の多糖類を含有することが好ましい。多糖類の好ましい濃度は、例えば、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、５質量％以上、６質量％以上、７質量％以上、８質量％以上、９質量％以上、１０質量％以上、１１質量％以上又は１２質量％以上である。また、多糖類の好ましい濃度は、例えば、４０質量％以下、３５質量％以下、３０質量％以下、２５質量％以下、２０質量％以下、１９質量％以下、１８質量％以下、１７質量％以下、１６質量％以下、１５質量％以下、１４質量％以下又は１３質量％以下である。多糖類としては、例えば、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）又はデキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ４０など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。
【0048】
上記の凍結用保存液は、相対的に増殖能が高いＭＳＣを効率よく選別する観点から、所定濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有することが好ましい。ＤＭＳＯの好ましい濃度は、例えば、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、５質量％以上、６質量％以上、７質量％以上、８質量％以上又は９質量％以上である。また、ＤＭＳＯの好ましい濃度は、例えば、２０質量％以下、１９質量％以下、１８質量％以下、１７質量％以下、１６質量％以下、１５質量％以下、１４質量％以下、１３質量％以下、１２質量％以下、１１質量％以下又は１０質量％以下である。
【0049】
上記の凍結用保存液は、相対的に増殖能が高いＭＳＣの生存率を高める観点から、０質量％より多い所定濃度のアルブミンを含有することが好ましい。アルブミンの好ましい濃度は、例えば、０．５質量％以上、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、５質量％以上、６質量％以上、７質量％以上又は８質量％以上である。また、アルブミンの好ましい濃度は、例えば、４０質量％以下、３５質量％以下、３０質量％以下、２５質量％以下、２０質量％以下、１５質量％以下、１０質量％以下又は９質量％以下である。アルブミンとしては、例えば、ウシ血清アルブミン、マウスアルブミン、ヒトアルブミン等を挙げることができるが、これに限定されない。
【0050】
増殖能が異なるＭＳＣを含む細胞集団を凍結するための手段は、特に限定されないが、例えば、プログラムフリーザー、ディープフリーザー、液体窒素への浸漬などが挙げられる。凍結する際の好ましい温度は、例えば、－３０℃以下、－４０℃以下、－５０℃以下、－６０℃以下、－７０℃以下、－８０℃以下、－９０℃以下、－１００℃以下、－１１０℃以下、－１２０℃以下又は－１３０℃以下である。また、凍結する際の好ましい温度は、例えば、－１９６℃（液体窒素温度）以上、－１９０℃以上、－１８０℃以上、－１７０℃以上、－１６０℃以上、－１５０℃以上又は－１４０℃以上である。凍結する際の好ましい凍結速度は、例えば、－１℃／分、－２℃／分、－３℃／分、－４℃／分、－５℃／分、－６℃／分、－７℃／分、－８℃／分、－９℃／分、－１０℃／分、－１１℃／分、－１２℃／分、－１３℃／分、－１４℃／分又は－１５℃／分である。かかる凍結手段としてプログラムフリーザーを用いた場合、例えば、－２℃／分以上－１℃／分以下の凍結速度で－５０℃以上－３０℃以下の間の温度（例えば、－４０℃）まで温度を下げ、さらに－１１℃／分以上－９℃／分以下（例えば、－１０℃／分）の凍結速度で－１００℃以上－８０℃以下の温度（例えば、－９０℃）まで温度を下げることができる。
【0051】
上記の凍結手段により凍結する際、上記の細胞集団は、任意の保存容器に入った状態で凍結されてよい。かかる保存容器としては、例えば、クライオチューブ、クライオバイアル、凍結用バッグ、輸注バッグなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0052】
上記の凍結された細胞集団は、相対的に増殖能が高いＭＳＣを効率よく選別する観点から、凍結状態を維持できる温度にて所定期間維持することが好ましい。凍結状態を維持する際の好ましい温度の上限は、例えば、－１３０℃以下、－１４０℃以下又は－１５０℃以下である。また、凍結状態を維持する際の好ましい温度の下限は、例えば、－１９６℃（液体窒素温度）以上、－１９０℃以上、－１８０℃以上、－１７０℃以上又は－１６０℃以上である。細胞質のガラス転移温度は－１３０℃であるため、凍結状態を維持する際の温度を－１３０℃より大きくすると、細胞内に氷晶ができ、細胞生存率が低下することがある。凍結状態にて維持する好ましい期間の下限は、例えば、１２時間以上、１６時間以上、２０時間以上、２４時間以上、３０時間以上、３６時間以上、４２時間以上、２日間以上、３日間以上、４日間以上、５日間以上、６日間以上、７日間以上、８日間以上、９日間以上、１０日間以上、１１日間以上、１２日間以上、１３日間以上、１４日間以上、１５日間以上、１６日間以上、１７日間以上、１８日間以上、１９日間以上、２０日間以上、２１日間以上、２２日間以上、２３日間以上、２４日間以上、２５日間以上、２６日間以上、２７日間以上、２８日間以上、２９日間以上、３０日間以上又は３１日間以上である。また、凍結状態にて維持する期間の上限は、特に限定されないが、例えば、２０年以下、１０年以下、５年以下、４年以下、３年以下、２年以下、１年以下、１１か月以下、１０か月以下、９か月以下、８か月以下、７か月以下、６か月以下、５か月以下、４か月以下、３か月以下、２か月以下又は１か月以下である。
【0053】
上記の凍結された細胞集団の解凍手段としては、例えば、凍結温度よりも高い温度の媒体（例えば、固体、液体、気体）への接触（例えば、浸漬）が挙げられるが、これに限定されない。上記媒体の温度の下限は、特に限定されないが、例えば、１℃以上、２℃以上、３℃以上、４℃以上、５℃以上、６℃以上、７℃以上、８℃以上、９℃以上、１０℃以上、１１℃以上、１２℃以上、１３℃以上、１４℃以上、１５℃以上、１６℃以上、１７℃以上、１８℃以上、１９℃以上、２０℃以上、２１℃以上、２２℃以上、２３℃以上、２４℃以上、２５℃以上、２６℃以上、２７℃以上、２８℃以上、２９℃以上、３０℃以上、３１℃以上、３２℃以上、３３℃以上、３４℃以上、３５℃以上又は３６℃以上である。また、上記媒体の温度の上限は、特に限定されないが、例えば、５０℃以下、４９℃以下、４８℃以下、４７℃以下、４６℃以下、４５℃以下、４４℃以下、４３℃以下、４２℃以下、４１℃以下、４０℃以下、３９℃以下、３８℃以下又は３７℃以下である。解凍に要する時間は、特に限定されないが、例えば、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、６０秒（１分）、７０秒、８０秒、９０秒、１００秒、１１０秒、１２０秒（２分）、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分又は１０分である。例えば、ポリプロピレン製の２ｍｌ容量クライオチューブ（外径：１３．５ｍｍ）に入った１ｍｌの凍結状態の細胞懸濁液を、３７℃の恒温槽にて解凍する場合、２分以内に解凍できる。また、例えば、ポリオレフィン製の２５ｍｌ容量の凍結用バッグ（外寸：８１ｍｍ×１２１．５ｍｍ）に入った２０ｍｌの凍結状態の細胞懸濁液を、３７℃の恒温槽にて解凍する場合、５分以内に解凍できる。急速に解凍することにより、相対的に増殖能が高いＭＳＣの生存率を向上させることができる。
【0054】
上記した選別工程で得られたＭＳＣを含む細胞集団は、さらに培養及び／又は継代することができ、これにより、相対的に増殖能が高いＭＳＣ（後述される、比増殖速度が高いＭＳＣ）を大量に得ることができ、さらに得られた細胞集団における相対的に増殖能が高いＭＳＣの含有率を高めることができる。すなわち、本発明の製造方法は、前記選別工程で得られたＭＳＣを含む細胞集団を、培養及び／又は継代する工程をさらに含む製造方法でもよい。前記選別工程の後に培養及び／又は継代して得られた間葉系幹細胞集団における、前記の相対的に増殖能が高いＭＳＣの含有率は、１０％以上であり、好ましくは２０％以上であり、さらに好ましくは３０％以上であり、さらに好ましくは４０％以上であり、さらに好ましくは５０％以上であり、さらに好ましくは６０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９８％以上であり、さらに好ましくは９９％以上であり、特に好ましくは１００％である。尚、刺激処理前の細胞集団における相対的に増殖能が高いＭＳＣの含有率は、ドナーによって異なるが、本発明者らは、後記の実施例に示す通り、当該含有率は概して１％以下であることを見出している。
【0055】
上記した選別工程で得られたＭＳＣの培養（本培養）は、例えば、以下のような工程にて行うことができる。まず、凍結－解凍処理後の融解した細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。次に、プラスチック製培養容器に細胞を播種し、３％以上５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境にて、培地を用いてコンフルエント率９５％以下となるように培養する。上記の培地としては、例えば、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＢＭＥ、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ１０６６、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ、ＩＭＤＭ、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｍ１９９、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）、無血清培地、或いはこれらを基礎とする培地を挙げることができるが、これらに限定されない。これらの培地には、特に限定されないが、必要に応じて、アルブミン、血清、血清代替試薬、増殖因子、増殖因子の安定化試薬等の追加成分を添加してもよい。上記のような培養（本培養）により取得した細胞は、１回培養した細胞である。
【0056】
上記の１回培養した細胞は、例えば、以下のようにさらに継代し、培養することができる。まず、１回培養した細胞を、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）にて処理した後にトリプシンにて処理してプラスチック製培養容器から剥離させる。次に、得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。最後に、プラスチック製培養容器に細胞を播種し、３％以上５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境にて、培地を用いてコンフルエント率９５％以下となるように培養する。上記の培地としては、例えば、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＢＭＥ、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ１０６６、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ、ＩＭＤＭ、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｍ１９９、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）、無血清培地、或いはこれらを基礎とする培地を挙げることができるが、これらに限定されない。これらの培地には、特に限定されないが、必要に応じて、アルブミン、血清、血清代替試薬、増殖因子、増殖因子の安定化試薬等の追加成分を添加してもよい。上記のような継代及び培養により取得した細胞は、１回継代した細胞である。同様の継代及び培養を行うことにより、Ｎ回継代した細胞を取得することができる（Ｎは１以上の整数を示す）。継代回数Ｎの下限は、細胞を大量に製造する観点から、例えば、１回以上、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、６回以上、７回以上、８回以上又は９回以上であることが好ましい。また、継代回数Ｎの上限は、細胞の老化を抑える観点から、例えば、５０回以下、４５回以下、４０回以下、３５回以下、３０回以下、２５回以下又は２０回以下であることが好ましい。
【0057】
上記した本発明の方法において選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞は、ＣＤ１０６陰性であり、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が前記物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞よりも増加していることを特徴とする。上記した相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞の特性については、本明細書中において後記する。
【0058】
［３］本発明における間葉系幹細胞の特性
本発明における間葉系幹細胞の特性は、ＣＤ１０６陰性であり、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加している。したがって、本発明における間葉系幹細胞（相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞）は、ＣＤ１０６陰性であり、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加している間葉系幹細胞である。
本発明における間葉系幹細胞の特性は、ＣＤ１０６陰性であり、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加している。したがって、本発明における間葉系幹細胞（相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞）は、ＣＤ１０６陰性であり、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加している間葉系幹細胞である。
【0059】
本発明において、ＭＳＣの発現マーカーは、当該技術分野において公知の任意の検出方法により検出することができる。上記発現マーカーとしては、例えば、細胞表面抗原又は細胞内発現タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。発現マーカーの具体例としては、ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ１）、ＣＤ１０５（Ｅｎｄｏｇｌｉｎ）、ＣＤ７３（Ｅｃｔｏ－５’－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ）、ＣＤ９０（Ｔｈｙ－１）、ＣＤ４５（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｃｏｍｍｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＤ３４（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＤ１１ｂ（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ αＭ）、ＣＤ７９ａｌｐｈａ（Ｍｂ－１）、ＨＬＡ－ＤＲ（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ＤＲ）、ＣＤ３２４（Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）及びＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）などを挙げることができる。
【0060】
本発明の間葉系幹細胞は、ＣＤ１０６陰性である。本発明の間葉系幹細胞は、好ましくは、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１ｂ陰性、ＣＤ７９ａｌｐｈａ陰性、及びＨＬＡ－ＤＲ陰性である。
【0061】
上記した発現マーカーを検出する方法としては、例えばフローサイトメトリー又は細胞染色が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光標識抗体を用いるフローサイトメトリーにおいて、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。細胞染色において、着色するか若しくは蛍光を発する細胞が顕微鏡下にて観察された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。細胞染色は、抗体を使用する免疫細胞染色であってもよく、抗体を使用しない非免疫細胞染色であってもよい。
【0062】
上記した発現マーカーを検出するタイミングは、特に限定されないが、例えば、物理的刺激又は化学的刺激により処理する前（例えば、生体試料から細胞を分離した直後、前培養の直後、選別工程の直前など）、物理的刺激又は化学的刺激により処理した後（例えば、選別工程の直後、本培養の直後、本培養の後にＮ回継代した直後（Ｎは１以上の整数を示す）など）、又は医薬品組成物として製剤化する前が挙げられる。
【0063】
本発明の間葉系幹細胞は、好ましくは、ＳＡ－β－Ｇａｌ（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ；老化関連βガラクトシダーゼ）陰性である。本発明者らは、後記の実施例に示す通り、相対的に増殖能が低いＭＳＣはＳＡ－β－Ｇａｌ陽性の老化細胞であるのに対して、相対的に増殖能が高いＭＳＣはＳＡ－β－Ｇａｌ陰性の非老化細胞であることを見出している。ＭＳＣがＳＡ－β－Ｇａｌ陰性であることは、当該細胞が、相対的に増殖能が高いＭＳＣであることを意味する。
【0064】
上記したＳＡ－β－Ｇａｌの検出は、例えば、ＳＡ－β－Ｇａｌの活性を検出することにより行なうことができ、具体的には、ＳＡ－β－Ｇａｌ特異的基質（例えば、発色性基質又は蛍光性基質）を用いた細胞染色により行なうことができる。ＳＡ－β－Ｇａｌ特異的基質を用いた細胞染色において、細胞質内が染色された細胞が光学顕微鏡下にて観察された場合、当該細胞はＳＡ－β－Ｇａｌについて「陽性」と判定される。
【0065】
上記したＳＡ－β－Ｇａｌを検出するタイミングは、特に限定されないが、例えば、物理的刺激又は化学的刺激により処理する前（例えば、生体試料から細胞を分離した直後、前培養の直後、選別工程の直前など）、物理的刺激又は化学的刺激により処理した後（例えば、選別工程の直後、本培養の直後、本培養の後にＮ回継代した直後（Ｎは１以上の整数を示す）など）、又は医薬品組成物として製剤化する前が挙げられる。
【0066】
本発明の間葉系幹細胞においては、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加している。メタロチオネインは、システイン残基を多く含む低分子量（約６，５００）の金属結合タンパク質であり、多くの生物種で存在が確認されており、哺乳類で４種の亜型が存在（ＭＴ－Ｉ，ＭＴ－ＩＩ，ＭＴ－ＩＩＩ，ＭＴ－ＩＶ）する。メタロチオネイン－Ｉ及び－ＩＩの生理機能としては、重金属の毒性軽減、重金属の蓄積、亜鉛や銅の代謝調節、抗酸化作用、フリーラジカルに対するスカベンジ作用、制癌剤の副作用軽減及び制癌剤耐性などが知られている。本発明においては、物理的刺激又は化学的刺激による処理、具体的には例えば、凍結－解凍処理を通じてメタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加することから、間葉系幹細胞の増殖性の向上、並びに間葉系幹細胞の凍結－解凍に対する耐性の向上が達成されていることが推察されるが、本発明は上記の理論又はメカニズムにより何ら限定されるものではない。
【0067】
好ましくは、メタロチオネインファミリー遺伝子としては、ＭＴ１Ｅ、ＭＴ１Ｆ、ＭＴ１Ｇ、ＭＴ１Ｈ、ＭＴ１Ｘ及びＭＴ２Ａからなる群から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、又は６種全てを挙げることができる。
【0068】
ＭＴ１Ｅは、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子、或いは配列番号７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子である。
【0069】
ＭＴ１Ｆは、配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子、或いは配列番号８に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子である。
【0070】
ＭＴ１Ｇは、配列番号３に示す塩基配列からなる遺伝子、或いは配列番号９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子である。
【0071】
ＭＴ１Ｈは、配列番号４に示す塩基配列からなる遺伝子、或いは配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子である。
【0072】
ＭＴ１Ｘは、配列番号５に示す塩基配列からなる遺伝子、或いは配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子である。
【0073】
ＭＴ２Ａは、配列番号６に示す塩基配列からなる遺伝子、或いは配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子である。
【0074】
本発明の間葉系幹細胞においては、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加していれば、特に限定されないが、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２．０倍以上、２．１倍以上、又は２．２倍以上増大していることが好ましい。なお、ここで言うメタロチオネインファミリー遺伝子の発現量は、後述されるいずれかの方法により測定したものでもよいし、それら以外の方法で測定したものでもよく、測定方法は特に限定されない。
【0075】
上記したメタロチオネインファミリー遺伝子の発現量の測定は、メタロチオネインファミリー遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）又はメタロチオネインファミリータンパク質を指標として行なうことができる。具体的には、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量の測定は、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロットハイブリダーゼーション、マイクロアレイ上でハイブリダイゼーションを行うマイクロアレイ解析、又は免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ－ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ））等により行うことができる。
【0076】
上記したマイクロアレイ上でハイブリダイゼーションを行うマイクロアレイ解析は、具体的には、以下の手順（１）～（４）にて行なうことができる。
（１）プラスチック製培養容器から、セルスクレーパー（コーニング社製）を用いて非酵素的に接着細胞を剥離し、遠心分離により細胞を回収する。ＲＮＡ安定化試薬（ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））を用いて細胞を安定保存した後、ＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製））を用いてトータルＲＮＡを抽出、精製する。
（２）精製したトータルＲＮＡを鋳型として用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、さらに合成されたｃＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによりｃＲＮＡに転写してビオチン標識を行う。
（３）ビオチン標識ｃＲＮＡをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＧｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ ２．０ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）上で１６時間のハイブリダイゼーションを行う。ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて洗浄し、フィコエリスリン染色後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にてスキャンを行い、ＡＧＣＣ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｃｏｍｍａｎｄ Ｃｏｎｓｏｌｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて画像解析し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて数値化する。
（４）２アレイ分の数値データファイルを、解析ソフトＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（アジレント・テクノロジー社製）を用いて比較解析する。間葉系幹細胞のサンプルでのＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ値を、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞のサンプル（コントロール）でのＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ値で割ることにより、Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値を算出する。
（１）プラスチック製培養容器から、セルスクレーパー（コーニング社製）を用いて非酵素的に接着細胞を剥離し、遠心分離により細胞を回収する。ＲＮＡ安定化試薬（ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））を用いて細胞を安定保存した後、ＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製））を用いてトータルＲＮＡを抽出、精製する。
（２）精製したトータルＲＮＡを鋳型として用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、さらに合成されたｃＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによりｃＲＮＡに転写してビオチン標識を行う。
（３）ビオチン標識ｃＲＮＡをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＧｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ ２．０ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）上で１６時間のハイブリダイゼーションを行う。ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて洗浄し、フィコエリスリン染色後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にてスキャンを行い、ＡＧＣＣ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｃｏｍｍａｎｄ Ｃｏｎｓｏｌｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて画像解析し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて数値化する。
（４）２アレイ分の数値データファイルを、解析ソフトＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（アジレント・テクノロジー社製）を用いて比較解析する。間葉系幹細胞のサンプルでのＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ値を、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞のサンプル（コントロール）でのＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ値で割ることにより、Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値を算出する。
【0077】
実施例にて詳述するが、本発明の間葉系幹細胞は、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞と比較して、凍結－解凍に対する耐性が向上している。凍結－解凍に対する耐性の評価は、例えば、凍結保存及び解凍した後の細胞の生存率を指標として行なうことができる。具体的には、凍結－解凍に対する耐性の評価は、凍結保存及び解凍した後の細胞を所定温度（例えば、２５℃（室温）、３７℃（体温））にて所定時間（例えば、０、１又は２時間）静置した後、トリパンブルーにて染色し、血球計算盤を用いて細胞生存率を計測することにより行うことができるが、これに限定されない。
【0078】
本発明者らは、相対的に増殖能が高いＭＳＣの浮遊状態での平均直径が、相対的に増殖能が低いＭＳＣの浮遊状態での平均直径より小さい場合があることを見出している。ＭＳＣの浮遊状態での直径の測定方法は、特に限定されないが、例えば位相差顕微鏡観察下にて測定することができるし、自動セルカウンターにて計測することもできる。ＭＳＣの浮遊状態での平均直径は、上記の測定方法により測定した複数個の細胞の直径の平均値として算出される。
【0079】
本発明における相対的に増殖能が高いＭＳＣの浮遊状態での直径は、例えば、相対的に増殖能が低いＭＳＣの浮遊状態での平均直径の８０％以下、７５％以下、７０％以下又は６５％以下であってもよいが、特に限定されない。また、相対的に増殖能が高いＭＳＣの浮遊状態での平均直径は、例えば、相対的に増殖能が低いＭＳＣの浮遊状態での直径の４５％以上、５０％以上又は５５％以上であってもよいが、特に限定されない。
【0080】
本発明における相対的に増殖能が高いＭＳＣの浮遊状態での平均直径は、例えば、２８μｍ以下、２７μｍ以下、２６μｍ以下、２５μｍ以下、２４μｍ以下、２３μｍ以下、２２μｍ以下、２１μｍ以下、２０μｍ以下、１９μｍ以下、１８μｍ以下、１７μｍ以下、１６μｍ以下、１５μｍ以下又は１４μｍ以下であってもよいが、特に限定されない。また、相対的に増殖能が高いＭＳＣの浮遊状態での平均直径は、例えば、８μｍ以上、９μｍ以上又は１０μｍ以上であってもよいが、特に限定されない。
【0081】
本発明者らは、相対的に増殖能が高いＭＳＣの接着状態での長軸の平均長さが、相対的に増殖能が低いＭＳＣの接着状態での長軸の平均長さより小さい傾向にある場合があること見出しているが、このことに特に限定されない。また、本発明者らは、相対的に増殖能が高いＭＳＣの接着状態での短軸の平均長さが、相対的に増殖能が低いＭＳＣの接着状態での短軸の平均長さより小さい傾向にある場合があること見出しているが、このことに特に限定されない。ＭＳＣの接着状態での長軸又は短軸の長さの測定方法は、特に限定されないが、例えば、プラスチック製培養容器に接着させた細胞の顕微鏡観察により測定することができる。ＭＳＣの接着状態での長軸又は短軸の平均長さは、上記の測定方法により測定した複数個の細胞の長軸又は短軸の長さの平均値として算出される。
【0082】
本発明における相対的に増殖能が高いＭＳＣの接着状態での長軸の平均長さは、例えば、相対的に増殖能が低いＭＳＣの接着状態での長軸の平均長さの８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下又は４０％以下であってもよいが、特に限定されない。また、相対的に増殖能が高いＭＳＣの接着状態での長軸の平均長さは、例えば、相対的に増殖能が低いＭＳＣの接着状態での長軸の平均長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上又は３５％以上であってもよいが、特に限定されない。
【0083】
本発明における相対的に増殖能が高いＭＳＣの接着状態での長軸の平均長さは、例えば、１３μｍ以上、１４μｍ以上、１５μｍ以上又は１６μｍ以上であってもよいが、特に限定されない。また、相対的に増殖能が高いＭＳＣの接着状態での長軸の平均長さは、例えば、４８μｍ以下、４６μｍ以下又は４４μｍ以下であってもよいが、特に限定されない。
【0084】
本発明における相対的に増殖能が高いＭＳＣの接着状態での短軸の平均長さは、例えば、相対的に増殖能が低いＭＳＣの接着状態での短軸の平均長さの８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下又は４０％以下であってもよいが、特に限定されない。また、相対的に増殖能が高いＭＳＣの接着状態での短軸の平均長さは、例えば、相対的に増殖能が低いＭＳＣの接着状態での短軸の平均長さの２５％以上、３０％以上又は３５％以上であってもよいが、特に限定されない。
【0085】
本発明における相対的に増殖能が高いＭＳＣの接着状態での短軸の平均長さは、例えば、４μｍ以上、５μｍ以上又は６μｍ以上であってもよいが、特に限定されない。また、相対的に増殖能が高いＭＳＣの接着状態での短軸の平均長さは、例えば、１４μｍ以下、１３μｍ以下又は１２μｍ以下であってもよいが、特に限定されない。
【0086】
本発明者らは、相対的に増殖能が高いＭＳＣの比増殖速度が、相対的に増殖能が低いＭＳＣの比増殖速度より高いことを見出している。すなわち、相対的に増殖能が高いＭＳＣは、相対的に比増殖速度が高いＭＳＣであり、相対的に増殖能が低いＭＳＣは、相対的に比増殖速度が低いＭＳＣである。ＭＳＣの増殖能は、比増殖速度を用いて評価することができる。比増殖速度は、単位時間あたりの細胞数の増加として定義され、比増殖速度：μ＝ｌｎ（ｍｔ２／ｍｔ１）／（ｔ２－ｔ１） で表される。ここで、ｔ１及びｔ２は培養日数、ｍｔ１ はｔ１日目における細胞数、ｍｔ２はｔ２日目における細胞数である（ただし、ｔ２＞ｔ１）。したがって、比増殖速度の単位は、（個／個／ｄａｙ）＝（１／ｄａｙ）である。
【0087】
本発明における相対的に増殖能が高いＭＳＣの比増殖速度は、好ましくは、相対的に増殖能が低いＭＳＣの比増殖速度の１．１倍以上であり、より好ましくは１．２倍以上であり、さらに好ましくは１．３倍以上であり、さらに好ましくは１．４倍以上であり、さらに好ましくは１．５倍以上であり、さらに好ましくは１．６倍以上であり、さらに好ましくは１．７倍以上であり、さらに好ましくは１．８倍以上であり、さらに好ましくは１．９倍以上であり、さらに好ましくは２．０倍以上であり、さらに好ましくは２．１倍以上であり、さらに好ましくは２．２倍以上であり、さらに好ましくは２．３倍以上であり、さらに好ましくは２．４倍以上であり、さらに好ましくは２．５倍以上であり、さらに好ましくは２．６倍以上であり、さらに好ましくは２．７倍以上であり、さらに好ましくは２．８倍以上であり、さらに好ましくは２．９倍以上であり、さらに好ましくは３．０倍以上であり、さらに好ましくは３．１倍以上であり、さらに好ましくは３．２倍以上であり、さらに好ましくは３．３倍以上であり、さらに好ましくは３．４倍以上であり、特に好ましくは３．５倍以上である。また、相対的に増殖能が高いＭＳＣの比増殖速度は、特に限定されないが、例えば、相対的に増殖能が低いＭＳＣの比増殖速度の５．０倍以下、４．５倍以下又は４．０倍以下である。
【0088】
本発明における相対的に増殖能が高いＭＳＣの比増殖速度は、０．０７（１／ｄａｙ）以上であり、好ましくは０．０８（１／ｄａｙ）以上であり、より好ましくは０．０９（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１０（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１１（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１２（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１３（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１４（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１５（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１６（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１７（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１８（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１９（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２０（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２１（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２２（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２３（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２４（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２５（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２６（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２７（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２８（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２９（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．３０（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．３１（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．３２（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．３３（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．３４（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．３５（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．３６（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．３７（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．３８（１／ｄａｙ）以上であり、特に好ましくは０．３９（１／ｄａｙ）以上である。また、相対的に増殖能が高いＭＳＣの比増殖速度は、特に限定されないが、例えば、０．６０（１／ｄａｙ）以下又は０．５０（１／ｄａｙ）以下である。
【0089】
本発明における相対的に増殖能が高いＭＳＣの継代可能回数は、１回以上、好ましくは２回以上、より好ましくは３回以上、さらに好ましくは４回以上、さらに好ましくは５回以上、さらに好ましくは６回以上、さらに好ましくは７回以上、さらに好ましくは８回以上、さらに好ましくは９回以上、さらに好ましくは１０回以上、さらに好ましくは１１回以上、さらに好ましくは１２回以上、さらに好ましくは１３回以上、さらに好ましくは１４回以上、さらに好ましくは１５回以上、さらに好ましくは１６回以上、さらに好ましくは１７回以上、さらに好ましくは１８回以上、さらに好ましくは１９回以上、さらに好ましくは２０回以上、さらに好ましくは２５回以上である。また、継代可能回数の上限は、特に限定されないが、例えば、５０回以下、４５回以下、４０回以下、３５回以下又は３０回以下である。
【0090】
本発明の製造方法によれば、相対的に増殖能が高いＭＳＣを得ることができ、これにより細胞製剤（医薬組成物）を大量かつ迅速に製造することができる。培養１バッチあたりの取得細胞数（単位表面積あたり、単位培養日数あたりの得られる細胞数）の下限は、播種細胞数、播種密度等によって異なるが、例えば、２．３×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、２．４×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、２．５×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、２．６×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、２．７×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、２．８×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、２．９×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、３．０×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、３．１×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上又は３．２×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上である。また、培養１バッチあたりの取得細胞数の上限は、特に限定されないが、例えば、４．０×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下、３．９×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下、３．８×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下、３．７×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下、３．６×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下、３．５×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下、３．４×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下又は３．３×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下である。
【0091】
本発明の間葉系幹細胞は、媒体と組み合わせた組成物として提供してもよい。媒体としては、好ましくは液体媒体（例えば、培地、又は後記する製薬上許容し得る媒体など）を使用することができる。
【0092】
［４］間葉系幹細胞を含む細胞集団
本発明によれば、間葉系幹細胞を含む細胞集団であって、前記間葉系幹細胞が、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加しており、且つ、ＣＤ１０６陰性である、前記細胞集団が提供される。
本発明によれば、間葉系幹細胞を含む細胞集団であって、前記間葉系幹細胞が、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加しており、且つ、ＣＤ１０６陰性である、前記細胞集団が提供される。
【0093】
前記細胞集団において、ＣＤ１０６陽性である前記間葉系幹細胞の比率は、５％未満であることが好ましく、４％未満であることがより好ましく、３％未満であることがさらに好ましく、２％未満であることがさらに好ましく、１％未満であることがさらに好ましく、０％でもよい。
【0094】
前記細胞集団において、ＣＤ１０６陰性である前記間葉系幹細胞の比率は、９５％以上であることが好ましく、９６％以上であることがより好ましく、９７％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがさらに好ましく、９９％以上であることがさらに好ましく、１００％でもよい。
【0095】
本発明の細胞集団は、少なくとも、ＣＤ９０陽性である間葉系幹細胞を含んでいてもよい。前記細胞集団において、ＣＤ９０陽性である間葉系幹細胞の比率は、７０％以上であることが好ましく、７５％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９１％以上であることがさらに好ましく、９２％以上であることがさらに好ましく、９３％以上であることがさらに好ましく、９４％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９６％以上であることがさらに好ましく、９７％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがさらに好ましく、９９％以上であることがさらに好ましく、１００％でもよい。
【0096】
本発明の細胞集団は、少なくとも、ＣＤ７３陽性である間葉系幹細胞を含んでいてもよい。前記細胞集団において、ＣＤ７３陽性である間葉系幹細胞の比率は、５５％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、６５％以上であることがさらに好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、７５％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、８５％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９６％以上であることがさらに好ましく、９７％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがさらに好ましく、９９％以上であることがさらに好ましく、１００％でもよい。
【0097】
前記細胞集団において、上記の発現マーカーについて陽性である細胞の比率を測定する方法としては、例えばフローサイトメトリーが挙げられるが、これに限定されない。蛍光標識抗体を用いるフローサイトメトリーにおいて、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。細胞集団における特定の発現マーカーについて陽性である間葉系幹細胞の比率は、以下の手順（１）～（３）にて算出することができる。
（１）測定結果を、縦軸に細胞数、横軸を抗体に標識された色素の蛍光強度としたヒストグラムで展開する。
（２）アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が０．１～１．０％となる蛍光強度を決定する。
（３）特定の発現マーカーに対する抗体で測定した総細胞のうち、上記（２）で決定した蛍光強度よりも蛍光強度が高い細胞の割合を算出する。
蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
また、前記細胞集団において、上記の発現マーカーについて陽性である細胞の比率を測定する他の方法としては、例えば細胞染色が挙げられるが、これに限定されない。細胞染色において、着色するか若しくは蛍光を発する細胞が顕微鏡下にて観察された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。顕微鏡を用いて同一拡大倍率にて細胞集団を観察し、視野内における全細胞数に対する陽性細胞数の比率を求めることにより、細胞集団における特定の発現マーカーが陽性である細胞の比率を決定することができる。細胞染色は、抗体を使用する免疫細胞染色であってもよく、抗体を使用しない非免疫細胞染色であってもよい。
（１）測定結果を、縦軸に細胞数、横軸を抗体に標識された色素の蛍光強度としたヒストグラムで展開する。
（２）アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が０．１～１．０％となる蛍光強度を決定する。
（３）特定の発現マーカーに対する抗体で測定した総細胞のうち、上記（２）で決定した蛍光強度よりも蛍光強度が高い細胞の割合を算出する。
蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
また、前記細胞集団において、上記の発現マーカーについて陽性である細胞の比率を測定する他の方法としては、例えば細胞染色が挙げられるが、これに限定されない。細胞染色において、着色するか若しくは蛍光を発する細胞が顕微鏡下にて観察された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。顕微鏡を用いて同一拡大倍率にて細胞集団を観察し、視野内における全細胞数に対する陽性細胞数の比率を求めることにより、細胞集団における特定の発現マーカーが陽性である細胞の比率を決定することができる。細胞染色は、抗体を使用する免疫細胞染色であってもよく、抗体を使用しない非免疫細胞染色であってもよい。
【0098】
本発明の細胞集団における相対的に増殖能が高いＭＳＣは、好ましくはＳＡ－β－Ｇａｌ（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ；老化関連βガラクトシダーゼ）陰性である。本発明者らは、後記の実施例に示す通り、相対的に増殖能が低いＭＳＣはＳＡ－β－Ｇａｌ陽性の老化細胞であるのに対して、相対的に増殖能が高いＭＳＣはＳＡ－β－Ｇａｌ陰性の非老化細胞であることを見出している。ＭＳＣがＳＡ－β－Ｇａｌ陰性であることは、当該細胞が、相対的に増殖能が高いＭＳＣであることを意味する。
【0099】
前記細胞集団において、ＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である間葉系幹細胞の平均比率は、９０％以上であることが好ましく、９１％以上であることがより好ましく、９２％以上であることがさらに好ましく、９３％以上であることがさらに好ましく、９４％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９６％以上であることがさらに好ましく、９７％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがさらに好ましく、９９％以上であることがさらに好ましく、９９．５％以上であることがさらに好ましく、１００％でもよい。
【0100】
前記細胞集団において、上記したＳＡ－β－Ｇａｌが陽性である細胞の平均比率を測定する方法としては、例えば、ＳＡ－β－Ｇａｌの活性を検出することにより行なうことができ、具体的には、ＳＡ－β－Ｇａｌ特異的基質（例えば、発色性基質又は蛍光性基質）を用いた細胞染色により行なうことができる。ＳＡ－β－Ｇａｌ特異的基質を用いた細胞染色において、細胞質内が染色された細胞が光学顕微鏡下にて観察された場合、当該細胞はＳＡ－β－Ｇａｌについて「陽性」と判定される。また、細胞集団におけるＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である細胞の平均比率（細胞集団におけるＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である細胞の比率の相加平均値）は、以下の手順（１）～（４）により算出される。
（１）プラスチック培養容器に接着した細胞集団を用意し、ＳＡ－β－Ｇａｌ特異的基質を用いた細胞染色を行う。
（２）細胞染色の後、同一プラスチック培養容器の少なくとも３箇所を、光学顕微鏡を用いて同一拡大倍率にて観察し、視野内における全細胞数とＳＡ－β－Ｇａｌ陽性細胞数とを測定する。
（３）各々の測定箇所について、以下の式により、細胞集団におけるＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である細胞の比率を算出する。
細胞集団におけるＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である細胞の比率＝１００－｛（ＳＡ－β－Ｇａｌ陽性細胞数／全細胞数）×１００（％）｝
（４）細胞集団におけるＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である細胞の平均比率（細胞集団におけるＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である細胞の比率の相加平均値）を算出する。
（１）プラスチック培養容器に接着した細胞集団を用意し、ＳＡ－β－Ｇａｌ特異的基質を用いた細胞染色を行う。
（２）細胞染色の後、同一プラスチック培養容器の少なくとも３箇所を、光学顕微鏡を用いて同一拡大倍率にて観察し、視野内における全細胞数とＳＡ－β－Ｇａｌ陽性細胞数とを測定する。
（３）各々の測定箇所について、以下の式により、細胞集団におけるＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である細胞の比率を算出する。
細胞集団におけるＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である細胞の比率＝１００－｛（ＳＡ－β－Ｇａｌ陽性細胞数／全細胞数）×１００（％）｝
（４）細胞集団におけるＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である細胞の平均比率（細胞集団におけるＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である細胞の比率の相加平均値）を算出する。
【0101】
本発明の細胞集団における間葉系幹細胞は、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加していれば、特に限定されないが、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２．０倍以上、２．１倍以上、又は２．２倍以上増大していることが好ましい。
【0102】
前記細胞集団において、上記したメタロチオネインファミリー遺伝子の発現量の測定は、メタロチオネインファミリー遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）又はメタロチオネインファミリータンパク質を指標として行なうことができる。具体的には、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量の測定は、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロットハイブリダーゼーション、マイクロアレイ上でハイブリダイゼーションを行うマイクロアレイ解析、又は免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ－ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ））等により行うことができる。
【0103】
上記したマイクロアレイ上でハイブリダイゼーションを行うマイクロアレイ解析は、具体的には、以下の手順（１）～（４）にて行なうことができる。
（１）プラスチック製培養容器から、セルスクレーパー（コーニング社製）を用いて非酵素的に接着細胞集団を剥離し、遠心分離により細胞集団を回収する。ＲＮＡ安定化試薬（ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））を用いて細胞集団を安定保存した後、ＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製））を用いてトータルＲＮＡを抽出、精製する。
（２）精製したトータルＲＮＡを鋳型として用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、さらに合成されたｃＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによりｃＲＮＡに転写してビオチン標識を行う。
（３）ビオチン標識ｃＲＮＡをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＧｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ ２．０ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）上で１６時間のハイブリダイゼーションを行う。ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて洗浄し、フィコエリスリン染色後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にてスキャンを行い、ＡＧＣＣ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｃｏｍｍａｎｄ Ｃｏｎｓｏｌｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて画像解析し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて数値化する。
（４）２アレイ分の数値データファイルを、解析ソフトＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（アジレント・テクノロジー社製）を用いて比較解析する。間葉系幹細胞のサンプルでのＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ値を、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞のサンプル（コントロール）でのＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ値で割ることにより、Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値を算出する。
（１）プラスチック製培養容器から、セルスクレーパー（コーニング社製）を用いて非酵素的に接着細胞集団を剥離し、遠心分離により細胞集団を回収する。ＲＮＡ安定化試薬（ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））を用いて細胞集団を安定保存した後、ＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製））を用いてトータルＲＮＡを抽出、精製する。
（２）精製したトータルＲＮＡを鋳型として用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、さらに合成されたｃＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによりｃＲＮＡに転写してビオチン標識を行う。
（３）ビオチン標識ｃＲＮＡをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＧｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ ２．０ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）上で１６時間のハイブリダイゼーションを行う。ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて洗浄し、フィコエリスリン染色後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にてスキャンを行い、ＡＧＣＣ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｃｏｍｍａｎｄ Ｃｏｎｓｏｌｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて画像解析し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて数値化する。
（４）２アレイ分の数値データファイルを、解析ソフトＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（アジレント・テクノロジー社製）を用いて比較解析する。間葉系幹細胞のサンプルでのＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ値を、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞のサンプル（コントロール）でのＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ値で割ることにより、Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値を算出する。
【0104】
好ましくは、本発明の細胞集団における間葉系幹細胞は、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、凍結－解凍に対する耐性が向上している。凍結－解凍に対する耐性の評価は、例えば、凍結保存及び解凍した後の細胞の生存率を指標として行なうことができる。具体的には、凍結－解凍に対する耐性の評価は、凍結保存及び解凍した後の細胞を所定温度（例えば、２５℃（室温）、３７℃（体温））にて所定時間（例えば、０、１又は２時間）静置した後、トリパンブルーにて染色し、血球計算盤を用いて細胞生存率を計測することにより行うことができるが、これに限定されない。
【0105】
本発明者らは、相対的に増殖能が高いＭＳＣの浮遊状態での平均直径が、相対的に増殖能が低いＭＳＣの浮遊状態での平均直径より小さい場合があることを見出している。ＭＳＣの浮遊状態での直径の測定方法は、特に限定されないが、例えば位相差顕微鏡観察下にて測定することができるし、自動セルカウンターにて計測することもできる。ＭＳＣの浮遊状態での平均直径は、上記の測定方法により測定した複数個の細胞の直径の平均値として算出される。
【0106】
本発明の間葉系幹細胞集団における相対的に増殖能が高いＭＳＣの浮遊状態での平均直径は、例えば、２８μｍ以下、２７μｍ以下、２６μｍ以下、２５μｍ以下、２４μｍ以下、２３μｍ以下、２２μｍ以下、２１μｍ以下、２０μｍ以下、１９μｍ以下、１８μｍ以下、１７μｍ以下、１６μｍ以下、１５μｍ以下又は１４μｍ以下であってもよいが、特に限定されない。また、相対的に増殖能が高いＭＳＣの浮遊状態での平均直径は、例えば、８μｍ以上、９μｍ以上又は１０μｍ以上であってもよいが、特に限定されない。
【0107】
本発明者らは、相対的に増殖能が高いＭＳＣの接着状態での長軸の平均長さが、相対的に増殖能が低いＭＳＣの接着状態での長軸の平均長さより小さい傾向にある場合があることを見出している。また、本発明者らは、相対的に増殖能が高いＭＳＣの接着状態での短軸の平均長さが、相対的に増殖能が低いＭＳＣの接着状態での短軸の平均長さより小さい傾向にある場合があることを見出している。ＭＳＣの接着状態での長軸又は短軸の長さの測定方法は、特に限定されないが、例えば、プラスチック製培養容器に接着させた細胞の顕微鏡観察により測定することができる。ＭＳＣの接着状態での長軸又は短軸の平均長さは、上記の測定方法により測定した複数個の細胞の長軸又は短軸の長さの平均値として算出される。
【0108】
本発明の細胞集団における相対的に増殖能が高いＭＳＣの接着状態での長軸の平均長さは、例えば、１３μｍ以上、１４μｍ以上、１５μｍ以上又は１６μｍ以上であってもよいが、特に限定されない。また、相対的に増殖能が高いＭＳＣの接着状態での長軸の平均長さは、例えば、４８μｍ以下、４６μｍ以下又は４４μｍ以下であってもよいが、特に限定されない。
【0109】
本発明の細胞集団における相対的に増殖能が高いＭＳＣの接着状態での短軸の平均長さは、例えば、相対的に増殖能が低いＭＳＣの接着状態での短軸の平均長さの８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下又は４０％以下であってもよいが、特に限定されない。また、相対的に増殖能が高いＭＳＣの接着状態での短軸の平均長さは、例えば、相対的に増殖能が低いＭＳＣの接着状態での短軸の平均長さの２５％以上、３０％以上又は３５％以上であってもよいが、特に限定されない。
【0110】
本発明の間葉系幹細胞集団における相対的に増殖能が高いＭＳＣの接着状態での短軸の平均長さは、例えば、４μｍ以上、５μｍ以上又は６μｍ以上であってもよいが、特に限定されない。また、相対的に増殖能が高いＭＳＣの接着状態での短軸の平均長さは、例えば、１４μｍ以下、１３μｍ以下又は１２μｍ以下であってもよいが、特に限定されない。
【0111】
本発明者らは、本発明の細胞集団における相対的に増殖能が高いＭＳＣの比増殖速度が、相対的に増殖能が低いＭＳＣの比増殖速度より高いことを見出している。すなわち、細胞集団における相対的に増殖能が高いＭＳＣは、相対的に比増殖速度が高いＭＳＣであり、細胞集団における相対的に増殖能が低いＭＳＣは、相対的に比増殖速度が低いＭＳＣである。細胞集団におけるＭＳＣの増殖能は、比増殖速度を用いて評価することができる。比増殖速度は、単位時間あたりの細胞数の増加として定義され、比増殖速度：μ＝ｌｎ（ｍｔ２／ｍｔ１）／（ｔ２－ｔ１） で表される。ここで、ｔ１及びｔ２は培養日数、ｍｔ１ はｔ１日目における細胞数、ｍｔ２はｔ２日目における細胞数である（ただし、ｔ２＞ｔ１）。したがって、比増殖速度の単位は、（個／個／ｄａｙ）＝（１／ｄａｙ）である。
【0112】
本発明の細胞集団における相対的に増殖能が高いＭＳＣの比増殖速度は、好ましくは、相対的に増殖能が低いＭＳＣの比増殖速度の１．１倍以上であり、より好ましくは１．２倍以上であり、さらに好ましくは１．３倍以上であり、さらに好ましくは１．４倍以上であり、さらに好ましくは１．５倍以上であり、さらに好ましくは１．６倍以上であり、さらに好ましくは１．７倍以上であり、さらに好ましくは１．８倍以上であり、さらに好ましくは１．９倍以上であり、さらに好ましくは２．０倍以上であり、さらに好ましくは２．１倍以上であり、さらに好ましくは２．２倍以上であり、さらに好ましくは２．３倍以上であり、さらに好ましくは２．４倍以上であり、さらに好ましくは２．５倍以上であり、さらに好ましくは２．６倍以上であり、さらに好ましくは２．７倍以上であり、さらに好ましくは２．８倍以上であり、さらに好ましくは２．９倍以上であり、さらに好ましくは３．０倍以上であり、さらに好ましくは３．１倍以上であり、さらに好ましくは３．２倍以上であり、さらに好ましくは３．３倍以上であり、さらに好ましくは３．４倍以上であり、特に好ましくは３．５倍以上である。また、相対的に増殖能が高いＭＳＣの比増殖速度の比増殖速度は、特に限定されないが、例えば、相対的に増殖能が低いＭＳＣの比増殖速度の５．０倍以下、４．５倍以下又は４．０倍以下である。
【0113】
本発明の細胞集団における相対的に増殖能が高いＭＳＣの比増殖速度は、０．０７（１／ｄａｙ）以上であり、好ましくは０．０８（１／ｄａｙ）以上であり、より好ましくは０．０９（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１０（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１１（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１２（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１３（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１４（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１５（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１６（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１７（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１８（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．１９（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２０（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２１（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２２（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２３（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２４（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２５（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２６（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２７（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２８（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．２９（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．３０（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．３１（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．３２（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．３３（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．３４（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．３５（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．３６（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．３７（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．３８（１／ｄａｙ）以上であり、特に好ましくは０．３９（１／ｄａｙ）以上である。また、相対的に増殖能が高いＭＳＣの比増殖速度は、特に限定されないが、例えば、０．６０（１／ｄａｙ）以下又は０．５０（１／ｄａｙ）以下である。
【0114】
本発明の細胞集団における相対的に増殖能が高いＭＳＣの継代可能回数は、１回以上、好ましくは２回以上、より好ましくは３回以上、さらに好ましくは４回以上、さらに好ましくは５回以上、さらに好ましくは６回以上、さらに好ましくは７回以上、さらに好ましくは８回以上、さらに好ましくは９回以上、さらに好ましくは１０回以上、さらに好ましくは１１回以上、さらに好ましくは１２回以上、さらに好ましくは１３回以上、さらに好ましくは１４回以上、さらに好ましくは１５回以上、さらに好ましくは１６回以上、さらに好ましくは１７回以上、さらに好ましくは１８回以上、さらに好ましくは１９回以上、さらに好ましくは２０回以上、さらに好ましくは２５回以上である。また、継代可能回数の上限は、特に限定されないが、例えば、５０回以下、４５回以下、４０回以下、３５回以下又は３０回以下である。
【0115】
本発明の細胞集団における相対的に増殖能が高いＭＳＣの含有率は、好ましくは１０％以上であり、より好ましくは２０％以上であり、さらに好ましくは３０％以上であり、さらに好ましくは４０％以上であり、さらに好ましくは５０％以上であり、さらに好ましくは６０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９１％以上であり、さらに好ましくは９２％以上であり、さらに好ましくは９３％以上であり、さらに好ましくは９４％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９６％以上であり、さらに好ましくは９７％以上であり、さらに好ましくは９８％以上であり、さらに好ましくは９９％以上であり、特に好ましくは１００％である。
【0116】
本発明の細胞集団は、使用直前まで凍結状態にて保存することができる。本発明の細胞集団は、相対的に増殖能が高いＭＳＣ以外に、任意の成分を含んでもよい。かかる成分としては、例えば、塩類、多糖類（例えば、ＨＥＳ、デキストランなど）、タンパク質（例えば、アルブミンなど）、ＤＭＳＯ、培地成分（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に含まれる成分など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。
【0117】
本発明の細胞集団は、媒体と組み合わせた組成物として提供してもよい。媒体としては、好ましくは液体媒体（例えば、培地、又は後記する製薬上許容し得る媒体など）を使用することができる。
【0118】
［５］医薬組成物
本発明による相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞、あるいは上記間葉系幹細胞を含む細胞集団は、医薬組成物として使用することができる。本発明の医薬組成物は、本発明の間葉系幹細胞あるいは本発明の細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物である。
本発明による相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞、あるいは上記間葉系幹細胞を含む細胞集団は、医薬組成物として使用することができる。本発明の医薬組成物は、本発明の間葉系幹細胞あるいは本発明の細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物である。
【0119】
本発明の医薬組成物は、細胞治療剤、例えば、難治性疾患治療剤として使用することができる。
本発明の医薬組成物は、免疫関連疾患、虚血性疾患（下肢虚血、虚血性心疾患（心筋梗塞等）、冠動脈性心疾患、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血等）、神経性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデスを含む膠原病、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、紅斑性狼瘡、糖尿病、菌状息肉腫（Ａｌｉｂｅｒｔ－Ｂａｚｉｎ症候群）、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、眼疾患、血管新生関連疾患、うっ血性心不全、心筋症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、癌から選択される疾患の治療剤として使用することができる。本発明の医薬組成物を治療部位に効果が計測できる量投与することで、炎症を抑制することができる。
本発明の医薬組成物は、免疫関連疾患、虚血性疾患（下肢虚血、虚血性心疾患（心筋梗塞等）、冠動脈性心疾患、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血等）、神経性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデスを含む膠原病、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、紅斑性狼瘡、糖尿病、菌状息肉腫（Ａｌｉｂｅｒｔ－Ｂａｚｉｎ症候群）、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、眼疾患、血管新生関連疾患、うっ血性心不全、心筋症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、癌から選択される疾患の治療剤として使用することができる。本発明の医薬組成物を治療部位に効果が計測できる量投与することで、炎症を抑制することができる。
【0120】
さらに本発明によれば、医薬組成物の製造のための、本発明の間葉系幹細胞あるいは細胞集団の使用が提供される。
さらに本発明によれば、医薬組成物のために使用される、本発明の間葉系幹細胞あるいは本発明の細胞集団が提供される。さらに本発明によれば、免疫関連疾患、虚血性疾患（下肢虚血、虚血性心疾患（心筋梗塞等）、冠動脈性心疾患、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血等）、神経性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデスを含む膠原病、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、紅斑性狼瘡、糖尿病、菌状息肉腫（Ａｌｉｂｅｒｔ－Ｂａｚｉｎ症候群）、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、眼疾患、血管新生関連疾患、うっ血性心不全、心筋症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、癌から選択される疾患の治療のために使用される、本発明の間葉系幹細胞あるいは本発明の細胞集団が提供される。さらに本発明によれば、患者又は被験者に投与して、心筋の再生、心筋細胞の産生、血管新生、血管の修復、又は、免疫応答の抑制のために使用される、本発明の間葉系幹細胞あるいは本発明の細胞集団が提供される。
さらに本発明によれば、医薬組成物のために使用される、本発明の間葉系幹細胞あるいは本発明の細胞集団が提供される。さらに本発明によれば、免疫関連疾患、虚血性疾患（下肢虚血、虚血性心疾患（心筋梗塞等）、冠動脈性心疾患、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血等）、神経性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデスを含む膠原病、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、紅斑性狼瘡、糖尿病、菌状息肉腫（Ａｌｉｂｅｒｔ－Ｂａｚｉｎ症候群）、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、眼疾患、血管新生関連疾患、うっ血性心不全、心筋症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、癌から選択される疾患の治療のために使用される、本発明の間葉系幹細胞あるいは本発明の細胞集団が提供される。さらに本発明によれば、患者又は被験者に投与して、心筋の再生、心筋細胞の産生、血管新生、血管の修復、又は、免疫応答の抑制のために使用される、本発明の間葉系幹細胞あるいは本発明の細胞集団が提供される。
【0121】
さらに本発明によれば、患者又は被験者に、本発明の間葉系幹細胞あるいは本発明の細胞集団の治療有効量を投与する工程を含む、患者又は被験者に細胞を移植する方法、並びに患者又は被験者の疾患の治療方法が提供される。
【0122】
本発明の医薬組成物の投与量としては、患者又は被験者に投与した場合に、投与していない患者又は被験者と比較して疾患に対して治療効果を得ることができるような細胞の量である。具体的な投与量は、投与形態、投与方法、使用目的、及び患者又は被験者の年齢、体重及び症状等によって適宜決定することができる。投与量は、特に限定されないが、例えば、１０４個／ｋｇ体重以上、１０５個／ｋｇ体重以上又は１０６個／ｋｇ体重以上である。また、投与量は、特に限定されないが、例えば、１０９個／ｋｇ体重以下、１０８個／ｋｇ体重以下又は１０７個／ｋｇ体重以下である。
【0123】
本発明の医薬組成物の投与方法は、特に限定されないが、例えば、皮下注射、リンパ節内注射、静脈内注射、点滴静脈注射、腹腔内注射、胸腔内注射又は局所への直接注射、又は局所に直接移植することなどが挙げられる。医薬組成物の投与方法については、例えば、特開２０１５－６１５２０号公報、Ｏｎｋｅｎ ＪＥ， ｔ ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ２００６Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ，ＮＶ， Ａｂｓｔｒａｃｔ １２１．、Ｇａｒｃｉａ－Ｏｌｍｏ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓ Ｃｏｌｏｎ Ｒｅｃｔｕｍ ２００５；４８：１４１６－２３．などにおいて、静脈内注射、点滴静脈注射、局所への直接注射、局所への直接移植などが知られている。本発明の医薬組成物も、上記文献に記載されている各種方法により投与することができる。
【0124】
本発明の医薬組成物は、他の疾患治療目的に注射用製剤、或いは細胞塊又はシート状構造の移植用製剤、或いは任意のゲルと混合したゲル製剤として用いることも可能である。
【0125】
本発明の患者又は被験者とは、典型的にはヒトであるが、他の動物であってもよい。他の動物としては、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル（カニクイザル、アカゲザル、コモンマーモセット、ニホンザル）、フェレット、ウサギ、げっ歯類（マウス、ラット、スナネズミ、モルモット、ハムスター）等の哺乳動物、ニワトリ、ウズラ等の鳥類が挙げられるが、特に限定されない。
【0126】
本発明の医薬組成物は、使用直前まで凍結状態にて保存することができる。本発明の医薬組成物は、ヒトの治療の際に用いられる任意の成分を含んでもよい。かかる成分としては、例えば、塩類、多糖類（例えば、ＨＥＳ、デキストランなど）、タンパク質（例えば、アルブミンなど）、ＤＭＳＯ、培地成分（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に含まれる成分など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。
【0127】
また、本発明の医薬組成物は、間葉系幹細胞又は細胞集団を、製薬上許容し得る媒体として使用される輸液製剤により希釈したものでもよい。本明細書における「輸液製剤（製薬上許容し得る媒体）」としては、ヒトの治療の際に用いられる溶液であれば特に限定されないが、例えば、生理食塩水、５％ブドウ糖液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、開始液（１号液）、脱水補給液（２号液）、維持輸液（３号液）、術後回復液（４号液）等を挙げることができる。
【0128】
なお間葉系幹細胞などの幹細胞の医療用途については、例えば、特表２０１２－５０９０８７号公報、特表２０１４－５０１２４９号公報、特開２０１３－２５６５１５号公報、特開２０１４－１８５１７３号公報、特開２０１５－０３８０５９号公報、特開２０１５－１１０６５９号公報、特表２００６－５２１１２１号公報、特表２００９－５４２７２７号公報、特表２０１０－５３５７１５号公報、特開２０１４－２２４１１７号公報、特開２０１５－０６１８６２号公報、特表２００２－５１１０９４号公報、特表２００４－５０７４５４号公報、特表２０１０－５０５７６４号公報、特表２０１１－５１４９０１号公報、特開２０１３－０６４００３号公報、特開２０１５－１３１７９５号公報などにおいて、免疫関連疾患及び障害の治療、血管形成、結合組織の生成、修復および／または維持、眼疾患及び過剰血管新生の治療、心筋再生、関節修復、遺伝子疾患および障害の治療、及び免疫調節などが知られている。また、特表２０１０－５１８０９６号公報には、胎盤幹細胞を使用した炎症性疾患の治療が記載され、特開２０１５－１７８４９８号公報及び特許第５９５０５７７号には、胎盤幹細胞を使用した脳卒中の治療が記載されている。さらに、Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２００９ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ８； ５４（２４）： ２２７７－２２８６．には骨髄間葉系幹細胞を用いた心不全の治療、Ｂｒａｉｎ ２０１１： １３４； １７９０－１８０７．には骨髄間葉系幹細胞を用いた脳梗塞の治療、Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ、２０１３；９５：１８２７-３３．には胎盤間葉系幹細胞を用いた心不全の治療が記載されている。本発明の間葉系幹細胞又は細胞集団も、上記文献に記載されている各種疾患の治療に有用である。
【0129】
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【0130】
（実施例１）
比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣ（相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣ）を、以下の一連の工程１－１から工程１－６により取得した。
比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣ（相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣ）を、以下の一連の工程１－１から工程１－６により取得した。
【0131】
（工程１－１：羊膜の採取）
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて２回洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて２回洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。
【0132】
（工程１－２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収）
（方法）
羊膜１ｇあたりに、３００ＣＤＵ／ｍＬ精製コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社、ＣＬＳＰＡ）及び２００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩ（和光純薬、品番３８６－０２２７１）を含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）を５ｍＬ添加し、３７℃にて９０分間、６０ｒｐｍの条件にて震盪攪拌した。ここで、ＣＤＵ（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）は、コラーゲンを基質として、３７℃、ｐＨ７．５において５時間に１μｍｏｌのロイシンに相当するアミノ酸及びペプチドを生成する酵素量と定義される。また、ＰＵ（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｕｎｉｔ）は、乳酸カゼインを基質として３５℃、ｐＨ７．２において１分間に１μｇのチロシンに相当するアミノ酸及びペプチドを生成する酵素量と定義される。羊膜の酵素処理物を、２倍量の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にて懸濁した。得られた細胞懸濁液をナイロンメッシュフィルター（ポアサイズ：１００μｍ）を用いて濾過し、羊膜ＭＳＣを含む濾液を回収した。ナイロンメッシュフィルター上に残留した未消化の羊膜をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色にて評価した。羊膜ＭＳＣを含む濾液を４００ｘｇにて５分間遠心し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁し、増殖能が異なる羊膜ＭＳＣを含む細胞懸濁液を取得した。得られた細胞懸濁液の一部にチュルク染色液を混合し、細胞数を測定した。濾液から回収した羊膜ＭＳＣは、標識抗体にて４℃にて１５分間染色した後、死細胞除去のためヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）又は７－ＡＡＤ（７－Ａｍｉｎｏ－Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）を添加し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ：Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、日本ＢＤ社（以下、ＢＤ社と略す））を用いて表面抗原を解析した。標識抗体は、抗ＣＤ９０－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）を用いた。
（方法）
羊膜１ｇあたりに、３００ＣＤＵ／ｍＬ精製コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社、ＣＬＳＰＡ）及び２００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩ（和光純薬、品番３８６－０２２７１）を含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）を５ｍＬ添加し、３７℃にて９０分間、６０ｒｐｍの条件にて震盪攪拌した。ここで、ＣＤＵ（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）は、コラーゲンを基質として、３７℃、ｐＨ７．５において５時間に１μｍｏｌのロイシンに相当するアミノ酸及びペプチドを生成する酵素量と定義される。また、ＰＵ（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｕｎｉｔ）は、乳酸カゼインを基質として３５℃、ｐＨ７．２において１分間に１μｇのチロシンに相当するアミノ酸及びペプチドを生成する酵素量と定義される。羊膜の酵素処理物を、２倍量の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にて懸濁した。得られた細胞懸濁液をナイロンメッシュフィルター（ポアサイズ：１００μｍ）を用いて濾過し、羊膜ＭＳＣを含む濾液を回収した。ナイロンメッシュフィルター上に残留した未消化の羊膜をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色にて評価した。羊膜ＭＳＣを含む濾液を４００ｘｇにて５分間遠心し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁し、増殖能が異なる羊膜ＭＳＣを含む細胞懸濁液を取得した。得られた細胞懸濁液の一部にチュルク染色液を混合し、細胞数を測定した。濾液から回収した羊膜ＭＳＣは、標識抗体にて４℃にて１５分間染色した後、死細胞除去のためヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）又は７－ＡＡＤ（７－Ａｍｉｎｏ－Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）を添加し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ：Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、日本ＢＤ社（以下、ＢＤ社と略す））を用いて表面抗原を解析した。標識抗体は、抗ＣＤ９０－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）を用いた。
【0133】
（結果）
ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色の結果、フィルター上に残留した羊膜は上皮細胞層が消化されずに保たれており、上皮細胞層内に多数の上皮細胞が存在していることが分かった。また、フィルター上に残留した羊膜はその細胞外基質層が消化されており、フィルター上に羊膜ＭＳＣは確認されなかった。これは、羊膜の細胞外基質層を標的とし、かつ羊膜の上皮細胞層を標的としないコラゲナーゼ及びディスパーゼを採用したことにより、上皮細胞をほとんど含有しない濾液が回収されたことを示している。
ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色の結果、フィルター上に残留した羊膜は上皮細胞層が消化されずに保たれており、上皮細胞層内に多数の上皮細胞が存在していることが分かった。また、フィルター上に残留した羊膜はその細胞外基質層が消化されており、フィルター上に羊膜ＭＳＣは確認されなかった。これは、羊膜の細胞外基質層を標的とし、かつ羊膜の上皮細胞層を標的としないコラゲナーゼ及びディスパーゼを採用したことにより、上皮細胞をほとんど含有しない濾液が回収されたことを示している。
【0134】
チュルク染色による細胞数測定の結果、羊膜組織から取得した細胞の数は、組織重量１ｇあたりの２．３×１０６個であることを確認した。
【0135】
フローサイトメトリーの結果、濾液から回収した細胞を含む細胞集団はＣＤ９０陽性であった。このことは、濾液から回収した細胞が、間葉系幹細胞であることを示している。
【0136】
（工程１－３：前培養１）
羊膜の酵素処理物から得られた細胞集団の一部をプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにてコンフルエント率９０％以上９５％以下になるまで培養した。この工程により取得した細胞を前培養１細胞と称す。
羊膜の酵素処理物から得られた細胞集団の一部をプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにてコンフルエント率９０％以上９５％以下になるまで培養した。この工程により取得した細胞を前培養１細胞と称す。
【0137】
（工程１－４：前培養２）
（方法）
前培養１細胞を、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）にて処理した後にトリプシンにて処理してプラスチック製培養容器から剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁した。播種密度が２．８×１０３個／ｃｍ２となるようにプラスチック製培養容器に細胞を播種し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて８日間培養した。この前培養により取得した細胞を前培養２細胞と称す。前培養２細胞を、以降の試験に用いた。
（方法）
前培養１細胞を、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）にて処理した後にトリプシンにて処理してプラスチック製培養容器から剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁した。播種密度が２．８×１０３個／ｃｍ２となるようにプラスチック製培養容器に細胞を播種し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて８日間培養した。この前培養により取得した細胞を前培養２細胞と称す。前培養２細胞を、以降の試験に用いた。
【0138】
（結果）
８日間の培養の後、前培養２細胞は４．６×１０３個／ｃｍ２得られた。この場合、前培養２細胞の比増殖速度は０．０６（１／ｄａｙ）であった。
８日間の培養の後、前培養２細胞は４．６×１０３個／ｃｍ２得られた。この場合、前培養２細胞の比増殖速度は０．０６（１／ｄａｙ）であった。
【0139】
（工程１－５：凍結－解凍による羊膜ＭＳＣの刺激処理）
（方法）
前培養２細胞を、ＥＤＴＡにて処理した後にトリプシンにて処理してプラスチック製培養容器から剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、０．５％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（ベネシス社製、献血アルブミン２５％静注１２．５ｇ／５０ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて２．０×１０７個／ｍＬ以下となるように懸濁した。１２％（ｗ／ｖ）ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）（ニプロ社製、品番ＨＥＳ４０）、１０％（ｗ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、品番Ｄ２６５０）及び８％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（ベネシス社製、献血アルブミン２５％静注１２．５ｇ／５０ｍＬ）を含む凍結用保存液を調製した。細胞懸濁液と凍結用保存液とを氷上で等量混合し、１ｍＬをクライオチューブに移した。プログラムフリーザーを用いて、クライオチューブを－２℃／分以上－１℃／分以下の速度で－４０℃まで冷却し、続いて－１０℃／分の速度で－９０℃まで冷却した後、－１５０℃の超低温冷凍庫内にて２日間凍結保存した。凍結保存したクライオチューブを３７℃恒温槽に浸し、急速に融解した。融解した細胞懸濁液の一部を採取し、トリパンブルーにて染色し、血球計算盤を用いて細胞の数、生存率及び大きさを計測した。
（方法）
前培養２細胞を、ＥＤＴＡにて処理した後にトリプシンにて処理してプラスチック製培養容器から剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、０．５％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（ベネシス社製、献血アルブミン２５％静注１２．５ｇ／５０ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて２．０×１０７個／ｍＬ以下となるように懸濁した。１２％（ｗ／ｖ）ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）（ニプロ社製、品番ＨＥＳ４０）、１０％（ｗ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、品番Ｄ２６５０）及び８％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（ベネシス社製、献血アルブミン２５％静注１２．５ｇ／５０ｍＬ）を含む凍結用保存液を調製した。細胞懸濁液と凍結用保存液とを氷上で等量混合し、１ｍＬをクライオチューブに移した。プログラムフリーザーを用いて、クライオチューブを－２℃／分以上－１℃／分以下の速度で－４０℃まで冷却し、続いて－１０℃／分の速度で－９０℃まで冷却した後、－１５０℃の超低温冷凍庫内にて２日間凍結保存した。凍結保存したクライオチューブを３７℃恒温槽に浸し、急速に融解した。融解した細胞懸濁液の一部を採取し、トリパンブルーにて染色し、血球計算盤を用いて細胞の数、生存率及び大きさを計測した。
【0140】
（結果）
図１及び表１に示すように、凍結－解凍処理直後の浮遊状態の羊膜ＭＳＣには、直径１９．９±３．１μｍ（すなわち、平均直径１９．９μｍ）の細胞群と、直径１２．０±１．９μｍ（すなわち、平均直径１２．０μｍ）の細胞群という、２種類の細胞（すなわち、相対的にサイズが大きい細胞と相対的にサイズが小さい細胞）が含まれていた。凍結－解凍処理直後の細胞生存率は５５％であり、（生細胞中の）相対的にサイズが小さい細胞の含有率、すなわち、相対的にサイズが小さい細胞の数／相対的にサイズが大きい細胞の数の比率は、２％（すなわち、相対的にサイズが小さい細胞の数／相対的にサイズが大きい細胞の数＝２／９８）であった。
尚、凍結－解凍処理に供した細胞（前培養２細胞）における細胞生存率は９１％であり、（生細胞中の）相対的にサイズが小さい細胞の含有率は、１％（すなわち、相対的にサイズが小さい細胞の数／相対的にサイズが大きい細胞の数＝１／９９）であった。
上記の結果から、凍結－解凍処理により羊膜ＭＳＣの生存率が低下したこと、また、この生存率の低下は相対的にサイズが大きい細胞（直径の大きな細胞）の死滅に起因することが分かった。
図１及び表１に示すように、凍結－解凍処理直後の浮遊状態の羊膜ＭＳＣには、直径１９．９±３．１μｍ（すなわち、平均直径１９．９μｍ）の細胞群と、直径１２．０±１．９μｍ（すなわち、平均直径１２．０μｍ）の細胞群という、２種類の細胞（すなわち、相対的にサイズが大きい細胞と相対的にサイズが小さい細胞）が含まれていた。凍結－解凍処理直後の細胞生存率は５５％であり、（生細胞中の）相対的にサイズが小さい細胞の含有率、すなわち、相対的にサイズが小さい細胞の数／相対的にサイズが大きい細胞の数の比率は、２％（すなわち、相対的にサイズが小さい細胞の数／相対的にサイズが大きい細胞の数＝２／９８）であった。
尚、凍結－解凍処理に供した細胞（前培養２細胞）における細胞生存率は９１％であり、（生細胞中の）相対的にサイズが小さい細胞の含有率は、１％（すなわち、相対的にサイズが小さい細胞の数／相対的にサイズが大きい細胞の数＝１／９９）であった。
上記の結果から、凍結－解凍処理により羊膜ＭＳＣの生存率が低下したこと、また、この生存率の低下は相対的にサイズが大きい細胞（直径の大きな細胞）の死滅に起因することが分かった。
【0141】
【表1】
【0142】
（工程１－６：本培養）
（方法）
凍結－解凍処理後の羊膜ＭＳＣを、以下のようにして培養した。融解した細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞細胞懸濁液の一部をプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにてコンフルエント率９０％以上９５％以下になるまで培養した。この培養により取得した細胞を本培養１細胞と称す。
接着している本培養１細胞を、ＥＤＴＡにて処理した後にトリプシンにて処理してプラスチック製培養容器から剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞細胞懸濁液の一部を、６３００ｃｍ２（総培養表面積）のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにてコンフルエント率９０％以上９５％以下になるまで培養した。この継代及び培養により取得した細胞を継代１細胞と称す。ＥＤＴＡ－トリプシン処理及び遠心分離により、継代１細胞を回収した。
本培養１細胞及び継代１細胞の一部を採取し、トリパンブルーにて染色し、血球計算盤を用いて細胞の数及び生存率を計測した。Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＡ－β－Ｇａｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ）（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて、本培養１細胞及び継代１細胞の細胞老化アッセイを行った。また、本培養１細胞及び継代１細胞の一部を採取し、標識抗体にて４℃にて１５分間染色した後、死細胞除去のためヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）又は７－ＡＡＤ（７－Ａｍｉｎｏ－Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）を添加し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ：ＢＤ社）を用いて表面抗原を解析した。上記の標識抗体として、抗ＣＤ９０－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ１０５－ＦＩＴＣ抗体（Ａｎｃｅｌｌ社）、抗ＣＤ７３－ＰＥ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ１０６－ＰＥ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）、抗ＣＤ３２４－ＰＥ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ３２６－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ４５－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ３４－ＰＥ抗体（ＢＤ社）及び抗ＨＬＡ－ＤＲ－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）を用いた。細胞集団におけるＣＤ１０６陽性である間葉系幹細胞の比率は、以下の手順（１）～（３）にて算出した。
（１）測定結果を、縦軸に細胞数、横軸を抗体に標識された色素の蛍光強度としたヒストグラムで展開した。
（２）アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が０．１～１．０％となる蛍光強度を決定した。
（３）ＣＤ１０６に対する抗体で測定した総細胞のうち、上記（２）で決定した蛍光強度よりも蛍光強度が高い細胞の割合を算出した。
（方法）
凍結－解凍処理後の羊膜ＭＳＣを、以下のようにして培養した。融解した細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞細胞懸濁液の一部をプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにてコンフルエント率９０％以上９５％以下になるまで培養した。この培養により取得した細胞を本培養１細胞と称す。
接着している本培養１細胞を、ＥＤＴＡにて処理した後にトリプシンにて処理してプラスチック製培養容器から剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞細胞懸濁液の一部を、６３００ｃｍ２（総培養表面積）のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにてコンフルエント率９０％以上９５％以下になるまで培養した。この継代及び培養により取得した細胞を継代１細胞と称す。ＥＤＴＡ－トリプシン処理及び遠心分離により、継代１細胞を回収した。
本培養１細胞及び継代１細胞の一部を採取し、トリパンブルーにて染色し、血球計算盤を用いて細胞の数及び生存率を計測した。Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＡ－β－Ｇａｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ）（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて、本培養１細胞及び継代１細胞の細胞老化アッセイを行った。また、本培養１細胞及び継代１細胞の一部を採取し、標識抗体にて４℃にて１５分間染色した後、死細胞除去のためヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）又は７－ＡＡＤ（７－Ａｍｉｎｏ－Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）を添加し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ：ＢＤ社）を用いて表面抗原を解析した。上記の標識抗体として、抗ＣＤ９０－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ１０５－ＦＩＴＣ抗体（Ａｎｃｅｌｌ社）、抗ＣＤ７３－ＰＥ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ１０６－ＰＥ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）、抗ＣＤ３２４－ＰＥ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ３２６－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ４５－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ３４－ＰＥ抗体（ＢＤ社）及び抗ＨＬＡ－ＤＲ－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）を用いた。細胞集団におけるＣＤ１０６陽性である間葉系幹細胞の比率は、以下の手順（１）～（３）にて算出した。
（１）測定結果を、縦軸に細胞数、横軸を抗体に標識された色素の蛍光強度としたヒストグラムで展開した。
（２）アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が０．１～１．０％となる蛍光強度を決定した。
（３）ＣＤ１０６に対する抗体で測定した総細胞のうち、上記（２）で決定した蛍光強度よりも蛍光強度が高い細胞の割合を算出した。
【0143】
（結果）
凍結－解凍処理後の細胞（本培養１細胞及び継代１細胞）は、コンフルエント率９０％以上９５％以下に達するまでの日数がそれぞれ１０日、１１日であった。これらの場合、本培養１細胞の比増殖速度は０．２０（１／ｄａｙ）、継代１細胞の比増殖速度は０．１９（１／ｄａｙ）であった（表２）。このことから、凍結－解凍処理された羊膜ＭＳＣの比増殖速度は非常に高いことが分かった。以上の結果は、相対的にサイズが小さい羊膜ＭＳＣは比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣ（すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣ）であることを示している。また、得られた継代１細胞の細胞数は２．０×１０８個であった。このことから、培養１バッチあたり２．９×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）の細胞（継代１細胞）が得られたことが分かる。以上の結果は、細胞製剤化に必要な羊膜ＭＳＣを大量かつ迅速に調製・製造しうることを示している。
凍結－解凍処理後の細胞（本培養１細胞及び継代１細胞）は、コンフルエント率９０％以上９５％以下に達するまでの日数がそれぞれ１０日、１１日であった。これらの場合、本培養１細胞の比増殖速度は０．２０（１／ｄａｙ）、継代１細胞の比増殖速度は０．１９（１／ｄａｙ）であった（表２）。このことから、凍結－解凍処理された羊膜ＭＳＣの比増殖速度は非常に高いことが分かった。以上の結果は、相対的にサイズが小さい羊膜ＭＳＣは比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣ（すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣ）であることを示している。また、得られた継代１細胞の細胞数は２．０×１０８個であった。このことから、培養１バッチあたり２．９×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）の細胞（継代１細胞）が得られたことが分かる。以上の結果は、細胞製剤化に必要な羊膜ＭＳＣを大量かつ迅速に調製・製造しうることを示している。
【0144】
【表2】
【0145】
図２、図３及び図４は、接着した羊膜ＭＳＣの位相差顕微鏡像を示している。凍結－解凍処理の有無に関わらず、羊膜ＭＳＣの接着状態での形態は、線維芽細胞様の紡錘形又は小型多角形であった。
凍結－解凍処理を行っていない羊膜ＭＳＣ（前培養２細胞）は、コンフルエントの状態において、ほとんど全ての細胞が、長軸の長さが７８．４±２５．３μｍ（すなわち、長軸の平均長さ７８．４μｍ）が、短軸の長さが２２．８±６．０μｍ（すなわち、短軸の平均長さ２２．８μｍ）の細胞（長軸・短軸の大きな細胞、すなわち、相対的にサイズが大きい細胞）であった（表３）。尚、前述したように、この前培養２細胞における、相対的にサイズが小さい細胞の含有率は１％である。
一方、凍結－解凍処理の後、コンフルエントになるまで培養した細胞（本培養１細胞）は、前記の相対的にサイズが大きい細胞だけでなく、長軸の長さが３０．１±１３．６μｍ（すなわち、長軸の平均長さ３０．１μｍ）、短軸の長さが８．７±２．５μｍ（すなわち、短軸の平均長さ８．７μｍ）の細胞（長軸・短軸の小さな細胞、すなわち、相対的にサイズが小さい細胞）が含まれていた（表３）。尚、本培養１細胞における相対的にサイズが小さい細胞の含有率は９０％（すなわち、相対的にサイズが小さい細胞の数／相対的にサイズが大きい細胞の数＝９０／１０）であり、継代１細胞における相対的にサイズが小さい細胞の含有率は９８％（すなわち、相対的にサイズが小さい細胞の数／相対的にサイズが大きい細胞の数＝９８／２）であった。
以上の結果から、凍結－解凍処理により相対的にサイズが大きい細胞の増殖性（比増殖速度）が著しく低下したため、培養において相対的にサイズが大きい細胞が増殖せず、主として、相対的にサイズが小さい細胞が増殖したことが分かる。
凍結－解凍処理を行っていない羊膜ＭＳＣ（前培養２細胞）は、コンフルエントの状態において、ほとんど全ての細胞が、長軸の長さが７８．４±２５．３μｍ（すなわち、長軸の平均長さ７８．４μｍ）が、短軸の長さが２２．８±６．０μｍ（すなわち、短軸の平均長さ２２．８μｍ）の細胞（長軸・短軸の大きな細胞、すなわち、相対的にサイズが大きい細胞）であった（表３）。尚、前述したように、この前培養２細胞における、相対的にサイズが小さい細胞の含有率は１％である。
一方、凍結－解凍処理の後、コンフルエントになるまで培養した細胞（本培養１細胞）は、前記の相対的にサイズが大きい細胞だけでなく、長軸の長さが３０．１±１３．６μｍ（すなわち、長軸の平均長さ３０．１μｍ）、短軸の長さが８．７±２．５μｍ（すなわち、短軸の平均長さ８．７μｍ）の細胞（長軸・短軸の小さな細胞、すなわち、相対的にサイズが小さい細胞）が含まれていた（表３）。尚、本培養１細胞における相対的にサイズが小さい細胞の含有率は９０％（すなわち、相対的にサイズが小さい細胞の数／相対的にサイズが大きい細胞の数＝９０／１０）であり、継代１細胞における相対的にサイズが小さい細胞の含有率は９８％（すなわち、相対的にサイズが小さい細胞の数／相対的にサイズが大きい細胞の数＝９８／２）であった。
以上の結果から、凍結－解凍処理により相対的にサイズが大きい細胞の増殖性（比増殖速度）が著しく低下したため、培養において相対的にサイズが大きい細胞が増殖せず、主として、相対的にサイズが小さい細胞が増殖したことが分かる。
【0146】
【表3】
【0147】
継代可能回数を調べるために、継代１細胞をさらに継続して継代及び培養したところ、継代１７細胞（継代を１７回行なった細胞）を取得することができた。このことから、凍結－解凍処理後に得られた細胞は、少なくとも１７回継代可能であることが分かる。
【0148】
老化マーカーであるＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ＳＡ－β－Ｇａｌ）を指標として、羊膜ＭＳＣの細胞老化アッセイ（細胞染色）を行った。その結果、相対的にサイズが大きい羊膜ＭＳＣ（すなわち、比増殖速度が低い羊膜ＭＳＣ、すなわち、相対的に増殖能が低い羊膜ＭＳＣ）はＳＡ－β－Ｇａｌ陽性の老化細胞である（図５）のに対して、相対的にサイズが小さい羊膜ＭＳＣ（すなわち、比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣ、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣ）はＳＡ－β－Ｇａｌ陰性の非老化細胞であった。
【0149】
フローサイトメトリーの結果、本培養１細胞と継代１細胞のＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ７３はいずれも陽性であり、ＣＤ１０６、ＣＤ３２４、ＣＤ３２６、ＣＤ４５、ＣＤ３４及びＨＬＡ－ＤＲはいずれも陰性であった。本培養１細胞を含む細胞集団におけるＣＤ１０６陽性である細胞の比率は１．４％であった。一方、継代１細胞を含む細胞集団におけるＣＤ１０６陽性である細胞の比率は０．０％であった。これらのことは、本培養１細胞と継代１細胞が、上皮細胞、血球系細胞及び血管内皮細胞をほとんど含まない羊膜間葉系幹細胞であることを示している。尚、得られた羊膜間葉系幹細胞は、細胞製剤化に好適な生細胞であった。
【0150】
（実施例２）
比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣ（相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣ）を、以下の一連の工程２－１から工程２－８により取得した。
比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣ（相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣ）を、以下の一連の工程２－１から工程２－８により取得した。
【0151】
（工程２－１：羊膜の採取）
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて２回洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて２回洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。
【0152】
（工程２－２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収）
羊膜１ｇあたりに、３００ＣＤＵ／ｍＬ精製コラゲナーゼ及び２００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）を５ｍＬ添加し、３７℃にて９０分間、６０ｒｐｍの条件にて震盪攪拌した。羊膜の酵素処理物を、２倍量の１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞懸濁液をナイロンメッシュフィルター（ポアサイズ：１００μｍ）を用いて濾過し、羊膜ＭＳＣを含む濾液を回収した。得られた濾液を４００ｘｇにて５分間遠心し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁し、細胞懸濁液を取得した。
羊膜１ｇあたりに、３００ＣＤＵ／ｍＬ精製コラゲナーゼ及び２００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）を５ｍＬ添加し、３７℃にて９０分間、６０ｒｐｍの条件にて震盪攪拌した。羊膜の酵素処理物を、２倍量の１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞懸濁液をナイロンメッシュフィルター（ポアサイズ：１００μｍ）を用いて濾過し、羊膜ＭＳＣを含む濾液を回収した。得られた濾液を４００ｘｇにて５分間遠心し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁し、細胞懸濁液を取得した。
【0153】
（工程２－３：前培養１）
羊膜の酵素処理物から得られた細胞集団を、１８９０ｃｍ２（総培養表面積）のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにてコンフルエント率９０％以上９５％以下になるまで培養した。
羊膜の酵素処理物から得られた細胞集団を、１８９０ｃｍ２（総培養表面積）のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにてコンフルエント率９０％以上９５％以下になるまで培養した。
【0154】
（工程２－４：前培養２）
工程２－３にて得られた接着状態の細胞に、ＥＤＴＡ－トリプシンを処理し、プラスチック製培養容器から細胞を剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞懸濁液の全量を、６３００ｃｍ２（総培養表面積）のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにてコンフルエント率９０％以上９５％以下になるまで培養した。
工程２－３にて得られた接着状態の細胞に、ＥＤＴＡ－トリプシンを処理し、プラスチック製培養容器から細胞を剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞懸濁液の全量を、６３００ｃｍ２（総培養表面積）のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにてコンフルエント率９０％以上９５％以下になるまで培養した。
【0155】
（工程２－５：前培養３）
工程２－４にて得られた接着状態の細胞に、ＥＤＴＡ－トリプシンを処理し、プラスチック製培養容器から細胞を剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞懸濁液の全量を、２．５ｍ２（総培養表面積）のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにてコンフルエント率９０％以上９５％以下になるまで培養した。
工程２－４にて得られた接着状態の細胞に、ＥＤＴＡ－トリプシンを処理し、プラスチック製培養容器から細胞を剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞懸濁液の全量を、２．５ｍ２（総培養表面積）のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにてコンフルエント率９０％以上９５％以下になるまで培養した。
【0156】
（工程２－６：凍結－解凍による羊膜ＭＳＣの刺激処理）
工程２－５にて得られた接着状態の細胞に、ＥＤＴＡ－トリプシンを処理し、プラスチック製培養容器から細胞を剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、０．５％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて２．０×１０７個／ｍＬ以下となるように懸濁した。１２％（ｗ／ｖ）ＨＥＳ、１０％（ｗ／ｖ）ＤＭＳＯ及び８％（ｗ／ｖ）ＨＳＡを含む凍結用保存液を調製した。細胞懸濁液と凍結用保存液とを氷上で等量混合し、４個の凍結用バッグに分注した。プログラムフリーザーを用いて、凍結用バッグを－２℃／分以上－１℃／分以下の速度で－４０℃まで冷却し、続いて－１０℃／分の速度で－９０℃まで冷却した後、－１５０℃の超低温冷凍庫内にて１４日間凍結保存した。凍結保存した４個の凍結用バッグのうち１個を３７℃恒温槽に浸し、急速に融解した。
工程２－５にて得られた接着状態の細胞に、ＥＤＴＡ－トリプシンを処理し、プラスチック製培養容器から細胞を剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、０．５％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて２．０×１０７個／ｍＬ以下となるように懸濁した。１２％（ｗ／ｖ）ＨＥＳ、１０％（ｗ／ｖ）ＤＭＳＯ及び８％（ｗ／ｖ）ＨＳＡを含む凍結用保存液を調製した。細胞懸濁液と凍結用保存液とを氷上で等量混合し、４個の凍結用バッグに分注した。プログラムフリーザーを用いて、凍結用バッグを－２℃／分以上－１℃／分以下の速度で－４０℃まで冷却し、続いて－１０℃／分の速度で－９０℃まで冷却した後、－１５０℃の超低温冷凍庫内にて１４日間凍結保存した。凍結保存した４個の凍結用バッグのうち１個を３７℃恒温槽に浸し、急速に融解した。
【0157】
（工程２－７：本培養１）
（方法）
工程２－６にて得られた融解した細胞懸濁液（凍結用バッグ１個分）を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞懸濁液の全量を、２．５ｍ２（総培養表面積）のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにてコンフルエント率９０％以上９５％以下になるまで培養した。ＥＤＴＡ－トリプシン処理及び遠心分離により、細胞（比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団）を回収した。
（方法）
工程２－６にて得られた融解した細胞懸濁液（凍結用バッグ１個分）を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞懸濁液の全量を、２．５ｍ２（総培養表面積）のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにてコンフルエント率９０％以上９５％以下になるまで培養した。ＥＤＴＡ－トリプシン処理及び遠心分離により、細胞（比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団）を回収した。
【0158】
（結果）
工程２－７にて得られた細胞の数は７．６×１０８個であった。また、本工程において、細胞を播種してからコンフルエント率９０％以上９５％以下に達するまでの培養日数は１０日であった。これらの結果から、培養１バッチあたり３．０×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）の細胞が得られたことが分かる。尚、得られた細胞の比増殖速度は０．１４（１／ｄａｙ）であった。また、得られた羊膜ＭＳＣは、細胞製剤化に好適な生細胞であった。以上の結果は、細胞製剤化に必要な羊膜ＭＳＣを大量かつ迅速に調製・製造しうることを示している。
工程２－７にて得られた細胞の数は７．６×１０８個であった。また、本工程において、細胞を播種してからコンフルエント率９０％以上９５％以下に達するまでの培養日数は１０日であった。これらの結果から、培養１バッチあたり３．０×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）の細胞が得られたことが分かる。尚、得られた細胞の比増殖速度は０．１４（１／ｄａｙ）であった。また、得られた羊膜ＭＳＣは、細胞製剤化に好適な生細胞であった。以上の結果は、細胞製剤化に必要な羊膜ＭＳＣを大量かつ迅速に調製・製造しうることを示している。
【0159】
（工程２－８：本培養２）
（方法）
工程２－７にて得られた細胞の全量を、１０．１ｍ２（総培養表面積）のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにてコンフルエント率９０％以上９５％以下になるまで培養した。ＥＤＴＡ－トリプシン処理及び遠心分離により、細胞（比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団）を回収した。
（方法）
工程２－７にて得られた細胞の全量を、１０．１ｍ２（総培養表面積）のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにてコンフルエント率９０％以上９５％以下になるまで培養した。ＥＤＴＡ－トリプシン処理及び遠心分離により、細胞（比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団）を回収した。
【0160】
（結果）
工程２－８にて得られた細胞の数は３．０×１０９個であった。また、本工程において、細胞を播種してからコンフルエント率９０％以上９５％以下に達するまでの培養日数は９日であった。これらの結果から、培養１バッチあたり３．３×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）の細胞が得られたことが分かる。尚、得られた細胞の比増殖速度は０．１５（１／ｄａｙ）であった。また、得られた羊膜ＭＳＣは、細胞製剤化に好適な生細胞であった。以上の結果は、細胞製剤化に必要な羊膜ＭＳＣを大量かつ迅速に調製・製造しうることを示している。
工程２－８にて得られた細胞の数は３．０×１０９個であった。また、本工程において、細胞を播種してからコンフルエント率９０％以上９５％以下に達するまでの培養日数は９日であった。これらの結果から、培養１バッチあたり３．３×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）の細胞が得られたことが分かる。尚、得られた細胞の比増殖速度は０．１５（１／ｄａｙ）であった。また、得られた羊膜ＭＳＣは、細胞製剤化に好適な生細胞であった。以上の結果は、細胞製剤化に必要な羊膜ＭＳＣを大量かつ迅速に調製・製造しうることを示している。
【0161】
（実施例３）
比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣ（相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣ）を、以下の一連の工程３－１から工程３－９により取得した。
比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣ（相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣ）を、以下の一連の工程３－１から工程３－９により取得した。
【0162】
（工程３－１：羊膜の採取）
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて２回洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて２回洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。
【0163】
（工程３－２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収）
（方法）
羊膜１ｇあたりに、３００ＣＤＵ／ｍＬ精製コラゲナーゼ及び２００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）を５ｍＬ添加し、３７℃にて９０分間、６０ｒｐｍの条件にて震盪攪拌した。羊膜の酵素処理物を、２倍量の１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞懸濁液をナイロンメッシュフィルター（ポアサイズ：１００μｍ）を用いて濾過し、羊膜ＭＳＣを含む濾液を回収した。ナイロンメッシュフィルター上に残留した未消化の羊膜をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色にて評価した。得られた濾液を、４００ｘｇにて５分間遠心し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むαＭＥＭにて懸濁し、細胞懸濁液を取得した。得られた細胞懸濁液の一部にチュルク染色液を混合し、細胞数を測定した。濾液から回収した羊膜ＭＳＣは、標識抗体にて４℃にて１５分間染色した後、死細胞除去のためヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）又は７－ＡＡＤ（７－Ａｍｉｎｏ－Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）を添加し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ：Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、日本ＢＤ社（以下、ＢＤ社と略す））を用いて表面抗原を解析した。標識抗体は、抗ＣＤ９０－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）を用いた。
（方法）
羊膜１ｇあたりに、３００ＣＤＵ／ｍＬ精製コラゲナーゼ及び２００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）を５ｍＬ添加し、３７℃にて９０分間、６０ｒｐｍの条件にて震盪攪拌した。羊膜の酵素処理物を、２倍量の１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞懸濁液をナイロンメッシュフィルター（ポアサイズ：１００μｍ）を用いて濾過し、羊膜ＭＳＣを含む濾液を回収した。ナイロンメッシュフィルター上に残留した未消化の羊膜をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色にて評価した。得られた濾液を、４００ｘｇにて５分間遠心し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むαＭＥＭにて懸濁し、細胞懸濁液を取得した。得られた細胞懸濁液の一部にチュルク染色液を混合し、細胞数を測定した。濾液から回収した羊膜ＭＳＣは、標識抗体にて４℃にて１５分間染色した後、死細胞除去のためヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）又は７－ＡＡＤ（７－Ａｍｉｎｏ－Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）を添加し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ：Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、日本ＢＤ社（以下、ＢＤ社と略す））を用いて表面抗原を解析した。標識抗体は、抗ＣＤ９０－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）を用いた。
【0164】
（結果）
ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色の結果、フィルター上に残留した羊膜は上皮細胞層が消化されずに保たれており、上皮細胞層内に多数の上皮細胞が存在していることが分かった。また、フィルター上に残留した羊膜はその細胞外基質層が消化されており、フィルター上に羊膜ＭＳＣは確認されなかった。これは、羊膜の細胞外基質層を標的とし、かつ羊膜の上皮細胞層を標的としないコラゲナーゼ及びディスパーゼを採用したことにより、上皮細胞をほとんど含有しない濾液が回収されたことを示している。
ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色の結果、フィルター上に残留した羊膜は上皮細胞層が消化されずに保たれており、上皮細胞層内に多数の上皮細胞が存在していることが分かった。また、フィルター上に残留した羊膜はその細胞外基質層が消化されており、フィルター上に羊膜ＭＳＣは確認されなかった。これは、羊膜の細胞外基質層を標的とし、かつ羊膜の上皮細胞層を標的としないコラゲナーゼ及びディスパーゼを採用したことにより、上皮細胞をほとんど含有しない濾液が回収されたことを示している。
【0165】
チュルク染色による細胞数測定の結果、羊膜組織から取得した細胞の数は、組織重量１ｇあたりの１．５×１０６個であることを確認した。
【0166】
フローサイトメトリーの結果、濾液から回収した細胞を含む細胞集団はＣＤ９０陽性であった。このことは、濾液から回収した細胞が、間葉系幹細胞であることを示している。
【0167】
（工程３－３：前培養１）
羊膜の酵素処理物から得られた細胞集団の一部を１５０ｃｍ２のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにて３日間培養した。
羊膜の酵素処理物から得られた細胞集団の一部を１５０ｃｍ２のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにて３日間培養した。
【0168】
（工程３－４：前培養２）
工程３－３にて得られた接着状態の細胞に、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（１×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を処理し、プラスチック製培養容器から細胞を剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞懸濁液の一部を１５０ｃｍ２のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにて７日間培養した。
工程３－３にて得られた接着状態の細胞に、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（１×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を処理し、プラスチック製培養容器から細胞を剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞懸濁液の一部を１５０ｃｍ２のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにて７日間培養した。
【0169】
（工程３－５：前培養３）
（方法）
工程３－４にて得られた接着状態の細胞に、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（１×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を処理し、プラスチック製培養容器から細胞を剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞懸濁液の一部を１５０ｃｍ２のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにて８日間培養した。この前培養により取得した細胞を前培養３細胞と称す。前培養３細胞を、以降の試験に用いた。
（方法）
工程３－４にて得られた接着状態の細胞に、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（１×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を処理し、プラスチック製培養容器から細胞を剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞懸濁液の一部を１５０ｃｍ２のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにて８日間培養した。この前培養により取得した細胞を前培養３細胞と称す。前培養３細胞を、以降の試験に用いた。
【0170】
（結果）
８日間の培養の後、前培養３細胞は６．７×１０３個／ｃｍ２得られた。この場合、前培養３細胞の比増殖速度は０．１１（１／ｄａｙ）であった。
８日間の培養の後、前培養３細胞は６．７×１０３個／ｃｍ２得られた。この場合、前培養３細胞の比増殖速度は０．１１（１／ｄａｙ）であった。
【0171】
（工程３－６：凍結－解凍による羊膜ＭＳＣの刺激処理）
（方法）
工程３－５にて得られた接着状態の細胞（前培養３細胞）に、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（１×）を処理し、プラスチック製培養容器から細胞を剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、０．５％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて２．０×１０６個／ｍＬとなるように懸濁した。１２％（ｗ／ｖ）ＨＥＳ、１０％（ｗ／ｖ）ＤＭＳＯ及び８％（ｗ／ｖ）ＨＳＡを含む凍結用保存液を調製した。細胞懸濁液と凍結用保存液とを氷上で等量混合し、クライオチューブに分注した。プログラムフリーザーを用いて、クライオチューブを－２℃／分以上－１℃／分以下の速度で－４０℃まで冷却し、続いて－１０℃／分の速度で－９０℃まで冷却した後、－１５０℃の超低温冷凍庫内にて３０日間凍結保存した。凍結保存したクライオチューブを３７℃恒温槽に浸し、急速に融解した。融解した細胞懸濁液の一部を採取し、トリパンブルーにて染色し、血球計算盤を用いて細胞の数、生存率及び大きさを計測した。
（方法）
工程３－５にて得られた接着状態の細胞（前培養３細胞）に、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（１×）を処理し、プラスチック製培養容器から細胞を剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、０．５％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて２．０×１０６個／ｍＬとなるように懸濁した。１２％（ｗ／ｖ）ＨＥＳ、１０％（ｗ／ｖ）ＤＭＳＯ及び８％（ｗ／ｖ）ＨＳＡを含む凍結用保存液を調製した。細胞懸濁液と凍結用保存液とを氷上で等量混合し、クライオチューブに分注した。プログラムフリーザーを用いて、クライオチューブを－２℃／分以上－１℃／分以下の速度で－４０℃まで冷却し、続いて－１０℃／分の速度で－９０℃まで冷却した後、－１５０℃の超低温冷凍庫内にて３０日間凍結保存した。凍結保存したクライオチューブを３７℃恒温槽に浸し、急速に融解した。融解した細胞懸濁液の一部を採取し、トリパンブルーにて染色し、血球計算盤を用いて細胞の数、生存率及び大きさを計測した。
【0172】
（結果）
凍結－解凍処理直後の浮遊状態の羊膜ＭＳＣの直径は、２２．２±５．０μｍ（すなわち、平均直径２２．２μｍ）であった。
凍結－解凍処理直後の浮遊状態の羊膜ＭＳＣの直径は、２２．２±５．０μｍ（すなわち、平均直径２２．２μｍ）であった。
【0173】
（工程３－７：本培養１）
（方法）
工程３－６にて得られた融解した細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞懸濁液の一部を１５０ｃｍ２のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにて７日間培養した。ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（１×）処理及び遠心分離により、細胞（比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団）を回収した。この工程により取得した細胞を本培養１細胞と称す。
（方法）
工程３－６にて得られた融解した細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにて懸濁した。得られた細胞懸濁液の一部を１５０ｃｍ２のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにて７日間培養した。ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（１×）処理及び遠心分離により、細胞（比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団）を回収した。この工程により取得した細胞を本培養１細胞と称す。
【0174】
（結果）
工程３－７にて得られた本培養１細胞の数は２．２×１０６個であった。この結果から、培養１バッチあたり２．１×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）の細胞が得られたことが分かる。尚、得られた細胞の比増殖速度は０．２１（１／ｄａｙ）であった。また、得られた羊膜ＭＳＣは、細胞製剤化に好適な生細胞であった。以上の結果は、細胞製剤化に必要な羊膜ＭＳＣを大量かつ迅速に調製・製造しうることを示している。
工程３－７にて得られた本培養１細胞の数は２．２×１０６個であった。この結果から、培養１バッチあたり２．１×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）の細胞が得られたことが分かる。尚、得られた細胞の比増殖速度は０．２１（１／ｄａｙ）であった。また、得られた羊膜ＭＳＣは、細胞製剤化に好適な生細胞であった。以上の結果は、細胞製剤化に必要な羊膜ＭＳＣを大量かつ迅速に調製・製造しうることを示している。
【0175】
（工程３－８：本培養２）
（方法）
工程３－７にて得られた本培養１細胞の一部を、播種密度が６．０×１０３個／ｃｍ２となるように１５０ｃｍ２のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにて５日間培養した。ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（１×）処理及び遠心分離により、細胞（比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団）を回収した。この工程により取得した細胞を継代１細胞と称す。
（方法）
工程３－７にて得られた本培養１細胞の一部を、播種密度が６．０×１０３個／ｃｍ２となるように１５０ｃｍ２のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにて５日間培養した。ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（１×）処理及び遠心分離により、細胞（比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団）を回収した。この工程により取得した細胞を継代１細胞と称す。
【0176】
（結果）
工程３－８にて得られた継代１細胞の数は４．６×１０６個であった。この結果から、培養１バッチあたり４．４×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）の細胞が得られたことが分かる。尚、得られた細胞の比増殖速度は０．３２（１／ｄａｙ）であった。また、得られた羊膜ＭＳＣは、細胞製剤化に好適な生細胞であった。以上の結果は、細胞製剤化に必要な羊膜ＭＳＣを大量かつ迅速に調製・製造しうることを示している。
工程３－８にて得られた継代１細胞の数は４．６×１０６個であった。この結果から、培養１バッチあたり４．４×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）の細胞が得られたことが分かる。尚、得られた細胞の比増殖速度は０．３２（１／ｄａｙ）であった。また、得られた羊膜ＭＳＣは、細胞製剤化に好適な生細胞であった。以上の結果は、細胞製剤化に必要な羊膜ＭＳＣを大量かつ迅速に調製・製造しうることを示している。
【0177】
（工程３－９：本培養３）
（方法）
工程３－８にて得られた継代１細胞の一部を、播種密度が２．５×１０３個／ｃｍ２となるように１５０ｃｍ２のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにて６日間培養した。ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（１×）処理及び遠心分離により、細胞（比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団）を回収した。この工程により取得した細胞を継代２細胞と称す。
Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＡ－β－Ｇａｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ）（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて、前培養３細胞及び継代２細胞の細胞老化アッセイ（細胞染色）を行った。また、本培養１細胞、継代１細胞及び継代２細胞の一部を採取し、標識抗体にて４℃にて１５分間染色した後、死細胞除去のためヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）又は７－ＡＡＤ（７－Ａｍｉｎｏ－Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）を添加し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ：ＢＤ社）を用いて表面抗原を解析した。上記の標識抗体として、抗ＣＤ９０－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ１０５－ＦＩＴＣ抗体（Ａｎｃｅｌｌ社）、抗ＣＤ７３－ＰＥ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ１０６－ＰＥ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）、抗ＣＤ３２４－ＰＥ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ３２６－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ４５－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ３４－ＰＥ抗体（ＢＤ社）及び抗ＨＬＡ－ＤＲ－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）を用いた。細胞集団における特定の発現マーカー（ＣＤ１０６、ＣＤ９０）について陽性である間葉系幹細胞の比率は、以下の手順（１）～（３）にて算出した。
（１）測定結果を、縦軸に細胞数、横軸を抗体に標識された色素の蛍光強度としたヒストグラムで展開した。
（２）アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が０．１～１．０％となる蛍光強度を決定した。
（３）特定の発現マーカー（ＣＤ１０６、ＣＤ９０）に対する抗体で測定した総細胞のうち、上記（２）で決定した蛍光強度よりも蛍光強度が高い細胞の割合を算出した。
（方法）
工程３－８にて得られた継代１細胞の一部を、播種密度が２．５×１０３個／ｃｍ２となるように１５０ｃｍ２のプラスチック製培養容器に播種し、１０％ＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにて６日間培養した。ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（１×）処理及び遠心分離により、細胞（比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣを含む細胞集団）を回収した。この工程により取得した細胞を継代２細胞と称す。
Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＡ－β－Ｇａｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ）（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて、前培養３細胞及び継代２細胞の細胞老化アッセイ（細胞染色）を行った。また、本培養１細胞、継代１細胞及び継代２細胞の一部を採取し、標識抗体にて４℃にて１５分間染色した後、死細胞除去のためヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）又は７－ＡＡＤ（７－Ａｍｉｎｏ－Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）を添加し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ：ＢＤ社）を用いて表面抗原を解析した。上記の標識抗体として、抗ＣＤ９０－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ１０５－ＦＩＴＣ抗体（Ａｎｃｅｌｌ社）、抗ＣＤ７３－ＰＥ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ１０６－ＰＥ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）、抗ＣＤ３２４－ＰＥ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ３２６－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ４５－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＤ３４－ＰＥ抗体（ＢＤ社）及び抗ＨＬＡ－ＤＲ－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ社）を用いた。細胞集団における特定の発現マーカー（ＣＤ１０６、ＣＤ９０）について陽性である間葉系幹細胞の比率は、以下の手順（１）～（３）にて算出した。
（１）測定結果を、縦軸に細胞数、横軸を抗体に標識された色素の蛍光強度としたヒストグラムで展開した。
（２）アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が０．１～１．０％となる蛍光強度を決定した。
（３）特定の発現マーカー（ＣＤ１０６、ＣＤ９０）に対する抗体で測定した総細胞のうち、上記（２）で決定した蛍光強度よりも蛍光強度が高い細胞の割合を算出した。
【0178】
（結果）
工程３－９にて得られた継代２細胞の数は３．９×１０６個であった。この結果から、培養１バッチあたり３．７×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）の細胞が得られたことが分かる。尚、得られた細胞の比増殖速度は０．３９（１／ｄａｙ）であった。また、得られた羊膜ＭＳＣは、細胞製剤化に好適な生細胞であった。以上の結果は、細胞製剤化に必要な羊膜ＭＳＣを大量かつ迅速に調製・製造しうることを示している。
工程３－９にて得られた継代２細胞の数は３．９×１０６個であった。この結果から、培養１バッチあたり３．７×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）の細胞が得られたことが分かる。尚、得られた細胞の比増殖速度は０．３９（１／ｄａｙ）であった。また、得られた羊膜ＭＳＣは、細胞製剤化に好適な生細胞であった。以上の結果は、細胞製剤化に必要な羊膜ＭＳＣを大量かつ迅速に調製・製造しうることを示している。
【0179】
継代可能回数を調べるために、工程３－９にて得られた継代２細胞をさらに継続して継代及び培養したところ、継代１０細胞（継代を１０回行なった細胞）を取得することができた。このことから、凍結－解凍処理後に得られた細胞は、少なくとも１０回継代可能であることが分かる。
【0180】
老化マーカーであるＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ＳＡ－β－Ｇａｌ）を指標として、羊膜ＭＳＣの細胞老化アッセイ（細胞染色）を行った。その結果、前培養３細胞はＳＡ－β－Ｇａｌ陽性であるのに対して、継代２細胞はＳＡ－β－Ｇａｌ陰性であった。前培養３細胞を含む細胞集団におけるＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である間葉系幹細胞の比率は、２．９±２．３％（平均比率：２．９％）であった。一方、継代２細胞を含む細胞集団におけるＳＡ－β－Ｇａｌ陰性である間葉系幹細胞の比率は、９４．３±３．９％（平均比率：９４．３％）であった。
【0181】
フローサイトメトリーの結果、本培養１細胞、継代１細胞及び継代２細胞のＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ７３はいずれも陽性であり、ＣＤ１０６、ＣＤ３２４、ＣＤ３２６、ＣＤ４５、ＣＤ３４及びＨＬＡ－ＤＲはいずれも陰性であった。本培養１細胞、継代１細胞又は継代２細胞を含む細胞集団において、ＣＤ１０６陽性である間葉系幹細胞の比率は、いずれも０．０％であった。本培養１細胞、継代１細胞又は継代２細胞を含む細胞集団において、ＣＤ９０陽性である間葉系幹細胞の比率は、それぞれ９５％、９９％、９７％であった。これらのことは、本培養１細胞、継代１細胞及び継代２細胞が、上皮細胞、血球系細胞及び血管内皮細胞をほとんど含まない羊膜ＭＳＣであることを示している。尚、得られた羊膜ＭＳＣは、細胞製剤化に好適な生細胞であった。
【0182】
（実施例４）
以下の工程４－１から工程４－３により、比増殖速度の異なる羊膜ＭＳＣの遺伝子発現の比較解析を行った。
以下の工程４－１から工程４－３により、比増殖速度の異なる羊膜ＭＳＣの遺伝子発現の比較解析を行った。
【0183】
（工程４－１：トータルＲＮＡの抽出）
（方法）
実施例３の工程３－５にて得られた接着状態の前培養３細胞（比増殖速度：０．１１（１／ｄａｙ））と、実施例３の工程３－９にて得られた接着状態の継代２細胞（比増殖速度：０．３９（１／ｄａｙ））を、セルスクレーパー（コーニング社製）を用いてプラスチック製培養容器から剥離し、遠心分離により回収した。得られた細胞ペレットにＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加してＲＮＡを安定保存した後、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出、精製した。
（方法）
実施例３の工程３－５にて得られた接着状態の前培養３細胞（比増殖速度：０．１１（１／ｄａｙ））と、実施例３の工程３－９にて得られた接着状態の継代２細胞（比増殖速度：０．３９（１／ｄａｙ））を、セルスクレーパー（コーニング社製）を用いてプラスチック製培養容器から剥離し、遠心分離により回収した。得られた細胞ペレットにＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加してＲＮＡを安定保存した後、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出、精製した。
【0184】
（結果）
ＬａｂＣｈｉｐキット及びアジレント２１００バイオアナライザーによる泳動パターン解析の結果、いずれのＲＮＡサンプルにおいても明瞭な２本のリボソームＲＮＡ（１８ＳｒＲＮＡ、２８ＳｒＲＮＡ）のピークが検出された。また、分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた定量の結果、いずれのＲＮＡサンプルもＡ２６０／Ａ２８０比が１．８から２．１の間の値であった。以上より、両ＲＮＡサンプルはアレイ解析用サンプルとして適切な純度であることが確認された。
ＬａｂＣｈｉｐキット及びアジレント２１００バイオアナライザーによる泳動パターン解析の結果、いずれのＲＮＡサンプルにおいても明瞭な２本のリボソームＲＮＡ（１８ＳｒＲＮＡ、２８ＳｒＲＮＡ）のピークが検出された。また、分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた定量の結果、いずれのＲＮＡサンプルもＡ２６０／Ａ２８０比が１．８から２．１の間の値であった。以上より、両ＲＮＡサンプルはアレイ解析用サンプルとして適切な純度であることが確認された。
【0185】
（工程４－２：マイクロアレイデータの取得）
（方法）
１００ｎｇのトータルＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによりｃＲＮＡに転写してビオチン標識を行った（３’ＩＶＴ ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを使用）。１０．０μｇの標識ｃＲＮＡをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＧｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ ２．０ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）上で１６時間のハイブリダイゼーションを行った。ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて洗浄、フィコエリスリン染色後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にてスキャンを行い、ＡＧＣＣ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｃｏｍｍａｎｄ Ｃｏｎｓｏｌｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて画像解析し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて数値化した。
（方法）
１００ｎｇのトータルＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによりｃＲＮＡに転写してビオチン標識を行った（３’ＩＶＴ ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを使用）。１０．０μｇの標識ｃＲＮＡをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＧｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ ２．０ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）上で１６時間のハイブリダイゼーションを行った。ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて洗浄、フィコエリスリン染色後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にてスキャンを行い、ＡＧＣＣ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｃｏｍｍａｎｄ Ｃｏｎｓｏｌｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて画像解析し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて数値化した。
【0186】
（結果）
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅで解析したデータにおいて、各サンプルにおけるハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨのシグナル（３’／５’）比が各々０．９８、１．０４（理想値である３以下）であったことから、得られたｃＲＮＡの品質に問題がないことを確認した。
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅで解析したデータにおいて、各サンプルにおけるハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨのシグナル（３’／５’）比が各々０．９８、１．０４（理想値である３以下）であったことから、得られたｃＲＮＡの品質に問題がないことを確認した。
【0187】
（工程４－３：マイクロアレイデータの解析）
（方法）
２アレイ分の数値データファイルを、解析ソフトＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（アジレント・テクノロジー社製）を用いて比較解析した。継代２細胞のサンプルでのＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ値を、コントロールである前培養３細胞のサンプルでのＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ値で割り算し、商が２以上のプローブを選別することにより２倍以上の発現変動をしている遺伝子（２倍以上のＦｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値を示す遺伝子）を探索した。
（方法）
２アレイ分の数値データファイルを、解析ソフトＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（アジレント・テクノロジー社製）を用いて比較解析した。継代２細胞のサンプルでのＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ値を、コントロールである前培養３細胞のサンプルでのＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ値で割り算し、商が２以上のプローブを選別することにより２倍以上の発現変動をしている遺伝子（２倍以上のＦｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値を示す遺伝子）を探索した。
【0188】
（結果）
継代２細胞と前培養３細胞のメタロチオネインのアイソフォームの遺伝子発現を比較した結果を表４に示す。
継代２細胞と前培養３細胞のメタロチオネインのアイソフォームの遺伝子発現を比較した結果を表４に示す。
【0189】
【表4】
【0190】
表４より、前培養３細胞に比べて、継代２細胞は、メタロチオネイン‐１Ｅ（ＭＴ１Ｅ）、メタロチオネイン‐１Ｆ（ＭＴ１Ｆ）、メタロチオネイン‐１Ｇ（ＭＴ１Ｇ）、メタロチオネイン‐１Ｈ（ＭＴ１Ｈ）、メタロチオネイン‐１Ｘ（ＭＴ１Ｘ）、及びメタロチオネイン‐２Ａ（ＭＴ２Ａ）について２倍以上のＦｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値を示すことが分かった。以上より、継代２細胞はこれらのメタロチオネインファミリー遺伝子を高発現していることが明らかになった。
【0191】
（実施例５）
比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣを含有する組成物を調製し、当該組成物を凍結保存及び解凍した後、組成物中の細胞の生存率を計測した。
比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣを含有する組成物を調製し、当該組成物を凍結保存及び解凍した後、組成物中の細胞の生存率を計測した。
【0192】
（方法）
実施例３の工程３－９にて得られた羊膜ＭＳＣ（継代２細胞）８．０×１０６個、デキストラン２０ｍｇ、ＤＭＳＯ５２ｍｇ及びヒト血清アルブミン４０ｍｇを含有するＲＰＭＩ１６４０培地１ｍＬからなる組成物を調製した。組成物をクライオチューブに封入し、―１５０℃にて７日間凍結状態で保存した。凍結保存した組成物を３７℃の恒温槽中にて急速解凍した後、２５℃（室温）又は３７℃（体温）にて１又は２時間静置した。得られた組成物の一部を採取し、トリパンブルーにて染色した後、血球計算盤を用いて細胞の生存率を計測した。
実施例３の工程３－９にて得られた羊膜ＭＳＣ（継代２細胞）８．０×１０６個、デキストラン２０ｍｇ、ＤＭＳＯ５２ｍｇ及びヒト血清アルブミン４０ｍｇを含有するＲＰＭＩ１６４０培地１ｍＬからなる組成物を調製した。組成物をクライオチューブに封入し、―１５０℃にて７日間凍結状態で保存した。凍結保存した組成物を３７℃の恒温槽中にて急速解凍した後、２５℃（室温）又は３７℃（体温）にて１又は２時間静置した。得られた組成物の一部を採取し、トリパンブルーにて染色した後、血球計算盤を用いて細胞の生存率を計測した。
【0193】
（結果）
解凍直後の組成物に含まれる細胞の生存率は９６．３±１．２％であった。２５℃にて１又は２時間静置した組成物に含まれる細胞の生存率は、それぞれ９４．７±１．５％、９３．０±１．０％であった。３７℃にて１又は２時間静置した組成物に含まれる細胞の生存率は、それぞれ９２．７±３．１％、９０．３±２．９％であった。以上より、２５℃及び３７℃のいずれにおいても、少なくとも２時間後まで９０％以上の高い細胞生存率を維持できることが確認された。
解凍直後の組成物に含まれる細胞の生存率は９６．３±１．２％であった。２５℃にて１又は２時間静置した組成物に含まれる細胞の生存率は、それぞれ９４．７±１．５％、９３．０±１．０％であった。３７℃にて１又は２時間静置した組成物に含まれる細胞の生存率は、それぞれ９２．７±３．１％、９０．３±２．９％であった。以上より、２５℃及び３７℃のいずれにおいても、少なくとも２時間後まで９０％以上の高い細胞生存率を維持できることが確認された。
【0194】
（実施例６）
（細胞製剤化と投与）
実施例２の工程２－８又は実施例３の工程３－９にて得られた羊膜ＭＳＣ（比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣ、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣ）の一部を医薬組成物の調製に供した。相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣ２．３×１０８個、ＨＥＳ又はデキストラン０．５０ｇ、ＤＭＳＯ１．３ｇ及びヒト血清アルブミン１．０ｇを含有するＲＰＭＩ１６４０培地２５ｍＬからなる医薬組成物（細胞製剤）を調製した。当該医薬組成物を凍結用バッグに封入し、凍結状態で保存した。
医薬組成物を使用する際には、まず、凍結保存した医薬組成物を３７℃にて急速解凍した後、解凍した医薬組成物を生理食塩水にて希釈する。次に、希釈した組成物中の細胞が均一に分散するよう穏やかに混ぜながら、静脈内注射、点滴静脈注射又は局所への直接注射により医薬組成物を患者に投与することができる。
（細胞製剤化と投与）
実施例２の工程２－８又は実施例３の工程３－９にて得られた羊膜ＭＳＣ（比増殖速度が高い羊膜ＭＳＣ、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣ）の一部を医薬組成物の調製に供した。相対的に増殖能が高い羊膜ＭＳＣ２．３×１０８個、ＨＥＳ又はデキストラン０．５０ｇ、ＤＭＳＯ１．３ｇ及びヒト血清アルブミン１．０ｇを含有するＲＰＭＩ１６４０培地２５ｍＬからなる医薬組成物（細胞製剤）を調製した。当該医薬組成物を凍結用バッグに封入し、凍結状態で保存した。
医薬組成物を使用する際には、まず、凍結保存した医薬組成物を３７℃にて急速解凍した後、解凍した医薬組成物を生理食塩水にて希釈する。次に、希釈した組成物中の細胞が均一に分散するよう穏やかに混ぜながら、静脈内注射、点滴静脈注射又は局所への直接注射により医薬組成物を患者に投与することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】