特許 7584408 遺伝性障害のための遺伝子発現を改変するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-07

(45)【発行日】2024-11-15

(54)【発明の名称】遺伝性障害のための遺伝子発現を改変するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/90 20060101AFI20241108BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20241108BHJP

【ＦＩ】

C12N15/90 Z ZNA

C12N15/90 104Z

C12N15/09 110

【請求項の数】 21

(21)【出願番号】P 2021523850

(86)(22)【出願日】2019-10-30

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(86)【国際出願番号】 US2019058857

(87)【国際公開番号】W WO2020092557

(87)【国際公開日】2020-05-07

【審査請求日】2022-10-28

(31)【優先権主張番号】62/754,548

(32)【優先日】2018-11-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/755,755

(32)【優先日】2018-11-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/756,175

(32)【優先日】2018-11-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/799,615

(32)【優先日】2019-01-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】521162883

【氏名又は名称】ブルーアレル， エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】バルテス， ニコラス

【審査官】小倉 梢

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／２０３２７５（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

導入遺伝子と、内因性遺伝子内の部位を標的とする少なくとも１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼとを含む、前記導入遺伝子を前記内因性遺伝子に組み込むための組み合わせ物であって、
前記導入遺伝子が、
ｉ．第１および第２のスプライスドナー配列、
ｉｉ．第１および第２の部分コード配列、ならびに
ｉｉｉ．第１および第２のプロモーター、
を含み、
前記導入遺伝子が、前記内因性遺伝子内に組み込まれ、
前記第１のスプライスドナー配列が、前記第１の部分コード配列に作動可能に連結されており、前記第２のスプライスドナー配列が、前記第２の部分コード配列に作動可能に連結されており、
前記第１の部分コード配列が、前記第１のプロモーターに作動可能に連結されており、前記第２の部分コード配列が、前記第２のプロモーターに作動可能に連結されており、
前記第１および第２のスプライスドナー配列、第１および第２の部分コード配列、ならびに第１および第２のプロモーターが、頭対頭（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ）配向で配向されている、組み合わせ物。

【請求項2】

前記導入遺伝子が、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの第１および第２の標的部位をさらに含み、前記標的部位が、前記第１および第２のスプライスドナー配列に隣接する、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項3】

前記導入遺伝子が、前記第１および第２のスプライスドナー配列に隣接する第１および第２の相同アームをさらに含む、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項4】

前記導入遺伝子が、アデノ随伴ウイルスベクター内に保有される、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項5】

前記導入遺伝子が、前記内因性遺伝子のイントロン内、またはエキソン－イントロン接合部に組み込まれる、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項6】

前記導入遺伝子が、ＡＴＸＮ２遺伝子もしくはＳＮＣＡ遺伝子のイントロン内、またはエキソン－イントロン接合部に組み込まれる、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項7】

前記導入遺伝子が、非病原性ＡＴＸＮ２遺伝子のエキソン１によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含む、請求項６に記載の組み合わせ物。

【請求項8】

前記導入遺伝子が、非病原性ＳＮＣＡ遺伝子のエキソン２によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含む、請求項６に記載の組み合わせ物。

【請求項9】

前記ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項10】

前記第１および第２の部分コード配列が、同じアミノ酸配列をコードする、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項11】

前記第１および第２の部分コード配列が、核酸配列において異なるが、同じアミノ酸配列をコードする、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項12】

前記導入遺伝子が、ベクターに保有され、前記ベクターの形式が、二本鎖直鎖ＤＮＡ、二本鎖環状ＤＮＡ、またはウイルスベクターから選択される、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項13】

前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターから選択される、請求項１２に記載の組み合わせ物。

【請求項14】

前記導入遺伝子が、４．７ｋｂ以下である、請求項１３に記載の組み合わせ物。

【請求項15】

前記内因性遺伝子が、前記部分コード配列の野生型遺伝子である、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項16】

前記内因性遺伝子が、異常または病原性であり、前記部分コード配列が、前記内因性遺伝子の機能性バージョンから産生される部分タンパク質をコードする、請求項１５に記載の組み合わせ物。

【請求項17】

前記第１および第２の部分コード配列が、対応する前記内因性遺伝子と比較して、核酸配列において異なる、請求項１６に記載の組み合わせ物。

【請求項18】

前記内因性遺伝子が、ＳＯＤ１、ＴＲＰＶ４、ＣＨＲＮＡ１、ＣＨＲＮＤ、ＣＨＲＮＥ、ＣＨＲＮＢ１、ＰＲＰＳ１、ＬＲＲＫ２、ＳＴＩＭ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＣＰ２、ＳＮＣＡ、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＡＴＸＮ３、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、ＴＢＰ、ＨＴＴ、ＡＲ、ＦＸＮ、ＤＭＰＫ、ＰＡＢＰＮ１、ＡＴＸＮ８、ＲＨＯ、またはＣ９ｏｒｆ７２から選択される、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項19】

前記導入遺伝子が、第１および第２のターミネーターをさらに含む、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項20】

導入遺伝子を含む、前記導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込むための組成物であって、
前記導入遺伝子が、
ｉ．第１および第２のスプライスドナー配列、
ｉｉ．第１および第２の部分コード配列、ならびに
ｉｉｉ．第１および第２のプロモーター、を含み、
前記組成物は、前記内因性遺伝子内の部位を標的とする少なくとも１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼと組み合わせて投与されることを特徴とし、
前記導入遺伝子が、前記内因性遺伝子内に組み込まれ、
前記第１のスプライスドナー配列が、前記第１の部分コード配列に作動可能に連結されており、前記第２のスプライスドナー配列が、前記第２の部分コード配列に作動可能に連結されており、
前記第１の部分コード配列が、前記第１のプロモーターに作動可能に連結されており、前記第２の部分コード配列が、前記第２のプロモーターに作動可能に連結されており、
前記第１および第２のスプライスドナー配列、第１および第２の部分コード配列、ならびに第１および第２のプロモーターが、頭対頭配向で配向されている、組成物。

【請求項21】

内因性遺伝子内の部位を標的とする少なくとも１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼを含む、導入遺伝子を前記内因性遺伝子に組み込むための組成物であって、
前記導入遺伝子が、
ｉ．第１および第２のスプライスドナー配列、
ｉｉ．第１および第２の部分コード配列、ならびに
ｉｉｉ．第１および第２のプロモーター、を含み、
前記組成物は、前記導入遺伝子と組み合わせて投与されることを特徴とし、
前記導入遺伝子が、前記内因性遺伝子内に組み込まれ、
前記第１のスプライスドナー配列が、前記第１の部分コード配列に作動可能に連結されており、前記第２のスプライスドナー配列が、前記第２の部分コード配列に作動可能に連結されており、
前記第１の部分コード配列が、前記第１のプロモーターに作動可能に連結されており、前記第２の部分コード配列が、前記第２のプロモーターに作動可能に連結されており、
前記第１および第２のスプライスドナー配列、第１および第２の部分コード配列、ならびに第１および第２のプロモーターが、頭対頭配向で配向されている、組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の参照
本出願は、先の出願および同時係属出願である２０１８年１１月１日に出願されたＵＳＳＮ６２／７５４，５４８、２０１８年１１月５日に出願されたＵＳＳＮ６２／７５５，７５５、２０１８年１１月６日に出願されたＵＳＳＮ６２／７５６，１７５、および２０１９年１月３１日に出願されたＵＳＳＮ６２／７９９，６１５に対する優先権を主張し、これらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

【0002】

配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年１０月２９日に作成されたＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＢＡ２０１８－５＿Ｐ１２９８８という名前で、５０７，９０４バイトのサイズである。

【0003】

本文書は、ゲノム編集および遺伝子治療の分野である。より具体的には、本文書は、内因性遺伝子の標的化修飾、または導入遺伝子からの遺伝子発現と共に内因性遺伝子発現の低減に関する。

【背景技術】

【0004】

単一遺伝子障害（ｍｏｎｏｇｅｎｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）は、その例としては鎌状赤血球症（ヘモグロビン－β遺伝子）、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通伝導調節因子遺伝子）、およびテイ・サックス病（β－ヘキソサミニダーゼＡ遺伝子）が挙げられる、単一の遺伝子における１つ以上の変異によって引き起こされる。単一遺伝子障害は、欠陥遺伝子を機能性コピーで置き換えることが治療上の利益をもたらす可能性があるため、遺伝子治療に対する関心が高まってきた。しかしながら、効果的な療法を生み出す上での１つの妨げとしては、遺伝子の機能性コピーのサイズが挙げられる。ウイルスを使用するものを含む多くの送達方法には、サイズ制限があり、大きな導入遺伝子の送達を妨げる。さらに、多くの遺伝子は、複数のタンパク質をコードする単一の遺伝子をもたらす、選択的スプライシングパターンを有する。欠陥遺伝子の領域を修正する方法は、単一遺伝子障害を治療するための追加の手段を提供し得る。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

遺伝子編集は、遺伝性障害に見出される変異を修正するために有望であるが、機能獲得変異によって引き起こされるもの、または正確な修復が必要な場合を含む、個々の障害に対する効果的な療法を創出する上で多くの課題が残されている。これらの課題は、脊髄小脳失調症２およびパーキンソン病などの障害で見られ、この障害は、機能獲得変異と関連付けられる。

【0006】

一態様では、本明細書に記載の方法は、機能獲得障害を治療するための新規なアプローチを提供し、病原性アレル（複数可）および非病原性アレル（複数可）がサイレンシングされ、タンパク質発現がサイレンシング耐性のコード配列を使用して置き換えられる。これらの方法は、１つ以上のアイソフォームを産生する遺伝子に対して使用することができる。一実施形態では、レアカッティング（ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ）エンドヌクレアーゼまたはトランスポゾンを使用して、サイレンシング配列およびサイレンシング耐性の完全または部分コード配列を含む導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込むことができる（図１２～１７）。導入遺伝子がサイレンシング耐性部分コード配列を含む場合、導入遺伝子は、部分コード配列に作動可能に連結されたスプライスアクセプターまたはスプライスドナーをさらに含むことができる。導入遺伝子は、（遺伝子の５’領域を標的とする場合）サイレンシング耐性コード配列に作動可能に連結されたプロモーター、または（遺伝子の３’領域を標的とする場合）サイレンシング耐性コード配列に作動可能に連結されたターミネーターをさらに含むことができる。機能獲得変異は、ＨＤ（ハンチントン病）、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症）、ＳＣＡ１（脊髄小脳失調症１型）、ＳＣＡ２（脊髄小脳失調症２型）、ＳＣＡ３（脊髄小脳失調症３型またはマシャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ６（脊髄小脳失調症６型）、ＳＣＡ７（脊髄小脳失調症７型）、脆弱Ｘ症候群、脆弱ＸＥ精神遅滞、フリードライヒ運動失調症、筋強直性ジストロフィー１型、筋強直性ジストロフィー２型、脊髄小脳失調症８型、脊髄小脳失調症１２型、球脊髄性筋萎縮症、ＪＰＨ３、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、遺伝性運動性感覚性ニューロパチーＩＩＣ型、シナプス後スローチャネル先天性筋無力症候群、ＰＲＰＳ１過活動性、パーキンソン病、細管集合体ミオパチー、軟骨無形成症、ルブスＸ連鎖精神遅滞症候群、ならびに常染色体優性網膜色素変性症からなる群から選択される疾患をもたらす変異であり得る。

【0007】

別の態様では、本明細書に記載の方法は、遺伝子の５’末端で見出される変異を修正するための新規なアプローチを提供する。本方法は、部分的に、複数の修復経路を通した組み込みと互換性のある、バイモジュール（ｂｉｍｏｄｕｌｅ）の双方向導入遺伝子の設計に基づく。本明細書に記載の導入遺伝子は、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ、ＨＲ）経路、非相同末端結合（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）経路、または相同組換えと非相同末端結合経路との両方によって、あるいは転位（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）を通して、遺伝子に組み込むことができる。さらに、任意の場合における組み込みの結果（ＨＲ、ＮＨＥＪフォワード、ＮＨＥＪリバース、フォワード転位、またはリバース転位）は、標的遺伝子のタンパク質産物の正確な修正（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）／改変をもたらし得る。本明細書に記載の導入遺伝子を使用して、目的の遺伝子の５’領域の変異を修正（ｆｉｘ）または導入することができる。これらの方法は、遺伝子の正確な編集が必要な場合、または標的とされる変異した内因性遺伝子が、標準的なベクターまたはウイルスベクターのサイズ容量を超えているために合成コピーによって「置き換える」ことができない場合に、特に有用である。本明細書に記載の方法は、応用研究（例えば、遺伝子治療）または基礎研究（例えば、動物モデルの創出、または遺伝子機能の理解）のために使用することができる。

【0008】

本明細書に記載の方法は、現在のインビボ送達ビヒクル（例えば、アデノ随伴ウイルスベクターおよび脂質ナノ粒子）と適合性があり、遺伝子産物（特に、機能獲得変異を有するもの、および複数のアイソフォームを産生するもの）の正確な改変を達成することで、いくつかの課題に対処する。

【0009】

一実施形態では、本文書は、導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込むための方法を特徴とする。本方法は、導入遺伝子の送達を含むことができ、導入遺伝子は、第１および第２のスプライスドナー配列、第１および第２のコード配列、ならびに１つの双方向プロモーター、または第１および第２のプロモーターを保有する（図１）。別の態様では、導入遺伝子は、第１および第２のターミネーターも含み得る。一部の実施形態では、第１および第２のターミネーターは、単一の双方向ターミネーターで置き換えることができる。本方法は、内因性遺伝子内の部位を標的とするレアカッティングエンドヌクレアーゼを投与することをさらに含む。本方法の結果、導入遺伝子が内因性遺伝子と組み込まれ、配向（例えば、フォワードまたはリバース）に関係なく、組み込みは、内因性遺伝子から産生されるタンパク質のアミノ酸配列の正確な修飾をもたらすであろう（図３および４）。本方法は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼを含む、任意の好適なレアカッティングエンドヌクレアーゼの使用を含むことができる。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、内因性遺伝子のイントロンまたはエキソン内の配列を標的とすることができる。内因性遺伝子は、ＡＴＸＮ２遺伝子を含むことができ、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＡＴＸＮ２遺伝子のイントロン１またはエキソン１を標的とすることができる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり得る。他の実施形態では、第１および第２のコード配列は、レポーター遺伝子、精製タグ、または内因性遺伝子によってコードされるアミノ酸と相同であるアミノ酸をコードすることができる。第１および第２のコード配列は、同じ核酸配列を保有することによって、または異なる核酸配列を保有することによって（例えば、コドン縮重を使用して）、同じアミノ酸をコードする。導入遺伝子は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター）上で合成され得る。または、導入遺伝子は、非ウイルスベクター上で合成され得る。上に記載の実施形態は、両方の産物が依然として所望の結果をもたらす一方で、導入遺伝子のフォワードまたはリバースのいずれかの方向への標的化組み込みをもたらし得る。

【0010】

一実施形態では、本文書は、導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込むための方法を特徴とする。この方法は、導入遺伝子の送達を含み得、導入遺伝子は、第１および／または第２の相同アーム、第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼの標的部位、第１および第２のプロモーターまたは１つの双方向プロモーター、第１および第２のスプライスドナー配列、第１および第２のコード配列、ならびに、任意選択的に、第１および第２のターミネーターを保有する。一部の実施形態では、第１および第２のターミネーターは、単一の双方向ターミネーターで置き換えることができる。本方法は、内因性遺伝子内の部位および導入遺伝子内の２つの部位を標的とするレアカッティングエンドヌクレアーゼを投与することをさらに含む。本方法の結果、導入遺伝子が内因性遺伝子と組み込まれ、配向（例えば、フォワードまたはリバース）に関係なく、組み込みは、内因性遺伝子から産生されるタンパク質のアミノ酸配列の正確な修飾をもたらすであろう。本方法は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼを含む、任意の好適なレアカッティングエンドヌクレアーゼの使用を含むことができる。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、内因性遺伝子のイントロンまたはエキソン内の配列を標的とすることができる。内因性遺伝子は、ＡＴＸＮ２遺伝子を含むことができ、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＡＴＸＮ２遺伝子のイントロン１またはエキソン１を標的とすることができる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり得る。他の実施形態では、第１および第２のコード配列は、レポーター遺伝子、精製タグ、または内因性遺伝子によってコードされるアミノ酸と相同であるアミノ酸をコードすることができる。第１および第２のコード配列は、同じ核酸配列を保有することによって、または異なる核酸配列を保有することによって（例えば、コドン縮重を使用して）、同じアミノ酸をコードする。導入遺伝子は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター）上で合成され得る。または、導入遺伝子は、非ウイルスベクター上で合成され得る。上に記載の実施形態は、両方の産物が依然として所望の結果をもたらす一方で、導入遺伝子のフォワードまたはリバースのいずれかの方向への標的化組み込みをもたらし得る。

【0011】

さらなる実施形態では、本文書は、二本鎖ポリヌクレオチドを特徴とする。二本鎖ポリヌクレオチドは、第１および第２のスプライスドナー配列、第１および第２のコード配列、双方向プロモーター、または第１および第２のプロモーターを含むことができる。二本鎖ポリヌクレオチドは、第１および／または第２の相同アーム、第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位、ならびに第１および第２のターミネーターをさらに含むことができる。一部の実施形態では、第１および第２のターミネーターは、単一の双方向ターミネーターで置き換えることができる。二本鎖ポリヌクレオチド上のコード配列は、逆相補（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）の配向であり得る。コード配列は、同じアミノ酸配列をコードすることができる。コード配列は、同じヌクレオチド配列、または異なる核酸配列（例えば、コドン縮重に起因する）から構成され得る。第１および第２のプロモーターは、互いに逆相補の配向であってもよい。

【0012】

さらなる実施形態では、本文書は、導入遺伝子をＡＴＸＮ２に組み込む方法を特徴とする。本方法は、ＡＴＸＮ２遺伝子内の部位を標的とするレアカッティングエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、レアカッティングエンドヌクレアーゼによる切断後にＡＴＸＮ２遺伝子内に組み込まれる導入遺伝子とを投与することを含み得る。別の実施形態では、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、タンパク質（例えば、Ｃａｓ９もしくはＣａｓ１２ａタンパク質、またはＴＡＬＥＮタンパク質）、またはリボ核タンパク質複合体（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａと共に、対応するｇＲＮＡ）の形態で送達され得る。導入遺伝子は、誘導多能性幹細胞、プルキンエ細胞、顆粒細胞、ニューロン細胞、またはグリア細胞を含む細胞に組み込むことができる。ＡＴＸＮ２遺伝子内に組み込まれる導入遺伝子は、ＡＴＸＮ２遺伝子のエキソン１のコード配列を保有することができる。導入遺伝子は、ＡＴＸＮ２遺伝子のイントロン１またはエキソン１の中に組み込むことができる。導入遺伝子は、コード配列の上流に、プロモーターをさらに含むことができる。導入遺伝子の組み込みは、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼを含む任意の好適なレアカッティングエンドヌクレアーゼを使用して促進され得る。導入遺伝子は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター）上で合成され得る。あるいは、導入遺伝子は、非ウイルスベクター上で合成され得る。

【0013】

別の実施形態では、本文書は、内因性遺伝子の発現を修飾する方法を特徴とし、本方法は、導入遺伝子を投与することを含み、導入遺伝子は、第１および第２のプロモーター、または双方向プロモーター、当該内因性遺伝子の発現を低減する第１の核酸配列、ならびに当該内因性遺伝子によって産生されるタンパク質と相同性を有するタンパク質をコードする第２の核酸配列を含む。第２の核酸配列は、第１の核酸配列と比較して、異なる核酸配列を含み得る（例えば、コドン縮重または配列の欠如に起因する）。本明細書に記載の導入遺伝子は、第１および第２の核酸配列に作動可能に連結された第１および第２のターミネーターをさらに含むことができる。導入遺伝子は、少なくとも１つのアレルが機能獲得変異を含む場合に使用され得る。機能獲得変異は、ＨＤ（ハンチントン病）、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症）、ＳＣＡ１（脊髄小脳失調症１型）、ＳＣＡ２（脊髄小脳失調症２型）、ＳＣＡ３（脊髄小脳失調症３型またはマシャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ６（脊髄小脳失調症６型）、ＳＣＡ７（脊髄小脳失調症７型）、脆弱Ｘ症候群、脆弱ＸＥ精神遅滞、フリードライヒ運動失調症、筋強直性ジストロフィー１型、筋強直性ジストロフィー２型、脊髄小脳失調症８型、脊髄小脳失調症１２型、球脊髄性筋萎縮症、ＪＰＨ３、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、遺伝性運動性感覚性ニューロパチーＩＩＣ型、シナプス後スローチャネル先天性筋無力症候群、ＰＲＰＳ１過活動性、パーキンソン病、細管集合体ミオパチー、軟骨無形成症、ルブスＸ連鎖精神遅滞症候群、ならびに常染色体優性網膜色素変性症からなる群から選択される疾患をもたらす変異であり得る。導入遺伝子は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターを含むウイルスベクターに保有され得る。導入遺伝子は、４．７ｋｂ以下のサイズであり得る。導入遺伝子は、非ウイルスベクター上にあり得る。導入遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれ得る。

【0014】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を使用して本発明を実施することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体において参照により援用される。矛盾する場合、定義を含めて、本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は、単に例示であり、限定することを意図するものではない。

【0015】

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込む方法であって、
ａ．導入遺伝子を投与することであって、前記導入遺伝子が、
ｉ．第１および第２のスプライスドナー配列、
ｉｉ．第１および第２の部分コード配列、ならびに
ｉｉｉ．１つの双方向プロモーター、または第１および第２のプロモーター、を含む、導入遺伝子を投与することと、
前記内因性遺伝子内の部位を標的とする少なくとも１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼを投与することと、を含み、
前記導入遺伝子が、前記内因性遺伝子内に組み込まれる、方法。
（項目２）
前記第１のスプライスドナーが、前記第１の部分コード配列に作動可能に連結され、前記第２のスプライスドナーが、前記第２の部分コード配列に作動可能に連結される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第１の部分コード配列が、前記第１のプロモーターに作動可能に連結され、前記第２の部分コード配列が、前記第２のプロモーターに作動可能に連結される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記第１および第２の部分コード配列が、双方向プロモーターに作動可能に連結される、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記第１および第２のスプライスドナー、第１および第２の部分コード配列、ならびに第１および第２のプロモーターが、頭対頭（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ）配向で配向される、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記導入遺伝子が、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの第１および第２の標的部位をさらに含み、前記標的部位が、前記第１および第２のスプライスドナーに隣接する、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記導入遺伝子が、前記第１および第２のスプライスドナーに隣接する第１および第２の相同アームをさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記導入遺伝子が、アデノ随伴ウイルスベクター内に保有される、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記導入遺伝子が、前記１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの第１および第２の標的部位をさらに含み、前記標的部位が、前記第１および第２のスプライスドナーに隣接する、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記第１および第２の標的部位が、前記第１および第２の相同アームに隣接する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記導入遺伝子が、前記内因性遺伝子のイントロン内、またはエキソン－イントロン接合部に組み込まれる、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記導入遺伝子が、ＡＴＸＮ２遺伝子もしくはＳＮＣＡ遺伝子のイントロン内、またはエキソン－イントロン接合部に組み込まれる、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記導入遺伝子が、非病原性ＡＴＸＮ２遺伝子のエキソン１によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記導入遺伝子が、非病原性ＳＮＣＡ遺伝子のエキソン２によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記第１および第２の部分コード配列が、同じアミノ酸をコードする、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記第１および第２のコード配列が、核酸配列において異なるが、同じアミノ酸をコードする、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記導入遺伝子が、ベクターに保有され、前記ベクターの形式が、二本鎖直鎖ＤＮＡ、二本鎖環状ＤＮＡ、またはウイルスベクターから選択される、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターから選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記導入遺伝子が、４．７ｋｂ以下である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記内因性遺伝子が、前記部分コード配列の野生型遺伝子である、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記内因性遺伝子が、異常または病原性であり、前記部分コード配列が、前記内因性遺伝子の機能性バージョンから産生される部分タンパク質をコードする、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記第１および第２の部分コード配列が、対応する前記内因性遺伝子と比較して、核酸配列において異なる、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記内因性遺伝子が、ＳＯＤ１、ＴＲＰＶ４、ＣＨＲＮＡ１、ＣＨＲＮＤ、ＣＨＲＮＥ、ＣＨＲＮＢ１、ＰＲＰＳ１、ＬＲＲＫ２、ＳＴＩＭ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＣＰ２、ＳＮＣＡ、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＡＴＸＮ３、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、ＴＢＰ、ＨＴＴ、ＡＲ、ＦＸＮ、ＤＭＰＫ、ＰＡＢＰＮ１、ＡＴＸＮ８、ＲＨＯ、またはＣ９ｏｒｆ７２から選択される、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記導入遺伝子が、第１および第２のターミネーターをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２６）
導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込む方法であって、
ａ．導入遺伝子を投与することであって、前記導入遺伝子が、
ｉ．スプライスドナー配列、
ｉｉ．部分コード配列、
ｉｉｉ．プロモーター、
ｉｖ．１つのＲＮＡ干渉カセット、ならびに
ｖ．任意選択的に、第１および第２の相同アームまたは左右のトランスポゾン末端、を含む、導入遺伝子を投与することと、
ｂ．前記内因性遺伝子内の部位を標的とする少なくとも１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼまたはトランスポザーゼを投与することと、を含み、
前記導入遺伝子が、前記内因性遺伝子内に組み込まれる、方法。
（項目２７）
導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込む方法であって、
ａ．導入遺伝子を投与することであって、前記導入遺伝子が、
ｉ．左右のトランスポゾン末端、
ｉｉ．第１および第２のスプライスドナー配列、
ｉｉｉ．第１および第２の部分コード配列、
ｉｖ．１つの双方向プロモーター、または第１および第２のプロモーター、ならびに
ｖ．任意選択的に、第１および第２のターミネーター、を含む、導入遺伝子を投与することと、
ｂ．トランスポザーゼを投与することと、を含み、
前記導入遺伝子が、前記内因性遺伝子内に組み込まれる、方法。
（項目２８）
導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込む方法であって、
ａ．導入遺伝子を投与することであって、前記導入遺伝子が、
ｉ．スプライスアクセプター配列、
ｉｉ．部分コード配列、
ｉｉｉ．ターミネーター、および
ｉｖ．１つのＲＮＡ干渉カセット、ならびに
ｖ．任意選択的に、第１および第２の相同アーム、または左右のトランスポゾン末端、を含む、導入遺伝子を投与することと、
ｂ．前記内因性遺伝子内の部位を標的とする少なくとも１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼまたはトランスポザーゼを投与することと、を含み、
前記導入遺伝子が、前記内因性遺伝子内に組み込まれる、方法。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】内因性遺伝子への標的化挿入および５’末端の修復のための例示的な導入遺伝子の図である。ＴＳ１：標的部位１、ＳＤ１：スプライスドナー部位１、ＣＤＳ１：コード配列１、Ｐ１：プロモーター１、ＴＳ２：標的部位２、ＳＤ２：スプライスドナー部位２、ＣＤＳ２：コード配列２、Ｐ２：プロモーター２、ＨＡ１：相同アーム１、ＨＡ２：相同アーム２、Ｔ１：ターミネーター１、Ｔ２：ターミネーター２、ＡＳ１：追加配列１、ＡＳ２：追加配列２。

【図2】例示的な遺伝子のイントロンへの導入遺伝子の組み込みを示す図である。導入遺伝子は、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの２つの標的部位、２つのスプライスドナー配列、２つのコード配列（１．１および１．２）、ならびに２つのプロモーターを含む。組み込みは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して進行する。ＡＴＧ：開始コドン、ＴＡＡ：停止コドン

【図3】例示的な遺伝子への導入遺伝子の組み込みを示す図である。導入遺伝子は、２つの相同アーム、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの２つの標的部位、２つのスプライスドナー配列、２つのコード配列（１．１および１．２）、ならびに２つのプロモーターを含む。組み込みは、相同組換え（ＨＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のいずれかを介して進行する。

【図4】導入遺伝子の例示的な遺伝子への組み込みを示す図である。導入遺伝子は、２つの相同アーム、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの２つの標的部位、２つのスプライスドナー配列、２つのコード配列（１．１および１．２）、ならびに２つのプロモーターを含む。組み込みは、相同組換え（ＨＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のいずれかを介して進行する。

【図5】本明細書に記載の導入遺伝子の組み込み後に産生される遺伝子産物の図である。導入遺伝子内の第１および第２の部分コード配列が内因性遺伝子のコード配列と相同である場合、ＲＮＡヘアピンおよびｄｓＲＮＡが形成され得る（上）。内因性遺伝子のコード配列との相同性を低減させて、第１および第２の部分コード配列をコドン調整した場合、ＲＮＡ対合が低減され得る（下）。Ｔ１：転写産物１、Ｔ２：転写産物２、Ｔ３：転写産物３、＋１：ＲＮＡ合成開始部位、Ｓ：センス、ＡｎｔｉＳ：アンチセンス。

【図6】ＡＴＸＮ２遺伝子のエキソン１～３の図である。ＡＴＸＮ２遺伝子に組み込むためのｐＢ１０１２－Ｄ１およびｐＢＡ１１４１の導入遺伝子も示されている。

【図7】ＡＴＸＮ２遺伝子内のｐＢ１０１２－Ｄ１またはｐＢＡ１１４１の導入遺伝子の組み込み結果の図である。

【図8】例示的な遺伝子のエキソンへの導入遺伝子の組み込みを示す図である。導入遺伝子は、２つの相同アーム、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの２つの標的部位、２つのスプライスドナー配列、２つのコード配列（１．１および１．２）、ならびに２つのプロモーターを含む。組み込みは、相同組換え（ＨＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のいずれかを介して進行する。

【図9】サイレンシング配列およびサイレンシング耐性コード配列を含む導入遺伝子の図である。２つのシナリオが示される。シナリオ１は、ＷＴタンパク質の置換物を産生しながら、内因性遺伝子の両方のアレルをサイレンシングするためのアプローチを示す図である。シナリオ２は、タンパク質の置換物を産生しながら、２つのアレルをサイレンシングするアプローチを示す図であり、一方は機能獲得変異を有するアレルであり、他方はＷＴ配列を有するアレルである。サイレンシング配列は、ＲＮＡｉカセットであり得る。サイレンシング耐性ＣＤＳは、結合を阻止するためにサイレンシング標的配列内に変異を有することができる。あるいは、ＣＤＳは、配列を除去することができる。

【図10】１つのアレルにおける機能獲得変異を有する細胞中のＳＯＤ１アレルをサイレンシングするための導入遺伝子の構造を示す図である。導入遺伝子は、置換ＳＯＤ１タンパク質を発現するためのコドン調整配列も含む。

【図11】例示的な内因性遺伝子のサイレンシングおよび内因性遺伝子のタンパク質産物の置換のための導入遺伝子の構造の例を示す図である。

【図12】タンパク質産生を置き換えながら、機能獲得アレルをサイレンシングするための一般的なアプローチを示す図である。ＲＮＡｉカセットによるサイレンシングを阻止するための変異を有する部分コード配列が、遺伝子に組み込まれる。遺伝子の５’または３’末端に組み込まれた場合、結果として、結果１：内因性遺伝子のサイレンシング、結果２：内因性遺伝子内のアレルのうちの１つの修飾、結果３：組み込み事象由来の新しいタンパク質の産生が得られる場合があり、ここでｍＲＮＡが、サイレンシング耐性であり、タンパク質産物が、元の遺伝子と同じまたは異なる配列を含む。

【図13】内因性遺伝子の発現をサイレンシングし、タンパク質産生を置き換えるための導入遺伝子の図である。ＣＤＳ１およびＣＤＳ２は、内因性遺伝子の部分コード配列であり得る。ＣＤＳは、ＲＮＡｉカセットの対応する標的に変異を含むか、または配列が除外され得る。組み込みのための標的は、イントロン内にあってもよいが、イントロンの内因性スプライスドナー配列の後にある。また、組み込みのための標的は、イントロン－エキソン接合部にあり得る。

【図14】内因性遺伝子の発現をサイレンシングし、タンパク質産生を置き換えるための導入遺伝子の図である。ＣＤＳ１およびＣＤＳ２は、内因性遺伝子の完全コード配列であり得る。ＣＤＳは、ＲＮＡｉカセットの対応する標的に変異を含むか、または配列が除外され得る。組み込みのための標的は、イントロン内にあってもよいが、イントロンの内因性スプライスドナー配列の後にある。また、組み込みのための標的は、イントロン－エキソン接合部にあり得る。

【図15】内因性遺伝子の発現をサイレンシングし、タンパク質産生を置き換えるための導入遺伝子の図である。ＣＤＳ１およびＣＤＳ２は、内因性遺伝子の完全コード配列であり得る。ＣＤＳは、ＲＮＡｉカセットの対応する標的に変異を含むか、または配列が除外され得る。組み込みのための標的は、エキソン内にあってもよい。

【図16】内因性遺伝子の発現をサイレンシングし、タンパク質産生を置き換えるための導入遺伝子の図である。ＣＤＳ１およびＣＤＳ２は、内因性遺伝子の完全コード配列であり得る。ＣＤＳは、ＲＮＡｉカセットの対応する標的に変異を含むか、または配列が除外され得る。組み込みのための標的は、５’ＵＴＲ内にあってもよい。組み込みのための標的は、５’ＵＴＲ領域内のイントロンであってもよいが、ＣＤＳに作動可能に連結されたスプライスアクセプターが必要である。

【図17】内因性遺伝子の発現をサイレンシングし、タンパク質産生を置き換えるための導入遺伝子の図である。ＣＤＳ１およびＣＤＳ２は、内因性遺伝子の部分コード配列であり得る。ＣＤＳは、ＲＮＡｉカセットの対応する標的に変異を含むか、または配列が除外され得る。組み込みの標的は、開始コドンと停止コドンとの間の任意の場所であってもよいが、内因性スプライスアクセプター内ではなく、または最後の内因性スプライス（ｓｌｉｃｅ）アクセプターの下流ではない。

【図18】本明細書に記載の導入遺伝子の組み込みを検出するゲルの画像である。１：１ｋｂラダー、２：１５９４ｂｐの予想サイズを有するｐＢＡ１１４１の３’ＨＲ接合部、３：１７７５ｂｐの予想サイズを有するｐＢＡ１１４１の３’ＨＲ接合部、４：１７７５ｂｐの予想サイズを有するｐＢＡ１１４１の３’ＨＲ接合部、５：２０６７ｂｐの予想サイズを有するｐＢＡ１１４１の３’ＮＨＥＪリバース、６：８１３ｂｐの予想サイズを有するｐＢＡ１１４２の３’ＮＨＥＪフォワード接合部、７：１２２５ｂｐの予想サイズを有するｐＢＡ１１４３の３’ＨＲ接合部、８：１４０７ｂｐの予想サイズを有するｐＢＡ１１４３の３’ＨＲ接合部、９：１２２５ｂｐの予想サイズを有するｐＢＡ１１４３の３’ＨＲ接合部、１０：１４０７ｂｐの予想サイズを有するｐＢＡ１１４３の３’ＨＲ接合部、１１：１ｋｂラダー、１２：プライマーｏＮＪＢ２０１＋ｏＮＪＢ１９０によるＷＴのＤＮＡ対照、１３：プライマーｏＮＪＢ２０２＋ｏＮＪＢ１９１によるＷＴのＤＮＡ対照、１４：プライマーｏＮＪＢ１９７＋ｏＮＪＢ１９１によるＷＴのＤＮＡ対照、１５：プライマーｏＮＪＢ２０２＋ｏＮＪＢ２１１によるＷＴのＤＮＡ対照、１６：１ｋｂラダー、１７：ｐＢＡ１１４１＋Ｃａｓ９トランスフェクションのゲノムＤＮＡ対照、１８：ｐＢＡ１１４２トランスフェクションのゲノムＤＮＡ対照、１９：ｐＢＡ１１４３＋Ｃａｓ９トランスフェクションのゲノムＤＮＡ対照、２０：ｐＢＡ１１４１＋Ｃａｓ１２ａトランスフェクションのゲノムＤＮＡ対照、２１：ｐＢＡ１１４２＋Ｃａｓ１２ａトランスフェクションのゲノムＤＮＡ対照、２２：ｐＢＡ１１４３＋Ｃａｓ１２ａトランスフェクションのゲノムＤＮＡ対照、２３：ＷＴ対照、２４：ＤＮＡなしの対照。

【発明を実施するための形態】

【0017】

内因性遺伝子のコード配列を修飾するための方法および組成物が本明細書に開示される。一部の実施形態では、方法は、導入遺伝子を内因性遺伝子に挿入することを含み、導入遺伝子は、内因性遺伝子のコード配列を置換する部分コード配列を提供する。また、置換タンパク質を発現すると共に、内因性遺伝子の発現を低減するための方法および組成物も、本明細書に開示される。

【0018】

一実施形態では、本文書は、導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込み、ｍＲＮＡまたはタンパク質産物を修飾する方法を特徴とする。本方法は、導入遺伝子を投与することを含み、導入遺伝子は、第１および第２のスプライスドナー配列、第１および第２の部分コード配列、１つの双方向プロモーター、または第１および第２のプロモーター、ならびに、任意選択的に、第１および第２のターミネーターを含み、導入遺伝子は、内因性遺伝子内の部位を標的とする少なくとも１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼと共に投与され、導入遺伝子は、内因性遺伝子内に組み込まれる。内因性遺伝子は、ヒト細胞を含む真核細胞内にあってもよい。導入遺伝子は、第１の部分コード配列に作動可能に連結された第１のスプライスドナーを有することができ、第２のスプライスドナーは、第２の部分コード配列に作動可能に連結され得る。また、第１の部分コード配列は、第１のプロモーターに作動可能に連結され得、第２の部分コード配列は、第２のプロモーターに作動可能に連結され得る。あるいは、第１および第２の部分コード配列は、双方向プロモーターに作動可能に連結され得る。第１および第２のスプライスドナー、第１および第２の部分コード配列、ならびに第１および第２のプロモーターを有する導入遺伝子は、頭対頭配向（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）で配向され得る。これらの導入遺伝子は、アデノ随伴ウイルスベクター内に保有され、標的二本鎖切断へのＮＨＥＪ媒介組み込みを介して内因性遺伝子に組み込まれ得る。導入遺伝子は、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの第１および第２の標的部位をさらに含み得、標的部位は、第１および第２のスプライスドナーに隣接する。あるいは、導入遺伝子は、第１および第２のスプライスドナーに隣接する左右の相同アームをさらに含み得る。導入遺伝子は、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの第１および第２の標的部位の両方を有することができ、標的部位は、第１および第２のスプライスドナーに隣接する。第１および第２の標的部位は、第１および第２の相同アームに隣接することができる。本方法に記載の導入遺伝子は、内因性遺伝子のイントロン内またはエキソン－イントロン接合部に組み込むことができる。内因性遺伝子は、ＡＴＸＮ２またはＳＮＣＡであってもよく、組み込みのための部位は、ＡＴＸＮ２遺伝子またはＳＮＣＡ遺伝子のイントロン内、またはエキソン－イントロン接合部であってもよい。ＡＴＸＮ２に組み込まれるとき、導入遺伝子は、非病原性ＡＴＸＮ２遺伝子のエキソン１によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含むことができる。ＳＮＣＡに組み込まれるとき、導入遺伝子は、非病原性ＳＮＣＡ遺伝子のエキソン２によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含むことができる。組み込みは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼの使用を介して生じ得る。第１および第２の部分コード配列は、同じアミノ酸をコードすることができる。第１および第２のコード配列は、核酸配列において（例えば、コドン縮重を通して）異なっていてもよいが、依然として同じアミノ酸をコードする。本方法に記載の導入遺伝子は、ベクターに保有され得、ベクターの形式は、二本鎖直鎖ＤＮＡ、二本鎖環状ＤＮＡ、またはウイルスベクターから選択される。導入遺伝子は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターから選択されるウイルスベクターに保有され得る。導入遺伝子は、４．７ｋｂ以下の全長を有し得る。本方法は、標的内因性遺伝子によって産生されるペプチドをコードする部分コード配列を有する導入遺伝子を使用することを含み得る。部分コード配列は、標的内因性遺伝子のＷＴバージョンであり得、標的内因性遺伝子は、異常遺伝子、または病原性変異を含む遺伝子であり得る。宿主遺伝子は、一実施形態では、タンパク質の発現が異常である、言い換えれば、タンパク質が、発現しない、機能性タンパク質よりも低いレベルもしくは高いレベルで発現する、またはタンパク質もしくはその一部が非機能性で宿主において障害をもたらすように発現する、遺伝子である。この方法で使用される導入遺伝子は、対応する内因性遺伝子と比較して核酸配列が異なる第１および第２の部分コード配列を有することができる。言い換えれば、部分コード配列は、内因性遺伝子に対して最小限の相同性を有するように（コドン縮重を介して）修飾され得る。この方法を使用して、ＳＯＤ１、ＴＲＰＶ４、ＣＨＲＮＡ１、ＣＨＲＮＤ、ＣＨＲＮＥ、ＣＨＲＮＢ１、ＰＲＰＳ１、ＬＲＲＫ２、ＳＴＩＭ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＣＰ２、ＳＮＣＡ、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＡＴＸＮ３、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、ＴＢＰ、ＨＴＴ、ＡＲ、ＦＸＮ、ＤＭＰＫ、ＰＡＢＰＮ１、ＡＴＸＮ８、ＲＨＯ、またはＣ９ｏｒｆ７２を含む機能獲得障害に関与する遺伝子を修飾することができる。

【0019】

別の実施形態では、本文書は、導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込み、ｍＲＮＡまたはタンパク質産物を修飾する方法を特徴とする。本方法は、導入遺伝子を投与することを含み、導入遺伝子は、左右のトランスポゾン末端、第１および第２のスプライスドナー配列、第１および第２の部分コード配列、１つの双方向プロモーター、または第１および第２のプロモーター、ならびに、任意選択的に、第１および第２のターミネーターを含み、導入遺伝子は、内因性遺伝子内の部位を標的とする少なくとも１つのトランスポザーゼと共に投与され、導入遺伝子は、内因性遺伝子内に組み込まれる。内因性遺伝子は、ヒト細胞を含む真核細胞内にあってもよい。導入遺伝子は、第１の部分コード配列に作動可能に連結された第１のスプライスドナーを有することができ、第２のスプライスドナーは、第２の部分コード配列に作動可能に連結され得る。また、第１の部分コード配列は、第１のプロモーターに作動可能に連結され得、第２の部分コード配列は、第２のプロモーターに作動可能に連結され得る。あるいは、第１および第２の部分コード配列は、双方向プロモーターに作動可能に連結され得る。第１および第２のスプライスドナー、第１および第２の部分コード配列、ならびに第１および第２のプロモーターを有する導入遺伝子は、頭対頭配向（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）で配向され得る。導入遺伝子は、第１および第２のスプライスドナーに隣接する左右のトランスポゾン末端をさらに含み得る。トランスポザーゼは、ＣＲＩＳＰＲトランスポザーゼであってもよく、ＣＲＩＳＰＲトランスポザーゼは、Ｃａｓ１２ｋまたはＣａｓ６タンパク質を含む。これらの導入遺伝子は、アデノ随伴ウイルスベクター内に保有され得る。本方法に記載の導入遺伝子は、内因性遺伝子のイントロン内またはエキソン－イントロン接合部に組み込むことができる。内因性遺伝子は、ＡＴＸＮ２またはＳＮＣＡであってもよく、組み込みのための部位は、ＡＴＸＮ２遺伝子またはＳＮＣＡ遺伝子のイントロン内、またはエキソン－イントロン接合部であってもよい。ＡＴＸＮ２に組み込まれるとき、導入遺伝子は、非病原性ＡＴＸＮ２遺伝子のエキソン１によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含むことができる。ＳＮＣＡに組み込まれるとき、導入遺伝子は、非病原性ＳＮＣＡ遺伝子のエキソン２によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含むことができる。第１および第２の部分コード配列は、同じアミノ酸をコードすることができる。第１および第２のコード配列は、核酸配列において（例えば、コドン縮重を通して）異なっていてもよいが、依然として同じアミノ酸をコードする。本方法に記載の導入遺伝子は、ベクターに保有され得、ベクターの形式は、二本鎖直鎖ＤＮＡ、二本鎖環状ＤＮＡ、またはウイルスベクターから選択される。導入遺伝子は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターから選択されるウイルスベクターに保有され得る。導入遺伝子は、４．７ｋｂ以下の全長を有し得る。本方法は、標的内因性遺伝子によって産生されるペプチドをコードする部分コード配列を有する導入遺伝子を使用することを含み得る。部分コード配列は、標的内因性遺伝子のＷＴバージョンであり得、標的内因性遺伝子は、異常遺伝子、または病原性変異を含む遺伝子であり得る。この方法で使用される導入遺伝子は、対応する内因性遺伝子と比較して核酸配列が異なる第１および第２の部分コード配列を有することができる。言い換えれば、部分コード配列は、内因性遺伝子に対して最小限の相同性を有するように（コドン縮重を介して）修飾され得る。この方法を使用して、ＳＯＤ１、ＴＲＰＶ４、ＣＨＲＮＡ１、ＣＨＲＮＤ、ＣＨＲＮＥ、ＣＨＲＮＢ１、ＰＲＰＳ１、ＬＲＲＫ２、ＳＴＩＭ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＣＰ２、ＳＮＣＡ、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＡＴＸＮ３、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、ＴＢＰ、ＨＴＴ、ＡＲ、ＦＸＮ、ＤＭＰＫ、ＰＡＢＰＮ１、ＡＴＸＮ８、ＲＨＯ、またはＣ９ｏｒｆ７２を含む機能獲得障害に関与する遺伝子を修飾することができる。

【0020】

本文書はまた、導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込み、ｍＲＮＡまたはタンパク質産物を修飾する方法を特徴とする。本方法は、導入遺伝子を投与することを含み、導入遺伝子は、スプライスアクセプター配列、部分コード配列、ターミネーター、および１つのＲＮＡ干渉カセットを含み、導入遺伝子は、内因性遺伝子内の部位を標的とする少なくとも１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼまたはトランスポザーゼと共に投与され、導入遺伝子は、内因性遺伝子内に組み込まれる。部分コード配列は、ＲＮＡｉカセットによるサイレンシングを阻止する変異を含むことができる。内因性遺伝子は、ヒト細胞を含む真核細胞内にあってもよい。導入遺伝子は、部分コード配列に作動可能に連結されたスプライスアクセプターを有することができる。また、部分コード配列は、ターミネーターに作動可能に連結され得る。内因性遺伝子は、ヒト細胞を含む真核細胞内にあってもよい。導入遺伝子は、部分コード配列に作動可能に連結されたスプライスアクセプターを有することができる。また、部分コード配列は、ターミネーターに作動可能に連結され得る。これらの導入遺伝子は、アデノ随伴ウイルスベクター内に保有され、ＮＨＥＪ媒介性の標的二本鎖切断への組み込みまたは相同組換えを介して内因性遺伝子に組み込まれ得る。導入遺伝子は、左右の相同アームをさらに含み得る。本方法に記載の導入遺伝子は、内因性遺伝子のイントロン内またはイントロン－エキソン接合部に組み込むことができる。ＲＮＡｉカセットは、内因性遺伝子と相同性を有する配列に作動可能に連結されたプロモーターであり得る。ＲＮＡｉカセットは、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを生成することができる。ＲＮＡｉカセットは、内因性遺伝子と相同的な配列を含むことができ、導入遺伝子内の部分コード配列は、内因性遺伝子と同じ配列を含むことができるが、ＲＮＡｉカセットの標的部位は、組み込まれた導入遺伝子（例えば、同義の単一ヌクレオチド多型、挿入または欠失を有する）による発現のサイレンシングを阻止するように変異され得る。組み込みは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼの使用を介して、またはＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼとの使用を介して生じ得る。ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼが使用される場合、導入遺伝子は、相同アームの代わりに、左右のトランスポゾン末端を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ関連トランスザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓｅ）は、Ｃａｓ６タンパク質またはＣａｓ１２ｋタンパク質を含み得る。本方法に記載の導入遺伝子は、ベクターに保有され得、ベクターの形式は、二本鎖直鎖ＤＮＡ、二本鎖環状ＤＮＡ、またはウイルスベクターから選択される。導入遺伝子は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターから選択されるウイルスベクターに保有され得る。導入遺伝子は、４．７ｋｂ以下の全長を有し得る。本方法は、標的内因性遺伝子によって産生されるペプチドをコードする部分コード配列を有する導入遺伝子を使用することを含み得る。部分コード配列は、標的内因性遺伝子のＷＴバージョンであり得、標的内因性遺伝子は、異常遺伝子、または病原性変異を含む遺伝子であり得る。この方法を使用して、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ３、ＳＯＤ１、ＴＲＰＶ４、ＣＨＲＮＡ１、ＣＨＲＮＤ、ＣＨＲＮＥ、ＣＨＲＮＢ１、ＰＲＰＳ１、ＬＲＲＫ２、ＳＴＩＭ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＣＰ２、ＳＮＣＡ、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、ＴＢＰ、ＨＴＴ、ＡＲ、ＦＸＮ、ＤＭＰＫ、ＰＡＢＰＮ１、ＡＴＸＮ８、ＲＨＯ、またはＣ９ｏｒｆ７２を含む、機能獲得障害に関与する遺伝子を修飾することができる。

【0021】

本文書はまた、導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込み、ｍＲＮＡまたはタンパク質産物を修飾する方法を特徴とする。本方法は、導入遺伝子を投与することを含み、導入遺伝子は、スプライスアクセプター配列、第１および第２の部分コード配列、ターミネーター、ならびに１つのＲＮＡ干渉カセットを含み、導入遺伝子は、内因性遺伝子内の部位を標的とする少なくとも１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼまたはトランスポザーゼと共に投与され、導入遺伝子は、内因性遺伝子内に組み込まれる。第１および第２の部分コード配列は、ＲＮＡｉカセットによるサイレンシングを阻止する変異を含むことができる。内因性遺伝子は、ヒト細胞を含む真核細胞内にあってもよい。導入遺伝子は、第１の部分コード配列に作動可能に連結された第１のスプライスアクセプター、および第２の部分コード配列に作動可能に連結された第２のスプライスアクセプターを有することができる。また、第１の部分コード配列は、第１のターミネーターに作動可能に連結され得、第２の部分コード配列は、第２のターミネーターに作動可能に連結され得る。部分コード配列は、２つのターミネーター間のＲＮＡｉカセットを用いて、尾対尾配向（ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）であり得る。これらの導入遺伝子は、アデノ随伴ウイルスベクター内に保有され、ＮＨＥＪ媒介性の標的二本鎖切断への組み込みまたは相同組換えを介して内因性遺伝子に組み込まれ得る。導入遺伝子は、左右の相同アームをさらに含み得る。本方法に記載の導入遺伝子は、内因性遺伝子のイントロン内またはイントロン－エキソン接合部に組み込むことができる。ＲＮＡｉカセットは、内因性遺伝子と相同性を有する配列に作動可能に連結されたプロモーターであり得る。ＲＮＡｉカセットは、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを生成することができる。ＲＮＡｉカセットは、内因性遺伝子に相同的な配列を含むことができ、導入遺伝子内の部分コード配列は、内因性遺伝子と同じ配列を含むことができるが、ＲＮＡｉカセットの標的部位は、サイレンシングを阻止するように変異され得る。組み込みは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼの使用を介して、またはＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼとの使用を介して生じ得る。ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼが使用される場合、導入遺伝子は、相同アームの代わりに、左右のトランスポゾン末端を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポーズは、Ｃａｓ６タンパク質またはＣａｓ１２ｋタンパク質を含み得る。本方法に記載の導入遺伝子は、ベクターに保有され得、ベクターの形式は、二本鎖直鎖ＤＮＡ、二本鎖環状ＤＮＡ、またはウイルスベクターから選択される。導入遺伝子は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターから選択されるウイルスベクターに保有され得る。導入遺伝子は、４．７ｋｂ以下の全長を有し得る。本方法は、標的内因性遺伝子によって産生されるペプチドをコードする部分コード配列を有する導入遺伝子を使用することを含み得る。部分コード配列は、標的内因性遺伝子のＷＴバージョンであり得、標的内因性遺伝子は、異常遺伝子、または病原性変異を含む遺伝子であり得る。この方法を使用して、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ３、ＳＯＤ１、ＴＲＰＶ４、ＣＨＲＮＡ１、ＣＨＲＮＤ、ＣＨＲＮＥ、ＣＨＲＮＢ１、ＰＲＰＳ１、ＬＲＲＫ２、ＳＴＩＭ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＣＰ２、ＳＮＣＡ、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、ＴＢＰ、ＨＴＴ、ＡＲ、ＦＸＮ、ＤＭＰＫ、ＰＡＢＰＮ１、ＡＴＸＮ８、ＲＨＯ、またはＣ９ｏｒｆ７２を含む、機能獲得障害に関与する遺伝子を修飾することができる。

【0022】

本文書はまた、導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込み、ｍＲＮＡまたはタンパク質産物を修飾する方法を特徴とする。本方法は、導入遺伝子を投与することを含み、導入遺伝子は、スプライスドナー配列、部分コード配列、プロモーター、およびＲＮＡ干渉カセットを含み、導入遺伝子は、内因性遺伝子内の部位を標的とする少なくとも１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼまたはトランスポザーゼと共に投与され、導入遺伝子は、内因性遺伝子内に組み込まれる。部分コード配列は、ＲＮＡｉカセットによるサイレンシングを阻止する変異を含むことができる。例えば、ＲＮＡｉカセットが、内因性遺伝子によって産生される転写産物内の配列を標的とするように設計されている場合、部分コード配列（導入遺伝子内に見出される）は、内因性遺伝子および対応するＲＮＡｉ標的と同じコード配列を含んでもよく、それによって修飾された内因性遺伝子をＲＮＡｉカセットによる同じ干渉に供する。修飾された内因性遺伝子のサイレンシングを最小化または阻止するために、導入遺伝子内の部分コード配列を変異させることができる。内因性遺伝子は、ヒト細胞を含む真核細胞内にあってもよい。導入遺伝子は、部分コード配列に作動可能に連結されたスプライスドナーを有し得る。また、部分コード配列は、プロモーターに作動可能に連結され得る。これらの導入遺伝子は、アデノ随伴ウイルスベクター内に保有され、ＮＨＥＪ媒介性の標的二本鎖切断への組み込みまたは相同組換えを介して内因性遺伝子に組み込まれ得る。導入遺伝子は、左右の相同アームをさらに含み得る。本方法に記載の導入遺伝子は、内因性遺伝子のイントロン内またはエキソン－イントロン接合部に組み込むことができる。ＲＮＡｉカセットは、内因性遺伝子と相同性を有する配列に作動可能に連結されたプロモーターであり得る。ＲＮＡｉカセットは、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを生成することができる。ＲＮＡｉカセットは、内因性遺伝子に相同的な配列を含むことができ、導入遺伝子内の部分コード配列は、内因性遺伝子と同じ配列を含むことができるが、ＲＮＡｉカセットの標的部位は、サイレンシングを阻止するように変異され得る。内因性遺伝子は、ＡＴＸＮ２またはＳＮＣＡであってもよく、組み込みのための部位は、ＡＴＸＮ２遺伝子またはＳＮＣＡ遺伝子のイントロン内、またはエキソン－イントロン接合部であってもよい。ＡＴＸＮ２に組み込まれる場合、導入遺伝子は、非病原性ＡＴＸＮ２遺伝子のエキソン１によって産生されるペプチドをコードする部分コード配列を含むことができる。ＲＮＡｉカセットは、ＡＴＸＮ２遺伝子のエキソン１からの転写配列を標的とするように設計することができ、部分コード配列内の対応する配列は、サイレンシングを阻止するように変異させることができる。ＳＮＣＡに組み込まれる場合、導入遺伝子は、非病原性ＳＮＣＡ遺伝子のエキソン２によって産生されるペプチドをコードする部分コード配列を含むことができる。ＲＮＡｉカセットは、ＳＮＣＡ遺伝子のエキソン２からの転写配列を標的とするように設計することができ、部分コード配列内の対応する配列は、サイレンシングを阻止するように変異させることができる。組み込みは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼの使用を介して、またはＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼとの使用を介して生じ得る。ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼが使用される場合、導入遺伝子は、相同アームの代わりに、左右のトランスポゾン末端を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポーズは、Ｃａｓ６タンパク質またはＣａｓ１２ｋタンパク質を含み得る。本方法に記載の導入遺伝子は、ベクターに保有され得、ベクターの形式は、二本鎖直鎖ＤＮＡ、二本鎖環状ＤＮＡ、またはウイルスベクターから選択される。導入遺伝子は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターから選択されるウイルスベクターに保有され得る。導入遺伝子は、４．７ｋｂ以下の全長を有し得る。本方法は、標的内因性遺伝子によって産生されるペプチドをコードする部分コード配列を有する導入遺伝子を使用することを含み得る。部分コード配列は、標的内因性遺伝子のＷＴバージョンであり得、標的内因性遺伝子は、異常遺伝子、または病原性変異を含む遺伝子であり得る。この方法を使用して、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ３、ＳＯＤ１、ＴＲＰＶ４、ＣＨＲＮＡ１、ＣＨＲＮＤ、ＣＨＲＮＥ、ＣＨＲＮＢ１、ＰＲＰＳ１、ＬＲＲＫ２、ＳＴＩＭ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＣＰ２、ＳＮＣＡ、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、ＴＢＰ、ＨＴＴ、ＡＲ、ＦＸＮ、ＤＭＰＫ、ＰＡＢＰＮ１、ＡＴＸＮ８、ＲＨＯ、またはＣ９ｏｒｆ７２を含む、機能獲得障害に関与する遺伝子を修飾することができる。

【0023】

本文書はまた、導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込み、ｍＲＮＡまたはタンパク質産物を修飾する方法を特徴とする。本方法は、導入遺伝子を投与することを含み、導入遺伝子は、第１および第２のスプライスドナー配列、第１および第２の部分コード配列、第１および第２のプロモーター（または双方向プロモーター）、ならびにＲＮＡ干渉カセットを含み、導入遺伝子は、内因性遺伝子内の部位を標的とする少なくとも１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼまたはトランスポザーゼと共に投与され、導入遺伝子は、内因性遺伝子内に組み込まれる。部分コード配列は、ＲＮＡｉカセットによるサイレンシングを阻止する変異を含むことができる。内因性遺伝子は、ヒト細胞を含む真核細胞内にあってもよい。導入遺伝子は、第１の部分コード配列に作動可能に連結された第１のスプライスドナー、および第２の部分コード配列に作動可能に連結された第２のスプライスドナーを有することができる。また、第１の部分コード配列は、第１のプロモーターに作動可能に連結され得、第２の部分コード配列は、第２のプロモーターに作動可能に連結され得る。部分コード配列は、頭対頭配向であり得、ＲＮＡｉカセットは、第１のプロモーターと第２のプロモーターとの間に配置することができる。これらの導入遺伝子は、アデノ随伴ウイルスベクター内に保有され、ＮＨＥＪ媒介性の標的二本鎖切断への組み込みまたは相同組換えを介して内因性遺伝子に組み込まれ得る。導入遺伝子は、左右の相同アームをさらに含み得る。本方法に記載の導入遺伝子は、内因性遺伝子のイントロン内またはエキソン－イントロン接合部に組み込むことができる。ＲＮＡｉカセットは、内因性遺伝子と相同性を有する配列に作動可能に連結されたプロモーターであり得る。ＲＮＡｉカセットは、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを生成することができる。ＲＮＡｉカセットは、内因性遺伝子に相同的な配列を含むことができ、導入遺伝子内の部分コード配列は、内因性遺伝子と同じ配列を含むことができるが、ＲＮＡｉカセットの標的部位は、サイレンシングを阻止するように変異され得る。内因性遺伝子は、ＡＴＸＮ２またはＳＮＣＡであってもよく、組み込みのための部位は、ＡＴＸＮ２遺伝子またはＳＮＣＡ遺伝子のイントロン内、またはエキソン－イントロン接合部であってもよい。ＡＴＸＮ２に組み込まれる場合、導入遺伝子は、非病原性ＡＴＸＮ２遺伝子のエキソン１によって産生されるペプチドをコードする部分コード配列を含むことができる。ＲＮＡｉカセットは、ＡＴＸＮ２遺伝子のエキソン１からの転写配列を標的とするように設計することができ、部分コード配列内の対応する配列は、サイレンシングを阻止するように変異させることができる。ＳＮＣＡに組み込まれる場合、導入遺伝子は、非病原性ＳＮＣＡ遺伝子のエキソン２によって産生されるペプチドをコードする部分コード配列を含むことができる。ＲＮＡｉカセットは、ＳＮＣＡ遺伝子のエキソン２からの転写配列を標的とするように設計することができ、部分コード配列内の対応する配列は、サイレンシングを阻止するように変異させることができる。組み込みは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼの使用を介して、またはＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼとの使用を介して生じ得る。ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼが使用される場合、導入遺伝子は、相同アームの代わりに、左右のトランスポゾン末端を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポーズは、Ｃａｓ６タンパク質またはＣａｓ１２ｋタンパク質を含み得る。本方法に記載の導入遺伝子は、ベクターに保有され得、ベクターの形式は、二本鎖直鎖ＤＮＡ、二本鎖環状ＤＮＡ、またはウイルスベクターから選択される。導入遺伝子は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターから選択されるウイルスベクターに保有され得る。導入遺伝子は、４．７ｋｂ以下の全長を有し得る。本方法は、標的内因性遺伝子によって産生されるペプチドをコードする部分コード配列を有する導入遺伝子を使用することを含み得る。部分コード配列は、標的内因性遺伝子のＷＴバージョンであり得、標的内因性遺伝子は、異常遺伝子、または病原性変異を含む遺伝子であり得る。この方法で使用される導入遺伝子は、対応する内因性遺伝子と比較して核酸配列が異なる第１および第２の部分コード配列を有することができる。言い換えれば、部分コード配列は、内因性遺伝子に対して最小限の相同性を有するように（コドン縮重を介して）修飾され得る。この方法を使用して、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ３、ＳＯＤ１、ＴＲＰＶ４、ＣＨＲＮＡ１、ＣＨＲＮＤ、ＣＨＲＮＥ、ＣＨＲＮＢ１、ＰＲＰＳ１、ＬＲＲＫ２、ＳＴＩＭ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＣＰ２、ＳＮＣＡ、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、ＴＢＰ、ＨＴＴ、ＡＲ、ＦＸＮ、ＤＭＰＫ、ＰＡＢＰＮ１、ＡＴＸＮ８、ＲＨＯ、またはＣ９ｏｒｆ７２を含む、機能獲得障害に関与する遺伝子を修飾することができる。

【0024】

本方法の実施は、本明細書に開示される組成物の調製および使用に加えて、別段の指示がない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、ならびに当該技術分野内の関連分野における従来の技術を使用する。これらの技術は、文献において完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９および２００１の第３版、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７および定期更新、シリーズのＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９、およびＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。

【0025】

本明細書で使用される場合、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され得る。核酸およびポリヌクレオチドは、直鎖または環状の立体構造、ならびに一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかで、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指すことができる。これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的なものとして解釈されるべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸部分で修飾されるヌクレオチドを包含することができる。

【0026】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、共に共有結合されたアミノ酸残基を指すために互換的に使用され得る。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学類似体または修飾誘導体であるタンパク質にも適用される。

【0027】

「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」または「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、互換的に使用され、２つ以上の構成要素（配列要素など）の近位を指し、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが他の構成要素のうちの少なくとも１つに作用する機能を媒介し得る可能性を可能にするように、構成要素が配置される。例示として、転写調節配列（例えば、プロモーター）は、転写調節配列が、１つ以上の転写調節因子の有無に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に作動可能に連結される。転写調節配列は、概してコード配列とシスで作動可能に連結されるが、コード配列に直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが連続していないにもかかわらず、コード配列に作動可能に連結された転写調節配列である。

【0028】

本明細書で使用される場合、「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）」という用語は、核酸分子の共有結合骨格の切断を指す。切断は、限定されないが、ホスホジエステル結合の酵素加水分解または化学加水分解を含む様々な方法によって開始され得る。切断は、一本鎖ニック（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｎｉｃｋ）および二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｂｒｅａｋ）の両方を指すことができる。二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖ニックの結果として生じ得る。核酸切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらし得る。特定の実施形態では、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、標的の二本鎖または一本鎖ＤＮＡの切断のために使用される。

【0029】

「外因性」分子は、小分子（例えば、糖、脂質、アミノ酸、脂肪酸、フェノール化合物、アルカロイド）、または高分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖）、もしくは上記分子の任意の修飾誘導体、あるいは細胞の外側で生成もしくは存在するか、または通常は細胞内に存在しない、上記の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体を指し得る。外因性分子は、細胞に導入され得る。細胞に外因性分子を導入するための方法としては、脂質媒介性輸送、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子衝撃、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性輸送、およびウイルスベクター媒介性輸送が挙げられる。

【0030】

「内因性」分子は、特定の環境条件下の、特定の発生段階の、特定の細胞に存在する小分子または高分子である。内因性分子は、核酸、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他のオルガネラのゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸であり得る。追加の内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含み得る。

【0031】

本明細書で使用される場合、「遺伝子」は、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含む、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域を指す。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位、および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。

【0032】

「内因性遺伝子」は、遺伝子産物をコードする特定の細胞内に通常存在するＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を指す。

【0033】

「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報を遺伝子産物に変換することを指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物であり得る。例えば、遺伝子産物は、限定されないが、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されるＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されるタンパク質も含まれる。

【0034】

「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」は、核酸に含まれる情報を産物に変換することを指し、産物は、核酸配列の直接転写産物から生じ得る。例えば、産物は、限定されないが、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されるＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されるタンパク質も含まれる。

【0035】

「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在する場合、例えば、レアカッティングエンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼを含むエンドヌクレアーゼまたはトランスポザーゼが存在する場合、結合分子が結合する核酸配列である。標的部位は、内因性遺伝子であり得、細胞に対して天然または異種であってもよい。

【0036】

本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換プロセスを指す。「相同組換え（ＨＲ）」という用語は、例えば、二本鎖切断の修復中に起こり得る組換えの特殊形態を指す。相同組換えは、「ドナー」分子上に存在するヌクレオチド配列相同性を必要とする。ドナー分子は、二本鎖切断の修復のための鋳型として、細胞によって使用され得る。二本鎖切断部位、またはその近傍におけるゲノム配列とは異なるドナー分子内の情報は、細胞のゲノムＤＮＡに安定的に組み込まれ得る。

【0037】

本明細書で使用される場合、「相同」という用語は、核酸またはアミノ酸の第２の配列と類似性を有する、核酸またはアミノ酸の配列を指す。一部の実施形態では、相同配列は、互いに、少なくとも８０％の配列同一性（例えば、８１％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有し得る。

【0038】

「標的部位」または「標的配列」は、結合のために十分な条件が存在する場合、レアカッティングエンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼが結合する核酸の一部を定義する。

【0039】

本明細書で使用される場合、「導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」という用語は、生物または細胞に輸送され得る核酸の配列を指す。導入遺伝子は、標的生物または細胞内に通常存在しない遺伝子または核酸配列を含み得る。さらに、導入遺伝子は、標的生物または細胞内に通常存在する遺伝子または核酸配列のコピーを含んでいてもよい。導入遺伝子は、標的細胞の細胞質または核に導入された外因性ＤＮＡ配列であり得る。一実施形態では、本明細書に記載の導入遺伝子は、部分コード配列を含み、部分コード配列は、宿主細胞内の遺伝子によって産生されるタンパク質の一部をコードする。

【0040】

本明細書で使用される場合、「病原性」という用語は、疾患を引き起こし得る全てのものを指す。病原性変異は、疾患を引き起こす遺伝子における修飾を指し得る。病原性遺伝子は、疾患を引き起こす修飾を含む遺伝子を指す。例えば、脊髄小脳失調症２の患者における病原性ＡＴＸＮ２遺伝子は、拡張ＣＡＧトリヌクレオチド反復を有するＡＴＸＮ２遺伝子を指し、拡張ＣＡＧトリヌクレオチド反復は、疾患を引き起こす。

【0041】

本明細書で使用される「尾対尾（ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ）」という用語は、反対かつリバース方向の２つのユニットの配向を指す。２つのユニットは、各配列の３’末端が互いに隣接して配置されている、単一核酸分子上の２つの配列であり得る。例えば、５’から３’方向へ、エレメント［スプライスアクセプター１］－［部分コード配列１］－［ターミネーター１］を有する第１の核酸、およびエレメント［スプライスアクセプター２］－［部分コード配列２］－［ターミネーター２］を有する第２の核酸を、尾対尾配向で配置することができ、［スプライスアクセプター１］－［部分コード配列１］－［ターミネーター１］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［部分コード配列２ ＲＣ］－［スプライスアクセプター２ ＲＣ］が得られる（ＲＣは逆相補（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を指す）。

【0042】

本明細書で使用される「頭対頭（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ）」という用語は、反対かつリバース方向の２つのユニットの配向を指す。２つのユニットは、各配列の５’末端が互いに隣接して配置されている、単一核酸分子上の２つの配列であり得る。例えば、５’から３’方向へ、エレメントを有する第１の核酸：［プロモーター１］－［部分コード配列１］－［スプライスドナー１］、およびエレメントを有する第２の核酸：［プロモーター２］－［部分コード配列２］－［スプライスドナー２］を、頭対頭配向で配置することができ、［スプライスドナー１ ＲＣ］－［部分コード配列１ ＲＣ］－［プロモーター１ ＲＣ］［プロモーター２］－［部分コード配列２］－［スプライスドナー２］が得られる（ＲＣは逆相補（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を指す）。

【0043】

本明細書で使用される場合、「組み込む（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）」という用語は、ＤＮＡをＤＮＡの標的領域に添加するプロセスを指す。本明細書に記載されるように、組み込みは、非相同末端結合、相同組換え、または標的化転位を含む、いくつかの異なる手段によって促進され得る。例として、ユーザ提供ＤＮＡ分子の標的遺伝子への組み込みは、非相同末端結合によって促進され得る。ここで、標的遺伝子内で標的二本鎖切断がなされ、ユーザ提供ＤＮＡ分子が投与される。ユーザ提供ＤＮＡ分子は、非相同末端結合による標的遺伝子の修復中の捕捉を促進するために、露出したＤＮＡ末端を含むことができる。露出した末端は、投与時（すなわち、直鎖ＤＮＡ分子の投与時）にＤＮＡ分子上に存在し得るか、または細胞への投与時に創出され得る（すなわち、レアカッティングエンドヌクレアーゼが、細胞内でユーザ提供ＤＮＡ分子を切断して、末端を露出する）。さらに、ユーザ提供ＤＮＡ分子は、アデノ随伴ウイルスベクターを含むウイルスベクターに保有され得る。別の例では、組み込みは、相同組換えを介して生じる。ここで、ユーザ提供ＤＮＡは、左右の相同アームを保有し得る。別の例では、組み込みは、転位を介して生じる。ここで、ユーザ提供ＤＮＡは、トランスポゾンの左右の末端を保有する。

【0044】

「イントロン－エキソン接合部」という用語は、遺伝子内の特定の位置を指す。この特定の位置は、イントロンの最後のヌクレオチドと、それに続くエキソンの最初のヌクレオチドとの間にある。本明細書に記載の導入遺伝子を組み込む場合、導入遺伝子は、「イントロン－エキソン接合部」内に組み込まれ得る。導入遺伝子がカーゴ（ｃａｒｇｏ）を含む場合、カーゴは、イントロンの最後のヌクレオチドの直後に組み込まれる。場合によっては、イントロン－エキソン接合部内に導入遺伝子が組み込まれると、エキソン内の配列の除去（例えば、ＨＲを介した組み込み、およびエキソン内の配列の導入遺伝子内のカーゴへの置き換え）をもたらし得る。

【0045】

「エキソン－イントロン接合部」という用語は、遺伝子内の特定の位置を指す。この特定の位置は、エキソンの最後のヌクレオチドと、それに続くイントロンの最初のヌクレオチドとの間にある。本明細書に記載の導入遺伝子を組み込む場合、導入遺伝子は、「エキソン－イントロン接合部」内に組み込まれ得る。導入遺伝子がカーゴ（ｃａｒｇｏ）を含む場合、カーゴは、イントロンの最初のヌクレオチドの直前に組み込まれる。場合によっては、エキソン－イントロン接合部内に導入遺伝子が組み込まれると、エキソン内の配列の除去（例えば、ＨＲを介した組み込み、およびエキソン内の配列の導入遺伝子内のカーゴへの置き換え）をもたらし得る。

【0046】

本明細書で使用される「部分コード配列（ｐａｒｔｉａｌ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、部分タンパク質（ｐａｒｔｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする核酸の配列を指す。部分コード配列は、野生型タンパク質または機能性タンパク質と比較して、１つ以下のアミノ酸を含むタンパク質をコードすることができる。部分コード配列は、野生型タンパク質または機能性タンパク質と相同性を有する部分タンパク質をコードすることができる。プロモーターに作動可能に連結される「部分コード配列」を指す場合、「部分コード配列」という用語は、目的のタンパク質のＮ末端をコードするヌクレオチドの配列を指す。例えば、２５個のエキソンを含むＡＴＸＮ２遺伝子の部分コード配列は、エキソン１、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１１、１～１２、１～１３、１～１４、１～１５、１～１６、１～１７、１～１８、１～１９、１～２０、１～２１、１～２２、１～２３、または１～２４によって産生されるペプチドをコードするヌクレオチドを含み得る。ターミネーターに作動可能に連結される「部分コード配列」を指す場合、「部分コード配列」という用語は、目的のタンパク質のＣ末端をコードするヌクレオチドの配列を指す。例えば、ＡＴＸＮ２遺伝子の部分コード配列は、エキソン２～２５、３～２５、４～２５、５～２５、６～２５、７～２５、８～２５、９～２５、１０～２５、１１～２５、１２～２５、１３～２５、１４～２５、１５～２５、１６～２５、１７～２５、１８～２５、１９～２５、２０～２５、２１～２５、２２～２５、２３～２５、２４～２５、または２５によって産生されるペプチドをコードするヌクレオチドを含み得る。

【0047】

「サイレンシング耐性コード配列」または「サイレンシング耐性部分コード配列」という用語は、ＲＮＡが当該配列を鋳型として使用して産生されるとき、ＲＮＡが対応するＲＮＡｉ分子によってサイレンシングされ得ないか、またはサイレンシングされる可能性が低い核酸の配列を指す。これは、ＲＮＡｉ標的部位内の変異、または部位の不在に起因し得る。

【0048】

本文書に記載の方法および組成物は、カーゴ配列を有する導入遺伝子を使用することができる。「カーゴ（ｃａｒｇｏ）」という用語は、遺伝子の完全コード配列または部分コード配列、ＷＴまたは改変標的と比較して単一ヌクレオチド多型（ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）を保有する遺伝子の部分配列、スプライスアクセプター、スプライスドナー、プロモーター、ターミネーター、転写調節エレメント、ＲＮＡｉカセット、精製タグ（例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ポリ（Ｈｉｓ）、マルトース結合タンパク質、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｍｙｃタグ、ＡｖｉＴａｇ、ＨＡタグ、またはキチン結合タンパク質）、またはレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｌａｃＺ、ｃａｔ、ルシフェラーゼ、ｐｕｒｏ、ネオマイシン）などのエレメントを指し得る。本明細書で定義される場合、「カーゴ」は、標的部位に組み込まれる導入遺伝子内の配列を指し得る。例えば、「カーゴ」は、２つの相同アーム間、２つのレアカッティングエンドヌクレアーゼの標的部位間、または左右のトランスポゾン末端間の導入遺伝子上の配列を指し得る。

【0049】

「相同配列」（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）という用語は、第２の核酸に対する相同性を含む核酸の配列を指す。相同配列は、例えば、「相同のアーム（ａｒｍ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「相同アーム（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍ）」としてドナー分子上に存在し得る。相同アームは、第２の核酸との相同組換えを促進するドナー分子内の核酸の配列であり得る。一実施形態では、相同配列または相同アームは、内因性遺伝子と相同性を有する。本明細書で定義される場合、相同アームは「アーム（ａｒｍ）」とも称され得る。２つの相同アームを有するドナー分子では、相同アームは、「アーム１」および「アーム２」と称され得る。一態様では、カーゴ配列は、第１および第２の相同アームに隣接することができる。

【0050】

「双方向ターミネーター（ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）」という用語は、センス方向またはアンチセンス方向のいずれかでＲＮＡポリメラーゼの転写を終結させることができるターミネーターを指す。尾対尾配向の２つの一方向ターミネーターとは対照的に、双方向ターミネーターは、ＤＮＡの非キメラ配列を含み得る。双方向ターミネーターの例としては、ＡＲＯ４、ＴＲＰ１、ＴＲＰ４、ＡＤＨ１、ＣＹＣ１、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ１０ターミネーターが挙げられる。

【0051】

「双方向プロモーター（ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」という用語は、センス方向またはアンチセンス方向のいずれかでＲＮＡポリメラーゼの転写を開始することができるプロモーターを指す。頭対頭配向の２つの一方向プロモーターとは対照的に、双方向プロモーターは、ＤＮＡの非キメラ配列を含み得る。双方向プロモーターの例としては、Ｔｒｉｎｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１４：６２－６６，２００４に記載されているプロモーターが挙げられる（その開示全体は、任意の定義、免責事項、否認、および矛盾を除いて、参照により本明細書に援用される）。

【0052】

核酸分子の５’または３’末端は、核酸の方向性および化学的配向を指す。本明細書で定義される場合、「遺伝子の５’末端」は、開始コドンを有するエキソンを含み得るが、停止コドンを有するエキソンは含まない。本明細書で定義される場合、「遺伝子の３’末端」は、停止コドンを有するエキソンを含み得るが、開始コドンを有するエキソンは含まない。

【0053】

「ＲＮＡｉ」という用語は、ＲＮＡ干渉を指し、ＲＮＡ分子を使用して遺伝子の発現または翻訳を阻害または低減するプロセスである。ＲＮＡｉは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用して誘導することができる。

【0054】

「ＡＴＸＮ２」遺伝子という用語は、酵素アタキシン－２をコードする遺伝子を指す。ＡＴＸＮ２遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０１１５７２．３および対応する配列番号５６に見出すことができる。エキソンとイントロンの境界は、配列番号５６に提供される配列で定義することができる。具体的には、エキソン１は、２８２～５３２の配列を含む。エキソン２は、４３３９７～４３４３３の配列を含む。エキソン３は、４５０９９～４５１５８の配列を含む。エキソン４は、４６３３９～４６４１０の配列を含む。エキソン５は、４６８８６～４７０３６の配列を含む。エキソン６は、７４０００～７４１２４の配列を含む。エキソン７は、７８３４３～７８４３４の配列を含む。エキソン８は、７９２４０～７９４３７の配列を含む。エキソン９は、８０８８９～８１０６７の配列を含む。エキソン１０は、８２９５３～８３１６２の配列を含む。エキソン１１は、８５７７７～８５９５９の配列を含む。エキソン１２は、８８７３４～８８９３１の配列を含む。エキソン１３は、８９３１８～８９４２５の配列を含む。エキソン１４は、８９６９７～８９７６７の配列を含む。エキソン１５は、１１０５３６～１１０８４０の配列を含む。エキソン１６は、１１２４９２～１１２５５５の配列を含む。エキソン１７は、１１３４５１～１１３６０３の配列を含む。エキソン１８は、１１３９８５～１１４０５１の配列を含む。エキソン１９は、１２８５７４～１２８７５８の配列を含む。エキソン２０は、１２９０７６～１２９２０８の配列を含む。エキソン２１は、１３４６０１～１３４６５４の配列を含む。エキソン２２は、１４１９５７～１４２１０２の配列を含む。エキソン２３は、１４３０６０～１４３２８７の配列を含む。エキソン２４は、１４５４７１～１４５６３９の配列を含む。エキソン２５は、１４６４７６～１４６５０４の配列を含む。イントロン１は、５３３～４３３９６の配列を含む。イントロン２は、４３４３４～４５０９８の配列を含む。イントロン３は、４５１５９～４６３３８の配列を含む。イントロン４は、４６４１１～４６８８５の配列を含む。イントロン５は、４７０３７～７３９９９の配列を含む。イントロン６は、７４１２５～７８３４２の配列を含む。イントロン７は、７８４３５～７９２３９の配列を含む。イントロン８は、７９４３８～８０８８８の配列を含む。イントロン９は、８１０６８～８２９５２の配列を含む。イントロン１０は、８３１６３～８５７７６の配列を含む。イントロン１１は、８５９６０～８８７３３の配列を含む。イントロン１２は、８８９３２～８９３１７の配列を含む。イントロン１３は、８９４２６～８９６９６の配列を含む。イントロン１４は、８９７６８～１１０５３５の配列を含む。イントロン１５は、１１０８４１～１１２４９１の配列を含む。イントロン１６は、１１２５５６～１１３４５０の配列を含む。イントロン１７は、１１３６０４～１１３９８４の配列を含む。イントロン１８は、１１４０５２～１２８５７３の配列を含む。イントロン１９は、１２８７５９～１２９０７５の配列を含む。イントロン２０は、１２９２０９～１３４６００の配列を含む。イントロン２１は、１３４６５５～１４１９５６の配列を含む。イントロン２２は、１４２１０３～１４３０５９の配列を含む。イントロン２３は、１４３２８８～１４５４７０の配列を含む。イントロン２４は、１４５６４０～１４６４７５の配列を含む。ＡＴＸＮ２における病原性変異の例としては、エキソン１におけるＣＡＧトリヌクレオチド拡張（３２以上のＣＡＧ反復）が挙げられる。非病原性変異の例としては、ＣｌｉｎＶａｒ受託番号ＶＣＶ０００５２２３６７、ＶＣＶ０００５２２３６８、ＶＣＶ０００５２２３６９、ＶＣＶ０００５２２３７０、ＶＣＶ０００１２８５０９、ＶＣＶ０００１２８５０８、ＶＣＶ０００１２８５０７、ＶＣＶ０００２１８６１８が挙げられる。

【0055】

「ＳＮＣＡ」遺伝子という用語は、タンパク質シヌクレインαをコードする遺伝子を指す。ＳＮＣＡ遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０１１８５１．１および対応する配列番号５５に見出すことができる。エキソンとイントロンの境界は、配列番号５５に提供される配列で定義することができる。具体的には、エキソン１は、１～２００の配列を含む。エキソン２は、１４７０～１６１５の配列を含む。エキソン３は、８９７８～９０１９の配列を含む。エキソン４は、１４７７４～１４９１６の配列を含む。エキソン５は、１０７８８５～１０７９６８の配列を含む。エキソン６は、１１０５０２～１１３０６３の配列を含む。イントロン１は、２０１～１４６９の配列を含む。イントロン２は、１６１６～８９７７の配列を含む。イントロン３は、９０２０～１４７７３の配列を含む。イントロン４は、１４９１７～１０７８８４の配列を含む。イントロン５は、１０７９６９～１１０５０１の配列を含む。開始コドンは、イントロン２に存在する。ＳＮＣＡにおける病原性変異の例としては、遺伝子、Ａ５３Ｔ、Ｇ５１Ｄ、Ｅ４６Ｋ、およびＡ３０Ｐの重複または三重化が挙げられる。非病原性変異の例としては、ＣｌｉｎＶａｒ受託番号ＶＣＶ０００３５００６３、ＶＣＶ０００３５００６４、ＶＣＶ０００３５００８６、およびＶＣＶ０００３５００９３が挙げられる。

【0056】

本明細書で定義される場合、ＳＯＤ１遺伝子は、酵素スーパーオキシドジスムターゼを産生する遺伝子を指す。ＳＯＤ１遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００８６８９．１および対応する配列番号５７に見出すことができる。エキソンとイントロンの境界は、配列番号５７に提供される配列で定義することができる。具体的には、エキソン１は、５００１～５２２０の配列を含む。エキソン２は、９１６９～９２６５の配列を含む。エキソン３は、１１８２８～１１８９７の配列を含む。エキソン４は、１２６３７～１２７５４の配列を含む。エキソン５は、１３８５０～１４３１０の配列を含む。イントロン１は、５２２１～９１６８の配列を含む。イントロン２は、９１７０～１１８２７の配列を含む。イントロン３は、１１８９８～１２６３６の配列を含む。イントロン４は、１２７５５～１２８４９の配列を含む。本明細書に記載の方法は、ＳＯＤ１遺伝子に組み込むための導入遺伝子を提供する。導入遺伝子は、プロモーター、部分的ＳＯＤ１コード配列、およびスプライスドナーを含み得、組み込み部位は、内因性ＳＯＤ１遺伝子のイントロン１、２、３、または４内であり得る。さらに、導入遺伝子は、内因性ＳＯＤ１転写産物を標的とするＲＮＡｉカセット、プロモーター、部分ＳＯＤ１コード配列（ＲＮＡｉカセットによるサイレンシングに耐性）、およびスプライスドナーを含むことができる。導入遺伝子は、内因性ＳＯＤ１遺伝子のイントロン１、２、３、または４内に組み込まれ得る。また、導入遺伝子は、スプライスアクセプター、部分ＳＯＤ１コード配列（ＲＮＡｉカセットによるサイレンシングに耐性）、ターミネーター、および内因性ＳＯＤ１転写産物を標的とするＲＮＡｉカセットを含み得る。導入遺伝子は、内因性ＳＯＤ１遺伝子のうちのイントロン１、２、３、または４内に組み込まれ得る。ＳＯＤ１における病原性変異の例としては、Ａ５Ｖ、Ｃ７Ｆ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１７Ｓ、Ｅ２２Ｋ、Ｇ３８Ｒ、Ｌ３９Ｖ、Ｇ４２Ｓ、Ｆ４６Ｃ、Ｈ４７Ｒ、Ｇ７３Ｓ、Ｈ８１Ｒ、Ｌ８５Ｖ、Ｇ８６Ｒ、Ｇ９４Ｒ、Ｅ１０１Ｇ、Ｉ１０５Ｆ、およびＬ１０７Ｖが挙げられる。非病原性変異の例としては、ＣｌｉｎＶａｒ受託番号ＶＣＶ０００４４０２９２、ＶＣＶ０００２５６２０２、ＶＣＶ０００５８６６３３、およびＶＣＶ０００３９５１７３が挙げられる。

【0057】

本明細書で定義される場合、ＲＨＯ遺伝子は、タンパク質ロドプシンを産生する遺伝子を指す。ＲＨＯ遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０００００３．１２および対応する配列番号５８に見出すことができる。エキソンとイントロンの境界は、配列番号５８に示される配列で定義することができる。具体的には、エキソン１は、１～４５６の配列を含む。エキソン２は、２２３８～２４０６の配列を含む。エキソン３は、３６１３～３７７８の配列を含む。エキソン４は、３８９５～４１３４の配列を含む。エキソン５は、４９７０～６７０６の配列を含む。イントロン１は、４５７～２２３７の配列を含む。イントロン２は、２４０７～３６１２の配列を含む。イントロン３は、３７７９～３８９４の配列を含む。イントロン４は、４１３５～４９６９の配列を含む。本明細書に記載の方法は、ＲＨＯ遺伝子に組み込むための導入遺伝子を提供する。導入遺伝子は、プロモーター、部分的ＲＨＯコード配列、およびスプライスドナーを含み得、組み込み部位は、内因性ＲＨＯ遺伝子のイントロン１、２、３、または４内にあり得る。さらに、導入遺伝子は、内因性ＲＨＯ転写産物を標的とするＲＮＡｉカセット、プロモーター、部分ＲＨＯコード配列（ＲＮＡｉカセットによるサイレンシングに耐性）、およびスプライスドナーを含むことができる。導入遺伝子は、内因性ＲＨＯ遺伝子のイントロン１、２、３、または４内に組み込まれ得る。また、導入遺伝子は、スプライスアクセプター、部分ＲＨＯコード配列（ＲＮＡｉカセットによるサイレンシングに耐性）、ターミネーター、および内因性ＲＨＯ転写産物を標的とするＲＮＡｉカセットを含み得る。導入遺伝子は、内因性ＲＨＯ遺伝子のうちのイントロン１、２、３、または４内に組み込まれ得る。ＲＨＯにおける病原性変異の例としては、ＣｌｉｎＶａｒ受託番号ＶＣＶ００００１３０３９、ＶＣＶ００００１３０３１、ＶＣＶ００００１３０１７、ＶＣＶ００００１３０４２、ＶＣＶ００００１３０１８、ＶＣＶ０００６２５２９７、ＶＣＶ００００１３０５５、ＶＣＶ００００１３０１３、ＶＣＶ００００１３０１９、ＶＣＶ００００１３０４７、ＶＣＶ００００１３０１６、ＶＣＶ００００１３０２０、ＶＣＶ００００１３０２１、ＶＣＶ００００１３０４５、ＶＣＶ００００１３０５４、ＶＣＶ０００６２５３０１、ＶＣＶ００００１３０３８、ＶＣＶ００００１３０２２、ＶＣＶ００００１３０３５、ＶＣＶ００００１３０４８、ＶＣＶ０００３７３０９４、ＶＣＶ００００１３０２８、ＶＣＶ０００２７９８８２、ＶＣＶ００００１３０２４、ＶＣＶ００００１３０４６、ＶＣＶ００００２９８７５、ＶＣＶ００００１３０４９、ＶＣＶ０００４１７８６７、ＶＣＶ００００１３０５０、ＶＣＶ０００１４３０８０、ＶＣＶ０００６２５３０３、ＶＣＶ００００１３０２５、ＶＣＶ０００１９６２８２、ＶＣＶ００００１３０３３、ＶＣＶ０００５９０９１１、ＶＣＶ０００１４３０８１、ＶＣＶ００００１３０２３、ＶＣＶ００００１３０２６、ＶＣＶ００００１３０４３、ＶＣＶ００００１３０２７、ＶＣＶ００００１３０５１、ＶＣＶ００００１３０３４、ＶＣＶ００００１３０３６、ＶＣＶ０００６３６０８４、ＶＣＶ００００１３０３０、ＶＣＶ０００５２３３７６、ＶＣＶ００００１３０４４、ＶＣＶ００００１３０２９、ＶＣＶ０００４１９２５０、ＶＣＶ００００１３０５６、ＶＣＶ００００１３０５２、ＶＣＶ００００１３０１５、ＶＣＶ００００１３０５３、ＶＣＶ００００１３０３２、ＶＣＶ００００１３０１４、ＶＣＶ０００６０５５０２、ＶＣＶ０００６０５４９７、ＶＣＶ０００４４２４０１、ＶＣＶ０００４４２４００、ＶＣＶ０００１５４２５８、およびＶＣＶ０００１４５６１４が挙げられる。非病原性変異の例としては、ＣｌｉｎＶａｒ受託番号ＶＣＶ０００３４３２７２、ＶＣＶ０００２５６３８３、ＶＣＶ０００２８１５１２、ＶＣＶ０００２５６３８４、ＶＣＶ０００２５６３８２、ＶＣＶ０００３４３２８６、ＶＣＶ０００３４３２９０、ＶＣＶ０００３４３３０２、ＶＣＶ０００３４３３０３、ＶＣＶ０００３４３３０６、およびＶＣＶ０００６０６１５３が挙げられる。

【0058】

本明細書で定義される場合、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子は、様々な組織においてタンパク質を産生し、筋萎縮性側索硬化症に関連している遺伝子を指す。Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０３１９７７．１および対応する配列番号５９に見出すことができる。エキソンとイントロンの境界は、配列番号５９に示される配列で定義することができる。具体的には、エキソン１は、１～１５８の配列を含む。エキソン２は、６７０３～７１９０の配列を含む。エキソン３は、８２７７～８３３６の配列を含む。エキソン４は、１１３９１～１１４８６の配列を含む。エキソン５は、１２２１８～１２２８２の配列を含む。エキソン６は、１３５６８～１３６４０の配列を含む。エキソン７は、１５２６０～１５３７６の配列を含む。エキソン８は、１７０７１～１７３０６の配列を含む。エキソン９は、２３１６０～２３２１７の配列を含む。エキソン１０は、２５２０１～２５３１０の配列を含む。エキソン１１は、２５４４５～２７３２１の配列を含む。イントロン１は、１５９～６７０２の配列を含む。イントロン２は、７１９１～８２７６の配列を含む。イントロン３は、８３３７～１１３９０の配列を含む。イントロン４は、１１４８７～１２２１７の配列を含む。イントロン５は、１２２８３～１３５６７の配列を含む。イントロン６は、１３６４１～１５２５９の配列を含む。イントロン７は、１５３７７～１７０７０の配列を含む。イントロン８は、１７３０７～２３１５９の配列を含む。イントロン９は、２３２１８～２５２００の配列を含む。イントロン１０は、２５３１１～２５４４４の配列を含む。本明細書に記載の方法は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子に組み込むための導入遺伝子を提供する。導入遺伝子は、プロモーター、部分Ｃ９ｏｒｆ７２コード配列、およびスプライスドナーを含み得、組み込み部位は、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子のイントロン１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０内であり得る。さらに、導入遺伝子は、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２転写産物を標的とするＲＮＡｉカセット、プロモーター、部分Ｃ９ｏｒｆ７２コード配列（ＲＮＡｉカセットによるサイレンシングに耐性）、およびスプライスドナーを含むことができる。導入遺伝子は、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子のイントロン１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０内に組み込まれ得る。また、導入遺伝子は、スプライスアクセプター、部分的なＣ９ｏｒｆ７２コード配列（ＲＮＡｉカセットによるサイレンシングに耐性）、ターミネーター、および内因性Ｃ９ｏｒｆ７２転写産物を標的とするＲＮＡｉカセットを含み得る。導入遺伝子は、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子のイントロン１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０内に組み込まれ得る。Ｃ９ｏｒｆ７２における病原性変異の例としては、Ｃ９ｏｒ７２遺伝子の重複、三重化もしくは四重化、またはＧＧＧＧＣＣ反復の拡張が挙げられる。非病原性変異の例としては、ＣｌｉｎＶａｒ受託番号ＶＣＶ０００３６６４８６、ＶＣＶ０００３６６５２１、ＶＣＶ０００３６６５２４、ＶＣＶ０００１８３０３３、およびＶＣＶ０００６１１７０５が挙げられる。

【0059】

本明細書で定義される場合、ＣＨＲＮＡ１遺伝子は、タンパク質ニコチン性コリン受容体α１サブユニットを産生する遺伝子を指す。ＣＨＲＮＡ１遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００８１７２．１に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＣＨＲＮＤ遺伝子は、タンパク質ニコチン性コリン受容体δサブユニットを産生する遺伝子を指す。ＣＨＲＮＤ遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００８０２８．１に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＣＨＲＮＥ遺伝子は、タンパク質ニコチン性コリン受容体εサブユニットを産生する遺伝子を指す。ＣＨＲＮＥ遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００８０２９．２に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＣＨＲＮＢ１遺伝子は、タンパク質ニコチン性コリン受容体β１サブユニットを産生する遺伝子を指す。ＣＨＲＮＢ１遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００８０２６．１．に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＰＲＰＳ１遺伝子は、タンパク質ホスホリボシルピロリン酸合成酵素１を産生する遺伝子を指す。ＰＲＰＳ１遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００８４０７．１に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＬＲＲＫ２遺伝子は、タンパク質ロイシンリッチ反復キナーゼ２を産生する遺伝子を指す。ＬＲＲＫ２遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０１１７０９．１に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＳＴＩＭ１遺伝子は、タンパク質間質相互作用分子１を産生する遺伝子を指す。ＳＴＩＭ１遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０１６２７７．１に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＦＧＦＲ３遺伝子は、タンパク質線維芽細胞増殖因子受容体３を産生する遺伝子を指す。ＦＧＦＲ３遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０１２６３２．１に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＭＥＣＰ２遺伝子は、タンパク質メチル化ＣｐＧ結合タンパク質２を産生する遺伝子を指す。ＭＥＣＰ２遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００７１０７．２に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＡＴＸＮ１遺伝子は、タンパク質アタキシン１を産生する遺伝子を指す。ＡＴＸＮ１遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０１１５７１．１に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＡＴＸＮ３遺伝子は、タンパク質アタキシン３を産生する遺伝子を指す。ＡＴＸＮ３遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００８１９８．２に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子は、タンパク質電位依存性カルシウムチャネルサブユニットα１Ａを産生する遺伝子を指す。ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０１１５６９．１に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＡＴＸＮ７遺伝子は、タンパク質アタキシン７を産生する遺伝子を指す。ＡＴＸＮ７遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００８２２７．１に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＴＢＰ遺伝子は、タンパク質ＴＡＴＡボックス結合タンパク質を産生する遺伝子を指す。ＴＢＰ遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００８１６５．１に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＨＴＴ遺伝子は、タンパク質ハンチンチンを産生する遺伝子を指す。ＨＴＴ遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００９３７８．１に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＡＲ遺伝子は、タンパク質アンドロゲン受容体を産生する遺伝子を指す。ＡＲ遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００９０１４．２に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＦＸＮ遺伝子は、タンパク質フラタキシンを産生する遺伝子を指す。ＦＸＮ遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００８８４５．２に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＤＭＰＫ遺伝子は、タンパク質ＤＭ１プロテインキナーゼを産生する遺伝子を指す。ＤＭＰＫ遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００９７８４．１に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＰＡＢＰＮ１遺伝子は、タンパク質ポリ（Ａ）結合核内タンパク質１を産生する遺伝子を指す。ＰＡＢＰＮ１遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００８２３９．１に見出すことができる。本明細書で定義される場合、ＡＴＸＮ８遺伝子は、タンパク質アタキシン８を産生する遺伝子を指す。ＡＴＸＮ８遺伝子の代表的な配列は、ゲノム座標（ＧＲＣｈ３８）：１３：５４，７００，０００－７２，８００，０００に見出すことができる。

【0060】

本明細書に記載の「サイレンシング耐性部分コード配列」という用語は、対応する内因性遺伝子由来の相同配列と比較して変異を有する部分コード配列を指し、変異は、対応するＲＮＡｉカセットによるサイレンシングを阻止または低減するように設計される。変異は、標的ＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列内のヌクレオチドの挿入、置換、または欠失であり得る。変異は、ＲＮＡ転写産物への短鎖ＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションを阻止または低減するのに十分であり得る。

【0061】

本明細書で定義される場合、サイレンシング耐性部分コード配列を指すとき、「配列の欠如（ｌａｃｋ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、対応するＲＮＡｉ標的部位内の１つ以上のヌクレオチドの欠失を指す。例えば、ＲＮＡｉが配列ＧＧＴＡＴＣＡＡＧＡＣＴＡＣＧＡＡＣ（内因性遺伝子のエキソン内）によって産生される転写産物を標的とする場合、この配列はまた、本明細書に記載の導入遺伝子の部分コード配列内に存在し得る。修飾遺伝子のサイレンシングを阻止するために、導入遺伝子内の部分コード配列内のＲＮＡｉ標的配列を修飾することができる。具体的には、部位は、部位内のヌクレオチドの挿入、置換または欠失によって変異され得る。変異が欠失である場合、ヌクレオチドのうちの１つ以上が欠失され得る。ヌクレオチドが欠失される場合、欠失は、タンパク質機能を排除しないインフレーム欠失であるように設計されることが好ましい。

【0062】

本明細書で定義される場合、「投与」は、外因性分子の細胞への送達、提供、または導入を指すことができる。導入遺伝子またはレアカッティングエンドヌクレアーゼが細胞に投与される場合、導入遺伝子またはレアカッティングエンドヌクレアーゼが細胞内に送達、提供、または導入される。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、精製タンパク質、核酸、または精製タンパク質と核酸の混合物として投与することができる。核酸（すなわち、ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、レアカッティングエンドヌクレアーゼ、またはレアカッティングエンドヌクレアーゼ（例えば、ｇＲＮＡ）の一部をコードすることができる。投与は、脂質媒介性輸送、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子注入、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性輸送、ウイルスベクター媒介性輸送、あるいは精製タンパク質もしくは核酸、または精製タンパク質および核酸の混合物を細胞に送達するのに好適な任意の手段などの方法を通して達成することができる。

【0063】

特定の核酸またはアミノ酸配列と、特定の配列識別番号によって参照される配列との間のパーセント配列同一性は、以下のように決定される。まず、核酸またはアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．１４およびＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．１４を含むＢＬＡＳＴＺのスタンドアロンバージョンからのＢＬＡＳＴ２配列（Ｂｌ２ｓｅｑ）プログラムを使用して、特定の配列識別番号で示される配列と比較する。このスタンドアロンバージョンのＢＬＡＳＴＺは、ｆｒ．ｃｏｍ／ｂｌａｓｔまたはｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからオンラインで入手することができる。Ｂｌ２ｓｅｑプログラムの使用方法については、ＢＬＡＳＴＺに付属するｒｅａｄｍｅファイルに見出すことができる。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して、２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用され、一方、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。２つの核酸配列を比較するために、オプションは、以下のように設定される：－ｉは、比較される第１の核酸配列を含むファイル（例えば、Ｃ：￥ｓｅｑ１．ｔｘｔ）に設定され、－ｊは、比較される第２の核酸配列を含むファイル（例えば、Ｃ：￥ｓｅｑ２．ｔｘｔ）に設定され、－ｐは、ｂｌａｓｔｎに設定され、－ｏは、任意の所望のファイル名（例えば、Ｃ：￥ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）に設定され、－ｑは、－１に設定され、－ｒは、２に設定され、他の全てのオプションは、それらのデフォルト設定のままである。例えば、以下のコマンドを使用して、２つの配列間の比較を含む出力ファイルを生成することができる：Ｃ：￥Ｂｌ２ｓｅｑ －ｉ ｃ：￥ｓｅｑ１．ｔｘｔ －ｊ ｃ：￥ｓｅｑ２．ｔｘｔ －ｐ ｂｌａｓｔｎ －ｏ ｃ：￥ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ －ｑ －１ －ｒ ２。２つのアミノ酸配列を比較するために、Ｂｌ２ｓｅｑのオプションは、以下のように設定される：－ｉは、比較される第１のアミノ酸配列を含むファイル（例えば、Ｃ：￥ｓｅｑ１．ｔｘｔ）に設定され、－ｊは、比較される第２のアミノ酸配列を含むファイル（例えば、Ｃ：￥ｓｅｑ２．ｔｘｔ）に設定され、－ｐは、ｂｌａｓｔｐに設定され、－ｏは、任意の所望のファイル名（例えば、Ｃ：￥ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）に設定され、他の全てのオプションは、それらのデフォルト設定のままである。例えば、以下のコマンドを使用して、２つのアミノ酸配列間の比較を含む出力ファイルを生成することができる：Ｃ：￥Ｂｌ２ｓｅｑ －ｉ ｃ：￥ｓｅｑ１．ｔｘｔ －ｊ ｃ：￥ｓｅｑ２．ｔｘｔ －ｐ ｂｌａｓｔｐ －ｏ ｃ：￥ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ。２つの比較配列が相同性を共有する場合、次いで、指定された出力ファイルは、それらの相同性の領域を整列配列として提示する。２つの比較配列が相同性を共有しない場合、指定された出力ファイルは整列配列を提示しない。

【0064】

整列すると、一致の数は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列に提示されている位置の数をカウントすることによって決定される。パーセント配列同一性は、一致の数を、特定された配列に示される配列の長さで除算するか、または繋がった長さ（例えば、特定された配列に示される配列からの１００個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基）のいずれかで除算し、続いて、得られた値に１００を乗算することによって決定される。パーセント配列同一性の値は、最も近い１０分の１に四捨五入される。

【0065】

プロモーター（複数可）を有する双方向遺伝子修復システム
一実施形態では、本文書は、導入遺伝子および内因性遺伝子の５’末端を修飾するための方法を特徴とする。導入遺伝子は、第１および第２のプロモーターを含むことができ、第１のプロモーターは、第１の部分コード配列に作動可能に連結され、第２のプロモーターは、第２の部分コード配列に作動可能に連結されている。第１および第２の部分コード配列は、それぞれ第１および第２のスプライスドナー配列に作動可能に連結され得る（図１）。第１のプロモーター、第１の部分コード配列、および第１のスプライスドナーは、第２のプロモーター、第２の部分コード配列、および第２のスプライスドナーと頭対頭配向で配置することができる。この導入遺伝子は、イントロン内またはエキソン－イントロン接合部で内因性遺伝子に組み込まれ得る。一部の実施形態では、導入遺伝子は、レアカッティングエンドヌクレアーゼまたはトランスポゾンを使用して内因性遺伝子に組み込まれ得る。一実施形態では、第１および第２のプロモーター、第１および第２の部分コード配列、ならびに第１および第２のスプライスドナーを含む導入遺伝子は、追加の配列、例えば、ウイルス逆位末端反復（例えば、アデノ随伴ウイルス逆位反復）に隣接することができる。これらの導入遺伝子は、レアカッティングエンドヌクレアーゼを使用して標的化二本鎖切断を介して内因性遺伝子に組み込まれ得る。

【0066】

別の実施形態では、第１および第２のプロモーター、第１および第２の部分コード配列、ならびに第１および第２のスプライスドナーを含む導入遺伝子は、第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位に隣接することができる。これらの導入遺伝子は、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼを使用した標的化二本鎖切断を介して内因性遺伝子に組み込むことができ、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼは、内因性遺伝子内の配列を切断し、導入遺伝子内の隣接標的部位を切断する。

【0067】

別の実施形態では、第１および第２のプロモーター、第１および第２の部分コード配列、ならびに第１および第２のスプライスドナーを含む導入遺伝子は、第１および第２の相同アームに隣接することができる。これらの導入遺伝子は、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼを使用した標的二本鎖切断を介して内因性遺伝子に組み込むことができ、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼは、内因性遺伝子を切断する。

【0068】

別の実施形態では、第１および第２のプロモーター、第１および第２の部分コード配列、ならびに第１および第２のスプライスドナーを含む導入遺伝子は、第１および第２の相同アームならびに第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位に隣接することができる。これらの導入遺伝子は、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼを使用した標的化二本鎖切断を介して内因性遺伝子に組み込むことができ、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼは、内因性遺伝子内の配列を切断し、導入遺伝子内の隣接標的部位を切断する。ベクター内の第１および第２の標的部位は、第１および第２の相同アームに隣接することができる。あるいは、第１の標的部位もしくは第２の標的部位、または第１および第２の標的部位のブースは、相同アーム内であり得る。

【0069】

別の実施形態では、第１および第２のプロモーター、第１および第２の部分コード配列、ならびに第１および第２のスプライスドナーを含む導入遺伝子は、左右のトランスポゾン末端に隣接することができる。これらの導入遺伝子は、トランスポザーゼを使用した転位を通して内因性遺伝子に組み込まれ得る。本明細書に記載されるように、トランスポザーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼであり得る。

【0070】

一部の実施形態では、第１および第２のプロモーターは、双方向プロモーターで置き換えることができる。他の実施形態では、導入遺伝子は、第１のプロモーターと第２のプロモーターとの間に尾対尾配向で配置された第１および第２のターミネーターをさらに含むことができる（図１）。あるいは、第１および第２のターミネーターは、双方向ターミネーターで置換することができる。

【0071】

一実施形態では、本文書は、内因性遺伝子の５’末端を修飾するための方法を特徴とし、内因性遺伝子は、２つのコードエキソン間の少なくとも１つのイントロンを有する。イントロンは、通常のメッセンジャーＲＮＡプロセシング機構によって前駆体メッセンジャーＲＮＡから除去される任意のイントロンであり得る。イントロンは、２０ｂｐ～５００ｋｂ超であり得、スプライスドナー部位、分岐配列、およびアクセプター部位を含む要素を含む。内因性遺伝子の５’末端の修飾のための本明細書に開示される導入遺伝子は、複数の機能性エレメントを含むことができ、レアカッティングエンドヌクレアーゼの標的部位、相同アーム、スプライスアクセプター配列、コード配列、プロモーター、および転写ターミネーターを含む、（図１）。

【0072】

実施形態では、導入遺伝子の組み込みのための位置は、イントロンまたはイントロン－エキソン接合部であってもよい。イントロンを標的とする場合、部分コード配列は、内因性遺伝子内の当該イントロンの前のエキソンによって産生されるペプチドをコードする配列を含むことができる。例えば、導入遺伝子が、１２個のエキソンを有する内因性遺伝子のイントロン２に組み込まれるように設計される場合、部分コード配列は、内因性遺伝子のエキソン１および２によって産生されるペプチドをコードすることができる。エキソン－イントロン接合部を標的とする場合、導入遺伝子は、イントロン配列が保存されるようにエキソン－イントロン接合部に組み込まれ得る。一実施形態では、組み込み後、イントロン配列が保存され、上流のエキソン配列が保存される（すなわち、導入遺伝子由来のヌクレオチドが、エキソン内の最後のヌクレオチドとイントロン内の最初のヌクレオチドとの間に追加される）。あるいは、一実施形態では、組み込み後、イントロン配列は保存されるが、エキソン配列の１つ以上のヌクレオチドが除去される。

【0073】

一実施形態では、導入遺伝子は、レアカッティングエンドヌクレアーゼの２つの標的部位を含む。標的部位は、レアカッティングエンドヌクレアーゼによる切断に好適な配列および鎖長であり得る。標的部位は、ＣＲＩＳＰＲ系、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼもしくはメガヌクレアーゼ、あるいはＣＲＩＳＰＲ系、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼもしくはメガヌクレアーゼ、または任意の他のレアカッティングエンドヌクレアーゼの組み合わせによる切断に適し得る。標的部位は、レアカッティングエンドヌクレアーゼによる切断がベクターから導入遺伝子の遊離をもたらすように位置付けすることができる。ベクターは、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ベクター）または非ウイルスベクター（例えば、プラスミド、ミニサークルベクター）を含むことができる。導入遺伝子が２つの標的部位を含む場合、標的部位は、同じ配列であり得るか（すなわち、同じレアカッティングエンドヌクレアーゼによって標的化される）、またはそれらは、異なる配列であり得る（すなわち、２つ以上の異なるレアカッティングエンドヌクレアーゼによって標的化される）。

【0074】

一部の実施形態では、本明細書で提供される導入遺伝子は、トランスポザーゼにより組み込まれ得る。トランスポザーゼには、ＣＲＩＳＰＲトランスポザーゼが含まれ得る（Ｓｔｒｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｘ９１８１，２０１９、Ｋｌｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－１３２３－ｚ，２０１９）。トランスポザーゼは、第１および第２のスプライスアクセプター配列、第１および第２のコード配列、１つの双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーター（図１）、ならびにトランスポゾンの左右の末端を含む導入遺伝子と組み合わせて使用することができる。ＣＲＩＳＰＲトランスポザーゼは、タンパク質ｔｎｓＢ、ｔｎｓＣ、およびｔｎｉＱと共に、ＴｙｐｅＶ－Ｕ５、Ｃ２Ｃ５ ＣＲＩＳＰＲタンパク質、Ｃａｓ１２ｋを含み得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ｋは、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ ｈｏｆｍａｎｎｉ（配列番号３０）またはＡｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ（配列番号３１）由来であり得る。一実施形態では、トランスポゾンの左末端（配列番号３２）および右末端（配列番号３３）を含む本明細書に記載の導入遺伝子は、ＳｈＣａｓ１２ｋ、ｔｎｓＢ、ｔｎｓＣ、ＴｎｉＱ、およびｇＲＮＡ（配列番号４４）と共に細胞に送達することができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲトランスポザーゼは、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、およびＴｎｉＱを含むヘルパータンパク質と共に、Ｃａｓ６タンパク質を含み得る。一実施形態では、トランスポゾンの左末端（配列番号４１）および右末端（配列番号４３）を含む本明細書に記載の導入遺伝子は、Ｃａｓ６（配列番号３７）、Ｃａｓ７（配列番号３６）、Ｃａｓ８（配列番号３５）、ＴｎｉＱ（配列番号３４）、ＴｎｓＡ（配列番号３８）、ＴｎｓＢ（配列番号３９）、ＴｎｓＣ（配列番号４０）、およびｇＲＮＡ（配列番号４２）と共に真核細胞に送達され得る。タンパク質は、精製タンパク質として細胞に直接投与され得るか、ＲＮＡまたはＤＮＡにコードされ得る。ＲＮＡまたはＤＮＡにコードされる場合、配列は、真核細胞内での発現のためにコドンが最適化され得る。ｇＲＮＡ（配列番号４２）をＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターの下流に配置し、ポリ（Ｔ）ターミネーターで終結させることができる。

【0075】

一実施形態では、導入遺伝子は、第１および第２の標的部位、ならびに第１および第２の相同アームを含む。第１および第２の相同アームは、所望の組み込み部位で、またはその近傍で、ゲノム配列と相同的な配列を含むことができる。相同アームは、所望の組み込み部位の配列、またはその近傍の配列との相同組換えに関与するための好適な鎖長であり得る。各相同アームの鎖長は、５０ｎｔ～１０，０００ｎｔ（例えば、５０ｎｔ、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔ、６００ｎｔ、７００ｎｔ、８００ｎｔ、９００ｎｔ、１，０００ｎｔ、２，０００ｎｔ、３，０００ｎｔ、４，０００ｎｔ、５，０００ｎｔ、６，０００ｎｔ、７，０００ｎｔ、８，０００ｎｔ、９，０００ｎｔ、１０，０００ｎｔ）であり得る。一実施形態では、相同アームは、レアカッティングエンドヌクレアーゼの標的部位を含む機能性エレメントを含むことができる。一実施形態では、第１の相同アーム（例えば、左の相同アーム）は、標的となるエキソンまたはイントロンと相同的な配列を含むことができ、第２の相同アームは、第１の相同アームの下流のゲノム配列と相同的な配列を含むことができる。第１の相同アームは、導入遺伝子上のプロモーターからの転写方向に対してスプライスアクセプター機能を有してはならない。配列がスプライスアクセプター機能を含むかどうかを決定するために、インシリコ分析および実験的な試験を含むいくつかのステップを行うことができる。スプライスアクセプター機能の可能性があるかどうかを決定するために、第２の相同アームに望まれる配列を、コンセンサス分岐配列（例えばＹＴＲＡＣ）およびスプライスアクセプター部位（例えばＹリッチＮＣＡＧＧ）について検索することができる。分岐またはスプライスアクセプター配列が存在する場合、機能を破壊するために単一ヌクレオチド多型を導入するか、またはそのような配列を含まない異なるが隣接する配列を選択することができる。第１の相同アームがスプライスアクセプター機能を有するかどうかを実験的に決定するために、レポーター遺伝子内のイントロン内に第１の相同アームを含む合成構築物を構築することができる。次いで、構築物を適切な細胞型に投与し、レポーター遺伝子活性を評価することによって、スプライシング機能についてモニタリングすることができる。

【0076】

一実施形態では、導入遺伝子は、２つのスプライスドナー配列を含み、本明細書では、第１および第２のスプライスドナー配列と称される。第１および第２のスプライスドナー配列は、導入遺伝子内で反対方向（すなわち、頭対頭配向）、かつ隣接する内部配列（すなわち、部分コード配列およびプロモーター）に位置付けられる。導入遺伝子がフォワード方向またはリバース方向にイントロンに組み込まれると、スプライスドナー配列は、対応するプレｍＲＮＡ内でのイントロンのスプライシングの開始を促進する。第１および第２のスプライスドナー配列は、同じ配列または異なる配列であり得る。片方または両方のスプライスドナー配列は、導入遺伝子が組み込まれるイントロンのスプライスドナー配列であり得る。片方または両方のスプライスドナー配列は、合成スプライスドナー配列または異なる遺伝子由来のイントロンからのスプライスドナー配列であり得る。

【0077】

一実施形態では、導入遺伝子は、第１および第２のスプライスドナー配列に作動可能に連結された第１および第２のコード配列を含む。第１および第２のコード配列は、導入遺伝子内で反対方向（すなわち、頭対頭配向）に位置付けられる。導入遺伝子がフォワード方向またはリバース方向に内因性遺伝子に組み込まれると、第１および第２のコード配列は、導入遺伝子内に位置するプロモーターによってｍＲＮＡに転写される。コード配列は、欠陥のあるコード配列を修正する、変異を導入する、または新規のペプチド配列を導入するように設計され得る。第１および第２のコード配列は、同じ核酸配列および同じタンパク質のコードであり得る。あるいは、第１および第２のコード配列は、異なる核酸配列であり、かつ同じタンパク質をコードしてもよい（すなわち、コドン縮重を使用する）。コード配列は、精製タグ（例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ポリ（Ｈｉｓ）、マルトース結合タンパク質、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｍｙｃタグ、ＡｖｉＴａｇ、ＨＡタグ、またはキチン結合タンパク質）またはレポータータンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｌａｃＺ、ｃａｔ、ルシフェラーゼ、ｐｕｒｏ、ネオマイシン）をコードすることができる。

【0078】

一実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、内因性遺伝子の５’末端を修飾することによって、内因性遺伝子によってコードされるタンパク質のＮ末端の修飾をもたらすことができる。内因性遺伝子のコード配列の５’末端の修飾は、最初のコードエキソンから最初のエキソンと最後のエキソンとの間にあるエキソンまでの置き換えを含み得る。例えば、遺伝子が１２個のエキソンを含む場合、修飾は、エキソン１、または１～２、または１～３、または１～４、または１～５、または１～６、または１～７、または１～８、または１～９、または１～１０、または１～１１の置き換えを含み得る。一実施形態では、置換される内因性エキソンは、類似の配列で置き換えることができる。例えば、導入遺伝子の第１または第２のコード配列は、エキソン１、または１～２、または１～３、または１～４、または１～５、または１～６、または１～７、または１～８、または１～９、または１～１０、または１～１１を含み得る。導入遺伝子は、導入遺伝子のコード配列内の最後のエキソンであるエキソンの下流のイントロン内に、内因性遺伝子内で組み込まれ得る（図３）。あるいは、導入遺伝子は、導入遺伝子のコード配列内の最後のエキソンに対応するエキソン内に組み込まれ得る（図８）。導入遺伝子は、４．７ｋｂ以下であるように設計され、ＡＡＶベクターおよび粒子に組み込まれ、インビボで標的細胞に送達され得る。

【0079】

一実施形態では、導入遺伝子は、第１および第２のコード配列に作動可能に連結された双方向プロモーター、または第１および第２のプロモーターを含むことができる。双方向プロモーター、または第１および第２のプロモーターは、導入遺伝子内に反対方向（すなわち、頭対頭配向）に位置付けられる。導入遺伝子がフォワード方向またはリバース方向に内因性遺伝子に組み込まれると、双方向プロモーター、または第１および第２のプロモーターは、第１および第２のコード配列の転写を開始する。第１および第２のプロモーターは、同一のプロモーターまたは異なるプロモーターであり得る。

【0080】

一実施形態では、導入遺伝子は、第１および第２のコード配列に作動可能に連結された双方向プロモーター、または第１および第２のプロモーターを含むことができる。双方向プロモーター、または第１および第２のプロモーターは、導入遺伝子内に反対方向（すなわち、頭対頭配向）に位置付けられる。導入遺伝子がフォワード方向またはリバース方向に内因性遺伝子に組み込まれると、双方向プロモーター、または第１および第２のプロモーターは、第１および第２のコード配列の転写を開始する。第１および第２のプロモーターは、同一のプロモーターまたは異なるプロモーターであり得る。プロモーターは、例えば、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、または部分コード配列の転写を開始するのに十分な活性を有する任意のプロモーターから選択され得る。理論に束縛されるものではないが、リバース方向のプロモーターは、二本鎖ＲＮＡの生成を引き起こし、それによって、組み込み部位の上流の遺伝子発現のサイレンシングをもたらし得る。さらに、フォワード方向のプロモーターは、（例えば、コード配列のコドン縮重により）同じサイレンシングを受けず、ＲＮＡの転写を開始し得る。プロモーターによってリバース方向に産生されたＲＮＡからの潜在的なＲＮＡｉを低減するための方法も本明細書に記載される（図５）。

【0081】

一実施形態では、導入遺伝子は、第１のプロモーターと第２のプロモーターとの間に、双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーターを含むことができる（図１）。双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーターは、導入遺伝子内に反対方向（すなわち、尾対尾配向）に位置付けられる。導入遺伝子がフォワード方向またはリバース方向に内因性遺伝子に組み込まれると、双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーターは、内因性遺伝子のプロモーターからの転写を終結させる。第１および第２のターミネーターは、同一のターミネーターまたは異なるターミネーターであり得る。

【0082】

一実施形態では、本文書は、第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位、第１および第２のスプライスドナー配列、第１および第２のコード配列、ならびに１つの双方向プロモーター、または第１および第２のプロモーターを含む導入遺伝子を提供する。導入遺伝子は、非相同末端結合および代替非相同末端結合を含む非相同性依存的方法を介して、またはマイクロホモロジー媒介末端結合によって、内因性遺伝子に組み込むことができる。一態様では、導入遺伝子は、内因性遺伝子内のイントロンに組み込まれる（図２）。

【0083】

別の実施形態では、本文書は、第１および第２の相同アーム、第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位、第１および第２のスプライスドナー配列、第１および第２のコード配列、ならびに１つの双方向プロモーター、または第１および第２のプロモーターを含む導入遺伝子を提供する。導入遺伝子は、相同性に依存的な方法（例えば、合成依存性鎖アニーリングおよびマイクロホモロジー媒介末端結合）および相同性に非依存的な方法（例えば、非相同末端結合および代替非相同末端結合）の両方を介して、内因性遺伝子に組み込むことができる。一態様では、導入遺伝子は、内因性遺伝子内のイントロンに組み込まれる（図３）。別の態様では、導入遺伝子は、内因性遺伝子のエキソン内に組み込まれる（図８）。

【0084】

別の実施形態では、本文書は、第１および第２の相同アーム、第１および第２のスプライスドナー配列、第１および第２のコード配列、ならびに１つの双方向プロモーター、または第１および第２のプロモーターを含む導入遺伝子を提供する（図１）。別の実施形態では、本文書は、第１および第２のコード配列、第１および第２のスプライスドナー配列、ならびに１つの双方向プロモーター、または第１および第２のプロモーターを含む導入遺伝子を提供する。

【0085】

別の実施形態では、本文書は、第１および第２の相同アーム、第１および第２のコード配列、第１および第２のスプライスドナー配列、１つの双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーター、ならびに第１および第２の追加配列を含む導入遺伝子を提供する（図１）。追加の配列は、５’末端および３’末端に導入遺伝子上に存在する任意の追加の配列であり得るが、追加の配列は、スプライスアクセプターまたはスプライスドナーとして機能する任意のエレメントを含むべきではない。追加の配列は、例えば、アデノ随伴ウイルスゲノムの逆位末端反復、または左右のトランスポゾン末端であり得る。

【0086】

別の実施形態では、本文書は、アデノ随伴ウイルスおよびアデノウイルスを含むウイルスベクター内の導入遺伝子を提供し、導入遺伝子は、第１および第２のスプライスドナー配列、第１および第２のコード配列、ならびに１つの双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーターを含む。ウイルスベクターの逆位末端反復に起因して、導入遺伝子はまた、第１および第２の追加の配列を含む。

【0087】

別の実施形態では、本文書は、アデノ随伴ウイルスおよびアデノウイルスを含むウイルスベクター内の導入遺伝子を提供し、導入遺伝子は、第１および第２の相同アーム、第１および第２のスプライスドナー配列、第１および第２のコード配列、ならびに１つの双方向プロモーターまたは第１および第２のプロモーターを含む。ウイルスベクターの逆位末端反復に起因して、導入遺伝子はまた、第１および第２の追加の配列を含む。

【0088】

別の態様では、組み込みのための導入遺伝子は、各結果で所望の効果を創出しながら、複数の修復経路を通して組み込むように設計され得る。例として、導入遺伝子は、第１および第２のアーム相同アーム、第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位、第１および第２のコード配列、第１および第２のプロモーターを含み得、ＡＡＶゲノム内に（すなわち、１４５ヌクレオチド逆位末端反復に隣接して）保有され得る。レアカッティングエンドヌクレアーゼによる発現後、以下の結果が生じ得る：１）ＮＨＥＪによる標的部位におけるＡＡＶゲノム全体のフォワードもしくはリバース方向の組み込み、２）ＮＨＥＪによる標的部位における第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位間の配列のフォワードもしくはリバース方向の組み込み、３）第１および第２の相同アームを使用したＨＲによる組み込み、または４）上記結果の任意の組み合わせ。上述の結果のうちのいずれかを伴う組み込みの後、本明細書に記載の導入遺伝子は、内因性遺伝子によって産生されるタンパク質配列を修正または改変することができる。

【0089】

一部の実施形態では、本明細書に記載される導入遺伝子は、スプライスドナー、部分コード配列、プロモーター、相同アーム、左右のトランスポザーゼ末端、ならびにレアカッティングエンドヌクレアーゼによる切断部位を含むエレメントの組み合わせを有し得る。一実施形態では、組み合わせは、５’から３’にであり得る。

【0090】

一部の実施形態では、本明細書に記載される導入遺伝子は、スプライスアクセプター、部分コード配列、ターミネーター、相同アーム、左右のトランスポザーゼ末端、ならびにレアカッティングエンドヌクレアーゼによる切断部位を含むエレメントの組み合わせを有し得る。

【0091】

一実施形態では、組み合わせは、５’から３’へ、［スプライスドナー１ ＲＣ］－［部分コード配列１ ＲＣ］－［プロモーター１ ＲＣ］－［プロモーター２］－［部分コード配列２］－［スプライスドナー２］であり得る（ＲＣは逆相補を表す）。この組み合わせは、直鎖ＤＮＡ分子またはＡＡＶ分子上に保有され得、標的遺伝子の標的切断を介してＮＨＥＪによって組み込まれ得る。

【0092】

別の実施形態では、組み合わせは、５’から３’へ、［レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位１］－［スプライスドナー１ ＲＣ］－［部分コード配列１ ＲＣ］－［プロモーター１ ＲＣ］－［プロモーター２］－［部分コード配列２］－［スプライスドナー２］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位２］であり得る。

【0093】

別の実施形態では、組み合わせは、５’から３’へ、［レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位１］－［相同アーム１］－［スプライスドナー１ ＲＣ］－［部分コード配列１ ＲＣ］－［プロモーター１ ＲＣ］－［プロモーター２］－［部分コード配列２］－［スプライスドナー２］－［相同アーム２］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位２］であり得る。この組み合わせでは、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼを使用して、ＨＲおよびＮＨＥＪを促進することができる。例えば、単一のレアカッティングヌクレアーゼは、標的遺伝子（すなわち、所望のイントロン）を切断することができ、相同アームに隣接する切断部位は、イントロン内の同じ標的配列であるように設計することができる。

【0094】

別の実施形態では、組み合わせは、５’から３’へ、［相同アーム１＋レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位１］－［スプライスドナー１ ＲＣ］－［部分コード配列１ ＲＣ］－［プロモーター１ ＲＣ］－［プロモーター２］－［部分コード配列２］－［スプライスドナー２］－［相同アーム２］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位２］であり得る。この組み合わせでは、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＨＲおよびＮＨＥＪを促進することができる。例えば、単一レアカッティングヌクレアーゼは、相同アーム１内、相同アーム２の下流、およびゲノム標的部位（すなわち、相同アーム１の配列と相同性を有する部位）で切断することができる。

【0095】

別の実施形態では、組み合わせは、５’から３’へ、［トランスポザーゼの左末端］－［スプライスドナー１ ＲＣ］－［部分コード配列１ ＲＣ］－［プロモーター１ ＲＣ］－［プロモーター２］－［部分コード配列２］－［スプライスドナー２］－［トランスポザーゼの右末端］であり得る。全ての実施形態では、スプライスドナー１およびスプライスドナー２は、同一または異なる配列であってもよく、部分コード配列１および部分コード配列２は、同一または異なる配列であってもよく、プロモーター１およびプロモーター２は、同一または異なる配列であってもよい。

【0096】

実施形態では、構造［レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位１］－［相同アーム１］－［スプライスドナー１ ＲＣ］－［部分コード配列１］－［プロモーター１ ＲＣ］－［プロモーター２］－［部分コード配列２］－［スプライスドナー２］－［相同アーム２］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位２］を含む導入遺伝子は、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの送達を通してＤＮＡに組み込まれ得る。１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼが送達される場合、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位１および２での切断によって導入遺伝子を遊離することができる。さらに、同じレアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＨＲまたはＮＨＥＪを介した挿入をシミュレートする、標的遺伝子内の切断を生成することができる。

【0097】

他の実施形態では、構造［相同アーム１＋レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位１］－［スプライスドナー１ ＲＣ］－［部分コード配列１］－［プロモーター１ ＲＣ］－［プロモーター２］－［部分コード配列２］－［スプライスドナー２］－［相同アーム２］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位１］を含む導入遺伝子は、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの送達によりＤＮＡに組み込まれ得る。１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼが送達される場合、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位１および２での切断によって導入遺伝子を遊離することができる。さらに、同じレアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＨＲまたはＮＨＥＪを介した挿入をシミュレートする、標的遺伝子内の切断を生成することができる。ＨＲによる組み込みは、切断が組み込み部位の上流（すなわち、相同アーム内）にあるときに生じ得る。

【0098】

実施形態では、部分コード配列は、コドン調整され得る。コドン調整は、１）二本鎖ＲＮＡ対合の低減（図５）、および２）タンパク質発現の最適化を目的とすることができる。第１および第２のプロモーターに作動可能に連結された第１および第２の部分コード配列を含む導入遺伝子は、内因性遺伝子に組み込まれ、第１および第２の部分コード配列が互いに相同的で、内因性遺伝子である場合、二本鎖ＲＮＡが産生され得る（図５）。部分コード配列は、ＲＮＡ対合を最小限に抑えるようにコドン調整することができる。一実施形態では、コドン最適化は、完全であり、第１および第２の部分コード配列に関して異なり得る。例えば、部分コード配列１は、部分コード配列２とは異なるヌクレオチド配列を有し得、部分コード配列１および２の両方は、目的の内因性遺伝子内の対応する配列とは異なる配列であり得る。

【0099】

別の実施形態では、コドン最適化は、第１および第２の部分コード配列間で分割され得る。例えば、第１の部分コード配列は、コドン未調整配列（すなわち、目的の内因性遺伝子内の対応する配列と相同である）と、コドン調整配列との混合物を有することができる。この実施例では、第２の部分コード配列は、反対の調整を有することができる。例えば、２００ヌクレオチドの部分コード配列１および２内では、部分コード配列１のヌクレオチド１～１００は、目的の内因性遺伝子内の配列と相同であり得、ヌクレオチド１０１～２００は、目的の内因性遺伝子と最小限の配列類似性を有するようにコドン調整することができ、部分コード配列２のヌクレオチド１～１００は、目的の内因性遺伝子と最小限の配列類似性を有するようにコドン調整することができ、ヌクレオチド１０１～２００は、目的の内因性遺伝子内の配列と相同であり得る。

【0100】

一実施形態では、ゲノム修飾は、内因性ＡＴＸＮ２ゲノム配列中の導入遺伝子の挿入である。導入遺伝子は、ＡＴＸＮ２タンパク質の部分コード配列を含み得る。部分コード配列は、野生型ＡＴＸＮ２遺伝子内のコード配列、または野生型ＡＴＸＮ２遺伝子の機能性バリアント、ＡＴＸＮ２遺伝子のコドン調整バージョン、または変異体ＡＴＸＮ２遺伝子と相同であり得る。一実施形態では、部分的ＡＴＸＮ２タンパク質をコードする導入遺伝子は、内因性ＡＴＸＮ２遺伝子のイントロン１に挿入される（図３および４）。

【0101】

一実施形態では、本明細書で提供される導入遺伝子は、ＡＴＸＮ２遺伝子のエキソン１によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含む（図７）。導入遺伝子は、イントロン１内の内因性ＡＴＸＮ２遺伝子内に、またはエキソン１－イントロン１接合部に組み込まれ得る。この実施形態は、ＡＴＸＮ２のエキソン１中の拡張トリヌクレオチド反復を含む細胞において特に有用である。

【0102】

本明細書に提供される方法および組成物を使用して、細胞内のタンパク質をコードする遺伝子を修飾することができる。内因性タンパク質としては、フィブリノーゲン、プロトロンビン、組織因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）、第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子）、フォン・ヴィレブランド因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン（フィッツジェラルド因子）、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ因子、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン、α２－抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－２、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、イズロン酸スルファターゼ（ＩＤＳ）、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１）、ＭＭＡＡ、ＭＭＡＢ、ＭＭＡＣＨＣ、ＭＭＡＤＨＣ（Ｃ２ｏｒｆ２５）、ＭＴＲＲ、ＬＭＢＲＤ１、ＭＴＲ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）（ＰＣＣＡ、および／もしくはＰＣＣＢサブユニット）、グルコース－６－リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）タンパク質またはグルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）、ＡｐｏＢ、ＬＤＬＲＡＰ－１、ＰＣＳＫ９、ミトコンドリアタンパク質（ＮＡＧＳ（Ｎ－アセチルグルタミン酸合成酵素）、ＣＰＳ１（カルバモイルリン酸合成酵素Ｉ）、およびＯＴＣ（オルニチントランスカルバミラーゼ）など）、ＡＳＳ（アルギニノコハク酸合成酵素）、ＡＳＬ（アルギニノスクシナーゼ酸リアーゼ）および／もしくはＡＲＧ１（アルギナーゼ）、ならびに／または溶質担体ファミリー２５（ＳＬＣ２５Ａ１３、アスパラギン酸／グルタミン酸担体）タンパク質、ＵＧＴ１Ａ１もしくはＵＤＰグルクロンシルトランスフェラーゼポリペプチドＡ１、フマリルアセト酢酸ヒドロリアーゼ（ＦＡＨ）、アラニングリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）タンパク質、グリオキシル酸レダクターゼ／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＧＲＨＰＲ）タンパク質、トランスサイレチン遺伝子（ＴＴＲ）タンパク質、ＡＴＰ７Ｂタンパク質、フェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）タンパク質、ＵＳＨ２Ａタンパク質、ＡＴＸＮタンパク質、ならびにリポタンパク質リアーゼ（ＬＰＬ）タンパク質、が挙げられる。

【0103】

導入遺伝子は、機能喪失変異または機能獲得変異を保有する内因性遺伝子を修飾するための配列を含むことができる。変異には、以下の遺伝的疾患をもたらすものが含まれ得る：軟骨無形成症、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、アイカルディ症候群、α１アンチトリプシン欠損症、αサラセミア、アンドロゲン不感性症候群、アペール症候群（ｐｅｒｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、不整脈源性右室異形成、毛細血管拡張性運動失調症、バース症候群、βサラセミア、青色ゴム乳首様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）、ネコ鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉異形成、ファンコニ貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症、全身性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）、ヘモクロマトーシス、β－グロビン（ＨｂＣ）の６番目のコドンにおけるヘモグロビンＣ変異、血友病、ハンチントン病、低ホスファターゼ症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ランガー・ギディオン症候群、白血球粘着不全症、白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、爪膝蓋骨症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ニーマン・ピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンフィリッポ症候群、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シュワックマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、スミス・マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ・サックス病、血小板減少－橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トリーチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群、リソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病、ＧＭ１、ファブリー病、およびテイ・サックス病）、フォン・ヴィレブランド病、アッシャー症候群、多発性嚢胞腎疾患、脊髄小脳失調症２型、球脊髄性筋萎縮症、フリードライヒ運動失調症、および筋強直性ジストロフィー２型。

【0104】

本明細書に記載されるように、導入遺伝子は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター内に保有され得る。ベクターは、環状または直鎖の二本鎖または一本鎖のＤＮＡの形態であり得る。ドナー分子は、安定性または細胞更新（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｄａｔｅ）を促進する試薬とコンジュゲートまたは会合することができる。試薬は、脂質、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、ＤＥＡＥ－デキストラン、デンドリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、細胞膜透過性ペプチド、ガス封入マイクロバブル、または磁気ビーズであり得る。ドナー分子は、ウイルス粒子に組み込むことができる。ウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、単純ヘルペス、ポックスウイルス、ハイブリッドアデノウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルス、レンチウイルス、または単純ヘルペスウイルスであり得る。

【0105】

ＲＮＡｉカセットを用いた遺伝子修復系
別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、サイレンシングに起因する失われたＲＮＡ／タンパク質を同時に置き換えながら、内因性遺伝子をサイレンシングするために使用され得る。一実施形態では、本方法は、導入遺伝子を細胞に投与することを含み得、導入遺伝子は、以下の２つの機能性エレメントを含む：１）サイレンシング配列、および２）サイレンシングされたタンパク質と相同であるが、サイレンシングに耐性であるタンパク質をコードする完全コード配列（図９）。２つの機能性エレメントは、別個の導入遺伝子上、または同一の導入遺伝子上にあり得る。別の実施形態では、本方法は、細胞に導入遺伝子を投与することを含み得、導入遺伝子は、目的の内因性遺伝子に組み込まれ、かつ１）サイレンシング配列、および２）サイレンシングに耐性である、変異遺伝子の修復のための部分的または完全なコード配列（図１２～１７）を含む。

【0106】

サイレンシング配列は、プロモーター、標的核酸をサイレンシングするように機能する核酸配列、およびターミネーターを含むことができる。核酸配列は、標的核酸（例えば、マイクロＲＮＡ、ヘアピンＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）内で遺伝子のサイレンシングを誘導することができる形式であり得る。核酸配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡの異なる領域を標的とすることができ、５’ＵＴＲ、コード配列、または３’ＵＴＲを含む。

【0107】

一実施形態では、本文書は、図１３に記載の導入遺伝子を細胞に投与し、当該導入遺伝子を目的の内因性遺伝子に組み込むことによって、目的のタンパク質の産生をサイレンシングさせ、置き換える方法を説明する。一実施形態では、導入遺伝子は、スプライスアクセプター、部分コード配列（サイレンシングに耐性である）、ターミネーター、および目的の内因性遺伝子をサイレンシングするように設計されたＲＮＡｉカセットを含むことができる。スプライスアクセプターは、ターミネーターに作動可能に連結され得る部分コード配列に作動可能に連結され得る。スプライスアクセプター、部分コード配列、ターミネーター、およびＲＮＡｉカセットは、第１および第２の相同アーム、または左右のトランスポゾン末端に隣接することができる。導入遺伝子は、目的の内因性遺伝子内のイントロンまたは目的の内因性遺伝子内のイントロン－エキソン接合部に組み込まれ得る。部分コード配列は、導入遺伝子が組み込まれる位置と比較して、残りのペプチド配列をコードすることができる。例えば、導入遺伝子が５個のエキソンを含む遺伝子のイントロン３に組み込まれる場合（図１３）、部分コード配列は、内因性遺伝子のエキソン４およびエキソン５によって産生されるペプチドをコードすることができる。これらの導入遺伝子内のＲＮＡｉカセットは、エキソン４もしくは５または３’ＵＴＲ内の配列を標的とすることができる。したがって、導入遺伝子内の部分コード配列内の対応する標的部位は、修飾された内因性アレルのサイレンシングを阻止するように修飾され得る。他の実施形態では、導入遺伝子は、第１および第２のスプライスアクセプター、第１および第２の部分コード配列（両方ともサイレンシングに耐性である）、第１および第２のターミネーター、ならびにＲＮＡｉカセットを含むことができる。これらの導入遺伝子は、追加の配列（例えば、ウイルスＩＴＲ）、第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位、左右のトランスポゾン末端、または第１および第２の相同アームと第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位との両方に隣接することができる。一実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［相同アーム１］－［スプライスアクセプター］－［部分コード配列］－［ターミネーター］－［ＲＮＡｉカセット］－［相同アーム２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［トランスポザーゼの左末端］－［スプライスアクセプター］－［部分コード配列］－［ターミネーター］－［ＲＮＡｉカセット］－［トランスポザーゼの右末端］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［追加配列１］－［スプライスアクセプター１］－［部分コード配列１］－［ターミネーター１］－［ＲＮＡｉカセット］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［部分コード配列２ ＲＣ］－［スプライスアクセプター２ ＲＣ］－［追加配列２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位１］－［スプライスアクセプター１］－［部分コード配列１］－［ターミネーター１］－［ＲＮＡｉカセット］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［部分コード配列２ ＲＣ］－［スプライスアクセプター２ ＲＣ］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位１］－［相同アーム１］－［スプライスアクセプター１］－［部分コード配列１］－［ターミネーター１］－［ＲＮＡｉカセット］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［部分コード配列２ ＲＣ］－［スプライスアクセプター２ ＲＣ］－［相同アーム２］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［トランスポザーゼの左末端］－［スプライスアクセプター１］－［部分コード配列１］－［ターミネーター１］－［ＲＮＡｉカセット］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［部分コード配列２ ＲＣ］－［スプライスアクセプター２ ＲＣ］－［トランスポザーゼの右末端］であり得る。

【0108】

一実施形態では、本文書は、図１４に記載の導入遺伝子を細胞に投与し、当該導入遺伝子を目的の内因性遺伝子に組み込むことによって、目的のタンパク質の産生をサイレンシングさせ、置き換える方法を説明する。一実施形態では、導入遺伝子は、スプライスアクセプター、２Ａ配列、完全コード配列（サイレンシングに耐性である）、ターミネーター、および目的の内因性遺伝子をサイレンシングするように設計されたＲＮＡｉカセットを含むことができる。スプライスアクセプターは、２Ａ配列に作動可能に連結され得、ターミネーターに作動可能に連結され得る完全コード配列に作動可能に連結され得る。スプライスアクセプター、２Ａ配列、完全コード配列、ターミネーター、およびＲＮＡｉカセットは、第１および第２の相同アーム、または左右のトランスポゾン末端に隣接することができる。導入遺伝子は、目的の内因性遺伝子内のイントロンまたは目的の内因性遺伝子内のイントロン－エキソン接合部に組み込まれ得る（図１４）。ＲＮＡｉは、目的の内因性遺伝子の発現をサイレンシングするように設計することができ、導入遺伝子内の完全コード配列は、サイレンシングに耐性であるように設計することができる。したがって、導入遺伝子内の完全コード配列内の対応する標的部位は、サイレンシングを阻止するように修飾され得る。他の実施形態では、導入遺伝子は、第１および第２のスプライスアクセプター、第１および第２の２Ａ配列、第１および第２のコード配列（両方ともサイレンシングに耐性である）、第１および第２のターミネーター、ならびにＲＮＡｉカセットを含むことができる。これらの導入遺伝子は、追加の配列（例えば、ウイルスＩＴＲ）、第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位、左右のトランスポゾン末端、または第１および第２の相同アームと第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位との両方に隣接することができる。一実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［相同アーム１］－［スプライスアクセプター］－［２Ａ］－［コード配列］－［ターミネーター］－［ＲＮＡｉカセット］－［相同アーム２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［トランスポザーゼの左末端］－［スプライスアクセプター］－［２Ａ］－［コード配列］－［ターミネーター］－［ＲＮＡｉカセット］－［トランスポザーゼの右末端］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［追加配列１］－［スプライスアクセプター１］－［２Ａ１］－［コード配列１］－［ターミネーター１］－［ＲＮＡｉカセット］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［コード配列２ ＲＣ］－［２Ａ２ ＲＣ］－［スプライスアクセプター２ ＲＣ］－［追加配列２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位１］－［スプライスアクセプター１］－［２Ａ１］－［コード配列１］－［ターミネーター１］－［ＲＮＡｉカセット］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［コード配列２ ＲＣ］－［２Ａ２ ＲＣ］－［スプライスアクセプター２ ＲＣ］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位１］－［相同アーム１］－［スプライスアクセプター１］－［２Ａ１］－［コード配列１］－［ターミネーター１］－［ＲＮＡｉカセット］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［コード配列２ ＲＣ］－［２Ａ２ ＲＣ］－［スプライスアクセプター２ ＲＣ］－［相同アーム２］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［トランスポザーゼの左末端］－［スプライスアクセプター１］－［２Ａ１］－［コード配列１］－［ターミネーター１］－［ＲＮＡｉカセット］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［コード配列２ ＲＣ］－［２Ａ２ ＲＣ］－［スプライスアクセプター２ ＲＣ］－［トランスポザーゼの右末端］であり得る。

【0109】

一実施形態では、本文書は、図１５に記載の導入遺伝子を細胞に投与し、当該導入遺伝子を目的の内因性遺伝子に組み込むことによって、目的のタンパク質の産生をサイレンシングさせ、置き換える方法を説明する。一実施形態では、導入遺伝子は、２Ａ配列、完全コード配列（サイレンシングに耐性である）、ターミネーター、および目的の内因性遺伝子をサイレンシングするように設計されたＲＮＡｉカセットを含むことができる。２Ａ配列は、ターミネーターに作動可能に連結され得る完全コード配列に作動可能に連結され得る。２Ａ配列、完全コード配列、ターミネーター、およびＲＮＡｉカセットは、第１および第２の相同アーム、または左右のトランスポゾン末端に隣接することができる。導入遺伝子は、目的の内因性遺伝子内のエキソンに組み込まれ得る（図１５）。ＲＮＡｉは、目的の内因性遺伝子の発現をサイレンシングするように設計することができ、導入遺伝子内の完全コード配列は、サイレンシングに耐性であるように設計することができる。したがって、導入遺伝子内の完全コード配列内の対応する標的部位は、サイレンシングを阻止するように修飾され得る。他の実施形態では、導入遺伝子は、第１および第２の２Ａ配列、第１および第２のコード配列（両方ともサイレンシングに耐性である）、第１および第２のターミネーター、ならびにＲＮＡｉカセットを含むことができる。これらの導入遺伝子は、追加の配列（例えば、ウイルスＩＴＲ）、第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位、左右のトランスポゾン末端、または第１および第２の相同アームと第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位との両方に隣接することができる。一実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［相同アーム１］－［２Ａ］－［コード配列］－［ターミネーター］－［ＲＮＡｉカセット］－［相同アーム２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［トランスポザーゼの左末端］－［２Ａ］－［コード配列］－［ターミネーター］－［ＲＮＡｉカセット］－［トランスポザーゼの右末端］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［追加配列１］－［２Ａ１］－［コード配列１］－［ターミネーター１］－［ＲＮＡｉカセット］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［コード配列２ ＲＣ］－［２Ａ２ ＲＣ］－［追加配列２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位１］－［２Ａ１］－［コード配列１］－［ターミネーター１］－［ＲＮＡｉカセット］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［コード配列２ ＲＣ］－［２Ａ２ ＲＣ］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位１］－［相同アーム１］－［２Ａ１］－［コード配列１］－［ターミネーター１］－［ＲＮＡｉカセット］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［コード配列２ ＲＣ］－［２Ａ２ ＲＣ］－［相同アーム２］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［トランスポザーゼの左末端］－［２Ａ１］－［コード配列１］－［ターミネーター１］－［ＲＮＡｉカセット］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［コード配列２ ＲＣ］－［２Ａ２ ＲＣ］－［トランスポザーゼの右末端］であり得る。

【0110】

一実施形態では、本文書は、図１６に記載の導入遺伝子を細胞に投与し、当該導入遺伝子を目的の内因性遺伝子に組み込むことによって、目的のタンパク質の産生をサイレンシングさせ、置き換える方法を説明する。一実施形態では、導入遺伝子は、完全なコード配列（サイレンシングに耐性であり、開始コドンを含む）、ターミネーター、および目的の内因性遺伝子をサイレンシングするように設計されたＲＮＡｉカセットを含むことができる。完全コード配列は、ターミネーターに作動可能に連結され得る。完全コード配列、ターミネーター、およびＲＮＡｉカセットは、第１および第２の相同アーム、または左右のトランスポゾン末端に隣接することができる。組み込み部位は、５’ＵＴＲ内であっても、開始コドンの前であってもよい（図１６）。追加の組み込み部位は、存在する場合、５’ＵＴＲ内のイントロン内にあってもよいが、この実施形態内で記載される導入遺伝子は、次いで、完全コード配列（複数可）に作動可能に連結されたスプライスアクセプター配列を含む必要がある。ＲＮＡｉは、目的の内因性遺伝子の発現をサイレンシングするように設計することができ、導入遺伝子内の完全コード配列は、サイレンシングに耐性であるように設計することができる。したがって、導入遺伝子内の完全コード配列内の対応する標的部位は、サイレンシングを阻止するように修飾され得る。他の実施形態では、導入遺伝子は、第１および第２のコード配列（両方ともサイレンシングに耐性である）、第１および第２のターミネーター、ならびにＲＮＡｉカセットを含むことができる。これらの導入遺伝子は、追加の配列（例えば、ウイルスＩＴＲ）、第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位、左右のトランスポゾン末端、または第１および第２の相同アームと第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位との両方に隣接することができる。一実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［相同アーム１］－［コード配列］－［ターミネーター］－［ＲＮＡｉカセット］－［相同アーム２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［トランスポザーゼの左末端］－［コード配列］－［ターミネーター］－［ＲＮＡｉカセット］－［トランスポザーゼの右末端］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［追加配列１］－［コード配列１］－［ターミネーター１］－［ＲＮＡｉカセット］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［コード配列２ ＲＣ］－［追加配列２］であり得る。他の実施形態では、導入遺伝子は、タンパク質産生を置き換え、内因性遺伝子をサイレンシングさせないように設計され得る。一実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位１］－［コード配列１］－［ターミネーター１］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［コード配列２ ＲＣ］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位１］－［相同アーム１］－［コード配列１］－［ターミネーター１］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［コード配列２ ＲＣ］－［相同アーム２］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［トランスポザーゼの左末端］－［コード配列１］－［ターミネーター１］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［コード配列２ ＲＣ］－［トランスポザーゼの右末端］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［相同アーム１］－［コード配列］－［ターミネーター］－［相同アーム２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［トランスポザーゼの左末端］－［コード配列］－［ターミネーター］－［トランスポザーゼの右末端］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［追加配列１］－［コード配列１］－［ターミネーター１］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［コード配列２ ＲＣ］－［追加配列２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位１］－［コード配列１］－［ターミネーター１］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［コード配列２ ＲＣ］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位１］－［相同アーム１］－［コード配列１］－［ターミネーター１］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［コード配列２ ＲＣ］－［相同アーム２］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［トランスポザーゼの左末端］－［コード配列１］－［ターミネーター１］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［コード配列２ ＲＣ］－［トランスポザーゼの右末端］であり得る。

【0111】

一実施形態では、本文書は、図１７に記載の導入遺伝子を細胞に投与し、当該導入遺伝子を目的の内因性遺伝子に組み込むことによって、目的のタンパク質の産生をサイレンシングさせ、置き換える方法を説明する。一実施形態では、導入遺伝子は、内因性遺伝子をサイレンシングするように設計されたＲＮＡｉカセット、プロモーター、部分コード配列（サイレンシングに耐性である）、およびスプライスドナー配列を含むことができる。プロモーターは、スプライスドナーに作動可能に連結され得る部分コード配列に作動可能に連結され得る。ＲＮＡｉカセット、プロモーター、部分コード配列、およびスプライスドナーは、第１および第２の相同アーム、または左右のトランスポゾン末端に隣接することができる。導入遺伝子は、目的の内因性遺伝子内のエキソンまたはイントロンに組み込むことができるが（図１７）、全長タンパク質の産生に必要な内因性スプライスアクセプターを破壊する部位内に組み込むことはできない。ＲＮＡｉは、目的の内因性遺伝子の発現をサイレンシングするように設計することができ、導入遺伝子内の部分コード配列は、サイレンシングに耐性であるように設計することができる。したがって、導入遺伝子内の完全コード配列内の対応する標的部位は、サイレンシングを阻止するように修飾され得る。他の実施形態では、導入遺伝子は、第１および第２のスプライスドナー配列、第１および第２の部分コード配列（両方ともサイレンシングに耐性である）、第１および第２のプロモーター、ならびにＲＮＡｉカセットを含むことができる。これらの導入遺伝子は、追加の配列（例えば、ウイルスＩＴＲ）、第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位、左右のトランスポゾン末端、または第１および第２の相同アームと第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位との両方に隣接することができる。一実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［相同アーム１］－［ＲＮＡｉカセット］－［プロモーター］－［部分コード配列］－［スプライスドナー］－［相同アーム２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［トランスポゾンの左末端］－［ＲＮＡｉカセット］－［プロモーター］－［部分コード配列］－［スプライスドナー］－［トランスポゾンの右末端］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［追加配列１］－［スプライスドナー１ ＲＣ］－［部分コード配列１ ＲＣ］－［プロモーター１ ＲＣ］－［ＲＮＡｉカセット］－［プロモーター２］－［部分コード配列２］－［スプライスドナー２］－［追加配列２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位１］－［スプライスドナー１ ＲＣ］－［部分コード配列１ ＲＣ］－［プロモーター１ ＲＣ］－［ＲＮＡｉカセット］－［プロモーター２］－［部分コード配列２］－［スプライスドナー２］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位１］－［相同アーム１］－［スプライスドナー１ ＲＣ］－［部分コード配列１ ＲＣ］－［プロモーター１ ＲＣ］－［ＲＮＡｉカセット］－［プロモーター２］－［部分コード配列２］－［スプライスドナー２］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位２］であり得る。別の実施形態では、導入遺伝子の構造は、５’から３’へ、［トランスポザーゼの左末端］－［スプライスドナー１ ＲＣ］－［部分コード配列１ ＲＣ］－［プロモーター１ ＲＣ］－［ＲＮＡｉカセット］－［プロモーター２］－［部分コード配列２］－［スプライスドナー２］－［トランスポザーゼの右末端］であり得る。導入遺伝子を使用して、ＳＮＣＡ遺伝子を修飾することができる。ＳＮＣＡにおける変異は、パーキンソン病を引き起こすことが見出されている。本明細書に記載の導入遺伝子を使用して、ＳＮＣＡの遺伝子発現を修正することができる。場合によっては、ＳＮＣＡは、重複または三重であり、αシヌクレインタンパク質の過剰な産生をもたらす。他の場合では、Ａｌａ３０Ｐｒｏなどの変異は、タンパク質の誤った折り畳みを引き起こす。本明細書に記載の導入遺伝子は、ＳＮＣＡの発現をＳＮＣＡアイソフォーム（全長１４０ａａタンパク質、１２６ａａタンパク質、１１２ａａタンパク質、９８ａａタンパク質、６７ａａタンパク質、および１１５ａａタンパク質を含む、少なくとも６つのＳＮＣＡの転写産物が存在する）の一部または全てに置き換えながら、内因性ＳＮＣＡ発現（遺伝子重複および遺伝子内変異から）の発現を低減する方法を提供する。ＳＮＣＡ遺伝子は６個のエキソンを含み、エキソン２に開始コドンが含まれる。本文書は、ＳＮＣＡ遺伝子への組み込みのための導入遺伝子を提供する。導入遺伝子は、ＳＮＣＡのエキソン１またはエキソン２を標的とするＲＮＡｉカセット、プロモーター、ＳＮＣＡのエキソン２によって産生されるペプチドをコードする部分コード配列（この部分コード配列はＲＮＡｉカセットによるサイレンシングに耐性がある）、およびスプライスドナーを含むことができる。

【0112】

一実施形態では、本明細書で提供される方法は、完全機能性サイレンシング耐性コード配列およびＲＮＡｉサイレンシング配列を有する導入遺伝子の送達を説明する（図９）。機能性コード配列は、プロモーター、ＲＮＡまたはタンパク質産物を産生するように機能する核酸配列、およびターミネーターを含んでもよい。核酸配列は、サイレンシング配列によるサイレンシングを回避するようにカスタマイズされ得る（図９）。一実施形態では、導入遺伝子は、転写産物の５’ＵＴＲを標的とするサイレンシング配列を含むことができる。導入遺伝子内の機能性コード配列は、標的遺伝子に由来しない代替の５’ＵＴＲと共に、または５’ＵＴＲがない、サイレンシングされた遺伝子（ＷＴまたはコドン調整のいずれか）のコード配列を含むことができる。別の実施形態では、導入遺伝子は、転写産物の３’ＵＴＲを標的とするサイレンシング配列を含み得る。導入遺伝子内の機能性コード配列は、標的遺伝子に由来しない代替の３’ＵＴＲと共に、または３’ＵＴＲがない、サイレンシングされた遺伝子（ＷＴまたはコドン調整のいずれか）のコード配列を含むことができる。さらに別の実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子のコード配列を標的とするサイレンシング配列を含むことができる。機能性コード配列は、サイレンシングされた遺伝子のコード配列を含むことができ、このコード配列全体またはコード配列の一部分は、サイレンシング配列によるサイレンシングを回避するように修飾される。修飾は、コドン最適化／コドン調整などの方法によって、または標的領域を欠失することによって達成することができる。一実施形態では、サイレンシング配列および機能性コード配列を含む本明細書に記載の導入遺伝子は、（例えば、ウイルスベクターもしくはプラスミドＤＮＡによって）細胞に一過性に送達され得るか、または細胞のゲノム内に組み込まれ得る。一部の実施形態では、導入遺伝子は、細胞に送達され得、機能獲得変異を有する１つ以上の遺伝子を含む（図７）。機能獲得変異を有する疾患の例としては、ＨＤ（ハンチントン病）、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症）、ＳＣＡ１（脊髄小脳失調症１型）、ＳＣＡ２（脊髄小脳失調症２型）、ＳＣＡ３（脊髄小脳失調症３型またはマシャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ６（脊髄小脳失調症６型）、ＳＣＡ７（脊髄小脳失調症７型）、脆弱Ｘ症候群、脆弱ＸＥ精神遅滞、フリードライヒ運動失調症、筋強直性ジストロフィー１型、筋強直性ジストロフィー２型、脊髄小脳失調症８型、脊髄小脳失調症１２型、球脊髄性筋萎縮症、ＪＰＨ３、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、遺伝性運動性感覚性ニューロパチーＩＩＣ型、シナプス後スローチャネル先天性筋無力症候群、ＰＲＰＳ１過活動性、パーキンソン病、細管集合体ミオパチー、軟骨無形成症、ルブスＸ連鎖精神遅滞症候群、ならびに常染色体優性網膜色素変性症が挙げられる。

【0113】

特定の実施形態では、サイレンシング配列および機能性コード配列を含む本明細書に記載の導入遺伝子は、特定の遺伝子をサイレンシングし、遺伝子の発現を置き換えることによって機能獲得障害を修正するために使用することができる。遺伝子は、ＳＯＤ１、ＴＲＰＶ４、ＣＨＲＮＡ１、ＣＨＲＮＤ、ＣＨＲＮＥ、ＣＨＲＮＢ１、ＰＲＰＳ１、ＬＲＲＫ２、ＳＴＩＭ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＣＰ２、ＳＮＣＡ、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＡＴＸＮ３、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、ＴＢＰ、ＨＴＴ、ＡＲ、ＦＸＮ、ＤＭＰＫ、ＰＡＢＰＮ１、ＡＴＸＮ８、ＲＨＯ、およびＣ９ｏｒｆ７２を含むことができる。

【0114】

サイレンシング配列および機能性コード配列を含む本明細書に記載の導入遺伝子は、ウイルス性（例えば、ＡＡＶベクター）または非ウイルス性の方法を使用して、細胞に送達することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶに由来し得る。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、欠陥および非病原性のパルボウイルス科アデノ随伴２型ウイルス由来である。かかるベクターは全て、導入遺伝子の発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐ逆位末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムへの組み込みによる効率的な遺伝子輸送および安定した導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特徴である。（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２－３，１９９８；Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８－５５、１９９６）。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶｒｈ．１０、ならびに任意の新規のＡＡＶ血清型を含む他のＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用することができる。一部の実施形態では、キメラＡＡＶが使用され、ウイルス核酸の長鎖末端反復（ＬＴＲ）配列のウイルス起源は、カプシド配列のウイルス起源に対して異種である。非限定的な例としては、ＡＡＶ２に由来するＬＴＲと、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９に由来するカプシド（すなわち、それぞれＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８、およびＡＡＶ２／９）とを有するキメラウイルスが挙げられる。

【0115】

また、本明細書に記載の構築物は、アデノウイルスベクター系に組み込むこともできる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターにより、高力価および高レベルの発現を得ることができる。

【0116】

本明細書に記載の方法および組成物は、ゲノム修飾を通して生物を改変することが所望される任意の真核生物に適用可能である。真核生物としては、植物、藻類、動物、真菌、および原生生物が挙げられる。また、真核生物は植物細胞、藻類細胞、動物細胞、真菌細胞、および原生生物細胞を含むこともできる。

【0117】

例示的な哺乳動物細胞としては、卵母細胞、Ｋ５６２細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＨＥＰ－Ｇ２細胞、ＢａＦ－３細胞、シュナイダー細胞、ＣＯＳ細胞（ＳＶ４０のＴ－抗原を発現するサル腎臓細胞）、ＣＶ－１細胞、ＨｕＴｕ８０細胞、ＮＴＥＲＡ２細胞、ＮＢ４細胞、ＨＬ－６０細胞、およびＨｅＬａ細胞、２９３細胞（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９を参照されたい）、ならびにＳＰ２またはＮＳ０のような骨髄腫細胞（例えば、Ｇａｌｆｒｅ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９８１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（Ｂ）：３ ４６を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。また、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはＴ細胞も使用することができ、同様に、胚幹細胞および成体幹細胞も使用することができる。例えば、使用可能な幹細胞としては、胚幹細胞（ＥＳ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉幹細胞、造血幹細胞、肝臓幹細胞、皮膚幹細胞、および神経幹細胞が挙げられる。

【0118】

本発明の方法および組成物は、組換え生物（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の産生に使用することができる。組換え生物は、小型哺乳動物、伴侶動物、家畜、および霊長類であり得る。げっ歯類の非限定的な例としては、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、およびモルモットが挙げられ得る。伴侶動物の非限定的な例としては、ネコ、イヌ、ウサギ、ハリネズミ、およびフェレットが挙げられ得る。家畜の非限定的な例としては、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカ、およびウシが挙げられ得る。霊長類の非限定的な例としては、オマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカクザル、マーモセット、タマリン、クモザル、リスザル、およびベルベットモンキーが挙げられ得る。本発明の方法および組成物は、ヒトに使用することができる。

【0119】

本明細書に記載の方法を使用して修飾することができる例示的な植物および植物細胞としては、限定されないが、単子葉植物（例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、アワ、オオムギ、サトウキビ）、双子葉植物（例えば、ダイズ、ジャガイモ、トマト、アルファルファ）、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えば、アルファルファ）、根野菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ）、葉野菜作物（例えば、レタス、ホウレンソウ）、消費用の植物作物（例えば、ダイズおよび他のマメ科植物、カボチャ、ピーマン、ナス、セロリなど）、顕花植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹およびマツ（例えば、マツ、モミ、スプルース）、ポプラ樹（例えば、Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａ×Ｐ．ａｌｂａ）、繊維作物（ワタ、ジュート、アマ、タケ）、フィトレメディエーションに使用される植物（例えば、重金属集積植物）、油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）、ならびに実験目的で使用される植物（例えば、シロイヌナズナ）が挙げられる。本明細書に開示される方法は、アスパラガス属、カラスムギ属、アブラナ属、柑橘属、スイカ属、トウガラシ属、カボチャ属、ニンジン属、ムカシヨモギ属、ダイズ属、ワタ属、オオムギ属、アキノノゲシ属、ドクムギ属、トマト属、リンゴ属、キャッサバ属、タバコ属、ショカツサイ属、イネ属、ワニナシ属、インゲン属、エンドウ属、ナシ属、サクラ属、ダイコン属、ライムギ属、ナス属、モロコシ属、コムギ属、ブドウ属、ササゲ属、およびトウモロコシ属内で使用することができる。植物細胞という用語は、単離された植物細胞、ならびに種子、カルス、葉、および根などの全植物または全植物の一部を含む。また、本開示は、上に記載の植物の種子も包含し、本明細書に記載の組成物および／または方法を使用して、種子が修飾される。本開示は、上に記載のトランスジェニック植物の子孫、クローン、細胞株または細胞をさらに包含し、当該子孫、クローン、細胞株または細胞は、導入遺伝子または遺伝子構築物を有する。例示的な藻類種としては、微細藻類、珪藻類、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ、クロレラ属、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ、グラシレリア属、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ ｃａｒｔｅｒａｅ、ソルガスム属、およびアオサ属が挙げられる。

【0120】

本文書に記載の方法は、導入遺伝子分子の内因性遺伝子への相同組換えまたは非相同組み込みを刺激するためのレアカッティングエンドヌクレアーゼの使用を含むことができる。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、または亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ系は、広範なＰＡＭ能力を示すバリアント（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５６，５７－６３，２０１８；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ＤＯＩ：１０．１１２６，２０１８）、またはより高いオンターゲット結合または切断活性を示すバリアント（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２９：４９０－４９５，２０１６）を含むことができる。遺伝子編集試薬は、ヌクレアーゼ（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３－８２６，２０１３、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６：７５７－７６１，２０１０）、ニッカーゼ（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９－８２３，２０１３、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １：２６１－２６６，２０１４）、ＣＲＩＳＰＲ－ＦｏｋＩ二量体（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２：５６９－５７６，２０１４）、またはＣＲＩＳＰＲ・ニッカーゼ対（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５４：１３８０－１３８９，２０１３）の形式であり得る。

【0121】

本文書に記載の方法および組成物は、内因性遺伝子のコード配列の５’末端を修飾することが所望される状況で、使用することができる。例えば、ＳＣＡ２を有する患者は、エキソン１に拡張したＣＡＧ反復を有する。ＳＣＡ２を有する患者は、エキソン１の置き換えから利益を得ることができる。他の例では、内因性遺伝子の５’末端内の機能喪失変異に起因する遺伝性障害を有する患者は、当該遺伝子の最初のエキソンの置き換えから利益を得ることができる。

【0122】

さらに、本文書に記載の方法および組成物は、野生型タンパク質が依然として産生されることを保証しながら、機能獲得遺伝性障害を治療することが所望される状況で使用することができる。例えば、ＲＨＯ遺伝子において機能獲得変異を有する網膜色素変性症を有する患者は、内因性ＲＨＯ遺伝子をサイレンシングし、野生型ＲＨＯタンパク質を同時に産生することができる導入遺伝子を含む療法から利益を得ることができる。このアプローチのさらなる利点としては、機能獲得変異部位を中心としないサイレンシングのための標的部位を選択する能力が挙げられる。この利点は、効果的なサイレンシング構築物の設計（例えば、低いオフターゲティングおよび非常に効果的なオンターゲティング）を可能にし、ＲＨＯ遺伝子の異なる領域における機能獲得変異を有する患者のための単独療法の設計を可能にする。さらに、本方法は、パーキンソン病およびＳＮＣＡを含む複数のアイソフォームを産生する遺伝子による機能獲得障害において特に有用であり得る。ＳＮＣＡ遺伝子の５’末端に機能獲得変異を有する細胞は、エキソン２を標的とするＲＮＡｉカセットを、プロモーターおよびＲＮＡｉサイレンシングに耐性のある部分コード配列を含む導入遺伝子との組み込みから利益を得ることができる。

【0123】

本発明は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない以下の実施例でさらに説明される。

【実施例】

【0124】

実施例１：ＡＴＸＮ２遺伝子におけるＤＮＡの標的組み込み
ヒト細胞のＡＴＸＮ２遺伝子に組み込むように設計された導入遺伝子を用いて、３つのプラスミドを構築した。全ての導入遺伝子は、ＡＴＸＮ２遺伝子のイントロン２内に組み込まれるように設計され、全ての導入遺伝子は、双方向の部分コード配列を、個々のプロモーターと共に挿入するように設計された。部分コード配列は、ＡＴＸＮ２遺伝子のエキソン１によって産生されるペプチドをコードする。第１のプラスミド（ｐＢＡ１１４１と称される）は、イントロン１の開始部と相同的な配列を有する左右の相同アームを含んだ（すなわち、成功した遺伝子標的化は、イントロン１へのｐＢＡ１１４１のカーゴの挿入をもたらす）。相同アーム間には、５’から３’へ、逆相補配向のスプライスドナー、逆相補配向のコドン調整を伴う部分コード配列１（ＡＴＸＮ２遺伝子のエキソン１によって産生されるペプチドをコードする）、逆相補配向のＥＦ１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、コドン調整を伴う部分コード配列２（ＡＴＸＮ２遺伝子のエキソン１によって産生されるペプチドをコードする）、およびスプライスドナーが含まれた。ｐＢＡ１１４１導入遺伝子の配列を、配列番号１５に示す（図６）。２つのヌクレアーゼを設計して、ｐＢＡ１１４１のゲノムへの組み込みを促進した：標的部位が（ＴＧＴＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＴＧＧＧＧＧ、配列番号１６）であるＣａｓ９、および標的部位が（ＴＴＴＣＣＣＴＴＧＴＧＣＣＴＣＡＡＧＴＣＣＡＴＣＣＧＴ、配列番号１７）であるＣａｓ１２ａ。また、標的部位もｐＢＡ１１４１に含めて、プラスミドからのドナー分子の遊離を促進させた。ｐＢＡ１１４１内の個々の成分を、配列番号１８～２４に示す。配列番号１８は、Ｃａｓ９およびＣａｓ１２ａの両方の標的部位を含む配列である。配列番号１９は、左の相同アームの配列を含む。配列番号２０は、非病原性ＡＴＸＮ２遺伝子の逆相補コドン調整部分コード配列（エキソン１）を含む。配列番号２１は、逆相補のＥＦ１αプロモーターを含む。配列番号２２は、逆相補のＣＭＶプロモーターを含む。配列番号２３は、非病原性ＡＴＸＮ２遺伝子のコドン調整部分コード配列（エキソン１）を含む。配列番号２４は、右の相同アームの配列を含む。第２のプラスミド（ｐＢＡ１１４２と称される）は、ｐＢＡ１１３５と同じカーゴを含むが、相同アームが除去されている。ヌクレアーゼ標的部位は保持され、プラスミドからの導入遺伝子の遊離を促進した。プラスミドの切断に成功することで、導入遺伝子が遊離され、それによってＮＨＥＪによるＡＴＸＮ２遺伝子への組み込みに配列が使用されることが可能になると予想された。ｐＢＡ１１４１の配列を、配列番号２５に示す。第３のプラスミド（ｐＢＡ１１４３と称される）は、ヌクレアーゼ標的部位を保有する配列（左の相同アームの上流）が除去され、右の相同アームが６００ｂｐに短縮されたことを除いて、ｐＢＡ１１４１と同じ配列を含んだ。

【0125】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して、トランスフェクションを行った。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ_２で維持した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２ｕｇのドナー、２ｕｇのガイドＲＮＡ（ＲＮＡ形式）、および２ｕｇのＣａｓ９（ＲＮＡ形式）または２ｕｇのＣａｓ１２ａプラスミド（ＤＮＡ形式）でトランスフェクトした。エレクトロポレーションを使用して、トランスフェクションを行った。トランスフェクションの７２時間後、ゲノムＤＮＡを単離し、組み込み事象について評価した。組み込みまたはゲノムＤＮＡを検出するために使用したプライマーのリストを、表１に示す。

【表1-1】

【表1-2】

【0126】

ｐＢＡ１１４１、ｐＢＡ１１４２およびｐＢＡ１１４３の組み込みを検出するために、ゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行った。ｐＢＡ１１４３に関して、導入遺伝子は、ＨＲにより正確に組み込まれるように設計された。したがって、バンドは、Ｃａｓ９およびＣａｓ１２ａトランスフェクション試料の両方について３’接合部のＰＣＲで検出され、イントロン１への正確な挿入を示す（図１７レーン７～１０）。予想されるバンドサイズは、１，２２５ｂｐ（レーン７および９）、および１，４０７ｂｐ（レーン８および１０）であった。プライマーｏＮＪＢ２０１＋ｏＮＪＢ１９０、およびｏＮＪＢ２０２＋ｏＮＪＢ１９１を、３’接合部のＰＣＲに使用した。ｐＢＡ１１４２に関して、相同アームが存在しなかったため、導入遺伝子は、ＮＨＥＪ挿入を介して挿入されることが予測された。Ｃａｓ９でトランスフェクトされた試料中のＮＨＥＪによる組み込みは、図１７のレーン６に見ることができる。予想されるバンドサイズは、８１３ｂｐであった。プライマーｏＮＪＢ２０２＋ｏＮＪＢ２１１を、ＮＨＥＪ挿入３’接合部のＰＣＲに使用した。ｐＢＡ１１４１に関して、相同アームおよびヌクレアーゼ切断部位の両方が、導入遺伝子上に存在した（図７）。ＨＲによる組み込みは、図１７のレーン２～４で観察され、ＮＨＥＪによる組み込みは、図１７のレーン５で観察された。ＨＲによる挿入をＰＣＲで検出するのに予想されるサイズは、１５９４ｂｐ（レーン２、プライマーｏＮＪＢ２０１＋ｏＮＪＢ１９０）、１７７５ｂｐ（レーン３、プライマーｏＮＪＢ２０２＋ｏＮＪＢ１９１）、１７７５ｂｐ（レーン４、プライマーｏＮＪＢ２０２＋ｏＮＪＢ１９１）であった。ＮＨＥＪによる挿入をＰＣＲで検出するのに予想されるサイズは、２０６７ｂｐであった（レーン５、プライマーｏＮＪＢ２０２＋ｏＮＪＢ２１１）。

【0127】

結果は、プロモーターを有する双方向の部分コード配列を含む記載の導入遺伝子が、複数の異なる修復経路を介してゲノムＤＮＡに組み込まれ得ることを示している。

【0128】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して、トランスフェクションを行う。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ_２で維持する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２ｕｇのドナー、２ｕｇのガイドＲＮＡ（ＲＮＡ形式）、および２ｕｇのＣａｓ９（ＲＮＡ形式）または２ｕｇのＣａｓ１２ａプラスミド（ＤＮＡ形式）でトランスフェクトした。エレクトロポレーションを使用して、トランスフェクションを行う。組み込みを含む単一細胞クローンを単離し、ＲＮＡを抽出する。ＲＮＡ配列決定を使用して、新しい転写産物を検出することができる。

【0129】

実施例２：内因性ＳＯＤ１の遺伝子発現のサイレンシングおよび置換ＳＯＤ１タンパク質の発現
本文書は、内因性遺伝子の発現をサイレンシングし、置き換える目的で、ＲＮＡｉ、ＲＮＡｉ耐性コード配列、および遺伝子編集を使用するための方法を説明する。これらの方法は、ＳＯＤ１遺伝子の変異を有する筋萎縮性側索硬化症を含む機能獲得障害に特に有用である。

【0130】

遺伝子のサイレンシングおよび置換を検証するために、導入遺伝子を、ＳＯＤ１のエキソン２内のＲＮＡｉ（ｓｈＲＮＡ）カセット標的配列で設計した。ｓｈＲＮＡは、配列ＧＧＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＴＧＧＡＡＴＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣ（配列番号４９）を含み、これをＵ６プロモーターの下流に配置した。また、導入遺伝子は、ＣＭＶプロモーターの下流のＳＯＤ１コード配列も含んだ。コード配列内の配列を、ｓｈＲＮＡのサイレンシングを回避するように修飾した。導入遺伝子（ｐＢＡ１１４８と称される）の配列、を配列番号１０に示す。スクランブルｓｈＲＮＡ（ｐＢＡ１１４７と称される、配列番号５３）、およびＷＴ ＳＯＤ１のコード配列（ｐＢＡ１１４９と称される、配列番号５４）を含む対照ベクターを生成した。

【0131】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して、トランスフェクションを行った。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ_２で維持した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２ｕｇのプラスミドでトランスフェクトした。エレクトロポレーションを使用して、トランスフェクションを行った。トランスフェクションの４８時間後、ＲＮＡを単離し、ＳＯＤ１のｍＲＮＡレベルを評価する。

【0132】

遺伝子編集を使用してＳＯＤ１遺伝子の発現をサイレンシングし、置換ＳＯＤ１タンパク質を産生するために、イントロン１に組み込まれるように、２つのベクターを設計する。第１のベクターは、５’から３’へ、左の相同アーム、スプライスアクセプター、エキソン２～５によって産生されるペプチドをコードするＳＯＤ１の部分コード配列（およびＲＮＡｉカセットによるサイレンシングを回避するための変異も含む）、ターミネーター、配列番号４９に示されるｓｈＲＮＡ配列を有するＲＮＡｉカセット、および右の相同アームを含む。第２のベクターは、５’から３’へ、ヌクレアーゼ標的部位、スプライスアクセプター、エキソン２～５によって産生されるペプチドをコードするＳＯＤ１の部分コード配列（およびＲＮＡｉカセットによるサイレンシングを回避するための変異も含む）、ターミネーター、配列番号４９に示されるｓｈＲＮＡ配列を有するＲＮＡｉカセット、逆相補配向の第２のターミネーター、エキソン２～５によって産生されるペプチドをコードする逆相補配向のＳＯＤ１の第２の部分コード配列（およびＲＮＡｉカセットによるサイレンシングを回避するための変異も含む）、逆相補配向の第２のスプライスアクセプター、および第２のヌクレアーゼ標的部位を含む（図１２）。

【0133】

２つの追加のベクターは、ＳＯＤ１遺伝子のイントロン３に組み込まれるように設計される。第１のベクターは、５’から３’へ、左の相同アーム、配列番号４９に示されるｓｈＲＮＡ配列を有するＲＮＡｉカセット、プロモーター、エキソン１および２によって産生されるペプチドをコードするＳＯＤ１の部分コード配列（およびＲＮＡｉカセットによるサイレンシングを回避するための変異も含む）、スプライスドナー、および右の相同アームを含む。第２のベクターは、５’から３’へ、ヌクレアーゼ標的部位、逆相補配向のスプライスドナー、エキソン１および２によって産生されるペプチドをコードする逆相補配向のＳＯＤ１の部分コード配列（およびＲＮＡｉカセットによるサイレンシングを回避するための変異も含む）、逆相補配向のプロモーター、配列番号４９に示されるｓｈＲＮＡ配列を有するＲＮＡｉカセット、第２のプロモーター、エキソン１および２によって産生されるペプチドをコードするＳＯＤ１の第２の部分コード配列（およびＲＮＡｉカセットによるサイレンシングを回避するための変異も含む）、スプライスドナー、および第２のヌクレアーゼ標的部位を含む（図１６）。

【0134】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して、トランスフェクションを行う。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ_２で維持する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２ｕｇのプラスミド、２ｕｇのガイドＲＮＡ（ＲＮＡ形式）、および２ｕｇのＣａｓ９（ＲＮＡ形式）でトランスフェクトする。エレクトロポレーションを使用して、トランスフェクションを行う。トランスフェクションの７２時間後、ＤＮＡを単離し、導入遺伝子の組み込みについて評価する。組み込み事象を含むクローンを単離し、ＳＯＤ１のｍＲＮＡレベル（内因性遺伝子由来および修飾遺伝子由来の両方）について評価する。

【0135】

実施例３：内因性ＳＮＣＡの遺伝子発現のサイレンシングおよび２つのＳＮＣＡタンパク質アイソフォームの発現
ＳＮＣＡにおける変異は、パーキンソン病を引き起こすことが見出されている。本明細書に記載の方法は、ＳＮＣＡの遺伝子発現を修正するのに使用することができる。場合によっては、ＳＮＣＡは、重複または三重であり、αシヌクレインタンパク質の過剰な産生をもたらす。他の場合では、Ａｌａ３０Ｐｒｏなどの変異は、タンパク質の誤った折り畳みを引き起こす。ＳＮＣＡおよびＳＮＣＡアイソフォーム（全長１４０ａａタンパク質、１２６ａａタンパク質、１１２ａａタンパク質、９８ａａタンパク質、６７ａａタンパク質、および１１５ａａタンパク質を含む、少なくとも６つの存在するＳＮＣＡの転写産物）の一部または全てを置き換えながら、内因性ＳＮＣＡの発現（遺伝子重複および遺伝子内変異から）の発現を低減する方法が、本明細書に記載される。

【0136】

導入遺伝子は、内因性ＳＮＣＡ遺伝子の発現をサイレンシングするために、ｓｈＲＮＡを保有するように設計された。導入遺伝子はまた、それぞれが各アイソフォームのための２つのオープンリーディングフレームをコードすることによって、２つのＳＮＣＡタンパク質アイソフォームを置き換えるように設計した。ｓｈＲＮＡは、ＳＮＣＡのコード配列（ＧＧＴＡＴＣＡＡＧＡＣＴＡＣＧＡＡＣ、配列番号１１）の３’末端を標的とする１９ｎｔのヘアピン配列を含む。導入遺伝子内の２つのＳＮＣＡオープンリーディングフレームは、ｓｈＲＮＡ標的部位に変異を保有するように設計された。配列番号１２は、発現プラスミド（ｐＢＡ１１５３と称される）にクローニングされた導入遺伝子の核酸配列を示す。他の２つの導入遺伝子を構築した：１つ目は、ｓｈＲＮＡおよび２つの野生型ＳＮＣＡアイソフォーム（ｓｈＲＮＡサイレンシングを阻止する変異を伴わない）を有し、２つ目は、スクランブルｓｈＲＮＡおよび２つの変異を伴うＳＮＣＡアイソフォームを有する。

【0137】

導入遺伝子を、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトする。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％のペニシリンストレプトマイシン（ＰＳ）溶液（×１００）が補充され、Ｌ－グルタミンとピルビン酸ナトリウムとを含まないＤＭＥＭ高グルコース培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２で維持する。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して、プラスミド構築物およびそれらの組み合わせの各々でトランスフェクトする。トランスフェクションの４８時間後、ＲＮＡを抽出し、ＳＮＣＡの転写レベルを評価する。内因性ＳＮＣＡ ＲＮＡの発現の低減、およびコドン調整ＳＮＣＡ配列からのＲＮＡの発現は、導入遺伝子の機能性を示す。

【0138】

遺伝子編集を使用してＳＮＣＡ遺伝子の発現をサイレンシングし、アイソフォーム産生を維持しながら置換ＳＮＣＡタンパク質を産生するために、エキソン２－イントロン２接合部に組み込まれるように、２つのベクターを設計する。第１のベクターは、５’から３’へ、左の相同アーム、エキソン２転写配列を標的とするｓｈＲＮＡ配列を有するＲＮＡｉカセット、プロモーター（１，０００ｂｐの内因性ＳＮＣＡプロモーターを含む）、開始コドンおよび内因性ＳＮＣＡ遺伝子のエキソン２によって産生されるペプチドをコードする部分コード配列（およびＲＮＡｉカセットによるサイレンシングを回避するための変異も含む）、スプライスドナー、および右の相同アームを含む。スプライスドナーおよび右の相同アームは、内因性イントロン２の５’末端由来の配列である。第２のベクターは、５’から３’へ、ヌクレアーゼ標的部位、逆相補配向のスプライスドナー、エキソン２によって産生されるペプチドをコードする逆相補配向のＳＮＣＡの部分コード配列（およびＲＮＡｉカセットによるサイレンシングを回避するための変異も含む）、逆相補配向のプロモーター、エキソン２を標的とするｓｈＲＮＡを有するＲＮＡｉカセット、第２のプロモーター、エキソン２によって産生されるペプチドをコードするＳＮＣＡの第２の部分コード配列（およびＲＮＡｉカセットによるサイレンシングを回避するための変異も含む）、スプライスドナー、および第２のヌクレアーゼ標的部位を含む（図１６）。スプライスドナー配列は、ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン２由来のスプライスドナー配列である。ヌクレアーゼは、導入遺伝子のエキソン２－イントロン２接合部への組み込みを促進するように設計されている。

【0139】

導入遺伝子およびヌクレアーゼを、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトする。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％のペニシリンストレプトマイシン（ＰＳ）溶液（×１００）が補充され、Ｌ－グルタミンとピルビン酸ナトリウムとを含まないＤＭＥＭ高グルコース培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２で維持する。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して、プラスミド構築物およびそれらの組み合わせの各々でトランスフェクトする。組み込み事象を含むクローンを単離し、ＲＮＡを抽出する。内因性ＳＮＣＡ ＲＮＡの発現の低減、および修飾ＳＮＣＡ遺伝子からのＲＮＡの発現は、導入遺伝子の機能性を示す。

【0140】

実施例４：内因性ＲＨＯ遺伝子の発現のサイレンシングおよび置換ＲＨＯタンパク質の発現
導入遺伝子は、内因性ＲＨＯ遺伝子の発現をサイレンシングするｓｈＲＮＡ、および野生型ＲＨＯタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを保有するように設計される。ＲＨＯタンパク質の配列は、配列番号１３に示される。サイレンシング配列は、内因性ＲＨＯ転写産物を標的とするヘアピン配列を保有する。導入遺伝子内のＲＨＯオープンリーディングフレームは、ｓｈＲＮＡ標的部位において最小限の配列相同性を含むようにコドン調整される。

【0141】

導入遺伝子を、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトする。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％のペニシリンストレプトマイシン（ＰＳ）溶液（×１００）が補充され、Ｌ－グルタミンとピルビン酸ナトリウムとを含まないＤＭＥＭ高グルコース培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２で維持する。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して、プラスミド構築物およびそれらの組み合わせの各々でトランスフェクトする。トランスフェクションから３日後、ＲＮＡを細胞から抽出し、転写物レベルを評価する。内因性ＲＨＯ ＲＮＡの発現の低減、およびコドン調整ＲＨＯ配列からのＲＮＡの発現は、導入遺伝子の機能性を示す。

【0142】

実施例５：内因性Ｃ９ｏｒｆ７２の遺伝子発現のサイレンシングおよび置換Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質の発現
導入遺伝子は、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の発現をサイレンシングするｓｈＲＮＡ、および野生型Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを保有するように設計される。Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質の配列は、配列番号１４に示される。サイレンシング配列は、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２転写産物を標的とするヘアピン配列を保有する。導入遺伝子内のＣ９ｏｒｆ７２のオープンリーディングフレームは、ｓｈＲＮＡの標的部位で最小限の配列相同性を含むようにコドン調整される。

【0143】

導入遺伝子を、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトする。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％のペニシリンストレプトマイシン（ＰＳ）溶液（×１００）が補充され、Ｌ－グルタミンとピルビン酸ナトリウムとを含まないＤＭＥＭ高グルコース培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２で維持する。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して、プラスミド構築物およびそれらの組み合わせの各々でトランスフェクトする。トランスフェクションから３日後、ＲＮＡを細胞から抽出し、転写物レベルを評価する。内因性Ｃ９ｏｒｆ７２ ＲＮＡの発現の低減、およびコドン調整Ｃ９ｏｒｆ７２配列の発現は、導入遺伝子の機能性を示す。

【0144】

実施例６：ＡＴＸＮ２遺伝子におけるＤＮＡの標的化組み込み
ＡＴＸＮ２を標的とする導入遺伝子が、ＡＴＸＮ２コード配列の５’末端を置き換えるように設計される。ｐＢＡ１０１２－Ｄ１と称されるプラスミドは、ＷＴコード配列をＡＴＸＮ２遺伝子のイントロン１に組み込むように設計された導入遺伝子で構築される（図４）。導入遺伝子は、イントロン１（配列番号２）中のスプライスドナー部位に続いて、配列に相同な第１の相同アームを含む。第１の相同アームに隣接するのは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの標的部位である。第１の相同アームの後に、ＡＴＸＮ２遺伝子（非拡張ＣＡＧ反復配列、配列番号３）の逆相補スプライスドナー配列およびエキソン１が続く。第１のコード配列に続いて、ＥＦ１αプロモーター（配列番号４）がある。頭対頭配向では、機能性エレメントの第２のセットが存在する。第２のセットのエレメントの開始は、ＡＴＸＮ２遺伝子のコドン調整エキソン１のコード配列（配列番号６）の発現を駆動するＣＭＶプロモーター（配列番号５）を含む。コード配列の後に、スプライスドナー部位および第２の相同アームが続く。第２の相同アームは、レアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位（配列番号８）を含む。導入遺伝子の配列は、配列番号１に示される。

【0145】

対応するＣａｓ９ヌクレアーゼは、１）内因性ＡＴＸＮ２遺伝子のイントロン１内、２）ｐＢＡ１０１２－Ｄ１導入遺伝子内の第１の相同アームに隣接部、および３）ｐＢＡ１０１２－Ｄ１導入遺伝子内の第２の相同アーム内、の３つの二本鎖切断を生成するように設計される。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの標的配列を、配列番号８に示す。

【0146】

導入遺伝子およびＣＲＩＳＰＲベクターの機能の確認は、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションによって達成される。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％のペニシリンストレプトマイシン（ＰＳ）溶液（×１００）が補充され、Ｌ－グルタミンとピルビン酸ナトリウムとを含まないＤＭＥＭ高グルコース培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２で維持する。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して、プラスミド構築物およびそれらの組み合わせの各々でトランスフェクトする。トランスフェクションの２日後、ＤＮＡを抽出し、ＡＴＸＮ２遺伝子内の変異および標的化挿入について評価する。ヌクレアーゼ活性は、Ｃｅｌ－Ｉアッセイを使用するか、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的配列を含むアンプリコンのディープ配列決定によって分析される。導入遺伝子の組み込みの成功は、ＰＣＲを使用して分析する。

【0147】

他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と併せて説明されているが、上述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図するものであり、限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲内にある。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

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