(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-06
(45)【発行日】2024-11-14
(54)【発明の名称】熱安定性グルコセレブロシダーゼ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/56 20060101AFI20241107BHJP
C12N 15/29 20060101ALI20241107BHJP
C12N 9/24 20060101ALI20241107BHJP
C07K 14/415 20060101ALI20241107BHJP
A23L 33/185 20160101ALI20241107BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20241107BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20241107BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20241107BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20241107BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20241107BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241107BHJP
A61K 38/47 20060101ALI20241107BHJP
A61K 36/31 20060101ALI20241107BHJP
A61K 36/899 20060101ALI20241107BHJP
A61K 36/42 20060101ALI20241107BHJP
A61K 36/28 20060101ALI20241107BHJP
A61K 36/81 20060101ALI20241107BHJP
A61K 36/73 20060101ALI20241107BHJP
A61K 36/88 20060101ALI20241107BHJP
A61K 36/48 20060101ALI20241107BHJP
A61K 36/896 20060101ALI20241107BHJP
【ＦＩ】
C12N15/56 ZNA
C12N15/29
C12N9/24
C07K14/415
A23L33/185
A61P3/00
A61P1/16
A61P7/06
A61P7/04
A61P19/08
A61P43/00 111
A61K38/47
A61K36/31
A61K36/899
A61K36/42
A61K36/28
A61K36/81
A61K36/73
A61K36/88
A61K36/48
A61K36/896
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2020088950
(22)【出願日】2020-05-21
(65)【公開番号】P2021182873
(43)【公開日】2021-12-02
【審査請求日】2023-05-15
(73)【特許権者】
【識別番号】399086263
【氏名又は名称】学校法人帝京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100137589
【弁理士】
【氏名又は名称】右田 俊介
(74)【代理人】
【識別番号】100158698
【弁理士】
【氏名又は名称】水野 基樹
(72)【発明者】
【氏名】古賀 仁一郎
(72)【発明者】
【氏名】山根 久和
(72)【発明者】
【氏名】宮本 皓司
(72)【発明者】
【氏名】矢沢 誠
(72)【発明者】
【氏名】窪田 朋義
【審査官】上條 のぶよ
(56)【参考文献】
【文献】特表２００６－５２４５０６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５２７７５３（ＪＰ，Ａ）
【文献】Full=Beta-glucosidase 6; Short=Os3bglu6; Flags: Precursor, Accession No. Q8L7J2.1，DATABASE UniProt[online]，2019年12月11日， [2021年03月02日検索], Retrieved from the Internet: <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/75301142?sat=48&satkey=106257349>
【文献】Beta-glucosidase 40 isoform A [Glycine soja], Accession No. RZB42136.1，GenBank[online]，2019年02月13日， [2021年03月02日検索], Retrieved from the Internet: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/RZB42136.1>
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／５６
Ｃ１２Ｎ １５／２９
Ｃ１２Ｎ ９／２４
Ｃ０７Ｋ １４／４１５
Ａ２３Ｌ ３３／１１５
Ａ６１Ｋ ３８／４７
Ａ６１Ｋ ３６／１８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（Ａ）または（Ｂ）に示されるタンパク質を有効成分として含む、ゴーシェ病予防および治療用医薬組成物。（Ａ）配列表の配列番号１、配列番号１のうちアミノ酸番号３８～５２１、配列番号２、または配列番号２のうちアミノ酸番号１９～５０３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号１、配列番号１のうちアミノ酸番号３８～５２１、配列番号２、または配列番号２のうちアミノ酸番号１９～５０３に示されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加がされたアミノ酸配列からなり、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質。
【請求項2】
以下の（Ａ）または（Ｂ）に示されるタンパク質と、植物、動物、または微生物より単離されたグルコシルセラミド、もしくは化学合成されたグルコシルセラミドと、を有効成分として含有する、肌の潤い向上用、紫外線による肌の損傷予防用、炎症性腸疾患予防用、および大腸がん予防用から選ばれる１以上の用途の食品組成物。（Ａ）配列表の配列番号１、配列番号１のうちアミノ酸番号３８～５２１、配列番号２、または配列番号２のうちアミノ酸番号１９～５０３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号１、配列番号１のうちアミノ酸番号３８～５２１、配列番号２、または配列番号２のうちアミノ酸番号１９～５０３に示されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加がされたアミノ酸配列からなり、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、グルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質（以下においては、これを「熱安定性グルコセレブロシダーゼ」という場合もある）、このタンパク質を含む酵素組成物、医薬組成物または食品組成物、このタンパク質を用いたセラミドの製造方法等に関する。
【背景技術】
【0002】
糖脂質の一種であるグルコシルセラミドを加水分解してセラミドに変換する酵素として、グルコセレブロシダーゼが知られている。このグルコセレブロシダーゼは、主に動物での存在が認められており、動物の体内においてグルコシルセラミドからセラミドを生成させるという重要な役割を果たしているが、植物ではその存在がほとんど知られていない。
【0003】
そして、ヒトにおいては、先天的にグルコセレブロシダーゼ遺伝子が欠損しており、体内のグルコシルセラミドをセラミドに変換できない先天性代謝異常症（ゴーシェ病）が知られている。このゴーシェ病では、グルコシルセラミドが体内に異常蓄積し、肝臓や脾臓の肥大、貧血や血小板の減少、骨の異常などの様々な症状が現れる（非特許文献１、２）。
【0004】
ゴーシェ病患者は、世界に約５千人以上いると言われており、その治療方法としては、主として、不足しているグルコセレブロシダーゼを点滴薬として体内に補充し、蓄積されたグルコシルセラミドをセラミドに変換させる治療が行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４，４０３－４３６ （２００３）
【文献】Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ １２９，１７８－１８８ （２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
ここで、現在、ゴーシェ病の点滴薬として用いられている酵素剤には、遺伝子組み換え技術を用いてチャイニーズハムスターの卵巣細胞において生産させたヒト由来のグルコセレブロシダーゼであるイミグルセラーゼが主に使用されている。しかしながら、このイミグルセラーゼは薬価が高額の上、熱安定性が低いために２週間に１回の補充が必要とされ、患者にとって大きな経済的負担となっているという課題がある。
【0007】
なお、動物由来のグルコセレブロシダーゼは動物の体温付近で作用する酵素であるため、いずれも上記したイミグルセラーゼと同様に熱安定性が低い。そこで、もし熱安定性を有し、補充回数が少なくて済むようなグルコセレブロシダーゼがあれば、その医療上の価値は計り知れないが、まだそのようなグルコセレブロシダーゼの報告はない。
【0008】
一方、ヒトの肌の角質などに存在するセラミドは、肌の潤いを保つために必要な成分であり、化粧品などに配合されているが、この化粧品等の有効成分としてのセラミドは、通常、化学合成により製造されている。ここで、動物や植物中の含有率が高く、比較的安価なグルコシルセラミドをグルコセレブロシダーゼにより分解してセラミドを製造し、このセラミドを化粧品や試薬などに用いることが考えられるが、上記のイミグルセラーゼは非常に高価であり、熱安定性も低いため、実用化には至っていない。なお、動物や植物中のセラミド含有率はグルコシルセラミドと異なり非常に低いため、このセラミドを直接抽出して精製する場合には莫大なコストがかかってしまう。
【0009】
そこで本発明は、グルコセレブロシダーゼ活性を有し、さらに熱安定性を有するタンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
上記課題を解決するために本発明者は鋭意検討し、植物由来であり、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質を見出した。さらにこのタンパク質は熱安定性を有することを見出し、本発明を完成させた。なお、現在までに、植物からＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼが見出されたという報告はない。
【0011】
すなわち、本発明は次の＜１＞～＜１７＞である。
＜１＞植物由来であり、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性を有する、タンパク質。
＜２＞前記植物が種子植物である、＜１＞に記載のタンパク質。
＜３＞前記種子植物が、アブラナ科植物、イネ科植物、ウリ科植物、キク科植物、ナス科植物、バラ科植物、ヒガンバナ科植物、マメ科植物、またはユリ科植物のいずれかである、＜２＞に記載のタンパク質。
＜４＞以下の（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）に示されるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号１、配列番号１のうちアミノ酸番号３８～５２１、配列番号２、または配列番号２のうちアミノ酸番号１９～５０３に示されるアミノ酸配列からなる、タンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号１、配列番号１のうちアミノ酸番号３８～５２１、配列番号２、または配列番号２のうちアミノ酸番号１９～５０３に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加がされたアミノ酸配列からなり、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号１、配列番号１のうちアミノ酸番号３８～５２１、配列番号２、または配列番号２のうちアミノ酸番号１９～５０３に示されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有し、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質。
＜５＞＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜６＞以下の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に示されるＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号３、配列番号３のうち塩基番号１１２～１５６６、配列番号４、または配列番号４のうち塩基番号５５～１５１２に示される塩基配列からなる、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号３、配列番号３のうち塩基番号１１２～１５６６、配列番号４、または配列番号４のうち塩基番号５５～１５１２に示される塩基配列において、１もしくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、または付加がされた塩基配列からなり、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号３、配列番号３のうち塩基番号１１２～１５６６、配列番号４、または配列番号４のうち塩基番号５５～１５１２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることができ、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜７＞＜５＞または＜６＞に記載のＤＮＡを含む、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質発現用の発現ベクター。
＜８＞＜７＞に記載の発現ベクターが導入された、形質転換体。
＜９＞前記形質転換体が、植物体、植物細胞、動物細胞、大腸菌、酵母、または糸状菌のいずれかである、＜８＞に記載の形質転換体。
＜１０＞＜８＞または＜９＞に記載の形質転換体を育種または培養する工程、および、この工程によって得られる前記形質転換体または前記形質転換体含有物から＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載のタンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の製造方法。
＜１１＞＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載のタンパク質を含有する、グルコシルセラミド加水分解用酵素組成物。
＜１２＞＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載のタンパク質を有効成分として含む、医薬組成物。
＜１３＞ゴーシェ病予防および治療用である、＜１２＞に記載の医薬組成物。
＜１４＞＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載のタンパク質と、植物、動物、または微生物より単離されたグルコシルセラミド、もしくは化学合成されたグルコシルセラミドと、を含有する、食品組成物。
＜１５＞＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載のタンパク質を用いて、植物、動物、または微生物より単離されたグルコシルセラミド、もしくは化学合成されたグルコシルセラミドから、セラミドを生成させる工程を含む、セラミドの製造方法。
＜１＞植物由来であり、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性を有する、タンパク質。
＜２＞前記植物が種子植物である、＜１＞に記載のタンパク質。
＜３＞前記種子植物が、アブラナ科植物、イネ科植物、ウリ科植物、キク科植物、ナス科植物、バラ科植物、ヒガンバナ科植物、マメ科植物、またはユリ科植物のいずれかである、＜２＞に記載のタンパク質。
＜４＞以下の（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）に示されるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号１、配列番号１のうちアミノ酸番号３８～５２１、配列番号２、または配列番号２のうちアミノ酸番号１９～５０３に示されるアミノ酸配列からなる、タンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号１、配列番号１のうちアミノ酸番号３８～５２１、配列番号２、または配列番号２のうちアミノ酸番号１９～５０３に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加がされたアミノ酸配列からなり、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号１、配列番号１のうちアミノ酸番号３８～５２１、配列番号２、または配列番号２のうちアミノ酸番号１９～５０３に示されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有し、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質。
＜５＞＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜６＞以下の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に示されるＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号３、配列番号３のうち塩基番号１１２～１５６６、配列番号４、または配列番号４のうち塩基番号５５～１５１２に示される塩基配列からなる、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号３、配列番号３のうち塩基番号１１２～１５６６、配列番号４、または配列番号４のうち塩基番号５５～１５１２に示される塩基配列において、１もしくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、または付加がされた塩基配列からなり、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号３、配列番号３のうち塩基番号１１２～１５６６、配列番号４、または配列番号４のうち塩基番号５５～１５１２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることができ、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜７＞＜５＞または＜６＞に記載のＤＮＡを含む、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質発現用の発現ベクター。
＜８＞＜７＞に記載の発現ベクターが導入された、形質転換体。
＜９＞前記形質転換体が、植物体、植物細胞、動物細胞、大腸菌、酵母、または糸状菌のいずれかである、＜８＞に記載の形質転換体。
＜１０＞＜８＞または＜９＞に記載の形質転換体を育種または培養する工程、および、この工程によって得られる前記形質転換体または前記形質転換体含有物から＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載のタンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の製造方法。
＜１１＞＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載のタンパク質を含有する、グルコシルセラミド加水分解用酵素組成物。
＜１２＞＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載のタンパク質を有効成分として含む、医薬組成物。
＜１３＞ゴーシェ病予防および治療用である、＜１２＞に記載の医薬組成物。
＜１４＞＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載のタンパク質と、植物、動物、または微生物より単離されたグルコシルセラミド、もしくは化学合成されたグルコシルセラミドと、を含有する、食品組成物。
＜１５＞＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載のタンパク質を用いて、植物、動物、または微生物より単離されたグルコシルセラミド、もしくは化学合成されたグルコシルセラミドから、セラミドを生成させる工程を含む、セラミドの製造方法。
【0012】
＜１６＞＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載のタンパク質、あるいは、＜１２＞または＜１３＞に記載の医薬組成物をゴーシェ病患者に投与（点滴など）することを特徴とする、ゴーシェ病予防または治療方法。
＜１７＞ゴーシェ病患者に対して３～１０週間当たり１回、グルコセレブロシダーゼ活性として１０～２００Ｕ／体重１ｋｇとなるように前記タンパク質または前記医薬組成物を投与する、＜１６＞に記載のゴーシェ病予防または治療方法。
＜１７＞ゴーシェ病患者に対して３～１０週間当たり１回、グルコセレブロシダーゼ活性として１０～２００Ｕ／体重１ｋｇとなるように前記タンパク質または前記医薬組成物を投与する、＜１６＞に記載のゴーシェ病予防または治療方法。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、グルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質を提供することができる。そして、このタンパク質を含む酵素組成物、医薬組成物、および食品組成物も提供することができ、さらには、このタンパク質を用いたセラミド製造方法の提供も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】イネ由来グルコセレブロシダーゼ（ＲＧＣ１）、およびヒト由来グルコセレブロシダーゼ（イミグルセラーゼ）の、３７℃（ｐＨ５）におけるインキュベーション時間と相対残存活性との関係を示すグラフである。
【図2】イネ由来グルコセレブロシダーゼ（ＲＧＣ１）、およびヒト由来グルコセレブロシダーゼ（イミグルセラーゼ）の、３７℃（ｐＨ７）におけるインキュベーション時間と相対残存活性との関係を示すグラフである。
【図3】ダイズ由来グルコセレブロシダーゼ（ＳＧＣ１）、およびヒト由来グルコセレブロシダーゼ（イミグルセラーゼ）の、４５℃（ｐＨ５）におけるインキュベーション時間と相対残存活性との関係を示すグラフである。
【図4】ダイズ由来グルコセレブロシダーゼ（ＳＧＣ１）、およびヒト由来グルコセレブロシダーゼ（イミグルセラーゼ）の、４５℃（ｐＨ７）におけるインキュベーション時間と相対残存活性との関係を示すグラフである。
【図5】イネ由来グルコセレブロシダーゼ（ＲＧＣ１）のアミノ酸配列である。
【図6】イネ由来グルコセレブロシダーゼ（ＲＧＣ１）をコードするＤＮＡの塩基配列である。
【図7】イネ由来グルコセレブロシダーゼ（ＲＧＣ１）のトリプシン処理により得られた９種のペプチド断片のアミノ酸配列である。
【図8】イネ由来グルコセレブロシダーゼ（ＲＧＣ１）をコードするＤＮＡのクローニングに用いたＦ－プライマーおよびＲ－プライマーの塩基配列である。
【図9】ダイズ由来グルコセレブロシダーゼ（ＳＧＣ１）のアミノ酸配列である。
【図10】ダイズ由来グルコセレブロシダーゼ（ＳＧＣ１）をコードするＤＮＡの塩基配列である。
【図11】ダイズ由来グルコセレブロシダーゼ（ＳＧＣ１）のトリプシン処理により得られた７種のペプチド断片のアミノ酸配列である。
【図12】ダイズ由来グルコセレブロシダーゼ（ＳＧＣ１）をコードするＤＮＡのクローニングに用いたＦ－プライマーおよびＲ－プライマーの塩基配列である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明について説明する。
本発明は、植物由来であり、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質（以下においては、これを「本発明のタンパク質」あるいは「本発明の熱安定性グルコセレブロシダーゼ」ともいう）、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡおよびこのＤＮＡを含む発現ベクター、この発現ベクターが導入された形質転換体およびこの形質転換体を用いた本発明のタンパク質の製造方法、本発明のタンパク質を含む酵素組成物、医薬組成物または食品組成物、本発明のタンパク質を用いたセラミドの製造方法等である。
本発明は、植物由来であり、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質（以下においては、これを「本発明のタンパク質」あるいは「本発明の熱安定性グルコセレブロシダーゼ」ともいう）、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡおよびこのＤＮＡを含む発現ベクター、この発現ベクターが導入された形質転換体およびこの形質転換体を用いた本発明のタンパク質の製造方法、本発明のタンパク質を含む酵素組成物、医薬組成物または食品組成物、本発明のタンパク質を用いたセラミドの製造方法等である。
【0016】
まず、本発明のタンパク質について詳細に説明する。
本発明のタンパク質は、植物由来であり、グリコシドハイドロラーゼファミリー１（ＧＨ１）に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質である。そして、この植物由来のＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質は、熱安定性を有している。
本発明のタンパク質は、植物由来であり、グリコシドハイドロラーゼファミリー１（ＧＨ１）に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質である。そして、この植物由来のＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質は、熱安定性を有している。
【0017】
ここで、「グルコセレブロシダーゼ活性」とは、ＥＣ番号が（ＥＣ３．２．１．４５）である酵素（グルコセレブロシダーゼ）が有する酵素活性であり、つまり糖脂質であるグルコシルセラミドのグルコースとセラミドのβ－１，４－グリコシル結合を加水分解してセラミドを生成する反応を触媒する活性である。また、「グリコシドハイドロラーゼファミリー（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ）１」とは、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＡＺｙ ｄａｔａｂｅ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）によって１３０程度に分類された糖質加水分解酵素のファミリーの１つであり、グルコセレブロシダーゼは、グリコシドハイドロラーゼファミリー１（ＧＨ１）に属するもの、グリコシドハイドロラーゼファミリー３０（ＧＨ３０）に属するもの、およびグリコシドハイドロラーゼファミリー１１６（ＧＨ１１６）に属するものが知られている。
【0018】
また、「植物由来」とは、植物の遺伝子から発現されたタンパク質であることを意味し、この植物の遺伝子は、例えば、植物の葉、茎、根、種子、実、花びら、めしべ、花粉（おしべ）、仮根、および胞子嚢からなる群から選ばれる少なくとも１つから取得することができる。
さらに、「熱安定性」とは、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（登録商標、以下同じ）および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に、０．０００２～０．０００８Ｕ／ｍＬのグルコセレブロシダーゼ活性となるようにグルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質を含む溶液において、３７℃で３０時間インキュベーションしたときにこのグルコセレブロシダーゼ活性が８０％以上残存する（このインキュベーション前のグルコセレブロシダーゼ活性を１００％としたときの相対残存活性が８０％以上である）性能を意味する。なお、この熱安定性は、上記した相対残存活性が９０％以上であるのが好ましい。ここで、このグルコセレブロシダーゼ活性は、以下のようにして測定されたものである。すなわち、１００μＭグルコシルセラミド（セレブロシドＢ、（４Ｅ，８Ｅ）－Ｎ－Ｄ－２´－ｈｙｄｒｏｘｙｐａｌｍｉｔｏｙｌ－１－Ｏ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－９－ｍｅｔｈｙｌ－４，８－ｓｐｈｉｎｇａｄｉｅｎｉｎｅ （「Ｅ」、「Ｎ」および「Ｏ」はイタリック体、「Ｄ」は小型英大文字）：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４１，（１９８８）４６９－４８０、以下同じ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に試料を所定量添加し、３７℃で１５～６０分間インキュベーションし、次いで、得られた酵素反応液に４倍量のエタノールを加え混合後、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、酵素反応により生成されたセラミド量を測定する。上記以外のグルコセレブロシダーゼ活性測定に必要な条件は、後述する実施例２に記載の方法に従って実施する。
さらに、「熱安定性」とは、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（登録商標、以下同じ）および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に、０．０００２～０．０００８Ｕ／ｍＬのグルコセレブロシダーゼ活性となるようにグルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質を含む溶液において、３７℃で３０時間インキュベーションしたときにこのグルコセレブロシダーゼ活性が８０％以上残存する（このインキュベーション前のグルコセレブロシダーゼ活性を１００％としたときの相対残存活性が８０％以上である）性能を意味する。なお、この熱安定性は、上記した相対残存活性が９０％以上であるのが好ましい。ここで、このグルコセレブロシダーゼ活性は、以下のようにして測定されたものである。すなわち、１００μＭグルコシルセラミド（セレブロシドＢ、（４Ｅ，８Ｅ）－Ｎ－Ｄ－２´－ｈｙｄｒｏｘｙｐａｌｍｉｔｏｙｌ－１－Ｏ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－９－ｍｅｔｈｙｌ－４，８－ｓｐｈｉｎｇａｄｉｅｎｉｎｅ （「Ｅ」、「Ｎ」および「Ｏ」はイタリック体、「Ｄ」は小型英大文字）：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４１，（１９８８）４６９－４８０、以下同じ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に試料を所定量添加し、３７℃で１５～６０分間インキュベーションし、次いで、得られた酵素反応液に４倍量のエタノールを加え混合後、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、酵素反応により生成されたセラミド量を測定する。上記以外のグルコセレブロシダーゼ活性測定に必要な条件は、後述する実施例２に記載の方法に従って実施する。
【0019】
そして、本発明のタンパク質は、種子植物由来であるのが好ましい。種子植物としては、限定されるものではないが、アオイ科植物、アカザ科植物、アカネ科植物、アサ科植物、アジサイ科植物、アブラナ科植物、アヤメ科植物、イネ科植物、ウコギ科植物、ウリ科植物、ウルシ科植物、カヤツリグサ科植物、キキョウ科植物、キク科植物、クスノキ科植物、クワ科植物、ケシ科植物、サトイモ科植物、サボテン科植物、シソ科植物、スイレン科植物、セリ科植物、タデ科植物、ツツジ科植物、ツバキ科植物、ナス科植物、ナデシコ科植物、ニレ科植物、ハス科植物、バラ科植物、ハス科植物、ヒガンバナ科植物、ヒルガオ科植物、ブドウ科植物、ブナ科植物、ボタン科植物、マメ科植物、ミカン科植物、ミズアオイ科植物、モクセイ科植物、ヤシ科植物、ヤナギ科植物、ユリ科植物、ラン科植物、イチイ科植物、イチョウ科植物、スギ科植物、ソテツ科植物、ヒノキ科植物、マツ科植物などが具体例として示される。
【0020】
より具体的に種子植物を例示すると、ワタ、ハイビスカス、ホウレンソウ、アカザ、ビート、アカネ、クチナシ、コーヒーノキ、アサ、ホップ、アジサイ、シロイズナズナ、アブラナ、ダイコン、ハクサイ、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、コマツマ、チンゲンサイ、ワサビ、カキツバタ、ハナショウブ、アヤメ、イネ、チモシー、コムギ、トウモロコシ、モロコシ、オオムギ、ライムギ、サトウキビ、エンバク、ヒエ、アワ、シバ、ヨシ、タケ、ササ、タラノキ、ウド、ヤツデ、キュウリ、ニガウリ、メロン、スイカ、ゴーヤ、カボチャ、ヘチマ、トウガン、ヒョウタン、ユウガオ、ウルシ、ハゼノキ、スターグラス、キキョウなど、キンケイギク、レタス、ガーベラ、ガザニア、アザミ、ゴボウ、ヒマワリ、コスモス、タンポポ、キンセンカ、フキ、ブタクサ、クスノキ、ゲッケイジュ、クワ、イチジク、ヒナゲシ、ボタンウキクサ、サトイモ、サボテン、シソ、サルビア、ラベンダー、スイレン、ニンジン、セリ、セロリ、ソバ、タデ、ツツジ、ブルーベリー、シャクナゲ、ツバキ、トマト、ナス、タバコ、ペチュニア、トウガラシ、ジャガイモ、ナデシコ、カーネーション、カスミソウ、ハコベ、ケヤキ、ムクノキ、ハス、バラ、サクラ、アーモンド、アンズ、イチゴ、ウメ、リンゴ、ナシ、ビワ、モモ、ハス、ニンニク、ネギ、タマネギ、ヒルガオ、アサガオ、サツマイモ、ブドウ、ブナ、コナラ、クヌギ、クリ、ボタン、ダイズ、ソラマメ、クロマメ、フジ、ニホンフジ、ルピナス、インゲンマメ、エンドウ、アルファルファ、ラッカセイ、スイートピー、ミヤコグサ、ウンシュウミカン、サンショウ、ナツミカン、オレンジ、ライム、レモン、グレープフルーツ、カラタチ、ホテイアオイ、オリーブ、ジャスミン、ココヤシ、アブラヤシ、ナツメヤシ、シュロ、ポプラ、ヤナギ、ユリ、ヒメユリ、チューリップ、スイセン、コチョウラン、カトレヤ、バニラ、イチイ、ハンショウブ、イチョウ、スギ、ソテツ、ヒノキ、マツなどが示される。
【0021】
この中で、アブラナ科植物、イネ科植物、ウリ科植物、キク科植物、ナス科植物、バラ科植物、ヒガンバナ科植物、マメ科植物、またはユリ科植物のいずれか由来のＧＨ１に属し且つグルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質は、その熱安定性が非常に優れるため特に好適であり、例えば、イネ由来またはダイズ由来のＧＨ１に属し且つグルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質は、そのグルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性がいずれも極めて好適である。
【0022】
なお、イネ由来である本発明の熱安定性グルコセレブロシダーゼは、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列、あるいはシグナルペプチドが切断されたアミノ酸配列であるこの配列番号１のうちアミノ酸番号３８～５２１に示されるアミノ酸配列からなる。また、ダイズ由来である本発明の熱安定性グルコセレブロシダーゼは、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列、あるいはシグナルペプチドが切断されたアミノ酸配列であるこの配列番号２のうちアミノ酸番号１９～５０３に示されるアミノ酸配列からなる。
【0023】
また、配列表の配列番号１、この配列番号１のうちアミノ酸番号３８～５２１、配列表の配列番号２、またはこの配列番号２のうちアミノ酸番号１９～５０３のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加がされたアミノ酸配列からなり、ＧＨ１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質も本発明に包含される。この場合、このタンパク質は植物由来であるのが好ましいが、植物由来でなくても良い（後述する「本発明のタンパク質」には、植物由来でないものも含まれる場合もある）。ここで、「数個」とは１０個以下であることを意味し、６個以下であるのが好ましく、５個以下であるのがより好ましい。
【0024】
なお、このアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、保存的なものである。つまり、タンパク質の性質を実質的に改変しないように１個もしくは数個のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入、または付加することである。例えば、疎水性アミノ酸残基を別の疎水性アミノ酸残基によって置換する場合、極性アミノ酸残基を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸残基によって置換する場合などが挙げられる。このような機能的に類似のアミノ酸としては、具体的には、疎水性（非極性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。また、極性アミノ酸のうち、中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【0025】
さらに、配列表の配列番号１、配列番号１のうちアミノ酸番号３８～５２１、配列番号２、または配列番号２のうちアミノ酸番号１９～５０３のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して６０％以上、より好ましくは６２％以上、さらに好ましくは６５％以上、さらに好ましくは６７％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７３％以上、さらに好ましくは７７％以上の相同性を有し、ＧＨ１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質も本発明に包含される。この場合も、このタンパク質は植物由来であるのが好ましいが、植物由来でなくても良い。ここで、「相同性」とは、相同性検索プログラムであるＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値である。
【0026】
次に、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ、およびこのＤＮＡを用いたタンパク質の製造方法について詳細に説明する。
【0027】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、このタンパク質を発現することが可能な塩基配列により構成されていれば、天然由来のものや、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものなどであって良く、限定はされない。例えば、前述したイネ由来である本発明の熱安定性グルコセレブロシダーゼをコードするＤＮＡとして、配列表の配列番号３または配列番号３のうち塩基番号１１２～１５６６に示される塩基配列からなるＤＮＡが示される。また、前述したダイズ由来である本発明の熱安定性グルコセレブロシダーゼをコードするＤＮＡとして、配列表の配列番号４または配列番号４のうち塩基番号５５～１５１２に示される塩基配列からなるＤＮＡが示される。
【0028】
さらに、配列表の配列番号３、配列番号３のうち塩基番号１１２～１５６６、配列番号４、または配列番号４のうち塩基番号５５～１５１２のいずれかに示される塩基配列において、１もしくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、または付加がされた塩基配列からなり、ＧＨ１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも例示される。ここで、「数個」とは２０個以下であることを意味し、１０個以下であるのが好ましく、６個以下であるのがより好ましい。
【0029】
さらには、配列表の配列番号３、配列番号３のうち塩基番号１１２～１５６６、配列番号４、または配列番号４のうち塩基番号５５～１５１２のいずれかに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることができ、ＧＨ１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも例示される。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件である。一例を示せば、０．７～１．０Ｍ塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液（１×ＳＳＣの組成：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を使用し、６０℃、好ましくは６５℃、より好ましくは６８℃での洗浄が１～３回行われる条件などが挙げられる。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件である。一例を示せば、０．７～１．０Ｍ塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液（１×ＳＳＣの組成：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を使用し、６０℃、好ましくは６５℃、より好ましくは６８℃での洗浄が１～３回行われる条件などが挙げられる。
【0030】
そして、本発明においては、宿主となる植物体、植物細胞、動物細胞（昆虫細胞も含む）、もしくは微生物内において複製可能であり、且つ、前述したＤＮＡを、そのコードするタンパク質を発現可能な状態で含む発現ベクターも提供される。つまり、ＧＨ１に属し、且つグルコセレブロシダーゼ活性および熱安定性を有するタンパク質発現用の発現ベクターも提供される。この発現ベクターは、例えば、宿主の細胞の染色体外に独立体として存在し、その複製が染色体ＤＮＡの複製に依存しない自己複製ベクターや、宿主の細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてこの染色体ＤＮＡとともに複製されるベクターなどを用いて構築することができ、プラスミドベクターやウイルスベクターなどが好ましい例として示される。なお、発現ベクター構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されている方法を用いることができる。
【0031】
この発現ベクターは、これを実際に導入した形質転換体において本発明のタンパク質を発現させるために、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの他に、その発現を制御する塩基配列や形質転換体を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいるのが好ましい。発現を制御する塩基配列としては、プロモーター、ターミネーター、前述したもの以外のシグナルペプチドをコードする塩基配列等が例示される。プロモーターは宿主において転写活性を示すものであれば特に限定されない。シグナルペプチドも、宿主においてタンパク質の細胞外への分泌に寄与するものなどであれば特に限定されない。また、遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択されて良いが、例えば薬剤耐性遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子などを利用することができる。
【0032】
さらに、本発明においては、上記した発現ベクターが宿主の細胞内および／または染色体ＤＮＡに導入された形質転換体も提供される。この宿主－ベクター系は特に限定されず、例えば、植物体、植物細胞、動物細胞、もしくは微生物（大腸菌、酵母、糸状菌など）を用いた系、それらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。また、上記した発現ベクターの宿主への導入、つまり上記した発現ベクターを用いた宿主の形質転換も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。ここで、形質転換させる宿主としては、植物体、植物細胞、動物細胞、大腸菌、酵母、または糸状菌のいずれかを用いるのが好ましい。つまり、上記した発現ベクターが導入された、植物体、植物細胞、動物細胞、大腸菌、酵母、または糸状菌のいずれかの形質転換体であるのが好ましい。例えば、上記した発現ベクターが導入された植物体、植物細胞、または大腸菌の形質転換体において、本発明のタンパク質を大量発現させることができる。
【0033】
そして、この形質転換体を、その形質を維持したまま発育および増殖が可能な条件で育種または培養し、得られた形質転換体（植物体、植物培養細胞、動物培養細胞など）またはその含有物（培養細胞を含む培養液や固体培地など）から本発明のタンパク質を回収することができる。したがって、本発明では、この形質転換体を育種または培養する工程、および、この工程によって得られる形質転換体もしくはその含有物から本発明のタンパク質を回収（粗製、あるいは精製）する工程を含む、本発明のタンパク質の製造方法が提供される。形質転換体の育種、培養方法およびその条件は、形質転換体がその形質を維持したまま発育および増殖可能な方法、条件であれば良く、特段限定はされないが、宿主として使用する植物体、植物細胞、動物細胞、もしくは微生物についての育種または培養方法、条件と実質的に同等であって良い。また、形質転換体を育種または培養した後、目的のタンパク質を回収する方法も、この分野で慣用されている粗製方法、精製方法を用いることができる。
【0034】
本発明のタンパク質を製造する方法の好ましい実施態様の一例として、植物体、植物細胞、または動物細胞の形質転換体を使用する方法が挙げられる。動物細胞としては、チャイニーズハムスターやヒトが挙げられる。植物体や植物細胞としては、アオイ科植物、アカザ科植物、アカネ科植物、アサ科植物、アジサイ科植物、アブラナ科植物、アヤメ科植物、イネ科植物、ウコギ科植物、ウリ科植物、ウルシ科植物、カヤツリグサ科植物、キキョウ科植物、キク科植物、クスノキ科植物、クワ科植物、ケシ科植物、サトイモ科植物、サボテン科植物、シソ科植物、スイレン科植物、セリ科植物、タデ科植物、ツツジ科植物、ツバキ科植物、ナス科植物、ナデシコ科植物、ニレ科植物、ハス科植物、バラ科植物、ハス科植物、ヒガンバナ科植物、ヒルガオ科植物、ブドウ科植物、ブナ科植物、ボタン科植物、マメ科植物、ミカン科植物、ミズアオイ科植物、モクセイ科植物、ヤシ科植物、ヤナギ科植物、ユリ科植物、ラン科植物、イチイ科植物、イチョウ科植物、スギ科植物、ソテツ科植物、ヒノキ科植物、マツ科植物などが挙げられる。より具体的には、ワタ、ハイビスカス、ホウレンソウ、アカザ、ビート、アカネ、クチナシ、コーヒーノキ、アサ、ホップ、アジサイ、シロイズナズナ、アブラナ、ダイコン、ハクサイ、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、コマツマ、チンゲンサイ、ワサビ、カキツバタ、ハナショウブ、アヤメ、イネ、チモシー、コムギ、トウモロコシ、モロコシ、オオムギ、ライムギ、サトウキビ、エンバク、ヒエ、アワ、シバ、ヨシ、タケ、ササ、タラノキ、ウド、ヤツデ、キュウリ、ニガウリ、メロン、スイカ、ゴーヤ、カボチャ、ヘチマ、トウガン、ヒョウタン、ユウガオ、ウルシ、ハゼノキ、スターグラス、キキョウなど、キンケイギク、レタス、ガーベラ、ガザニア、アザミ、ゴボウ、ヒマワリ、コスモス、タンポポ、キンセンカ、フキ、ブタクサ、クスノキ、ゲッケイジュ、クワ、イチジク、ヒナゲシ、ボタンウキクサ、サトイモ、サボテン、シソ、サルビア、ラベンダー、スイレン、ニンジン、セリ、セロリ、ソバ、タデ、ツツジ、ブルーベリー、シャクナゲ、ツバキ、トマト、ナス、タバコ、ペチュニア、トウガラシ、ジャガイモ、ナデシコ、カーネーション、カスミソウ、ハコベ、ケヤキ、ムクノキ、ハス、バラ、サクラ、アーモンド、アンズ、イチゴ、ウメ、リンゴ、ナシ、ビワ、モモ、ハス、ニンニク、ネギ、タマネギ、ヒルガオ、アサガオ、サツマイモ、ブドウ、ブナ、コナラ、クヌギ、クリ、ボタン、ダイズ、ソラマメ、クロマメ、フジ、ニホンフジ、ルピナス、インゲンマメ、エンドウ、アルファルファ、ラッカセイ、スイートピー、ミヤコグサ、ウンシュウミカン、サンショウ、ナツミカン、オレンジ、ライム、レモン、グレープフルーツ、カラタチ、ホテイアオイ、オリーブ、ジャスミン、ココヤシ、アブラヤシ、ナツメヤシ、シュロ、ポプラ、ヤナギ、ユリ、ヒメユリ、チューリップ、スイセン、コチョウラン、カトレヤ、バニラ、イチイ、ハンショウブ、イチョウ、スギ、ソテツ、ヒノキ、マツなどが挙げられる。
【0035】
また、本発明のタンパク質を製造する方法の好ましい実施態様の他の例として、大腸菌細胞、酵母細胞、あるいは糸状菌細胞の形質転換体を使用する方法が挙げられる。酵母細胞としては、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。糸状菌細胞としては、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、スタフィロトリクム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、またはアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属するものが挙げられる（括弧内の学名はいずれもイタリック体）。
【0036】
次に、本発明のタンパク質を含む酵素組成物、医薬組成物、および食品組成物等について詳細に説明する。
【0037】
本発明では、前述した本発明のタンパク質を含有する酵素組成物を提供することができる。この酵素組成物は、本発明のタンパク質を有効成分（酵素組成物が有するグルコセレブロシダーゼ活性の活性成分）として含むものであり、グルコシルセラミド加水分解用（グルコシルセラミド分子中のグルコースの加水分解用）として、つまりグルコシルセラミドのセラミドへの変換用として好適に使用することができる。
【0038】
また、本発明のタンパク質を有効成分として含有させることにより、医薬組成物を提供することができる。そして、この医薬組成物は、ゴーシェ病の予防および治療用として好適に使用することができる。また、その形態としては、点滴薬とすることが好ましいが、経口薬（錠剤、散剤、シロップ剤など）であっても良い。
【0039】
言い換えれば、本発明では、本発明のタンパク質を有効成分として含む医薬組成物をゴーシェ病患者に投与（例えば、点滴など）する、ゴーシェ病予防または治療方法を提供することができる。そして、その用法および用量は、ゴーシェ病患者に対して３～１０週間当たり１回、より好ましくは４～８週間当たり１回、グルコセレブロシダーゼ活性として１０～２００Ｕ／体重１ｋｇとなるように本発明のタンパク質または本発明のタンパク質を有効成分として含む医薬組成物（ゴーシェ病の予防および治療剤）を投与するのが好適である。なお、この場合の「Ｕ（ユニット）」とは、合成基質ｐ－ニトロフェニル－β－Ｄ－グルコピラノシド（「ｐ」はイタリック体、「Ｄ」は小型英大文字）を３７℃で１分間に１μｍｏｌ分解する単位とする。
【0040】
さらに、本発明のタンパク質と、植物、動物、または微生物（例えば担子菌など）より単離されたグルコシルセラミド、もしくは化学合成されたグルコシルセラミドと、を含有させることにより、組成物中のグルコシルセラミドからセラミドを容易に遊離させることができる食品組成物を提供することができる。そして、本発明のタンパク質と上記グルコシルセラミドとを有効成分として含有させることにより、この遊離するセラミドが機能性素材となる機能性食品として、肌潤い向上用、紫外線による肌の損傷予防用、炎症性腸疾患予防用、および大腸がん予防用から選ばれる１以上の用途の食品組成物を提供することもできる。さらには、生活習慣病（例えば糖尿病、心臓病、高血圧、高脂血症など）予防用の食品組成物を提供することもできる。
【0041】
なお、本発明では、本発明の熱安定性グルコセレブロシダーゼを有効成分として含有させることにより、機能性食品として、ゴーシェ病予防または治療用の食品組成物や、グルコシルセラミドを含有させた食品組成物とともに摂取するセラミド補給用食品組成物を提供することもできる。そして、上記したゴーシェ病予防または治療用の食品組成物の用法および用量は、前述したゴーシェ病の予防および治療用医薬組成物と同じであって良い。
【0042】
次に、本発明のタンパク質を用いたセラミドの製造方法について詳細に説明する。
本発明のタンパク質を用いたセラミドの製造方法は、本発明のタンパク質を用いて、植物、動物、または微生物（例えば担子菌など）より単離されたグルコシルセラミド、もしくは化学合成されたグルコシルセラミドから、セラミドを生成させる工程を含む。なお、この製造方法には、本発明の効果に大きな影響を与えない範囲において、上記以外の任意の工程を含んでいて良い。
本発明のタンパク質を用いたセラミドの製造方法は、本発明のタンパク質を用いて、植物、動物、または微生物（例えば担子菌など）より単離されたグルコシルセラミド、もしくは化学合成されたグルコシルセラミドから、セラミドを生成させる工程を含む。なお、この製造方法には、本発明の効果に大きな影響を与えない範囲において、上記以外の任意の工程を含んでいて良い。
【0043】
グルコシルセラミドは、セラミドと比べると動植物などの生体内に比較的多く含まれており、このようなグルコシルセラミドから、前述した形質転換体によって大量発現させることにより安価に得られる本発明の熱安定性グルコセレブロシダーゼを用いることによって、低コストでセラミドを製造することができる。そして、このようにして得られたセラミドを用いて、肌の保湿改善効果、紫外線による肌の損傷の予防効果、大腸がんの予防効果などを目的とした化粧品または機能性食品を安価に提供することができ、さらには研究用試薬、薬品としてのセラミドも安価に提供することができる。
【0044】
上記において説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするための一例に過ぎず、本発明を限定するものではない。
【0045】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明は以下の実施例にも限定されるものではなく、本発明の技術的思想内において様々な変形が可能である。
【実施例】
【0046】
（実施例１）
イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ（「Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ」はイタリック体）：日本晴）の若葉１０ｇを採取し、０．０５％コール酸ナトリウムおよび０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中においてホモジナイザーにより破砕した。この破砕液を１５０００ｒｐｍ、４℃の条件により２０分間遠心分離し、遠心上清液を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標、以下同じ）および０．０２５％コール酸ナトリウムを含む４０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を１０００倍量用いて透析し、酵素抽出液を得た。この酵素抽出液５０ｍＬに、１ｍＬのエタノールに溶解した１０ｍＭグルコシルセラミド（セレブロシドＣ、（４Ｅ，８Ｅ）－Ｎ－Ｄ－２´－ｈｙｄｒｏｘｙ－（Ｅ）－３´－ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｙｌ－１－Ｏ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－９－ｍｅｔｈｙｌ－４，８－ｓｐｈｉｎｇａｄｉｅｎｉｎｅ（「Ｅ」、「Ｎ」および「Ｏ」はイタリック体、「Ｄ」は小型英大文字）：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４１，（１９８８）４６９－４８０、以下同じ）および４９ｍＬの０．４％コール酸ナトリウムを添加し、４５℃で５時間反応させた。得られた反応液を炭酸ナトリウム溶液および水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ１１．５に調整した上で、酢酸エチル溶液を加えて混合し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件により２０分間遠心分離した。遠心分離後、得られた酢酸エチル層を乾固した後、８０％エタノール溶液にこの乾固物を溶解し、高速液体クロマトグラフィー分析に供した。すなわち、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ－１２０Ｔ カラム（４．６ｍｍ×３０ｃｍ、東ソー社製、登録商標（以下同じ））に試料を注入し、エタノール濃度８１％の溶媒を流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで流し、ＵＶ検出器（紫外吸収波長２１５ｎｍ）にて検出することにより、酵素反応によって新しく生成された物質を分取した。
そして、分取した物質の、ＩＲ（ＦＴＳ－１３５、バイオラッド社製）、１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ ＵＮＩＴＹ ｐｌｕｓ ５００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、アジレント社製）、およびＥＳＩ－ＭＳ分析（Ａｇｉｌｅｎｔ ６４６０、アジレント社製）を行った。この結果を下記表１に示す。
イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ（「Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ」はイタリック体）：日本晴）の若葉１０ｇを採取し、０．０５％コール酸ナトリウムおよび０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中においてホモジナイザーにより破砕した。この破砕液を１５０００ｒｐｍ、４℃の条件により２０分間遠心分離し、遠心上清液を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標、以下同じ）および０．０２５％コール酸ナトリウムを含む４０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を１０００倍量用いて透析し、酵素抽出液を得た。この酵素抽出液５０ｍＬに、１ｍＬのエタノールに溶解した１０ｍＭグルコシルセラミド（セレブロシドＣ、（４Ｅ，８Ｅ）－Ｎ－Ｄ－２´－ｈｙｄｒｏｘｙ－（Ｅ）－３´－ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｙｌ－１－Ｏ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－９－ｍｅｔｈｙｌ－４，８－ｓｐｈｉｎｇａｄｉｅｎｉｎｅ（「Ｅ」、「Ｎ」および「Ｏ」はイタリック体、「Ｄ」は小型英大文字）：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４１，（１９８８）４６９－４８０、以下同じ）および４９ｍＬの０．４％コール酸ナトリウムを添加し、４５℃で５時間反応させた。得られた反応液を炭酸ナトリウム溶液および水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ１１．５に調整した上で、酢酸エチル溶液を加えて混合し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件により２０分間遠心分離した。遠心分離後、得られた酢酸エチル層を乾固した後、８０％エタノール溶液にこの乾固物を溶解し、高速液体クロマトグラフィー分析に供した。すなわち、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ－１２０Ｔ カラム（４．６ｍｍ×３０ｃｍ、東ソー社製、登録商標（以下同じ））に試料を注入し、エタノール濃度８１％の溶媒を流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで流し、ＵＶ検出器（紫外吸収波長２１５ｎｍ）にて検出することにより、酵素反応によって新しく生成された物質を分取した。
そして、分取した物質の、ＩＲ（ＦＴＳ－１３５、バイオラッド社製）、１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ ＵＮＩＴＹ ｐｌｕｓ ５００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、アジレント社製）、およびＥＳＩ－ＭＳ分析（Ａｇｉｌｅｎｔ ６４６０、アジレント社製）を行った。この結果を下記表１に示す。
【0047】
【表1】
【0048】
この結果から、上記したイネ由来酵素によってセレブロシドＣから生成された物質はセレブロシドＣ由来のセラミドであることが明らかとなった。さらに、この物質はヒト由来のグルコセレブロシダーゼであるイミグルセラーゼ（サノフィ社製）によってセレブロシドＣから生成されたセラミドと上記ＩＲ、１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、およびＥＳＩ－ＭＳ分析結果が完全に一致した。これらの結果により、このイネ由来酵素にはグルコセレブロシダーゼ活性があることが明らかとなった。
【0049】
（実施例２）
イネ（日本晴）の茎１１０ｇを採取し、細かく裁断した後、０．０５％コール酸ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中においてホモジナイザーにより破砕した。この破砕液を１００００ｒｐｍ、４℃の条件において６０分間遠心分離し、遠心上清液を取り除いた。さらに、この遠心沈殿物に０．０５％コール酸ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を加え、５分攪拌後、１００００ｒｐｍ、４℃の条件において６０分間遠心分離し、遠心上清液を取り除いた。そして、この遠心沈殿物に０．０５％コール酸ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を加え、そこへグルコセレブロシダーゼの溶出に十分な量のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加した。３０分攪拌後、１８０００ｒｐｍ、４℃の条件により６０分間遠心分離した。得られた遠心上清液をデュラポア メンブレンフィルター０．４５μｍ ＨＶ（メルクミリポア社製、登録商標（以下同じ））にてろ過した後、脱塩濃縮し、酵素抽出液を得た。
イネ（日本晴）の茎１１０ｇを採取し、細かく裁断した後、０．０５％コール酸ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中においてホモジナイザーにより破砕した。この破砕液を１００００ｒｐｍ、４℃の条件において６０分間遠心分離し、遠心上清液を取り除いた。さらに、この遠心沈殿物に０．０５％コール酸ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を加え、５分攪拌後、１００００ｒｐｍ、４℃の条件において６０分間遠心分離し、遠心上清液を取り除いた。そして、この遠心沈殿物に０．０５％コール酸ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を加え、そこへグルコセレブロシダーゼの溶出に十分な量のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加した。３０分攪拌後、１８０００ｒｐｍ、４℃の条件により６０分間遠心分離した。得られた遠心上清液をデュラポア メンブレンフィルター０．４５μｍ ＨＶ（メルクミリポア社製、登録商標（以下同じ））にてろ過した後、脱塩濃縮し、酵素抽出液を得た。
【0050】
この酵素抽出液を、０．０５％コール酸ナトリウムおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化させたＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラム（アマシャムバイオサイエンス社製、登録商標（以下同じ））にアプライした。そして、０．０５％コール酸ナトリウムおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）から、０．０５％コール酸ナトリウムおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液に対して、グラジエント溶離法で溶出した。次に、グルコセレブロシダーゼ活性が強く認められた画分をプールし、限外濾過により脱塩濃縮した。この脱塩濃縮液を０．０５％コール酸ナトリウムおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化させたＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライした。そして、０．０５％コール酸ナトリウムおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）から、０．０５％コール酸ナトリウムおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．７８）中に１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液に対して、グラジエント溶離法で溶出し、分画した。そして、グルコセレブロシダーゼ活性が強く認められた酵素画分をプールし、限外濾過により脱塩濃縮した液をイネ由来グルコセレブロシダーゼ（ＲＧＣ１）とした。
【0051】
なお、画分のグルコセレブロシダーゼ活性は以下のように測定した。まず、１００μＭグルコシルセラミド（セレブロシドＢ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に試料を所定量添加し、３７℃で１５分間インキュベーションした。次いで、得られた反応液に４倍量のエタノールを加え混合後、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、遠心上清液を高速液体クロマトグラフィー分析に供した。高速液体クロマトグラフィー分析は、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ－１２０Ｔ カラム（４．６ｍｍ×３０ｃｍ）に試料を注入し、エタノール濃度８３％の溶媒を流速０．８ｍＬ／ｍｉｎで流し、ＵＶ検出器（紫外吸収波長２１５ｎｍ）にて検出することにより、酵素反応によって新しく生成されたセラミド量を測定した。セラミド量はヒト由来のグルコセレブロシダーゼであるイミグルセラーゼ（サノフィ社製）によってセレブロシドＢから生成されたセラミドを標準品として求めた。また、生成されたセラミドの分子量をネガティブＬＣ－ＭＳ（アジレント社製）で調べることによってセレブロシドＢから生成されたセラミドであることを確認した（ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：５６４．５［Ｍ－Ｈ］－）。酵素反応液中で１分間に１μｍｏｌのセラミドを生成する酵素量を１Ｕ（ユニット）として酵素液１ｍＬあたりのグルコセレブロシダーゼ活性を算出した。
【0052】
また、精製されたＲＧＣ１のタンパク質濃度は、プロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）で牛血清アルブミンをスタンダードとして、あらかじめタンパク質濃度を測定しておいたイミグルセラーゼを標品として求めた。すなわち、精製されたＲＧＣ１溶液およびイミグルセラーゼ溶液をＴＳＫｇｅｌ Ｏｃｔｙｌ－８０Ｔｓ カラム（４．６ｍｍ×１５ｃｍ、東ソー社製）に注入し、０．０５％トリフルオロ酢酸中アセトニトリル溶液比率を上げるグラジエントモードで、流速０．８ｍＬ／ｍｉｎで流し、ＵＶ検出器（紫外吸収波長２８０ｎｍ）にて検出することによって生じたピーク面積を求め、イミグルセラーゼと比較することにより精製ＲＧＣ１のタンパク質濃度を求めた。
【0053】
このＲＧＣ１を含む画分はＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて単一なバンドを示し、その平均分子量（ＭＷ）は約６２ｋＤであった。なお、ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、ＡＥ－６０００電気泳動（アトー株式会社製）およびプリキャストミニゲルｅ－ＰＡＧＥＬ（Ｅ－Ｒ１０Ｌ／ゲル濃度１０％／１８検体、アトー株式会社製）を使用して行い、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ ＭＳ Ｋｉｔ（和光純薬工業株式会社製）により銀染色を行った。分子量マーカーはＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ（バイオラッドラボラトリー社製）を使用した。
【0054】
（実施例３）
実施例２で得られたＲＧＣ１を、１２．５μＭのグルコシルセラミド（動物由来、植物由来、または糸状菌由来である下記表２の１２種のいずれか）あるいは合成β－グルコシド、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に添加し、３７℃にて１５分間インキュベーションした。次いで、得られた反応液に４倍量のエタノールを加え混合後、１５０００ｒｐｍの条件により２０分間遠心分離し、上清液中のセラミド量を高速液体クロマトグラフィーにて各種逆相カラムを用いて測定することによってグルコセレブロシダーゼ活性を求めた。セラミド量はイミグルセラーゼによって上記グルコシルセラミドから生成されたセラミドを標準品として求めた。なお、グルコセレブロシダーゼ活性は、動物由来グルコシルセラミドであるｄ１８：１（４Ｅ）－Ｃ８：０－ＧｌｕＣｅｒ（「Ｅ」はイタリック体）を基質にした場合の活性を１００とした時の相対活性で求めた（下記表２の最右列）。なお、この試験は５回行い、その相対活性の平均値を求めた。この結果を下記表２に示す。
実施例２で得られたＲＧＣ１を、１２．５μＭのグルコシルセラミド（動物由来、植物由来、または糸状菌由来である下記表２の１２種のいずれか）あるいは合成β－グルコシド、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に添加し、３７℃にて１５分間インキュベーションした。次いで、得られた反応液に４倍量のエタノールを加え混合後、１５０００ｒｐｍの条件により２０分間遠心分離し、上清液中のセラミド量を高速液体クロマトグラフィーにて各種逆相カラムを用いて測定することによってグルコセレブロシダーゼ活性を求めた。セラミド量はイミグルセラーゼによって上記グルコシルセラミドから生成されたセラミドを標準品として求めた。なお、グルコセレブロシダーゼ活性は、動物由来グルコシルセラミドであるｄ１８：１（４Ｅ）－Ｃ８：０－ＧｌｕＣｅｒ（「Ｅ」はイタリック体）を基質にした場合の活性を１００とした時の相対活性で求めた（下記表２の最右列）。なお、この試験は５回行い、その相対活性の平均値を求めた。この結果を下記表２に示す。
【0055】
【表2】
【0056】
この結果、ＲＧＣ１はｄ１８：１（４Ｅ）－Ｃ１８：０－ＧＭ３、ｄ１８：１（４Ｅ）－Ｃ８：０－ＬａｃＣｅｒのようなラクトシルセラミド、およびｄ１８：１（４Ｅ）－Ｃ８：０－ＧａｌＣｅｒのようなガラクトシルセラミド（いずれも「Ｅ」はイタリック体）を基質とした時にはほとんど反応しないことから、グルコシルセラミドのグルコース構造を特異的に認識して反応することが明らかとなった。さらに、ｐＮＰ－β－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（「ｐ」はイタリック体）にもほとんど反応しないことから、グルコシルセラミドのセラミド構造を特異的に認識して反応することも明らかとなった。これらの結果から、ＲＧＣ１はグルコセレブロシダーゼであることが判明した。また、ＲＧＣ１は、植物、動物、糸状菌由来いずれのタイプのグルコシルセラミド基質にも反応することも示された。
【0057】
（実施例４）
動物由来グルコセレブロシダーゼは、グルコセレブロシダーゼ１（ＧＢＡ１；イミグルセラーゼ、ＧＨ３０に属する）、グルコセレブロシダーゼ２（ＧＢＡ２、ＧＨ１１６に属する）、グルコセレブロシダーゼ３（ＧＢＡ３、ＧＨ１に属する）、Ｌａｃｔａｓｅ－ｐｈｌｏｒｉｚｉｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＧＨ１に属する）の４種があることが知られている。また、植物由来グルコセレブロシダーゼは、シロイズナズナからＧＨ１１６に属するグルコセレブロシダーゼ（ＡｔＧＣＤ３）が単離されている。そこで、合成グルコシルセラミド基質であるＮ－［６－［（７－ｎｉｔｒｏ－２－１，３－ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌ－４－ｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｈｅｘａｎｏｙｌ］－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｙｌ－β１－１´－ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ（Ｃ６－ＮＢＤ ｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ：「Ｎ」はイタリック体、「Ｄ」は小型英大文字）を使用して、実施例２で得られたＲＧＣ１およびイミグルセラーゼのＫcat／Ｋm値（１分子の酵素が１秒間に変換できる基質の分子数を酵素の最大反応速度の５０％の反応速度を与える基質濃度で割った値：「Ｋ」はイタリック体）を実施例２の反応方法に従ってＨａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆ ｐｌｏｔを用いて求めた。また、動物由来グルコセレブロシダーゼであるＧＢＡ３とシロイズナズナ由来グルコセレブロシダーゼであるＡｔＧＣＤ３のＫcat／Ｋm値は文献値（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８２，（２００７） ３０８８９－３０９００、およびＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９５，（２０２０） ７１７－７２８）より引用した。この結果を下記表３に示す。この結果から、ＲＧＣ１は他のグルコセレブロシダーゼに比べて明らかにＫcat／Ｋm値が高く、優れたグルコセレブロシダーゼであることが明らかとなった。
動物由来グルコセレブロシダーゼは、グルコセレブロシダーゼ１（ＧＢＡ１；イミグルセラーゼ、ＧＨ３０に属する）、グルコセレブロシダーゼ２（ＧＢＡ２、ＧＨ１１６に属する）、グルコセレブロシダーゼ３（ＧＢＡ３、ＧＨ１に属する）、Ｌａｃｔａｓｅ－ｐｈｌｏｒｉｚｉｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＧＨ１に属する）の４種があることが知られている。また、植物由来グルコセレブロシダーゼは、シロイズナズナからＧＨ１１６に属するグルコセレブロシダーゼ（ＡｔＧＣＤ３）が単離されている。そこで、合成グルコシルセラミド基質であるＮ－［６－［（７－ｎｉｔｒｏ－２－１，３－ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌ－４－ｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｈｅｘａｎｏｙｌ］－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｙｌ－β１－１´－ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ（Ｃ６－ＮＢＤ ｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ：「Ｎ」はイタリック体、「Ｄ」は小型英大文字）を使用して、実施例２で得られたＲＧＣ１およびイミグルセラーゼのＫcat／Ｋm値（１分子の酵素が１秒間に変換できる基質の分子数を酵素の最大反応速度の５０％の反応速度を与える基質濃度で割った値：「Ｋ」はイタリック体）を実施例２の反応方法に従ってＨａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆ ｐｌｏｔを用いて求めた。また、動物由来グルコセレブロシダーゼであるＧＢＡ３とシロイズナズナ由来グルコセレブロシダーゼであるＡｔＧＣＤ３のＫcat／Ｋm値は文献値（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８２，（２００７） ３０８８９－３０９００、およびＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９５，（２０２０） ７１７－７２８）より引用した。この結果を下記表３に示す。この結果から、ＲＧＣ１は他のグルコセレブロシダーゼに比べて明らかにＫcat／Ｋm値が高く、優れたグルコセレブロシダーゼであることが明らかとなった。
【0058】
【表3】
【0059】
（実施例５）
実施例２で得られたＲＧＣ１およびイミグルセラーゼを、１００μＭグルコシルセラミド（セレブロシドＢ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に添加し、各温度にて１５分間インキュベーションした。次いで、得られた反応液に４倍量のエタノールを加え混合後、１５０００ｒｐｍの条件により２０分間遠心分離し、上清液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、酵素反応により生成したセラミド量を測定した。高速液体クロマトグラフィー分析は、実施例２と同じように実施した。また、セラミド量および酵素活性の算出も実施例２と同じように実施した。そして、最もグルコセレブロシダーゼ活性の高い温度を至適温度とした。この試験は３回行い、その平均値を求めた。この結果を下記表４に示す。
この結果から、ヒト由来グルコセレブロシダーゼであるイミグルセラーゼの至適温度が４２．５℃だったのに対して、イネ由来グルコセレブロシダーゼであるＲＧＣ１の至適温度は５４．０℃と高く、ＲＧＣ１は生体内で安定性が高いことが示唆された。
実施例２で得られたＲＧＣ１およびイミグルセラーゼを、１００μＭグルコシルセラミド（セレブロシドＢ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に添加し、各温度にて１５分間インキュベーションした。次いで、得られた反応液に４倍量のエタノールを加え混合後、１５０００ｒｐｍの条件により２０分間遠心分離し、上清液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、酵素反応により生成したセラミド量を測定した。高速液体クロマトグラフィー分析は、実施例２と同じように実施した。また、セラミド量および酵素活性の算出も実施例２と同じように実施した。そして、最もグルコセレブロシダーゼ活性の高い温度を至適温度とした。この試験は３回行い、その平均値を求めた。この結果を下記表４に示す。
この結果から、ヒト由来グルコセレブロシダーゼであるイミグルセラーゼの至適温度が４２．５℃だったのに対して、イネ由来グルコセレブロシダーゼであるＲＧＣ１の至適温度は５４．０℃と高く、ＲＧＣ１は生体内で安定性が高いことが示唆された。
【0060】
【表4】
【0061】
（実施例６）
酵素では、一般的に、至適温度が高い程、その熱安定性が優れていることが知られている。実施例５より、ＲＧＣ１はイミグルセラーゼよりもグルコセレブロシダーゼ活性の至適温度が高いので、熱安定性を有することが期待された。そこで、ヒトの生体内でグルコセレブロシダーゼが主に存在および作用するリソソーム（ｐＨ５）と、細胞質（ｐＨ７）での熱安定性を確認するために以下の試験を実施した。
実施例２で得られたＲＧＣ１およびイミグルセラーゼについて、リソソームを想定したｐＨ５（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０））では３７℃で６～１０６時間、細胞質を想定したｐＨ７（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０））では３７℃で４～４８時間インキュベーションした。各時間インキュベーションした後のグルコセレブロシダーゼ活性を実施例２の方法に従って測定した。残存活性はインキュベーション前の活性を１００とした時の相対活性値として算出した。この試験は３回行い、その平均値を求めた。この結果を図１および図２に示す。なお、これらの図中において、各時間反応した後のＲＧＣ１のグルコセレブロシダーゼ活性がイミグルセラーゼのグルコセレブロシダーゼ活性よりも有意に高かった場合（１％有意）は＊印を記載した。
図１、２より、ｐＨ５、ｐＨ７のいずれにおいても、明らかにＲＧＣ１はイミグルセラーゼよりも安定性が優れ、熱安定性を有することが示された。
酵素では、一般的に、至適温度が高い程、その熱安定性が優れていることが知られている。実施例５より、ＲＧＣ１はイミグルセラーゼよりもグルコセレブロシダーゼ活性の至適温度が高いので、熱安定性を有することが期待された。そこで、ヒトの生体内でグルコセレブロシダーゼが主に存在および作用するリソソーム（ｐＨ５）と、細胞質（ｐＨ７）での熱安定性を確認するために以下の試験を実施した。
実施例２で得られたＲＧＣ１およびイミグルセラーゼについて、リソソームを想定したｐＨ５（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０））では３７℃で６～１０６時間、細胞質を想定したｐＨ７（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０））では３７℃で４～４８時間インキュベーションした。各時間インキュベーションした後のグルコセレブロシダーゼ活性を実施例２の方法に従って測定した。残存活性はインキュベーション前の活性を１００とした時の相対活性値として算出した。この試験は３回行い、その平均値を求めた。この結果を図１および図２に示す。なお、これらの図中において、各時間反応した後のＲＧＣ１のグルコセレブロシダーゼ活性がイミグルセラーゼのグルコセレブロシダーゼ活性よりも有意に高かった場合（１％有意）は＊印を記載した。
図１、２より、ｐＨ５、ｐＨ７のいずれにおいても、明らかにＲＧＣ１はイミグルセラーゼよりも安定性が優れ、熱安定性を有することが示された。
【0062】
（実施例７）
実施例２のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより得られたＲＧＣ１バンドを切り出した後、トリプシン処理を行い、得られたペプチド断片の分子質量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ－ｏｆ－Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ ＬＲＦ ２０，Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）により分析し、配列表の配列番号５～１３および図７に示す９種のペプチド断片のアミノ酸配列を決定した。
これらＲＧＣ１の９種のペプチド断片の精密分子量は、機能が未同定のイネ（日本晴）由来のＯｓ３ＢＧｌｕ６と名付けられたタンパク質由来の９種のペプチドの精密分子量と完全に一致したため、ＲＧＣ１はＯｓ３ＢＧｌｕ６と同一のタンパク質である可能性が示唆された。なお、現在までに、Ｏｓ３ＢＧｌｕ６がグルコセレブロシダーゼであるという報告はない。
実施例２のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより得られたＲＧＣ１バンドを切り出した後、トリプシン処理を行い、得られたペプチド断片の分子質量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ－ｏｆ－Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ ＬＲＦ ２０，Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）により分析し、配列表の配列番号５～１３および図７に示す９種のペプチド断片のアミノ酸配列を決定した。
これらＲＧＣ１の９種のペプチド断片の精密分子量は、機能が未同定のイネ（日本晴）由来のＯｓ３ＢＧｌｕ６と名付けられたタンパク質由来の９種のペプチドの精密分子量と完全に一致したため、ＲＧＣ１はＯｓ３ＢＧｌｕ６と同一のタンパク質である可能性が示唆された。なお、現在までに、Ｏｓ３ＢＧｌｕ６がグルコセレブロシダーゼであるという報告はない。
【0063】
（実施例８）
イネ（日本晴）のカルスからＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製、登録商標（以下同じ））を使って全ＲＮＡを抽出し、Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アジレント社製）を使って全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製した。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成とその後のＲＡＣＥ分析は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（サーモフィッシャー社製、登録商標）を使って行った。Ｏｓ３ＢＧｌｕ６のｃＤＮＡは、イネ（日本晴）の全ゲノム配列から推定されたオープンリーディングフレームより作製した配列表の配列番号１４、１５および図８に示される２つのプライマー（Ｆ－プライマー（ＲＧＣ１－ＣＮ）、およびＲ－プライマー（ＲＧＣ１－ＣＣ））を使用したＰＣＲ増幅によって得た。
具体的なＰＣＲの条件は、上記イネカルスｃＤＮＡおよび上記２種のプライマーにＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（東洋紡社製）を加え、９４℃２分間、６０℃０．５分間、６８℃１分間の反応条件を３５回繰り返すことにより増幅した。そして、増幅された断片をプラスミドベクターｐＵＣ１９にサブクローニングした。さらに、同様な方法により、増幅された断片よりも外側のＤＮＡ領域を含めたより長いＤＮＡ領域を増幅し、その断片の塩基配列を定法により解析することによって、Ｏｓ３ＢＧｌｕ６遺伝子のｃＤＮＡ全塩基配列を決定した。この塩基配列を配列表の配列番号３および図６に示す。また、この塩基配列から翻訳されたアミノ酸配列を配列表の配列番号１および図５に示す。このアミノ酸配列から、Ｏｓ３ＢＧｌｕ６がＧＨ１に属していることが明らかとなった。
イネ（日本晴）のカルスからＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製、登録商標（以下同じ））を使って全ＲＮＡを抽出し、Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アジレント社製）を使って全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製した。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成とその後のＲＡＣＥ分析は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（サーモフィッシャー社製、登録商標）を使って行った。Ｏｓ３ＢＧｌｕ６のｃＤＮＡは、イネ（日本晴）の全ゲノム配列から推定されたオープンリーディングフレームより作製した配列表の配列番号１４、１５および図８に示される２つのプライマー（Ｆ－プライマー（ＲＧＣ１－ＣＮ）、およびＲ－プライマー（ＲＧＣ１－ＣＣ））を使用したＰＣＲ増幅によって得た。
具体的なＰＣＲの条件は、上記イネカルスｃＤＮＡおよび上記２種のプライマーにＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（東洋紡社製）を加え、９４℃２分間、６０℃０．５分間、６８℃１分間の反応条件を３５回繰り返すことにより増幅した。そして、増幅された断片をプラスミドベクターｐＵＣ１９にサブクローニングした。さらに、同様な方法により、増幅された断片よりも外側のＤＮＡ領域を含めたより長いＤＮＡ領域を増幅し、その断片の塩基配列を定法により解析することによって、Ｏｓ３ＢＧｌｕ６遺伝子のｃＤＮＡ全塩基配列を決定した。この塩基配列を配列表の配列番号３および図６に示す。また、この塩基配列から翻訳されたアミノ酸配列を配列表の配列番号１および図５に示す。このアミノ酸配列から、Ｏｓ３ＢＧｌｕ６がＧＨ１に属していることが明らかとなった。
【0064】
（実施例９）
この単離されたＯｓ３ＢＧｌｕ６遺伝子がグルコセレブロシダーゼ遺伝子（ＲＧＣ１をコードする遺伝子）であることを明らかにするために、大腸菌で生産させたＯｓ３ＢＧｌｕ６にグルコセレブロシダーゼ活性があるかを調べた。実施例８において得られたＯｓ３ＢＧｌｕ６遺伝子をサブクローニングしたｐＵＣ１９を用いて、これを導入することにより大腸菌（ＤＨ５α）を形質転換した。次に、この形質転換体を、ＬＢ液体培地（１．０％トリプトン、０．５％酵母エキス、１．０％塩化ナトリウム、５０μｇ／ｍＬアンピリシリン）において、３７℃で２４時間培養し、１５０００ｒｐｍの条件により１０分間遠心分離して、集菌した。得られた菌体を、０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で２回洗浄した。その後、１５０００ｒｐｍの条件により１０分間遠心分離して集菌し、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁した後、超音波破砕した。この超音波破砕液を１８０００ｒｐｍ、４℃の条件により６０分遠心分離した。そして、遠心上清液をデュラポア メンブレンフィルター０．４５μｍ ＨＶ（メルクミリポア社製）にてろ過した後、脱塩濃縮し、酵素抽出液を得た。この酵素抽出液を、１００μＭグルコシルセラミド（セレブロシドＣ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に添加し、３７℃で１３分間インキュベーションした。次いで、得られた反応液に４倍量のエタノールを加え混合後、１５０００ｒｐｍの条件により２０分間遠心分離し、上清液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、酵素反応により生成したセラミド量を測定した。高速液体クロマトグラフィー分析は、実施例１と同じように実施した。生成されたセラミドの分子量をネガティブＬＣ－ＭＳ（アジレント社製）で調べることによって、セレブロシドＣから生成されたセラミドであることを確認した（ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：５９０．５［Ｍ－Ｈ］－）。また、酵素反応液中で１分間に１μｍｏｌのセラミドを生成する酵素量を１Ｕ（ユニット）として酵素抽出液１ｍＬあたりのグルコセレブロシダーゼ活性を算出した。この結果を下記表５に示す。
この単離されたＯｓ３ＢＧｌｕ６遺伝子がグルコセレブロシダーゼ遺伝子（ＲＧＣ１をコードする遺伝子）であることを明らかにするために、大腸菌で生産させたＯｓ３ＢＧｌｕ６にグルコセレブロシダーゼ活性があるかを調べた。実施例８において得られたＯｓ３ＢＧｌｕ６遺伝子をサブクローニングしたｐＵＣ１９を用いて、これを導入することにより大腸菌（ＤＨ５α）を形質転換した。次に、この形質転換体を、ＬＢ液体培地（１．０％トリプトン、０．５％酵母エキス、１．０％塩化ナトリウム、５０μｇ／ｍＬアンピリシリン）において、３７℃で２４時間培養し、１５０００ｒｐｍの条件により１０分間遠心分離して、集菌した。得られた菌体を、０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で２回洗浄した。その後、１５０００ｒｐｍの条件により１０分間遠心分離して集菌し、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁した後、超音波破砕した。この超音波破砕液を１８０００ｒｐｍ、４℃の条件により６０分遠心分離した。そして、遠心上清液をデュラポア メンブレンフィルター０．４５μｍ ＨＶ（メルクミリポア社製）にてろ過した後、脱塩濃縮し、酵素抽出液を得た。この酵素抽出液を、１００μＭグルコシルセラミド（セレブロシドＣ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に添加し、３７℃で１３分間インキュベーションした。次いで、得られた反応液に４倍量のエタノールを加え混合後、１５０００ｒｐｍの条件により２０分間遠心分離し、上清液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、酵素反応により生成したセラミド量を測定した。高速液体クロマトグラフィー分析は、実施例１と同じように実施した。生成されたセラミドの分子量をネガティブＬＣ－ＭＳ（アジレント社製）で調べることによって、セレブロシドＣから生成されたセラミドであることを確認した（ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：５９０．５［Ｍ－Ｈ］－）。また、酵素反応液中で１分間に１μｍｏｌのセラミドを生成する酵素量を１Ｕ（ユニット）として酵素抽出液１ｍＬあたりのグルコセレブロシダーゼ活性を算出した。この結果を下記表５に示す。
【0065】
【表5】
【0066】
この結果から、Ｏｓ３ＢＧｌｕ６遺伝子で形質転換された大腸菌から得られた酵素抽出液には明らかにグルコセレブロシダーゼ活性があることが示された。このことから、単離されたＲＧＣ１はＯｓ３ＢＧｌｕ６であり、ＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼであることが明らかとなった。なお、現在までに、植物からＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼが見出されたという報告はない。
【0067】
（実施例１０）
ＲＧＣ１のアミノ酸配列と動物由来グルコセレブロシダーゼ、およびシロイズナズナ由来グルコセレブロシダーゼＡｔＧＣＤ３のアミノ酸配列との相同性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）をＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）を用いることによって調べた結果、ＧＢＡ１とは１４．９％、ＧＢＡ２とは１０．１％、ＧＢＡ３とは３５．８％、Ｌａｃｔａｓｅ－ｐｈｌｏｒｉｚｉｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅとは１１．３％、ＡｔＧＣＤ３とは３．３％の相同性であった。この結果から、ＲＧＣ１はアミノ酸配列の面からも、今までに単離されたグルコセレブロシダーゼとは全く異なったグルコセレブロシダーゼであることが明らかとなった。
ＲＧＣ１のアミノ酸配列と動物由来グルコセレブロシダーゼ、およびシロイズナズナ由来グルコセレブロシダーゼＡｔＧＣＤ３のアミノ酸配列との相同性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）をＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）を用いることによって調べた結果、ＧＢＡ１とは１４．９％、ＧＢＡ２とは１０．１％、ＧＢＡ３とは３５．８％、Ｌａｃｔａｓｅ－ｐｈｌｏｒｉｚｉｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅとは１１．３％、ＡｔＧＣＤ３とは３．３％の相同性であった。この結果から、ＲＧＣ１はアミノ酸配列の面からも、今までに単離されたグルコセレブロシダーゼとは全く異なったグルコセレブロシダーゼであることが明らかとなった。
【0068】
（実施例１１）
ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ （Ｌ．） Ｍｅｒｒ． Ｅｎｒｅｉ（「Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ」はイタリック体）：えんれい）の茎１０２ｇを採取し、細かく裁断した後、０．０１％コール酸ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中においてホモジナイザーにより破砕した。この破砕液を１００００ｒｐｍ、４℃の条件により６０分間遠心分離し、遠心上清液を取り除いた。さらに、遠心沈殿物に０．０１％コール酸ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を加え、５分攪拌後、１００００ｒｐｍ、４℃の条件により６０分遠心分離し、遠心上清液を取り除いた。そして、得られた遠心沈殿物から、実施例２と同様の方法により酵素抽出液を得た。
ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ （Ｌ．） Ｍｅｒｒ． Ｅｎｒｅｉ（「Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ」はイタリック体）：えんれい）の茎１０２ｇを採取し、細かく裁断した後、０．０１％コール酸ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中においてホモジナイザーにより破砕した。この破砕液を１００００ｒｐｍ、４℃の条件により６０分間遠心分離し、遠心上清液を取り除いた。さらに、遠心沈殿物に０．０１％コール酸ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を加え、５分攪拌後、１００００ｒｐｍ、４℃の条件により６０分遠心分離し、遠心上清液を取り除いた。そして、得られた遠心沈殿物から、実施例２と同様の方法により酵素抽出液を得た。
【0069】
この酵素抽出液を０．０５％コール酸ナトリウムおよび０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む０．５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）で平衡化させたＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライした。そして、０．０５％コール酸ナトリウムおよび０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む０．５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）から、０．０５％コール酸ナトリウムおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中に１Ｍ塩化ナトリウムを含む液に対して、グラジエント溶離法で溶出した。次に、グルコセレブロシダーゼ活性が強く認められた画分をプールし、限外濾過により脱塩濃縮した。この脱塩濃縮液を０．０５％コール酸ナトリウムおよび０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む０．５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化させたＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライした。そして、０．０５％コール酸ナトリウムおよび０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む０．５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）から、０．０５％コール酸ナトリウムおよび０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む０．５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に１Ｍ塩化ナトリウムを含む液に対して、グラジエント溶離法で溶出し、分画した。その結果、グルコセレブロシダーゼ活性が強く認められた画分をプールし、限外濾過により脱塩濃縮した酵素液をダイズ由来グルコセレブロシダーゼ（ＳＧＣ１）とした。
【0070】
なお、画分のグルコセレブロシダーゼ活性、およびＳＧＣ１のタンパク質濃度は、実施例２と同じ方法により分析した。このＳＧＣ１画分はＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて単一なバンドを示し、その平均分子量（ＭＷ）は約６２．０ｋＤであった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥも、実施例２と同様の方法により行った。
【0071】
（実施例１２）
実施例１１で得られたＳＧＣ１およびイミグルセラーゼのグルコセレブロシダーゼ活性の至適温度について、実施例５と同じ方法により確認した。この結果を下記表６に示す。
この結果から、イミグルセラーゼの至適温度が４２．５℃だったのに対して、ＳＧＣ１の至適温度は６４．０℃と非常に高いことから、ＳＧＣ１は生体内で安定性が高い可能性が示唆された。
実施例１１で得られたＳＧＣ１およびイミグルセラーゼのグルコセレブロシダーゼ活性の至適温度について、実施例５と同じ方法により確認した。この結果を下記表６に示す。
この結果から、イミグルセラーゼの至適温度が４２．５℃だったのに対して、ＳＧＣ１の至適温度は６４．０℃と非常に高いことから、ＳＧＣ１は生体内で安定性が高い可能性が示唆された。
【0072】
【表6】
【0073】
（実施例１３）
前述したように、酵素では、至適温度が高い程、その熱安定性が優れていることが知られている。実施例１２より、ＳＧＣ１はイミグルセラーゼよりもグルコセレブロシダーゼ活性の至適温度が高いので、熱安定性を有することが期待された。そこで、リソソーム（ｐＨ５）と細胞質（ｐＨ７）での熱安定性を確認するために以下の試験を実施した。
実施例１１で得られたＳＧＣ１とイミグルセラーゼの２つのグルコセレブロシダーゼについて、リソソームを想定したｐＨ５（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０））では４５℃で１～３１時間、細胞質を想定したｐＨ７（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０））では４５℃で０．３～５時間インキュベーションした。各時間反応した後のグルコセレブロシダーゼ活性を実施例２の方法に従って測定した。残存活性はインキュベーション前の活性を１００とした時の相対活性値として算出した。この試験は３回行い、その平均値を求めた。この結果を図３、４に示す。なお、これらの図中において、各時間反応した後のＳＧＣ１のグルコセレブロシダーゼ活性がイミグルセラーゼのグルコセレブロシダーゼ活性よりも有意に高かった場合（１％有意）は＊印を記載した。
図３、４より、ｐＨ５、ｐＨ７のいずれにおいても、明らかにＳＧＣ１はイミグルセラーゼよりもはるかに安定性が優れ、熱安定性を有することが示された。
前述したように、酵素では、至適温度が高い程、その熱安定性が優れていることが知られている。実施例１２より、ＳＧＣ１はイミグルセラーゼよりもグルコセレブロシダーゼ活性の至適温度が高いので、熱安定性を有することが期待された。そこで、リソソーム（ｐＨ５）と細胞質（ｐＨ７）での熱安定性を確認するために以下の試験を実施した。
実施例１１で得られたＳＧＣ１とイミグルセラーゼの２つのグルコセレブロシダーゼについて、リソソームを想定したｐＨ５（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０））では４５℃で１～３１時間、細胞質を想定したｐＨ７（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０））では４５℃で０．３～５時間インキュベーションした。各時間反応した後のグルコセレブロシダーゼ活性を実施例２の方法に従って測定した。残存活性はインキュベーション前の活性を１００とした時の相対活性値として算出した。この試験は３回行い、その平均値を求めた。この結果を図３、４に示す。なお、これらの図中において、各時間反応した後のＳＧＣ１のグルコセレブロシダーゼ活性がイミグルセラーゼのグルコセレブロシダーゼ活性よりも有意に高かった場合（１％有意）は＊印を記載した。
図３、４より、ｐＨ５、ｐＨ７のいずれにおいても、明らかにＳＧＣ１はイミグルセラーゼよりもはるかに安定性が優れ、熱安定性を有することが示された。
【0074】
（実施例１４）
実施例１１のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより得られたＳＧＣ１バンドを切り出した後、トリプシン処理を行い、得られたペプチド断片の分子質量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ－ｏｆ－Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ ＬＲＦ ２０，Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）により分析し、配列表の配列番号１６～２２および図１１に示す７種のペプチド断片のアミノ酸配列を決定した。
これらＳＧＣ１由来の７種のペプチド断片の精密分子量は、機能が未同定の米国品種ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ （Ｌ．） Ｍｅｒｒ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２（「Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ」はイタリック体））由来のβ－グルコシダーゼ４０と名付けられたタンパク質由来の７種のペプチドの精密分子量と完全に一致したため、ＳＧＣ１はβ－グルコシダーゼ４０と同一のタンパク質である可能性が示唆された。なお、このβ－グルコシダーゼ４０はゲノム配列との相同性検索から簡易的に命名されたものであり、β－グルコシダーゼとしての酵素活性は確認されておらず、ましてやグルコセレブロシダーゼであるという報告は現在までに全くない。
実施例１１のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより得られたＳＧＣ１バンドを切り出した後、トリプシン処理を行い、得られたペプチド断片の分子質量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ－ｏｆ－Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ ＬＲＦ ２０，Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）により分析し、配列表の配列番号１６～２２および図１１に示す７種のペプチド断片のアミノ酸配列を決定した。
これらＳＧＣ１由来の７種のペプチド断片の精密分子量は、機能が未同定の米国品種ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ （Ｌ．） Ｍｅｒｒ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２（「Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ」はイタリック体））由来のβ－グルコシダーゼ４０と名付けられたタンパク質由来の７種のペプチドの精密分子量と完全に一致したため、ＳＧＣ１はβ－グルコシダーゼ４０と同一のタンパク質である可能性が示唆された。なお、このβ－グルコシダーゼ４０はゲノム配列との相同性検索から簡易的に命名されたものであり、β－グルコシダーゼとしての酵素活性は確認されておらず、ましてやグルコセレブロシダーゼであるという報告は現在までに全くない。
【0075】
（実施例１５）
ダイズ（えんれい）の葉からＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を使って全ＲＮＡを抽出し、この全ＲＮＡからＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（宝社製）を使ってｃＤＮＡを合成した。ダイズ（えんれい）由来β－グルコシダーゼ４０のｃＤＮＡは、米国品種ダイズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２）の全ゲノム配列から推定されたオープンリーディングフレームより作製した配列表の配列番号２３、２４および図１２に示される２つのプライマー（Ｆ－プライマー（ＳＧＣ１－ＣＮ）、およびＲ－プライマー（ＳＧＣ１－ＣＣ））を使用したＰＣＲ増幅によって得た。
具体的なＰＣＲの条件は、上記ダイズ（えんれい）の葉からのｃＤＮＡと上記２種のプライマーにＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（東洋紡社製）を加え、９４℃２分間、６０℃０．５分間、６８℃１分間の反応条件を４０回繰り返すことにより増幅した。そして、増幅された断片をプラスミドベクターｐＵＣ１９にサブクローニングした。さらに、同様な方法で、増幅された断片よりも外側のＤＮＡ領域を含めたより長いＤＮＡ領域を増幅し 、その断片の塩基配列を定法により解析することによって、ダイズ（えんれい）由来β－グルコシダーゼ４０遺伝子のｃＤＮＡ全塩基配列を決定した。この塩基配列を配列表の配列番号４および図１０に示す。また、この塩基配列から翻訳されたアミノ酸配列を配列表の配列番号２および図９に示す。このアミノ酸配列から、ダイズ（えんれい）由来β－グルコシダーゼ４０がＧＨ１に属していることが明らかとなった。
ダイズ（えんれい）の葉からＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を使って全ＲＮＡを抽出し、この全ＲＮＡからＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（宝社製）を使ってｃＤＮＡを合成した。ダイズ（えんれい）由来β－グルコシダーゼ４０のｃＤＮＡは、米国品種ダイズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２）の全ゲノム配列から推定されたオープンリーディングフレームより作製した配列表の配列番号２３、２４および図１２に示される２つのプライマー（Ｆ－プライマー（ＳＧＣ１－ＣＮ）、およびＲ－プライマー（ＳＧＣ１－ＣＣ））を使用したＰＣＲ増幅によって得た。
具体的なＰＣＲの条件は、上記ダイズ（えんれい）の葉からのｃＤＮＡと上記２種のプライマーにＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（東洋紡社製）を加え、９４℃２分間、６０℃０．５分間、６８℃１分間の反応条件を４０回繰り返すことにより増幅した。そして、増幅された断片をプラスミドベクターｐＵＣ１９にサブクローニングした。さらに、同様な方法で、増幅された断片よりも外側のＤＮＡ領域を含めたより長いＤＮＡ領域を増幅し 、その断片の塩基配列を定法により解析することによって、ダイズ（えんれい）由来β－グルコシダーゼ４０遺伝子のｃＤＮＡ全塩基配列を決定した。この塩基配列を配列表の配列番号４および図１０に示す。また、この塩基配列から翻訳されたアミノ酸配列を配列表の配列番号２および図９に示す。このアミノ酸配列から、ダイズ（えんれい）由来β－グルコシダーゼ４０がＧＨ１に属していることが明らかとなった。
【0076】
（実施例１６）
ダイズ（えんれい）由来β－グルコシダーゼ４０遺伝子がグルコセレブロシダーゼ遺伝子であることを明らかにするために、大腸菌で生産させたダイズ由来β－グルコシダーゼ４０遺伝子にグルコセレブロシダーゼ活性があるかを調べた。実施例１５において得られたダイズ由来β－グルコシダーゼ４０遺伝子をサブクローニングしたｐＵＣ１９を用いて、これを導入することにより大腸菌（ＤＨ５α）を形質転換した。この形質転換体を用いて、酵素反応を６０℃で３０分間インキュベーションしたこと以外は全て実施例９と同じ方法により酵素抽出液１ｍＬあたりのグルコセレブロシダーゼ活性を算出した。結果を下記表７に示す。
ダイズ（えんれい）由来β－グルコシダーゼ４０遺伝子がグルコセレブロシダーゼ遺伝子であることを明らかにするために、大腸菌で生産させたダイズ由来β－グルコシダーゼ４０遺伝子にグルコセレブロシダーゼ活性があるかを調べた。実施例１５において得られたダイズ由来β－グルコシダーゼ４０遺伝子をサブクローニングしたｐＵＣ１９を用いて、これを導入することにより大腸菌（ＤＨ５α）を形質転換した。この形質転換体を用いて、酵素反応を６０℃で３０分間インキュベーションしたこと以外は全て実施例９と同じ方法により酵素抽出液１ｍＬあたりのグルコセレブロシダーゼ活性を算出した。結果を下記表７に示す。
【0077】
【表7】
【0078】
この結果から、ダイズ（えんれい）由来β－グルコシダーゼ４０遺伝子で形質転換された大腸菌から得られた酵素抽出液には明らかにグルコセレブロシダーゼ活性があることが示された。このことから、単離されたダイズ由来ＳＧＣ１はダイズ由来β－グルコシダーゼ４０であり、ＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼであることが明らかとなった。なお、前述したように、現在までに、植物からＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼが見出されたという報告はない。
【0079】
（実施例１７）
ＳＧＣ１のアミノ酸配列と動物由来グルコセレブロシダーゼ、およびシロイズナズナ由来グルコセレブロシダーゼＡｔＧＣＤ３のアミノ酸配列との相同性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を上記したＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを用いることによって調べた結果、ＧＢＡ１とは１４．９％、ＧＢＡ２とは１０．０％、ＧＢＡ３とは３５．９％、Ｌａｃｔａｓｅ－ｐｈｌｏｒｉｚｉｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅとは １０．４％、ＡｔＧＣＤ３とは７．６％の相同性であった。この結果から、ＳＧＣ１はアミノ酸配列の面からも、今までに単離されたグルコセレブロシダーゼとは全く異なったグルコセレブロシダーゼであることが明らかとなった。
ＳＧＣ１のアミノ酸配列と動物由来グルコセレブロシダーゼ、およびシロイズナズナ由来グルコセレブロシダーゼＡｔＧＣＤ３のアミノ酸配列との相同性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を上記したＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを用いることによって調べた結果、ＧＢＡ１とは１４．９％、ＧＢＡ２とは１０．０％、ＧＢＡ３とは３５．９％、Ｌａｃｔａｓｅ－ｐｈｌｏｒｉｚｉｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅとは １０．４％、ＡｔＧＣＤ３とは７．６％の相同性であった。この結果から、ＳＧＣ１はアミノ酸配列の面からも、今までに単離されたグルコセレブロシダーゼとは全く異なったグルコセレブロシダーゼであることが明らかとなった。
【0080】
（実施例１８）
ＢＬＡＳＴｐ ｓｅａｒｃｈ （ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いることによって、ＲＧＣ１のアミノ酸配列と相同性の高いタンパク質を探索したところ、種子植物に幅広く、相同性の高いタンパク質があることが明らかとなった。なお、相同性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、上記したＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを用いることによって調べた。この結果を下記表８に示す。
ＢＬＡＳＴｐ ｓｅａｒｃｈ （ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いることによって、ＲＧＣ１のアミノ酸配列と相同性の高いタンパク質を探索したところ、種子植物に幅広く、相同性の高いタンパク質があることが明らかとなった。なお、相同性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、上記したＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを用いることによって調べた。この結果を下記表８に示す。
【0081】
【表8】
【0082】
表８より、ＲＧＣ１のアミノ酸配列は、単子葉植物由来のβ－グルコシダーゼ６およびβ－グルコシダーゼ３４との間において７３．８～８４．９％の相同性を示し、双子葉植物由来のβ－グルコシダーゼ６、β－グルコシダーゼ４０およびβ－グルコシダーゼ３４との間において６２．６～７０．０％の相同性を示した。また、シダ類やコケ類のβ－グルコシダーゼ６やβ－グルコシダーゼ４０との間において４６．６～５３．２％の相同性を示した。さらに、これらのアミノ酸配列はすべて、ＧＨ１に必要な保存領域を有し、ＧＨ１に属していた。この結果より、上記のβ－グルコシダーゼ６、β－グルコシダーゼ４０およびβ－グルコシダーゼ３４はグルコセレブロシダーゼであると考えられた。
【0083】
（実施例１９）
イネ以外の植物にも同じようにグルコセレブロシダーゼ活性があるかを調べるため、以下の試験を実施した。各種植物の葉、根、茎、花びら、めしべ、花粉、実、仮根、胞子嚢の各部位を０．０１～１ｇ採取し、０．０５％コール酸ナトリウムおよび０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中においてホモジナイザーで破砕した。この破砕液を１５０００ｒｐｍ、４℃の条件により２０分間遠心分離し、遠心上清液を酵素抽出液とした。
そして、この酵素抽出液を、１００μＭグルコシルセラミド（セレブロシドＢ）、０．０５％コール酸ナトリウムおよび０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）において、４５℃で６０分間インキュベーションした。次いで、得られた反応液に４倍量のエタノールを加え混合後、１５０００ｒｐｍの条件により２０分間遠心分離し、上清液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、酵素反応により生成したセラミド量を測定した。高速液体クロマトグラフィー分析は、実施例２と同じように実施した。また、セラミド量および酵素活性の算出も実施例２と同じように実施し、植物生重量１ｇあたりのグルコセレブロシダーゼ活性のユニット数を算出した。この試験は３回行い、その平均値を求めた。この結果を下記表９に示す。
イネ以外の植物にも同じようにグルコセレブロシダーゼ活性があるかを調べるため、以下の試験を実施した。各種植物の葉、根、茎、花びら、めしべ、花粉、実、仮根、胞子嚢の各部位を０．０１～１ｇ採取し、０．０５％コール酸ナトリウムおよび０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中においてホモジナイザーで破砕した。この破砕液を１５０００ｒｐｍ、４℃の条件により２０分間遠心分離し、遠心上清液を酵素抽出液とした。
そして、この酵素抽出液を、１００μＭグルコシルセラミド（セレブロシドＢ）、０．０５％コール酸ナトリウムおよび０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）において、４５℃で６０分間インキュベーションした。次いで、得られた反応液に４倍量のエタノールを加え混合後、１５０００ｒｐｍの条件により２０分間遠心分離し、上清液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、酵素反応により生成したセラミド量を測定した。高速液体クロマトグラフィー分析は、実施例２と同じように実施した。また、セラミド量および酵素活性の算出も実施例２と同じように実施し、植物生重量１ｇあたりのグルコセレブロシダーゼ活性のユニット数を算出した。この試験は３回行い、その平均値を求めた。この結果を下記表９に示す。
【0084】
【表9】
【0085】
この結果から、測定した全ての植物の抽出物においてグルコセレブロシダーゼ活性が認められた。表８および表９の結果を考慮すると、イネやダイズばかりでなく、植物全般にグルコセレブロシダーゼが存在することが示された。
そして、単子葉植物由来のＲＧＣ１、および双子葉植物由来のＳＧＣ１がＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼであること（実施例９および１６）、ＲＧＣ１のアミノ酸配列と相同性の高いＧＨ１に属する酵素が多くの種子植物に存在すること（実施例１８）、ならびに、上記した表９に示すように、多くの種子植物の抽出物から高いグルコセレブロシダーゼ活性を検出したことから、種子植物はＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼを有することが示された。さらに、シダ類やコケ類にもβ－グルコシダーゼ６やβ－グルコシダーゼ４０が存在することや（前述の表８）、シダ類やコケ類の抽出物からもグルコセレブロシダーゼ活性を検出したことから、シダ類やコケ類もＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼを有することが十分に示唆される。
次に相同性の面から考察すると、実施例９および１６においてＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼであることが証明されている単子葉植物由来のＲＧＣ１と双子葉植物由来のＳＧＣ１のアミノ酸配列の相同性が６７．６％であることから、少なくともＲＧＣ１とＳＧＣ１のアミノ酸配列と６７．５％以上の相同性を有する酵素は確実にＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼであると考えられる。さらに、上記した表９から、種子植物はグルコセレブロシダーゼを有することが判明したため、少なくとも、前述の表８で示される、種子植物でＲＧＣ１のアミノ酸配列と最も相同性の低い６２．６％（コウシンバラ）以上の相同性を有する酵素もＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼであると考えられる。
そして、単子葉植物由来のＲＧＣ１、および双子葉植物由来のＳＧＣ１がＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼであること（実施例９および１６）、ＲＧＣ１のアミノ酸配列と相同性の高いＧＨ１に属する酵素が多くの種子植物に存在すること（実施例１８）、ならびに、上記した表９に示すように、多くの種子植物の抽出物から高いグルコセレブロシダーゼ活性を検出したことから、種子植物はＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼを有することが示された。さらに、シダ類やコケ類にもβ－グルコシダーゼ６やβ－グルコシダーゼ４０が存在することや（前述の表８）、シダ類やコケ類の抽出物からもグルコセレブロシダーゼ活性を検出したことから、シダ類やコケ類もＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼを有することが十分に示唆される。
次に相同性の面から考察すると、実施例９および１６においてＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼであることが証明されている単子葉植物由来のＲＧＣ１と双子葉植物由来のＳＧＣ１のアミノ酸配列の相同性が６７．６％であることから、少なくともＲＧＣ１とＳＧＣ１のアミノ酸配列と６７．５％以上の相同性を有する酵素は確実にＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼであると考えられる。さらに、上記した表９から、種子植物はグルコセレブロシダーゼを有することが判明したため、少なくとも、前述の表８で示される、種子植物でＲＧＣ１のアミノ酸配列と最も相同性の低い６２．６％（コウシンバラ）以上の相同性を有する酵素もＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼであると考えられる。
【0086】
（実施例２０）
実施例１９に従って抽出した各種植物由来の酵素抽出液、ならびに前述のイネ由来精製ＲＧＣ１および前述のダイズ由来精製ＳＧＣ１を、１００μＭグルコシルセラミド（セレブロシドＢ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に添加し、各温度にて１５分間インキュベーションした。次いで、得られた反応液に４倍量のエタノールを加え混合後、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、酵素反応により生成したセラミド量を測定した。高速液体クロマトグラフィー分析は、実施例５と同じように実施した。また、セラミド量および酵素活性の算出も実施例５と同じように実施した。その結果として、最もグルコセレブロシダーゼ活性の高い温度を至適温度とした。この試験は３回行い、その平均値を求めた。この結果を下記表１０に示す。
実施例１９に従って抽出した各種植物由来の酵素抽出液、ならびに前述のイネ由来精製ＲＧＣ１および前述のダイズ由来精製ＳＧＣ１を、１００μＭグルコシルセラミド（セレブロシドＢ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．０５％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に添加し、各温度にて１５分間インキュベーションした。次いで、得られた反応液に４倍量のエタノールを加え混合後、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、酵素反応により生成したセラミド量を測定した。高速液体クロマトグラフィー分析は、実施例５と同じように実施した。また、セラミド量および酵素活性の算出も実施例５と同じように実施した。その結果として、最もグルコセレブロシダーゼ活性の高い温度を至適温度とした。この試験は３回行い、その平均値を求めた。この結果を下記表１０に示す。
【0087】
【表10】
【0088】
この結果から、イネおよびダイズを含む多くの種子植物由来グルコセレブロシダーゼにおいてもヒト由来グルコセレブロシダーゼであるイミグラセラーゼよりも至適温度が高いことが見出された。実施例６および１３で示されるように、酵素では、一般的に、至適温度が高い程、その熱安定性が優れていることが知られていることから、種子植物由来のＧＨ１に属するグルコセレブロシダーゼはヒト由来グルコセレブロシダーゼであるイミグラセラーゼよりも熱に対する安定性が優れ、つまり熱安定性を有していることを示していると言える。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】