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特許7584163グリシンＮ－メチルトランスフェラーゼ増強剤、その調製方法及び使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-07
(45)【発行日】2024-11-15
(54)【発明の名称】グリシンＮ－メチルトランスフェラーゼ増強剤、その調製方法及び使用
(51)【国際特許分類】
C07D 213/82 20060101AFI20241108BHJP
C07D 401/12 20060101ALI20241108BHJP
A61K 31/444 20060101ALI20241108BHJP
A61K 31/497 20060101ALI20241108BHJP
A61K 31/501 20060101ALI20241108BHJP
A61K 31/506 20060101ALI20241108BHJP
A61K 31/53 20060101ALI20241108BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20241108BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20241108BHJP
A61P 13/08 20060101ALI20241108BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241108BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241108BHJP
A61K 31/4402 20060101ALI20241108BHJP
【ＦＩ】
C07D213/82 CSP
C07D401/12
A61K31/444
A61K31/497
A61K31/501
A61K31/506
A61K31/53
A61P1/16
A61P1/18
A61P13/08
A61P35/00
A61P43/00 105
A61K31/4402
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2022580223
(86)(22)【出願日】2020-12-25
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-14
(86)【国際出願番号】 CN2020139547
(87)【国際公開番号】W WO2022134043
(87)【国際公開日】2022-06-30
【審査請求日】2023-05-26
(73)【特許権者】
【識別番号】505302362
【氏名又は名称】高雄醫學大學
【氏名又は名称原語表記】ＫＡＯＨＳＩＵＮＧ ＭＥＤＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１００， Ｓｈｉｈ－ｃｈｕａｎ １ｓｔ Ｒｏａｄ， Ｓａｎｍｉｎ Ｄｉｓｔ． Ｋａｏｈｓｉｕｎｇ Ｃｉｔｙ， Ｔａｉｗａｎ
(74)【代理人】
【識別番号】100102842
【弁理士】
【氏名又は名称】葛和 清司
(72)【発明者】
【氏名】チェン，イ－ミン
(72)【発明者】
【氏名】ツェン，チェン－チ
(72)【発明者】
【氏名】チェン，イェ－ロン
(72)【発明者】
【氏名】ツェン，チ－フア
(72)【発明者】
【氏名】イェン，チア－フン
(72)【発明者】
【氏名】カン，ラジニ
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，ミン－フイ
【審査官】三木 寛
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／０１７５８９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０３８８０７０７（ＣＮ，Ａ）
【文献】Journal of Drug Targeting，2019年，Vol.27(3)，p.300-305
【文献】Journal of Molecular Structure，2017年，Vol.1135，p.82-97
【文献】Bulletin of the Chemical Society of Ethiopia，2016年，Vol.30(1)，p.101-110
【文献】Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2017年，Vol.114(5)，p.1033-1038
【文献】Journal of Chemical Crystallography，2012年，Vol.42(7)，p.668-672
【文献】Chemical & Pharmaceutical Bulletin，1999年，Vol.47(7)，p.944-949
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（I）の構造を有するニコチノヒドラジド誘導体、その立体異性体又は薬理学的に許容される塩であって、【化1】
【請求項2】
ニコチノヒドラジド誘導体を調製する方法であって、２－アミノニコチン酸エチルをヒドラジン水和物と反応させて２－カルボヒドラジドを形成するステップと、
前記２－カルボヒドラジドと２－アセチルピリジンとの縮合反応を行い、以下の構造を有するＮ’－(１－(ピリジン－２－イル)エチリデン)－２－カルボヒドラジドを形成するステップと、を含むことを特徴とする、前記方法。
【化2】
【請求項3】
請求項１に記載のニコチノヒドラジド誘導体、その立体異性体又は薬理学的に許容される塩の有効量を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項4】
式（I）の構造を有するニコチノヒドラジド誘導体、その立体異性体又は薬理学的に許容される塩の、癌疾患の治療薬の調製における使用であって、【化3】
【請求項5】
前記癌疾患が、肝臓癌、前立腺癌及び膵臓癌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項6】
前記肝臓癌は肝細胞癌であることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項7】
ニコチノヒドラジド誘導体、その立体異性体又は薬理学的に許容される塩は、グリシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）を高める作用を有することを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、癌細胞を阻害するための医薬組成物、特に、グリシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）の発現を増強することにより癌細胞を阻害するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
肝細胞癌（ＨＣＣ）は、発生率が増加している世界的な健康負担である。
肝臓癌は、世界で五番目に多い癌であり、癌による死亡原因の三番目に多いがんである。診断が遅れ、治療の選択肢が少なく、再発率が高いため、ＨＣＣの発生率は依然として死亡率とほぼ同じである。ＨＣＣの治療選択肢は多くない。現在、食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されているＨＣＣ治療薬は、ソラフェニブとレゴレフェニブである。これらの薬は一部の人にしか効果がないが、副作用があり、患者はすぐに薬剤耐性を発症する。従って、ＨＣＣに対して満たされていない高いニーズがある。ＨＣＣに対する新薬の開発は非常に遅く、多くの化合物は臨床試験で失敗した。患者の生存率を改善し、病気のコントロールに役立てるための予防薬、新しい治療法、又は薬物の組み合わせ戦略の開発が緊急に必要とされている。
肝臓癌は、世界で五番目に多い癌であり、癌による死亡原因の三番目に多いがんである。診断が遅れ、治療の選択肢が少なく、再発率が高いため、ＨＣＣの発生率は依然として死亡率とほぼ同じである。ＨＣＣの治療選択肢は多くない。現在、食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されているＨＣＣ治療薬は、ソラフェニブとレゴレフェニブである。これらの薬は一部の人にしか効果がないが、副作用があり、患者はすぐに薬剤耐性を発症する。従って、ＨＣＣに対して満たされていない高いニーズがある。ＨＣＣに対する新薬の開発は非常に遅く、多くの化合物は臨床試験で失敗した。患者の生存率を改善し、病気のコントロールに役立てるための予防薬、新しい治療法、又は薬物の組み合わせ戦略の開発が緊急に必要とされている。
【0003】
ＧＮＭＴは、ＨＣＣ用の腫瘍抑制遺伝子（ＴＳＧ）である。ＧＮＭＴには、正常な哺乳類の肝臓の細胞質タンパク質の１～３%が含まれているが、ＨＣＣ患者の７５％以上ではＧＮＭＴが下方制御されている。ＧＮＭＴは、一炭素代謝経路における主要な酵素の一つである。Ｓ－アデノシルメチオニンとＳ－アデノシルホモシスチンの比率を調節することで遺伝的安定性に影響を与え、肝細胞の主要な葉酸結合タンパク質として機能する。更に、以前の研究では、ＧＮＭＴが副業タンパク質（Moonlighting proteins）の一例であることが示唆された。ＧＮＭＴは、そのリン酸化状態に基づいて、代謝酵素としての機能から４Ｓ多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）結合タンパク質に機能を切り替えることができ、サブユニットの構成が変化する。ＧＮＭＴの細胞局在を細胞質から核に変えることにより、ＧＮＭＴは転写補助因子として作用し、解毒（及び／又は他の標的）遺伝子の発現を調節することができる。
【0004】
以前に、ＧＮＭＴ－／－マウスモデルにおいて、オスとメスの両方のＧＮＭＴ－／－マウスが４～１１週齢で慢性肝炎を発症することが発見された。これらのＧＮＭＴ－／－マウスを生後２４ヶ月まで追跡した結果、メスのＧＮＭＴ－／－マウスのすべてとオスのＧＮＭＴ－／－マウスの半数がＨＣＣを発症したことが示された。対照的に、ＧＮＭＴの再発現は癌細胞の細胞増殖を阻害する。最も重要なことは、ＧＮＭＴを過剰発現するトランスジェニックマウスは、アフラトキシン（AFB１）による発癌と肝臓癌の進行を防いだことである。さらに重要なことに、ＧＮＭＴはＨｕｈ７細胞の増殖を抑制し、インビトロとインビボの両方でラパマイシン治療に対して感作することが実証された。最近、ＧＮＭＴの過剰発現がＨｕｈ７細胞をラパマイシンだけでなく、インビトロとインビボの両方でソラフェニブ治療に対しても感作することがさらに実証された。したがって、ＧＮＭＴ欠乏症と肝臓障害との間の強い関連性、及び肝発癌に対するＧＮＭＴの保護的役割を考慮すると、ＧＮＭＴ発現を増強できる小分子化合物の正確な同定は、ＨＣＣの治療に重要な意味を持つ。
【0005】
予備的結果は、小分子Ｋ７８がＨｕｈ７細胞において２．５μＭのＩＣ５０値を有し、ＨＣＣ治療の有力なリードであることを示した。医薬品化学チームの協力により、Ｋ７８に関する包括的な構造活性相関（ＳＡＲ）研究が行われた。本発明では、Ｋシリーズ化合物（Ｋ７８誘導体）を合成して、ＧＮＭＴプロモーターレポーター活性を誘導するＫ７８及びその誘導体の能力を同定する。
【0006】
出願人は、従来技術の欠点を考慮して克服するために本発明を開発した。以下、本発明の概要を説明する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、癌細胞におけるＧＮＭＴ発現の増加を介して癌を治療するための新規ＧＮＭＴ増強剤を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
したがって、本発明は、ニコチノヒドラジド誘導体、その立体異性体又は薬理学的に許容される塩を提供し、前記ニコチノヒドラジド誘導体は、式（I）の構造を有し、
Ｘ、ＹとＺのそれぞれがＮとＣＨのいずれかであり、Ｘ、ＹとＺの少なくとも一つがＣＨであり、Ｘ、ＹとＺの少なくとも一つがＮであり、ＲがＯＨとＮＨ２のいずれかである。
【化1】
【0009】
式（Ｉ）を有する化合物の好ましい実施形態を合成するために、本発明は、ニコチノヒドラジド誘導体を調製する方法を提供し、前記方法は、ニコチン酸エチルをヒドラジン水和物と反応させてカルボヒドラジドを形成するステップと、前記カルボヒドラジドとアセチルピリジンとの縮合反応を行い、以下の構造を有するN’－(１－(ピリジン－２－イル)エチリデン)－２－カルボヒドラジド（Ｋ１１７）を形成するステップと、を含む。
【化2】
【0010】
本発明は、有効量のニコチノヒドラジド誘導体、その立体異性体又はその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物をさらに提供し、ニコチノヒドラジド誘導体は式（Ｉ）の構造を有する。
【0011】
さらなる態様において、本発明は、癌疾患の治療における薬物を調製するための、上記のニコチノヒドラジド誘導体、その立体異性体又はその薬学的に許容される塩の使用を提供する。ニコチノヒドラジド誘導体は、式（Ｉ）の構造を有し、式（Ｉ）は、
で表され、
ここで、XがＮとＣＨのいずれかであり、ＹとＺのそれぞれがＣＨであり、ＲがＯＨとＮＨ２のいずれかである。
【化3】
ここで、XがＮとＣＨのいずれかであり、ＹとＺのそれぞれがＣＨであり、ＲがＯＨとＮＨ２のいずれかである。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】本発明のニコチノヒドラジド誘導体の好ましい実施形態を合成するフローチャートである。
【図2A】Ｋ７８の構造を示す。
【図2B】ＧＮＭＴの発現に対するＫ７８の効果を示す。
【図2C】ＧＮＭＴの発現に対するＫ７８の効果を示す。
【図2D】ＧＮＭＴの発現に対するＫ７８の効果を示す。
【図3A】インビトロとインビボでの肝臓癌細胞の増殖の阻害に対するＫ７８の効果を示す。
【図3B】インビトロとインビボでの肝臓癌細胞の増殖の阻害に対するＫ７８の効果を示す。
【図3C】インビトロとインビボでの肝臓癌細胞の増殖の阻害に対するＫ７８の効果を示す。
【図3D】インビトロとインビボでの肝臓癌細胞の増殖の阻害に対するＫ７８の効果を示す。
【図4A】Ｋ１０２の構造を示す。
【図4B】ＧＮＭＴの発現に対する化合物Ｋ１１７とＫ１０２の効果を示す。
【図4C】ＧＮＭＴの発現に対する化合物Ｋ１１７とＫ１０２の効果を示す。
【図4D】ＧＮＭＴの発現に対する化合物Ｋ１１７とＫ１０２の効果を示す。
【図5A】インビトロとインビボでの肝臓癌細胞の増殖の阻害に対するＫ１１７の効果を示す。
【図5B】インビトロとインビボでの肝臓癌細胞の増殖の阻害に対するＫ１１７の効果を示す。
【図5C】インビトロとインビボでの肝臓癌細胞の増殖の阻害に対するＫ１１７の効果を示す。
【図5D】インビトロとインビボでの肝臓癌細胞の増殖の阻害に対するＫ１１７の効果を示す。
【図5E】インビトロとインビボでの肝臓癌細胞の増殖の阻害に対するＫ１１７の効果を示す。
【図5F】インビトロとインビボでの肝臓癌細胞の増殖の阻害に対するＫ１１７の効果を示す。
【図6A】Ｋ９０の構造を示す。
【図6B】Ｍｙｃ発現に対するＧＮＭＴ誘導化合物の効果を示す。
【図6C】Ｍｙｃ発現に対するＧＮＭＴ誘導化合物の効果を示す。
【図6D】Ｍｙｃ発現に対するＧＮＭＴ誘導化合物の効果を示す。
【図6E】Ｍｙｃ発現に対するＧＮＭＴ誘導化合物の効果を示す。
【図6F】Ｍｙｃ発現に対するＧＮＭＴ誘導化合物の効果を示す。
【図6G】Ｍｙｃ発現に対するＧＮＭＴ誘導化合物の効果を示す。
【図6H】Ｍｙｃ発現に対するＧＮＭＴ誘導化合物の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明の一態様によれば、ニコチノヒドラジド誘導体、その立体異性体又は薬学的に許容される塩が提供される。一つの好ましい実施形態において、ニコチノヒドラジド誘導体は、式（Ｉ）の構造を有し、
ここで、Ｘ、ＹとＺのそれぞれがＮとＣＨのいずれかであり、Ｘ、ＹとＺの少なくとも一つがＣＨであり、Ｘ、ＹとＺの少なくとも一つがＮであり、ＲがＯＨとＮＨ２のいずれかである。
【化4】
【0014】
本明細書で使用される「ニコチノヒドラジド誘導体」という用語は、ニコチノヒドラジド誘導体、それらの立体異性体又はそれらの薬学的に許容される塩を指す。
【0015】
本発明の別の態様において、ニコチノヒドラジド誘導体、それらの立体異性体又はそれらの薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物が提供される。ニコチノヒドラジド誘導体、それらの立体異性体又はそれらの薬学的に許容される塩の定義は、上記の通りである。好ましくは、医薬組成物は、薬学的に許容される担体及び賦形剤のうちの少なくとも一つを更に含む。
【0016】
本発明のさらなる態様において、ニコチノヒドラジド誘導体の好ましい実施形態を調製するための方法が提供される。前記方法は、ニコチン酸エチルをヒドラジン水和物と反応させてカルボヒドラジドを形成するステップと、前記カルボヒドラジドとアセチルピリジンとの縮合反応を行い、以下の構造を有するN’－(１－(ピリジン－２－イル)エチリデン)－２－カルボヒドラジド（Ｋ１１７）を形成するステップと、を含む。
【化5】
【0017】
本発明によれば、前記ニコチン酸エチルが２－アミノニコチン酸エチルであり、前記カルボヒドラジドが２－カルボヒドラジドであり、前記アセチルピリジンが２－アセチルピリジンである。
【0018】
さらなる態様において、本発明は、有効量のニコチノヒドラジド誘導体、その立体異性体又はその薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物を提供する。ニコチノヒドラジド誘導体は、上記の式（Ｉ）の構造を有する。好ましくは、医薬組成物は、薬学的に許容される担体及び賦形剤のうちの少なくとも一つを更に含む。
【0019】
さらなる態様において、本発明は、癌疾患の治療における薬物を調製するための、上記のニコチノヒドラジド誘導体、その立体異性体及び薬学的に許容される塩の使用を提供する。前記ニコチノヒドラジド誘導体は、式（Ｉ）の構造を有し、
ここで、XがＮとＣＨのいずれかであり、ＹとＺのそれぞれがＣＨであり、ＲがＯＨとＮＨ２のいずれかである。
【化6】
【0020】
本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、制御されていない又は無秩序な細胞増殖、細胞分化の減少、周囲の組織に侵入する不適切な能力、及び／又は異所性部位での新しい成長を確立する能力によって特徴付けられる細胞障害を指す。「癌」という用語には、固形腫瘍及び血液由来の腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。「癌」という用語には、皮膚、組織、臓器、骨、軟骨、血液及び血管の疾患が含まれる。「癌」という用語は、原発性及び転移性の癌を更に含む。本発明における癌の非限定的な例には、肝臓癌、前立腺癌及び膵臓癌が含まれる。好ましくは、肝臓癌は肝細胞癌である。
【0021】
本発明の医薬組成物は、癌細胞におけるＧＮＭＴ発現の増強を介して癌を治療するために使用される。
【実施例】
【0022】
１、ニコチノヒドラジド誘導体の合成
本発明のニコチノヒドラジド誘導体の好ましい実施形態（Ｋ１１７）を合成するフローチャートを示す図１を参照されたい。２－アミノニコチン酸エチルをヒドラジン水和物と反応させて、２－カルボヒドラジドを得た。図１に示すように、２－カルボヒドラジドは２－アセチルピリジンと縮合反応し、N’－(１－(ピリジン－２－イル)エチリデン)－２－カルボヒドラジド（Ｋ１１７）を得た。
本発明のニコチノヒドラジド誘導体の好ましい実施形態（Ｋ１１７）を合成するフローチャートを示す図１を参照されたい。２－アミノニコチン酸エチルをヒドラジン水和物と反応させて、２－カルボヒドラジドを得た。図１に示すように、２－カルボヒドラジドは２－アセチルピリジンと縮合反応し、N’－(１－(ピリジン－２－イル)エチリデン)－２－カルボヒドラジド（Ｋ１１７）を得た。
【0023】
別の態様において、異なるニコチン酸エチルを使用して、他のＫ系列化合物を合成する。２－ヒドロキシニコチン酸エチル、３－アミノイソニコチン酸エチル、３－アミノピラジン－２－カルボン酸エチルをそれぞれヒドラジン水和物と反応させ、それぞれの２－カルボヒドラジドを得た。次に、それぞれの２－カルボヒドラジドをそれぞれ２－アセチルピリジンと縮合反応して、式（Ｉ）の構造を有する他の化合物を得た。これらの化合物の構造は次のように表される。
Ｋ１１８ Ｘ＝Ｎ、Ｙ＝Ｚ＝ＣＨ、Ｒ＝ＯＨ
Ｋ１２０ Ｘ＝Ｎ、Ｘ＝Ｚ＝ＣＨ、Ｒ＝ＮＨ２
Ｋ１２１ Ｘ＝Ｚ＝Ｎ、Ｙ＝ＣＨ、Ｒ＝ＮＨ２
【化7】
Ｋ１２０ Ｘ＝Ｎ、Ｘ＝Ｚ＝ＣＨ、Ｒ＝ＮＨ２
Ｋ１２１ Ｘ＝Ｚ＝Ｎ、Ｙ＝ＣＨ、Ｒ＝ＮＨ２
【0024】
２、細胞培養と試薬
ヒト肝臓癌細胞株（Ｈｕｈ７とＨｅｐＧ２）、ヒト膵臓癌細胞株（ＰＡＮＣ１）及び前立腺癌細胞株（ＰＣ３）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（HyClone、米国ユタ州ローガン）、L－グルタミン（２ｍＭ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）及び非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養された。ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ３は、ＤＭＥＭと同じ添加物を含むRoswell Park Memorial Institute（ＲＰＭＩ）１６４０の培地で培養された。すべての細胞株は、加湿したＣＯ２インキュベーター内で３７°Cに維持された。レンチウイルスシステムによって確立されたH7GPL安定細胞は、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを添加したＤＭＥＭで増殖させた。ソラフェニブはSigma-Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス) から購入した。
ヒト肝臓癌細胞株（Ｈｕｈ７とＨｅｐＧ２）、ヒト膵臓癌細胞株（ＰＡＮＣ１）及び前立腺癌細胞株（ＰＣ３）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（HyClone、米国ユタ州ローガン）、L－グルタミン（２ｍＭ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）及び非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養された。ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ３は、ＤＭＥＭと同じ添加物を含むRoswell Park Memorial Institute（ＲＰＭＩ）１６４０の培地で培養された。すべての細胞株は、加湿したＣＯ２インキュベーター内で３７°Cに維持された。レンチウイルスシステムによって確立されたH7GPL安定細胞は、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを添加したＤＭＥＭで増殖させた。ソラフェニブはSigma-Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス) から購入した。
【0025】
３、ＧＮＭＴ誘導能力分析
－１８１２／＋１４ ＧＮＭＴプロモーター－ルシフェラーゼレポーター細胞株H7GPLが構築された。一次分析では、９６ウェルプレートに播種したH7GPL細胞を１０μＭの個々の薬物で２４時間処理した後、ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega、マディソン、ウィスコンシン州、米国）を使用してルシフェラーゼ活性アッセイのために溶解した。次に、用量の異なる化合物を用いて二次分析を行った。alamarBlueR試薬（AbD Serotec、オックスフォード、イギリス）を使用して、同じ確認されたヒットを細胞毒性に使用した。細胞毒性は、製造元の推奨に従って測定された。ホットデータは、さらなる研究に使用された。
－１８１２／＋１４ ＧＮＭＴプロモーター－ルシフェラーゼレポーター細胞株H7GPLが構築された。一次分析では、９６ウェルプレートに播種したH7GPL細胞を１０μＭの個々の薬物で２４時間処理した後、ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega、マディソン、ウィスコンシン州、米国）を使用してルシフェラーゼ活性アッセイのために溶解した。次に、用量の異なる化合物を用いて二次分析を行った。alamarBlueR試薬（AbD Serotec、オックスフォード、イギリス）を使用して、同じ確認されたヒットを細胞毒性に使用した。細胞毒性は、製造元の推奨に従って測定された。ホットデータは、さらなる研究に使用された。
【0026】
４、細胞生存率とコロニー形成分析
Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、ＰＡＮＣ１、ＰＣ３及びＢｘＰＣ３細胞を９６ウェルプレートに２４時間播種し、さまざまな濃度の薬物に曝露した。AlamarBlue（登録商標）を細胞に添加し、更に４時間インキュベートして、試験薬の細胞毒性効果を評価した。同量の試験物質を含むブランクウェル（細胞なし）をバックグラウンド減算に使用し、生存細胞の相対数を相対溶媒対照の平均のパーセンテージとして表した。AlamarBlue（登録商標）分析（AbD Serotec、オックスフォード、英国）を使用して、製造元の指示に従って細胞生存率を評価した。
Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、ＰＡＮＣ１、ＰＣ３及びＢｘＰＣ３細胞を９６ウェルプレートに２４時間播種し、さまざまな濃度の薬物に曝露した。AlamarBlue（登録商標）を細胞に添加し、更に４時間インキュベートして、試験薬の細胞毒性効果を評価した。同量の試験物質を含むブランクウェル（細胞なし）をバックグラウンド減算に使用し、生存細胞の相対数を相対溶媒対照の平均のパーセンテージとして表した。AlamarBlue（登録商標）分析（AbD Serotec、オックスフォード、英国）を使用して、製造元の指示に従って細胞生存率を評価した。
【0027】
５、イムノブロッティング
プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Molecular Biochemicals）及びホスファターゼ阻害剤（１０ｍM Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＮａＦ、５ｍＭ ＮａＰＰi）を含むＲＩＰＡバッファーを使用して、細胞又は異種移植腫瘍を溶解物調製のために採取した。タンパク質濃度は、Bio-Rad タンパク質分析（Bio-Rad）によって定量化され、前の説明（Yen et al., ２０１２）に従って免疫ブロッティングが実行された。抗MYC（D84C12、Cell Signaling Technology）、抗GNMT（YMAC-Bioteck）及び抗β－アクチン（AC-15、Sigma-Aldrich）抗体は、製造元の説明書の説明に従って使用された。
プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Molecular Biochemicals）及びホスファターゼ阻害剤（１０ｍM Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＮａＦ、５ｍＭ ＮａＰＰi）を含むＲＩＰＡバッファーを使用して、細胞又は異種移植腫瘍を溶解物調製のために採取した。タンパク質濃度は、Bio-Rad タンパク質分析（Bio-Rad）によって定量化され、前の説明（Yen et al., ２０１２）に従って免疫ブロッティングが実行された。抗MYC（D84C12、Cell Signaling Technology）、抗GNMT（YMAC-Bioteck）及び抗β－アクチン（AC-15、Sigma-Aldrich）抗体は、製造元の説明書の説明に従って使用された。
【0028】
６、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
製造元のプロトコルに従って、Trizol試薬（Life Technologies）を使用してRNAを分離した。SuperScript II RNase H-逆転写酵素キット （Life Technologies）を使用して、細胞ＲＮＡを相補的ＤＮＡに逆転写した。Applied Biosystems Step-One-plusリアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems、Foster City、CA、USA）でSuper Script II 逆転写酵素キット（Invitrogen Inc.、Carlsbad、CA、USA）を使用してＰＣＲ反応を実施した。TATA-box結合タンパク質（ＴＢＰ）のｍＲＮＡレベルを内部対照として使用した。ｑＲＴ－ＰＣＲに使用したプライマーペアは次のとおりである。
ＴＢＰ正方向：配列番号１、
逆方向：配列番号：２、
ＭＹＣ正方向：配列番号３、
逆方向：配列番号４、
p21 正方向: 配列番号:５、
逆方向：配列番号：６、
p27 正方向: 配列番号:７、
逆方向：配列番号８、
GNMT正方向: 配列番号:９、及び
逆方向：配列番号：１０。
製造元のプロトコルに従って、Trizol試薬（Life Technologies）を使用してRNAを分離した。SuperScript II RNase H-逆転写酵素キット （Life Technologies）を使用して、細胞ＲＮＡを相補的ＤＮＡに逆転写した。Applied Biosystems Step-One-plusリアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems、Foster City、CA、USA）でSuper Script II 逆転写酵素キット（Invitrogen Inc.、Carlsbad、CA、USA）を使用してＰＣＲ反応を実施した。TATA-box結合タンパク質（ＴＢＰ）のｍＲＮＡレベルを内部対照として使用した。ｑＲＴ－ＰＣＲに使用したプライマーペアは次のとおりである。
ＴＢＰ正方向：配列番号１、
逆方向：配列番号：２、
ＭＹＣ正方向：配列番号３、
逆方向：配列番号４、
p21 正方向: 配列番号:５、
逆方向：配列番号：６、
p27 正方向: 配列番号:７、
逆方向：配列番号８、
GNMT正方向: 配列番号:９、及び
逆方向：配列番号：１０。
【0029】
７、プラスミドとトランスフェクション
国立ＲＮＡiコア施設（中央研究院、台北、台湾）からレンチウイルス産生用プラスミド（ｐＣＭＶ－ΔＲ８．９１及びｐＭＤ．Ｇ）、ＭＹＣ用ｓｈＲＮＡ（ＭＹＣ－レンチウイルスｓｈＲＮＡ、配列番号１１）及びＲＮＡ干渉用対照プラスミド（ｐＬＫＯ．１－ｓｈＬａｃＺ）を得た。過剰発現実験用のベクターコントロールプラスミドとｐｃＤＮＡ－ＭＹＣプラスミドは、劉詩平（Shih-Ping Liu）博士（中国医科大学、台中、台湾）から提供された。ウミシイタケルシフェラーゼコントロールレポーターベクター（Promega、マディソン、ウィスコンシン州、米国）は、トランスフェクション効率を標準化するために使用された。メーカーの推奨に従って、TurboFect Reagent（Fermentas、ハノーバー、MD）及びLipofectamine 3000（Life Technologies、Mulgrave、オーストラリア）を使用して、プラスミドDNAをトランスフェクトした。メーカーの推奨に従って、TurboFect（商標）試剤とリポフェクタミン３０００を使用して、プラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。
国立ＲＮＡiコア施設（中央研究院、台北、台湾）からレンチウイルス産生用プラスミド（ｐＣＭＶ－ΔＲ８．９１及びｐＭＤ．Ｇ）、ＭＹＣ用ｓｈＲＮＡ（ＭＹＣ－レンチウイルスｓｈＲＮＡ、配列番号１１）及びＲＮＡ干渉用対照プラスミド（ｐＬＫＯ．１－ｓｈＬａｃＺ）を得た。過剰発現実験用のベクターコントロールプラスミドとｐｃＤＮＡ－ＭＹＣプラスミドは、劉詩平（Shih-Ping Liu）博士（中国医科大学、台中、台湾）から提供された。ウミシイタケルシフェラーゼコントロールレポーターベクター（Promega、マディソン、ウィスコンシン州、米国）は、トランスフェクション効率を標準化するために使用された。メーカーの推奨に従って、TurboFect Reagent（Fermentas、ハノーバー、MD）及びLipofectamine 3000（Life Technologies、Mulgrave、オーストラリア）を使用して、プラスミドDNAをトランスフェクトした。メーカーの推奨に従って、TurboFect（商標）試剤とリポフェクタミン３０００を使用して、プラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。
【0030】
８、異種移植分析
すべての動物実験は、高雄医科大学の施設内動物管理使用委員会によって審査及び承認され、関連するガイドラインに従って実施された。５～６週齢の雄NOD-SCIDマウスの右側腹部に、Ｈｕｈ７細胞 （１x １０６） を皮下注射した。触知可能な腫瘍が検出されたら、マウスを無作為にグループ分けし、３００ｍｐｋ、１００ｍｐｋ、又は２５ｍｐｋのＬＫＹ４６０６Ｄ又はＫＹＴ５３９７及び薬物ビヒクルを２８日間毎日経口投与して治療した。Ｋ１１７については、１０ｍｐｋ及び２５ｍｐｋの用量が使用された。ソラフェニブの場合、２５ｍｐｋの用量が使用された。ノギスを使用して腫瘍の長さ（Ｌ）と幅（Ｗ）を測定することにより、腫瘍の成長を監視した (毎日又は週に３回）。腫瘍体積（ＴＶ）は、式：体積＝（Ｌ×Ｗ２）／２を使用して計算した。すべての薬物は、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩に溶解した。
すべての動物実験は、高雄医科大学の施設内動物管理使用委員会によって審査及び承認され、関連するガイドラインに従って実施された。５～６週齢の雄NOD-SCIDマウスの右側腹部に、Ｈｕｈ７細胞 （１x １０６） を皮下注射した。触知可能な腫瘍が検出されたら、マウスを無作為にグループ分けし、３００ｍｐｋ、１００ｍｐｋ、又は２５ｍｐｋのＬＫＹ４６０６Ｄ又はＫＹＴ５３９７及び薬物ビヒクルを２８日間毎日経口投与して治療した。Ｋ１１７については、１０ｍｐｋ及び２５ｍｐｋの用量が使用された。ソラフェニブの場合、２５ｍｐｋの用量が使用された。ノギスを使用して腫瘍の長さ（Ｌ）と幅（Ｗ）を測定することにより、腫瘍の成長を監視した (毎日又は週に３回）。腫瘍体積（ＴＶ）は、式：体積＝（Ｌ×Ｗ２）／２を使用して計算した。すべての薬物は、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩に溶解した。
【0031】
９、統計分析
ＭＳ ｅｘｃｅｌとＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウェアを使用して、統計分析を行った。さまざまなグループを比較するために、スチューデントの両側ｔ検定によってＰ値が決定され、Ｐ＜０．０５で統計的に有意であると見なされた。
ＭＳ ｅｘｃｅｌとＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウェアを使用して、統計分析を行った。さまざまなグループを比較するために、スチューデントの両側ｔ検定によってＰ値が決定され、Ｐ＜０．０５で統計的に有意であると見なされた。
【0032】
結果
１、ＧＮＭＴインデューサーの同定
予備研究では、構造が図２Ａに示されているナフトヒドラジド誘導体、Ｋ７８がＨＣＣ治療の強力なリードであることが示された。図２Ｂに示すように、Ｋ７８はルシフェラーゼ活性の用量依存的な誘導を示し、レポーター遺伝子発現のインデューサーの有力な候補として選択された。Ｋ７８が内因性ＧＮＭＴ発現を増強するかどうかを確認するために、Ｈｕｈ７細胞のＧＮＭＴ ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを調べた。図２Ｃと２Ｄでは、Ｋ７８は、Ｈｕｈ７細胞においてｍＲＮＡレベル（図２Ｃ）及びタンパク質レベル（図２Ｄ）で内因性ＧＮＭＴ発現を上方制御した。
１、ＧＮＭＴインデューサーの同定
予備研究では、構造が図２Ａに示されているナフトヒドラジド誘導体、Ｋ７８がＨＣＣ治療の強力なリードであることが示された。図２Ｂに示すように、Ｋ７８はルシフェラーゼ活性の用量依存的な誘導を示し、レポーター遺伝子発現のインデューサーの有力な候補として選択された。Ｋ７８が内因性ＧＮＭＴ発現を増強するかどうかを確認するために、Ｈｕｈ７細胞のＧＮＭＴ ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを調べた。図２Ｃと２Ｄでは、Ｋ７８は、Ｈｕｈ７細胞においてｍＲＮＡレベル（図２Ｃ）及びタンパク質レベル（図２Ｄ）で内因性ＧＮＭＴ発現を上方制御した。
【0033】
２、インビトロとインビボでのＫ７８の抗ＨＣＣ効果
ＨＣＣに対するＫ７８の治療可能性を決定するために、Ｈｕｈ７細胞の増殖に対するＫ７８の阻害効果を最初に評価した。Ｋ７８は、７２時間の処理後にＨｕｈ７細胞の増殖を用量依存的に抑制した（図３Ａ）。続いて、Ｋ７８に２４、４８、７２及び９６時間暴露した後、Ｈｕｈ７細胞の増殖は時間依存的に有意に阻害された（図３Ｂ）。次に、本発明では、Ｈｕｈ７細胞を用いて異種モデルに関する研究を行った。担癌ヌードマウスは、溶媒Ｋ７８ ２５ｍｐｋ、Ｋ７８ １００ｍｐｋ及びＫ７８ ３００ｍｐｋで経口的に治療された。ソラフェニブは、ＨＣＣのＦＤＡ承認薬であるため、比較対照として選択された。すべてのグループで体重に対する毒性の証拠はない（図３Ｃ）。図３Ｄに示すように、Ｋ７８は溶媒対照群と比較して、このモデルの腫瘍増殖を阻害した。ただし、ソラフェニブには最も大きな違いがある。まとめると、これらの結果は、インビトロとインビボモデルを使用した Ｋ７８の抗ＨＣＣ能力の強力な証拠を提供する。
ＨＣＣに対するＫ７８の治療可能性を決定するために、Ｈｕｈ７細胞の増殖に対するＫ７８の阻害効果を最初に評価した。Ｋ７８は、７２時間の処理後にＨｕｈ７細胞の増殖を用量依存的に抑制した（図３Ａ）。続いて、Ｋ７８に２４、４８、７２及び９６時間暴露した後、Ｈｕｈ７細胞の増殖は時間依存的に有意に阻害された（図３Ｂ）。次に、本発明では、Ｈｕｈ７細胞を用いて異種モデルに関する研究を行った。担癌ヌードマウスは、溶媒Ｋ７８ ２５ｍｐｋ、Ｋ７８ １００ｍｐｋ及びＫ７８ ３００ｍｐｋで経口的に治療された。ソラフェニブは、ＨＣＣのＦＤＡ承認薬であるため、比較対照として選択された。すべてのグループで体重に対する毒性の証拠はない（図３Ｃ）。図３Ｄに示すように、Ｋ７８は溶媒対照群と比較して、このモデルの腫瘍増殖を阻害した。ただし、ソラフェニブには最も大きな違いがある。まとめると、これらの結果は、インビトロとインビボモデルを使用した Ｋ７８の抗ＨＣＣ能力の強力な証拠を提供する。
【0034】
構造活性相関（ＳＡＲ）研究を実行することにより、ＧＮＭＴ発現を増強する能力を持つ、より強力なＨＣＣ阻害薬を特定した。Ｋ１１７及びＫ１０２（Ｋ７８誘導体）は、ＧＮＭＴ発現の誘導においてＫ７８よりも効果的である。Ｋ１０２の構造を図４Ａに示す。更に、Ｋ１１７及びＫ１０２は用量依存的にＧＮＭＴプロモーター活性を誘導した（図４Ｂ）。次に、最も強力なインデューサーであるＫ１１７をさらなる研究のために選択し、Ｈｕｈ７細胞でＧＮＭＴ ｍＲＮＡ及びタンパク質発現を誘導した（図４Ｃと図４Ｄ）。
【0035】
表１に示すように、構造活性相関 （ＳＡＲ）研究を実行することにより、Ｋシリーズ化合物（ＧＮＭＴインデューサー）が異なるニコチン酸エチルによって合成される。表１に、Ｋシリーズ化合物のＧＮＭＴ誘導能力を示す。
【0036】
【表1】
【0037】
３、Ｋ１１７がインビトロとインビボで肝癌細胞を阻害する
次に、さまざまな肝癌細胞株（Ｈｕｈ７、Ｈｅｐ３B及びＨｅｐＧ２を含む）の細胞増殖に対するＫ１１７の影響を分析した。結果は、Ｋ１１７が試験したすべての肝癌細胞の増殖を用量依存的に阻害したことを示した（図５Ａ）。更に、Ｋ１１７は、Ｈｕｈ７及びＨｅｐＧ２細胞のコロニー形成を用量依存的に減少させた（図５Ｂ及び５Ｃ）。インビボでのＫ１１７の抗腫瘍効果を更に評価するために、Ｈｕｈ７細胞を上記のようにヌードマウスに皮下注射した。次に、これらのマウスを無作為にグループ分けし、溶媒、Ｋ１１７ ２５ｍｐｋ、Ｋ１１７ １０ｍｐｋ及びソラフェニブ ２５ｍｐｋ（比較対照として）で処理しました。
次に、さまざまな肝癌細胞株（Ｈｕｈ７、Ｈｅｐ３B及びＨｅｐＧ２を含む）の細胞増殖に対するＫ１１７の影響を分析した。結果は、Ｋ１１７が試験したすべての肝癌細胞の増殖を用量依存的に阻害したことを示した（図５Ａ）。更に、Ｋ１１７は、Ｈｕｈ７及びＨｅｐＧ２細胞のコロニー形成を用量依存的に減少させた（図５Ｂ及び５Ｃ）。インビボでのＫ１１７の抗腫瘍効果を更に評価するために、Ｈｕｈ７細胞を上記のようにヌードマウスに皮下注射した。次に、これらのマウスを無作為にグループ分けし、溶媒、Ｋ１１７ ２５ｍｐｋ、Ｋ１１７ １０ｍｐｋ及びソラフェニブ ２５ｍｐｋ（比較対照として）で処理しました。
【0038】
図５Ｄに示すように、対照群と比較した場合、Ｋ１１７治療群では有意な腫瘍増殖の減少が観察された。更に、１０ ｍｐｋという低用量の Ｋ１１７は、ソラフェニブ ２５ ｍｐｋと同じ効果を示した。更に、Ｋ１１７治療は、動物の生存率、体重及び肝機能のテストによって監視される重篤な有害事象を引き起こしないが、すべてのグループ間で有意差はない（図５Ｅ及び５Ｆ）。全体として、これらの結果は、インビトロとインビボでのＫ１１７の腫瘍増殖阻害活性と耐性の強力な証拠を提供する。
【0039】
４、ＧＮＭＴが前立腺癌及び膵臓癌において腫瘍感受性遺伝子 （ＴＳＧ）として機能する
正常前立腺及び良性前立腺肥大組織におけるＧＮＭＴ発現は豊富であるが、前立腺癌組織の８２．２％で減少したことが報告されている。 これは、ＧＮＭＴが前立腺癌の腫瘍感受性遺伝子であることを示唆した。
正常前立腺及び良性前立腺肥大組織におけるＧＮＭＴ発現は豊富であるが、前立腺癌組織の８２．２％で減少したことが報告されている。 これは、ＧＮＭＴが前立腺癌の腫瘍感受性遺伝子であることを示唆した。
【0040】
膵臓癌を含む多くの癌で、過剰メチル化が遺伝子のサイレンシングに利用されていることがわかっている。このような状態では、ＧＮＭＴの下方制御は、メチルドナーＳＡＭが遺伝子サイレンシングを実行できるようにするのに役立つ可能性がある。以前は、ＧＮＭＴは膵臓癌で大幅に下方制御されていることが判明しており、膵臓癌の二次腫瘍は通常肝臓を狙っている。この点で、ＧＮＭＴが膵臓癌のＴＳＧである可能性があることはＨＣＣと同様であり、膵臓癌におけるこの下方制御されたＴＳＧの再活性化は治療計画になるでしょう。表２は、膵臓及び前立腺癌細胞株のＩＣ５０（μＭ）を示している。これは、ＧＮＭＴの誘導が癌細胞の増殖を阻害することを示している。
【0041】
【表2】
【0042】
５、ＨＣＣにおけるＫ７８シリーズＧＮＭＴインデューサーのメカニズム
次に、Ｋ７８がＧＮＭＴ発現を増強し、肝癌細胞の増殖を阻害するメカニズムが、本発明において調査された。ＧＮＭＴインデューサー薬、即ち、１，２，３，４，６－ペンタ－Ｏ－ガロイル－ベータ－Ｄ－グルコピラノシド（ＰＧＧ）は、肝臓癌の病因におけるＭＹＣ下方制御を介してＧＮＭＴ発現を増強することが知られている。従って、Ｋ７８シリーズ化合物がＨＣＣにおいてもＭＹＣ阻害を通じて効果を発揮するかどうかを決定するために、Ｈｕｈ７細胞におけるＭＹＣのｍＲＮＡ発現に対するＫ７８シリーズ化合物（Ｋ７８、Ｋ９０及びＫ１０２）の処理の効果を本発明で調べた。Ｋ９０の構造を図６Ａに示す。図６Bに示すように、すべてのＫ７８シリーズ化合物 （Ｋ７８、Ｋ９０及びＫ１０２）は、Ｈｕｈ７細胞でＭＹＣのｍＲＮＡ発現を阻害する。更に、Ｋ１１７がｃ-Ｍｙｃ ｍＲＮＡ発現を用量依存的に抑制することが示された（図６Ｃ）。更に、本発明では、Ｋ１１７処理後のＭＹＣ標的遺伝子の発現を分析することにより、ＭＹＣ機能に対するＫ１１７の効果を評価した。ＭＹＣ阻害と一致して、Ｋ１１７処理により、Ｈｕｈ７細胞のｐ２１及びｐ２７のｍＲＮＡ発現が増加した（図６Ｄ）。インビトロの結果と一致して、ＭＹＣタンパク質の発現は、Ｋ１１７で処理されたマウスのＨｕｈ７異種移植腫瘍で減少した（図６Ｅ）。これらの結果は、Ｋ７８シリーズ化合物が、ＨＣＣ細胞におけるＭＹＣ発現を抑制するＭＹＣ阻害剤であることを示している。ＰＧＧはＭＹＣ遺伝子の発現を阻害し、カルパインと同様にプロテアソームとは無関係なメカニズムを介してＭＹＣタンパク質の分解を促進することが示されている。Ｋ７８シリーズ化合物におけるこの同じメカニズムの作用を調査するために、本発明は、ＭＹＣの異所性発現が、Ｈｕｈ７細胞においてＫ１１７によって誘導されるＭＹＣ ｍＲＮＡ及びタンパク質抑制を救助するかどうかを調べた。興味深いことに、ＭＹＣの異所性発現は、Ｈｕｈ７細胞でＫ１１７によって誘導されたＭＹＣ ｍＲＮＡ及びタンパク質抑制を救助することができた（図６Ｆ及び図６Ｇ）。更に、誘導の結果は、ＭＹＣの過剰発現がＫ１１７誘導のＨ７ＧＰＬ－１細胞のＧＮＭＴプロモーター活性を元に戻すことを示した（図６Ｈ）。まとめると、Ｋ７８シリーズ化合物はＭＹＣ転写を抑制し、ＧＮＭＴ発現を増強した。
次に、Ｋ７８がＧＮＭＴ発現を増強し、肝癌細胞の増殖を阻害するメカニズムが、本発明において調査された。ＧＮＭＴインデューサー薬、即ち、１，２，３，４，６－ペンタ－Ｏ－ガロイル－ベータ－Ｄ－グルコピラノシド（ＰＧＧ）は、肝臓癌の病因におけるＭＹＣ下方制御を介してＧＮＭＴ発現を増強することが知られている。従って、Ｋ７８シリーズ化合物がＨＣＣにおいてもＭＹＣ阻害を通じて効果を発揮するかどうかを決定するために、Ｈｕｈ７細胞におけるＭＹＣのｍＲＮＡ発現に対するＫ７８シリーズ化合物（Ｋ７８、Ｋ９０及びＫ１０２）の処理の効果を本発明で調べた。Ｋ９０の構造を図６Ａに示す。図６Bに示すように、すべてのＫ７８シリーズ化合物 （Ｋ７８、Ｋ９０及びＫ１０２）は、Ｈｕｈ７細胞でＭＹＣのｍＲＮＡ発現を阻害する。更に、Ｋ１１７がｃ-Ｍｙｃ ｍＲＮＡ発現を用量依存的に抑制することが示された（図６Ｃ）。更に、本発明では、Ｋ１１７処理後のＭＹＣ標的遺伝子の発現を分析することにより、ＭＹＣ機能に対するＫ１１７の効果を評価した。ＭＹＣ阻害と一致して、Ｋ１１７処理により、Ｈｕｈ７細胞のｐ２１及びｐ２７のｍＲＮＡ発現が増加した（図６Ｄ）。インビトロの結果と一致して、ＭＹＣタンパク質の発現は、Ｋ１１７で処理されたマウスのＨｕｈ７異種移植腫瘍で減少した（図６Ｅ）。これらの結果は、Ｋ７８シリーズ化合物が、ＨＣＣ細胞におけるＭＹＣ発現を抑制するＭＹＣ阻害剤であることを示している。ＰＧＧはＭＹＣ遺伝子の発現を阻害し、カルパインと同様にプロテアソームとは無関係なメカニズムを介してＭＹＣタンパク質の分解を促進することが示されている。Ｋ７８シリーズ化合物におけるこの同じメカニズムの作用を調査するために、本発明は、ＭＹＣの異所性発現が、Ｈｕｈ７細胞においてＫ１１７によって誘導されるＭＹＣ ｍＲＮＡ及びタンパク質抑制を救助するかどうかを調べた。興味深いことに、ＭＹＣの異所性発現は、Ｈｕｈ７細胞でＫ１１７によって誘導されたＭＹＣ ｍＲＮＡ及びタンパク質抑制を救助することができた（図６Ｆ及び図６Ｇ）。更に、誘導の結果は、ＭＹＣの過剰発現がＫ１１７誘導のＨ７ＧＰＬ－１細胞のＧＮＭＴプロモーター活性を元に戻すことを示した（図６Ｈ）。まとめると、Ｋ７８シリーズ化合物はＭＹＣ転写を抑制し、ＧＮＭＴ発現を増強した。
【0043】
本発明は、添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、当業者によっていかなる方法でも修正され得る。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【配列表】