特許 7583460 抗体－薬物コンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-06

(45)【発行日】2024-11-14

(54)【発明の名称】抗体－薬物コンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/68 20170101AFI20241107BHJP

   A61K 38/05 20060101ALI20241107BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241107BHJP

   C07K 16/32 20060101ALN20241107BHJP

   C07K 5/062 20060101ALN20241107BHJP

   C07K 5/065 20060101ALN20241107BHJP

   C07K 5/087 20060101ALN20241107BHJP

   C07K 5/083 20060101ALN20241107BHJP

   C07K 5/103 20060101ALN20241107BHJP

【ＦＩ】

A61K47/68

A61K38/05

A61P35/00

C07K16/32 ZNA

C07K5/062

C07K5/065

C07K5/087

C07K5/083

C07K5/103

【請求項の数】 23

(21)【出願番号】P 2022562980

(86)(22)【出願日】2021-04-15

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-25

(86)【国際出願番号】 CN2021087513

(87)【国際公開番号】W WO2021209007

(87)【国際公開日】2021-10-21

【審査請求日】2022-12-06

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/084880

(32)【優先日】2020-04-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】522403848

【氏名又は名称】シェンチェン・エンデュアリング・バイオテック・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｅｎｄｕｒｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｌｔｄ．

(74)【代理人】

【識別番号】100129791

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 真由美

(74)【代理人】

【識別番号】100138900

【弁理士】

【氏名又は名称】新田 昌宏

(72)【発明者】

【氏名】ウー，デチュン

(72)【発明者】

【氏名】リウ，シューミン

(72)【発明者】

【氏名】イン，シューチアン

(72)【発明者】

【氏名】ウェン，ユィ

【審査官】三上 晶子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１５－５３３８４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１９－５３７５７２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ４７／６８

Ａ６１Ｋ ３８／０５

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ０７Ｋ １６／３２

Ｃ０７Ｋ ５／０６２

Ｃ０７Ｋ ５／０６５

Ｃ０７Ｋ ５／０８７

Ｃ０７Ｋ ５／０８３

Ｃ０７Ｋ ５／１０３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉｂ）：

【化1】

［式中、
Ｐは、非免疫原性ポリマーであり、該非免疫原性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、そして、該ＰＥＧの総分子量は、１０，０００～８０，０００ダルトンであり；
Ｍは、Ｈ、または、Ｃ_１－５０アルキルおよびアリールから選択される末端キャッピング基であり、ここで、前記アルキルの１つ以上の炭素は、ヘテロ原子で任意に置き換えられていてもよく；
ｙは、１～１０から選択される整数であり；
Ａは、抗体の抗原結合フラグメントであり；
Ｔは、ヒドロキシル、アミノ、ヒドラジニル、アジド、アルケン、アルキン、カルボキシル（アルデヒド、ケトン、エステル、カルボン酸、酸無水物、ハロゲン化アシル）、チオール、ジスルフィド、ニトリル、エポキシド、イミン、ニトロ、およびハライドから独立して選択される３つの官能基を有する分子に由来する三官能性リンカーであり、そして、Ｔと（Ｌ^１）_ａとの間の結合およびＴと（Ｌ^２）_ｂとの間の結合は、同一または異なり；
Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、ヘテロまたはホモ二官能性リンカーであり；
ａおよびｂは、それぞれ、０～１０から選択される整数であり；
Ｂは、分岐リンカーであり、ここで、各分枝は、自壊スペーサーに連結されたアミノ酸配列または炭水化物部分を有していて、酵素によるアミノ酸配列または炭水化物部分の切断により自壊メカニズムが誘発されて、Ｄが放出されるか、あるいは、各分枝は、ジスルフィド結合または切断可能な結合を有していて、ジスルフィド結合または切断可能な結合の切断により、Ｄが放出され、そして、該分岐リンカーＢは、伸長スペーサー、トリガーユニット、自壊スペーサー、またはそれらの任意の組み合わせを含み、場合により、該トリガーユニットは、カテプシンＢ、プラスミン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、β－グルクロニダーゼ、β－ガラクトシダーゼなどの酵素によって切断可能な、アミノ酸配列またはβ－グルコロニドまたはβ－ガラクトシドのトリガー部分；酸性ｐＨ条件で薬物Ｄを放出できるｐＨ感受性リンカー；または、グルタチオン、チオレドキシンファミリーメンバー（ＷＣＧＨ／ＰＣＫ）またはチオレダクターゼによって薬物Ｄを放出できるジスルフィド結合リンカー、である、
Ｄは、それぞれ独立して、細胞傷害性小分子であり；および、
ｎは、２～２５から選択される整数である。］
で示される、化合物。

【請求項2】

Ｔが、リジンであるか、またはリジンに由来するものである、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

式（Ｉｃ）：

【化2】

［式中、
Ｐは、直鎖ＰＥＧであり、該ＰＥＧの総分子量は、１０，０００～８０，０００ダルトンであり；
Ａは、抗体の抗原結合フラグメントであり；
Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、二官能性リンカーであり；
ａおよびｂは、それぞれ、０～１０から選択される整数であり；
Ｂは、分岐リンカーであり、ここで、各分枝は、自壊スペーサーに連結されたアミノ酸配列または炭水化物部分を有していて、酵素によるアミノ酸配列または炭水化物部分の切断により自壊メカニズムが誘発されて、Ｄが放出されるか、あるいは、各分枝は、ジスルフィド結合または切断可能な結合を有していて、ジスルフィド結合または切断可能な結合の切断により、Ｄが放出され、そして、該分岐リンカーＢは、伸長スペーサー、トリガーユニット、自壊スペーサー、またはそれらの任意の組み合わせを含み、場合により、該トリガーユニットは、カテプシンＢ、プラスミン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、β－グルクロニダーゼ、β－ガラクトシダーゼなどの酵素によって切断可能な、アミノ酸配列またはβ－グルコロニドまたはβ－ガラクトシドのトリガー部分；酸性ｐＨ条件で薬物Ｄを放出できるｐＨ感受性リンカー；または、グルタチオン、チオレドキシンファミリーメンバー（ＷＣＧＨ／ＰＣＫ）またはチオレダクターゼによって薬物Ｄを放出できるジスルフィド結合リンカー、である、
Ｄは、それぞれ独立して、細胞傷害性小分子であり；
ｎは、２～２５から選択される整数である。］
で示される、化合物。

【請求項4】

Ｌ^１のリンカー末端の官能基が、Ａとの部位特異的コンジュゲーションが可能であり、そして、チオール、マレイミド、２－ピリジルジチオ変異体、芳香族スルホンまたはビニルスルホン、アクリレート、ブロモまたはヨードアセトアミド、アジド、アルキン、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）、カルボニル、２－アミノベンズアルデヒドまたは２－アミノアセトフェノン基、ヒドラジド、オキシム、アシルトリフルオロホウ酸カリウム、Ｏ－カルバモイルヒドロキシルアミン、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン、テトラジン、トリアリールホスフィン、ボロン酸、およびヨウ素、からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項5】

抗体が、単一特異性または多重特異性の、一本鎖抗体、単一特異性または多重特異性のナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、または、単一特異性または多重特異性のそれらの抗原結合ドメインである、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項6】

Ａが、二重特異性抗体フラグメント、例えば二重特異性一本鎖抗体、であり、
二重特異性抗体フラグメントの２つの結合ドメインが、同じ腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合するか、２つの異なるＴＡＡに結合するか、または、ＴＡＡ、およびＴ細胞またはＮＫ細胞上で発現される抗原（例えば、Ｔ細胞受容体の成分）に結合する、請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項7】

Ａが、抗Ｈｅｒ２ＩＩ×抗Ｈｅｒ２ＩＶ一本鎖二重特異性抗体である、請求項６に記載の化合物。

【請求項8】

Ａが、配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の化合物。

【請求項9】

二重特異性一本鎖抗体の２つの結合ドメインが、リンカーを介して連結され、そして、該リンカーが、抗体のＬ^１への部位特異的コンジュゲーションのための非天然アミノ酸残基またはシステインを含む、請求項６～８のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項10】

非天然アミノ酸が、遺伝的にコードされたアルケンリジン（例えば、Ｎ６－（ヘキサ－５－エノイル）－Ｌ－リジン）、２－アミノ－８－オキソノナン酸、ｍまたはｐ－アセチル－フェニルアラニン、β－ジケトン側鎖を有するアミノ酸（例えば、２－アミノ－３－（４－（３－オキソブタノイル）フェニル）プロパン酸）、（Ｓ）－２－アミノ－６－（（（１Ｒ，２Ｒ）－２－アジドシクロペンチルオキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸、アジドホモアラニン、ピロリシン類似体Ｎ６－（（プロパ－２－イン－１－イルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、（Ｓ）－２－アミノ－６－ペンタ－４－インアミドヘキサン酸、（Ｓ）－２－アミノ－６－（（プロパ－２－インイルオキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸、（Ｓ）－２－アミノ－６－（（２－アジドエトキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸、ｐ－アジドフェニルアラニン、パラ－アジドフェニルアラニン、Ｎε－アクリロイル－１－リジン、Ｎε－５－ノルボルネン－２－イルオキシカルボニル－１－リジン、Ｎ－ε－（シクロオクタ－２－イン－１－イルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、Ｎ－ε－（２－（シクロオクタ－２－イン－１－イルオキシ）エチル）カルボニル－Ｌ－リジン、遺伝的にコードされたテトラジンアミノ酸（例えば、４－（６－メチル－ｓ－テトラジン－３－イル）アミノフェニルアラニン）、から選択される、請求項９に記載の化合物。

【請求項11】

Ｄが、ＤＮＡ架橋剤、微小管阻害剤、ＤＮＡアルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項12】

Ｄが、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＳＮ３８、ＤＭ１、ＤＭ４、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、デュオカルマイシン、またはそれらの誘導体、またはそれらの組み合わせから選択されるか、または、
Ｄが、ビンカアルカロイド、ラウリマリド、タキサン、コルヒチン、ツブリシン（tubulysin）、クリプトフィシン（Cryptophycin）、ヘミアステリン（Hemiasterlin）、セマドチン（Cemadotin）、リゾキシン（Rhizoxin）、ディスコデルモライド（Discodermolide）、タッカロノリド（taccalonolide）ＡまたはＢまたはＡＦまたはＡＪ、タッカロノリド（taccalonolide）ＡＩ－エポキシド、ＣＡ－４、エポチロンＡおよびＢ、ラウリマリド、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、カンプトテシン、ｉＳＧＤ－１８８２、センタナマイシン（centanamycin）、ＰＮＵ－１５９６８２、ウンシアラマイシン（uncialamycin）、インドリノベンゾジアゼピン二量体、β－アマニチン、アマトキシン、タイランスタチン（thailanstatin）、またはそれらの類似体、またはそれらの組み合わせから選択される、
請求項１１に記載の化合物。

【請求項13】

ＰＥＧが、直鎖ＰＥＧ、または分岐ＰＥＧであり、
ポリエチレングリコールの少なくとも１つの末端が、メチルまたは低分子量アルキルでキャッピングされている、請求項１～２または４～１２のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項14】

ＰＥＧが、永続的な結合または切断可能な結合を介して、Ｔ（例えば、リジン）に結合している、請求項１３に記載の化合物。

【請求項15】

ＰＥＧの総分子量が、２０，０００～４０，０００である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項16】

Ｌ^１およびＬ^２が、それぞれ独立して、
－（ＣＨ_２）_ａＸＹ（ＣＨ_２）_ｂ－、
－Ｘ（ＣＨ_２）_ａＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃ（ＣＨ_２）_ｂＹ－、
－（ＣＨ_２）ヘテロシクリル－、
－（ＣＨ_２）_ａＸ－、
－Ｘ（ＣＨ_２）_ａＹ－、
－Ｗ_１－（ＣＨ_２）_ａＣ（Ｏ）ＮＲ_１（ＣＨ_２）_ｂＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃ（ＣＨ_２）_ｄＣ（Ｏ）－、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ａＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２）_ｃＷ_２Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｄＮＲ_１－、
－Ｗ_３－（ＣＨ_２）_ａＣ（Ｏ）ＮＲ_１（ＣＨ_２）_ｂＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃ（ＣＨ_２）_ｄＷ_２Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｅＣ（Ｏ）－、
［式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅは、それぞれ、０～２５から独立して選択される整数であり；ＸおよびＹは、それぞれ、Ｃ（＝Ｏ）、ＮＲ_１、Ｓ、Ｏ、ＣＲ_２Ｒ_３、または不存在から独立して選択され；Ｒ_１およびＲ_２は、独立して、水素、Ｃ_１－１０アルキル、または（ＣＨ_２）_１－１０Ｃ（＝Ｏ）を表し；Ｗ_１および／またはＷ_３は、マレイミドをベースとした部分に由来し、Ｗ_２は、トリアゾリルまたはテトラゾリル含有基を表し；ヘテロシクリル基は、マレイミド由来の部分またはテトラゾリルをベースとした部分またはトリアゾリルをベースとした部分から選択される。］
から選択される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項17】

（Ｌ^１）_ａおよび（Ｌ^２）_ｂが、それぞれ独立して、

【化3】

［式中、ｎおよびｍは整数であり、０～２０から独立して選択される。］
から選択される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項18】

分岐リンカーＢが、

【化4】

［式中、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｆは、それぞれ整数であり、１～２５から独立して選択され；
（Ａ）_ｎは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ｄ－Ｐｈｅ－ＬＰｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｄ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ、またはＡｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕなどの、アミノ酸配列のトリガーユニットであり；
ＰＡＢは、パラ－アミノベンジルアルコールであり；
Ｅｘは、それぞれ、
－ＮＲ^１（ＣＨ_２）_ｘＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｙ（ＣＨ_２）_ｚＣ（Ｏ）－、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｘＮＲ^１－、
－ＮＲ^１（ＣＨ_２）_ｘＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｙ（ＣＨ_２）_ｚＮＲ^２－、
－ＮＲ^１（ＣＨ_２）_ｘＮＲ^２－、
－ＮＲ^１（ＣＨ_２）_ｘＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｙ（ＣＨ_２）_ｚＯ－、
－Ｏ（ＣＨ_２）_ｘＮＲ^１－、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｘＯ－、
－Ｏ（ＣＨ_２）_ｘＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｙ（ＣＨ_２）_ｚＣ（Ｏ）－、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｘＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｙ（ＣＨ_２）_ｚＣ（Ｏ）－、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｘＣ（Ｏ）－、または、
不存在、
（式中、ｘ、ｙ、およびｚは、それぞれ整数であり、０～２５から独立して選択され；そして、Ｒ^１およびＲ^２は、独立して、水素またはＣ_１－１０アルキル基を表す。）
から独立して選択されるリンカー鎖を含む伸長スペーサーである。］
から選択される、請求項１～１７のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項19】

分岐リンカーＢが、

【化5】

から選択される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項20】

下記の式：

【化6】

【化7】

【化8】

から選択される、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項21】

下記の式：

【化9】

から選択される、請求項３に記載の化合物。

【請求項22】

乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、結腸癌、大腸癌、唾液腺癌、甲状腺癌、および子宮内膜癌からなる群から選択される癌の治療のための医薬製剤であって、有効量の請求項１～２１のいずれか１項に記載の化合物および薬学的に許容される塩、担体または賦形剤を含む、医薬製剤。

【請求項23】

乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、結腸癌、大腸癌、唾液腺癌、甲状腺癌、および子宮内膜癌からなる群から選択される癌の治療に使用する医薬の製造のための、請求項１～２１のいずれか１項に記載の化合物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２０年４月１５日に出願されたＰＣＴ出願：ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０８４８８０の出願日の利益を主張し、その全内容はすべての目的のために参照により組み込まれる。

【0002】

本発明は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、特に部位特異的コンジュゲーションにより製造され、効力が高く毒性が低い均一なコンジュゲートを提供する、多重特異性抗体－薬物コンジュゲート、に関する。特に、本発明は、単一特異性抗体または二重特異性抗体へのＰＥＧ化薬物コンジュゲートの部位特異的コンジュゲーションによって製造される、長時間作用型ＰＥＧ化単一特異性または二重特異性一本鎖抗体薬物コンジュゲートに関する。

【背景技術】

【0003】

癌治療は、手術（１８００年代後半）から放射線療法（１９００年代前半）、化学療法とホルモン療法（１９００年代半ば）から標的薬（１９９０年代）、標的薬と化学療法およびホルモン療法との組み合わせ（２０００年代前半）から近年の抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などへと、ゆっくりと進歩してきた。ＡＤＣで癌を治療するという概念は、５０年以上前に遡ることができ（Decarvalho, S. et al. Nature, 1964, 202, 255-258）、担体として抗体を使用して、非常に強力な物質を腫瘍細胞に直接送達するものである。初期のＡＤＣは、それ自体が取得と操作が困難な抗原性のベータ放出放射性核種ペイロードである非ヒト化抗体と、細胞毒性ペイロードを早い時期に放出する不安定なリンカーを使用していた。今日のＡＤＣ技術は、ヒト化抗体、細胞毒性の高い有機ペイロード、および、標的に到達してＡＤＣ分子全体が細胞内に取り込まれるまで細胞殺傷剤の完全性を維持するように設計された比較的安定したリンカーを用いている。

【0004】

米国ではＦＤＡによって承認されたＡＤＣが１０種類あり、そのすべてが、癌治療用であり、現在１００を超えるＡＤＣの候補が臨床試験で使用中である（Ｂｅａｃｏｎ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ｜ｈａｎｓｏｎｗａｄｅによる研究報告）。承認された１０種類のＡＤＣはすべて、治療中に深刻な悪影響を示した。実際のところ、承認された１０種のＡＤＣのうち８種は、黒色枠囲み警告ラベルを表示する必要があり、さまざまな癌の適応症への適用が制限されている。今日のＩｇＧベースのＡＤＣの最大の課題は、治療の利益を示すために最大耐用量（ＭＴＤ）に非常に近い用量で投与する必要があることであり、その結果、治療域を非常に狭くしている（Beck, A. et al. Nat. Rev. Drug Discov., 2017, 16, 315-337; Vankemmelbeke, M. et al. Ther. Deliv., 2016, 7, 141-144; Tolcher A. W. et al. Ann. Oncol., 2016, 27, 2168-2172）。さらに、これらのＡＤＣで見つかった毒性プロファイルは、細胞毒性ワーヘッドに関連する用量制限毒性を伴って、標準治療化学療法の毒性プロファイルと同等である（Coats, S. et al. Clin. Cancer Res., 2019, 25, 5441-5448）。臨床試験で打ち切られた約８０種の伝統的なＡＤＣのうち、打ち切られたものの大半は、既存の治療法と比較した場合、治療域または指数が不十分であることが原因であった。コンジュゲーション部位およびリンカー／薬物疎水性が、ＡＤＣの安定性、有効性および治療指数に大きな影響を与え、親水性リンカーによる細胞毒性分子の抗体への部位特異的コンジュゲーションが治療指数を向上できることが十分に報告されている（Junutula, J. R. et al. Nat. Biotechnol., 2008, 26, 925-932; Lyon, R. P. et al. Nat. Biotechnol., 2015, 33, 733-735）。しかしながら、現在臨床開発中または市場に出ている多くのＡＤＣでは、高いＤＡＲを得るために、全長の抗体の２つ以上の鎖間ジスルフィド結合を切断する必要がある。残念ながら、このアプローチは、タンパク質の不安定化につながる可能性がある。二重特異性抗体は非天然の抗体であり、ＤＡＲの高いＦｃを有するＢｓＡＤＣの製造はさらに困難であるため、前記事項は、特にＦｃを有するＢｓＡＤＣに当てはまる。開発中または承認済みの他の多くのＡＤＣは、抗体のシステイン残基またはリジン残基のいずれかでランダムにコンジュゲーションして製造されており、本質的に異種であるため、臨床環境での正確な投与と分析は困難である。さらに、完全長の抗体から作製されたＡＤＣ分子は、大きすぎて、密度のある固形腫瘍に深く浸透して中期から後期の癌を治療することができないと考えられている。さらに、Ｆｃを有するすべての伝統的なＡＤＣは、巨核球（ＭＫ）上のＦｃγＲＩＩａへの該Ｆｃの結合と、その後のインターナリゼーションとそれに続くＭＫの死滅により、最終的に血小板産生の停止と血小板減少をもたらす、固有の毒性を有しており（Uppal, H. et al. Clin Cancer Res; 21(1) January 1, 2015）、そして、抗体－薬物コンジュゲートで観察される多くのオフターゲット毒性も、ＡＤＣのＦｃ成分に直接関連するマンノース受容体の取り込みによって引き起こされる（Gorovits, B. et.al. 2013, Cancer Immunol Immunother 62, 217-223）。

【0005】

したがって、強力な効力および改善した毒性プロファイルを有する新規なＡＤＣ技術が緊急に必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、部位特異的コンジュゲーションのために調製された部位（例えばシステイン）を有する、単一特異性または多重特異性の抗体フラグメント；または、単一特異性または多重特異性の一本鎖抗体に対する、ポリマー修飾された（例えばＰＥＧ化された）薬物コンジュゲートの部位特異的コンジュゲーションによって製造される、非免疫原性ポリマー修飾抗体薬物コンジュゲートを提供することにより、上述の満たされていないニーズに対処する。抗体フラグメントまたは一本鎖抗体は、抗原に対して一価または多価であり得る。

【0007】

一態様において、本発明は、式Ｉａ：

【化1】

で示されるポリマー抗体薬物コンジュゲート分子を提供する。Ｐは、非免疫原性ポリマーであり得る。Ｔは、多官能性（例えば三官能性）小分子リンカー部分であり得、単一特異性または多重特異性の抗体またはタンパク質への部位特異的コンジュゲーションが可能な少なくとも１つの官能基を有し得る。Ａは、単一特異性または多重特異性の抗体またはタンパク質であり得る。Ｄは、細胞傷害性小分子またはペプチドであり（ｎ≧１）、各Ｄは、同一であるか異なり得る。

【0008】

特に、本発明の一態様は、式Ｉｂ：

【化2】

式Ｉｂ
［式中、
Ｐは、非免疫原性ポリマーであり得；
Ｍは、Ｈ、または、Ｃ_１－５０アルキルおよびアリールから選択される末端キャッピング基であり得、ここで、前記アルキルの１つ以上の炭素は、ヘテロ原子で置き換えられていてもよく；
ｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０から選択される整数であり得；
Ｔは、三官能性または四官能性または他の環式または非環式の多官能性部分（例えば、リジン）を含むがこれらに限定されない、２つ以上の官能基を有する多官能性リンカーであり得、ここで、Ｔと（Ｌ^１）_ａの間の結合、および、Ｔと（Ｌ^２）_ｂの間の結合は、同一であるか異なることができ；
Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、二官能性リンカーであり得；
ａおよびｂは、それぞれ、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０から選択される整数であり得；
Ｂは分岐リンカーであり得、ここで、各分岐は、伸長スペーサー、トリガーユニット、自壊スペーサー、またはその任意の組み合わせを含んでよく、ここで、トリガーユニットは、酵素によって切断可能なトリガー部分またはアミノ酸配列；酸性ｐＨ条件で薬物Ｄまたはその誘導体を放出できるｐＨ感受性リンカー；または、化学的または酵素的切断によって薬物Ｄまたはその誘導体を放出できるジスルフィド結合リンカー；または、特定の切断メカニズムによって薬物Ｄを放出できる切断可能な結合であり得；
Ａは、抗原に対して一価または多価であり得る、抗体フラグメント、一本鎖抗体、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、または抗原結合フラグメントを含む、単一特異性または多重特異性の抗体または抗原結合タンパク質であり得；
Ｄは、細胞傷害性小分子またはペプチドまたはそれらの誘導体であり得、そして、酵素的切断および／または自壊メカニズム、または自壊メカニズムを伴うまたは伴わないｐＨ誘導加水分解のいずれかを介してＢから放出されることができ；各Ｄは、同一であるか異なることができ；
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５から選択される整数であり得る。］
で示されるコンジュゲート、を提供する。

【0009】

本発明の別の態様は、式Ｉｃ：

【化3】

式Ｉｃ
［式中、各可変部分は、式Ｉｂについて定義したとおりである。］
で示されるコンジュゲート、を提供する。

【0010】

いくつかの実施形態において、Ｂの各分岐は、トリガー部分を含み、これは、例えば、カテプシンＢ、プラスミン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、グルタチオン、チオレドキシン、チオレダクターゼ（Arunachalam, B. et. al. 2000, PNAS, 97 (2) 745-750）によって切断され得る、薬物Ｄに自壊スペーサーを介して接続されるか、または薬物Ｄに直接接続された、アミノ酸配列またはジスルフィド部分またはβ－グルコロニドまたはβ－ガラクトシド、である。自壊スペーサーとしては、これに限定されるものではないが、例えば、下記のものが挙げられる。

【化4】

式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４は、Ｈ、またはＣ_１－１０アルキルであり得る。そのような実施形態において、Ｄは、活性なＯまたはＮまたはＳの官能基を含む任意の小分子またはペプチドまたはその誘導体であり得る。

【0011】

いくつかの実施形態において、Ｂの各分枝は、腫瘍部位および／または腫瘍細胞内の酸性ｐＨ条件で薬物Ｄまたはその誘導体を放出できる、ｐＨ感受性リンカーであり得る。酸性に感受性のあるリンカーとしては、これに限定されるものではないが、例えば、下記の式のものが挙げられる。
－ＣＲ^１＝Ｎ－ＮＲ^１－、－ＣＲ^１＝Ｎ－Ｏ－、－ＣＲ^１＝Ｎ－ＮＲ^２－ＣＯ－、
－Ｎ＝Ｎ－ＣＯ－、－ＯＣＯＯ－、－ＮＲ^１－ＣＯＯ－

【0012】

いくつかの実施形態において、Ｂの各分岐は、グルタチオン、チオレドキシンファミリーメンバー（ＷＣＧＨ／ＰＣＫ）またはチオレダクターゼなどの、化学的または酵素的な切断によって、腫瘍部位および／または腫瘍細胞内で薬物Ｄまたはその誘導体を放出できる、ジスルフィド結合リンカーであり得る。

【0013】

いくつかの実施形態において、Ａは、抗原に対して一価または二価である単一特異性抗体であり、例えば、抗原に対して一価または二価の単一特異性一本鎖抗体である。

【0014】

いくつかの実施形態において、Ａは、多重特異性抗体であり、例えば、二重特異性一本鎖抗体である。

【0015】

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体の２つの結合ドメインは、同じ腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）分子の２つに、２つの異なるエピトープで結合するか、または２つの異なるＴＡＡ分子に結合する。

【0016】

さらなる実施形態において、Ａは、癌細胞で発現されるＨｅｒ２に結合する、一本鎖抗Ｈｅｒ２×抗Ｈｅｒ２抗体（ＳＣＡＨｅｒ２×ＳＣＡＨｅｒ２）である。ＳＣＡＨｅｒ２×ＳＣＡＨｅｒ２抗体の２つの結合ドメインは、２つのＨｅｒ２分子の同じエピトープに、または２つのＨｅｒ２分子の２つの異なるエピトープに結合し得る。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１または配列番号２に示される、アミノ酸配列を有する。

【0017】

いくつかの実施形態において、一本鎖抗体の２つの結合ドメインは、リンカーを介して連結され、リンカーは、Ｌ^１への抗体の部位特異的コンジュゲーションのための非天然アミノ酸残基またはシステインなどの部分を含み得る。

【0018】

いくつかの実施形態において、Ｄは、任意のＤＮＡ架橋剤、微小管阻害剤、ＤＮＡアルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせから選択され得る。

【0019】

いくつかの実施形態において、Ｄは、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＳＮ３８、ＤＭ１、ＤＭ４、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、デュオカルマイシン、またはそれらの誘導体、またはそれらの組み合わせなどから選択され得る。

【0020】

いくつかの実施形態において、Ｄは、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、細胞分裂抑制薬もしくはその誘導体、またはＳＮ３８、強力なトポイソメラーゼＩ阻害剤もしくはその誘導体、またはそれらの組み合わせである。

【0021】

さらなる実施形態において、Ｄは、ＭＭＡＥであり、４－アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）などの自壊スペーサーおよびバリン－シトルリンなどのトリガー部分に結合される。

【0022】

上記の態様および実施形態のいずれかにおいて、非免疫原性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、炭水化物ポリマー、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピル－メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、およびそれらのコポリマーからなる群から選択され得る。好ましくは、非免疫原性ポリマーは、ＰＥＧであり、例えば、分岐ＰＥＧまたは直鎖ＰＥＧである。ＰＥＧの総分子量は、５０００～１００，０００ダルトンの範囲、例えば、５０００～８０，０００、１０，０００～６０，０００、および２０，０００～４０，０００ダルトンの範囲であり得る。ＰＥＧは、永続的な結合または切断可能な結合のいずれかを介して、多官能性部分Ｔに結合することができる。

【0023】

（Ｌ^１）_ａとプロテインＡとの間の結合を形成する部位特異的コンジュゲーションのための官能基は、チオール、マレイミド、２－ピリジルジチオ変異体、芳香族スルホンまたはビニルスルホン、アクリレート、ブロモアセトアミドまたはヨードアセトアミド、アジド、アルキン、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）、カルボニル、２－アミノ－ベンズアルデヒドまたは２－アミノ－アセトフェノン基、ヒドラジド、オキシム、アシルトリフルオロホウ酸カリウム、Ｏ－カルバモイルヒドロキシルアミン、トランス－シクロオクテン、テトラジン、トリアリールホスフィン、ボロン酸、ヨウ素などからなる群から選択され得る。

【0024】

いくつかの実施形態において、（Ｌ^１）_ａの１つは、アジドとアルキンから、またはマレイミドとチオールから形成される結合（リンケージ）を含み得る。いくつかの実施形態において、アルキンは、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）であり得る。

【0025】

いくつかの実施形態において、Ｔはリジンであり得、ＰはＰＥＧであり得、ｙは１であり得、アルキンはジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）であり得る。

【0026】

いくつかの実施形態において、Ａは、抗体フラグメント、一本鎖抗体、ナノボディ、もしくは任意のその抗原結合フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む、アジドが付けられた単一特異性抗体または多重特異性抗体または抗原結合タンパク質、に由来することができ、アジドは、それぞれの（Ｌ^１）_ａでアルキンに結合し得る。他の実施形態において、プロテインＡは、抗体フラグメント、一本鎖抗体、ナノボディもしくは任意のその抗原結合フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む、チオールが付けられた単一特異性抗体または多重特異性抗体または抗原結合タンパク質、に由来することができ、チオールは、それぞれの（Ｌ^１）_ａでマレイミドに結合し得る。

【0027】

上記の抗体薬物コンジュゲートは、（ｉ）抗体またはタンパク質またはその改変形態に部位特異的コンジュゲートが可能な末端官能基を有する、高担持非免疫原性ポリマー薬物コンジュゲートを製造すること；および、（ｉｉ）非免疫原性ポリマー薬物コンジュゲートを、抗体またはタンパク質またはその改変構造に部位特異的にコンジュゲートさせて、式Ｉａ、式Ｉｂまたは式Ｉｃの化合物を形成すること、を含む方法によって、製造することができる。いくつかの例では、コンジュゲートの工程の前に、抗体またはタンパク質を小分子リンカーで修飾することができる。

【0028】

本発明はまた、上記の抗体薬物コンジュゲート、例えば、抗原に対して一価または多価であるＰＥＧ化単一特異性または二重特異性一本鎖抗体薬物コンジュゲート、および、薬学的に許容される担体、を含む、医薬製剤を提供する。

【0029】

本発明はさらに、有効量の上記の抗体薬物コンジュゲート、例えば、抗原に対して一価または多価であるＰＥＧ化単一特異性または二重特異性一本鎖抗体薬物コンジュゲート、を投与することを含む、それを必要とする対象において疾患を治療する方法を提供する。

【0030】

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、図面、明細書、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【0031】

本開示はさらに、以下の実施形態を提供する。
実施形態１
式（Ｉｂ）：

【化5】

［式中、
Ｐは、非免疫原性ポリマーであり；
Ｍは、Ｈ、または、Ｃ_１－５０アルキルおよびアリールから選択される末端キャッピング基であり、ここで、前記アルキルの１つ以上の炭素は、ヘテロ原子で任意に置き換えられていてもよく；
ｙは、１～１０から選択される整数、例えば、１～５、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、であり；
Ａは、抗体、またはその抗原結合フラグメントであり；
Ｔは、多官能性小分子リンカー部分であり；
Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、ヘテロまたはホモ二官能性リンカーであり；
ａおよびｂは、それぞれ、０～１０から選択される整数、例えば、０～５、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、であり；
Ｂは、分枝リンカーであり、ここで、各分枝は、自壊スペーサーに連結されたアミノ酸配列または炭水化物部分を有していて、酵素によるアミノ酸配列または炭水化物部分の切断により自壊メカニズムが誘発されて、Ｄが放出されるか、あるいは、各分枝は、ジスルフィド結合または切断可能な結合を有していて、ジスルフィド結合または切断可能な結合の切断により、Ｄまたはその誘導体が放出され；
Ｄは、それぞれ独立して、細胞傷害性小分子またはペプチドであり；および、
ｎは、１～２５から選択される整数、例えば、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、５～２５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～２５、１０～２０、１０～１５、１５～２５、１５～２０、または２０～２５、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、である。］
で示される、化合物。
実施形態２
Ｔが、ヒドロキシル、アミノ、ヒドラジニル、アジド、アルケン、アルキン、カルボキシル（アルデヒド、ケトン、エステル、カルボン酸、無水物、ハロゲン化アシル）、チオール、ジスルフィド、ニトリル、エポキシド、イミン、ニトロ、およびハライドから独立して選択される３つの官能基を有する分子に由来する三官能性リンカーであり、そして、Ｔと（Ｌ^１）_ａとの間の結合およびＴと（Ｌ^２）_ｂとの間の結合は、同一または異なる、実施形態１に記載の化合物。
実施形態３
Ｔが、リジンであるか、またはリジンに由来するものである、実施形態２に記載の化合物。
実施形態４
Ｌ^１のリンカー末端の官能基が、Ａとの部位特異的コンジュゲーションが可能であり、そして、チオール、マレイミド、２－ピリジルジチオ変異体、芳香族スルホンまたはビニルスルホン、アクリレート、ブロモまたはヨードアセトアミド、アジド、アルキン、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）、カルボニル、２－アミノベンズアルデヒドまたは２－アミノアセトフェノン基、ヒドラジド、オキシム、アシルトリフルオロホウ酸カリウム、Ｏ－カルバモイルヒドロキシルアミン、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン、テトラジン、トリアリールホスフィン、ボロン酸、およびヨウ素、からなる群から選択される、実施形態１～３のいずれか１つに記載の化合物。
実施形態５
抗体が、単一特異性または多重特異性の、完全長抗体、一本鎖抗体、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、またはそれらの抗原結合ドメインである、実施形態１～４のいずれか１つに記載の化合物。

【0032】

実施形態６
抗体が、単一特異性一本鎖抗体である、実施形態１～５のいずれか１つに記載の化合物。
実施形態７
単一特異性一本鎖抗体が、Ｈｅｒ２などの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する、実施形態６に記載の化合物。
実施形態８
単一特異性一本鎖抗体が、Ｈｅｒ２に結合する２つの結合ドメインを有する、実施形態７に記載の化合物。
実施形態９
単一特異性一本鎖抗体が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、実施形態８に記載の化合物。
実施形態１０
抗体が、二重特異性抗体、例えば二重特異性一本鎖抗体、である、実施形態１～５のいずれか１つに記載の化合物。

【0033】

実施形態１１
二重特異性抗体の２つの結合ドメインが、同じ腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合するか、２つの異なるＴＡＡに結合するか、または、ＴＡＡ、およびＴ細胞またはＮＫ細胞上で発現される抗原（例えば、Ｔ細胞受容体の成分）に結合する、実施形態１０に記載の化合物。
実施形態１２
抗体が、抗Ｈｅｒ２×抗Ｈｅｒ２一本鎖二重特異性抗体である、実施形態１１に記載の化合物。
実施形態１３
抗体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、実施形態１２に記載の化合物。
実施形態１４
単一特異性一本鎖抗体の２つの結合ドメインが、リンカーを介して連結され、そして、該リンカーが、抗体のＬ^１への部位特異的コンジュゲーションのための非天然アミノ酸残基またはシステインなどの部分を含む、実施形態６～９のいずれか１つに記載の化合物。
実施形態１５
二重特異性一本鎖抗体の２つの結合ドメインが、リンカーを介して連結され、そして、該リンカーが、抗体のＬ^１への部位特異的コンジュゲーションのための非天然アミノ酸残基またはシステインなどの部分を含む、実施形態１０～１３のいずれか１つに記載の化合物。

【0034】

実施形態１６
非天然アミノ酸が、遺伝的にコードされたアルケンリジン（例えば、Ｎ６－（ヘキサ－５－エノイル）－Ｌ－リジン）、２－アミノ－８－オキソノナン酸、ｍまたはｐ－アセチル－フェニルアラニン、β－ジケトン側鎖を有するアミノ酸（例えば、２－アミノ－３－（４－（３－オキソブタノイル）フェニル）プロパン酸）、（Ｓ）－２－アミノ－６－（（（１Ｒ，２Ｒ）－２－アジドシクロペンチルオキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸、アジドホモアラニン、ピロリシン類似体Ｎ６－（（プロパ－２－イン－１－イルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、（Ｓ）－２－アミノ－６－ペンタ－４－インアミドヘキサン酸、（Ｓ）－２－アミノ－６－（（プロパ－２－インイルオキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸、（Ｓ）－２－アミノ－６－（（２－アジドエトキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸、ｐ－アジドフェニルアラニン、パラ－アジドフェニルアラニン、Ｎε－アクリロイル－１－リジン、Ｎε－５－ノルボルネン－２－イルオキシカルボニル－１－リジン、Ｎ－ε－（シクロオクタ－２－イン－１－イルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、Ｎ－ε－（２－（シクロオクタ－２－イン－１－イルオキシ）エチル）カルボニル－Ｌ－リジン、遺伝的にコードされたテトラジンアミノ酸（例えば、４－（６－メチル－ｓ－テトラジン－３－イル）アミノフェニルアラニン）、から選択される、実施形態１４～１５のいずれか１つに記載の化合物。
実施形態１７
Ｄが、ＤＮＡ架橋剤、微小管阻害剤、ＤＮＡアルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせから選択される、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の化合物。
実施形態１８
Ｄが、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＳＮ３８、ＤＭ１、ＤＭ４、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、デュオカルマイシン、またはそれらの誘導体、またはそれらの組み合わせから選択される、実施形態１７に記載の化合物。
実施形態１９
Ｄが、ビンカアルカロイド、ラウリマリド、タキサン、コルヒチン、ツブリシン（tubulysin）、クリプトフィシン（Cryptophycin）、ヘミアステリン（Hemiasterlin）、セマドチン（Cemadotin）、リゾキシン（Rhizoxin）、ディスコデルモライド（Discodermolide）、タッカロノリド（taccalonolide）ＡまたはＢまたはＡＦまたはＡＪ、タッカロノリド（taccalonolide）ＡＩ－エポキシド、ＣＡ－４、エポチロンＡおよびＢ、ラウリマリド、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、カンプトテシン、ｉＳＧＤ－１８８２、センタナマイシン（centanamycin）、ＰＮＵ－１５９６８２、ウンシアラマイシン（uncialamycin）、インドリノベンゾジアゼピン二量体、β－アマニチン、アマトキシン、タイランスタチン（thailanstatin）、またはそれらの誘導体もしくは類似体、またはそれらの組み合わせから選択される、実施形態１７に記載の化合物。
実施形態２０
非免疫原性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の化合物。

【0035】

実施形態２１
ＰＥＧが、直鎖ＰＥＧ、または分枝ＰＥＧである、実施形態２０に記載の化合物。
実施形態２２
ポリエチレングリコールの少なくとも１つの末端が、メチルまたは低分子量アルキルでキャッピングされている、実施形態２０～２１のいずれか１つに記載の化合物。
実施形態２３
ＰＥＧの総分子量が、１００～８００００である、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載の化合物。
実施形態２４
ＰＥＧが、永続的な結合または切断可能な結合を介して、三官能性または四官能性または他の環式または非環式の多官能性部分Ｔ（例えば、リジン）に結合している、実施形態２０～２３のいずれか１つに記載の化合物。
実施形態２５
式（Ｉｃ）：

【化6】

［式中、
Ｐは、直鎖ＰＥＧであり；
Ａは、抗体、またはその抗原結合フラグメントであり；
Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、二官能性リンカーであり；
ａおよびｂは、それぞれ、０～１０から選択される整数、例えば、０～５、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、であり；
Ｂは、分枝リンカーであり、ここで、各分枝は、自壊スペーサーに連結されたアミノ酸配列または炭水化物部分を有していて、酵素によるアミノ酸配列または炭水化物部分の切断により自壊メカニズムが誘発されて、Ｄが放出されるか、あるいは、各分枝は、ジスルフィド結合または切断可能な結合を有していて、ジスルフィド結合または切断可能な結合の切断により、Ｄまたはその誘導体が放出され；
Ｄは、それぞれ独立して、細胞傷害性小分子またはペプチドであり；
ｎは、１～２５から選択される整数、例えば、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、５～２５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～２５、１０～２０、１０～１５、１５～２５、１５～２０、または２０～２５、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、である。］
で示される、化合物。

【0036】

実施形態２６
Ｌ^１のリンカー末端の官能基が、Ａとの部位特異的コンジュゲーションが可能であり、そして、チオール、マレイミド、２－ピリジルジチオ変異体、芳香族スルホンまたはビニルスルホン、アクリレート、ブロモまたはヨードアセトアミド、アジド、アルキン、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）、カルボニル、２－アミノベンズアルデヒドまたは２－アミノアセトフェノン基、ヒドラジド、オキシム、アシルトリフルオロホウ酸カリウム、Ｏ－カルバモイルヒドロキシルアミン、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン、テトラジン、トリアリールホスフィン、ボロン酸、およびヨウ素、からなる群から選択される、実施形態２５に記載の化合物。
実施形態２７
抗体が、単一特異性または多重特異性の、完全長抗体、一本鎖抗体、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、またはその抗原結合ドメインである、実施形態２５～２６のいずれか１つに記載の化合物。
実施形態２８
抗体が、単一特異性一本鎖抗体であり、場合により該単一特異性一本鎖抗体がＨｅｒ２などの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合してもよい、実施形態２７に記載の化合物。
実施形態２９
単一特異性一本鎖抗体が、Ｈｅｒ２に結合する２つの結合ドメインを有する、実施形態２８に記載の化合物。
実施形態３０
単一特異性一本鎖抗体が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、実施形態２９に記載の化合物。

【0037】

実施形態３１
抗体が、二重特異性抗体、例えば二重特異性一本鎖抗体、である、実施形態２７に記載の化合物。
実施形態３２
二重特異性抗体の２つの結合ドメインが、同じ腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合するか、２つの異なるＴＡＡに結合するか、または、ＴＡＡ、およびＴ細胞またはＮＫ細胞上で発現される抗原（例えば、Ｔ細胞受容体の成分）に結合する、実施形態３１に記載の化合物。
実施形態３３
抗体が、抗Ｈｅｒ２×抗Ｈｅｒ２一本鎖二重特異性抗体である、実施形態３２に記載の化合物。
実施形態３４
抗体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、実施形態３３に記載の化合物。
実施形態３５
単一特異性一本鎖抗体の２つの結合ドメインが、リンカーを介して連結され、そして、該リンカーが、抗体のＬ^１への部位特異的コンジュゲーションのための非天然アミノ酸残基またはシステインなどの部分を含む、実施形態２８～３０のいずれか１つに記載の化合物。

【0038】

実施形態３６
二重特異性一本鎖抗体の２つの結合ドメインが、リンカーを介して連結され、そして、該リンカーが、抗体のＬ^１への部位特異的コンジュゲーションのための非天然アミノ酸残基またはシステインなどの部分を含む、実施形態３１～３４のいずれか１つに記載の化合物。
実施形態３７
抗体のＬ^１への部位特異的コンジュゲーションのための非天然アミノ酸残基が、遺伝的にコードされたアルケンリジン（例えば、Ｎ６－（ヘキサ－５－エノイル）－Ｌ－リジン）、２－アミノ－８－オキソノナン酸、ｍまたはｐ－アセチル－フェニルアラニン、β－ジケトン側鎖を有するアミノ酸（例えば、２－アミノ－３－（４－（３－オキソブタノイル）フェニル）プロパン酸）、（Ｓ）－２－アミノ－６－（（（１Ｒ，２Ｒ）－２－アジドシクロペンチルオキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸、アジドホモアラニン、ピロリシン類似体Ｎ６－（（プロパ－２－イン－１－イルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、（Ｓ）－２－アミノ－６－ペンタ－４－インアミドヘキサン酸、（Ｓ）－２－アミノ－６－（（プロパ－２－インイルオキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸、（Ｓ）－２－アミノ－６－（（２－アジドエトキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸、ｐ－アジドフェニルアラニン、パラ－アジドフェニルアラニン、Ｎε－アクリロイル－１－リジン、Ｎε－５－ノルボルネン－２－イルオキシカルボニル－１－リジン、Ｎ－ε－（シクロオクタ－２－イン－１－イルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、Ｎ－ε－（２－（シクロオクタ－２－イン－１－イルオキシ）エチル）カルボニル－Ｌ－リジン、遺伝的にコードされたテトラジンアミノ酸（例えば、４－（６－メチル－ｓ－テトラジン－３－イル）アミノフェニルアラニン）、から選択される、実施形態３５～３６のいずれか１つに記載の化合物。
実施形態３８
Ｄが、ＤＮＡ架橋剤、微小管阻害剤、ＤＮＡアルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせから選択される、実施形態２５～３７のいずれか１つに記載の化合物。
実施形態３９
Ｄが、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＳＮ３８、ＤＭ１、ＤＭ４、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、デュオカルマイシン、またはそれらの誘導体、またはそれらの組み合わせから選択される、実施形態３８に記載の化合物。
実施形態４０
Ｄが、ビンカアルカロイド、ラウリマリド、タキサン、コルヒチン、ツブリシン（tubulysin）、クリプトフィシン（Cryptophycin）、ヘミアステリン（Hemiasterlin）、セマドチン（Cemadotin）、リゾキシン（Rhizoxin）、ディスコデルモライド（Discodermolide）、タッカロノリド（taccalonolide）ＡまたはＢまたはＡＦまたはＡＪ、タッカロノリド（taccalonolide）ＡＩ－エポキシド、ＣＡ－４、エポチロンＡおよびＢ、ラウリマリド、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、カンプトテシン、ｉＳＧＤ－１８８２、センタナマイシン（centanamycin）、ＰＮＵ－１５９６８２、ウンシアラマイシン（uncialamycin）、インドリノベンゾジアゼピン二量体、β－アマニチン、アマトキシン、タイランスタチン（thailanstatin）、またはそれらの誘導体もしくは類似体、またはそれらの組み合わせから選択される、実施形態３８に記載の化合物。

【0039】

実施形態４１
ＰＥＧの総分子量が、１００～８００００である、実施形態２５～４０のいずれか１つに記載の化合物。
実施形態４２
Ｌ^１およびＬ^２が、それぞれ独立して、
－（ＣＨ_２）_ａＸＹ（ＣＨ_２）_ｂ－、
－Ｘ（ＣＨ_２）_ａＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃ（ＣＨ_２）_ｂＹ－、
－（ＣＨ_２）ヘテロシクリル－、
－（ＣＨ_２）_ａＸ－、
－Ｘ（ＣＨ_２）_ａＹ－、
－Ｗ_１－（ＣＨ_２）_ａＣ（Ｏ）ＮＲ_１（ＣＨ_２）_ｂＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃ（ＣＨ_２）_ｄＣ（Ｏ）－、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ａＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２）_ｃＷ_２Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｄＮＲ_１－、
－Ｗ_３－（ＣＨ_２）_ａＣ（Ｏ）ＮＲ_１（ＣＨ_２）_ｂＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃ（ＣＨ_２）_ｄＷ_２Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｅＣ（Ｏ）－、
［式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅは、それぞれ、０～２５から独立して選択される整数であり、例えば、０～２０、０～１５、０～１０、０～５、５～２５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～２５、１０～２０、１０～１５、１５～２５、１５～２０、または２０～２５、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、であり；ＸおよびＹは、それぞれ、Ｃ（＝Ｏ）、ＮＲ_１、Ｓ、Ｏ、ＣＲ_２Ｒ_３、または不存在から独立して選択され；Ｒ_１およびＲ_２は、独立して、水素、Ｃ_１－１０アルキル、または（ＣＨ_２）_１－１０Ｃ（＝Ｏ）を表し；Ｗ_１および／またはＷ_３は、マレイミドをベースとした部分に由来し、Ｗ_２は、トリアゾリルまたはテトラゾリル含有基を表し；ヘテロシクリル基は、マレイミド由来の部分またはテトラゾリルをベースとした部分またはトリアゾリルをベースとした部分から選択される。］
から選択される、実施形態１～４１のいずれか１つに記載の化合物。
実施形態４３
（Ｌ^１）_ａおよび（Ｌ^２）_ｂは、それぞれ独立して、

【化7】

［式中、ｎおよびｍは整数であり、０～２０から独立して選択され、例えば、０～１５、０～１０、０～５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～２０、１０～１５、または１５～２０、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０、である。］
から選択される、実施形態１～４１のいずれか１つに記載の化合物。
実施形態４４
分岐リンカーＢが、伸長スペーサー、トリガーユニット、自壊スペーサー、またはそれらの任意の組み合わせを含み、場合により、該トリガーユニットは、カテプシンＢ、プラスミン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、β－グルクロニダーゼ、β－ガラクトシダーゼなどの酵素によって切断可能な、アミノ酸配列またはβ－グルコロニドまたはβ－ガラクトシドのトリガー部分；酸性ｐＨ条件で薬物Ｄまたはその誘導体を放出できるｐＨ感受性リンカー；または、グルタチオン、チオレドキシンファミリーメンバー（ＷＣＧＨ／ＰＣＫ）またはチオレダクターゼによって薬物Ｄまたはその誘導体を放出できるジスルフィド結合リンカー、である、実施形態１～４３のいずれか１つに記載の化合物。
実施形態４５
分岐リンカーＢが、

【化8】

［式中、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｆは、それぞれ整数であり、１～２５から独立して選択され、例えば、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、５～２５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～２５、１０～２０、１０～１５、１５～２５、１５～２０、または２０～２５、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、であり；
（Ａ）_ｎは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、ａｌ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ｄ－Ｐｈｅ－ＬＰｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｄ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ、またはＡｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕなどの、アミノ酸配列のトリガーユニットであり；
ＰＡＢは、パラ－アミノベンジルアルコールであり；
Ｅｘは、それぞれ、
－ＮＲ^１（ＣＨ_２）_ｘＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｙ（ＣＨ_２）_ｚＣ（Ｏ）－、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｘＮＲ^１－、
－ＮＲ^１（ＣＨ_２）_ｘＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｙ（ＣＨ_２）_ｚＮＲ^２－、
－ＮＲ^１（ＣＨ_２）_ｘＮＲ^２－、
－ＮＲ^１（ＣＨ_２）_ｘＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｙ（ＣＨ_２）_ｚＯ－、
－Ｏ（ＣＨ_２）_ｘＮＲ^１－、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｘＯ－、
－Ｏ（ＣＨ_２）_ｘＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｙ（ＣＨ_２）_ｚＣ（Ｏ）－、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｘＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｙ（ＣＨ_２）_ｚＣ（Ｏ）－、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｘＣ（Ｏ）－、または、
不存在、
（式中、ｘ、ｙ、およびｚは、それぞれ整数であり、０～２５から独立して選択され、例えば、０～２０、０～１５、０～１０、０～５、５～２５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～２５、１０～２０、１０～１５、１５～２５、１５～２０、または２０～２５、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、であり；そして、Ｒ^１およびＲ^２は、独立して、水素またはＣ_１－１０アルキル基を表す。）
から独立して選択されるリンカー鎖を含む伸長スペーサーである。］
から選択される、実施形態４４に記載の化合物。

【0040】

実施形態４６
分岐リンカーＢが、

【化9】

から選択される、実施形態１～４３のいずれか１つに記載の化合物。
実施形態４７
下記の式：

【化10】

【化11】

【化12】

から選択される、実施形態１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
実施形態４８
下記の式：

【化13】

から選択される、実施形態２５に記載の化合物。
実施形態４９
実施形態１～４８のいずれか１つに記載の化合物を製造する方法であって、
ａ）部位特異的コンジュゲーションのための遊離官能基を有する非免疫原性修飾された（例えばＰＥＧ化された）薬物コンジュゲートを製造する工程；
ｂ）非免疫原性修飾された（例えばＰＥＧ化された）薬物コンジュゲートを抗体に部位特異的にコンジュゲートさせて、式（Ｉｂ）または式（Ｉｃ）の化合物を提供する工程、
を含む、方法。
実施形態５０
有効量の実施形態１～４８のいずれか１つに記載の化合物、および薬学的に許容される塩、担体または賦形剤を含む、医薬製剤。

【0041】

実施形態５１
乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、結腸癌、大腸癌、唾液腺癌、甲状腺癌、および子宮内膜癌からなる群から選択される癌の治療に使用するための、実施形態１～４８のいずれか１つに記載の化合物。
実施形態５２
乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、結腸癌、大腸癌、唾液腺癌、甲状腺癌、および子宮内膜癌からなる群から選択される癌の治療において、有効量の別の抗癌剤、免疫抑制剤と組み合わせて使用するための、実施形態１～４８のいずれか１つに記載の化合物。

【図面の簡単な説明】

【0042】

【図1】図１は、実施例１に記載の分岐リンカー中間体化合物７を製造する反応スキームを模式的に示す。

【図2】図２は、実施例１に記載の化合物１４ Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを製造する反応スキームを模式的に示す。

【図3】図３は、実施例１に記載の化合物１９ ３０ｋｍＰＥＧ－Ｌｙｓ（Ｍａｌ）－（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）_４を製造する反応スキームを模式的に示す。

【図4】図４は、実施例３に記載の化合物２０ ３０ｋｍＰＥＧ－Ｌｙｓ（ＳＣＡＨｅｒ２／ＳＣＡＨｅｒ２）－（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）_４を製造する反応スキームを模式的に示す。

【図5】図５は、実施例４における化合物７ Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥを製造する反応スキームを模式的に示す。

【図6】図６は、実施例５における化合物１３（２×ＭＭＡＥを有する分岐リンカーＢ）を製造する反応スキームを模式的に示す。

【図7】図７は、実施例６における化合物１８（２×ＭＭＡＥを有する分岐リンカーＢ）を製造する反応スキームを模式的に示す。

【図8】図８は、実施例７における化合物２２（４×ＭＭＡＥを有する分岐リンカーＢ）を製造する反応スキームを模式的に示す。

【図9】図９は、実施例８における化合物２７（４×ＭＭＡＥを有する分岐リンカーＢ）を製造する反応スキームを模式的に示す。

【図10】図１０は、実施例９における化合物３２（３０ｋｍＰＥＧ（マレイミド）－２ＭＭＡＥ）を製造する反応スキームを模式的に示す。

【図11】図１１は、実施例１０における化合物３５（２０ｋｍＰＥＧ（マレイミド）－４ＭＭＡＥ）を製造する反応スキームを模式的に示す。

【図12】図１２は、実施例１１における化合物３９（マレイミド－２０ｍＰＥＧ－４ＭＭＡＥ）を製造する反応スキームを模式的に示す。

【図13】図１３は、実施例１２における化合物４１（ＤＢＣＯ－２０ｍＰＥＧ－４ＭＭＡＥ）を製造する反応スキームを模式的に示す。

【図14】図１４は、実施例１３における精製された化合物４２（ＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析である。

【図15】図１５は、実施例１４における化合物４３［３０ｋｍＰＥＧ－（ＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ／ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶ）－２ＭＭＡＥ］を製造する反応スキーム、およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を模式的に示す。

【図16】図１６は、実施例１５における化合物４４［ＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ／ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶ－２０ｋＰＥＧ－４ＭＭＡＥ］を製造する反応スキーム、およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を模式的に示す。

【図17】図１７は、実施例１６において、化合物４３（ＪＹ２０１）が強力なインビトロ細胞毒性を有することを示している。

【図18-1】図１８－１は、実施例１６において、同等のペイロードを有する化合物４４（ＪＹ２０１ｂ）が、腫瘍細胞に対するインビトロでの細胞毒性の誘導において、Ｔ－ＤＭ１より強力であることを示している。

【図18-2】図１８－２は、図１８－１の続きであり、実施例１６において、同等のペイロードを有する化合物４４（ＪＹ２０１ｂ）が、腫瘍細胞に対するインビトロでの細胞毒性の誘導において、Ｔ－ＤＭ１より強力であることを示している。

【図19】図１９は、実施例１４において、ＰＥＧ化ＢｓＡＤＣ ４３（ＪＹ２０１）が、標的細胞によるインターナリゼーションの増加を示すことを示している。

【図20】図２０は、実施例１５において、ＰＥＧ化ＢｓＡＤＣ ４３（ＪＹ２０１）が、インターナリゼーション後に標的細胞に保持されることを示す。

【図21】図２１は、実施例１６において、ＰＥＧ化ＢｓＡＤＣ ４３（ＪＹ２０１）が、巨核球に対して毒性を示さないことを示す。

【発明を実施するための形態】

【0043】

本発明では、ＰＥＧ化された単一特異性または多重特異性の抗体薬物コンジュゲートが提供される。本発明では、高いＤＡＲを得るために抗体の２つ以上のジスルフィド結合を破壊する必要がなく、同種のＡＤＣを実現でき、これは、毒性、有効性、調整管理、および製造、特に多重特異性ＡＤＣの製造の点で、異種のＡＤＣよりも大きな利点がある。

【0044】

さらに、本発明は、巨核球または他の正常細胞に対して毒性を示さず、治療域を増加させるだけでなく、インターナリゼーションの増加、および固形腫瘍への深い浸透を達成するための比較的小さなサイズの一本鎖抗体分子によって、コンジュゲートの抗腫瘍効果を増強させた、ＰＥＧ化単一特異性または二重特異性一本鎖抗体薬物コンジュゲートの新規な構造形式を提供する。したがって、本発明は、現在のＡＤＣ技術における問題に対処し、新規なＰＥＧ化単一特異性または多重特異性一本鎖抗体薬物コンジュゲートを用いて癌治療を向上する。

【0045】

Ｉ．コンジュゲート
本発明の一態様において、式（Ｉａ）：

【化14】

式（Ｉａ）
で示される化合物が提供される。
上記化合物において、Ｐは非免疫原性ポリマーであり得る。Ｔは、三官能性小分子リンカー部分などの多官能性部分であり得、抗体またはタンパク質との部位特異的コンジュゲーションが可能な少なくとも１つの官能基を有する。Ａは、完全長抗体、一本鎖抗体、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、またはその任意の抗原結合フラグメント、またはそれらの組み合わせなど、任意の単一特異性または多重特異性抗体またはタンパク質であり得る。Ｄは、任意の細胞傷害性小分子またはペプチド（ｎ＝１～２５）であり、各Ｄは、同じでも異なっていてもよい。

【0046】

特に、本発明の一態様は、式ＩｂまたはＩｃ：

【化15】

式Ｉｂ

【化16】

式Ｉｃ
で示されるコンジュゲートを提供する。
式Ｉｂまたは式Ｉｃのコンジュゲートにおいて、Ｐは、ＰＥＧなどの非免疫原性ポリマーであり得；
Ｍは、Ｈ、または、Ｃ_１－５０アルキルおよびアリールから選択される末端キャッピング基であり得、ここで、前記アルキルの１つ以上の炭素は、ヘテロ原子で置き換えられていてもよく；
ｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から選択される整数であり得；
Ｔは、２つ以上の官能基を有する部分であり得、ここで、Ｔと（Ｌ^１）_ａとの間の結合、およびＴと（Ｌ^２）_ｂとの間の結合は、同じであっても異なっていてもよく；
Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ、独立して、二官能性リンカーであり得；
ａおよびｂは、それぞれ、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から選択される整数であり得；
Ｂは、分岐リンカーであり得、ここで、各分岐は、伸長スペーサー、トリガーユニット、自壊スペーサーまたはそれらの任意の組み合わせを含むことができ、ここで、トリガーユニットは、カテプシンＢ、プラスミン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、β－グルクロニダーゼ、またはβ－ガラクトシダーゼなどの酵素によって切断可能な、アミノ酸配列またはβ－グルコロニドまたはβ－ガラクトシドトリガー部分；酸性ｐＨ条件で薬物Ｄまたはその誘導体を放出できる、ｐＨ感受性リンカー；または、グルタチオン、チオレドキシンファミリーメンバー（ＷＣＧＨ／ＰＣＫ）またはチオレダクターゼによって薬物Ｄまたはその誘導体を放出できる、ジスルフィド結合リンカー、であり得る。
Ａは、抗原に対して一価または多価である、抗体フラグメント、一本鎖抗体、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、または抗原結合フラグメントを含む、単一特異性または多重特異性抗体または抗原結合タンパク質であり得；
Ｄは、細胞傷害性小分子またはペプチドまたはそれらの誘導体であり得、そして、酵素的切断および／または自壊メカニズム、またはｐＨ誘導加水分解のいずれかを介してＢから放出されることができ；各Ｄは、同じでも異なっていてもよく；
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、および２５から選択される整数である。

【0047】

いくつかの実施形態において、Ｂの各分岐は、トリガー部分、例えば、自壊スペーサーを介して薬物Ｄに結合するか、または薬物Ｄに直接結合する、アミノ酸配列またはジスルフィド部分またはβ－グルコロニドまたはβ－ガラクトシド、を含む。自壊スペーサーとしては、これに限定されるものではないが、例えば、下記のものが挙げられる。

【化17】

式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４は、Ｈ、またはＣ_１－１０アルキルであり得る。そのような実施形態において、Ｄは、活性なＯまたはＮまたはＳ官能基を含む任意の小分子またはペプチド薬物またはその誘導体であり得る。

【0048】

いくつかの実施形態において、Ｂの各分枝は、腫瘍部位および／または腫瘍細胞内の酸性ｐＨ条件で薬物Ｄまたはその誘導体を放出できる、ｐＨ感受性リンカーを含み得る。酸性感受性リンカーとしては、これに限定されるものではないが、例えば、以下の式のものが挙げられる。
－ＣＲ^１＝Ｎ－ＮＲ^１－、－ＣＲ^１＝Ｎ－Ｏ－、－ＣＲ^１＝Ｎ－ＮＲ^２－ＣＯ－、
－Ｎ＝Ｎ－ＣＯ－、－ＯＣＯＯ－、－ＮＲ^１－ＣＯＯ－

【0049】

いくつかの実施形態において、Ｂの各分枝は、薬物Ｄまたはその誘導体を、腫瘍部位および／または腫瘍細胞内部において、酵素切断によって、例えば、グルタチオン、チオレドキシンファミリーメンバー（ＷＣＧＨ／ＰＣＫ）またはチオレダクターゼによって、放出することができる、ジスルフィド結合リンカーを含み得る。

【0050】

いくつかの実施形態において、Ａは、２つのＨｅｒ２抗原上の２つの異なるエピトープに結合（ＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶ）することができる、一本鎖二重特異性抗体である。

【0051】

いくつかの実施形態において、ＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶのアミノ酸配列は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＩＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＴＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧＲＦＴＬＳＶＤＲＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＣＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＨＨＨＨＨＨ（配列番号１）、であり得る。

【0052】

いくつかの実施形態において、Ａは、２つのＨｅｒ２抗原上の２つの同じエピトープに結合することができる、一本鎖抗Ｈｅｒ２×抗Ｈｅｒ２単一特異性抗体である。

【0053】

いくつかの実施形態において、ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶ／ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶのアミノ酸配列は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＣＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号２）、であり得る。

【0054】

いくつかの実施形態において、Ａは、２つの異なる抗原Ｈｅｒ２およびＨｅｒ３に結合（ＳＣＡＨｅｒ２×ＳＣＡＨｅｒ３）することができる、一本鎖二重特異性抗体であり得る。

【0055】

いくつかの実施形態において、ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶ×ＳＣＡＨｅｒ３のアミノ酸配列は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＣＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＹＧＧＳＦＳＧＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＨＳＧＳＴＮＴＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＥＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＫＷＴＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＤＩＥＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＳＳＱＳＶＬＹＳＳＳＮＲＮＹＬＡＷＹＱＱＮＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＨＨＨＨＨＨ（配列番号３）、であり得る。

【0056】

いくつかの実施形態において、Ａは、Ｍｅｔ１およびＭｅｔ２に結合（ＳＣＡｃ－Ｍｅｔ１×ＳＣＡｃ－Ｍｅｔ２）する、一本鎖二重特異性抗体である。

【0057】

いくつかの実施形態において、ＳＣＡｃ－Ｍｅｔ１×ＳＣＡｃ－Ｍｅｔ２のアミノ酸配列は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＩＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＶＮＰＮＲＧＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＮＷＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＧＣＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＡＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＫＰＮＮＧＬＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＥＩＴＴＥＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＥＳＶＤＳＹＡＮＳＦＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＳＫＥＤＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＨＨＨＨＨＨ（配列番号４）、であり得る。

【0058】

いくつかの実施形態において、Ｄは、酵素および／または自壊メカニズムまたはＰＨ誘導加水分解のいずれかによって、腫瘍部位または腫瘍細胞内部のいずれかに、放出され得る。

【0059】

いくつかの実施形態において、Ｄは、ＤＮＡ架橋剤、微小管阻害剤、ＤＮＡアルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせ、から選択することができる。

【0060】

いくつかの実施形態において、Ｄは、アウリスタチン（auristatin）（ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）、ビンカアルカロイド、ラウリマリド、タキサン、コルヒチン、メイタンシン（ＤＭ１、ＤＭ４）、ツブリシン（tubulysin）、クリプトフィシン（Cryptophycin）、ヘミアステリン（Hemiasterlin）、セマドチン（Cemadotin）、リゾキシン（Rhizoxin）、ディスコデルモライド（Discodermolide）、タッカロノリド（taccalonolide）ＡまたはＢまたはＡＦまたはＡＪ、タッカロノリド（taccalonolide）ＡＩ－エポキシド、ＣＡ－４、エポチロンＡおよびＢ、ラウリマリド、パクリタキセル、ドセタキセル、ピロロベンゾジアゼピン、デュオカルマイシン、ドキソルビシン、カリケアマイシン、カンプトテシン、ＳＮ３８、ｉＳＧＤ－１８８２、センタナマイシン（centanamycin）、ＰＮＵ－１５９６８２、ウンシアラマイシン（uncialamycin）、インドリノベンゾジアゼピン二量体、β－アマニチン、アマトキシン、タイランスタチン（thailanstatin）、またはそれらの誘導体もしくは類似体、またはそれらの組み合わせ、から選択することができる。

【0061】

いくつかの実施形態において、Ｄは、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、細胞分裂抑制薬もしくはその誘導体、またはＳＮ３８、強力なトポイソメラーゼＩ阻害剤もしくはその誘導体、またはそれらの組み合わせである。

【0062】

さらなる実施形態において、Ｄは、４－アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）などの自壊スペーサー、および、バリン－シトルリンなどのトリガー部分、に結合して、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－Ｄを形成する。

【0063】

本発明の一態様において、抗体フラグメントまたは一本鎖単一特異性または多重特異性抗体を含む抗体またはタンパク質に、部位特異的にコンジュゲートすることができる、ＰＥＧ化薬物コンジュゲートを製造する方法、が提供される。本発明の別の態様において、ＰＥＧ化一本鎖ＢｓＡＤＣを製造する方法が提供される。

【0064】

ＰＥＧ化一本鎖ＢｓＡＤＣを合成するために、１～５価の単一特異性一本鎖抗体または一本鎖二重特異性抗体のコード配列またはコード配列を保有するベクターを合成し、例えばＣＨＯ発現系に導入することができる。タンパク質は、以前に記載されているように発現および精製することができる（ＷＯ２０１８０７５３０８）。

【0065】

部位特異的コンジュゲーション官能基を有する側鎖を有するＰＥＧ化薬物コンジュゲートの合成では、ヒドロキシル基やカルボキシル基などのＰＥＧの末端官能基を活性化し、ＢｏｃまたはＦｍｏｃ保護リジンなどの三官能性小分子部分とコンジュゲートさせて、末端分岐ヘテロ二官能性ＰＥＧを形成することができる。新たに形成されたカルボキシル基は、分岐スペーサーとカップリングして、ＰＥＧ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｂを形成することができる。カップリング後、保護基を除去することができ、保護されていないＰＥＧ化分岐リンカーを、マレイミドやＤＢＣＯなどの部位特異的コンジュゲーション官能基を有する低分子リンカーとカップリングさせて、ＰＥＧ－Ｌｙｓ（Ｍａｌ）－Ｂ、またはＰＥＧ－Ｌｙｓ（ＤＢＣＯ）－Ｂ、を形成することができる。ＰＥＧ化薬物コンジュゲート、例えば、ＰＥＧ－ｌｙｓ（Ｍａｌ）－Ｂ－（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）_ｎ、またはＰＥＧ－ｌｙｓ（ＤＢＣＯ）－Ｂ－（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）_ｎなど（ここで、ｎは整数であり、例えば２である）は、ＰＥＧ－Ｌｙｓ（Ｍａｌ）－Ｂ、またはＰＥＧ－Ｌｙｓ（ＤＢＣＯ）－Ｂと、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥとのカップリング反応によって製造することができる。合成の最終ステップは、ＰＥＧ化薬物コンジュゲートを、チオールまたはアジドが付けられた一本鎖二重特異性抗体に、部位特異的にコンジュゲートさせることである。

【0066】

あるいは、部位特異的コンジュゲーション官能基を有する側鎖を有するＰＥＧ化薬物コンジュゲートの合成では、ヒドロキシル基やカルボキシル基などのＰＥＧの末端官能基を活性化し、ＢｏｃやＦｍｏｃ保護リジンなどの三官能性小分子部分とコンジュゲートさせて、末端分岐ヘテロ二官能性ＰＥＧを形成し、続いて、保護基を除去することができる。脱保護後のＰＥＧ化合物を、マレイミドやＤＢＣＯなどの部位特異的コンジュゲーション官能基を有する低分子リンカーとカップリングさせて、ＰＥＧ－Ｌｙｓ（Ｍａｌ）－ＯＨ、またはＰＥＧ－Ｌｙｓ（ＤＢＣＯ）－ＯＨ、を形成することができる。次いで、ＰＥＧ－Ｌｙｓ（Ｍａｌ）－ＯＨまたはＰＥＧ－Ｌｙｓ（ＤＢＣＯ）－ＯＨを、各分岐が、伸長スペーサー、トリガーユニットおよび／または自壊スペーサー介して薬物Ｄと結合した分岐部分と、カップリングさせて、ＰＥＧ化薬物コンジュゲート、例えば、ＰＥＧ－ｌｙｓ（Ｍａｌ）－Ｂ－（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）_ｎ、またはＰＥＧ－ｌｙｓ（ＤＢＣＯ）－Ｂ－（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）_ｎなど（ここで、ｎは整数であり、例えば２である）を形成することができる。合成の最終段階は、式ＩａおよびＩｂの化合物を形成するために、チオールまたはアジドが付けられた一本鎖二重特異性抗体に、ＰＥＧ化薬物コンジュゲートを部位特異的にコンジュゲートさせることである。あるいは、ＰＥＧ化薬物コンジュゲートは、式Ｉｃの化合物を形成するために、同様の手法を用いて、商業的に利用可能なヘテロ二官能性ＰＥＧから合成することができる。

【0067】

ＩＩ．ＰＥＧリンカー
本発明の一実施形態において、ＰＥＧは、式：

【化18】

で示されるものであり得る。
上記の式において、ｎは、１～約２３００の整数であり得、好ましくは、５０００～４００００の総分子量、または所望によりそれ以上の総分子量を有するポリマーを提供し得る。Ｍは、Ｈ、メチル、または他の低分子量のアルキルであり得る。Ｍとしては、これに限定されるものではないが、例えば、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、またはＦ_１（ＣＨ_２）_ｑＣＨ_２が挙げられる。ＦおよびＦ_１は、独立して、ヒドロキシル、カルボキシル、チオール、ハライド、アミノ基などの、末端官能基であり得、官能化、活性化、および／または小分子スペーサーまたはリンカーへのコンジュゲートが可能である。ｑおよびｍは、０～１０の任意の整数であり得る。

【0068】

本発明の別の実施形態において、方法は、別の分岐ＰＥＧを用いて実施され得る。分岐ＰＥＧは、下記の式：

【化19】

で示されるものであり得る。
この式において、ＰＥＧは、ポリエチレングリコールである。ｍは、２～１０の整数であり得、好ましくは、５０００から８００００の総分子量、または所望によりそれ以上の総分子量を有する、分枝ＰＥＧを提供する。Ｍは、メチル、または他の低分子量のアルキルであり得る。Ｌは、２つ以上のＰＥＧが結合する官能性リンケージ部分であり得る。そのようなリンケージ部分としては、これに限定されるものではないが、例えば、アミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、リジン、または１，３－ジアミノ－２－プロパノール、トリエタノールアミン、結合される３つ以上の官能基を有する５員または６員の芳香族環または脂肪族環が挙げられる。Ｓは、任意の切断不可能なスペーサーである。Ｆは、ヒドロキシル、カルボキシル、チオール、アミノ基などの末端官能基であり得る。ｉは、０または１である。ｉが０の場合、式は、下記：

【化20】

で示されるものとなる。
上記の式中、ＰＥＧ、ｍ、Ｍ、またはＬの各可変基は、上記と同じ定義を有する。

【0069】

本発明の方法はまた、その末端基を官能化または活性化することができる、デキストラン、炭水化物ポリマー、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、または他の同様の非免疫原性ポリマーなどの、代替的なポリマー物質を用いて実施することもできる。前記のリストは、単なる例示であり、本明細書での使用に適した非抗原性ポリマーの種類を限定することを意図するものではない。

【0070】

ＩＩＩ．三官能性リンカーＴ
Ｔは、Ｐ、（Ｌ^１）_ａおよび（Ｌ^２）_ｂと結合する、三官能性リンカーを表す。Ｔは、３つの官能基の任意の組み合わせを有する分子から誘導することができ、官能基は、これに限定されるものではないが、例えば、ヒドロキシル、アミノ、ヒドラジニル、アジド、アルケン、アルキン、カルボキシル（アルデヒド、ケトン、エステル、カルボン酸、無水物、ハロゲン化アシル）、チオール、ジスルフィド、ニトリル、エポキシド、イミン、ニトロ、およびハライド、が挙げられる。三官能性リンカーの官能基は、同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、官能基の１つまたは２つを保護して、他の反応パートナーと選択的にコンジュゲーションを行うことができる。さまざまな保護基が当技術分野で知られており、例えば、ＭａｒｃｈによるAdvanced Organic Chemistry (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)に示されるものなどが挙げられる。官能基はまた、Ｔと別の反応パートナーとの間の反応の前または後に、他の基に変換され得る。例えば、ヒドロキシル基は、メシレート基またはトシレート基に変換され得る。ハライドは、アジド基で置き換えられ得る。Ｔの酸性官能基は、末端アルキンを有するアミノ基とカップリングすることにより、アルキン官能基に変換され得る。

【0071】

例示的な実施形態において、Ｔは、リジン、１，３－ジアミノ－２－プロパノール、またはトリエタノールアミンに由来するものである。これらの分子上の官能基の１つ以上は、選択的反応のために、保護され得る。いくつかの実施形態において、Ｔは、Ｂｏｃ保護リジンに由来する。

【0072】

ＩＶ．二官能性リンカーＬ^１およびＬ^２
リンカーＬ^１およびＬ^２は、ともに、－（ＣＨ_２）_ａＸＹ（ＣＨ_２）_ｂ－、－Ｘ（ＣＨ_２）_ａＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃ（ＣＨ_２）_ｂＹ－、－（ＣＨ_２）_ａヘテロシクリル－、－（ＣＨ_２）_ａＸ－、および、－Ｘ（ＣＨ_２）_ａＹ－から独立して選択され得るリンカー鎖を含み、ここで、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ、すべてのサブユニットを含めて、０～２５から選択される整数であり；ＸまたはＹは、Ｃ（＝Ｏ）、ＮＲ_１、Ｓ、Ｏ、ＣＲ_２Ｒ_３または不存在から独立して選択され；および、Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_３は、水素、Ｃ_１－１０アルキル、または（ＣＨ_２）_１－１０Ｃ（＝Ｏ）を表す。

【0073】

リンカーＬ^１およびＬ^２内のヘテロシクリルリンケージ基（それが内部位置または末端位置にあるかどうかにかかわらず）は、マレイミドをベースとした部分に由来し得る。適切な前駆体としては、これに限定されるものではないが、例えば、Ｎ－スクシンイミジル４－（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート）（ＬＣ－ＳＭＣＣ）、κ－マレイミドウンデカン酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ－マレイミド酪酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）－スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル－６－（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）－ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ－（ｐ－マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）、が挙げられる。

【0074】

いくつかの他の例示的な実施形態において、これに限定されるものではないが、各リンカーユニットは、Ｎ－スクシンイミジル－４－（ヨードアセチル）－アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ－スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）、または、Ｎ－スクシンイミジル３－（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）から選択される、ハロアセチルベースの部分に由来することもできる。

【0075】

あるいは、リンカーのヘテロシクリルリンケージ基は、ＤＢＣＯおよびアジドなどの異なるリンカー部分のコンジュゲーションから形成される、テトラゾリルまたはトリアゾリルであってもよい。したがって、ヘテロシクリル基は、リンケージポイントとして機能する。

【0076】

いくつかの実施形態において、（Ｌ^１）_ａおよび（Ｌ^２）_ｂは、それぞれ、
－Ｘ^１－（ＣＨ_２）_ａＣ（Ｏ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｂＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃ（ＣＨ_２）_ｄＣ（Ｏ）－、または
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ａＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２）_ｃＸ^２Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｄＮＲ－、または、
－Ｘ^３－（ＣＨ_２）_ａＣ（Ｏ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｂＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃ（ＣＨ_２）_ｄＸ^２Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｅＣ（Ｏ）－、を含んでよく、
ここで、Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立して、ヘテロシクリル基を表し；
ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは、それぞれ、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５から選択される整数であり；および、
Ｒは、水素、またはＣ_１－１０アルキルを表す。

【0077】

いくつかの実施形態において、Ｘ^１および／またはＸ^３は、マレイミドをベースとした部分に由来する。いくつかの実施形態において、Ｘ^２は、トリアゾリルまたはテトラゾリル含有基を表す。いくつかの実施形態において、Ｒは、水素を表す。いくつかの実施形態において、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは、それぞれ独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から選択される。

【0078】

いくつかの例示的な実施形態において、（Ｌ^１）_ａおよび（Ｌ^２）_ｂは、下記から選択され得る。

【化21】

ここで、ｎおよびｍは整数であり、独立して、０～２０から選択される。

【0079】

Ｖ．分岐リンカーＢ
分岐リンカーＢは、分岐ユニット、伸長スペーサー、トリガーユニット、自壊スペーサー、またはそれらの任意の組み合わせ、を含み得る。

【0080】

いくつかの実施形態において、分岐ユニットは、下記から独立して選択され得る構造を含む。

【化22】

【0081】

他の実施形態において、分岐ユニットは、下記から独立して選択され得る構造を含む。

【化23】

【0082】

いくつかの実施形態において、各分枝の伸長スペーサーは、下記：
－Ｘ（ＣＨ_２）_ａＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２）_ｃＹ－、
－Ｘ（ＣＨ_２）_ａＹ－、
またはその組み合わせ、
から独立して選択され得るリンカー鎖を含み、ここで、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ、０～２５から選択される整数であり、これにはすべてのサブユニットが含まれ；ＸおよびＹは、ＮＲ^１、ＮＲ^２、Ｃ（Ｏ）、Ｏ、または不存在から独立して選択され得；Ｒ^１およびＲ^２は、独立して、水素、またはＣ_１－１０アルキル基を表す。

【0083】

他の実施形態において、トリガーユニットは、アミノ酸配列または炭水化物部分またはジスルフィド、または、酵素的または化学的に切断することができる切断可能結合、を含む。

【0084】

いくつかの実施形態において、自壊スペーサーは、下記から選択され得る構造を含む。

【化24】

ここで、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４は、独立して、水素、またはＣ_１－１０アルキルを表し；ＸおよびＹは、ＮＨ、またはＯまたはＳであり得、ｃは、１または２から選択される。

【0085】

いくつかの実施形態において、自壊スペーサーは、

【化25】

である。

【0086】

いくつかの実施形態において、分岐リンカーＢは、下記から選択され得る。

【化26】

【化27】

【化28】

ここで、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆは、それぞれ、１～２５から選択される整数であり；
（Ａ）_ｎは、アミノ酸配列のトリガーユニットであり、各Ａは、独立してアミノ酸であり、ｎは、１～２５の整数であり；
ＰＡＢは、パラ－アミノベンジルアルコールであり；
Ｅｘは、下記：
－ＮＲ^１（ＣＨ_２）_ａＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２）_ｃＣ（Ｏ）－、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ａＮＲ^１－、
－ＮＲ^１（ＣＨ_２）_ａＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２）_ｃＮＲ^２－、
－ＮＲ^１（ＣＨ_２）_ａＮＲ^２－、
－ＮＲ^１（ＣＨ_２）_ａＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２）_ｃＯ－、
－Ｏ（ＣＨ_２）_ａＮＲ^１－、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ａＯ－、
－Ｏ（ＣＨ_２）_ａＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２）_ｃＣ（Ｏ）－
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ａＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２）_ｃＣ（Ｏ）－、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ａＣ（Ｏ）－、
または、不存在、
から独立して選択され得るリンカー鎖を含む伸長スペーサーであり；
ここで、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ、０～２５から選択される整数であり、これにはすべてのサブユニットが含まれ；および、Ｒ^１およびＲ^２は、独立して、水素、またはＣ_１－１０アルキル基を表す。

【0087】

いくつかの他の実施形態において、アミノ酸配列のトリガーユニットは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、ａｌ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ｄ－Ｐｈｅ－ＬＰｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｄ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ、または、Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－；またはそれらの保護された形態、であり得る。

【0088】

好ましい実施形態として、アミノ酸配列は、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、または、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、であり得る。

【0089】

いくつかの例示的な実施形態において、分枝リンカーＢは、下記から選択され得る。

【化29】

【0090】

ＶＩ．リンケージ基
本発明のコンジュゲートの異なる部分は、様々な化学的リンケージを介して結合することができる。例えば、これに限定されるものではないが、アミド、エステル、ジスルフィド、エーテル、アミノ、カルバメート、ヒドラジン、チオエーテル、およびカーボネートが挙げられる。例えば、ＰＥＧ部分（Ｐ）の末端ヒドロキシル基を活性化し、次いで、リジン（Ｔ）とカップリングさせて、式Ｉａまたは式ＩｂにおけるＰとＴとの間に目的のリンケージポイントを提供することができる。ＴとＬ^１の間、またはＴとＬ^２の間、またはＬ^２とＢの間の、リンケージ基は、リンカーＬ^２のアミノ基とリジン（Ｔ）のカルボキシル基の間、またはＬ^１のカルボキシル基とＴのアミノ基の間、またはＬ^２のカルボキシル基とＢのアミノ基の間の、反応から生じるアミドであり得る。コンジュゲートの所望の特性に応じて、抗体部分（Ａ）と隣接するリンカーＬ^１との間、または任意の２つのアミノ酸の間、またはアミノ酸とパラ－アミノベンジルアルコールとの間に、適切なリンケージ基が組み込まれてもよい。

【0091】

いくつかの実施形態において、コンジュゲートの異なる部分間のリンケージ基は、互いに固有の化学的親和性または選択性を有する一対の官能基のカップリングに由来し得る。これらのタイプのカップリングまたは環形成により、タンパク質または抗体部分の導入のための部位特異的コンジュゲーションが可能になる。部位特異的コンジュゲーションをもたらすこれらの官能基としては、これに限定されるものではないが、例えば、チオール、マレイミド、２’－ピリジルジチオ変異体、芳香族またはビニルスルホン、アクリレート、ブロモまたはヨードアセトアミド、アジド、アルキン、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）、カルボニル、２－アミノ－ベンズアルデヒドまたは２－アミノ－アセトフェノン基、ヒドラジド、オキシム、アシルトリフルオロホウ酸カリウム、Ｏ－カルバモイルヒドロキシルアミン、トランス－シクロオクテン、テトラジン、およびトリアリールホスフィン、ボロン酸、アルキン、が挙げられる。

【0092】

ＶＩＩ．細胞傷害性化合物Ｄ
いくつかの実施形態において、Ｄとしては、これに限定されるものではないが、メイタンシノイド（ＤＭ１、ＤＭ４）（ＵＳ５２０８０２０；ＵＳ５４１６０６４；ＥＰ０４２５２３５）、アウリスタチン誘導体、例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびＦ（ＭＭＡＦ）（ＵＳ５６３５４８３；ＵＳ５７８０５８８；ＵＳ７４９８２９８）、ピロロベンゾジアゼピン、セマドチン（Cemadotin）、ＳＮ３８、ディスコデルモライド、タッカロノリド（taccalonolide）ＡまたはＢまたはＡＦまたはＡＪ、タッカロノリドＡＩ－エポキシド、ＣＡ－４、ビンカアルカロイド、ｉＳＧＤ－１８８２、インドリノベンゾジアゼピンダイマー、ウンシアラマイシン（uncialamycin）、センタナマイシン（centanamycin）、ラウリマライド（laulimalide）、ドラスタチン（dolastatin）、タイランスタチン（thailanstatins）、アマトキシン（Amatoxins）、β－アマニチン（amanitin）、ヘミアステリン（Hemiasterlin）、デュオカルマイシン（duocarmycins）、ＰＮＵ－１５９６８２、コルヒチン、ツブリシン（tubulysins）、カリケアマイシンまたはそれらの誘導体（ＵＳ５７１２３７４；ＵＳ５７１４５８６；ＵＳ５７３９１１６；ＵＳ５７６７２８５；ＵＳ５７７０７０１；ＵＳ５７７０７１０；ＵＳ５７７３００１；ＵＳ５８７７２９６；Hinman, L. M. et al. Cancer Res., 1993, 53, 3336-3342; Lode, H. N. et al. Cancer Res., 1998, 58, 2925-2928）、アントラサイクリン、例えば、ダウノマイシンまたはドキソルビシン（Kratz, F. et al. Curr. Med. Chem., 2006, 13, 477-523; Jeffrey, S. C. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006, 16, 358-362; Torgov, M. Y. et al. Bioconjug. Chem., 2005, 16 717-721; Nagy, A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 829-834; Dubowchik, G. M. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2002, 12, 1529-1532; King, H. D. et al. J. Med. Chem., 2002, 45, 4336-4343; ＵＳ６６３０５７９）、メトトレキサート、ビンデシン、タキサン、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル（larotaxel）、テセタキセル（tesetaxel）およびオルタタキセル（ortataxel）、トリコテセン、ＣＣ－１０６５、を挙げることができる。

【0093】

他の実施形態において、Ｄは、酵素的に活性な毒素またはそのフラグメントであり得、これに限定されるものではないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α－サルシン（sarcin）、シナアブラギリ（aleurites fordii）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン（crotin）、サボンソウ（saponaria officinalis）阻害剤、ゲロニン（gelonin）、マイトジェリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、およびエノマイシン（enomycin）、が挙げられる。

【0094】

さらにいくつかの他の実施形態において、Ｄは、放射性原子であり得る。放射性コンジュゲートの製造には、さまざまな放射性同位元素が利用できる。例えば、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２、および、Ｌｕの放射性同位元素が挙げられる。放射性コンジュゲートを検出に用いる場合、シンチグラフィ研究用の放射性原子、例えば、Ｔｃ^９９またはＩ^１２３、または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用のスピン標識、例えば、Ｉ^１２３、Ｉ^１３１、Ｉｎ^１１１、Ｆ^１９、Ｃ^１３、Ｎ^１５、Ｏ^１７、ガドリニウム、マンガン、または鉄などが挙げられる。

【0095】

いくつかのさらなる実施形態において、Ｄとしては、アルキル化剤、例えば、チオテパ、およびシクロホスファミド；アルキルスルホン酸塩、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メトレドーパ（meturedopa）、およびウレドーパ（uredopa）；エチレンイミンおよびメチルアメラミン（methylamelamines）、例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロールメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンとブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（その合成類似体、アドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシンを含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９およびＣＢＩ－ＴＭＩを含む）；エレウテロビン（eleutherobin）；パンクラチスタチン（pancratistatin）；サルコディクチン（sarcodictyin）；スポンギスタチン（spongistatin）；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質、例えば、カリケアマイシン（Nicolaou, K. C. et al. Agnew Chem. Intl. Ed., 1994, 33, 183-186）、ダイネマイシン（dynemicin）、エスペラマイシン（esperamicin）、ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン（aclacinomysins）、アクチノマイシン、オートラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（cactinomycin）、カラビシン（carabicin）、カミノマイシン（caminomycin）、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（detorubicin）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシン（deoxydoxorubicin）を含む）、エピルビシン、エソルビシン（esorubicin）、イダルビシン、マルセロマイシン（marcellomycin）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、ケラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート、および５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５－ＦＵ；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン（dromostanolone propionate）、エピチオスタノール（epitiostanol）、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎物質（anti-adrenals）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補給剤、例えば、フロリン酸（frolinic acid）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジクオン；エルホルミチン（elformithine）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド（maytansinoids）、例えば、メイタンシン（maytansine）およびアンサマイトシン（ansamitocins）；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン（sizofuran）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ－２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、アングイジン（anguidine））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（arabinoside）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（商標））、およびドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（商標））；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；プラチナ類似体、例えば、シスプラチン、およびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤 ルビテカン（９－ニトロカンプトテシンまたはＲＦＳ－２０００）；ジフルオロメチルオルニチン；レチノイン酸；カペシタビン；および、上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体、を挙げることができる。この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれ、、例えば、抗エストロゲン剤として、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（trioxifene）、ケオキシフェン（keoxifene）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（onapristone）、およびトレミフェン（toremifene）；抗アンドロゲン剤として、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド（leuprolide）、およびゴセレリン；および、上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体、が挙げられる。

【0096】

ＶＩＩＩ．抗体および標的
細胞表面分子および／またはそれらのリガンドに対して指向する多くの治療用抗体が知られている。これらの抗体は、単一特異性または多重特異性ＡＤＣにおけるオーダーメイドの特異的認識結合部分の選択および構築に使用することができる。例としては、ブリナツモマブ／ＢＬＩＮＣＹＴＯ（ＣＤ３／ＣＤ１９）、リツキサン／ＭａｂＴｈｅｒａ／リツキシマブ（ＣＤ２０）、Ｈ７／オクレリズマブ（ＣＤ２０）、ゼヴァリン／イブリツモマブ（ＣＤ２０）、Ａｒｚｅｒｒａ／オファツムマブ（ＣＤ２０）、ＨＬＬ２／エプラツズマブ、イノツズマブ（ＣＤ２２）、Ｚｅｎａｐａｘ／ダクリズマブ、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ／バシリキシマブ（ＣＤ２５）、ハーセプチン／トラスツズマブ、ペルツズマブ（Ｈｅｒ２／ＥＲＢＢ２）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ／ゲムツズマブ（ＣＤ３３）、Ｒａｐｔｉｖａ／エファリズマブ（Ｃｄ１１ａ）、アービタックス／セツキシマブ（ＥＧＦＲ、上皮成長因子受容体）、ＩＭＣ－１１２１Ｂ（ＶＥＧＦ受容体２）、タイサブリ／ナタリズマブ（α４β１およびα４β７インテグリンのα４サブユニット）、レオプロ／アブシキシマブ（ｇｐＩＩｂ－ｇｐＩＩａおよびαｖβ３－インテグリン）、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３／ムロモナブ－ＣＤ３（ＣＤ３）、ベンリスタ／ベリムマブ（ＢＡＦＦ）、Ｔｏｌｅｒｘ／オテリキシマブ（Ｏｔｅｌｉｘｉｍａｂ）（ＣＤ３）、Ｓｏｌｉｒｉｓ／エクリズマブ（Ｃ５補体タンパク質）、Ａｃｔｅｍｒａ／トシリズマブ（ＩＬ－６Ｒ）、Ｐａｎｏｒｅｘ／エドレコロマブ（ＥｐＣＡＭ、上皮細胞接着分子）、ＣＥＡ－ＣＡＭ５／ラベツズマブ（Ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）（ＣＤ６６／ＣＥＡ、癌胎児性抗原））、ＣＴ－１１（ＰＤ－１、プログラム死－１ Ｔ細胞阻害受容体、ＣＤ－ｄ２７９）、Ｈ２２４Ｇ１１（ｃ－Ｍｅｔ受容体）、ＳＡＲ３４１９（ＣＤ１９）、ＩＭＣ－Ａ１２／シクツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）（ＩＧＦ－１Ｒ、インスリン様成長因子１受容体）、ＭＥＤＩ－５７５（ＰＤＧＦ－Ｒ、血小板由来成長因子受容体）、ＣＰ－６７５、２０６／トレメリムマブ（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４）、ＲＯ５３２３４４１（胎盤成長因子またはＰＧＦ）、ＨＧＳ１０１２／マパツムマブ（Ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１）、ＳＧＮ－７０（ＣＤ７０）、ベドチン（ＳＧＮ－３５）／ブレンツキシマブ（ＣＤ３０）、およびＡＲＨ４６０－１６－２（ＣＤ４４）、が挙げられる。

【0097】

本明細書に開示される単一特異性または多重特異性ＡＤＣは、腫瘍性疾患、心血管疾患、感染性疾患、炎症性疾患、自己免疫性疾患、代謝性（例えば、内分泌）疾患、または神経性（例えば、神経変性）疾患の治療のための医薬品の製造に使用することができる。これらの疾患の例としては、これに限定されるものではないが、例えば、アルツハイマー病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性および慢性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、急性および慢性骨髄性白血病、Ｔ細胞リンパ腫および白血病、多発性骨髄腫、神経膠腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、癌（例えば、口腔癌、消化管癌、結腸癌、胃癌、肺管癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膀胱癌、膵臓癌、骨肉腫、肝臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、皮膚癌、および精巣癌）、黒色腫、肉腫、神経膠腫、および皮膚癌、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性疾患症候群、類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛症、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、または線維化性肺胞炎、が挙げられる。

【0098】

多くの細胞表面マーカーとそのリガンドが知られている。例えば、癌細胞は、以下の細胞表面マーカーおよび／またはリガンドの少なくとも１つを発現することが報告されており、これに限定されるものではないが、炭酸脱水酵素ＩＸ、α－フェトプロテイン、α－アクチニン－４、Ａ３（Ａ３３抗体に特異的な抗原）、ＡＲＴ－４、Ｂ７、Ｂａ－７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３－抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８／ｍ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ８、ＣＤ１－１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ－ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ－４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ－１－α、結腸特異抗原－ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－１、ＥＧＰ－２、ＥＬＦ２－Ｍ、Ｅｐ－ＣＡＭ、Ｆｌｔ－１、Ｆｌｔ－３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ＧＲＯＢ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ－１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ－１）、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＨＳＴ－２または１ａ、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－２、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－１７Ｒ、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２５、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、ＫＣ４－抗原、ＫＳ－１－抗原、ＫＳ１－４、Ｌｅ－Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＲＴ－１、ＭＡＲＴ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＡＧ－３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１Ａ、ＭＩＰ－１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＭ－１／２、ＭＵＭ－３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、膵臓癌ムチン、胎盤増殖因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、Ｐ１ＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ－１Ｒ、ＩＬ－６、ＩＬ－２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、５１００、サバイビン、サバイビン－２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ－７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ－α、Ｔｎ抗原、トムソン・フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、ＷＴ－１、１７－１Ａ抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃｌ－２、ｂｃｌ－６、Ｋｒａｓ、ｃ－Ｍｅｔ、癌遺伝子マーカーおよび癌遺伝子産物（Sensi, M. et al. Clin. Cancer Res., 2006, 12, 5023-5032; Parmiani, G. et al. J. Immunol., 2007, 178, 1975-1979; Castelli, C. et al. Cancer Immunol. Immunother., 2005, 54, 187-207）、が挙げられる。したがって、そのような特異的細胞表面受容体またはそれらのリガンドを認識する抗体は、本発明の単一特異性または多重特異性ＡＤＣにおける特異的かつ選択的な認識結合部分に使用することができ、疾患に関連する多数の細胞表面マーカーまたはリガンドを標的にして結合することができる。

【0099】

いくつかの実施形態において、癌／腫瘍の治療のために、Herbermanの「Immunodiagnosis of Cancer」、Fleisher編、「The Clinical Biochemistry of Cancer」ページ347 (American Association of Clinical Chemists, 1979)、および、ＵＳ４１５０１４９；ＵＳ４３６１５４４；ＵＳ４４４４７４４において報告されているような、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的として、単一特異性または多重特異性ＡＤＣが使用される。

【0100】

腫瘍関連抗原に関する報告としては、Mizukami et al., Nature Med. 2005 11, 992-997; Hatfield et al., Curr. Cancer Drug Targets 2005, 5229-248; Vallbohmer et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 3536-3544; および Ren et al., Ann. Surg. 2005, 242, 55-63、が挙げられ、これらそれぞれは、確認されるＴＡＡに関して参照により本明細書に組み込まれる。疾患が、リンパ腫、白血病、または自己免疫疾患に関連する場合、標的となる抗原は、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５４、ＣＤ６７、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、ＣＸＣＲ４、Ｂ７、ＭＵＣ１または１ａ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ－ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、Ｐ１ＧＦ、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子、癌遺伝子産物（ｃ－ＭｅｔまたはＰＬＡＧＬ２など）、ＣＤ６６ａ－ｄ、壊死抗原、ＩＬ－２、Ｔ１０１、ＴＡＧ、ＩＬ－６、ＭＩＦ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１（ＤＲ４）、およびＴＲＡＩＬ－Ｒ２（ＤＲ５）からなる群から選択され得る。

【0101】

上記の抗原に対する抗体を結合ドメインまたは部分として用いて、本発明のＡＤＣまたはＢｓＡＤＣを製造することができる。２つの異なる標的に対して、さまざまなＢｓＡＤＣを製造することができる。

【0102】

抗原のペアの例としては、ＣＤ１９／ＣＤ３、ＢＣＭＡ／ＣＤ３、組み合わせによるＨＥＲファミリーの異なる抗原（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３）、ＩＬ１７ＲＡ／ＩＬ７Ｒ、ＩＬ－６／ＩＬ－２３、ＩＬ－１－β／ＩＬ－８、ＩＬ－６またはＩＬ－６Ｒ／ＩＬ－２１またはＩＬ－２１Ｒ、ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦＲ－β、ＶＥＧＦ２／ＣＤ３、ＰＳＭＡ／ＣＤ３、ＥＰＣＡＭ／ＣＤ３；ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－２、ＶＥＧＦＲ－３、ＦＬＴ３、ｃ－ＦＭＳ／ＣＳＦ１Ｒ、ＲＥＴ、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｃ－ＫＩＴ、ＢＣＲ、インテグリン、およびＭＭＰからなる群から選択される抗原と、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、およびアンジオポエチンからなる群から選択される水溶性リガンドの組み合わせ、ＥＲＢＢ－３ｃＣ－Ｍｅｔ、ＥＲＢＢ－２／ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦ受容体１／ＣＤ３、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３、ＰＳＣＡ／ＣＤ３、ｃ－Ｍｅｔ／ＣＤ３、ＥＮＤＯＳＩＡＬＩＮ／ＣＤ３、ＥＰＣＡＭ／ＣＤ３、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤ３、ＦＡＰＡＬＰＨＡ／ＣＤ３、ＥＧＦＲ／ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＥＧＦ受容体１／ＣＤ３、およびＣＤ１９／ＣＤ１６、が挙げられる。二重特異性ＡＤＣのさらなる例は、（ｉ）ルイスｘ構造、ルイスｂ構造、およびルイスｙ構造、Ｇｌｏｂｏ Ｈ構造、ＫＨ１、Ｔｎ抗原、ＴＦ抗原、およびムチンなどの炭水化物構造、ＣＤ４４、糖脂質およびスフィンゴ糖脂質、例えば、Ｇｇ３、Ｇｂ３、ＧＤ３、ＧＤ２、Ｇｂ５、Ｇｍ１、Ｇｍ２、およびシアリルテトラオシルセラミド（sialyltetraosylceramide）、からなる群から選択される抗原のグリコエピトープを指向する第１の特異性、および、（ｉｉ）ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４からなる群から選択されるＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼを指向する第２の特異性、を有し得る。第２の抗原結合部位と組み合わせたＧＤ２は、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、間葉系幹細胞、神経幹細胞からなる群から選択される免疫細胞と関係をもてる。

【0103】

単一特異性または二重特異性抗体は、本明細書に開示された方法を用いて別の単一特異性または二重特異性抗体と一緒に結合させて、多重特異性ＡＤＣを製造することができる。上記の治療用抗体など、すでに入手可能な単一特異性または二重特異性治療用結合物質を使用することにより、必要な多重特異性結合分子を迅速かつ容易に生成することができる。２つ以上の異なるエピトープへの同時ターゲティングと結合のために２つ以上の単一治療分子を組み合わせることにより、このオーダーメイドの多重特異性ＡＤＣを生成することで、単一ターゲティングＡＤＣと比較して、相加／相乗効果を期待することができる。

【0104】

いくつかの実施形態において、本発明の多重特異性ＡＤＣは、以下の標的ペアに対して、特異的に相互作用し、測定可能な親和性を示す、抗体ペアを使用して、製造される。

【0105】

【表1】

【0106】

いくつかの実施形態において、ＢｓＡＤＣは二重特異性一本鎖抗体を含み、ここで、二重特異性一本鎖抗体の２つの結合ドメインは、リンカーを介して連結される。いくつかの実施形態において、リンカーは、抗体を、非免疫原性ポリマー薬物コンジュゲート、例えば、ＰＥＧ化薬物コンジュゲートに、部位特異的にコンジュゲートさせるために使用できる、システインまたは非天然アミノ酸残基などの部分を含む。いくつかの他の実施形態において、二重特異性一本鎖抗体の２つの結合ドメインの一方または両方が、抗体を、非免疫原性ポリマー薬物コンジュゲート、例えば、ＰＥＧ化薬物コンジュゲートに、部位特異的にコンジュゲートさせるために使用できる、システインまたは非天然アミノ酸残基を含む。

【0107】

好ましい実施形態において、ＢｓＡＤＣは、Ｈｅｒ２の２つの異なるエピトープに対して、特異的に相互作用し、測定可能な親和性を示す、２つの抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）のコンジュゲートである。

【0108】

ＩＸ．合成
所望のＰＥＧのサイズおよび分岐の数を選択したあと、ヒドロキシル基、カルボキシル基などのＰＥＧの末端官能基を、任意の技術的に知られた方法を用いて、末端分岐ヘテロ二官能基に変換することができる（ＷＯ２０１８０７５３０８）。大まかに言えば、末端分枝ヘテロ二官能性ＰＥＧは、末端ヒドロキシル基の場合には、ジ（Ｎ－スクシンイミジル）カーボネート（ＤＳＣ）、トリホスゲンなどの試薬を使用して、あるいは、末端カルボキシル基の場合には、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などのカップリング試薬を使用して、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ピリジンなどの塩基の存在下で、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドによってＰＥＧの末端ヒドロキシル基またはカルボキシル基を活性化して、活性化ＰＥＧを形成することによって、製造することができる。

【0109】

次に、活性化したＰＥＧを、ジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）などの塩基の存在下で、リジン誘導体Ｈ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨなどの三官能性小分子と反応させて、遊離カルボキシル基およびＢｏｃ保護アミノ基を有する末端分岐ヘテロ二官能性ＰＥＧ ＰＥＧ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＣＯＯＨを形成することができる。当業者が理解するように、ハライド、アミノ、チオール基などのＰＥＧの他の末端官能基、および、－ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）Ｘ（Ｘ＝ハライド）、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、－ＳＨ、無水物、ハライド、マレイミド、Ｃ＝Ｃ、Ｃ≡Ｃなどやまたはそれらの保護体のリストうちの３つの官能基の任意の組み合わせを含む他の三官能性小分子を、必要に応じて、同じ目的の代替として、使用することができる。

【0110】

ＴＦＡによりＢｏｃの除去し、ＮＨＳ－ＰＥＧ_２－マレイミドなどのマレイミドが付いたスペーサーとの反応により、ＰＥＧ－Ｌｙｓ（Ｍａｌ）－ＣＯＯＨが生成される。

【0111】

これとは別に、トリガー（例えば、ｖａｌ－ｃｉｔ）および自壊スペーサー（例えば、ＰＡＢＣ）で連結された細胞傷害薬（例えば、ＭＭＡＥ）を、ＥＤＣ／ＨＯＢＴなどのカップリング試薬で分岐ユニットにカップリングさせて、Ｂ－Ｄ（例えば、下記）を生成する。

【化30】

【0112】

目的の生成物は、ＰＥＧ－Ｌｙｓ（Ｍａｌ）－ＣＯＯＨを、ＤＣＣなどのカップリング試薬を使用して、Ｂ－Ｄとカップリングさせ、ＰＥＧ化薬物コンジュゲート ＰＥＧ－Ｌｙｓ（Ｍａｌ）－（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）_２を形成することによって、形成することができる。

【0113】

抗原に対して二価である単一特異性の抗体、またはＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶなどの二重特異性の抗体は、発現系の遺伝子操作によって製造することができる。例えば、二重特異性ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを合成し、発現系（例えば、ＣＨＯ細胞）に導入することができる。次いで、目的のタンパク質を発現させ、クロマトグラフィー技術によって精製する。

【0114】

抗原に対して二価であるＰＥＧ化一本鎖ＡＤＣ、またはＢｓＡＤＣを製造するために、官能基マレイミドまたはＤＢＣＯを有するＰＥＧ化薬物コンジュゲートを、遺伝子的に挿入されるかまたは誘導体化された、ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶまたはＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶなどの二官能性抗体の遊離チオールまたはアジド官能基と、部位特異的に反応させて、ＰＥＧ－Ｌｙｓ（ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶ）－（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）_２、または、ＰＥＧ－Ｌｙｓ（ＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶ）－（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）_２を形成することができる。

【0115】

ＰＥＧ化多重特異性抗体は、単一特異性抗体または二重特異性抗体の代わりに多重特異性抗体を使用することにより、同様に製造することができる。

【0116】

本発明で例示されるチオール／マレイミドまたはＤＢＣＯ／アジドの部位特異的コンジュゲーション基ペアに加えて、当業者が理解するように、他の既知の部位特異的コンジュゲーション基ペア、例えば、トランス－シクロオクテン／テトラジンペア；カルボニル／ヒドラジド；カルボニル／オキシム；鈴木・宮浦クロスカップリング試薬ペア；薗頭クロスカップリング試薬ペア；シュタウディンガーライゲーション試薬ペア；クネーフェナーゲル（Ｋｎｏｅｖｅｎａｇｅｌ）－Ｉｎｔｒａマイケル付加試薬ペア、活性アミン／アクリレートペアなど、を同様に設計し、必要に応じて同じ目的のための代替物として、使用することができる。部位特異的コンジュゲーション基ペアの上記に列挙したものは、単なる例示であり、本明細書での使用に適した部位特異的コンジュゲーション基ペアの種類を限定することを意図するものではない。

【0117】

Ｘ．組成物
本発明はまた、薬学的に許容される担体と共に製剤化された、本発明の化合物を含有する組成物、例えば医薬組成物、を提供する。例えば、本発明の医薬組成物は、Ｈｅｒ２受容体の２つの異なるエピトープに結合する化合物（例えば、二重特異性抗体－薬物コンジュゲート）を含むことができる。

【0118】

本発明の治療製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の純度を有する単一特異性または多重特異性分子の薬物コンジュゲートを、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって、製造することができる。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量および濃度で被験者に対して非毒性であり、例えば、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸およびメチオニン；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、およびｍ－クレゾール）；低分子量（アミノ酸残基が約１０未満）のタンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；単糖類、二糖類、およびその他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール；塩形成カウンターイオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；および／または、非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、またはＰＥＧ、が挙げられる。

【0119】

製剤はまた、治療される特定の徴候にとって必要な場合、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有する、１つ以上の活性化合物を含み得る。例えば、製剤は、別の抗体または多重特異性抗体、細胞傷害剤、化学療法剤、またはＡＤＣをさらに含んでもよい。そのような分子は、意図する目的に有効な量で組み合わせられて、適切に存在する。

【0120】

活性成分はまた、例えばコアセルベーション技術または界面重合によって製造されたマイクロカプセルによって封入されていてもよく、例えば、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンにおいて、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセル、およびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルが挙げられる。そのような技術は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのPharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) に開示されている。

【0121】

持続放出性製剤が製造されてもよい。持続放出性製剤の適切な例として、単一特異性分子または多重特異性分子を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出性マトリックスとしては、例えば、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（ＵＳ３７７３９１９）、Ｌ－グルタミン酸とγ－エチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、例えば、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（乳酸－グリコール酸コポリマーとリュープロレリン酢酸塩で構成される注射用マイクロスフェア）、およびポリ－ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン－酢酸ビニルおよび乳酸－グリコール酸などのポリマーは、１００日を超える分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い期間でタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が長期間体内に留まると、３７℃の湿気にさらされる結果として変性または凝集し、その結果、生物活性が失われ、免疫原性が変化する可能性がある。関連するメカニズムに応じて、安定化のために合理的な戦略を立てることができる。例えば、凝集メカニズムが、チオジスルフィド交換による分子間Ｓ－Ｓ結合形成であることが判明した場合、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の使用、および特定のポリマーマトリックス組成の開発によって、達成することができる。

【0122】

本発明の医薬組成物は、併用療法で、すなわち他の薬剤と組み合わせて、投与することができる。併用療法で使用できる治療薬の例は、以下に、より詳細に記載されている。

【0123】

インビボ投与に使用する製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜による濾過によって容易に行うことができる。滅菌注射溶液は、必要に応じて、上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒に、必要量の活性化合物を混合し、続いて滅菌精密ろ過を行うことによって、製造することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、ベースとなる分散媒体および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに混合することによって、製造される。滅菌注射溶液の製造のための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）であり、これにより、事前に滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分が加わった、活性成分の粉末が得られる。

【0124】

ＸＩ．投与量
単一剤形を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される対象、および特定の投与方法に応じて変化する。単一剤形を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす組成の量である。一般に、この量は、１００パーセントのうち、薬学的に許容される担体との組み合わせにおいて、活性成分が約０．０１％～約９９％の範囲であり、好ましくは約０．１％～約７０％であり、さらに好ましくは活性成分が約１％～約３０％の範囲である。

【0125】

投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように、調整される。例えば、単回ボーラスで投与されてもよいし、時間をかけて数回に分けた用量が投与されてもよいし、治療状況の緊急性で示されるように、用量を比例的に減少または増加させてもよい。投与を容易にし、用量を均一にするために、非経口組成物を単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書において、単位剤形は、治療する対象に対する単位投与量として適した物理的に別個となった単位を意味し、各単位は、必要な薬学的担体と関連して、所望の治療効果をもたらすように計算された所定の量の活性化合物を含んでいる。本発明の単位剤形は、その仕様が、（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体の感受性の処置のためにそのような活性化合物を配合する技術に固有の制限、によって決定され、それに直接依存する。

【0126】

本発明の単一特異性または多重特異性分子薬物コンジュゲートの投与では、投与量は、被験者の体重１ｋｇあたり約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ、さらに通常、０．０１～５０ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、または１０ｍｇ／ｋｇ体重、あるいは、１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的な治療レジメンは、毎日、週に２回、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月に１回、３ヶ月に１回、または３～６ヶ月に１回の投与である。本発明の単一特異性または多重特異性薬物コンジュゲートの好ましい投与レジメンとしては、静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重の投与が挙げられ、単一特異性または多重特異性薬物コンジュゲートは、以下の投与スケジュール：（ｉ）４週間ごと６回の投与、その後は３か月ごと、（ｉｉ）３週間ごと、（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、その後３週間ごとに１ｍｇ／ｋｇ体重、のいずれかを用いて与えられる。

【0127】

あるいは、単一特異性または多重特異性薬物コンジュゲートを持続放出性製剤として投与することができ、この場合、必要な投与頻度は少なくなる。用量および頻度は、患者における単一特異性または多重特異性薬物コンジュゲートの半減期によって異なる。一般に、ヒト抗体の半減期が最も長く、次いでヒト化抗体、キメラ抗体、そして非ヒト抗体と続く。投与量と投与頻度は、処置が予防的か治療的かによって異なる。予防用途では、比較的低用量が、長期間にわたって比較的頻度が少ない間隔で投与される。一部の患者は、生涯にわたって処置を受け続ける。治療用途では、疾患の進行が軽減または終了するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的高用量が、必要となる場合がある。その後、患者は予防療法を受けることができる。

【0128】

本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性がなく、特定の患者、組成物、および投与方法に対して所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るために、変化し得る。選択される用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、処置の期間、使用する特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態および以前の病歴、ならびに医療分野でよく知られている要因、を含む、様々な薬物動態的要因に依存する。

【0129】

本発明の単一特異性または多重特異性分子の「治療有効量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の低下、疾患症状のない期間の頻度および時間の増加、または疾患の苦痛による機能低下または障害の防止をもたらす。例えば、腫瘍の治療の場合、「治療有効量」は、好ましくは、細胞増殖または腫瘍増殖または転移を、治療をしない対象と比較して、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、阻害する。腫瘍増殖を阻害する薬剤または化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系によって、評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、当業者に知られているアッセイによるインビトロでの阻害など、阻害する化合物の能力を調べることによって、評価することができる。治療有効量の治療用化合物は、対象において、腫瘍サイズ、転移を低減させ、あるいは、症状を改善することができる。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択された特定の組成物または投与経路などの要因に基づいて、その量を決定することができるものである。

【0130】

ＸＩＩ．投与
本発明の組成物は、当技術分野で知られている様々な方法の１つ以上を用いて、１つ以上の投与経路を介して、投与することができる。当業者によって理解されるように、投与の経路および／または方法は、目的とする結果に応じて変化する。本発明の抗体薬物コンジュゲートの好ましい投与経路としては、例えば、注射または注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、または他の非経口経路の投与が挙げられる。本明細書において、「非経口投与」という語句は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、これに限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の、注射および注入が挙げられる。あるいは、本発明の単一特異性または多重特異性分子薬物コンジュゲートは、例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下、または局所などの、局所、表皮または粘膜の投与経路などの非経口でない経路を介して、投与することができる。

【0131】

活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤など、化合物を急速な放出から保護する担体とともに、製造され得る。エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤を製造するための多くの方法は、特許され、当業者に一般的に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。

【0132】

治療用組成物は、当技術分野で知られている医療装置で投与することができる。例えば、本発明の治療用組成物は、ＵＳ５３９９１６３、ＵＳ５３８３８５１、ＵＳ５３１２３３５、ＵＳ５０６４４１３、ＵＳ４９４１８８０、ＵＳ４７９０８２４、およびＵＳ４５９６５５６に開示されている装置などの無針皮下注射装置を用いて投与することができる。本発明に有用な既知のインプラントおよびモジュールとしては、例えば、ＵＳ４４８７６０３、ＵＳ４４８６１９４、ＵＳ４４４７２３３、ＵＳ４４４７２２４、ＵＳ４４３９１９６、およびＵＳ４４７５１９６に記載されているものが挙げられる。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。多くの他のそのようなインプラント、送達システム、およびモジュールは、当業者に知られている。

【0133】

ＸＩＩＩ．治療方法
一態様において、本発明は、癌の腫瘍の増殖および／または転移を阻害するための、上記の単一特異性または多重特異性分子薬物コンジュゲートを用いた、インビボでの被験体の治療に関する。一実施形態において、本発明は、治療有効量の単一特異性または多重特異性分子薬物コンジュゲートを対象に投与することを含む、対象において腫瘍細胞の増殖を阻害するおよび／または転移拡散を制限する方法を提供する。

【0134】

治療に好ましい癌（がん）としては、これに限定されるものではないが、例えば、慢性または急性白血病、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ球性リンパ腫、乳癌、卵巣癌、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、明細胞癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン抵抗性前立腺癌）、結腸癌、および肺癌（例えば、非小細胞肺癌）が挙げられる。さらに、本発明には、本発明の抗体を使用して増殖を抑制することができる、難治性または再発性の悪性腫瘍が含まれる。本発明の方法を用いて治療できる他の癌としては、例えば、骨肉腫、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎腫瘍、悪性軟部腫瘍、尿道癌、陰茎癌、小児の固形腫瘍、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、中枢神経系原発悪性リンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍（spinal axis tumor）、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって引き起こされるものを含む環境的に誘発された癌、およびこれらの癌の組み合わせ、が挙げられる。

【0135】

本明細書において、「対象」との用語は、ヒトおよびヒト以外の動物を含むことを意図している。ヒト以外の動物には、すべての脊椎動物が含まれ、例えば、哺乳類および非哺乳類、例えば、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類などが挙げられるが、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシおよびウマなどの哺乳類が好ましい。好ましい対象には、免疫応答の増強を必要とするヒト患者が含まれる。この方法は、免疫応答を増強することによって治療できる障害を有するヒト患者を治療するのに特に適している。

【0136】

上記の治療は、標準的な癌治療と組み合わせることもできる。例えば、化学療法レジメンと効果的に組み合わせることができる。その場合、投与する化学療法薬の用量を減らすことが可能となり得る（Mokyr, M. et al. Cancer Res., 1998, 58, 5301-5304）。

【0137】

ホスト免疫応答性を活性化するために使用できる他の抗体は、本発明の多重特異性分子薬物コンジュゲートにおいて、またはそれと共に、使用することができる。これらには、ＤＣ機能と抗原提示を活性化する樹状細胞の表面を標的とする分子が含まれる。例えば、抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞ヘルパー活性を効果的に置き換えることができ（Ridge, J. et al. Nature, 1998, 393, 474-478）、本発明の多重特異性分子薬物コンジュゲートと組み合わせて使用することができる（Ito, N. et al. Immunobiology, 2000, 201, 527-540）。同様に、Ｔ細胞共刺激分子、例えば、ＣＴＬＡ－４（ＵＳ５８１１０９７）、ＣＤ２８（Haan, J. et al. Immunol. Lett., 2014, 162, 103-112）、ＯＸ－４０（Weinberg, A. et al. J. Immunol., 2000, 164, 2160-2169）、４－１ＢＢ（Melero, I. et al. Nature Med., 1997, 3, 682-685）、および、ＩＣＯＳ（Hutloff, A. et al. Nature, 1999, 397, 262-266）、を標的とする抗体、または、ＰＤ－１（ＵＳ８００８４４９）およびＰＤ－Ｌ１（ＵＳ７９４３７４３；ＵＳ８１６８１７９）を標的とする抗体も、Ｔ細胞の活性化レベルの増加をもたらす可能性がある。別の例では、本発明の単一特異性または多重特異性分子薬物コンジュゲートは、ＲＩＴＵＸＡＮ（リツキシマブ）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（トラスツズマブ）、ＢＥＸＸＡＲ（トシツモマブ）、ＺＥＶＡＬＩＮ（イブリツモマブ）、ＣＡＭＰＡＴＨ（アレムツズマブ）、ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（エプラツズマブ）、ＡＶＡＳＴＩＮ（ベバシズマブ）、ＴＡＲＣＥＶＡ（エルロチニブ）などの抗腫瘍性抗体と組み合わせて、使用することができる。

【0138】

用語の定義
本明細書において、「アルキル」との用語は、典型的には長さが約１～２５原子の範囲の炭化水素鎖を意味する。このような炭化水素鎖は、好ましくは飽和しているがそうでなくてもよく、分岐鎖でも直鎖でもよいが、典型的には直鎖が好ましい。Ｃ_１－１０アルキルとの用語には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０個の炭素を有するアルキル基が含まれる。同様に、Ｃ_１－２５アルキルには、１～２５個の炭素を有するすべてのアルキルが含まれる。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、２－メチル－１－ブチル、３－ペンチル、３－メチル－３－ペンチルなどが挙げられる。本明細書において、「アルキル」には、３つ以上の炭素原子が参照される場合、シクロアルキルが含まれる。特に断りのない限り、アルキルは置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。

【0139】

本明細書において、「官能基」との用語は、有機合成の通常の条件下で、それが結合している実体と、典型的にはさらなる官能基を有する別の実体との間の共有結合を形成するために使用され得る基を意味する。「二官能性リンカー」とは、コンジュゲートの他の部分を介して２つの結合を形成する２つの官能基を有するリンカーを意味する。

【0140】

本明細書において、「誘導体」との用語は、新しい官能基を導入するため、または元の化合物の特性を調整するために、追加の構造部分を有する、化学的に修飾された化合物を意味する。

【0141】

本明細書において、「保護基」との用語は、特定の反応条件下で分子内の特定の化学反応性官能基の反応を防止または遮断する部分を意味する。様々な保護基が当技術分野でよく知られており、例えば、T. W. Greene and G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Third Edition, Wiley, New York, 1999、および、P. J. Kocienski, Protecting Groups, Third Ed., Thieme Chemistry, 2003、および、そこに引用された参考文献に記載されている。

【0142】

本明細書において、「ＰＥＧ」との用語は、ポリエチレングリコールを意味する。本発明で使用するためのＰＥＧは、典型的には、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－の構造を含む。ＰＥＧは、さまざまな分子量、構造、または幾何形状を有し得る。ＰＥＧ基は、典型的な合成反応条件下で容易に化学変換を受けないキャッピング基を含んでいてもよい。キャッピング基としては、例えば、－ＯＣ_１－２５アルキル、または－Ｏアリールが挙げられる。

【0143】

本明細書において、「ＰＥＧ化」との用語は、ポリエチレングリコールによる化学修飾を意味する。

【0144】

本明細書において、「リンカー」との用語は、抗体およびポリマー部分などの相互接続部分を連結するために使用される、原子または原子の集合を意味する。リンカーは、切断可能であり得るか、または切断不可能であり得る。コンジュゲートのためのさまざまなリンカーの製造は、文献に記載されており、例えば、Goldmacher et al., Antibody-drug Conjugates and Immunotoxins: From Pre-clinical Development to Therapeutic Applications, Chapter 7, in Linker Technology and Impact of Linker Design on ADC properties, Edited by Phillips GL; Ed. Springer Science and Business Media, New York (2013) が挙げられる。切断可能なリンカーには、特定の生物学的または化学的条件下で切断され得る基または部分が組み込まれている。例としては、酵素的に切断可能なジスルフィドリンカー、１，４－または１，６－ベンジル脱離、トリメチルロックシステム、ビシン（ｂｉｃｉｎｅ）ベースの自己切断システム、酸に不安定なシリルエーテルリンカー、およびその他の光に不安定なリンカーが挙げられる。

【0145】

本明細書において、「連結基」または「リンケージ基」との用語は、化合物またはコンジュゲートの異なる部分を接続する官能基または部分を意味する。リンケージ基としては、これに限定されるものではないが、例えば、アミド、エステル、カルバメート、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、ヒドラゾン、オキシム、およびセミカルバジド、カルボジイミド、酸に不安定な基、光に不安定な基、ペプチダーゼに不安定な基、およびエステラーゼに不安定な基が挙げられる。例えば、リンカー部分およびポリマー部分は、アミドまたはカルバメートのリンケージ基を介して互いに結合され得る。

【0146】

「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」との用語は、ポリマー中のアミノ酸残基の配置を説明するために、本明細書において交換可能に使用される。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、希少アミノ酸および合成アミノ酸類似体に加えて、標準的な２０個の天然アミノ酸から構成される。それらは、長さや翻訳後修飾（例えばグリコシル化やリン酸化など）に関係なく、任意のアミノ酸鎖であり得る。

【0147】

「組換え」ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生された、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を意味し、それは、すなわち、目的のペプチドをコードする外因性ＤＮＡ構築物によって形質転換された細胞から生成される。「合成」のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、化学合成によって製造された、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を意味する。「組換え」との用語は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターを述べることに使用される場合、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種の核酸またはタンパク質の導入によって、または天然の核酸またはタンパク質の改変によって、改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞に由来すること、を意味する。本発明の範囲内には、前述の配列および異種配列の１つ以上を含む融合タンパク質が含まれる。異種ポリペプチド、核酸、または遺伝子は、外来種に由来するものであるか、または、同じ種に由来する場合、元の形態から実質的に改変されたものである。２つの融合ドメインまたは配列は、天然に存在するタンパク質または核酸において互いに隣接していない場合、互いに異種である。

【0148】

「単離」されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、天然に関連する他のタンパク質、脂質、および核酸から分離された、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を意味する。ポリペプチド／タンパク質は、精製された調製物の乾燥重量で、少なくとも１０％（すなわち、１０％～１００％の任意のパーセンテージ、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％）を構成することができる。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析などの任意の適切な標準方法によって、測定することができる。本発明で説明される単離されたポリペプチド／タンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって、または化学的方法によって生成された天然源から精製することができる。

【0149】

「抗原」とは、免疫学的反応を誘発するか、またはその反応の生成物に結合する物質を意味する。「エピトープ」との用語は、抗体またはＴ細胞が結合する抗原の領域を意味する。

【0150】

本明細書において、「抗体」との用語には、抗体全体および任意の抗原結合フラグメントまたはその単鎖が含まれる。抗体全体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）と２つの軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）と重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３の３つのドメインで構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）と軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）から構成され、軽鎖定常領域は１つのドメインで構成されている。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性の領域に、さらに細分化することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在する。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖可変領域のＣＤＲおよびＦＲは、ＨＦＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＦＲ２、ＨＣＤＲ２、ＨＦＲ３、ＨＣＤＲ３、ＨＦＲ４である。軽鎖可変領域のＣＤＲおよびＦＲは、ＬＦＲ１、ＬＣＤＲ１、ＬＦＲ２、ＬＣＤＲ２、ＬＦＲ３、ＬＣＤＲ３、ＬＦＲ４である。重鎖と軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（ＣＩ_ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。

【0151】

本明細書において、「抗体フラグメント」は、一般に、完全な（無傷の）抗体の抗原結合領域および／または可変領域、および／または、ＦｃＲ結合能力を保持する抗体のＦｃ領域を含む、完全な抗体の一部を含み得る。抗体フラグメントとしては、例えば、線状抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；一本鎖抗体分子；および、抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体、が挙げられる。

【0152】

抗体の「抗原結合フラグメントまたは部分」（または単に「抗体フラグメントまたは部分」）との用語は、本明細書において、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントによって実施され得ることが示されている。抗体の「抗原結合フラグメントまたは部分」との用語に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_ＬおよびＣ_ＨＩのドメインからなる一価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、；（ｉｉｉ）本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂである、Ｆａｂ’フラグメント、；（ｉｖ）Ｖ_ＨおよびＣ_ＨＩドメインからなる、Ｆｄフラグメント；（ｖ）抗体の単一アームのＶ_ＬおよびＶ_Ｈドメインからなる、Ｆｖフラグメント；（ｖｉ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂ；（ｖｉｉ）単離された、相補性決定領域（ＣＤＲ）；および、（ｖｉｉｉ）単一の可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む重鎖可変領域である、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶ_ＬとＶ_Ｈは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を用いて、Ｖ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域がペアになって一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらを作成できるようにする合成リンカーによって、結合することができる；例えば、Bird et al. Science 1988, 242, 423-426; and Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 5879-5883を参照されたい。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合フラグメントまたは部分」との用語の範囲内に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られている従来の技術を用いて得られ、フラグメントは、完全な抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。

【0153】

本明細書において、「Ｆｃフラグメント」または「Ｆｃ領域」との用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。

【0154】

本明細書において、「モノクローナル抗体」との用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味するものであり、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する可能性のある変異体を除いて、同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位を指向する。さらに、異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を典型的に含む従来型（ポリクローナル）抗体の調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を指向する。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に記載されたハイブリドーマ法（Kohler, G. et al. Nature, 1975, 256, 495-497）（これは参照により本明細書に組み込まれる）によって作製することができ、あるいは、組換えＤＮＡ法（ＵＳ４８１６５６７）（これは参照により本明細書に組み込まれる）によって作製することができる。モノクローナル抗体はまた、例えば、Clackson et al., Nature, 1991, 352, 624-628、および、Marks et al., J Mol Biol, 1991, 222, 581-597（これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる）に記載の技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。

【0155】

本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的には、「キメラ」抗体を含み、これは、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残部が、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントも含まれる（米国特許第4,816,567号; Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1984, 81, 6851-6855; Neuberger et al., Nature, 312, 1984, 604-608; Takeda et al., Nature, 1985, 314, 452-454; 国際特許出願PCT/GB85/00392を参照。これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0156】

非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここで、レシピエントの超可変領域の残基は、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、またはヒト以外の霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域の残基によって置き換えられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに向上させるために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、ここで、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのループに対応しており、ＦＲ残基のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列の残基である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を、任意に含む。さらなる詳細については、Jones et al., Nature, 1986, 321, 522-525; Riechmann et al., Nature, 1988, 332, 323-329; Presta, Curr Op Struct Biol, 1992, 2, 593-596; 米国特許第5,225,539号を参照されたい（これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる）。

【0157】

「ヒト抗体」は、ヒトハイブリドーマ、ヒトファージディスプレイライブラリー、またはヒト抗体配列を発現するトランスジェニックマウスから得ることができるような、完全ヒト配列を有する任意の抗体を意味する。

【0158】

「医薬組成物」との用語は、活性剤、および、組成物をインビボまたはエクスビボにおいて診断または治療の用途に特に適したものにする活性なまたは不活性な担体の組み合わせを意味する。

【0159】

本明細書において、「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合するあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などが含まれる。「薬学的に許容される担体」は、対象に投与された後、望ましくない生理学的作用を引き起こさない。医薬組成物中の担体は、活性成分と適合し、それを安定化できる可能性があるという意味でも、「許容可能」でなければならない。１つ以上の可溶化剤を、活性剤の送達のための薬学的担体として利用することができる。薬学的に許容される担体としては、これに限定されるものではないが、例えば、剤形として使用可能な組成物を達成するための、生体適合性を有する、ビヒクル、アジュバント、添加剤、および希釈剤が挙げられる。他の担体としては、例えば、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、およびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。さらなる適切な薬学的担体および希釈剤、ならびにそれらの使用のために必要な薬学的成分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮の投与（例えば、注射または注入による）に適している。治療用化合物は、１つ以上の薬学的に許容される塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望ましくない毒物学的影響を与えない塩を意味する（例えば、Berge, S. M., et al. J. Pharm. Sci. 1997, 66, 1-19を参照）。

【0160】

本明細書において、「治療する」または「治療」とは、障害を有するかまたは障害を発症するリスクがある対象に対して、障害、障害の症状、障害に続発する疾患状態、または障害に対する素因について、治癒、緩和、軽減、治療、発症の遅延、予防、または改善を目的として、化合物または薬剤を投与することを意味する。

【0161】

「有効量」とは、治療対象に治療効果を与えるのに必要な活性化合物／薬剤の量を意味する。当業者によって認識されるように、有効な用量は、治療される病気の種類、投与経路、賦形剤の使用、および他の治療処置の併用の可能性に応じて、変化する。新生物の疾患を治療するための組み合わせの治療有効量は、例えば、未処置の動物と比較して、腫瘍サイズの減少、腫瘍病巣数の減少、または腫瘍増殖の遅延を引き起こす量である。

【0162】

本明細書に開示されるように、多くの数値の範囲が提供されている。範囲の上限と下限の間の、下限の単位の１０分の１までの各介在値も、文脈上明確な断りがない限り、具体的に開示されていることが理解される。記載された値または記載された範囲内の介在値と、その記載された範囲内の他の記載されたまたは介在する値との間のそれぞれのより小さい範囲は、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してその範囲に含まれても、または除外されてもよく、そして、より小さい範囲にいずれかまたは両方の制限が含まれないまたは含まれる各範囲も、記載された範囲において特に除外される制限に従って、本発明に包含される。記載された範囲が制限の一方または両方を含む場合、含まれる制限のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。

【0163】

「約」との用語は、一般に、示された数値のプラスマイナス１０％を意味する。例えば、「約１０％」は９％～１１％の範囲を示すことができ、「約１」は０．９～１．１を意味し得る。「約」の他の意味は、四捨五入など、文脈から明らかであり、例えば「約１」は、０．５～１．４を意味することもあり得る。

【実施例】

【0164】

以下の実施例は、本発明のさらなる理解のために提供されるものであるが、本発明の有効な範囲を制限することを決して意味するものではない。

【0165】

実施例１． ３０ｋｍＰＥＧ－Ｌｙｓ（Ｍａｌ）－（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）_４の製造
分岐リンカー中間体化合物７の製造（図１）
１（３．１ｇ、１０ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍＬ）溶液に、アルゴン下、室温で、２（２．６ｇ、１２ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＥＤＣＩ（２．８７ｇ、１５ｍｍｏｌ、１．５当量）、およびＨＯＢｔ（０．２７ｇ、２ｍｍｏｌ、０．２当量）を加える。ＴＬＣにより完全な変換が観察されるまで、混合物を撹拌する。反応が完了した後、混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出し、有機層を塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮する。粗反応混合物をシリカゲルのクロマトグラフィーで精製して、生成物３を得る。

【0166】

３（２．６ｇ、５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液に、アルゴン下、室温で、１ＭのＬｉＯＨ（２０ｍＬ、２０ｍｍｏｌ、４．０当量）を加える。ＴＬＣにより完全な変換が観察されるまで、混合物を撹拌する。反応が完了した後、混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出し、有機層を塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮する。粗反応混合物をシリカゲルのクロマトグラフィーで精製して、生成物４を得る。

【0167】

４（２．３ｇ、５ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍＬ）溶液に、アルゴン下、室温で、５（１．６ｇ、６ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＥＤＣＩ（１．４ｇ、７．５ｍｍｏｌ、１．５当量）、およびＨＯＢｔ（０．１４ｇ、１ｍｍｏｌ、０．２当量）を加える。ＴＬＣにより完全な変換が観察されるまで、混合物を撹拌する。反応が完了した後、混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出し、有機層を塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮する。粗反応混合物をシリカゲルのクロマトグラフィーで精製して、生成物６を得る。

【0168】

６（０．９７ｇ、１．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液に、ジエチルアミン（１．０ｍｌ）を加え、反応を室温で１．５時間進行させる。ジエチルアミンおよび溶媒を、３０℃を超えない浴温で真空除去する。残渣をエーテル（２５ｍｌ）でトリチュレーションにかける。沈殿した固体を収集し、濾過し、エーテルで２回洗浄し（２×２０ｍｌ）、真空で乾燥させて、生成物７を得る。

【0169】

化合物１４ Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥの製造（図２）
Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ ８（３．４ｇ、１０ｍｍｏｌ、１．０当量）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（１．５ｇ、１３ｍｍｏｌ、１．３当量）を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（６０ｍｌ）とＴＨＦ（２０ｍｌ）の混合液に０℃で溶解させ、この溶液に、ＥＤＣＩ（２．５ｇ、１３ｍｍｏｌ、１．３当量）を加える。次いで、溶液を室温までゆっくり温める。反応が完了するまで、反応混合物を室温で撹拌する。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮する。濃縮した残渣をＴＨＦで溶解し、濾過してＥＤＵを除去する。ろ液を濃縮し、ｎ－ヘプタンにより、５～１０℃で１２時間再スラリー化する。固体を濾過し、洗浄し、真空下で乾燥して、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕを得る。

【0170】

Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕ（４．４ｇ、１０ｍｍｏｌ、１．０当量）を、室温でアセトニトリル（５０ｍＬ）に溶解し、続いて炭酸ナトリウム（１．２ｇ、１１ｍｍｏｌ、１．１当量）とＬ－シトルリン（１．９ｇ、１１ｍｍｏｌ、１．１当量）の水溶液（５０ｍｌ）を加える。反応が完了するまで、反応混合物を３５℃で数時間撹拌する。混合物を２０℃に冷却し、１５％クエン酸（１５０ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ／ｉ－ＰｒＯＨ（９：１）（２００ｍＬ×２）で抽出する。合わせた有機相を、水（１４０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮する。残渣をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで洗浄して、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＯＨ ９を得る。

【0171】

Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＯＨ ９（３．０ｇ、６．０ｍｍｏｌ、１．０当量）、および４－アミノベンジルアルコール（１．５ｇ、１２．１ｍｍｏｌ、２．０当量）を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（７０ｍＬ）とＭｅＯＨ（３０ｍＬ）の溶液に溶解する。ＥＥＤＱ（３．０ｇ、１２．１ｍｍｏｌ、２．０当量）を加え、溶液を室温で１日撹拌する。追加のＥＥＤＱ（１．５ｇ、６．０ｍｍｏｌ、１．０当量）を加え、溶液を１２時間継続して撹拌する。反応混合物を濃縮し、残渣をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで洗浄して、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＯＨ １０を得る。

【0172】

Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＯＨ １０（２．０ｇ、３．３ｍｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液に、ｐ－ニトロベンゾイルクロリド１１（１．２ｇ、６．６ｍｍｏｌ、２．０当量）およびピリジン（０．４ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ、１．５当量）を加える。混合物を室温で１２時間撹拌し、次いで濃縮する。残渣をＥｔＯＡｃ／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで洗浄して、生成物１２を得る。

【0173】

１２（１．３ｇ、１．７ｍｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（３．４ｍＬ）溶液に、室温で、ＨＯＢｔ（３７６ｍｇ、２．７８ｍｍｏｌ、１．６当量）およびピリジン（０．８５ｍＬ）を加え、次いで、ＭＭＡＥ（１．０ｇ、１．３９ｍｍｏｌ）を加える。溶液を室温で２４時間撹拌する。反応混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルのクロマトグラフィーで精製して、生成物Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ １３を得る。

【0174】

Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ １３（１．４ｇ、１．１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液に、Ｅｔ_２ＮＨ（５ｍＬ）を加え、溶液を室温で１２時間撹拌する。反応混合物を濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃ／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで洗浄して、生成物１４を得る。

【0175】

化合物１９ ３０ｋ ｍＰＥＧ－Ｌｙｓ（Ｍａｌ）－（ＭＭＡＥ）_４の製造（図３）
Ｈ－Ｌｙｓ（ｂｏｃ）－ＯＨ（３６９ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、３．０当量）を１００ｍＬの無水ＤＭＦに加え、続いて、ＤＩＥＡ（５．０ｍｍｏｌ、１０．０当量）、化合物１５（１５ｇ、０．５ｍｍｏｌ、１．０当量）、および１５０ｍＬの無水ＣＨ_２Ｃｌ_２を加える。混合物を、アルゴン下、室温で一晩撹拌する。不溶性物質を濾過する。溶媒を除去し、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルから再結晶させる。単離された固体を、ＡＣＮ／２－プロパノールから再び再結晶させる。生成物を、真空下、４０℃で４時間乾燥させて、生成物１６を得る。

【0176】

１６（１５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（１５０ｍＬ）溶液に、アルゴン下、室温で、７（１．１ｇ、１．５ｍｍｏｌ、３．０当量）、ＥＤＣＩ（０．５８ｇ、３．０ｍｍｏｌ、６．０当量）、およびＨＯＢｔ（０．６１ｇ、４．５ｍｍｏｌ、９．０当量）を加える。混合物を、アルゴン下、室温で、一晩撹拌する。溶媒を除去し、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルから再結晶させる。沈殿した固体を、ＡＣＮ／２－プロパノールから再び再結晶させる。生成物を、真空下、４０℃で４時間乾燥させて、生成物１７を得る。

【0177】

１７（９．０ｇ、０．３ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（９０ｍＬ）に溶解し、続いて、ＴＦＡ（４５ｍＬ）を加える。混合物を室温で１時間撹拌する。溶媒を、真空下、＜３５℃で可能な限り除去する。残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルから２回再結晶させる。生成物を真空下、４０℃で乾燥して、中間体を生成する。次いで、乾燥した中間体（６．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ、１．０当量）を、アルゴン下で無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（６０ｍＬ）に溶解する。溶液を０～５℃に冷却し、ＤＩＰＥＡ（５１７ｍｇ、４ｍｍｏｌ、２０当量）、およびＮＨＳ－ＰＥＧ_２－Ｍａｌ（０．２２ｇ、０．５ｍｍｏｌ、２．５当量）を０～５℃で加える。混合物を０～５℃で２時間撹拌し、次いで、ゆっくりと室温まで温め、アルゴン下で一晩室温に保つ。反応後、溶媒を除去し、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルから再結晶させる。沈殿した固体を、ＡＣＮ／２－プロパノールから再び再結晶させる。単離した生成物を、真空下、４０℃で４時間乾燥させて、生成物１８を得る。

【0178】

１８（３．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（３０ｍＬ）溶液に、アルゴン下、室温で、１４（０．９ｇ、０．８ｍｍｏｌ、８．０当量）、ＥＤＣＩ（０．４６ｇ、２．４ｍｍｏｌ、２４当量）、およびＨＯＢｔ（０．４９ｇ、３．６ｍｍｏｌ、３６当量）を加える。混合物を、アルゴン下、室温で一晩撹拌する。溶媒を除去し、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルから再結晶させる。沈殿した固体を、ＡＣＮ／２－プロパノールから再び再結晶させる。単離した生成物を、真空下、４０℃で４時間乾燥させて、生成物１９を得る。

【0179】

実施例２． ＳＣＡＨｅｒ２×ＳＣＡＨｅｒ２の製造
抗Ｈｅｒ２（ＳＣＡＨｅｒ２）－１および抗Ｈｅｒ２（ＳＣＡＨｅｒ２）－２の二重特異性一本鎖抗体（ＳＣＡ）フラグメントは、哺乳動物細胞（例えば、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ^ＴＭを使用したＣＨＯ）、または酵母（例えば、ｐＰＩＣＺベクターを含むピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉ）発現キット）による組換えＤＮＡ技術によって調製することができる。以下のアミノ酸配列（配列番号１）に対応するＳＣＡＨｅｒ２－１×ＳＣＡＨ２－２のＤＮＡ配列を合成し、発現ベクターにクローニングし、宿主細胞に形質転換する。発現したタンパク質は、Ｎｉ－キレートレジンまたはプロテインＬレジンで精製される。その後のコンジュゲートを容易にするために、部位特異的コンジュゲーション官能基チオールが、組換えＤＮＡ技術を介して、２つのＨｅｒ２ ＳＣＡ間のリンカーに挿入される。

【0180】

ＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶのアミノ酸配列（配列番号：１）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＩＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＴＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧＲＦＴＬＳＶＤＲＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＣＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＨＨＨＨＨＨ

【0181】

実施例３． ３０ｋｍＰＥＧ－（ＳＣＡＨｅｒ２×ＳＣＡＨｅｒ２）－（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）_４の製造（図４）
タンパク質ＳＣＡＨｅｒ２／ＳＣＡＨｅｒ２を、室温で３０分間、ＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．４）中、還元剤ＴＣＥＰ－ＨＣｌによって処理し、５００ｍＭのリン酸ナトリウムのｐＨ＝４．１２のストック溶液で、ｐＨ６．８に調整する。処理したタンパク質を５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、ＰＥＧ化する。ＳＣＡＨｅｒ２／ＳＣＡＨｅｒ２のＰＥＧ化は、５～１０モル当量の化合物１９［３０ｋ ｍＰＥＧ－Ｌｙｓ（Ｍａｌ）－（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）_４］を用いて、室温で３時間行う。室温で１０分間、１０ｍＭのＬ－シスチンで反応をクエンチする。最終生成物ＰＥＧ－Ｌｙｓ（ＳＣＡＨｅｒ２／ＳＣＡＨｅｒ２）－（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）_４を、２０ｍＭのリン酸緩衝液中、ｐＨ６．５で、陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＣＭ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）により精製する。目的の化合物２０は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣおよび細胞ベースの活性アッセイによって確認される。

【0182】

実施例４． Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥの製造（図５）
Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕ（化合物２）
Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ（２０．３ｇ、６０．０ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（９．０ｇ、７８．０ｍｍｏｌ）を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１２０ｍＬ）およびＴＨＦ（４０ｍＬ）の混合液に溶解した。別途、ＥＤＣＩ（１３．８ｇ、７２．０ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（２００ｍＬ）に溶解し、溶液を０～５℃に冷却した。次いで、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ／ＮＨＳ溶液を、ＥＤＣＩ溶液に加え、続いて、反応混合物を室温まで暖めた。反応が完了するまで、反応混合物を室温で撹拌した。次いで、反応混合物を減圧下で可能な限り濃縮し、残留ＣＨ_２Ｃｌ_２をＴＨＦ（２×１００ｍＬ）で除いた。濃縮した残渣をＴＨＦ（８００ｍＬ）に溶解し、濾過してＥＤＵを除去した。濾液を減圧下で濃縮し、残渣をｎ－ヘプタン（８００ｍＬ）により、５～１０℃で１２時間、スラリー化した。固体を濾過し、洗浄し、真空下で乾燥して、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕ（２）（２３．８ｇ、９１％）を白色粉末として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₂₄H₂₄N₂O₆Na [M+Na]⁺ 459.1532, 検出値 459.1523.

【0183】

Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ（化合物３）
Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｏｓｕ（９．８ｇ、２２．５ｍｍｏｌ）を、室温でＤＭＥ（１５０ｍＬ）に溶解した。別途、重炭酸ナトリウム（２．１ｇ、２４．７ｍｍｏｌ）を室温で水（１５０ｍＬ）に溶解し、続いて、Ｌ－シトルリン（４．３ｇ、２４．７ｍｍｏｌ）を加えて、均一な透明溶液を得た。次いで、調製したＬ－シトルリン溶液を、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｏｓｕ溶液に加えた。ＴＨＦ（７５ｍＬ）を加え、反応が完了するまで反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を１５％クエン酸（２００ｍＬ）で酸性化し、Ｒｏｔａｖａｐｏｒで濃縮した。残渣を水（５００ｍＬ）に２時間懸濁させた後、濾過し、真空下で乾燥させた。乾燥した固体をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（５００ｍＬ）に再懸濁し、１２時間撹拌した後、濾過、洗浄、真空下で乾燥して、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ（３）（６．８ｇ、６１％）を白色粉末として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₂₆H₃₃N₄O₆ [M+H]⁺ 497.2400, 検出値 497.2388.

【0184】

Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＯＨ（化合物４）
化合物３（４．９６ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）および４－アミノベンジルアルコール（２．４６ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）のＣＨ_２Ｃｌ_２（３５０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）の溶液に、ＥＥＤＱ（４．９５ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。追加のＥＥＤＱ（２．５ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を反応物に加え、混合物をさらに２４時間撹拌した。反応が完了した後、溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（８００ｍＬ）で１２時間スラリー化した。固体を濾過し、洗浄し、真空下で乾燥させて、化合物４（４．１ｇ、６９％）を白色粉末として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₃₃H₄₀N₅O₆ [M+H]⁺ 602.2979, 検出値 602.2969.

【0185】

Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＰＮＰ（化合物５）
化合物４（５．２ｇ、８．６ｍｍｏｌ）およびビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（４．９ｇ、１６．１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５２ｍＬ）溶液に、室温で、ＤＩＰＥＡ（２．５ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応が完了するまで、反応混合物を、室温で５時間撹拌した。無水酢酸エチル（２５０ｍＬ）およびメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２５０ｍＬ）を加えることにより、生成物を沈殿させた。懸濁液を０℃に冷却し、３０分間撹拌した。固体を濾過により単離し、洗浄し、真空下で乾燥させて、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＰＮＰ（５）（４．７ｇ、７２％）を淡黄色の粉末として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₄₀H₄₃N₆O₁₀ [M+H]⁺ 767.3041, 検出値 767.3045.

【0186】

Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ（化合物６）
化合物ＭＭＡＥ（２．０ｇ、１．８ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＰＮＰ（５）（２．８ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解した。次いで、ＨＯＢｔ（０．７５ｇ、５．６ｍｍｏｌ）およびピリジン（１．７ｍＬ）を加え、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を０℃に冷却し、続いて、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１８０ｍＬ）を加えて、生成物を沈殿させた。スラリーを３～５時間撹拌し、濾過し、洗浄し、真空下で乾燥させた。粗生成物をカラム精製により精製して、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ（６）（３．０ｇ、８０％）を黄色粉末として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₇₃H₁₀₅N₁₀O₁₄ [M+H]⁺ 1345.7812, 検出値 1345.7820.

【0187】

Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ（化合物７）
化合物６（３．０ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（４０ｍＬ）に懸濁し、均一な懸濁液が形成されるまで、室温で撹拌した。次いで、ジエチルアミン（１０ｍＬ）を加え、反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応が完了した後、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１００ｍＬ）および酢酸エチル（５０ｍＬ）を６０分かけて加えた。得られた混合物を０℃で４時間撹拌した。固体を濾過し、真空下で乾燥させて、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ（７）（２．３ｇ、９２％）を淡黄色の粉末として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₅₈H₉₅N₁₀O₁₂ [M+H]⁺ 1123.7131, 検出値 1123.7142.

【0188】

実施例５． 化合物１３（２×ＭＭＡＥを有する分岐リンカーＢ）の製造（図６）
化合物１０
化合物８（０．６２ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）溶液に、アルゴン下、室温で、ジ－ｔｅｒｔ－ブチル３，３’－アザンジイルジプロピオネート（９）（０．６２ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．５８ｇ、３．０ｍｍｏｌ）、およびＨＯＢｔ（５４ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で撹拌し、ＴＬＣで監視した。反応が完了した後、混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（３０ｍＬ×２）で抽出し、有機層を合わせ、塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶液をＲｏｔａｖａｐｏｒで濃縮した。粗反応混合物をシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製して、化合物１０（１．１ｇ、９６％）を無色の油として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₃₂H₄₃N₂O₇ [M+H]⁺ 567.3070, 検出値 567.3062.

【0189】

化合物１１
化合物１０（５．２ｇ、９．２ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）に溶解し、続いて、ＴＦＡ（２５ｍＬ）を加えた。混合物を室温で３時間撹拌した。溶媒を、真空下、＜３５℃で可能な限り除去した。残渣をシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製して、化合物１１（３．４ｇ、８３％）を無色の油として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₂₄H₂₇N₂O₇ [M+H]⁺ 455.1818, 検出値 455.1824.

【0190】

化合物１２
化合物１１（４１ｍｇ、０．０９１ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍＬ）およびＤＭＦ（２ｍＬ）中で撹拌した溶液に、アルゴン下、室温で、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ（７）（２２４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（５２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）、およびＨＯＢｔ（５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で撹拌し、ＴＬＣで監視した。反応が完了した後、混合物を真空中で濃縮した。残渣を、Ｗｅｌｃｈ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－Ｃ１８カラムを用いた分取ＨＰＬＣ（溶離液：Ａ＝０．１％ＴＦＡ水、Ｂ＝ＭｅＣＮ）により精製して、化合物１２（７４ｍｇ、３１％）を淡黄色の固体として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₁₄₀H₂₁₂N₂₂O₂₉ [M+2H]²⁺ 1333.2912, 検出値 1333.2907.

【0191】

化合物１３
ジエチルアミン（０．６ｍｌ）を、化合物１２（７３ｍｇ）のＤＭＦ（３ｍｌ）溶液に加えた。反応を室温で４時間進行させた。反応混合物をＲｏｔａｖａｐｏｒで濃縮し、Ｗｅｌｃｈ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－Ｃ１８カラム（溶離液：Ａ＝０．１％ＴＦＡ水、Ｂ＝ＭｅＣＮ）を用いた分取ＨＰＬＣにより残渣を精製して、化合物１３（７１ｍｇ、９９％）を淡黄色の固体として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₁₂₅H₂₀₂N₂₂O₂₇ [M+2H]²⁺ 1222.2572, 検出値 1222.2560.

【0192】

実施例６． 化合物１８（２×ＭＭＡＥを有する分岐リンカーＢ）の製造（図７）
化合物１５
化合物１４（０．６８ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）溶液に、アルゴン下、室温で、ジ－ｔｅｒｔ－ブチル３，３’－アザンジイルジプロピオネート（９）（０．６４ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．５８ｇ、３．０ｍｍｏｌ）、およびＨＯＢｔ（５４ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で撹拌し、ＴＬＣで監視した。反応が完了した後、混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（２×３０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、Ｒｏｔａｖａｐｏｒで濃縮した。残渣をシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製して、化合物１５（１．２ｇ、９９％）を無色の油として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₃₄H₄₇N₂O₇ [M+H]⁺ 595.3383, 検出値 595.3380.

【0193】

化合物１６
化合物１５（０．５ｇ、０．８４ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（６．０ｍＬ）に溶解し、続いて、ＴＦＡ（３．０ｍＬ）を加えた。混合物を室温で３時間撹拌した。溶媒を、真空下、＜３５℃で可能な限り除去した。残渣をシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製して、化合物１６（０．３４ｇ、８５％）を無色の油として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₂₆H₃₁N₂O₇ [M+H]⁺ 483.2131, 検出値 483.2127.

【0194】

化合物１７
化合物１６（１８５ｍｇ、０．３８３ｍｍｏｌ）の、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（８ｍＬ）およびＤＭＦ（８ｍＬ）の混合溶液に、アルゴン下、室温で、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ（７）（９４７ｍｇ、０．８４３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（２３８ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）、およびＨＯＢｔ（２６ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で撹拌し、ＨＰＬＣで監視した。反応が完了した後、混合物をＲｏｔａｖａｐｏｒで濃縮した。残渣を、Ｗｅｌｃｈ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－Ｃ１８カラム（溶離液：Ａ＝０．１％ＴＦＡ水、Ｂ＝ＭｅＣＮ）を用いた分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物１７（０．５６ｇ、５４％）を淡黄色の固体として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₁₄₂H₂₁₆N₂₂O₂₉ [M+H]⁺ 2694.6137, 検出値 2694.6146.

【0195】

化合物１８
ジエチルアミン（２．０ｍｌ）を、化合物１７（０．６２ｇ）のＤＭＦ（５ｍｌ）溶液に加えた。混合物の反応を室温で２時間進行させた。反応混合物をＲｏｔａｖａｐｏｒで濃縮し、Ｗｅｌｃｈ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－Ｃ１８カラム（溶離液：Ａ＝０．１％ＴＦＡ水、Ｂ＝ＭｅＣＮ）を用いた分取ＨＰＬＣにより残渣を精製して、化合物１８（０．５１ｇ、８９％）を淡黄色の固体として得た。。
HRMS (ESI) 計算値 C₁₂₇H₂₀₅N₂₂O₂₇ [M+H]⁺ 2471.5378, 検出値 2471.5369; 計算値 C₁₂₇H₂₀₆N₂₂O₂₇ [M+2H]²⁺ 1236.2728, 検出値 1236.2744.

【0196】

実施例７． 化合物２２（４×ＭＭＡＥを有する分岐リンカーＢ）の製造（図８）
化合物２０
化合物１９（０．７６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）溶液に、アルゴン下、室温で、ジ－ｔｅｒｔ－ブチル３，３’－アザンジイルジプロピオネート（９）（０．６４ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．５８ｇ、３．０ｍｍｏｌ）、およびＨＯＢｔ（５４ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で撹拌し、ＴＬＣで監視した。反応が完了した後、混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（２×３０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、Ｒｏｔａｖａｐｏｒで濃縮した。粗反応混合物をシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製して、化合物２０（１．２ｇ、９９％）を無色の油として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₂₉H₅₅N₄O₁₁ [M+H]⁺ 635.3867, 検出値 635.3860.

【0197】

化合物２１
化合物２０（０．３ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（４．０ｍＬ）に溶解し、続いて、ＴＦＡ（２．０ｍＬ）を加えた。混合物を室温で３時間撹拌した。溶媒を、真空下、＜３５℃で可能な限り除去した。残渣をシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製して、化合物２１（０．３４ｇ、８５％）を無色の油として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₂₁H₃₉N₄O₁₁ [M+H]⁺ 523.2615, 検出値 523.2607.

【0198】

化合物２２
化合物２１（３９ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍＬ）とＤＭＦ（２ｍＬ）の混合液中で撹拌した溶液に、アルゴン下、室温で、化合物１８（０．４１ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（４３ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、およびＨＯＢｔ（４．０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で撹拌し、ＨＰＬＣで監視した。反応が完了した後、混合物をＲｏｔａｖａｐｏｒで濃縮した。残渣を、Ｗｅｌｃｈ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－Ｃ１８カラムを用いた分取ＨＰＬＣ（溶離液：Ａ＝０．１％ＴＦＡ水、Ｂ＝ＭｅＣＮ）により精製して、化合物２２（８１ｍｇ、２０％）を淡黄色の固体として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₂₇₅H₄₄₅N₄₈O₆₃ [M+3H]³⁺ 1810.1053, 検出値 1810.1061; 計算値 C₂₇₅H₄₄₆N₄₈O₆₃ [M+4H]⁴⁺ 1357.8310, 検出値 1357.8346.

【0199】

実施例８． 化合物２７（４×ＭＭＡＥを有する分岐リンカーＢ）の製造（図９）
化合物２４
化合物２１（０．５７ｇ、１．１ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）溶液に、アルゴン下、室温で、化合物２３（０．５１ｇ、２．４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．６７ｇ、３．５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（７４ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（０．７８ｍＬ、４．４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で撹拌し、ＴＬＣで監視した。反応が完了した後、混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（２×３０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、Ｒｏｔａｖａｐｏｒで濃縮した。残渣をシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製して、化合物２４（０．７ｇ、７９％）を無色の油として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₃₉H₇₃N₆O₁₃ [M+H]⁺ 833.5236, 検出値 833.5231.

【0200】

化合物２５
化合物２４（０．５２ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（５．０ｍＬ）に溶解し、続いて、ＴＦＡ（２．０ｍＬ）を加えた。混合物を室温で３時間撹拌した。溶媒を、真空下、＜３５℃で可能な限り除去した。残渣をシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製して、化合物２５（０．４２ｇ、９３％）を無色の油として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₃₁H₅₇N₆O₁₃ [M+H]⁺ 721.3984, 検出値 721.3997.

【0201】

化合物２６
化合物２５（７７ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液に、アルゴン下、室温で、化合物１８（０．５８ｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（８２ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）、およびＨＯＢｔ（１４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で撹拌し、ＨＰＬＣで監視した。反応が完了した後、混合物をＲｏｔａｖａｐｏｒで濃縮した。粗反応混合物を、Ｗｅｌｃｈ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－Ｃ１８カラム（溶離液：Ａ＝０．１％ＴＦＡ水、Ｂ＝ＭｅＣＮ）を用いた分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物２６（０．２３ｇ、３８％）を淡黄色の固体として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₂₈₅H₄₆₃N₅₀O₆₅ [M+3H]³⁺ 1876.4854, 検出値 1876.4851; 計算値 C₂₈₅H₄₆₄N₅₀O₆₅ [M+4H]⁴⁺ 1407.6160, 検出値 1407.6158.

【0202】

化合物２７
リンドラー触媒（１３０ｍｇ、５重量％）を、アジド２６（１８０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）中で撹拌した溶液に加えた。反応フラスコを排気し、水素ガスでフラッシュした。反応混合物を、水素雰囲気下（バルーン）、室温で５時間撹拌した。反応の完了後、触媒をセライトのパッドを通して濾過し、ケーキをメタノール（１０ｍＬ）で洗浄し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣を、Ｗｅｌｃｈ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－Ｃ１８カラム（溶離液：Ａ＝０．１％ＴＦＡ水、Ｂ＝ＭｅＣＮ）を用いた分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物２７（１３０ｍｇ、７４％）を淡黄色の固体として得た。
HRMS (ESI) 計算値 C₂₈₅H₄₆₅N₄₈O₆₅ [M+3H]³⁺ 1867.8219, 検出値 1867.8217; 計算値 C₂₈₅H₄₆₆N₄₈O₆₅ [M+4H]⁴⁺ 1401.1184, 検出値 1401.1181.

【0203】

実施例９． 化合物３２（３０ｋｍＰＥＧ（マレイミド）－２ＭＭＡＥ）の製造（図１０）
化合物２９
Ｈ－Ｌｙｓ（ｂｏｃ）－ＯＨ（３６９ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１００ｍＬ）に加え、続いて、ＤＩＰＥＡ（０．８３ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ）、化合物２８（１５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）、および無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（１５０ｍＬ）を加えた。混合物を、アルゴン下、室温で一晩撹拌した。不溶物を濾別した。溶媒を除去し、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（４５ｍＬ／３００ｍＬ）から再結晶させた。単離した固体をＭｅＣＮ／２－プロパノール（３０ｍＬ／４５０ｍＬ）から再結晶させた。生成物を、真空下、４０℃で４時間乾燥させて、化合物２９（１３．６ｇ、９１％）を白色粉末として得た。
13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ 172.74, 155.65, 155.55, 78.41, 70.13 (PEG), 63.66, 58.55, 52.99, 39.90, 31.70, 29.17 , 28.08, 21.97.

【0204】

化合物３０
ＴＦＡ（２９．５ｍＬ）を、化合物２９（５．７ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（５７ｍＬ）溶液に加えた。混合物を室温で１時間撹拌した。真空下、＜３５℃で可能な限り溶媒を除去した。残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１４．５ｍＬ／１１５ｍＬ）から２回再結晶させた。単離された生成物を、真空下、４０℃で乾燥させて、化合物３０（４．７ｇ、８４％）を白色粉末として得た。

【0205】

化合物３１
ＤＩＰＥＡ（４７３ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）を、化合物３０（５．５ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（５５ｍＬ）中で撹拌した溶液に、０℃で加え、続いて、ＮＨＳ－ＰＥＧ_２－Ｍａｌ（０．２ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、０℃で１．５時間撹拌した。溶液を０℃から室温までゆっくり温め、次いで、アルゴン雰囲気下で一晩撹拌した。溶媒を除去し、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１３．８ｍＬ／１１０ｍＬ）から再結晶させた。単離された固体をＭｅＣＮ／２－プロパノール（１１ｍＬ／１６５ｍＬ）から再び再結晶させた。固体を真空下で乾燥させて、化合物３１（５．０ｇ、９０％）を白色粉末として得た。
13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ 172.76, 171.46, 170.01, 169.94, 155.55, 133.82, 71.37, 70.01 (PEG), 69.05, 68.92, 66.49, 63.53, 58.44, 52.92, 38.65, 36.01, 33.84, 33.71, 31.36, 28.21, 21.85.

【0206】

化合物３２
化合物３１（０．７６ｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ／ＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ／５ｍＬ）混合溶媒中で撹拌した溶液に、アルゴン下、室温で、化合物１３（０．１２ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（３１ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（２８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で撹拌し、ＨＰＬＣで監視した。反応が完了した後、混合物をＲｏｔａｖａｐｏｒで濃縮した。残渣を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ（登録商標）Ｃ１８カラム（溶離液：Ａ＝０．１％ＴＦＡ水、Ｂ＝ＭｅＣＮ）を用いた分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物３２（０．３６ｇ、４７％）を白色の固体として得た。
MS (MALDI-TOF) m/z 33863.

【0207】

実施例１０． 化合物３５（２０ｋｍＰＥＧ（マレイミド）－４ＭＭＡＥ）の製造（図１１）
化合物３３
化合物３３の合成については、化合物３１の製造を参照されたい。

【0208】

化合物３４
化合物３３（２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（２０ｍＬ）中で撹拌した溶液に、アルゴン下、室温で、ＤＢＣＯ－ＮＨ_２（８３ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（１１５ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、およびＨＯＢｔ（１２２ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で撹拌し、ＨＰＬＣで監視した。溶媒を除去し、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（５ｍＬ／４０ｍＬ）から再結晶させた。単離された固体をＭｅＣＮ／２－プロパノール（４ｍＬ／６０ｍＬ）から再び再結晶させた。固体を、真空下、４０℃で４時間乾燥させて、化合物３４（１．９ｇ、８９％）を白色粉末として得た。
13C-NMR (214 MHz, CDCl3) δ 171.12, 171.08, 170.05, 169.75, 155.64, 150.59 (d, J = 21.4 Hz), 147.54 (d, J = 6.6 Hz), 133.82, 131.69 (d, J = 13.8 Hz), 128.70, 128.27 (d, J = 11.3 Hz), 127.93 (d, J = 5.4 Hz), 127.79, 127.39 (d, J = 8.3 Hz), 126.66, 125.04 (d, J = 6.0 Hz), 122.46 (d, J = 4.9 Hz), 121.85 (d, J = 11.3 Hz), 114.21 (d, J = 9.8 Hz), 107.38 (d, J = 33.6 Hz), 70.06 (PEG), 66.59, 63.64 (d, J = 7.3 Hz), 58.50, 54.97 (d, J = 13.3 Hz), 54.23 (d, J = 59.1 Hz), 38.61, 38.40, 36.31, 34.86 (d, J = 18.0 Hz), 34.05 (d, J = 20.8 Hz), 33.89, 33.78, 31.76 (d, J = 40.2 Hz), 28.31 (d, J = 9.8 Hz), 21.99 (d, J = 17.1 Hz).

【0209】

化合物３５
化合物３４（１４７ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）を無水ＭｅＯＨ（３ｍＬ）に溶解し、続いて、化合物２２（４０ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、室温で２４時間撹拌した。混合物をＲｏｔａｖａｐｏｒで濃縮し、残渣を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ（登録商標）Ｃ１８カラム（溶離液：Ａ＝０．１％ＴＦＡ水、Ｂ＝ＭｅＣＮ）を用いた分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物３５（４１ｍｇ、２２％）を白色の固体として得た。
MS (MALDI-TOF) m/z 25963.

【0210】

実施例１１． 化合物３９（マレイミド－２０ｍＰＥＧ－４ＭＭＡＥ）の製造（図１２）
化合物３７
アミン－ＰＥＧ２０ｋ－ＣＯ_２Ｈ（３６）（１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）中で撹拌した溶液に、０℃で、ＤＩＰＥＡ（８３μＬ、０．５ｍｍｏｌ）を加え、続いて、６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（４６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を０℃で１．５時間撹拌した。溶液を０℃から室温までゆっくり温め、アルゴン雰囲気下で一晩撹拌した。溶媒を除去し、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２．５ｍＬ／２０ｍＬ）から再結晶させた。単離された固体をＭｅＣＮ／２－プロパノール（２ｍＬ／３０ｍＬ）から再び再結晶させた。残渣を真空下で乾燥させて、化合物３７（０．９５ｇ、９５％）を白色粉末として得た。

【0211】

化合物３８
化合物３７（０．９ｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（９ｍＬ）中で撹拌した溶液に、アルゴン下、室温で、ＤＢＣＯ－ＮＨ_２（３７ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（５２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）、およびＨＯＢｔ（５５ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で撹拌し、ＨＰＬＣで監視した。溶媒を除去し、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２．５ｍＬ／２０ｍＬ）から再結晶させた。単離された固体をＭｅＣＮ／２－プロパノール（２ｍＬ／３０ｍＬ）から再び再結晶させた。生成物を、真空下、４０℃で４時間乾燥させて、化合物３８（０．８６ｇ、８９％）を白色粉末として得た。

【0212】

化合物３９
化合物３８（１６６ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）を無水ＭｅＯＨ（３ｍＬ）に溶解し、続いて、化合物２２（３０ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒をＲｏｔａｖａｐｏｒで除去し、残渣を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ（登録商標）Ｃ１８カラム（溶離液：Ａ＝０．１％ＴＦＡ水、Ｂ＝ＭｅＣＮ）を用いた分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物３９（３７ｍｇ、２７％）を白色の固体として得た。HRMS (ESI) または NMR

【0213】

実施例１２． 化合物４１（ＤＢＣＯ－２０ｋＰＥＧ－４ＭＭＡＥ）の製造（図１３）
化合物４０
アミン－ＰＥＧ２０ｋ－ＣＯ_２Ｈ（３６）（１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）中で撹拌した溶液に、０℃で、ＤＩＰＥＡ（８３μＬ、０．５ｍｍｏｌ）を加え、続いて、ＤＢＣＯ－ＮＨＳ（６０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を０℃で１．５時間撹拌した。溶液を０℃から室温までゆっくり温め、アルゴン雰囲気下で一晩撹拌した。溶媒を除去し、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２．５ｍＬ／２０ｍＬ）から再結晶させた。単離された固体をＭｅＣＮ／２－プロパノール（２ｍＬ／３０ｍＬ）から再び再結晶させた。残渣を真空下で乾燥させて、化合物４０（０．９１ｇ、９１％）を白色粉末として得た。

【0214】

化合物４１
アルゴン雰囲気下で、化合物４０（１２０ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２／ＤＭＦ（２ｍＬ／２ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、続いて、化合物２７（５０ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（６．９ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）、およびＨＯＢｔ（７．３ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）を順次に加えた。得られた反応混合物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物をＲｏｔａｖａｐｏｒで濃縮し、残渣を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ（登録商標）Ｃ１８カラム（溶離液：Ａ＝０．１％ＴＦＡ水、Ｂ＝ＭｅＣＮ）を用いた分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物４１（５３ｍｇ、３６％）を白色の固体として得た。
MS (MALDI-TOF) m/z 25450 Da.

【0215】

実施例１３． ＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶ（化合物４２）の製造（図１４）
配列番号１のアミノ酸配列を有するＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶを、実施例２に記載のとおり、調製し、精製した。特に、ＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶを発現する宿主細胞の培養培地の約１．６Ｌの上清を、遠心分離後に収集し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０の液で、予め平衡化したＮｉ充填カラム（２．６ｃｍ×１３ｃｍ）（Ｃａｔ＃ＡＡ２０７３１１、ＢｅｓｔＣｈｒｏｍｅ、上海、中国）にロードした。タンパク質を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのイミダゾール、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０のバッファーで溶出し、１５ｍＬチューブに分画した。得られた８２ｍｇの捕捉されたタンパク質を、ＣａｐｔｏＬカラム（Ｃａｔ＃１７－５４７８－０２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＮＪ）でさらに精製した。ＣａｐｔｏＬカラム（１．６ｃｍ×８ｃｍ）は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０の液で予め平衡化され、タンパク質を、７５ｍＭの酢酸、ｐＨ３．０、で溶出し、５８．３ｍｇのタンパク質（プロテイン）を得た。図１４は、精製された化合物４２（ＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。

【0216】

実施例１４． ３０ｋｍＰＥＧ－（ＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶ）－２ＭＭＡＥ（化合物４３、ＪＹ２０１）の製造（図１５）
タンパク質ＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶ（４２）を、ＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．４）中、還元剤ＴＣＥＰ－ＨＣｌにより、室温で３０分間処理し、次いで、５００ｍＭのリン酸ナトリウムのｐＨ＝４．１２のストック溶液で、ｐＨを６．８に調整した。処理したタンパク質を、コンジュゲーションの前に、５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。ＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶのコンジュゲーションを、５～１０モル当量の化合物３２（３０ｋｍＰＥＧ（マレイミド）－２ＭＭＡＥ）を用いて、室温で３時間行った。反応物を、室温で１０分間、１０ｍＭのＬ－シスチンでクエンチした。最終生成物３０ｋｍＰＥＧ－（ＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶ）－２ＭＭＡＥ、ＪＹ２０１を、陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＣＭ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｃａｔ＃１７－０７１９－０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＮＪ）を用いて、２０ｍＭのリン酸緩衝液中、ｐＨ６．５で、精製した。図１５Ａは、化合物４３を製造する反応スキームを模式的に示し、得られた化合物４３は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図１５Ｂ）によって確認された。

【0217】

実施例１５． ＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶ－２０ｋＰＥＧ－４ＭＭＡＥ（化合物４４、ＪＹ２０１ｂ）の製造（図１６）
タンパク質ＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶ（４２）を、ＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．４）中、還元剤ＴＣＥＰ－ＨＣｌにより、室温で３０分間処理し、次いで、５００ｍＭのリン酸ナトリウムのｐＨ＝４．１２のストック溶液で、ｐＨを６．８に調整した。処理したタンパク質を、コンジュゲーションの前に、５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。ＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶのコンジュゲーションを、５～１０モル当量の化合物４１（ＤＢＣＯ－２０ｋＰＥＧ－４ＭＭＡＥ）を用いて、室温で３時間行った。反応物を、室温で１０分間、１０ｍＭのＬ－シスチンでクエンチした。最終生成物を、サイズ排除クロマトグラフィーカラム、ＨｉＰｒｅｐ^ＴＭ １６／６０、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ^ＴＭ Ｓ－３００ＨＲ（Ｃａｔ＃１７－１１６７－０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＮＪ）を用いて、２０ｍＭのリン酸緩衝液中、ｐＨ６．５で、精製した。図１６Ａは、化合物４４（ＳＣＡＨｅｒ２ＩＩ×ＳＣＡＨｅｒ２ＩＶ－２０ｋＰＥＧ－４ＭＭＡＥ、ＪＹ２０１ｂ）を製造する反応スキームを模式的に示し、最終化合物４４は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図１６Ｂ）によって確認された。

【0218】

実施例１６． 化合物４３（ＪＹ２０１）および化合物４４（ＪＹ２０１ｂ）のインビトロ細胞傷害性（図１７、１８）
ＰＥＧ化ＢｓＡＤＣ、ＪＹ２０１およびＪＹ２０１ｂのインビトロ細胞傷害性（毒性）に対するＰＥＧ化の効果を評価するために、化合物４３（ＪＹ２０１）または化合物４４（ＪＹ２０１ｂ）、または対照（コントロール）を用いて、細胞のインキュベーションをした後、細胞生存率アッセイを行った。具体的には、４×１０^４細胞／ウェルを平底９６ウェルプレートに播種して、細胞を接着させた。６時間後、細胞を、所定の用量のＪＹ２０１で、３７℃で７２時間処理し、続いて、製造元のプロトコルに従って、各ウェルに２０μｌのＭＴＳを加えた。次いで、ＯＤ_４９０ｎｍでの吸光度を検出し、細胞傷害性のパーセンテージを計算した。

【0219】

図１７は、ＳＫＢＲ－３細胞およびＨＣＣ－８２７細胞に対するＪＹ２０１のＥＣ５０が、それぞれ、２．２３ｎＭおよび７５．５５ｎＭであることを示している。ＨＣＣ８２７細胞は、ＳＫＢＲ－３よりもはるかに低いレベルのＨｅｒ２を発現するため（Kayatani, H. et al. 2020, Biochem Biophys Res Commun 532, 341-346）、これらの結果は、ＪＹ２０１が、非常に低いＨｅｒ２発現の腫瘍細胞に強力な細胞毒性を誘導できることを実証した。さらに、図１７の左パネルの結果から、一本鎖抗体Ｈｅｒ２ＩＩ×Ｈｅｒ２ＩＶが、ＳＫＢＲ－３に対して検出可能な傷害性を誘発せず、したがって、ＪＹ２０１の細胞傷害性が、ペイロードされたＭＭＡＥによって引き起こされたことが示された。

【0220】

上記と同じ方法を用いて、ＪＩＭＴ－１細胞に対するＪＹ２０１のインビトロ細胞傷害性を試験し、トラスツズマブ エムタンシン（Ｔ－ＤＭ１）と比較した。驚くべきことに、図１８Ａの結果から、ＤＡＲ（薬物と抗体の比率）は、ＪＹ２０１ではわずか２であるのに対し、Ｔ－ＤＭ１ではＤＡＲが４であるにも関わらず、ＪＹ２０１のＥＣ５０が、Ｔ－ＤＭ１のＥＣ５０と非常に類似していることが示された（それぞれ、３．２９μｇ／ｍｌおよび３．７４μｇ／ｍｌ）。これらの結果は、腫瘍細胞へのインビトロ細胞傷害性の誘導において、２つのペイロードのみを有するＰＥＧ化ＢｓＡＤＣ ＪＹ２０１の効力が、４つのペイロードを有するＴ－ＤＭ１と同等であることを示した。

【0221】

ＪＹ２０１ｂのインビトロ細胞傷害性（ＤＡＲが４である）を試験するために、さらなる実験を行い、ＪＹ２０１およびＴ－ＤＭ１と比較した（図１８Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）。結果は、４つのペイロードを有するＰＥＧ化ＢｓＡＤＣ ＪＹ２０１ｂが、２つのペイロードを有するＪＹ２０１よりも強力であり（図１８ＡおよびＤ）、試験された所定の濃度において腫瘍細胞株のパネル全体にわたって、Ｔ－ＤＭ１と同等またはより強力であることを示した。試験されたサンプルの濃度の下限サブセットでは、標的の抗原の発現が低い腫瘍細胞に対する強力な細胞傷害性の誘導において、ＪＹ２０１ｂが、Ｔ－ＤＭ１よりもはるかに優れていたことは注目に値する（Ｈｅｒ２発現レベル：ＳＫＢＲ－３＞ＪＩＭＴ－１＞ＺＲ７５－１、以下の表を参照）。このメリットは、より優れた傷害性プロファイルとともに、ＪＹ２０１ｂにより、現在の治療法を利用できないＨｅｒ２の発現が低い癌患者を治療する大きな希望をもたらす。

【表2】

【0222】

実施例１７． 標的の細胞によるＪＹ２０１のインターナリゼーション（図１９）
実施例１６で実証された細胞傷害性効果の機序を調べるために、ＳＫＢＲ－３細胞によるＰＥＧ化ＢｓＡＤＣ ＪＹ２０１のインターナリゼーションを、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ（Matsuzaki, S. et al. 2018, International Journal of Cancer 142, 1056-1066）に記載されたフローサイトメトリー法によって調べた。トリプシン処理後、ＳＫＢＲ－３細胞を洗浄し、２％ＦＢＳを含むＰＢＳで１×１０^７／ｍＬの濃度に再懸濁した。細胞懸濁液を１００μｌ／チューブに分配した。ＳＫＢＲ－３細胞を、１０μｇ／ｍｌのＦｌｏｕｒ６４７標識Ｔ－ＤＭ１またはＪＹ２０１を用い、４℃で一晩処理した。予め冷却したＰＢＳで２回洗浄した後、Ｔ－ＤＭ１およびＪＹ２０１をインターナリゼーションさせるために、細胞を、３７℃で所定の時間、インキュベートした。インキュベートした細胞を、３×２００μｌのＦＡＣＳバッファーで洗浄した。最後の洗浄後、１００μｌのＦＡＣＳバッファーを加え、フローサイトメトリー分析のために細胞を再懸濁させた。インターナリゼーション率は、次の式を用いて計算した。
（４℃の総ＭＦＩ－３７℃の総ＭＦＩ）／４℃の総ＭＦＩ × １００ ％

【0223】

図１９の結果から、標的に対するＪＹ２０１の親和性はＴ－ＤＭ１よりもはるかに弱いにもかかわらず（データは示していない）、ＳＫＢＲ－３細胞によるＪＹ２０１のインターナリゼーション率は、試験したすべての時点で、Ｔ－ＤＭ１よりも約２倍高かったことが示された。この結果は、従来のＦｃを有するＡＤＣが採用する動的インターナリゼーションおよび流出メカニズムが、本明細書に開示されるＰＥＧ化ＡＤＣには当てはまらない可能性があることを示唆した。注目すべきことに、例えば正常組織または細胞上のＦｃγＲまたはマンノース受容体に、従来のＡＤＣのＦｃ成分が結合することに関するインターナリゼーションメカニズムは、多くの場合、ＡＤＣ薬のオフターゲット傷害性または用量制限傷害性にさえ寄与している（Krop IE, et. al. J Clin Oncol, 30, 3234-41, 2012; Uppal, H. et al. 2015, Clin Cancer Res 21, 123-133; Gorovits, B. e. al. 2013, Cancer Immunol Immunother 62, 217-223）。

【0224】

実施例１８． ＪＹ２０１のインターナリゼーション後の標的細胞からの非流出（図２０）
インターナリゼーション後の標的細胞からの流出は、Ｆｃを有するＡｄｃで一般的に見られる。これにより、標的外の毒性（障害性）、有効性の低下、および薬剤耐性が生じる可能性がある。この現象は、ＦｃＲｎを介したリサイクリングに起因するとされている（Junghans, R. P. et. al. 1996, Proc Natl Acad Sci U S A 93, 5512-5516; Ryman, J. T. et. al. 2017, CPT Pharmacometrics Syst Pharmacol 6, 576-588）。インターナリゼーションされたトラスツズマブの５０％が、インターナリゼーションの５分以内に標的細胞から流出し、この数は、インターナリゼーションの３０分以内に８５％に増加したことが報告されている（Barok, M., Joensuu, et. al. 2014, Breast Cancer Res 16, 209-209）。

【0225】

ＪＹ２０１がインターナリゼーション後に標的細胞から流出するかどうかを調べるために、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を、製造元提供のプロトコルに従ってＪＹ２０１にコンジュゲートさせた。３×１０^４個のＳＫ－ＢＲ３細胞を、平底９６ウェルプレートに一晩播種し、細胞を接着させた。２日目に、細胞を洗浄し、０．２５μｇ／ｍＬのＪＹ２０１とともに室温で１８時間インキュベートした。完全培地で３回洗浄した後、細胞をさらに３７℃でインキュベートした。細胞溶解物および上清を異なる時点で収集した。細胞溶解物および細胞上清中のＪＹ２０１－ＨＲＰの含有量を、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）溶液を加えることによって、試験した。５０μｌ／ウェルの０．２Ｍ硫酸によって反応を終了させた後、マイクロプレートアナライザーにより、ＯＤ４５０を得た。０．２５μｇ／ｍｌのＴ－ＤＭ１－ＨＲＰを細胞とともに４時間インキュベートし、続いて、洗浄し、培地を交換し、さらに２時間および２４時間インキュベートすることを行って、Ｔ－ＤＭ１について同様の実験を行った。

【0226】

図２０Ａにより、０時間と比較して、上清中のＪＹ２０１は、さらに３時間および６時間インキュベートしても有意に増加しなかったことが示された。一方、細胞溶解物内のＪＹ２０１は、３時間および６時間で減少しなかった（図２０Ｂ）。さらに、０時間での細胞溶解物のＯＤ４５０は、上清のＯＤ４５０よりも少なくとも２倍高かった。ＪＹ２０１が内部に取り込まれ、取り込まれたＪＹ２０１は上清に流出していないことがわかる。

【0227】

比較のために、上清中のＴ－ＤＭ１のレベルも測定したところ、２時間のインキュベーション後に有意に増加した（ｐ＜０．００１）（図２０Ｃ）。さらに、２４時間のインキュベーション後のＴ－ＤＭ１のレベルは、２時間のインキュベーションよりも有意に高く、Ｔ－ＤＭ１の流出が続いていることを示した。それと一致するように、細胞溶解物中のＴ－ＤＭ１は、２４時間で有意に減少した（ｐ＜０．００１）（図２０Ｄ）。Ｔ－ＤＭ１の流出メカニズムにより、臨床効果が低下し、薬物の毒性が増加する可能性がある。

【0228】

全体として、図２０のデータは、ＪＹ２０１についてのリサイクリングまたは流出メカニズムがないという驚くべき結果を示しており、これは、おそらくＪＹ２０１のＦｃ成分の欠如によるものである。

【0229】

実施例１９． ＪＹ２０１は巨核球に対して細胞毒性を示さない（図２１）
血小板数の低下を特徴とする血小板減少症は、ＡＤＣで治療される癌患者における主要な有害事象であり（Uppal, H. et al. 2015, Clin Cancer Res 21, 123-133; Donaghy, H. 2016, MAbs 8, 659-671; de Goeij, B. E. et. al. 2016, Curr Opin Immunol 40, 14-23）、これは、Ｔ－ＤＭ１の用量制限毒性の原因になる（Krop IE, et. al. J Clin Oncol, 30, 3234-41, 2012）。血小板減少症に関するＪＹ２０１の細胞毒性を調べるため、ＤＡＭＩ（最終分化血小板の親細胞である巨核球の細胞株（Lev, P. R. et al. 2011，Platelets 22, 28-38））に対するＪＹ１０２の結合性および細胞毒性を試験した。

【0230】

結合の実験のために、ＤＡＭＩ細胞を収集し、２％ＦＢＳを含む氷冷ＰＢＳで、約５×１０^６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。次いで、細胞をＪＹ２０１または対照と共にインキュベートし、実施例１７に記載したのと同じ方法を用いて、フローサイトメトリー分析にかけた。実施例１６に記載したのと同じ方法を用いて、ＤＡＭＩ細胞に対するインビトロ細胞毒性（傷害性）を評価した。

【0231】

図２１Ｃに示すように、結果、ＰＥＧ化ＢｓＡＤＣ ＪＹ２０１は、驚くべきことに、５０μｇ／ｍｌの高濃度でさえＤＡＭＩ細胞に対して細胞毒性を誘発しなかったのに対し、Ｔ－ＤＭ１は、試験濃度で有意な薬物特異的細胞毒性を誘発したことを示した。予想外の結果は、図２１Ａおよび図２１Ｂの結果と一致しており、ＦＩＴＣ標識Ｔ－ＤＭ１は、ＤＡＭＩ細胞に結合するが、ＪＹ２０１は、おそらくＦｃ領域が存在しないために、それに結合しなかった。

【0232】

要約すると、現在のデータは、ＪＹ２０１の細胞傷害性（毒性）が組織特異的であり、巨核球ではなく腫瘍細胞に対してのみ細胞傷害性を発揮することを示唆している。ＪＹ２０１の予想外の優れた特性は、ＡＤＣ誘発性血小板減少症やその他の臨床で引き起こされるいくつかの主要な有害事象に対処する絶好の機会をもたらす。

【0233】

前述の実施例および好ましい実施形態の説明は、特許請求の範囲によって定義される本発明を限定するものではなく、説明するものとして解釈されるべきである。容易に理解されるように、特許請求の範囲に記載された本発明から逸脱することなく、上述の特徴の多数の変形および組み合わせを利用することができる。そのような変形は、本発明の範囲からの逸脱とは見なされず、そのような変形はすべて、特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18-1】

【図18-2】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

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