特許7583999気道上皮の異常及び気道がんのリスクを予測するための気道上皮細胞における多重シグナル伝達経路活性スコアの評価
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-07
(45)【発行日】2024-11-15
(54)【発明の名称】気道上皮の異常及び気道がんのリスクを予測するための気道上皮細胞における多重シグナル伝達経路活性スコアの評価
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6809 20180101AFI20241108BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALI20241108BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20241108BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20241108BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6809 Z
C12Q1/6886 Z
C12M1/00 A
C12M1/34 A
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021567791
(86)(22)【出願日】2020-05-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-14
(86)【国際出願番号】 EP2020062925
(87)【国際公開番号】W WO2020229361
(87)【国際公開日】2020-11-19
【審査請求日】2023-05-02
(31)【優先権主張番号】19174032.3
(32)【優先日】2019-05-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】590000248
【氏名又は名称】コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ
【氏名又は名称原語表記】Ｋｏｎｉｎｋｌｉｊｋｅ Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｎ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｈｉｇｈ Ｔｅｃｈ Ｃａｍｐｕｓ ５２， ５６５６ ＡＧ Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
(74)【代理人】
【識別番号】100122769
【弁理士】
【氏名又は名称】笛田 秀仙
(74)【代理人】
【識別番号】100163809
【弁理士】
【氏名又は名称】五十嵐 貴裕
(74)【代理人】
【識別番号】100145654
【弁理士】
【氏名又は名称】矢ヶ部 喜行
(72)【発明者】
【氏名】ファン デ ストルプ アニア
(72)【発明者】
【氏名】ヤコブス イゴル
(72)【発明者】
【氏名】カイパース スティーヴン パウルス ランベルトゥス
【審査官】鈴木 崇之
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５０３３５４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５３６９７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／０６８５８５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／０６８６２３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Cancers，2019年03月01日，11(3):293，pp. 1-10
【文献】Am J Respir Crit Care Med.，2009年，Vol. 179，pp 457-466
【文献】Int J Mol Sci.，2019年，19, 2460，pp. 1-18
【文献】Int J Biol Sci.，2017年，Vol. 13, No. 7，pp. 815-827
【文献】Journal of Hematology & Oncology，2014年，Vol. 7, No. 87，pp. 1-10
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
Ｃ１２Ｍ １／００－３／１０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象が異常な気道上皮を有しているか否かを決定するステップがデジタルプロセッシングデバイスによって実施されるコンピュータ実行方法であって、前記決定するステップが、前記対象の気道由来の上皮細胞試料における細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づいて前記対象が異常な気道上皮を有しているか否かを示す気道異常性スコアを決定するステップを含み、
前記細胞シグナル伝達経路がＴＧＦ-β経路、ＰＩ３Ｋ-ＦＯＸＯ経路、及びＮｏｔｃｈ経路からなる群から選択される２つ以上の細胞シグナル伝達経路を含み、
前記気道異常性スコアを決定するステップがさらに前記２つ以上の細胞シグナル伝達経路のそれぞれの細胞シグナル伝達経路の参照活性に基づき、
前記参照活性は健康な対象の気道上皮で見出されるそれぞれの細胞シグナル伝達経路の活性を反映し、
前記気道異常性スコアを決定するステップが、
上気道又は下気道から得られた前記上皮細胞試料における細胞シグナル伝達経路の活性の定量的測定値を、前記それぞれの細胞シグナル伝達経路に伴う転写因子の３つ以上の確認された直接標的遺伝子のｍＲＮＡレベルの測定から推定し、
推定された前記定量的測定値に基づいて前記２つ以上の細胞シグナル伝達経路のそれぞれについての細胞シグナル伝達経路異常性スコアを決定し、前記決定された細胞シグナル伝達経路異常性スコアを組合せることにより前記気道異常性スコアを計算する、コンピュータ実行方法。
【請求項2】
異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを決定するステップがデジタルプロセッシングデバイスによって実施されるコンピュータ実行方法であって、前記決定するステップが、前記対象の気道由来の上皮細胞試料における細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づいて前記リスクスコアを決定するステップを含み、
前記細胞シグナル伝達経路がＴＧＦ-β経路、ＰＩ３Ｋ-ＦＯＸＯ経路、及びＮｏｔｃｈ経路からなる群から選択される２つ以上の細胞シグナル伝達経路を含み、
前記リスクスコアを決定するステップがさらに前記細胞シグナル伝達経路の参照活性の組合せに基づき、
前記リスクスコアは、当該リスクスコアにより示されるリスクが前記細胞シグナル伝達経路の前記参照活性に対するＴＧＦ-β経路の活性の低下並びにＰＩ３Ｋ経路の活性の増大及び／又はＮｏｔｃｈ経路の活性の低下とともに増大するように定義され、
前記リスクスコアを決定するステップが、
前記上皮細胞試料における前記細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づいて気道異常性スコアを決定し、前記気道異常性スコアを前記リスクスコアに変換するステップを含み、
前記気道異常性スコアを決定するステップが、
上気道又は下気道から得られた前記上皮細胞試料における細胞シグナル伝達経路の活性の定量的測定値を、前記それぞれの細胞シグナル伝達経路に伴う転写因子の３つ以上の確認された直接標的遺伝子のｍＲＮＡレベルの測定から推定し、
推定された前記定量的測定値に基づいて前記２つ以上の細胞シグナル伝達経路のそれぞれについての細胞シグナル伝達経路異常性スコアを決定し、前記決定された細胞シグナル伝達経路異常性スコアを組合せることにより前記気道異常性スコアを計算する、コンピュータ実行方法。
【請求項3】
前記気道異常性スコア及びリスクスコアがそれぞれ、前記上皮細胞試料における前記細胞シグナル伝達経路の活性をそれぞれ前記気道異常性スコア及び前記リスクスコアと関連付けるように較正された数学的経路モデルの評価に基づいて決定される、請求項１又は２に記載のコンピュータ実行方法。
【請求項4】
前記数学的経路モデルは、前記細胞シグナル伝達経路に伴う転写因子（ＴＦ）エレメントの活性レベル及び前記３つ以上の標的遺伝子の発現レベルに関連する条件付き確率に基づくベイジアンネットワークモデルであるか、又は、前記３つ以上の標的遺伝子の発現レベルの１つ又は複数の線形結合に基づく、請求項３に記載のコンピュータ実行方法。
【請求項5】
前記上皮細胞試料における前記細胞シグナル伝達経路の活性が、前記それぞれの細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子の発現レベルを受信するステップ、
前記標的遺伝子の転写を制御する細胞シグナル伝達経路に伴うＴＦエレメントの活性レベルを決定するステップであって、前記標的遺伝子の発現レベルを前記それぞれの細胞シグナル伝達経路の活性レベルに関連付けるように較正された数学的経路モデルの評価に基づくステップ、並びに
前記細胞シグナル伝達経路に伴うＴＦエレメントの前記決定された活性レベルに基づいて前記それぞれの細胞シグナル伝達経路の活性を推測するステップ
を含む方法によって推測され、又は推測可能である、請求項１から４のいずれか一項に記載のコンピュータ実行方法。
【請求項6】
前記細胞シグナル伝達経路が、ＴＧＦ-β経路と、ＰＩ３Ｋ-ＦＯＸＯ経路及びＮｏｔｃｈ経路の一方又は両方とを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のコンピュータ実行方法。
【請求項7】
前記３つ以上のＴＧＦ-β標的遺伝子が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、ＶＥＧＦＡからなる群から選択され、又は前記３つ以上のＴＧＦ-β標的遺伝子がＣＤＣ４２ＥＰ３、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＯＶＡＬ１、ＶＥＧＦＡ、ＳＧＫ１からなる群から選択され、及び／又は前記３つ以上のＰＩ３Ｋ-ＦＯＸＯ標的遺伝子が、ＡＧＲＰ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ６、ＢＮＩＰ３、ＢＴＧ１、ＣＡＴ、ＣＡＶ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＥＳＲ１、ＦＡＳＬＧ、ＦＢＸＯ３２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、ＭＸＩ１、ＮＯＳ３、ＰＣＫ１、ＰＯＭＣ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＲＤＸ３、ＲＢＬ２、ＳＯＤ２、ＴＮＦＳＦ１０からなる群から選択され、及び／又は
前記３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＮＲＡＲＰ、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＰＴＣＲＡ、ＳＯＸ９、及びＴＮＣからなる群から選択され、１つ又は複数のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＳＯＸ９、及びＴＮＣからなる群から選択される、
請求項１から６のいずれか一項に記載のコンピュータ実行方法。
【請求項8】
決定された前記気道異常性スコアに基づいて、前記デジタルプロセッシングデバイスが、
診断できない結節が悪性又は良性であるさらなる証拠を提供するステップ、並びに／又は
気道上皮が前悪性であるか否かの予測、並びに／又は
人が気道がんの発症の高いリスクを有するか否かの予測、並びに／又は
人が肺がんの発症の高いリスクを有するか否かの予測、並びに／又は
人が扁平上皮肺がんの発症の高いリスクを有するか否かの予測、並びに／又は
人が肺腺癌の発症の高いリスクを有するか否かの予測、並びに／又は
人ががんの発症を防止する局所治療から恩恵を受けられるか否かの予測、並びに／又は
患者が肺がんを有するか否かの予測、並びに／又は
化学療法及び／若しくはホルモン治療の薬物有効性の予測、並びに／又は
薬物有効性のモニタリング、並びに／又は
モニタリングの頻度若しくはより詳細には治療応答性のモニタリングの頻度について判断するステップ、並びに／又は
薬物の開発、並びに／又は
アッセイの開発、並びに／又は
人が侵襲性気道がんの発症のリスクにあるか否かの予測、並びに／又は
人が疾患の進行のリスクにあるか否かの予測、並びに／又は
人が処置の後で低減したリスクを有するか否かの予測若しくは診断、並びに／又は
イメージング及び／又は他の病理学的及び／若しくは遺伝的な検査から得られる診断情報を補完するステップ、並びに／又は
がんのステージ分類
を実行する、請求項１に記載のコンピュータ実行方法。
【請求項9】
請求項１から８のいずれか一項に記載のコンピュータ実行方法を実施するように構成されたデジタルプロセッサを含む、対象が異常な気道上皮を有するか又は異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを有するかを示す気道異常性スコアを決定するための装置。
【請求項10】
請求項１から８のいずれか一項に記載のコンピュータ実行方法を実施するデジタルプロセッシングデバイスによって実行可能な命令を格納した、対象が異常な気道上皮を有するか又は異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを有するかを示す気道異常性スコアを決定するための非一時的格納媒体。
【請求項11】
コンピュータプログラムがデジタルプロセッシングデバイス上で実行された場合に請求項１から８のいずれか一項に記載のコンピュータ実行方法を前記デジタルプロセッシングデバイスに実施させるプログラムコード手段を含む、対象が異常な気道上皮を有するか又は異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを有するかを示す気道異常性スコアを決定するためのコンピュータプログラム。
【請求項12】
対象が異常な気道上皮を有するか又は異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを有するかを示す気道異常性スコアを決定するためのキットであって、ＴＧＦ-β細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、ＰＩ３Ｋ-ＦＯＸＯ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベルを決定するための部品、及び
請求項９に記載の装置、請求項１０に記載の非一時的格納媒体、又は請求項１１に記載のコンピュータプログラムを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書に記載する主題は、主として生物情報学、ゲノム処理技術、プロテオーム処理技術、及び関連する技術に関する。より詳細には、本発明は対象が異常な気道上皮を有しているかを判定するためのコンピュータ実行方法、及び異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを決定するためのコンピュータ実行方法に関する。本発明はさらに、対象が異常な気道上皮を有しているか又は異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを有しているかを示す気道異常因子を決定するための装置、非一時的格納媒体、及びコンピュータプログラムに関する。本発明はさらに、対象が異常な気道上皮を有しているか否かを示す気道異常性因子を決定するため又は異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを決定するためのキット、並びに対応する診断又は予知の方法における使用のためのキットに関する。気道異常性因子及びリスクスコアは、シグナル伝達経路活性の組合せに基づいて決定される。
【背景技術】
【0002】
肺がんは予後不良な致死性疾患であり、世界的にがんによる死亡の主な原因である。多くの患者は進行したステージで診断され、５年生存率はわずかに１８．６％である。したがって、早期の検知及びタイムリーな診断、ステージ分類、及び処置が、肺がんの治療において重要である。スクリーニングプログラムは、時には高リスク群における肺がんの早期検知を指向しており、早期のステージで治療を施すことによって臨床転帰を改善することを目的としている。高リスク集団の低線量ＣＴ（ＬＤＣＴ）スクリーニングが実行されており、ここではスクリーニングへの適性は一義的には喫煙履歴に基づいている。しかし、ＬＤＣＴスクリーニングの欠点の１つは、比較的高い偽陽性率（ＮＬＳＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅａｍ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ；３６８：１９８０～１９９１頁（２０１３））、並びにスクリーニング手技が繰り返された場合の蓄積放射線量への曝露である。陽性のＣＴ知見は病理学的な確認を得るための不必要かも知れない生検手技を用いるさらなるフォローアップを必要とし、目前の患者の健康上のリスクが伴う。腫瘍の位置によっては、診断／サブタイプ分類のための腫瘍試料の取得が困難なことがある。したがって、感度／特異性が高く、放射線曝露がない肺がんの早期検知のための検査へのニーズがある。不必要なＣＴスキャンの回数及びそれによる偽陽性を低減するために、引き続く次のステップである画像解析のための高リスク集団を識別する最小侵襲検査も必要である。また、例えばＣＴスキャンで結節が発見された場合には、病理診断を可能にするために生検を行なう必要があるか否かについて判断する必要がある。これは侵襲的で危険な手技である。したがって、識別された結節の可能な原因、即ち良性か悪性かに関する補完的な証拠を提供することによって、この判断をすることを助ける方法へのニーズがある。
【0003】
肺がんの最も一般的な型は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であり、その中で最も一般的なサブタイプは腺癌（４０％）及び扁平上皮細胞癌（３０％）である。喫煙は全肺がんの約８５％を占める。大まかに喫煙者の５～１５％が肺がんを発症する。（多量の）喫煙に伴うＣＯＰＤの患者は、肺がんを発症するリスクが増大している（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７ Ｓｅｐ ２９；８（４４）：７８０４４～７８０５６頁、Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ．２０１５ Ｎｏｖ；９０（２）：１２１～１２７頁、Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ．２０１１；８１（４）：２６５～８４頁）。
【0004】
タバコへの曝露は、前悪性変化の誘起において重要な因子である。肺がんの大多数は喫煙に伴っているが、１５％は全く喫煙をしていない人に起こる。特に多量の喫煙は肺がん、具体的には扁平上皮細胞及び小細胞型の肺がん、また他の組織病理学的ながんの型のリスクの増大を伴う。
【0005】
全く喫煙をしていない人においては腺癌が優勢なサブタイプであり、全く喫煙をしていない人における扁平上皮細胞癌は稀である。腺癌は末梢又は気管支内の起源を有することが多く、一方扁平上皮細胞癌は通常、気管又は近位の気道において起こる。
【0006】
タバコへの曝露は、気道の上皮細胞にストレスを誘起し、上皮の再生及び修復を必要とする喫煙によって誘起された傷害を惹起することがある。喫煙はこれらのプロセスに関与するシグナル伝達経路に干渉し、これが腫瘍原性を促進することがある。
【0007】
一般的な、例えば結腸腺癌における、また気道上皮における前悪性病変は、ＰＩ３Ｋ経路等のある種のシグナル変換経路の異常な活性に反映される増殖の増大によって特徴付けられる（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１８ Ｊｕｌ １；２４（１３）：２９８４～２９９２頁、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１０ Ａｐｒ ７；２（２６）：２６ｒａ２５頁）。異常な増殖は、例えば正常細胞におけるＴＧＦ－β若しくはＮｏｔｃｈ経路のような細胞増殖を抑制／制御する経路活性の喪失に伴うＰＩ３Ｋ経路又はＭＡＰＫ－ＡＰ１若しくはＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路のような１つ又は複数の増殖因子経路の活性によって可能になり得る。がんへの進展の間に、ゲノム変異及び／又は染色体異常の数の増加によって、他の腫瘍原性シグナル変換経路が動員され、又はより制御的な経路が失われる。即ち、前悪性病変はいくつかの経路活性特性を共有し得るが、最終的ながんと必ずしも全てを共有しない。おそらくこの理由により、（肺）がんの発症におけるシグナル変換経路の役割及び経路活性に対する喫煙の干渉についてはほとんど分かっていない。
【0008】
分析のために大気道又は小気道から上皮細胞試料を得ること：気道の上皮ライニングからの試料の分析によって前悪性変化に関する情報が提供され、又は例えばＣＴスキャンで疑いのある結節が見られた場合のさらなる診断情報が提供される。
【0009】
肺がんは大気道（気管から分岐する気管支）又は小気道の上皮で発症する。気道擦過又は気管支肺胞洗浄のような手法を用いて、比較的非侵襲的な方式で上気道及び下気道から分子解析のために上皮細胞を得ることができる。これにより、気道上皮における早期の増殖性変化の指標となる気道上皮における異常な腫瘍原性シグナル伝達経路活性を有し、及び肺がんが進行するリスクが増大している個体、即ち喫煙者を識別する潜在的な手段が提供される。ＣＯＰＤ患者は一般に慢性的な多量喫煙者であり、肺がんの発症の高リスク群を構成する。
【0010】
異常なシグナル変換経路活性は、識別された場合には、原理的には特定のシグナル伝達経路を標的とする標的薬物によって規制され、例えばＰＩ３Ｋ経路阻害剤によってブロックされる（Ｗ Ｖｅｒｈａｅｇｈら，Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４；７４（１１）：２９３６～４５頁、Ａ ｖａｎ ｄｅ Ｓｔｏｌｐｅら，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１９，９（１６０３頁）、ｖａｎ Ｏｏｉｊｅｎ，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２０１８，１８８（９）：１９５６～１９７２頁）。これにより、前悪性気道上皮病変は臨床的に処置可能であり、異常性は気道上皮の局所的処置によって逆転又は排除できるという選択肢が開かれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
したがって、異常な上皮の指標となる気道上皮における早期の変化を検知し、異常なシグナル伝達経路活性に関する異常性を特徴付ける方法への高いニーズがある。本方法は、肺がんの高いリスクにある個体の識別のために用いられ、識別された肺の結節の悪性及び良性の性質に対するさらなる証拠を提供し、識別された病変又は随伴する肺がんを処置するためにどの療法が有用かを指示することが期待される。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明の第１の態様によれば、上記の課題は、対象が異常な気道上皮を有しているか否かを決定するためのデジタルプロセッシングデバイスによって実施されるコンピュータ実行方法によって解決され、決定するステップは対象の気道由来の上皮細胞試料における細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づいて対象が異常な気道上皮を有しているか否かを示す気道異常性因子を決定するステップを含み、細胞シグナル伝達経路はＴＧＦ－β経路、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路、及びＮｏｔｃｈ経路からなる群から選択される２つ以上の細胞シグナル伝達経路を含み、シグナル伝達経路異常性因子を決定するステップはさらにそれぞれの細胞シグナル伝達経路の参照活性に基づき、参照活性は健康な対象の気道上皮で見出されるそれぞれの細胞シグナル伝達経路の活性を反映する。さらなる細胞シグナル伝達経路は任意選択で本発明の方法に含まれ得る。一実施形態では、本方法は、本明細書で開示した種々の用途のいずれか１つ、例えば異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを決定すること、その後で本方法を繰り返す間隔を定義すること、実施すべき補助的な診断を勧告すること、処置その他を勧告することを目的とする気道異常性因子を提供するステップをさらに含む。
【0013】
本発明の第２の態様によれば、本課題は、異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを決定するためのデジタルプロセッシングデバイスによって実施されるコンピュータ実行方法によって解決され、決定するステップは対象の気道由来の上皮細胞試料における細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づいてリスクスコアを決定するステップを含み、細胞シグナル伝達経路の解析はＴＧＦ－β経路、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路、及びＮｏｔｃｈ経路からなる群から選択される２つ以上の細胞シグナル伝達経路を含み、リスクスコアを決定するステップはさらに細胞シグナル伝達経路の参照活性の組合せに基づき、リスクスコアは、指示されたリスクが細胞シグナル伝達経路の参照活性に対するＴＧＦ－β経路の活性の低下並びにＰＩ３Ｋ経路の活性の増大及び／又はＮｏｔｃｈ経路の活性の低下の１つ又は複数とともに増大するように定義される。一実施形態では、本方法は、本明細書で開示した種々の用途、例えばその後で本方法を繰り返すべき間隔を定義すること、実施すべき補助的な診断方法を勧告すること、処置その他を勧告することのいずれか１つを目的としてリスクスコアを提供するステップをさらに含む。
【0014】
本発明は、シグナル変換経路活性の解析を用いて、悪性気道がんへの進行において役割を果たす気道上皮の前悪性の危険性さえも特徴付けることができるという本発明者らの革新に基づいている。本発明者らは、ある種のシグナル伝達経路の活性を測定することによって悪性及び前悪性の危険性の存在又は非存在が評価できることを見出し、測定した活性を組み合わせて評価した。本発明者らは、気道上皮が異常か否か、及び／又は異常な気道上皮が気道がんを発症するリスクにある対象を特徴付けるか否かの判定において、関連する経路活性がどのように相互に関連するかの洞察を初めて提供する。
【0015】
本発明は、健康な非喫煙者、少量喫煙者、及び多量喫煙者を含む様々な群に属する対象の気道上皮細胞におけるシグナル伝達経路（特にＴＧＦ－β、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ、Ｎｏｔｃｈ経路）の活性を集中的に研究することによって達成された。続いて、シグナル伝達経路異常性因子によって示すことができる正常な経路活性からの異常な逸脱を決定し、気道上皮の未知の特徴を有する対象の気道異常性因子及び／又はリスクスコアを提供するため、測定した経路活性の解釈のためのコンピュータモデルを開発した。このモデルにおいて、対象が異常な気道上皮を有し、及び／又は気道がんを発症するリスクにある可能性を特徴付けるインジケーター（バイオマーカー）として、シグナル伝達経路の組み合わされた活性が用いられる。
【0016】
利点として、本発明は、疾患の早期ステージにおいてがんを発症するリスクにある対象の識別を容易にし、したがって存在する方法より良い治療の選択肢を可能にする。本方法の使用により、不必要なＣＴスキャンの回数が低減され、それにより不必要な診断手技及び有害な放射線への曝露の回数が低減されることが期待される。肺がんの発症は多段階のプロセスであり、そこでは正常な肺上皮細胞が遺伝子異常を集積して悪性な表現型に変換される。本発明の方法は最終的には後のステージで悪性になる危険性がある早期の（前悪性の）変化の検知を補助する大きな可能性を有しており、このコンテキストにおいて種々の臨床シナリオに適用することができる。気道がんが検知可能になる前に、本発明の方法を、リスク評価及びスクリーニング若しくは一次的な化学的予防、又は進行をブロックし若しくは病変を正常に逆進させる局所的治療によって恩恵を受ける集団の識別のために用いることができる。さらに本発明の方法は、述べたように侵襲的な肺がんに進行する前に前悪性又は早期のステージで肺がんを検知するために用いることができる。本発明の方法は、緊密なＣＴモニタリング及び二次的な化学的予防のための個体の選択の補助となり得る。さらに、本発明の方法は、ＣＴ画像で見出された良性及び悪性の結節を鑑別し、予知するという価値がある。最後に、いくつかの生検手技は感度が限られており、したがって必ずしも常に診断の確立をもたらさない。例えば、気管支鏡検査はしばしば診断にならず、さらなる侵襲的検査を必要とすることがある。そのような既知の診断検査を本発明の方法と組み合わせることにより、それらの診断性能が顕著に改善されることが期待される。例えばＣＴスキャンにおいて診断できない結節が発見された場合には、本方法は結節を悪性又は良性と分類するための補助となる。
【0017】
用語「対象」は、本明細書で用いる場合、任意の生命体を意味する。いくつかの実施形態では、対象は動物、好ましくは哺乳動物である。ある特定の実施形態では、対象はヒト、例えば医療の対象である。本発明の方法の適用性は特定の対象の群に限定されないが、喫煙者又はＣＯＰＤのような高リスク群に属する対象が本発明の恩恵を最も受けることは明らかであろう。したがって、診断すべき対象は、喫煙者、特にタバコ喫煙者、又は日常的に煙に曝露している若しくは曝露していた対象、例えば喫煙者と同じ家庭に住む対象であることが好ましい。好ましくは診断すべき対象を定義するその他の危険因子には、ラドン、アスベスト、ヒ素、ディーゼル排ガス、シリカ、及びクロムへの曝露が含まれる。本発明の方法は、有利には特に気道上皮の前悪性変化ができるだけ早期に検知できるように規則的な間隔で、繰り返し適用される。
【0018】
本発明に従って用いるべき上皮細胞試料は抽出した試料、即ち対象から抽出した試料であってよい。試料の例には、これだけに限らないが、上皮細胞、組織、及び／又は対象の気道由来の上皮細胞を含む体液が含まれる。上皮細胞試料は、上皮細胞の前駆細胞及び／又は幹細胞、例えば損傷を受けた上皮細胞の再生に必要な幹／前駆細胞を構成する基底細胞（ＢＣ）を含む試料であってもよい。それぞれの試料は、例えば気管支肺胞洗浄、擦過、生検等によって対象の上気道又は下気道から得ることができる。用語「試料」は、本明細書で用いる場合、例えば細胞、組織、及び／又は体液が対象から取り出され、例えば顕微鏡のスライド若しくは固定台に載せられ、特許請求する方法を実施するために、例えばレーザーキャプチャーマイクロディセクション（ＬＣＭ）、又はパンチング、又はスライドからの着目した細胞の剥離、又は蛍光活性化細胞ソーティング手法によって、この試料の一部が抽出される事例をも包含する。さらに、用語「試料」は、本明細書で用いる場合、例えば細胞、組織、及び／又は体液が対象から取り出され、例えば顕微鏡のスライドに載せられ、特許請求する方法がスライド上で実施される事例をも包含する。
【0019】
用語「上気道」は、本明細書で用いる場合、鼻腔、咽頭（鼻咽頭、中咽頭、及び咽喉頭を含む）、及び喉頭を含む。用語「下気道」は、本明細書で用いる場合、気管及び肺（一次気管支及び細気管支を含む）を含む。
【0020】
用語「経路」、「シグナル変換経路」、「シグナル伝達経路」、及び「細胞シグナル伝達経路」は、本明細書で相互交換可能に用いられる。
【0021】
「シグナル伝達経路の活性」は、標的遺伝子の発現への推進において標的遺伝子の転写を制御する試料中のシグナル伝達経路に伴う転写因子（ＴＦ）エレメントの活性、即ち例えば高活性（即ち速い速度）若しくは低活性（即ち遅い速度）、又はそのような活性（例えば速度）に関連するレベル、値等のその他のディメンジョンの観点における、それによって標的遺伝子が転写される速度を意味する。したがって、本発明の目的のため、用語「活性」は、本明細書で用いる場合、本明細書に記載した「経路解析」の間の中間的な結果として得られる活性レベルをも意味することを意図している。
【0022】
用語「転写因子エレメント」（ＴＦエレメント）は、本明細書で用いる場合、好ましくは活性転写因子の中間体若しくは前駆体のタンパク質又はタンパク質複合体、或いは特定した標的遺伝子の発現を制御する活性転写因子タンパク質又はタンパク質複合体を意味する。例えば、タンパク質複合体は、それぞれのシグナル伝達経路タンパク質の１つの少なくとも細胞内ドメイン及び１つ又は複数の共因子を含み、それにより標的遺伝子の転写を制御する。好ましくは、この用語は、細胞内ドメインをもたらすそれぞれのシグナル伝達経路タンパク質の１つの切断によって誘発されるタンパク質又はタンパク質複合体転写因子を意味する。
【0023】
用語「標的遺伝子」は、本明細書で用いる場合、その転写がそれぞれの転写因子エレメントによって直接又は間接に制御される遺伝子を意味する。「標的遺伝子」は、（本明細書に記載したように）「直接標的遺伝子」及び／又は「間接標的遺伝子」である。
【0024】
用語「異常な」及び「異常性」は、本明細書で用いる場合、稀な、機能不全の、機能不良の、又は悪性とみなされる対象、細胞、又は細胞試料に帰せられる特徴を意味し、特に対象、細胞、又は細胞試料における「前悪性」変化を特徴付ける。異常な（前悪性）特徴の診断は、対象が悪性の気道がんに向かっているリスクにあることを示す。本発明の目的のため、対象、細胞、又は細胞試料は特に、本明細書で開示したそれぞれの経路活性に基づいてそれぞれの参照経路活性から逸脱していると判定されれば、異常であると考えられる。参照経路活性は特に、健康な（即ち正常な）対象、健康な対象由来の細胞、又は健康な対象由来の細胞を含む試料において見出される経路活性である。既に知られていなければ、参照経路活性は、１又は複数の健康な対象の上皮細胞試料を用いて、本明細書で開示した経路解析によって実験的に決定することができる。好ましくは、複数の健康な対象からの試料が、自然の経路活性の変動を考慮して評価される。
【0025】
これに従えば、気道の異常性因子及び／又はリスクスコアの決定がさらにシグナル伝達経路の参照活性のそれぞれの組合せに基づいていることは、本発明の実施形態である。同様に、シグナル伝達経路異常性因子の決定はさらに、それぞれのシグナル伝達経路の参照活性に基づく。参照活性は、健康な対象の気道上皮において見出されるそれぞれのシグナル伝達経路の活性を反映する。
【0026】
参照経路活性のそれぞれを診断すべき対象におけるそれぞれの経路活性のそれぞれと比較することによって、それぞれの経路のそれぞれにおけるシグナル伝達経路異常性因子を決定することができる。シグナル伝達経路異常性因子は、それぞれの経路の活性がそれぞれの経路の参照活性から（異常に）逸脱しているか否かを示す。シグナル伝達経路異常性因子は次に気道異常性因子に変換される。気道異常性因子は、経路活性の組合せから直接計算することもできる。気道異常性因子は多重経路スコア、即ちＭＰＳと考えることもでき、対象が異常な気道上皮を有している可能性を示す。したがって、「気道異常性因子」は、本明細書では「気道経路異常性スコア」（ＡＰＡＳ）又は具体的に「小気道経路異常性スコア」（ＳＡＰＡＳ）、又は「大気道経路異常性スコア」（ＬＡＰＡＳ）とも称され、経路活性の組合せを対象が異常な（例えば小又は大）気道上皮を有している可能性に関連付けるディメンジョン、例えばレベル又は値を意味する。
【0027】
用語「気道がん」は、本明細書で用いる場合、気道の悪性腫瘍を意味し、このコンテキストにおいて特に、喫煙した場合にリスクが増大するがんの型を意味する。本方法は、特にこれらのがんが上皮細胞に由来する場合に、これらのがんの型に広く適用することができる。本発明は、気道の上皮細胞に由来するがんに焦点を当てている。そのようながんの非限定的な例には、気管がん、気管支がん、上気道（鼻、口、喉頭等を含む）のがん、肺がん、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を含む肺がんのサブタイプ、扁平上皮肺がん、腺扁平上皮癌、大細胞癌、肉腫様癌、及び肺腺癌等の組織学的サブタイプが含まれる。リスクスコアは、参照経路活性のそれぞれを、診断すべき対象の上皮細胞試料におけるそれぞれの経路活性のそれぞれと比較することによって決定することができる。リスクスコアは多重経路スコア、即ちＭＰＳと考えることもでき、対象が気道がんを発症する可能性を示す。したがって、「リスクスコア」は、経路活性の組合せを対象が気道がんを発症する可能性に関連付けるディメンジョン、例えばレベル又は値を意味する。
【0028】
気道異常性因子及び／又は危険因子は、「細胞シグナル伝達経路の活性の組合せ」に基づいている。これは、気道異常性因子及び／又は危険因子が２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性に影響されることを意味している。２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性は、本明細書に記載した数学モデルによって推測され及び／又は組み合わされ得る。好ましい実施形態では、気道異常性因子及び／又は危険因子は、３つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性を含むシグナル伝達経路活性の組合せに基づいている。そのようなシグナル伝達経路活性の組合せは、３つ若しくは４つ、又は５つ以上、例えば５、６、７、８、又はそれ以上の異なるシグナル伝達経路の活性を含む。
【0029】
一般に、対象における２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づく気道異常性因子及び／又はリスクスコアを決定するために、多くの異なる式を考案することができる。即ち、
ＭＰＳ＝Ｆ（Ｐｉ）＋Ｘ、ここでｉ＝１...Ｎ、
ここでＭＰＳは気道異常性因子及び／又はリスクスコア表わし（用語「ＭＰＳ」は、リスクスコアが２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性によって影響されるということを表わすために「多重経路スコア」の略語として本明細書で用いられる）、Ｐｉは細胞シグナル伝達経路の活性を表わし、Ｎは気道異常性因子及び／又はリスクスコアを計算するために用いる細胞シグナル伝達経路の全数を表わし、Ｘは式の中に入り得る可能なさらなる因子及び／又はパラメーターのための代替項である。そのような式は、より具体的には所与の変数又は変数の線形結合におけるある次数の多項式であり得る。そのような多項式における重みづけ係数及び乗数は熟練者の知識に基づいて設定できるが、典型的には上記の式の重みづけ係数及び乗数を推定するために、既知の根拠、例えば生存データを含む訓練データセットが用いられる。上記の式を用いて活性を組み合わせることができ、引き続いてＭＰＳが生成される。次に、高いＭＰＳが、患者が異常な気道上皮を有し、及び／又は気道がんを発症する高い確率と相関するように、或いはその逆になるように、スコアリング関数の重みづけ係数及び乗数が最適化される。スコアリング関数の既知のデータとの相関の最適化は、数多くの解析手法、例えばＣｏｘ比例ハザード検定（本明細書で好ましく用いる）、ログ－ランク検定、勾配降下法又は手動適合化等の標準的最適化手法と併用したＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ推定量、その他を用いて行なうことができる。
ＭＰＳ＝Ｆ（Ｐｉ）＋Ｘ、ここでｉ＝１...Ｎ、
ここでＭＰＳは気道異常性因子及び／又はリスクスコア表わし（用語「ＭＰＳ」は、リスクスコアが２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性によって影響されるということを表わすために「多重経路スコア」の略語として本明細書で用いられる）、Ｐｉは細胞シグナル伝達経路の活性を表わし、Ｎは気道異常性因子及び／又はリスクスコアを計算するために用いる細胞シグナル伝達経路の全数を表わし、Ｘは式の中に入り得る可能なさらなる因子及び／又はパラメーターのための代替項である。そのような式は、より具体的には所与の変数又は変数の線形結合におけるある次数の多項式であり得る。そのような多項式における重みづけ係数及び乗数は熟練者の知識に基づいて設定できるが、典型的には上記の式の重みづけ係数及び乗数を推定するために、既知の根拠、例えば生存データを含む訓練データセットが用いられる。上記の式を用いて活性を組み合わせることができ、引き続いてＭＰＳが生成される。次に、高いＭＰＳが、患者が異常な気道上皮を有し、及び／又は気道がんを発症する高い確率と相関するように、或いはその逆になるように、スコアリング関数の重みづけ係数及び乗数が最適化される。スコアリング関数の既知のデータとの相関の最適化は、数多くの解析手法、例えばＣｏｘ比例ハザード検定（本明細書で好ましく用いる）、ログ－ランク検定、勾配降下法又は手動適合化等の標準的最適化手法と併用したＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ推定量、その他を用いて行なうことができる。
【0030】
本発明の好ましい実施形態によれば、気道異常性因子及びリスクスコアはそれぞれ、上皮細胞試料におけるシグナル伝達経路の活性をそれぞれ気道異常性因子及びリスクスコアと関連付ける較正された数学モデルの評価に基づいて決定される。このモデルは、経路活性の組合せを解釈して診断すべき対象の気道異常性因子及び／又はリスクスコアを決定するようにプログラムされる。特に、気道異常性因子及び／又はリスクスコアの決定は、（ｉ）診断すべき対象の上皮細胞試料におけるそれぞれのシグナル伝達経路の活性を受容するステップ、（ｉｉ）前記対象の気道異常性因子及び／又はリスクスコアを決定するステップを含み、決定するステップはそれぞれのシグナル伝達経路の活性を気道異常性因子及び／又はリスクスコアと関連付ける較正された数学モデルの評価に基づいている。
【0031】
較正された数学的経路モデルは、好ましくはセントロイドモデル若しくは線形モデル、又は条件付き確率に基づくベイジアンネットワークモデルである。例えば、較正された数学的経路モデルは確率的モデル、好ましくは気道異常性因子及び／又はリスクスコアとシグナル伝達経路の活性を関連付ける条件付き確率に基づくベイジアンネットワークモデルであってよく、又は較正された数学的経路モデルは、シグナル伝達経路の活性の１つ又は複数の線形結合に基づいてもよい。
【0032】
数学モデルに従えば、シグナル伝達経路の活性は気道異常性因子を提供するように解釈されてこれがさらにリスクスコアに変換されるか、又は直接リスクスコアを提供するように解釈される。気道異常性因子及びリスクスコアは、対象が異常な気道上皮を有し、及び／又は対象が気道がんを発症するリスクにある可能性を予測又は提供する。
【0033】
したがって、リスクスコアの決定は、上皮細胞試料における細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づいて気道異常性因子を決定するステップ、及び気道異常性因子をリスクスコアに変換するステップを含む。気道異常性因子の決定は、上皮細胞試料におけるそれぞれの細胞シグナル伝達経路の活性に基づいてそれぞれの細胞シグナル伝達経路のそれぞれについてシグナル伝達経路異常性因子を決定するステップ、及び決定されたシグナル伝達経路異常性因子の組合せに基づいて気道異常性因子を決定するステップを含む。
【0034】
本発明の好ましい実施形態によれば、それぞれのシグナル経路の活性は、本明細書に記載した経路解析によって決定され又は決定可能である。
【0035】
経路解析によって、それぞれのシグナル伝達経路に伴う転写因子のよく確認された直接標的遺伝子のｍＲＮＡレベルの測定からのシグナル変換経路の活性の推測に基づく上皮細胞におけるシグナル変換経路活性の定量的測定が可能になる（例えばＷ Ｖｅｒｈａｅｇｈら２０１４の上掲の文献、Ｗ Ｖｅｒｈａｅｇｈ，Ａ ｖａｎ ｄｅ Ｓｔｏｌｐｅ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１４，５（１４）：５１９６頁を参照）。
【0036】
好ましくは、シグナル伝達経路の活性の決定、多重経路活性の組合せ、及びそれらの応用は、例えばそれぞれがそれぞれのシグナル伝達経路の活性を決定する目的のために全体として本明細書に組み込まれる以下の文書、即ち国際特許出願公開ＷＯ２０１３０１１４７９（発明の名称「ＡＳＳＥＳＳＭＥＮＴ ＯＦ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＰＡＴＨＷＡＹ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＵＳＩＮＧ ＰＲＯＢＡＢＩＬＩＳＴＩＣ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＯＦ ＴＡＲＧＥＴ ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」)、ＷＯ２０１４１０２６６８（発明の名称「ＡＳＳＥＳＳＭＥＮＴ ＯＦ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＰＡＴＨＷＡＹ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＵＳＩＮＧ ＬＩＮＥＡＲ ＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ（Ｓ） ＯＦ ＴＡＲＧＥＴ ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＳ」)、ＷＯ２０１５１０１６３５（発明の名称「ＡＳＳＥＳＳＭＥＮＴ ＯＦ ＴＨＥ ＰＩ３Ｋ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＰＡＴＨＷＡＹ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＵＳＩＮＧ ＭＡＴＨＥＭＡＴＩＣＡＬ ＭＯＤＥＬＬＩＮＧ ＯＦ ＴＡＲＧＥＴ ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」)、ＷＯ２０１６０６２８９１（発明の名称「ＡＳＳＥＳＳＭＥＮＴ ＯＦ ＴＧＦ－β ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＰＡＴＨＷＡＹ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＵＳＩＮＧ ＭＡＴＨＥＭＡＴＩＣＡＬ ＭＯＤＥＬＬＩＮＧ ＯＦ ＴＡＲＧＥＴ ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」)、ＷＯ２０１７０２９２１５（発明の名称「ＡＳＳＥＳＳＭＥＮＴ ＯＦ ＮＦＫＢ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＰＡＴＨＷＡＹ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＵＳＩＮＧ ＭＡＴＨＥＭＡＴＩＣＡＬ ＭＯＤＥＬＬＩＮＧ ＯＦ ＴＡＲＧＥＴ ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」)、ＷＯ２０１４１７４００３（発明の名称「ＭＥＤＩＣＡＬ ＰＲＯＧＮＯＳＩＳ ＡＮＤ ＰＲＥＤＩＣＴＩＯＮ ＯＦ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ ＲＥＳＰＯＮＳＥ ＵＳＩＮＧ ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＳＩＧＮＡＬＬＩＮＧ ＰＡＴＨＷＡＹ ＡＣＴＩＶＩＴＩＥＳ」)、ＷＯ２０１６０６２８９２（発明の名称「ＭＥＤＩＣＡＬ ＰＲＯＧＮＯＳＩＳ ＡＮＤ ＰＲＥＤＩＣＴＩＯＮ ＯＦ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ ＲＥＳＰＯＮＳＥ ＵＳＩＮＧ ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＰＡＴＨＷＡＹ ＡＣＴＩＶＩＴＩＥＳ」)、ＷＯ２０１６０６２８９３（発明の名称「ＭＥＤＩＣＡＬ ＰＲＯＧＮＯＳＩＳ ＡＮＤ ＰＲＥＤＩＣＴＩＯＮ ＯＦ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ ＲＥＳＰＯＮＳＥ ＵＳＩＮＧ ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＰＡＴＨＷＡＹ ＡＣＴＩＶＩＴＩＥＳ」)、ＷＯ２０１８０９６０７６（発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ＦＯＸＯ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｒｏｍ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ」）、及び特許出願ＥＰ１６２００６９７．７（２０１６年１１月２５日出願、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ＦＯＸＯ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｒｏｍ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ」)、ＥＰ１７１９４２８８．１（２０１７年１０月２日出願、発明の名称「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」)、ＥＰ１７１９４２９１．５（２０１７年１０月２日出願、発明の名称「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ＪＡＫ－ＳＴＡＴ１／２ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」)、ＥＰ１７１９４２９３．１（２０１７年１０月２日出願、発明の名称「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」)、及びＥＰ１７２０９０５３．２（２０１７年１２月２０日出願、発明の名称「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ＭＡＰＫ－ＡＰ１ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」)、ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７６２３２（２０１８年９月２７日出願、発明の名称「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」)、ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７６３３４（２０１８年９月２７日出願、発明の名称「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ＪＡＫ－ＳＴＡＴ１／２ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」）、ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７６４８８（２０１８年９月２８日出願、発明の名称「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」)、ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７６５１３（２０１８年９月２８日出願、発明の名称「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ＭＡＰＫ－ＡＰ－１ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」）、及びＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７６６１４（２０１８年１０月１日出願、発明の名称「Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ」)に記載されているようにして実施される。
【0037】
モデルは、いくつかの細胞型におけるＥＲ、ＡＲ、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ、ＨＨ、Ｎｏｔｃｈ、ＴＧＦ－β、Ｗｎｔ、ＮＦｋＢ、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ１／２、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３、及びＭＡＰＫ－ＡＰ１経路について生物学的に確認した。まだ公開されていない特許出願で採用された数学モデル、並びにこれらの出願におけるこれらのモデルの較正及び使用は一般に、既に公開された特許出願で開示されたモデル、較正、及び使用に対応していることが注目される。
【0038】
その発現レベルが好ましくは解析される細胞シグナル伝達経路標的遺伝子の特有のセットを特定した。数学モデルにおける使用のために、それぞれの評価された細胞シグナル伝達経路からの３つ以上の、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又はそれ以上の標的遺伝子を解析して、経路活性を決定することができる。
【0039】
本明細書で開示した様々なシグナル伝達経路の活性を決定するための経路解析方法に共通なものは、本明細書の目的のため好ましく本明細書に適用される概念であり、試料中に存在する上皮細胞等の細胞におけるシグナル伝達経路の活性は、シグナル伝達経路の１つ若しくは複数、好ましくは３つ以上の標的遺伝子の発現レベルを受容するステップ、３つ以上の標的遺伝子の転写を制御する試料中のシグナル伝達経路に伴う転写因子（ＴＦ）エレメントの活性レベルを決定するステップであって、１つ若しくは複数、好ましくは３つ以上の標的遺伝子の発現レベルをシグナル伝達経路の活性レベルに関連付ける較正された数学的経路モデルの評価に基づくステップ、並びに任意選択でシグナル伝達経路に伴うＴＦエレメントの決定された活性レベルに基づいて上皮細胞におけるシグナル伝達経路の活性を推測するステップによって決定することができる。本明細書に記載したように、活性レベルは気道異常性因子及び／又はリスクスコアを決定するための入力として直接用いることができ、これも本発明によって意図されている。
【0040】
ＴＦエレメントの用語「活性レベル」は、本明細書で用いる場合、その標的遺伝子の転写に関するＴＦエレメントの活性のレベルを表わす。
【0041】
較正された数学的経路モデルは確率モデル、好ましくはシグナル伝達経路に伴うＴＦエレメントの活性レベル及び３つ以上の標的遺伝子の発現レベルに関連する条件付き確率に基づくベイジアンネットワークモデルであるか、又は較正された数学的経路モデルは３つ以上の標的遺伝子の発現レベルの１つ又は複数の線形結合に基づく。本発明の目的のため、較正された数学的経路モデルは、好ましくはセントロイドモデル若しくは線形モデル、又は条件付き確率に基づくベイジアンネットワークモデルである。
【0042】
特に、対象における発現レベルの決定及び任意選択でシグナル伝達経路の活性の推測は、例えばとりわけ（ｉ）対象の試料で測定された細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルを含む入力のセットについて細胞シグナル伝達経路を表わす較正された確率的経路モデルの一部、好ましくはベイジアンネットワークを評価するステップ、（ｉｉ）細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の転写を制御するシグナル伝達経路に伴う転写因子（ＴＦ）エレメントの対象における活性レベルを推定するステップであって、シグナル伝達経路に伴うＴＦエレメントの活性レベル及び対象の試料で測定された細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルに関連する条件付き確率に基づくステップ、並びに任意選択で（ｉｉｉ）対象の試料におけるシグナル伝達経路に伴うＴＦエレメントの推定された活性レベルに基づいて細胞シグナル伝達経路の活性を推測するステップによって実施される。これは公開された国際特許出願公開ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」）に詳細に記載されており、その内容は全体として本明細書に組み込まれる。
【0043】
例示的な選択肢では、対象における発現レベルの決定及び任意選択で細胞シグナル伝達経路の活性の推測は、とりわけ（ｉ）細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の転写を制御する対象の試料におけるシグナル伝達経路に伴う転写因子（ＴＦ）エレメントの活性レベルを決定するステップであって、決定するステップが細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルをシグナル伝達経路に伴うＴＦエレメントの活性レベルに関連付ける較正された数学的経路モデルの評価に基づき、数学的経路モデルが３つ以上の標的遺伝子の発現レベルの１つ若しくは複数の線形結合に基づく、ステップ、並びに任意選択で（ｉｉ）対象の試料におけるシグナル伝達経路に伴うＴＦエレメントの決定された活性レベルに基づいて対象における細胞シグナル伝達経路の活性を推測するステップによって実施される。これは公開された国際特許出願公開ＷＯ２０１４／１０２６６８Ａ２（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｌｉｎｅａｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ｓ） ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ」)に詳細に記載されている。
【0044】
標的遺伝子発現の数学モデル作成を用いる細胞シグナル伝達経路活性の推測に関するさらなる詳細は、上掲のＷ Ｖｅｒｈａｅｇｈら，２０１４で見出すことができる。
【0045】
一実施形態では、シグナル伝達経路の測定は、ｑＰＣＲ、多重ｑＰＣＲ、マルチプレックスｑＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、ＲＮＡｓｅｑ、ＲＮＡ発現アレイ、又はマススペクトルを用いて実施される。例えば遺伝子発現マイクロアレイデータ、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ、又はＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサー等のＲＮＡシーケンシング法を用いることができる。
【0046】
本発明はＴＧＦ－β経路、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路、Ｎｏｔｃｈ経路、及び／又はＨＨ経路に重点を置いている。本発明の好ましい実施形態によれば、シグナル伝達経路はＴＧＦ－β経路及びＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路とＮｏｔｃｈ経路の１つ又は複数、好ましくはＴＧＦ－β経路及び少なくともＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路を含む。
【0047】
本発明の好ましい実施形態によれば、リスクスコアは、指示されたリスクがＴＧＦ－β経路の活性の低下並びにＰＩ３Ｋ経路の活性の増大、Ｎｏｔｃｈ経路の活性の低下の１つ又は複数とともに増大するように定義される。同様に、気道異常性因子は、好ましくは指示された因子がＴＧＦ－β経路の活性の低下及びＰＩ３Ｋ経路の活性の増大及び／又はＮｏｔｃｈ経路の活性の低下の１つ又は複数を伴う正常からの逸脱の増大を反映するように定義される。増大及び／又は低下は、好ましくは単調増大及び／又は単調低下である。ＴＧＦ－β経路の活性の低下及びＰＩ３Ｋ経路の活性の増大、Ｎｏｔｃｈ経路の活性の低下の１つ又は複数は、好ましくは参照細胞シグナル伝達経路活性に関する。
【0048】
本発明の好ましい実施形態及びその種々の実施形態によれば、３つ以上のＴＧＦ－β標的遺伝子は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、ＶＥＧＦＡからなる群から、より好ましくはＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＤＧＦＢ、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、及びＶＥＧＦＡからなる群から、最も好ましくはＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７からなる群から選択される。
【0049】
本発明の好ましい実施形態及びその種々の実施形態によれば、３つ以上のＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ標的遺伝子は、ＡＧＲＰ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ６、ＢＮＩＰ３、ＢＴＧ１、ＣＡＴ、ＣＡＶ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＥＳＲ１、ＦＡＳＬＧ、ＦＢＸＯ３２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、ＭＸＩ１、ＮＯＳ３、ＰＣＫ１、ＰＯＭＣ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＲＤＸ３、ＲＢＬ２、ＳＯＤ２、ＴＮＦＳＦ１０からなる群から、好ましくはＦＢＸＯ３２、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＳＯＤ２、ＴＮＦＳＦ１０、ＢＣＬ６、ＢＴＧ１、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＢＮＩＰ３、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、及びＭＸＩ１からなる群から選択される。
【0050】
本発明の好ましい実施形態及びその種々の実施形態によれば、３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子は、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＮＲＡＲＰ、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＰＴＣＲＡ、ＳＯＸ９、及びＴＮＣからなる群から選択され、好ましくは２つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子は、ＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、ＮＲＡＲＰ、及びＰＴＣＲＡからなる群から選択され、１つ又は複数のＮｏｔｃｈ標的遺伝子はＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＳＯＸ９、及びＴＮＣからなる群から選択される。
【0051】
これに関して、上記の参照を提供する標的遺伝子の配列リストを特に以下のように参照する。
ＴＧＦ－β：ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮＩＡ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＮＫＸ２－５、ＯＶＯＬ１、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＴＩＭＰ１、及びＶＥＧＦＡ（ＷＯ２０１６／０６２８９１、ＷＯ２０１６／０６２８９３);
ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ：ＡＧＲＰ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ６、ＢＮＩＰ３、ＢＴＧ１、ＣＡＴ、ＣＡＶ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫ１Ａ、ＣＤＫ１Ｂ、ＥＳＲｌ、ＦＡＳＬＧ、ＦＢＸ０３２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、ＭＸＩｌ、ＮＯＳ３、ＰＣＫｌ、ＰＯＭＣ、ＰＰＡＲＧＣＩＡ、ＰＲＤＸ３、ＲＢＬ２、ＳＯＤ２、及びＴＮＦＳＦ１０（ＷＯ２０１５／１０１６３５）；ＡＴＰ８Ａ１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＮＩＰ３、ＢＴＧｌ、ＣｌＯｏｒｆｌＯ、ＣＡＴ、ＣＢＬＢ、ＣＣＮＤｌ、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫＮＩＢ、ＤＤＢ１、ＤＹＲＫ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＥＧ、ＥＳＲｌ、ＥＸＴ１、ＦＡＳＬＧ、ＦＧＦＲ２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ３、ＩＮＳＲ、ＬＧＭＮ、ＭＸＩ１、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＥＭＡ３Ｃ、ＳＥＰＰ１、ＳＥＳＮ１、ＳＬＣ５Ａ３、ＳＭＡＤ４、ＳＯＤ２、ＴＬＥ４、及びＴＮＦＳＦ１０（ＷＯ２０１６／０６２８９２、ＷＯ２０１６／０６２８９３）；ＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴ（ＥＰ１６２００６９７．７、上掲）；
Ｎｏｔｃｈ：ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＮＲＡＲＰ、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＰＴＣＲＡ、ＳＯＸ９、及びＴＮＣ（ＥＰ１７１９４２８８．１、上掲）
ＴＧＦ－β：ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮＩＡ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＮＫＸ２－５、ＯＶＯＬ１、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＴＩＭＰ１、及びＶＥＧＦＡ（ＷＯ２０１６／０６２８９１、ＷＯ２０１６／０６２８９３);
ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ：ＡＧＲＰ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ６、ＢＮＩＰ３、ＢＴＧ１、ＣＡＴ、ＣＡＶ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫ１Ａ、ＣＤＫ１Ｂ、ＥＳＲｌ、ＦＡＳＬＧ、ＦＢＸ０３２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、ＭＸＩｌ、ＮＯＳ３、ＰＣＫｌ、ＰＯＭＣ、ＰＰＡＲＧＣＩＡ、ＰＲＤＸ３、ＲＢＬ２、ＳＯＤ２、及びＴＮＦＳＦ１０（ＷＯ２０１５／１０１６３５）；ＡＴＰ８Ａ１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＮＩＰ３、ＢＴＧｌ、ＣｌＯｏｒｆｌＯ、ＣＡＴ、ＣＢＬＢ、ＣＣＮＤｌ、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫＮＩＢ、ＤＤＢ１、ＤＹＲＫ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＥＧ、ＥＳＲｌ、ＥＸＴ１、ＦＡＳＬＧ、ＦＧＦＲ２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ３、ＩＮＳＲ、ＬＧＭＮ、ＭＸＩ１、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＥＭＡ３Ｃ、ＳＥＰＰ１、ＳＥＳＮ１、ＳＬＣ５Ａ３、ＳＭＡＤ４、ＳＯＤ２、ＴＬＥ４、及びＴＮＦＳＦ１０（ＷＯ２０１６／０６２８９２、ＷＯ２０１６／０６２８９３）；ＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴ（ＥＰ１６２００６９７．７、上掲）；
Ｎｏｔｃｈ：ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＮＲＡＲＰ、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＰＴＣＲＡ、ＳＯＸ９、及びＴＮＣ（ＥＰ１７１９４２８８．１、上掲）
【0052】
例えばベイジアンモデル又は（疑似）線形モデルを用いるマイクロアレイ／ＲＮＡシーケンシングに基づく検討に基づいてそれぞれの細胞シグナル伝達経路の活性を最も良く示すことが見出された標的遺伝子のセットを、例えば対象の試料について実施される多重定量ＰＣＲアッセイ又は専用のマイクロアレイバイオチップに変換することができる。本明細書に記載した遺伝子配列を選択して、例えばマイクロアレイの開発のためのＲＴ－ＰＣＲ用のプライマー－プローブのセット又はオリゴヌクレオチドを選択することができる。経路活性及びリスクスコアの決定のためのそのようなＦＤＡ承認検査を開発するために、標準化された検査キットの開発が必要であり、これは規制承認を得るために臨床試験で臨床的に確認する必要がある。
【0053】
第３の態様によれば、本発明は、対象が異常な気道上皮を有するか又は異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを有するかを示す気道異常性因子を決定するための、本発明の第１及び／又は第２の態様並びにその種々の実施形態の方法を実施するように構成されたデジタルプロセッサを含む装置に関する。したがって、本発明は、本発明の第１及び／又は第２の態様並びにその種々の実施形態の方法を実施するように構成されたデジタルプロセッサを含む装置に関する。
【0054】
第４の態様によれば、本発明は、対象が異常な気道上皮を有するか又は異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを有するかを示す気道異常性因子を決定するための、本発明の第１及び／又は第２の態様並びにその種々の実施形態の方法を実施するデジタルプロセッシングデバイスによって実行可能な命令を格納した非一時的格納媒体に関する。非一時的格納媒体は、コンピュータで読取り可能な格納媒体、例えばハードドライブ若しくはその他の磁気格納媒体、光学ディスク若しくはその他の光学格納媒体、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、フラッシュメモリ、又はその他の電子的格納媒体、ネットワークサーバ、その他である。デジタルプロセッシングデバイスは、ハンドヘルドデバイス（例えばパーソナルデータアシスタント又はスマートフォン）、ノートブックコンピュータ、デスクトップコンピュータ、タブレットコンピュータ又はデバイス、リモートネットワークサーバ、その他である。したがって本発明は、本発明の第１及び／又は第２の態様並びにその種々の実施形態の方法を実施するデジタルプロセッシングデバイスによって実行可能な命令を格納した非一時的格納媒体に関する。
【0055】
第５の態様によれば、本発明は、コンピュータプログラムがデジタルプロセッシングデバイス上で実行された場合に本発明の第１及び／又は第２の態様並びにその種々の実施形態による方法をデジタルプロセッシングデバイスに実施させるプログラムコード手段を含む、対象が異常な気道上皮を有するか又は異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを有するかを示す気道異常性因子を決定するためのコンピュータプログラムに関する。コンピュータプログラムは好適な媒体、例えば他のハードウェアとともに又はその部品として供給される光学格納媒体又は固相媒体の上に格納／配布されるが、その他の形態、例えばインターネット又はその他の有線若しくは無線の遠隔通信システムを介しても配布される。したがって、本発明は、コンピュータプログラムがデジタルプロセッシングデバイス上で実行された場合に本発明の第１及び／又は第２の態様並びにその種々の実施形態による方法をデジタルプロセッシングデバイスに実施させるプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムに関する。
【0056】
第６の態様によれば、本発明は、対象が異常な気道上皮を有するか又は異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを有するかを示す気道異常性因子を決定するためのキットに関し、該キットは、ＴＧＦ－β細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、及び／又はＨＨ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベルを決定するための部品を含む。好ましくは、キットは、ＴＧＦ－β細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、及び／又はＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベルを決定するための部品を含む。本発明によるキットの好ましい実施形態では、３つ以上のＴＧＦ－β標的遺伝子は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、ＶＥＧＦＡからなる群から、より好ましくはＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＤＧＦＢ、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、及びＶＥＧＦＡからなる群から、最も好ましくはＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７からなる群から選択され、又は３つ以上のＴＧＦ－β標的遺伝子は、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＯＶＡＬ１、ＶＥＧＦＡ、ＳＧＫ１からなる群から選択され、
３つ以上のＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ標的遺伝子は、ＡＧＲＰ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ６、ＢＮＩＰ３、ＢＴＧ１、ＣＡＴ、ＣＡＶ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＥＳＲ１、ＦＡＳＬＧ、ＦＢＸＯ３２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、ＭＸＩ１、ＮＯＳ３、ＰＣＫ１、ＰＯＭＣ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＲＤＸ３、ＲＢＬ２、ＳＯＤ２、ＴＮＦＳＦ１０からなる群から、好ましくはＦＢＸＯ３２、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＳＯＤ２、ＴＮＦＳＦ１０、ＢＣＬ６、ＢＴＧ１、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＢＮＩＰ３、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、及びＭＸＩ１からなる群から選択され、
３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子はＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＮＲＡＲＰ、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＰＴＣＲＡ、ＳＯＸ９、及びＴＮＣからなる群から選択され、好ましくは２つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子は、ＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、ＮＲＡＲＰ、及びＰＴＣＲＡからなる群から選択され、１つ若しくは複数のＮｏｔｃｈ標的遺伝子は、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＳＯＸ９、及びＴＮからなる群から選択される。
３つ以上のＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ標的遺伝子は、ＡＧＲＰ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ６、ＢＮＩＰ３、ＢＴＧ１、ＣＡＴ、ＣＡＶ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＥＳＲ１、ＦＡＳＬＧ、ＦＢＸＯ３２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、ＭＸＩ１、ＮＯＳ３、ＰＣＫ１、ＰＯＭＣ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＲＤＸ３、ＲＢＬ２、ＳＯＤ２、ＴＮＦＳＦ１０からなる群から、好ましくはＦＢＸＯ３２、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＳＯＤ２、ＴＮＦＳＦ１０、ＢＣＬ６、ＢＴＧ１、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＢＮＩＰ３、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、及びＭＸＩ１からなる群から選択され、
３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子はＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＮＲＡＲＰ、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＰＴＣＲＡ、ＳＯＸ９、及びＴＮＣからなる群から選択され、好ましくは２つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子は、ＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、ＮＲＡＲＰ、及びＰＴＣＲＡからなる群から選択され、１つ若しくは複数のＮｏｔｃｈ標的遺伝子は、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＳＯＸ９、及びＴＮからなる群から選択される。
【0057】
本発明の別の態様は、対象が異常な気道上皮を有するか又は異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを有するかを示す気道異常性因子を決定するためのキットの製造のための、ＴＧＦ－β細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、及び／又はＨＨ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベルを決定するための部品の使用に関する。
【0058】
キットは特に定量キットであり、即ち発現レベルの定量を可能にする。
【0059】
キットは、ＤＮＡアレイチップ、オリゴヌクレオチドアレイチップ、タンパク質アレイチップ、抗体、複数のプローブ、例えば標識されたプローブ、ＲＮＡ逆転写酵素シーケンシング成分のセット、及び／又はＲＮＡ若しくはｃＤＮＡを含むＤＮＡ、増幅プライマーからなる群から選択される標的遺伝子の発現レベルを測定（特に定量）するための１つ又は複数の部品又は手段を含む。好ましい実施形態では、キットは、ｑＰＣＲ、多重ｑＰＣＲ、マルチプレックスｑＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、ＲＮＡｓｅｑ、ＲＮＡ発現アレイ、及びマススペクトルからなる群から選択される。一実施形態では、キットは、本明細書に記載した標的遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの配列の一部を指向する標識されたプローブのセットを含む。一実施形態では、キットは、標的遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの配列の一部を指向するプライマー及びプローブのセットを含む。一実施形態では、標識されたプローブは、標準化された９６ウェルのプレートに含まれる。一実施形態では、キットは、参照遺伝子のセットを指向するプライマー又はプローブをさらに含む。そのような参照遺伝子は、例えば本明細書に記載した標的遺伝子発現レベルの発現レベルの正規化又は標準化において有用な構成的に発現された遺伝子であってよい。
【0060】
したがって、一実施形態では、本発明はキットに関し、該キットは、
ＴＧＦ－β細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、及び／又はＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベルを決定するための部品を含み、
３つ以上のＴＧＦ－β標的遺伝子、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、又はそれ以上の遺伝子は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、ＶＥＧＦＡからなる群から選択され、より好ましくは、３つ以上のＴＧＦ－β標的遺伝子、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個の遺伝子は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＤＧＦＢ、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、及びＶＥＧＦＡからなる群から選択され、最も好ましくは、３つ以上のＴＧＦ－β標的遺伝子、例えば３、４、５、６、７、又は８個の遺伝子はＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７からなる群から選択され、或いは、３つ以上のＴＧＦ－β標的遺伝子、例えば３、４、５、６、７、又は８個の遺伝子はＣＤＣ４２ＥＰ３、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＯＶＡＬ１、ＶＥＧＦＡ、ＳＧＫ１からなる群から選択され、
及び／又は
３つ以上のＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ標的遺伝子、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、又はそれ以上の遺伝子はＡＧＲＰ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ６、ＢＮＩＰ３、ＢＴＧ１、ＣＡＴ、ＣＡＶ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＥＳＲ１、ＦＡＳＬＧ、ＦＢＸＯ３２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、ＭＸＩ１、ＮＯＳ３、ＰＣＫ１、ＰＯＭＣ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＲＤＸ３、ＲＢＬ２、ＳＯＤ２、ＴＮＦＳＦ１０からなる群から選択され、好ましくは、３つ以上のＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ遺伝子、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個の遺伝子はＦＢＸＯ３２、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＳＯＤ２、ＴＮＦＳＦ１０、ＢＣＬ６、ＢＴＧ１、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＢＮＩＰ３、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、及びＭＸＩ１からなる群から選択され、
及び／又は
３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、又はそれ以上の遺伝子はＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＮＲＡＲＰ、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＰＴＣＲＡ、ＳＯＸ９、及びＴＮＣからなる群から選択され、好ましくは、２つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子、例えば２、３、４、５、６、７、又は８個の遺伝子はＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、ＮＲＡＲＰ、及びＰＴＣＲＡからなる群から選択され、１つ又は複数のＮｏｔｃｈ標的遺伝子、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、又はそれ以上の遺伝子はＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＳＯＸ９、及びＴＮＣからなる群から選択される。好ましくは、キットは、対象が異常な気道上皮を有するか又は異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを有するかを示す気道異常性因子を決定するためであるか、又はそれに適している。
ＴＧＦ－β細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、及び／又はＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベルを決定するための部品を含み、
３つ以上のＴＧＦ－β標的遺伝子、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、又はそれ以上の遺伝子は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、ＶＥＧＦＡからなる群から選択され、より好ましくは、３つ以上のＴＧＦ－β標的遺伝子、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個の遺伝子は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＤＧＦＢ、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、及びＶＥＧＦＡからなる群から選択され、最も好ましくは、３つ以上のＴＧＦ－β標的遺伝子、例えば３、４、５、６、７、又は８個の遺伝子はＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７からなる群から選択され、或いは、３つ以上のＴＧＦ－β標的遺伝子、例えば３、４、５、６、７、又は８個の遺伝子はＣＤＣ４２ＥＰ３、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＯＶＡＬ１、ＶＥＧＦＡ、ＳＧＫ１からなる群から選択され、
及び／又は
３つ以上のＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ標的遺伝子、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、又はそれ以上の遺伝子はＡＧＲＰ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ６、ＢＮＩＰ３、ＢＴＧ１、ＣＡＴ、ＣＡＶ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＥＳＲ１、ＦＡＳＬＧ、ＦＢＸＯ３２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、ＭＸＩ１、ＮＯＳ３、ＰＣＫ１、ＰＯＭＣ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＲＤＸ３、ＲＢＬ２、ＳＯＤ２、ＴＮＦＳＦ１０からなる群から選択され、好ましくは、３つ以上のＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ遺伝子、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個の遺伝子はＦＢＸＯ３２、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＳＯＤ２、ＴＮＦＳＦ１０、ＢＣＬ６、ＢＴＧ１、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＢＮＩＰ３、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、及びＭＸＩ１からなる群から選択され、
及び／又は
３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、又はそれ以上の遺伝子はＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＮＲＡＲＰ、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＰＴＣＲＡ、ＳＯＸ９、及びＴＮＣからなる群から選択され、好ましくは、２つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子、例えば２、３、４、５、６、７、又は８個の遺伝子はＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、ＮＲＡＲＰ、及びＰＴＣＲＡからなる群から選択され、１つ又は複数のＮｏｔｃｈ標的遺伝子、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、又はそれ以上の遺伝子はＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＳＯＸ９、及びＴＮＣからなる群から選択される。好ましくは、キットは、対象が異常な気道上皮を有するか又は異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを有するかを示す気道異常性因子を決定するためであるか、又はそれに適している。
【0061】
いくつかの実施形態では、キットは、数千個の標的遺伝子の発現レベルを決定するためのマイクロアレイではない。例えば、本発明のキットは、本明細書で開示した特定の標的遺伝子に必要な成分に加えて、１０００個を超えない標的遺伝子、７００個を超えない標的遺伝子、５００個を超えない標的遺伝子、２００個を超えない標的遺伝子、１００個を超えない標的遺伝子の発現レベルを決定するための部品を含む。
【0062】
キットは、第３の態様の装置、第４の態様の非一時的格納媒体、又は第５の態様のコンピュータプログラムをさらに含む。
【0063】
第７の態様によれば、本発明は、対象が異常な気道上皮を有するか又は異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するかを診断し又は予知する方法における使用のためのキットに関し、該キットは、ＴＧＦ－β細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、及び／又はＨＨ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベルを決定するための部品を含む。好ましい実施形態によれば、診断又は予知する方法は、対象の気道から上皮細胞試料を抽出するステップ、及び抽出された上皮細胞試料を本発明の第１及び／又は第２の態様による方法に供するステップを含む。
【0064】
本発明の別の態様は、対象が異常な気道上皮を有するか又は異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するかを診断し又は予知する方法であり、本方法は、対象の気道の上皮細胞試料を準備するステップ又は対象の気道から上皮細胞試料を抽出するステップ、及び準備され又は抽出された上皮細胞試料を本発明の第１及び／又は第２の態様による方法に供するステップを含む。
【0065】
したがって、本発明はさらに、対象が異常な気道上皮を有するか又は異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するかを、キットを用いてｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｔｒｏで診断し又は予知する方法に関し、該キットは、ＴＧＦ－β細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベルを決定するための部品を含む。好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｔｒｏにおける診断又は予知のための前記方法において、対象の気道の上皮細胞試料が準備され、又は対象の気道からの抽出された上皮細胞試料が準備されて、準備され又は抽出された上皮細胞試料が本発明の第１及び／又は第２の態様による方法に供される。好ましくは、前記方法は、対象の気道の上皮細胞試料を準備するステップ、又は対象の気道から上皮細胞試料を抽出するステップをさらに含む。
【0066】
好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｔｒｏにおける診断又は予知のための前記方法において、ＴＧＦ－β細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベルを決定するための前記部品は、３つ以上のＴＧＦ－β標的遺伝子を含み、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、又はそれ以上の遺伝子は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、ＶＥＧＦＡからなる群から選択され、より好ましくは、３つ以上のＴＧＦ－β標的遺伝子、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個の遺伝子は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＤＧＦＢ、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、及びＶＥＧＦＡからなる群から選択され、最も好ましくは、３つ以上のＴＧＦ－β標的遺伝子、例えば３、４、５、６、７、又は８個の遺伝子はＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７からなる群から選択され、或いは、３つ以上のＴＧＦ－β標的遺伝子、例えば３、４、５、６、７、又は８個の遺伝子はＣＤＣ４２ＥＰ３、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＯＶＡＬ１、ＶＥＧＦＡ、ＳＧＫ１からなる群から選択され、３つ以上のＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ標的遺伝子、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、又はそれ以上の遺伝子はＡＧＲＰ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ６、ＢＮＩＰ３、ＢＴＧ１、ＣＡＴ、ＣＡＶ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＥＳＲ１、ＦＡＳＬＧ、ＦＢＸＯ３２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、ＭＸＩ１、ＮＯＳ３、ＰＣＫ１、ＰＯＭＣ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＲＤＸ３、ＲＢＬ２、ＳＯＤ２、ＴＮＦＳＦ１０からなる群から選択され、好ましくは、３つ以上のＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ遺伝子、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個の遺伝子はＦＢＸＯ３２、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＳＯＤ２、ＴＮＦＳＦ１０、ＢＣＬ６、ＢＴＧ１、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＢＮＩＰ３、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、及びＭＸＩ１からなる群から選択され、３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、又はそれ以上の遺伝子はＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＮＲＡＲＰ、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＰＴＣＲＡ、ＳＯＸ９、及びＴＮＣからなる群から選択され、好ましくは、２つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子、例えば２、３、４、５、６、７、又は８個の遺伝子はＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、ＮＲＡＲＰ、及びＰＴＣＲＡからなる群から選択され、１つ又は複数のＮｏｔｃｈ標的遺伝子、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、又はそれ以上の遺伝子はＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＳＯＸ９、及びＴＮＣからなる群から選択される。好ましくは、前記キットは、本発明の第６の態様によるキットに記載したキットである。
【0067】
さらなる実施形態では、対象が異常な気道上皮を有するか又は異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するかをｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｔｒｏで本発明によって診断し又は予知する方法は、対象の気道由来の上皮細胞試料における細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づいて対象が異常な気道上皮を有しているかを示す気道異常性因子を決定するステップをさらに含み、細胞シグナル伝達経路はＴＧＦ－β経路、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路、及びＮｏｔｃｈ経路からなる群から選択される２つ以上の細胞シグナル伝達経路を含み、シグナル伝達経路異常性因子を決定するステップはさらにそれぞれの細胞シグナル伝達経路の参照活性に基づき、参照活性は健康な対象の気道上皮において見出されるそれぞれの細胞シグナル伝達経路の活性を反映する。
【0068】
第８の態様によれば、本発明は、ＴＧＦ－β細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベルを決定するための部品を含むキットに関する。好ましくは、キットは、対象が異常な気道上皮を有するか又は異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するかを示すリスクスコアを決定するためであるか、又はそれに適している。
【0069】
さらに好ましい実施形態では、本発明は、対象が異常な気道上皮を有すること若しくは異常な気道上皮を有する対象が気道がんを発症するか否かを示す気道異常性スコアの決定における又はリスクスコアの決定のための、本発明の第６又は第８の態様によるキットの使用に関する。
【0070】
本発明の１つの利点は、例えば経路活性の組合せに基づいて決定される気道異常性因子及び／又はリスクスコアによって示される本明細書に記載した経路活性の組合せに基づいて対象のための処置を判断することによって臨床的勧告を提供するように適合された臨床判断補助（ＣＤＳ）システムに存する。
【0071】
別の利点は、本明細書に記載した２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づいて決定される気道異常性因子及び／又はリスクスコアによって示される対象が気道がんを発症する様々なリスクを伴う複数のリスクグループのうち少なくとも１つに対象を割り当てるように適合されたＣＤＳシステムに存する。
【0072】
別の利点は、対象が気道がんを発症するリスクを示し、本明細書に記載した２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づいて決定されるリスクスコアを、１つ又は複数のさらなる予知検査から得られる１つ又は複数のさらなるリスクスコアと組み合わせるステップに存する。
【0073】
本明細書に記載した本発明は、例えば
気道上皮が前悪性であるか否かの予測、及び／又は
人が（本明細書で定義した）気道がんの発症の高いリスクを有するか否かの予測、及び／又は
人が肺がんの発症の高いリスクを有するか否かの予測、及び／又は
人が扁平上皮肺がんの発症の高いリスクを有するか否かの予測、及び／又は
人が肺腺癌の発症の高いリスクを有するか否かの予測、及び／又は
人ががんの発症を防止する局所治療から恩恵を受けられるか否かの予測、及び／又は
患者が肺がんを有するか、及び／又は
２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づく予知及び／又は予測、及び／又は
２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づく、例えば化学療法及び／又はホルモン治療の薬物有効性の予測、及び／又は２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づく薬物有効性のモニタリング、及び／又は
２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づくモニタリングの頻度又はより詳細には治療応答性のモニタリングの頻度の判断、及び／又は
２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づく薬物の開発、及び／又は
２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づくアッセイの開発、及び／又は
人が侵襲性気道がんの発症のリスクにあるか否かの予測、及び／又は
人が疾患の進行のリスクにあるか否かの予測、及び／又は人が処置（例えば化学的予防）の後で低減したリスクを有するか否かの予測又は診断、及び／又は
ＣＴスキャン等の造影手段によって検知された結節又は異常が悪性若しくは良性である可能性が大きいか否かの予測、及び／又は
２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づくがんのステージ分類
と関連して有利に用いることができ、それぞれの場合において細胞シグナル伝達経路はＴＧＦ－β経路、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路、及び／又はＮｏｔｃｈ経路を含む。
気道上皮が前悪性であるか否かの予測、及び／又は
人が（本明細書で定義した）気道がんの発症の高いリスクを有するか否かの予測、及び／又は
人が肺がんの発症の高いリスクを有するか否かの予測、及び／又は
人が扁平上皮肺がんの発症の高いリスクを有するか否かの予測、及び／又は
人が肺腺癌の発症の高いリスクを有するか否かの予測、及び／又は
人ががんの発症を防止する局所治療から恩恵を受けられるか否かの予測、及び／又は
患者が肺がんを有するか、及び／又は
２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づく予知及び／又は予測、及び／又は
２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づく、例えば化学療法及び／又はホルモン治療の薬物有効性の予測、及び／又は２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づく薬物有効性のモニタリング、及び／又は
２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づくモニタリングの頻度又はより詳細には治療応答性のモニタリングの頻度の判断、及び／又は
２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づく薬物の開発、及び／又は
２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づくアッセイの開発、及び／又は
人が侵襲性気道がんの発症のリスクにあるか否かの予測、及び／又は
人が疾患の進行のリスクにあるか否かの予測、及び／又は人が処置（例えば化学的予防）の後で低減したリスクを有するか否かの予測又は診断、及び／又は
ＣＴスキャン等の造影手段によって検知された結節又は異常が悪性若しくは良性である可能性が大きいか否かの予測、及び／又は
２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性の組合せに基づくがんのステージ分類
と関連して有利に用いることができ、それぞれの場合において細胞シグナル伝達経路はＴＧＦ－β経路、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路、及び／又はＮｏｔｃｈ経路を含む。
【0074】
さらなる利点は、添付した図面、以下の説明を読み理解することによって、また特に本明細書で以下に提供する詳細な実施例を読むことによって、当業者には明白になる。
【0075】
本出願は、いくつかの好ましい実施形態を記載している。上記の詳細な説明を読み理解することによって、他への改変及び変更が生じる。本出願は、そのような全ての改変及び変更が添付した特許請求の範囲又はそれらの等価物の範囲内に含まれる限り、そのような全ての改変及び変更を含むと解釈されることを意図している。
【0076】
開示した実施形態のその他の変形は、図面、開示、及び添付した特許請求の範囲の研究から、特許請求する発明の実施において、当業者によって理解され、達成され得る。
【0077】
第１及び第２の態様の方法、第３の方法の装置、第４の方法の非一時的格納媒体、第５の態様のコンピュータプログラム、第６、第７、及び第８の態様のキットは、特に従属請求項に定義したものと同様の及び／又は同一の好ましい実施形態を有することを理解されたい。
【0078】
特許請求の範囲において、単語「含む」は他の要素又はステップを除外せず、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は複数を除外しない。
【0079】
単一の単位又はデバイスは、特許請求の範囲で引用したいくつかの項目の機能を満たす。相互に異なる従属請求項においてある尺度が引用されているという事実だけでは、これらの尺度の組合せが有利に使用できないことは意味しない。
【0080】
１つ又はいくつかの単位又はデバイスによって実施されるリスクスコアの決定のような計算は、任意の他の数の単位又はデバイスによって実施することができる。
【0081】
本発明の好ましい実施形態は、従属請求項又は上記の実施形態とそれぞれの独立請求項との任意の組合せであってもよいことを理解されたい。
【0082】
本発明のこれらの及びその他の態様は、これ以降記載する実施形態から明白になり、またそれらを参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【0083】
【図1】非喫煙者（ｎ＝１３）（左のボックス、「ＮＳ」とラベル）から擦過によって得られた正常な小気道上皮細胞及び多量喫煙者（ｎ＝１８）（右のボックス、「Ｓ」とラベル）から得られた正常な小気道上皮細胞で測定したシグナル伝達経路活性の決定の例示的な結果を示す図である（図１Ａ：ＴＧＦ－β、図１Ｂ：Ｎｏｔｃｈ、図１Ｃ：ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ）。Ｌｏｇ２オッズ経路スコアを示す。
【図2】データセットＧＳＥ１０００６を用いるＴＧＦ－β経路活性を用いる気道上皮細胞における異常な経路活性の閾値の例示的な計算を示す図である。ここでは「非喫煙者」と「喫煙者」について個別に、データセット中のそれぞれの試料についての経路活性スコアを示している。両方の群について、経路活性スコアの平均、並びに標準偏差（ＳＤ）を計算する（小さな長方形として図２に示す）。異常な低ＴＧＦ－β活性の閾値は、健康な非喫煙者の正常な小気道のＴＧＦ－β経路スコアの平均経路活性スコアマイナス１ＳＤ、或いは平均マイナス２ＳＤとして設定し、それぞれ「１ＳＤ」及び「２ＳＤ」とラベルした水平点線として図２に示している。閾値として１ＳＤを採用すれば、このレベル未満のＴＧＦ－β経路スコアは健康な非喫煙者の１５．８％のみで起こり、２ＳＤを低い閾値とすれば、その集団の２．２％のみで起こる。この閾値より低い値は（１ＳＤ又は２ＳＤの閾値に応じて）異常な気道上皮に由来するリスクの増大を伴っていると考えられる。ここで記載したセントロイドコンピュータ法の開発のため、定義した２ＳＤ閾値未満の試料経路解析結果は、異常と考えられる。この場合には、異常な経路活性は、腫瘍抑制性ＴＧＦ－β活性の喪失によって特徴付けられる。このデータセットの喫煙者群では、喫煙者の全てではないがサブグループのみが異常な気道上皮を有することが予想される。このサブグループは、正常な上皮のＴＧＦ－β経路活性の閾値をこの群に適用することによって、識別することができる。まさに、比較的多数の試料がそれぞれ１ＳＤ及び２ＳＤの閾値未満のＴＧＦ－β経路活性を有していた（図２Ｂ）。セントロイドコンピュータモデルを引き続いて較正するため、正常の２ＳＤ未満のＴＧＦ－β経路スコアを有する試料は、異常な試料のための較正セットと考えられる。一方、２ＳＤ閾値より高いＴＧＦ－β経路スコアを有する非喫煙者試料は、正常試料のための較正セットを構成する。線形モデルのため、例としてそれ未満では経路活性スコアが異常に低いと考えられる閾値として１ＳＤ閾値が採用される。他のシグナル伝達経路についても、対応する様式でこれを行なうことができる。図２Ｂは、較正データを四角形でさらに示す。左の四角形は正常試料「ＮＳ」のための較正セットを示す。右の四角形は異常試料「ＡＳ」のための較正セットを示す。
【図3】本明細書で開示したように、対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを決定するように構成された臨床判断補助（ＣＤＳ）システムを図式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0084】
以下の実施形態は、特に好ましい方法及びこれに関連して選択された態様を単に示すのみである。ここに提供した教示は、いくつかの検査及び／又はキットを構築するために用いられる。以下の実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【0085】
本発明は、気道上皮における異常な／前悪性の変化を有する、及び／又は肺がんを発症するリスクが増大した個体、特に喫煙者を識別することができる方法に関する。シグナル変換経路活性の測定によって、異常な気道上皮及び前悪性変化の可能性の増大の指標となる異常なシグナル変換経路活性を識別することができる。本発明によれば、肺がんを発症するリスクが潜在的に増大した異常な気道上皮を有する個体を識別する以下の（小／大）気道経路異常性スコアとも表わされる（Ｓ／Ｌ）ＡＰＡＳにおいて２つ以上の経路の活性が決定され、気道異常性因子に変換される。
【0086】
本発明は、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路、Ｎｏｔｃｈ、ＨＨ、及び／又はＴＧＦ－β経路の組み合わされた活性に基づく気道由来の上皮細胞における前悪性変化の存在の指標となるリスクスコア及び／又は気道上皮異常性因子／スコア、並びにリスクスコア及び／又は気道上皮異常性因子を提供するコンピュータモデルを用いる経路結果の解釈を提供する。大気道又は小気道由来の上皮細胞の解析を用いて、肺がんを発症する高いリスクを示す異常を早期に検知することができる。リスクスコア及び／又は気道上皮異常性因子を用いて、これらの経路をその非病理的な状態に戻して前悪性変化を逆行させることを指向する治療の選択において、緊密なモニタリング又は補助のために患者を階層化することもできる。
【0087】
肺がんは大気道（気管から離れた気管支分枝）又は小気道の上皮で発症する。気道擦過、鼻細胞の採取（鼻綿棒）、又は気管支肺胞洗浄等の手法を用いて、比較的非侵襲的な様式で上気道及び下気道から上皮細胞を分子解析用に得ることができる。これにより、その気道上皮におけるこれらの早期の増殖性変化を有し、肺がんを発症するリスクが増大した個体、特に喫煙者を識別する可能な手段が提供される。
【0088】
シグナル変換経路解析によって、例えば気管支肺胞洗浄、擦過、又は生検によって上気道又は下気道から得られた上皮細胞におけるシグナル変換経路活性の定量的測定が可能になり、これはそれぞれのシグナル伝達経路に伴う転写因子の確認された直接の標的遺伝子のｍＲＮＡレベルの測定からのシグナル変換経路の活性を推測することに基づいている（例えば上掲のＷ Ｖｅｒｈａｅｇｈら，２０１４、上掲のＷ Ｖｅｒｈａｅｇｈ，Ａ ｖａｎ ｄｅ Ｓｔｏｌｐｅ，２０１４を参照）。１つ又は複数の経路の活性、多重経路活性の組合せ、及びそれらの応用を決定するステップは、上述のようにして実施される。モデルは、上皮細胞を含むいくつかの細胞型におけるＥＲ、ＡＲ、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ、ＨＨ、Ｎｏｔｃｈ、ＴＧＦ－β、Ｗｎｔ、ＮＦｋＢ、並びにＳＴＡＴ１／２及びＳＴＡＴ３経路について生物学的に確認されている。
【0089】
本発明はＴＧＦ－β経路、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路、Ｎｏｔｃｈ経路、及び／又はＨＨ経路に重点を置いている。
【0090】
ＴＧＦ－βは、細胞増殖、分化、免疫細胞活性、細胞微小環境、及びその他の細胞プロセスに関与している。正常細胞及び前悪性細胞では、ＴＧＦ－βは腫瘍抑制機能を発揮する。しかし、がん細胞への進行においては、受容体不活性化変異又は経路の抑制アームの選択的喪失によって、腫瘍抑制効果が失われることがある（Ｍａｓｓａｇｕｅら，Ｃｅｌｌ，２００８，１３４（２）：２１５～２３０頁）。タバコへの曝露は、ＴＧＦ－β媒介増殖阻害及びアポトーシスを低減することがあり、これは喫煙が腫瘍原性を促進することを示している（Ｓａｍａｎｔａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ Ｒｅｓ，２０１２，５（３）：４５３～６３頁）。
【0091】
ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路は種々の型のがんにおいて一般に超活性化される。腫瘍はＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路阻害剤におそらく感受性であるが、機能的ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ活性を評価する信頼できる診断検査はない。ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路は腫瘍抑制性ＦＯＸＯ転写因子を負に制御するので、ＦＯＸＯ標的遺伝子の発現は（酸化ストレスがないという前提で）ＰＩ３Ｋ活性と逆相関する（ｖａｎ Ｏｏｉｊｅｎ，２０１８、上掲）。ＦＯＸＯ３の欠如は喫煙による炎症の罹患性の増大、空隙の増大、及びＣＯＰＤをもたらすことが示されている（Ｈｗａｎｇら,Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１１，１８７（２）：９８７～９９８頁）。ＦＯＸＯ３のレベルは、喫煙者及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の患者の肺において顕著に低下している。
【0092】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、細胞増殖、分化、及びアポトーシスの制御に関与している。Ｎｏｔｃｈの様々なアイソフォームの腫瘍抑制機能と腫瘍促進機能は、細胞及び環境の状況に依存している。例えばある腫瘍では、Ｎｏｔｃｈ１は腫瘍の開始の促進において腫瘍原性の役割を有し、Ｎｏｔｃｈ２は腫瘍抑制の役割を有していることが記載されている（Ｚｏｕら，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１８，１５：３４１５～３４２１頁）。しかし、これは異なる腫瘍型で異なることがあり、例えば膀胱がんではＮＯＴＣＨ１とＮＯＴＣＨ２の両方が腫瘍抑制性である（Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ，２０１４，４（１１）：１２５２頁）。異なるアイソフォームの発現レベルは肺がんの種々の組織学的サブタイプの間で異なっている（Ｃｈｅｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，２０１７，８（７）：１２９２～１３００頁）。肺がんの１つの型であるＳＣＬＣでは、Ｎｏｔｃｈ経路の腫瘍抑制機能は失われており、これは治療標的さえも提供し、ＳＣＬＣの患者においてＮｏｔｃｈ経路活性を増加させる薬物が開発されている（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２０１７，１４（９）：５４９～５６１頁）。Ｎｏｔｃｈ経路は健康な喫煙者及び慢性閉塞性肺疾患を有する喫煙者の気道上皮で下方制御されており、この経路が喫煙によって誘起された傷害の修復に重要であることを暗示している（Ｔｉｌｌｅｙら，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ，２００９，１７９（６）：４５７～６６頁）。
【0093】
喫煙者及び非喫煙者のデータによるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ２．０発現マイクロアレイデータセット（ＧＥＯ、公共データセット）のシグナル伝達経路解析
ＧＥＯデータセットデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｄｓ／）において、非喫煙者、並びに少量及び多量のタバコ喫煙者の上皮気道細胞からのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータを含むＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｐｌｕｓ２．０の公共利用可能な臨床研究を特定した。
ＧＥＯデータセットデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｄｓ／）において、非喫煙者、並びに少量及び多量のタバコ喫煙者の上皮気道細胞からのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータを含むＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｐｌｕｓ２．０の公共利用可能な臨床研究を特定した。
【0094】
データセットＧＳＥ１０００６。検討した群は、喫煙者の大気道（ｎ＝９）、非喫煙者の大気道（ｎ＝２０）、喫煙者の小気道（ｎ＝１３）、非喫煙者の小気道（ｎ＝１８）、及びバリデーション目的のための独立のデータセットとしてのＣＯＰＤ患者データ。ＴＧＦベータ、ＮＯＴＣＨ経路及びＦＯＸＯ転写因子活性の解析の結果を、非喫煙者及び喫煙者の正常な小気道上皮について図１Ａ～図１Ｃに示す。本明細書で開示した標的遺伝子の発現レベルを、ＴＧＦ－β、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ、及びＮｏｔｃｈ経路のそれぞれについてデータセットから収集した。続いて、シグナル伝達経路活性を本明細書に記載したように決定し、非喫煙者と喫煙者との間で比較した。経路活性はｌｏｇ２オッズスケールで表示し、有意差（Ｒａｎｋ Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）を表示する。
【0095】
このアプローチを用いて、ＴＧＦ－β及びＮｏｔｃｈ経路は多量喫煙者のサブ集団において失われる（図１Ａ及び図１Ｂ参照）一方、ＦＯＸＯ転写因子の活性はＰＩ３Ｋ増殖因子経路が活性化された喫煙者のサブグループで失われる（図１Ｃ参照）ことが見出された。これは、多量喫煙者のサブグループの気道上皮細胞において、非喫煙者と比較して特徴的な経路活性プロファイルが存在することを意味する。ＴＧＦ－β経路及びＮｏｔｃｈ経路の活性の腫瘍抑制効果の喪失は、増殖性ＰＩ３Ｋ経路の活性の増大を伴っている。これは、多量喫煙集団のサブグループにおける異常な増殖並びにＮｏｔｃｈ及びＴＧＦ－β経路の腫瘍抑制活性の喪失を示す。このサブグループの対象はおそらく、ある形態の肺がんの発症の高いリスクがある。これらの異常が上気道由来の細胞で見られた場合には、それらはおそらく典型的にはここで起こる扁平上皮肺がんのようながんを発症する高いリスクにあり、下気道上皮細胞に存在する場合には、対象はおそらく典型的には下気道で起こる腺癌を発症する高いリスクにある。
【0096】
気管（上気道）由来の上皮細胞は下気道上皮細胞で見出されるのと同様の経路活性異常性を示し、したがって上皮異常性スコア及びがんリスクスコアを提供する代理の試料として用いられる可能性があることも確かめられた（データは示していない）。気管由来の上皮細胞は容易に得られ、サンプリングは侵襲性が低い。
【0097】
データセットＧＳＥ１９７２２を用いて、本発明は上皮細胞の幹／前駆細胞にも適用可能であることがさらに見出された（Ｄａｔａｓｅｔ ＧＳＥ１９７２２．ＲＥＦ：Ｓｈａｙｋｈｉｅｖ Ｒ，Ｗａｎｇ Ｒ，Ｚｗｉｃｋ ＲＫ，Ｈａｃｋｅｔｔ ＮＲら Ａｉｒｗａｙ ｂａｓａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｍｏｋｅｒｓ ｅｘｐｒｅｓｓ ａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｔｏ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２０１３ Ｓｅｐ；３１（９）：１９９２～２００２頁）。したがって特に、損傷を受けた上皮の再生に必要な幹／前駆細胞を構成する培養された基底細胞（ＢＣ）は、一次の非培養上皮細胞試料の代理試料として用いることができる。喫煙者由来の基底細胞における非喫煙者と比較して低下したＦＯＸＯ転写因子活性は、ＰＩ３Ｋ経路活性の増大の指標である（表１参照）。
【0098】
表１．データセットＧＳＥ１９７２２を用いる上皮細胞の幹／前駆細胞の解析。可撓性気管支鏡を用いて小気道上皮細胞を採取し、培養した。１週後にＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ解析のためにＲＮＡを抽出した。ＦＯＸＯ活性についてのＬｏｇ２オッズ値を示す。
【0099】
【表1】
【0100】
喫煙に伴う気道上皮の最も早い損傷は、本明細書に記載したＰｈｉｌｉｐｓ経路解析によって識別されるように、ＰＩ３Ｋ経路の活性の増大によって惹起されるＢＣの過形成に反映される。この場合には、ＢＣは非喫煙者及び喫煙者の気管支鏡検査によって得られ、解析の前にコラーゲンの上で１週間培養した。これらの条件下で、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ活性は喫煙者の培養ＢＣにおいて増大し（有意ではない）、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路活性の増大を示した（ＦＯＸＯ活性は低下）（表１参照）。この細胞型における異常なＰＩ３Ｋ経路活性は、上皮細胞型における異常な経路活性と相関し、上皮細胞で見られたＰＩ３Ｋ経路活性が基底細胞に起源していることを示唆している。この実験は、ＢＣ由来の試料が原理的に上皮細胞の異常性を測定するためにも用い得ることを示している。
【0101】
正常経路活性の定義
健康な非喫煙対象（ＧＳＥ１０００６）における経路活性に基づいて、正常な小気道上皮について参照経路活性を定義した。測定した経路活性が、Ｎｏｔｃｈ、ＴＧＦ－β経路、及びＦＯＸＯ転写因子活性についての正常な経路活性の平均よりも１標準偏差を超えて（＞１ＳＤ）、或いは２標準偏差を超えて（＞２ＳＤ）低かった場合には、患者試料において測定した経路活性は異常とみなした。それぞれの経路についての決定した平均及び標準偏差を表２に示す。
健康な非喫煙対象（ＧＳＥ１０００６）における経路活性に基づいて、正常な小気道上皮について参照経路活性を定義した。測定した経路活性が、Ｎｏｔｃｈ、ＴＧＦ－β経路、及びＦＯＸＯ転写因子活性についての正常な経路活性の平均よりも１標準偏差を超えて（＞１ＳＤ）、或いは２標準偏差を超えて（＞２ＳＤ）低かった場合には、患者試料において測定した経路活性は異常とみなした。それぞれの経路についての決定した平均及び標準偏差を表２に示す。
【0102】
表２．ＴＧＦ－β、ＮＯＴＣＨ経路、及びＦＯＸＯ転写因子の活性の平均値及び標準偏差
【0103】
【表2】
【0104】
これらの値に基づいて、下閾値未満では経路活性は気道上皮細胞において異常とみなす経路活性の下閾値を計算した。
ＴＧＦ－β活性の下閾値：－１５．１７（１ＳＤ）及び－１７．１２（２ＳＤ）、
ＮＯＴＣＨ活性の下閾値：８．７９（１ＳＤ）及び６．５７（２ＳＤ）、
ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ活性の下閾値：－０．１４（１ＳＤ）及び－２．４０（２ＳＤ）
このようにして計算したＴＧＦ－β経路活性の下閾値を、図２Ａ及び図２Ｂに水平点線として示す。
ＴＧＦ－β活性の下閾値：－１５．１７（１ＳＤ）及び－１７．１２（２ＳＤ）、
ＮＯＴＣＨ活性の下閾値：８．７９（１ＳＤ）及び６．５７（２ＳＤ）、
ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ活性の下閾値：－０．１４（１ＳＤ）及び－２．４０（２ＳＤ）
このようにして計算したＴＧＦ－β経路活性の下閾値を、図２Ａ及び図２Ｂに水平点線として示す。
【0105】
コンピュータモデルの開発及び較正
個別の経路活性は患者試料の間で変動性を示すという事実から、多重経路活性を解釈し、分析した上皮細胞試料が正常でない確率を提供するコンピュータモデルを有利に採用した。これは、前悪性状態の指標を提示すると考えられる。モデルの較正のため、データセットＧＳＥ１０００６からの健康な喫煙者及び非喫煙者の小気道上皮のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０データを用いた。同じデータセットからのバリデーションの目的のため、ＣＯＰＤを有する喫煙者の試料からの独立のデータを用いた。
個別の経路活性は患者試料の間で変動性を示すという事実から、多重経路活性を解釈し、分析した上皮細胞試料が正常でない確率を提供するコンピュータモデルを有利に採用した。これは、前悪性状態の指標を提示すると考えられる。モデルの較正のため、データセットＧＳＥ１０００６からの健康な喫煙者及び非喫煙者の小気道上皮のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０データを用いた。同じデータセットからのバリデーションの目的のため、ＣＯＰＤを有する喫煙者の試料からの独立のデータを用いた。
【0106】
モデルは、本明細書に記載したように線形、セントロイド、ベイジアンモデル、又は別のモデルであってよい。モデルは下気道及び上気道の上皮細胞について別々に開発してよく、これらは様々な肺がんの型の発症におけるリスクを表示する異常性スコアを提供し得る。
【0107】
本実施例では、セントロイドモデル及び線形モデルを用いた。しかし、当業者には理解されるように、ベイジアンモデルその他も同様に用いることができる。
【0108】
セントロイドモデル
セントロイドモデル（小／大）気道経路異常性スコアを計算するための入力として擦過を用いて下（小）気道から得られた上皮細胞において測定したＰＩ３Ｋ、ＴＧＦ－β、及びＮｏｔｃｈの経路活性を用いる例示的なコンピュータモデルを開発した。
セントロイドモデル（小／大）気道経路異常性スコアを計算するための入力として擦過を用いて下（小）気道から得られた上皮細胞において測定したＰＩ３Ｋ、ＴＧＦ－β、及びＮｏｔｃｈの経路活性を用いる例示的なコンピュータモデルを開発した。
【0109】
セントロイドコンピュータモデルを較正するための試料の選択は下記の通りであった（図２Ｂ参照）。
【0110】
非喫煙者データの２×ＳＤ閾値を超える健康／正常小気道（非喫煙者）に基づく「正常試料」の選択。
【0111】
「異常試料」の選択は、非喫煙者データの２×ＳＤ閾値未満の健康／正常小気道（喫煙者）に基づく。
【0112】
モデルは、ＴＧＦ－βとＦＯＸＯ活性の組合せ（表３参照）、又はＴＧＦ－βとＦＯＸＯとＮｏｔｃｈ活性の組合せ（表４参照）を用いて較正した。マイクロアレイデータを用いる前に、別の箇所に記載したように、それぞれの個別の試料からのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータについて、広範な品質管理（ＱＣ）を実施した（Ａ ｖａｎ ｄｅ Ｓｔｏｌｐｅら，２０１９、上掲）。ＱＣに合格した試料だけをさらなる解析に用いた。
【0113】
表３．ＧＳＥ１０００６データセットを用いるＴＧＦ－β、ＮＯＴＣＨ、及びＦＯＸＯ活性の組合せに基づくモデルの較正データ。それぞれの行は個別の試料を表わす。試料「ＮＳ」は非喫煙者由来の試料を表わす（較正正常試料）。試料「ＡＳ」は喫煙者の試料を表わす（較正異常試料）。全ての試料は品質管理に合格した。
【0114】
【表3】
【0115】
表４．ＧＳＥ１０００６データセットを用いるＴＧＦ－β及びＦＯＸＯ活性の組合せに基づくモデルの較正データ。それぞれの行は個別の試料を表わす。試料「ＮＳ」は非喫煙者由来の試料を表わす（較正正常試料）。試料「ＡＳ」は喫煙者の試料を表わす（較正異常試料）。全ての試料は品質管理に合格した。
【0116】
【表4】
【0117】
モデルを確認するために同じデータセットからのＣＯＰＤを有する喫煙者を用いた。結果を以下の表５～表７にさらに示す。
【0118】
線形モデル
線形（小／大）気道経路異常性スコアを提供する別のコンピュータモデルを開発した。本実施例では、それぞれの異常経路活性に１ポイントのスコアを割り当てた。測定したＴＧＦ－β若しくはＮｏｔｃｈ経路又はＦＯＸＯ活性が正常な非喫煙者の平均－１ＳＤ又は－２ＳＤ未満であれば、経路活性は異常とみなした（これらの閾値の計算については、上の表２及び図２Ａを参照）。そうでなければ、それぞれの経路にスコア「０」を割り当てた。点数を集計して、気道上皮が異常であり患者がおそらく肺がんを発症する高いリスクにある可能性を示した。スコアが高ければ、上皮が異常であり肺がんの発症のリスクにある可能性が高い。スコアはＡＰＡＳスコア（気道経路活性スコア）と呼ばれる。スコア０は正常（低リスク）であり、スコア３は最大で異常な上皮を示し、肺がんが発症する最大のリスクを付与することが推測される。
線形（小／大）気道経路異常性スコアを提供する別のコンピュータモデルを開発した。本実施例では、それぞれの異常経路活性に１ポイントのスコアを割り当てた。測定したＴＧＦ－β若しくはＮｏｔｃｈ経路又はＦＯＸＯ活性が正常な非喫煙者の平均－１ＳＤ又は－２ＳＤ未満であれば、経路活性は異常とみなした（これらの閾値の計算については、上の表２及び図２Ａを参照）。そうでなければ、それぞれの経路にスコア「０」を割り当てた。点数を集計して、気道上皮が異常であり患者がおそらく肺がんを発症する高いリスクにある可能性を示した。スコアが高ければ、上皮が異常であり肺がんの発症のリスクにある可能性が高い。スコアはＡＰＡＳスコア（気道経路活性スコア）と呼ばれる。スコア０は正常（低リスク）であり、スコア３は最大で異常な上皮を示し、肺がんが発症する最大のリスクを付与することが推測される。
【0119】
コンピュータモデルのバリデーション
続いてバリデーションの目的のため、早期の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）又は長期のＣＯＰＤを有する喫煙者のＧＳＥ１０００６データセットからの小気道上皮の独立のデータを用いて、喫煙者における異常な上皮の状態をスコア付けした。
続いてバリデーションの目的のため、早期の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）又は長期のＣＯＰＤを有する喫煙者のＧＳＥ１０００６データセットからの小気道上皮の独立のデータを用いて、喫煙者における異常な上皮の状態をスコア付けした。
【0120】
線形コンピュータモデルを用いる気道上皮経路異常性スコア（ＡＰＡＳ）の計算
本実験では、健康な非喫煙者の小気道の上皮細胞（「正常な」気道上皮）において測定したそれぞれの経路活性の平均及び分散に基づいて閾値を計算した。より具体的には、正常な上皮細胞におけるＴＧＦ－β、Ｎｏｔｃｈ、及びＦＯＸＯの活性の平均及び標準偏差を、本明細書に記載した経路解析によって決定した。この値を得られた１ＳＤ及び２ＳＤの閾値とともに表２及びこの表に続く節にまとめ、図２Ａに示す。
本実験では、健康な非喫煙者の小気道の上皮細胞（「正常な」気道上皮）において測定したそれぞれの経路活性の平均及び分散に基づいて閾値を計算した。より具体的には、正常な上皮細胞におけるＴＧＦ－β、Ｎｏｔｃｈ、及びＦＯＸＯの活性の平均及び標準偏差を、本明細書に記載した経路解析によって決定した。この値を得られた１ＳＤ及び２ＳＤの閾値とともに表２及びこの表に続く節にまとめ、図２Ａに示す。
【0121】
データセットＧＳＥ１０００６を用いてＴＧＦ－β経路について例示的に示すように（図２Ａ及び図２Ｂを参照）、閾値を平均経路活性マイナス２ＳＤと定義した。閾値は正常から異常な低ＴＧＦ－β活性への遷移を示す。２ＳＤ閾値を小気道上皮について示す。経路活性が定義した閾値／水平線未満であると判定されれば、試料は異常な経路活性を有するとみなした。喫煙者のサブグループが、特に小気道において異常なＴＧＦ－β経路活性を有していることが見られる（図２Ｂ参照）。この場合には、異常な経路活性は腫瘍抑制性ＴＧＦ－β経路活性の喪失によって特徴付けられる。この群の対象は、気道がんを発症する増大したリスクにあると推察される。
【0122】
線形モデルについて、これらの閾値に基づいて、評価した経路活性のそれぞれについて経路異常性因子を割り当てた。経路活性が異常であると判定した場合には因子「１」を割り当て、そうでない場合には「０」を割り当てた。例えば、ＴＧＦ－β経路の活性がこの閾値未満であると判定された場合には、それぞれの経路に１ポイントのスコアを割り当てた。ＦＯＸＯ活性に関しても対応する見解が適用される。次いで経路異常性因子を合計してＡＰＡＳスコアを得た。
【0123】
線形モデルを用いるバリデーションの目的のため、小気道上皮における正常な経路活性からの偏差を評価し、ＴＧＦ－β経路活性とＦＯＸＯ転写因子活性との組合せに基づいてＡＰＡＳスコアを決定した。ＡＰＡＳスコア「０」は正常な気道上皮を表わす（低リスク）。スコアが高ければ、気道上皮が異常である確率が高い。バリデーションのために用いた全ての試料は、本明細書に記載したＱＣに合格した。バリデーションの結果を、較正データとともに表５に示す。
【0124】
表５．ＴＧＦ－βとＦＯＸＯの活性の組合せに基づく線形モデルの較正及びバリデーションの結果。較正結果は表４に示した結果に対応する。バリデーションは、ＧＳＥ１０００６データセットからの早期（試料「ｅＣＯＰＤ」）及び確定したＣＯＰＤ（試料「ＣＯＰＤ」）を有する喫煙者からの試料を用いて実施した。全ての試料は本明細書に記載したＱＣに合格した。
【0125】
【表5】
【0126】
線形モデルを用いると、異常な気道上皮を有する個体の発生率は確定したＣＯＰＤを有する喫煙者群で最大であり、早期ＣＯＰＤを有する群では少なかった。これは、ＣＯＰＤ患者における肺がんの予想された全リスクと一致する。したがって、モデルは予想した通りに機能した。
【0127】
セントロイドモデルのバリデーション
同じデータセット（ＧＳＥ１０００６）からの早期の及び確定したＣＯＰＤを有する喫煙者を用いて、このモデルを確認した。このモデルでは、試料で見出された経路活性の、正常／健康な経路活性のクラスター及び異常な上皮経路活性との距離スコアを計算する。このモデルの較正に基づいて、このスコアは、分析した試料が正常な小気道上皮とみなされるか異常とみなされるかを定義する。このモデルは、ＴＧＦ－βとＦＯＸＯの活性の組合せ（表６参照）又はＴＧＦ－β、ＦＯＸＯ、及びＮｏｔｃｈ活性の組合せ（表７参照）とともに用いることができる。
同じデータセット（ＧＳＥ１０００６）からの早期の及び確定したＣＯＰＤを有する喫煙者を用いて、このモデルを確認した。このモデルでは、試料で見出された経路活性の、正常／健康な経路活性のクラスター及び異常な上皮経路活性との距離スコアを計算する。このモデルの較正に基づいて、このスコアは、分析した試料が正常な小気道上皮とみなされるか異常とみなされるかを定義する。このモデルは、ＴＧＦ－βとＦＯＸＯの活性の組合せ（表６参照）又はＴＧＦ－β、ＦＯＸＯ、及びＮｏｔｃｈ活性の組合せ（表７参照）とともに用いることができる。
【0128】
表６．ＧＳＥ１０００６データセットからの早期の及び確定したＣＯＰＤを有する喫煙者からの試料を用いたＦＯＸＯとＴＧＦ－βの活性の組合せに基づくセントロイドモデルのバリデーションデータ。全ての試料は本明細書に記載したＱＣに合格した。
【0129】
【表6】
【0130】
表７．ＧＳＥ１０００６データセットからの早期の及び確定したＣＯＰＤを有する喫煙者からの試料を用いたＴＧＦ－β、ＮＯＴＣＨ、及びＦＯＸＯの活性の組合せに基づくセントロイドモデルのバリデーションデータ。全ての試料は本明細書に記載したＱＣに合格した。
【0131】
【表7】
【0132】
モデルは、いくつかの早期ＣＯＰＤ試料を正常とスコア付けするが、確定した／長期のＣＯＰＤ試料については常に異常とスコア付けすることが見られ、これはこれら２つの群における肺がんの予想されたリスクと一致する。
【0133】
本方法の臨床使用
明らかに全ての（多量）喫煙者が肺がんを発症するわけではなく、これが気道異常性因子及び／又はリスクスコアが喫煙者のサブグループのみで検知される理由である。喫煙者の間でのこの変動も、異常な気道上皮を有する対象、特に喫煙者の識別を可能にする本発明の手段及び方法に対するニーズを示している。
明らかに全ての（多量）喫煙者が肺がんを発症するわけではなく、これが気道異常性因子及び／又はリスクスコアが喫煙者のサブグループのみで検知される理由である。喫煙者の間でのこの変動も、異常な気道上皮を有する対象、特に喫煙者の識別を可能にする本発明の手段及び方法に対するニーズを示している。
【0134】
本発明は、多量喫煙者における不必要な侵襲的診断手技を低減することが期待され、高リスク患者の早期の最小侵襲性処置を可能にする。
【0135】
さらに、気道上皮細胞における経路解析は肺がんのさらなる診断検査になり、全身的（標的）療法の選択を可能にする。
１．記載した方法を用い、スクリーニングのためのＣＴスキャンのような画像技術に伴う放射線への繰り返し曝露を避けて、肺がんの発症の高いリスクを有する前悪性変化について喫煙者をスクリーニングすることができる。上皮細胞は気道上皮から得ることができ、ＴＧＦ－β／Ｎｏｔｃｈ／ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路活性の組合せ又はこれらの経路活性のうち少なくとも１つ、好ましくはＮｏｔｃｈ及びＴＧＦ－βの決定を実施することができる。スクリーニングモデルにおいて結果を解釈して前悪性変化が存在するリスクを予測し、喫煙に伴う肺がんの発症の高いリスクを示すことができる。
２．喫煙者が病状（例えば咳又は息切れ）又は異常な画像知見を呈すれば、例えばＢＡＬを用いて気道上皮から上皮細胞を得ることができ、ＴＧＦ－β／Ｎｏｔｃｈ／ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路活性の組合せの決定を実施して、スクリーニングモデルにおいて結果を解釈して前悪性変化が存在するリスクを予測し、喫煙に伴う肺がんの発症の高いリスクを示すことができる。
３．胸部Ｘ線又はＣＴのような画像で肺に病変が検知され、これが悪性病変か否かが不明であれば、ＢＡＬ細胞について経路解析を実施することによって、特に喫煙者にとっての悪性の可能性に関する病変の性質についての補完的な情報が提供される。
４．診断手技、例えば気管支鏡の読み出しにおける経路活性に基づく分類を集約して、肺がんの確率を評価する手法の感度／特異性を改善することができる。
５．上記シナリオのいずれにおいても、計算したリスクスコアを用いて、緊密なモニタリング及び／又は化学的予防のために患者を階層化することができる。
６．記載した方法を用い、スクリーニングのためのＣＴスキャンのような画像技術に伴う放射線への繰り返し曝露を避けて、肺がんの発症の高いリスクを有する前悪性変化について喫煙者をスクリーニングすることができる。ＢＡＬ又は他の手段を用いて上皮細胞を気道上皮から得ることができ、ＴＧＦ－β／ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路活性の組合せを実施することができ、コンピュータモデルにおいて結果を解釈して気道上皮異常性スコアを提供し、（扁平上皮）肺がんの発症のリスクを示す前悪性変化が存在する確率を示すことができる。
７．喫煙者が長引く咳のような病状を呈すれば、ＢＡＬ又は気管擦過手法を用いて気道上皮から上皮細胞を得ることができ、この細胞試料から単離されたＲＮＡについてＴＧＦ－β／ＨＨ／ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路活性の組合せの決定を実施して、コンピュータモデルにおいて結果を解釈して気道上皮異常性スコアを提供し、（扁平上皮）肺がんの発症のリスクを示す前悪性変化が存在する確率を示すことができる。
８．胸部Ｘ線又はＣＴのような画像で肺に病変が検知され、これが悪性病変か否かが不明であれば、ＢＡＬ／擦過によって得られた気道上皮細胞について記載した検査を実施することによって、特に喫煙者についても、悪性の可能性に関する病変の性質についての補完的な情報が提供される。
１．記載した方法を用い、スクリーニングのためのＣＴスキャンのような画像技術に伴う放射線への繰り返し曝露を避けて、肺がんの発症の高いリスクを有する前悪性変化について喫煙者をスクリーニングすることができる。上皮細胞は気道上皮から得ることができ、ＴＧＦ－β／Ｎｏｔｃｈ／ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路活性の組合せ又はこれらの経路活性のうち少なくとも１つ、好ましくはＮｏｔｃｈ及びＴＧＦ－βの決定を実施することができる。スクリーニングモデルにおいて結果を解釈して前悪性変化が存在するリスクを予測し、喫煙に伴う肺がんの発症の高いリスクを示すことができる。
２．喫煙者が病状（例えば咳又は息切れ）又は異常な画像知見を呈すれば、例えばＢＡＬを用いて気道上皮から上皮細胞を得ることができ、ＴＧＦ－β／Ｎｏｔｃｈ／ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路活性の組合せの決定を実施して、スクリーニングモデルにおいて結果を解釈して前悪性変化が存在するリスクを予測し、喫煙に伴う肺がんの発症の高いリスクを示すことができる。
３．胸部Ｘ線又はＣＴのような画像で肺に病変が検知され、これが悪性病変か否かが不明であれば、ＢＡＬ細胞について経路解析を実施することによって、特に喫煙者にとっての悪性の可能性に関する病変の性質についての補完的な情報が提供される。
４．診断手技、例えば気管支鏡の読み出しにおける経路活性に基づく分類を集約して、肺がんの確率を評価する手法の感度／特異性を改善することができる。
５．上記シナリオのいずれにおいても、計算したリスクスコアを用いて、緊密なモニタリング及び／又は化学的予防のために患者を階層化することができる。
６．記載した方法を用い、スクリーニングのためのＣＴスキャンのような画像技術に伴う放射線への繰り返し曝露を避けて、肺がんの発症の高いリスクを有する前悪性変化について喫煙者をスクリーニングすることができる。ＢＡＬ又は他の手段を用いて上皮細胞を気道上皮から得ることができ、ＴＧＦ－β／ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路活性の組合せを実施することができ、コンピュータモデルにおいて結果を解釈して気道上皮異常性スコアを提供し、（扁平上皮）肺がんの発症のリスクを示す前悪性変化が存在する確率を示すことができる。
７．喫煙者が長引く咳のような病状を呈すれば、ＢＡＬ又は気管擦過手法を用いて気道上皮から上皮細胞を得ることができ、この細胞試料から単離されたＲＮＡについてＴＧＦ－β／ＨＨ／ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路活性の組合せの決定を実施して、コンピュータモデルにおいて結果を解釈して気道上皮異常性スコアを提供し、（扁平上皮）肺がんの発症のリスクを示す前悪性変化が存在する確率を示すことができる。
８．胸部Ｘ線又はＣＴのような画像で肺に病変が検知され、これが悪性病変か否かが不明であれば、ＢＡＬ／擦過によって得られた気道上皮細胞について記載した検査を実施することによって、特に喫煙者についても、悪性の可能性に関する病変の性質についての補完的な情報が提供される。
【0136】
ＣＤＳの適用
（本明細書で開示したように、対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを決定するように構成された臨床判断補助（ＣＤＳ）システムを図式的に示す）図３を参照して、臨床判断補助（ＣＤＳ）システム１０は、好適に構成されたコンピュータ１２として実行される。コンピュータ１２は、ハードドライブ若しくはその他の磁気格納媒体、光学ディスク若しくは別の光学格納媒体、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、フラッシュメモリ、若しくは別の電子格納媒体、ネットワークサーバ、その他の非一時的格納媒体（示していない）に格納された好適なソフトウェア、ファームウェア、又はその他の命令を実行することによってＣＤＳシステム１０として作動するように構成される。実例的なＣＤＳシステム１０は実例的なコンピュータ１２によって具現化されているが、より一般的には、ＣＤＳシステムは、本明細書で説明した臨床判断補助方法を実施するように構成されたデジタルプロセッサを含むデジタルプロセッシングデバイス又は装置によって具現化される。例えば、デジタルプロセッシングデバイスは、ハンドヘルドデバイス（例えばパーソナルデータアシスタント又はＣＤＳアプリケーションを操作するスマートフォン）、ノートブックコンピュータ、デスクトップコンピュータ、タブレットコンピュータ若しくはデバイス、リモートネットワークサーバ、その他である。コンピュータ１２又はその他のデジタルプロセッシングデバイスは、典型的にはそれを介して臨床判断補助勧告を含む情報が医療従事者に表示されるディスプレイデバイス１４を含むか、それと操作可能に連結されている。コンピュータ１２又はその他のデジタルプロセッシングデバイスは、典型的にはまた、それを介して医療従事者がＣＤＳシステム１０を制御するための操作コマンド、ＣＤＳシステム１０によって使用されるデータ、その他の情報を入力できる実例的なキーボード１６、若しくはマウス、トラックボール、トラックパッド、接触感受性スクリーン（場合によりディスプレイデバイス１４と一体化されている）、又は別のポインター系ユーザ入力デバイス等の１つ又は複数のユーザ入力デバイスを含むか、これらと操作可能に連結されている。
（本明細書で開示したように、対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを決定するように構成された臨床判断補助（ＣＤＳ）システムを図式的に示す）図３を参照して、臨床判断補助（ＣＤＳ）システム１０は、好適に構成されたコンピュータ１２として実行される。コンピュータ１２は、ハードドライブ若しくはその他の磁気格納媒体、光学ディスク若しくは別の光学格納媒体、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、フラッシュメモリ、若しくは別の電子格納媒体、ネットワークサーバ、その他の非一時的格納媒体（示していない）に格納された好適なソフトウェア、ファームウェア、又はその他の命令を実行することによってＣＤＳシステム１０として作動するように構成される。実例的なＣＤＳシステム１０は実例的なコンピュータ１２によって具現化されているが、より一般的には、ＣＤＳシステムは、本明細書で説明した臨床判断補助方法を実施するように構成されたデジタルプロセッサを含むデジタルプロセッシングデバイス又は装置によって具現化される。例えば、デジタルプロセッシングデバイスは、ハンドヘルドデバイス（例えばパーソナルデータアシスタント又はＣＤＳアプリケーションを操作するスマートフォン）、ノートブックコンピュータ、デスクトップコンピュータ、タブレットコンピュータ若しくはデバイス、リモートネットワークサーバ、その他である。コンピュータ１２又はその他のデジタルプロセッシングデバイスは、典型的にはそれを介して臨床判断補助勧告を含む情報が医療従事者に表示されるディスプレイデバイス１４を含むか、それと操作可能に連結されている。コンピュータ１２又はその他のデジタルプロセッシングデバイスは、典型的にはまた、それを介して医療従事者がＣＤＳシステム１０を制御するための操作コマンド、ＣＤＳシステム１０によって使用されるデータ、その他の情報を入力できる実例的なキーボード１６、若しくはマウス、トラックボール、トラックパッド、接触感受性スクリーン（場合によりディスプレイデバイス１４と一体化されている）、又は別のポインター系ユーザ入力デバイス等の１つ又は複数のユーザ入力デバイスを含むか、これらと操作可能に連結されている。
【0137】
ＣＤＳシステム１０は、対象（例えば病院の患者、又は腫瘍専門医、臨床医、若しくはその他の医療従事者によって処置されている外来患者、又はがんのスクリーニング若しくはその他のある医学診断を受けていて、ある種の気道がん若しくは気道がんを発症する素因を有していることが知られているか若しくはその疑いがある人）に関する入力情報を受容する。ＣＤＳシステム１０は、ディスプレイデバイス１４を介して（又は音声合成器若しくは人が知覚できる出力を提供するその他のデバイスを介して）医療従事者に提示される臨床判断補助勧告を生成するために、種々のデータ解析アルゴリズムをこの入力情報に適用する。いくつかの実施形態では、これらのアルゴリズムは、臨床ガイドラインを患者に適用するステップを含む。臨床ガイドラインは、臨床ガイドラインによる方向付けを容易にするための臨床的「フローチャート」の形態の、典型的には医療専門家のパネルの勧告に基づいて構築され、任意選択でフォーマット化された標準的な又は「カノニカルな」処置勧告の格納されたセットである。種々の実施形態では、ＣＤＳ１０のデータプロセッシングアルゴリズムはさらに又はその代わりに、本明細書で開示したマシンラーニング法のような臨床判断の勧告を抽出するために入力情報について実施される種々の診断的又は臨床的な検査アルゴリズムを含む。
【0138】
本明細書で開示した実例的なＣＤＳシステム（例えばＣＤＳシステム１０）において、ＣＤＳデータ解析アルゴリズムは、１つ又は複数の医学実験室１８によって取得されたゲノム及び／又はプロテオームの入力情報について実施される１つ又は複数の診断的又は臨床的な検査アルゴリズムを含む。これらの実験室は「オンサイト」、即ち対象が医学検査及び／又は処置を受けている病院又はその他の場所に様々に位置していてもよく、又は「オフサイト」で、例えば対象から抽出された対象の試料を（郵便又は別の送達サービスを介して）受け入れる特化された又は集中された実験室であってもよい。
【0139】
試料は実験室によってゲノム又はプロテオームの情報を生成するように処理される。例えば、試料は、（当技術において遺伝子チップ、ＤＮＡチップ、バイオチップ等と様々に称される）マイクロアレイを用いて、又は着目した遺伝子の発現レベル等の証拠となるゲノム又はプロテオームの情報を測定する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）プロセッシングによって、例えば遺伝子から転写されるメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）のレベル又は遺伝子から転写されるｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質のレベルの形態で処理される。別の例として、試料は遺伝子シーケンシング実験室によって、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の配列を生成するように、又はＲＮＡ配列、コピー数の変動、メチル化、その他を生成するように処理される。その他の意図される測定アプローチには、病理学スライドの上で実施される免疫組織化学（ＩＨＣ）、細胞学、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、近接ライゲーションアッセイ、その他が含まれる。マイクロアレイプロセッシング、マススペクトル、遺伝子シーケンシング、又はその他の実験室手法によって生成され得るその他の情報には、メチル化情報が含まれる。そのようなゲノム及び／又はプロテオームの測定の様々な組合せも実施される。
【0140】
いくつかの実施形態では、医学実験室１８は対象の試料についていくつかの標準化されたデータ取得を実施し、それにより大量のゲノム及び／又はプロテオームのデータを生成する。例えば、標準化されたデータ取得手法によって、１つ又は複数の染色体若しくは染色体の部分について、又はゲノム全体について（任意選択で整列された）ＤＮＡ配列が生成される。標準マイクロアレイを応用することによって、多数の遺伝子の発現レベル、種々のメチル化データ等の数千又は数万のデータアイテムを生成することができる。同様に、ＰＣＲ系測定を用いて、選択された遺伝子の発現レベルを測定することができる。この大量のゲノム及び／又はプロテオームのデータ又はそれらの選択された部分は、処理すべきＣＤＳシステム１０の入力であり、それにより臨床判断補助勧告を立案するための臨床的に有用な情報が開発される。
【0141】
開示したＣＤＳシステム及び関連する方法は、種々の細胞シグナル伝達経路の活性を評価し、対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを決定するためのゲノム及び／又はプロテオームのデータを処理するステップに関する。しかし、開示したＣＤＳシステム（例えばＣＤＳシステム１０）は、バイタルサインのモニタリングデータ、患者の病歴データ、患者の人口学的データ（例えば性別、年齢、その他）、患者の医学画像データ、その他の種々の患者データに基づく格納された臨床ガイドラインに従って臨床判断補助勧告を生成するステップ等の、多様な追加的能力を任意選択でさらに含むことを理解されたい。或いは、いくつかの実施形態では、ＣＤＳシステム１０の能力は、本明細書で開示したように、細胞シグナル伝達経路の活性を評価し、対象が異常な気道上皮を有し、及び／又は気道がんを発症するリスクにあるか否かを示すリスクスコアを決定するためのゲノム及び／又はプロテオームのデータ解析を実施するステップのみに限られてもよい。
【0142】
例示的な図３を引き続いて参照して、ＣＤＳシステム１０は、対象の試料において測定された細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の発現レベル２０に基づくが、それには制限されない、対象におけるＴＧＦ－β経路、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ経路、及びＮｏｔｃｈ経路（Ｐｔ、Ｐｐ、Ｐｎ）からなる群から選択される２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性２２を推測する。
【0143】
細胞シグナル伝達経路を形成するタンパク質カスケードの一部である中間タンパク質のような細胞シグナル伝達経路の制御タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの測定は制御タンパク質の発現レベルの間接的な尺度であり、実際の制御タンパク質の発現レベルと強く相関することも相関しないこともある（細胞シグナル伝達経路の全体の活性とはあまり相関しない）。細胞シグナル伝達経路は標的遺伝子の転写を直接制御し、したがって標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現レベルはこの制御活性の直接の結果である。したがって、ＣＤＳシステム１０は、細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の発現レベル（代理の測定としてのｍＲＮＡ又はタンパク質のレベル）に基づいて２つ以上の細胞シグナル伝達経路の活性を推測する。これにより、ＣＤＳシステム１０が標的遺伝子の測定された発現レベルによって提供される直接の情報に基づいて経路の活性を推測することが保証される。
【0144】
推測された活性は次に、本明細書に詳細に記載したように、対象が気道がんを発症するリスクを示すリスクスコアを決定するステップ２４のために用いられる。リスクスコアは、推測された活性の組合せに基づく。例えば、リスクスコアは、本明細書及びそのそれぞれがそれぞれリスクスコア、多重経路スコア（ＭＰＳ）を計算する目的のために参照により全体として本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４１７４００３、ＷＯ２０１６０６２８９２、及びＷＯ２０１６０６２８９３に詳細に記載したように計算される「多経路スコア」（ＭＰＳ）である。
【0145】
決定されたＭＰＳに基づいて、ＣＤＳシステム１０は、本実施例では、対象が気道がんを発症する指示された様々なリスクを伴う複数のリスクグループのうち少なくとも１つに対象を割り当て（２６）、及び／又は指示されたリスクに基づいて対象に勧告する処置を決定（２８）する。
【0146】
ＣＤＳシステム１０がリスクスコアを１つ又は複数のさらなる予知検査から得られた１つ又は複数のさらなるリスクスコアと組み合わせてリスクスコアの組合せを得るように構成され、リスクスコアの組合せが、対象が気道がんを発症するリスクを示すこともさらに可能である。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図3】