(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-07
(45)【発行日】2024-11-15
(54)【発明の名称】二分岐脂質結合オリゴヌクレオチドの製造方法及び中間体
(51)【国際特許分類】
C07F 9/572 20060101AFI20241108BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20241108BHJP
【ＦＩ】
C07F9/572 A CSP
C12N15/11 Z ZNA
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2021524842
(86)(22)【出願日】2020-06-02
(86)【国際出願番号】 JP2020021676
(87)【国際公開番号】W WO2020246443
(87)【国際公開日】2020-12-10
【審査請求日】2023-05-19
(31)【優先権主張番号】P 2019103903
(32)【優先日】2019-06-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000001926
【氏名又は名称】塩野義製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(74)【代理人】
【識別番号】100221578
【弁理士】
【氏名又は名称】林 康次郎
(72)【発明者】
【氏名】谷野 哲也
(72)【発明者】
【氏名】関口 光明
(72)【発明者】
【氏名】越智 俊輔
(72)【発明者】
【氏名】福井 伸明
【審査官】神谷 昌克
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第１８／１８１４２８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第１８／１７９１７２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第１７／０５７５４０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第１５／０１２９１２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５１４１０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第１０／０７１８５２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】LIU,H. et al.，Membrane Anchored Immunostimulatory Oligonucleotides for In Vivo Cell Modification and Localized Imm，Angewandte Chemie, International Edition，2011年，Vol.50, No.31，pp.7052-7055, S7052/1-S7052/8，DOI 10.1002/anie.201101266
【文献】LIU,H. et al.，DNA-Based Micelles: Synthesis, Micellar Properties and Size-Dependent Cell Permeability，Chemistry - A European Journal，2010年，Vol.16, No.12，pp.3791-3797，DOI 10.1002/chem.200901546
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｆ
Ｃ１２Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下に記載の式で示される化合物又はその塩。【化1】
【請求項2】
以下に記載の式
【化2】
で示される化合物と、
式（ＩＩＩ）：
【化3】
（式中、Ｓｕｐｐｏｒｔは固相担体を意味し、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅはオリゴヌクレオチドを意味し、３’はオリゴヌクレオチドの３’末端を意味し、５’はオリゴヌクレオチドの５’末端を意味する。Ｗは単結合又は式：
【化4】
（式中、Ｚ１はＯ又はＳであり、
Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立してアルキル又はアルケニルであり、
式中の末端のアルキレンがオリゴヌクレオチドの３’末端の酸素に結合し、式中の末端の酸素原子が固相担体に結合する）で示される基である。）で示されるオリゴヌクレオチドを反応させ、式（ＩV）’：
【化5】
（式中、
Ｚ２はＯ又はＳであり、
Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、３’、５’及びＷは前記と同意義である。）で示される化合物を得る工程、
切断試薬及び脱保護剤の存在下で、式（ＩＶ）’で示される化合物中の保護基の脱保護及び固相担体からの切り出しを行い、式（Ｖ）’：
【化6】
（式中、各記号は前記と同意義であり、Ｗが上記式（ａ）～（ｄ）で示される基のいずれかである場合、式（ａ）～（ｄ）中の末端の酸素原子は水素原子に結合する。）で示される化合物を得る工程、及び
式（Ｖ）’で示される化合物に、
式（ＶＩ）：ＲＸ１－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ１（式中、ＲＸ１はアルキル又はアルケニルであり、Ｌ１はＯＨ又は脱離基である。）で示される化合物を反応させる工程を含む、
式（ＶＩＩ）’：
【化7】
（式中、各記号は前記と同意義である。）で示される化合物の製造方法。
【請求項3】
以下に記載の式
【化8】
で示される化合物と、
式（ＩＩＩ）：
【化9】
（式中、Ｓｕｐｐｏｒｔは固相担体を意味し、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅはオリゴヌクレオチドを意味し、３’はオリゴヌクレオチドの３’末端を意味し、５’はオリゴヌクレオチドの５’末端を意味する。Ｗは単結合又は式：
【化10】
（式中、Ｚ１はＯ又はＳであり、
Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立してのアルキル又はアルケニルであり、
式中の末端のアルキレンがオリゴヌクレオチドの３’末端の酸素に結合し、式中の末端の酸素原子が固相担体に結合する。）で示される基である）で示されるオリゴヌクレオチドを反応させ、式（ＩV）’：
【化11】
（式中、
Ｚ２はＯ又はＳであり、
Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、３’、５’及びＷは前記と同意義である。）で示される化合物を得る工程、
切断試薬及び脱保護剤の存在下で、式（ＩＶ）’で示される化合物中の保護基の脱保護及び固相担体からの切り出しを行い、式（Ｖ）’：
【化12】
（式中、各記号は前記と同意義であり、Ｗが上記式（ａ）～（ｄ）で示される基のいずれかである場合、式（ａ）～（ｄ）中の末端の酸素原子は水素原子に結合する）で示される化合物を得る工程、及び
式（Ｖ）’で示される化合物に、
式（ＶＩ）：ＲＸ１－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ１（式中、ＲＸ１はアルキル又はアルケニルであり、Ｌ１はＯＨ又は脱離基である。）で示される化合物を反応させ、式（ＶＩＩＩ）’：
【化13】
（式中、各記号は前記と同意義である。）で示される化合物を得る工程、
式（ＶＩＩＩ）’で示される化合物に、
式（ＩＸ）：ＲＸ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ２（式中、ＲＸ２はアルキル又はアルケニルであり、Ｌ２はＯＨ又は脱離基である。）で示される化合物を反応させる工程を含む、式（Ｘ）’：
【化14】
（式中、各記号は前記と同意義である。）で示される化合物の製造方法。
【請求項4】
ＲＸ１が、炭素数８～３０のアルキル又は炭素数８～３０のアルケニルであり、ＲＸ２が、炭素数１～２９のアルキル又は炭素数２～２９のアルケニルであり、
当該炭素数が、ＲＸ１のアルキル又はアルケニルの炭素数より少ないことを特徴とする、請求項３記載の製造方法。
【請求項5】
切断試薬及び脱保護剤が、ブチルアミン及び／又はベンジルアミンからを含む、請求項２～４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項6】
化合物（Ｖ）’を有機溶媒により洗浄する工程を含む、請求項２～５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項7】
請求項２～６のいずれかに記載の製造方法により化合物（ＶＩＩ）’又は（Ｘ）’を得る工程及び化合物（ＶＩＩ）’又は（Ｘ）’のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含むオリゴヌクレオチドをアニーリングして二本鎖を形成する工程を含む、
二本鎖オリゴヌクレオチドの製造方法。
【請求項8】
二本鎖オリゴヌクレオチドが、式：【化15】
で示される鎖及び以下から選択される一の式で示される鎖からなる二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項７記載の製造方法。
式：
【化16】
、式：
【化17】
、式：
【化18】
、式：
【化19】
、式：
【化20】
及び式：
【化21】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、二分岐脂質結合オリゴヌクレオチドの製造方法に関する。さらに、該製造方法に有用な中間体に関する。
【背景技術】
【0002】
特許文献１には、ジアシル脂質（つまり、二分岐脂質）が結合した免疫刺激性ＣｐＧオリゴヌクレオチドが記載されている。さらに、実施例１にジアシル脂質ホスホロアミダイトの合成方法及びジアシル脂質結合オリゴヌクレオチドの合成方法が記載されている。
特許文献２及び３には、免疫賦活活性を示すジアシル脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドが記載されている。さらに、これらの文献には、実施例１のＡ）の１－１）、１－２）及び３）にジアシル脂質を有するアミダイトの合成方法、Ｃ）にジアシル脂質結合オリゴヌクレオチドの合成方法が記載されている。
特許文献４には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ等の核酸医薬を含むオリゴヌクレオチドに、アミドを介するアルキルからなる鎖を末端に２つ含有する二分岐脂質が１つ結合している複合体（つまり、二分岐脂質結合オリゴヌクレオチド）が記載されている。さらに、実施例１のＡ）の１）に二分岐脂質が結合しているアミダイトの合成方法、Ｃ）に二分岐脂質結合オリゴヌクレオチドの合成方法が記載されている。
特許文献２及び３には、免疫賦活活性を示すジアシル脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドが記載されている。さらに、これらの文献には、実施例１のＡ）の１－１）、１－２）及び３）にジアシル脂質を有するアミダイトの合成方法、Ｃ）にジアシル脂質結合オリゴヌクレオチドの合成方法が記載されている。
特許文献４には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ等の核酸医薬を含むオリゴヌクレオチドに、アミドを介するアルキルからなる鎖を末端に２つ含有する二分岐脂質が１つ結合している複合体（つまり、二分岐脂質結合オリゴヌクレオチド）が記載されている。さらに、実施例１のＡ）の１）に二分岐脂質が結合しているアミダイトの合成方法、Ｃ）に二分岐脂質結合オリゴヌクレオチドの合成方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】国際公開第２０１３／１５１７７１号
【文献】国際公開第２０１７／０５７５４０号
【文献】国際公開第２０１８／１７９１７２号
【文献】国際公開第２０１８／１８１４２８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の目的は、二分岐脂質結合オリゴヌクレオチドの品質コントロールが可能な製造方法及び該製造方法に有用な、安定性がよく、管理及び分析が容易な中間体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
特許文献１～４にはジアシル脂質（二分岐脂質）とリンカーユニットを併せ持つ中間体（アミダイト）を固相でオリゴヌクレオチドに導入することにより二分岐脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドを得る方法が記載されている。本発明者らは、この方法では、オリゴヌクレオチドの二量体が生成され、アミダイトとオリゴヌクレオチドの縮合効率が悪いことを見出した。この問題点を克服するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、アシル脂質を導入予定の窒素原子に結合する二つの水素原子を保護基により置換したアミダイト（本発明のアミダイト）を中間体として利用し、オリゴヌクレオチドを合成した後に脂質を導入することにより、二量体の生成を抑え、アミダイトとオリゴヌクレオチドの縮合効率を改善し、二分岐脂質結合オリゴヌクレオチドを製造することができることを見出した。
【0006】
本発明者らは、さらに、特許文献２～４に記載の合成方法の中間体である特許文献２及び３記載の化合物４－１８（特許文献４記載の化合物５－１８、本願実施例における比較化合物）は（ａ）結晶性が悪く、その粉末Ｘ線回折は非晶質であること、（ｂ）一般的なＵＶ検出器を用いた分析に際し、実用的な波長域に吸収帯を有さないこと、（ｃ）－２０℃下においても不安定で経時的な分解が観測されたことという品質管理上の問題点を見出した。さらに、本発明者らは、（ｄ）該比較化合物を用いると二分岐脂質結合オリゴヌクレオチド合成の効率が比較的悪いという問題点を見出した。
それに対し、下記実施例２に記載の通り、（ａ’）本発明のアミダイト（中間体）である化合物５は、結晶性が良好であった。そのため、晶析による精製操作が容易であり、該比較化合物よりも十分に良好な純度にて化合物５を得ることができた。（ｂ’）化合物５はフタロイル基に由来すると一般に考えられるＵＶ吸収帯を有するため、純度の分析や不純物量の制御及び管理が容易であった。（ｃ’）化合物５は４０℃、５０日間においても分解は観測されなかった。その結果、ＵＶ検出器を備えた液体クロマトグラフィーにより品質管理された化合物５をオリゴヌクレオチドの原料として用いることにより、オリゴヌクレオチドの品質を担保することができた。さらに、（ｄ’）化合物５を使用した場合、特許文献１～４に記載の従来法と比較して、二分岐脂質結合オリゴヌクレオチド合成の効率が改善した。
本発明者らは、アシル脂質を導入予定の窒素原子に結合する一つの水素原子のみを保護基により置換したアミダイトを用いて、ジアシル脂質が結合したオリゴヌクレオチドの合成を試みた。８種の保護基を用いて、それぞれ下記実施例１と同様に、アミダイトの合成からオリゴヌクレオチドの合成を試みたが、アミダイトの合成が進行しない、アミダイトが不安定で徐々に分解する、オリゴヌクレオチドとアミダイトの縮合反応は進行するがアミダイトに施されていた保護基の脱保護ができない等の問題があった。つまり、本発明のアミダイト（下記式（ＩＩ）で示される化合物又はその塩、特に好ましくは下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩）が、アシル脂質を導入予定の窒素原子に結合する一つの水素原子のみを保護基により置換したアミダイトと比較し、高品質な二分岐脂質結合オリゴヌクレオチドの効率的な合成方法に用いる中間体として非常に優れていることを見出した。
それに対し、下記実施例２に記載の通り、（ａ’）本発明のアミダイト（中間体）である化合物５は、結晶性が良好であった。そのため、晶析による精製操作が容易であり、該比較化合物よりも十分に良好な純度にて化合物５を得ることができた。（ｂ’）化合物５はフタロイル基に由来すると一般に考えられるＵＶ吸収帯を有するため、純度の分析や不純物量の制御及び管理が容易であった。（ｃ’）化合物５は４０℃、５０日間においても分解は観測されなかった。その結果、ＵＶ検出器を備えた液体クロマトグラフィーにより品質管理された化合物５をオリゴヌクレオチドの原料として用いることにより、オリゴヌクレオチドの品質を担保することができた。さらに、（ｄ’）化合物５を使用した場合、特許文献１～４に記載の従来法と比較して、二分岐脂質結合オリゴヌクレオチド合成の効率が改善した。
本発明者らは、アシル脂質を導入予定の窒素原子に結合する一つの水素原子のみを保護基により置換したアミダイトを用いて、ジアシル脂質が結合したオリゴヌクレオチドの合成を試みた。８種の保護基を用いて、それぞれ下記実施例１と同様に、アミダイトの合成からオリゴヌクレオチドの合成を試みたが、アミダイトの合成が進行しない、アミダイトが不安定で徐々に分解する、オリゴヌクレオチドとアミダイトの縮合反応は進行するがアミダイトに施されていた保護基の脱保護ができない等の問題があった。つまり、本発明のアミダイト（下記式（ＩＩ）で示される化合物又はその塩、特に好ましくは下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩）が、アシル脂質を導入予定の窒素原子に結合する一つの水素原子のみを保護基により置換したアミダイトと比較し、高品質な二分岐脂質結合オリゴヌクレオチドの効率的な合成方法に用いる中間体として非常に優れていることを見出した。
【0007】
さらに、本発明者らは、鋭意研究の結果、化合物５を固相合成法でオリゴヌクレオチドに導入し、化合物７を得た後、固相担体から切り出しかつ脱保護を行い、化合物８を得る際に、オリゴヌクレオチドの配列中のシトシンのアミノ基をアセチル基で保護し、切断試薬及び脱保護剤としてｎ－ブチルアミン又はベンジルアミンを用いた場合が好ましいことを見出した。すなわち、副反応を起こすことなく、オリゴヌクレオチドの配列中の保護基（アデニン、グアニン又はシトシンのアミノ基の保護基及びリン酸のヒドロキシ基の保護基）及びフタロイル基を共に効率的に除去することができ、目的とする二分岐脂質結合オリゴヌクレオチドを得られることを見出した。つまり、本発明の切断試薬及び脱保護剤としてブチルアミン及び／又はベンジルアミンを用いるという条件が、その他条件と比較して、高品質な二分岐脂質結合オリゴヌクレオチドの合成方法として特に優れていることが示唆された。
【0008】
さらに、本発明者らは、鋭意研究の結果、固相担体から切り出しかつ脱保護の工程で用いるアルキルアミン等のアミン類は、アシル化反応の阻害要因となるが、化合物８を有機溶媒であるメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルにより洗浄することで、アミン類の残留量を低減できることを見出した。さらに、固相担体から切り出しかつ脱保護の工程でベンジルアミンを用いた場合には、ＵＶ検出によりその残存を追跡及び管理できるため、アシル化反応の進行に関して堅牢性が向上することを見出した。
【0009】
すなわち、本発明は、以下に関する。
（１）式（Ｉ）：
（式中、
Ａ及びＢはそれぞれ独立して、
であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４はそれぞれ独立して、Ｏ又はＳであり、
ｑはそれぞれ独立して、０～４の整数であり、
ｒ及びｓはそれぞれ独立して、０～３の整数であり、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、ハロゲン、ヒドロキシ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
ただし、ｑ個のＲ１、ｒ個のＲ２及びｓ個のＲ３は、同一でも異なっていてもよく、
ｍ、ｎ及びｐはそれぞれ独立して、０～５の整数であり、
Ｙは
式（Ｙ－１）：－Ｐ（ＯＲ４）（Ｎ（Ｒ５）２）（式中、Ｒ４は置換又は非置換のアルキルであり、Ｒ５はそれぞれ独立して、置換又は非置換のアルキルである。）で示される基、
式（Ｙ－２）：－Ｐ（＝Ｒ６）（ＯＲ７）２（式中、Ｒ６はＯ又はＳであり、Ｒ７はそれぞれ独立して、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキルカルボニル、置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基又は置換若しくは非置換の芳香族炭素環カルボニルである。）で示される基又は
式（Ｙ－３）：－Ｐ（＝Ｒ８）Ｈ（ＯＲ９）（式中、Ｒ８はＯ又はＳであり、Ｒ９は水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキルカルボニル、置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基又は置換若しくは非置換の芳香族炭素環カルボニルである。）で示される基である。）
で示される化合物又はその塩。
（２）Ａ及びＢが、それぞれ独立して
であり、
Ｘ１及びＸ２が、Ｏであり、
Ｙが、該式（Ｙ－１）で示される基である、（１）記載の化合物又はその塩。
（３）化合物が、以下に記載の式で示される、（１）又は（２）記載の化合物又はその塩。
（１）式（Ｉ）：
【化1】
（式中、
Ａ及びＢはそれぞれ独立して、
【化2】
であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４はそれぞれ独立して、Ｏ又はＳであり、
ｑはそれぞれ独立して、０～４の整数であり、
ｒ及びｓはそれぞれ独立して、０～３の整数であり、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、ハロゲン、ヒドロキシ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
ただし、ｑ個のＲ１、ｒ個のＲ２及びｓ個のＲ３は、同一でも異なっていてもよく、
ｍ、ｎ及びｐはそれぞれ独立して、０～５の整数であり、
Ｙは
式（Ｙ－１）：－Ｐ（ＯＲ４）（Ｎ（Ｒ５）２）（式中、Ｒ４は置換又は非置換のアルキルであり、Ｒ５はそれぞれ独立して、置換又は非置換のアルキルである。）で示される基、
式（Ｙ－２）：－Ｐ（＝Ｒ６）（ＯＲ７）２（式中、Ｒ６はＯ又はＳであり、Ｒ７はそれぞれ独立して、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキルカルボニル、置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基又は置換若しくは非置換の芳香族炭素環カルボニルである。）で示される基又は
式（Ｙ－３）：－Ｐ（＝Ｒ８）Ｈ（ＯＲ９）（式中、Ｒ８はＯ又はＳであり、Ｒ９は水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキルカルボニル、置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基又は置換若しくは非置換の芳香族炭素環カルボニルである。）で示される基である。）
で示される化合物又はその塩。
（２）Ａ及びＢが、それぞれ独立して
【化3】
であり、
Ｘ１及びＸ２が、Ｏであり、
Ｙが、該式（Ｙ－１）で示される基である、（１）記載の化合物又はその塩。
（３）化合物が、以下に記載の式で示される、（１）又は（２）記載の化合物又はその塩。
【化4】
【0010】
なお、上記（１）～（３）は下記（４）～（１０）のいずれかに記載の製造方法において、式（ＩＩ）で示される化合物として用いることが可能な有用中間体である。
【0011】
（４）式（ＩＩ）：
（式中、
Ｐｒｏ１、Ｐｒｏ２、Ｐｒｏ３及びＰｒｏ４はそれぞれ独立して、保護基であり、
Ｐｒｏ１及びＰｒｏ２又はＰｒｏ３及びＰｒｏ４は一緒になって保護基を形成していてもよく、
ｍ、ｎ及びｐはそれぞれ独立して、０～５の整数であり、
Ｙは、
式（Ｙ－１）：－Ｐ（ＯＲ４）（Ｎ（Ｒ５）２）（式中、Ｒ４は置換又は非置換のアルキルであり、Ｒ５はそれぞれ独立して、置換又は非置換のアルキルである。）で示される基、
式（Ｙ－２）：－Ｐ（＝Ｒ６）（ＯＲ７）２（式中、Ｒ６はＯ又はＳであり、Ｒ７はそれぞれ独立して、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキルカルボニル、置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基又は置換若しくは非置換の芳香族炭素環カルボニルである。）で示される基又は
式（Ｙ－３）：－Ｐ（＝Ｒ８）Ｈ（ＯＲ９）（式中、Ｒ８はＯ又はＳであり、Ｒ９は水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキルカルボニル、置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基又は置換若しくは非置換の芳香族炭素環カルボニルである。）で示される基である。）で示される化合物と、
式（ＩＩＩ）：
（式中、Ｓｕｐｐｏｒｔは固相担体を意味し、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅはオリゴヌクレオチドを意味し、３’はオリゴヌクレオチドの３’末端を意味し、５’はオリゴヌクレオチドの５’末端を意味する。Ｗは単結合又は式：
（式中、Ｚ１はＯ又はＳであり、
Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立してアルキル又はアルケニルであり、
式中の末端のアルキレンがオリゴヌクレオチドの３’末端の酸素に結合し、式中の末端の酸素原子が固相担体に結合する。）で示される基である。）で示されるオリゴヌクレオチドを反応させ、式（ＩＶ）：
（式中、
Ｚ２は
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－１）で示される基である場合はＯ又はＳであり、
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－２）で示される基である場合はＲ６であり、
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－３）で示される基である場合はＲ８であり、
Ｒ１２は
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－１）で示される基である場合はＯＲ４であり、
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－２）で示される基である場合はＯＲ７であり、
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－３）で示される基である場合はＯＲ９であり、
Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、３’、５’、Ｗ、Ｐｒｏ１、Ｐｒｏ２、Ｐｒｏ３、Ｐｒｏ４、ｍ、ｎ及びｐは前記と同意義である。）で示される化合物を得る工程、
切断試薬及び脱保護剤の存在下で、式（ＩＶ）で示される化合物中の保護基の脱保護及び固相担体からの切り出しを行い、式（Ｖ）：
（式中、各記号は前記と同意義であり、Ｗが上記式（ａ）～（ｄ）で示される基のいずれかである場合、式（ａ）～（ｄ）中の末端の酸素原子は水素原子に結合する）で示される化合物を得る工程、及び
式（Ｖ）で示される化合物に、
式（ＶＩ）：ＲＸ１－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ１（式中、ＲＸ１はアルキル又はアルケニルであり、Ｌ１はＯＨ又は脱離基である。）で示される化合物を反応させる工程を含む、
式（ＶＩＩ）：
（式中、各記号は前記と同意義である。）で示される化合物の製造方法。
【化5】
（式中、
Ｐｒｏ１、Ｐｒｏ２、Ｐｒｏ３及びＰｒｏ４はそれぞれ独立して、保護基であり、
Ｐｒｏ１及びＰｒｏ２又はＰｒｏ３及びＰｒｏ４は一緒になって保護基を形成していてもよく、
ｍ、ｎ及びｐはそれぞれ独立して、０～５の整数であり、
Ｙは、
式（Ｙ－１）：－Ｐ（ＯＲ４）（Ｎ（Ｒ５）２）（式中、Ｒ４は置換又は非置換のアルキルであり、Ｒ５はそれぞれ独立して、置換又は非置換のアルキルである。）で示される基、
式（Ｙ－２）：－Ｐ（＝Ｒ６）（ＯＲ７）２（式中、Ｒ６はＯ又はＳであり、Ｒ７はそれぞれ独立して、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキルカルボニル、置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基又は置換若しくは非置換の芳香族炭素環カルボニルである。）で示される基又は
式（Ｙ－３）：－Ｐ（＝Ｒ８）Ｈ（ＯＲ９）（式中、Ｒ８はＯ又はＳであり、Ｒ９は水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキルカルボニル、置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基又は置換若しくは非置換の芳香族炭素環カルボニルである。）で示される基である。）で示される化合物と、
式（ＩＩＩ）：
【化6】
（式中、Ｓｕｐｐｏｒｔは固相担体を意味し、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅはオリゴヌクレオチドを意味し、３’はオリゴヌクレオチドの３’末端を意味し、５’はオリゴヌクレオチドの５’末端を意味する。Ｗは単結合又は式：
【化7】
Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立してアルキル又はアルケニルであり、
式中の末端のアルキレンがオリゴヌクレオチドの３’末端の酸素に結合し、式中の末端の酸素原子が固相担体に結合する。）で示される基である。）で示されるオリゴヌクレオチドを反応させ、式（ＩＶ）：
【化8】
Ｚ２は
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－１）で示される基である場合はＯ又はＳであり、
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－２）で示される基である場合はＲ６であり、
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－３）で示される基である場合はＲ８であり、
Ｒ１２は
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－１）で示される基である場合はＯＲ４であり、
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－２）で示される基である場合はＯＲ７であり、
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－３）で示される基である場合はＯＲ９であり、
Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、３’、５’、Ｗ、Ｐｒｏ１、Ｐｒｏ２、Ｐｒｏ３、Ｐｒｏ４、ｍ、ｎ及びｐは前記と同意義である。）で示される化合物を得る工程、
切断試薬及び脱保護剤の存在下で、式（ＩＶ）で示される化合物中の保護基の脱保護及び固相担体からの切り出しを行い、式（Ｖ）：
【化9】
（式中、各記号は前記と同意義であり、Ｗが上記式（ａ）～（ｄ）で示される基のいずれかである場合、式（ａ）～（ｄ）中の末端の酸素原子は水素原子に結合する）で示される化合物を得る工程、及び
式（Ｖ）で示される化合物に、
式（ＶＩ）：ＲＸ１－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ１（式中、ＲＸ１はアルキル又はアルケニルであり、Ｌ１はＯＨ又は脱離基である。）で示される化合物を反応させる工程を含む、
式（ＶＩＩ）：
【化10】
（式中、各記号は前記と同意義である。）で示される化合物の製造方法。
【0012】
（５）式（ＩＩ）：
（式中、
Ｐｒｏ１、Ｐｒｏ２、Ｐｒｏ３及びＰｒｏ４はそれぞれ独立して、保護基であり、
Ｐｒｏ１及びＰｒｏ２又はＰｒｏ３及びＰｒｏ４は一緒になって保護基を形成していてもよく、
ｍ、ｎ及びｐはそれぞれ独立して、０～５の整数であり、
Ｙは、
式（Ｙ－１）：－Ｐ（ＯＲ４）（Ｎ（Ｒ５）２）（式中、Ｒ４は置換又は非置換のアルキルであり、Ｒ５はそれぞれ独立して、置換又は非置換のアルキルである。）で示される基、
式（Ｙ－２）：－Ｐ（＝Ｒ６）（ＯＲ７）２（式中、Ｒ６はＯ又はＳであり、Ｒ７はそれぞれ独立して、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキルカルボニル、置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基又は置換若しくは非置換の芳香族炭素環カルボニルである。）で示される基又は
式（Ｙ－３）：－Ｐ（＝Ｒ８）Ｈ（ＯＲ９）（式中、Ｒ８はＯ又はＳであり、Ｒ９は水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキルカルボニル、置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基又は置換若しくは非置換の芳香族炭素環カルボニルである。）で示される基である。）で示される化合物と、
式（ＩＩＩ）：
（式中、Ｓｕｐｐｏｒｔは固相担体を意味し、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅはオリゴヌクレオチドを意味し、３’はオリゴヌクレオチドの３’末端を意味し、５’はオリゴヌクレオチドの５’末端を意味する。Ｗは単結合又は式：
（式中、Ｚ１はＯ又はＳであり、
Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立してのアルキル又はアルケニルであり、
式中の末端のアルキレンがオリゴヌクレオチドの３’末端の酸素に結合し、式中の末端の酸素原子が固相担体に結合する。）で示される基である。）で示されるオリゴヌクレオチドを反応させ、式（ＩＶ）：
（式中、
Ｚ ２ は
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－１）で示される基である場合はＯ又はＳであり、
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－２）で示される基である場合はＲ６であり、
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－３）で示される基である場合はＲ８であり、
Ｒ１２は
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－１）で示される基である場合はＯＲ４であり、
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－２）で示される基である場合はＯＲ７であり、
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－３）で示される基である場合はＯＲ９であり、
Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、３’、５’、Ｗ、Ｐｒｏ１、Ｐｒｏ２、Ｐｒｏ３、Ｐｒｏ４、ｍ、ｎ及びｐは前記と同意義である。）で示される化合物を得る工程、
切断試薬及び脱保護剤の存在下で、式（ＩＶ）で示される化合物中の保護基の脱保護及び固相担体からの切り出しを行い、式（Ｖ）：
（式中、各記号は前記と同意義であり、Ｗが上記式（ａ）～（ｄ）で示される基のいずれかである場合、式（ａ）～（ｄ）中の末端の酸素原子は水素原子に結合する。）で示される化合物を得る工程、及び
式（Ｖ）で示される化合物に、
式（ＶＩ）：ＲＸ１－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ１（式中、ＲＸ１はアルキル又はアルケニルであり、Ｌ１はＯＨ又は脱離基である。）で示される化合物を反応させ、式（ＶＩＩＩ）：
（式中、各記号は前記と同意義である。）で示される化合物を得る工程、
式（ＶＩＩＩ）で示される化合物に、
式（ＩＸ）：ＲＸ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ２（式中、ＲＸ２はアルキル又はアルケニルであり、Ｌ２はＯＨ又は脱離基である。）で示される化合物を反応させる工程を含む、式（Ｘ）：
（式中、各記号は前記と同意義である。）で示される化合物の製造方法。
【化11】
（式中、
Ｐｒｏ１、Ｐｒｏ２、Ｐｒｏ３及びＰｒｏ４はそれぞれ独立して、保護基であり、
Ｐｒｏ１及びＰｒｏ２又はＰｒｏ３及びＰｒｏ４は一緒になって保護基を形成していてもよく、
ｍ、ｎ及びｐはそれぞれ独立して、０～５の整数であり、
Ｙは、
式（Ｙ－１）：－Ｐ（ＯＲ４）（Ｎ（Ｒ５）２）（式中、Ｒ４は置換又は非置換のアルキルであり、Ｒ５はそれぞれ独立して、置換又は非置換のアルキルである。）で示される基、
式（Ｙ－２）：－Ｐ（＝Ｒ６）（ＯＲ７）２（式中、Ｒ６はＯ又はＳであり、Ｒ７はそれぞれ独立して、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキルカルボニル、置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基又は置換若しくは非置換の芳香族炭素環カルボニルである。）で示される基又は
式（Ｙ－３）：－Ｐ（＝Ｒ８）Ｈ（ＯＲ９）（式中、Ｒ８はＯ又はＳであり、Ｒ９は水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキルカルボニル、置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基又は置換若しくは非置換の芳香族炭素環カルボニルである。）で示される基である。）で示される化合物と、
式（ＩＩＩ）：
【化12】
（式中、Ｓｕｐｐｏｒｔは固相担体を意味し、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅはオリゴヌクレオチドを意味し、３’はオリゴヌクレオチドの３’末端を意味し、５’はオリゴヌクレオチドの５’末端を意味する。Ｗは単結合又は式：
【化13】
Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立してのアルキル又はアルケニルであり、
式中の末端のアルキレンがオリゴヌクレオチドの３’末端の酸素に結合し、式中の末端の酸素原子が固相担体に結合する。）で示される基である。）で示されるオリゴヌクレオチドを反応させ、式（ＩＶ）：
【化14】
Ｚ ２ は
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－１）で示される基である場合はＯ又はＳであり、
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－２）で示される基である場合はＲ６であり、
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－３）で示される基である場合はＲ８であり、
Ｒ１２は
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－１）で示される基である場合はＯＲ４であり、
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－２）で示される基である場合はＯＲ７であり、
式（ＩＩ）のＹが式（Ｙ－３）で示される基である場合はＯＲ９であり、
Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、３’、５’、Ｗ、Ｐｒｏ１、Ｐｒｏ２、Ｐｒｏ３、Ｐｒｏ４、ｍ、ｎ及びｐは前記と同意義である。）で示される化合物を得る工程、
切断試薬及び脱保護剤の存在下で、式（ＩＶ）で示される化合物中の保護基の脱保護及び固相担体からの切り出しを行い、式（Ｖ）：
【化15】
（式中、各記号は前記と同意義であり、Ｗが上記式（ａ）～（ｄ）で示される基のいずれかである場合、式（ａ）～（ｄ）中の末端の酸素原子は水素原子に結合する。）で示される化合物を得る工程、及び
式（Ｖ）で示される化合物に、
式（ＶＩ）：ＲＸ１－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ１（式中、ＲＸ１はアルキル又はアルケニルであり、Ｌ１はＯＨ又は脱離基である。）で示される化合物を反応させ、式（ＶＩＩＩ）：
【化16】
（式中、各記号は前記と同意義である。）で示される化合物を得る工程、
式（ＶＩＩＩ）で示される化合物に、
式（ＩＸ）：ＲＸ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ２（式中、ＲＸ２はアルキル又はアルケニルであり、Ｌ２はＯＨ又は脱離基である。）で示される化合物を反応させる工程を含む、式（Ｘ）：
【化17】
（式中、各記号は前記と同意義である。）で示される化合物の製造方法。
【0013】
（６）ＲＸ１が、炭素数８～３０のアルキル又は炭素数８～３０のアルケニルであり、
ＲＸ２が、炭素数１～２９のアルキル又は炭素数２～２９のアルケニルであり、
当該炭素数が、ＲＸ１のアルキル又はアルケニルの炭素数より少ないことを特徴とする、（５）記載の製造方法。
（７）切断試薬及び脱保護剤が、ブチルアミン及び／又はベンジルアミンを含む、（４）～（６）のいずれかに記載の製造方法。
（８）化合物（Ｖ）を有機溶媒により洗浄する工程を含む、（４）～（７）のいずれかに記載の製造方法。
（９）（４）～（８）のいずれかに記載の製造方法により化合物（ＶＩＩ）又は（Ｘ）を得る工程及び
化合物（ＶＩＩ）又は（Ｘ）のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含むオリゴヌクレオチドをアニーリングして二本鎖を形成する工程を含む、
二本鎖オリゴヌクレオチドの製造方法。
ＲＸ２が、炭素数１～２９のアルキル又は炭素数２～２９のアルケニルであり、
当該炭素数が、ＲＸ１のアルキル又はアルケニルの炭素数より少ないことを特徴とする、（５）記載の製造方法。
（７）切断試薬及び脱保護剤が、ブチルアミン及び／又はベンジルアミンを含む、（４）～（６）のいずれかに記載の製造方法。
（８）化合物（Ｖ）を有機溶媒により洗浄する工程を含む、（４）～（７）のいずれかに記載の製造方法。
（９）（４）～（８）のいずれかに記載の製造方法により化合物（ＶＩＩ）又は（Ｘ）を得る工程及び
化合物（ＶＩＩ）又は（Ｘ）のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含むオリゴヌクレオチドをアニーリングして二本鎖を形成する工程を含む、
二本鎖オリゴヌクレオチドの製造方法。
【0014】
（１０）二本鎖オリゴヌクレオチドが、式：
で示される鎖（配列番号：１記載の塩基からなるオリゴヌクレオチド）及び以下から選択される一の式で示される鎖からなる二本鎖オリゴヌクレオチドである、（９）記載の製造方法。
式：
（５’末端に二分岐脂質を含む配列番号：２記載の塩基からなるオリゴヌクレオチド）
、式：
（５’末端に二分岐脂質を含む配列番号：３記載の塩基からなるオリゴヌクレオチド）
、式：
（５’末端に二分岐脂質を含む配列番号：４記載の塩基からなるオリゴヌクレオチド）
、式：
（５’末端に二分岐脂質を含む配列番号：５記載の塩基からなるオリゴヌクレオチド）
、式：
（５’末端に二分岐脂質を含む配列番号：２記載の塩基からなるオリゴヌクレオチド）
及び式：
（５’末端に二分岐脂質を含む配列番号：４記載の塩基からなるオリゴヌクレオチド）
【化18】
式：
【化19】
（５’末端に二分岐脂質を含む配列番号：２記載の塩基からなるオリゴヌクレオチド）
、式：
【化20】
（５’末端に二分岐脂質を含む配列番号：３記載の塩基からなるオリゴヌクレオチド）
、式：
【化21】
（５’末端に二分岐脂質を含む配列番号：４記載の塩基からなるオリゴヌクレオチド）
、式：
【化22】
（５’末端に二分岐脂質を含む配列番号：５記載の塩基からなるオリゴヌクレオチド）
、式：
【化23】
（５’末端に二分岐脂質を含む配列番号：２記載の塩基からなるオリゴヌクレオチド）
及び式：
【化24】
（５’末端に二分岐脂質を含む配列番号：４記載の塩基からなるオリゴヌクレオチド）
【0015】
（１１）式（ＩＩ）で示される化合物が、（１）記載の化合物である、（４）～（１０）のいずれかに記載の製造方法。
（１２）式（ＩＩ）で示される化合物が、（２）記載の化合物である、（１１）記載の製造方法。
（１３）式（ＩＩ）で示される化合物が、（３）記載の化合物である、（１１）記載の製造方法。
（１２）式（ＩＩ）で示される化合物が、（２）記載の化合物である、（１１）記載の製造方法。
（１３）式（ＩＩ）で示される化合物が、（３）記載の化合物である、（１１）記載の製造方法。
【0016】
（１４）式（ＩＶ）：
（式中、各記号は前記と同意義である。）で示される化合物。
【化25】
【0017】
（１５）式（ＸＩ）：
（式中、各記号は前記と同意義である。）で示される化合物。
【化26】
【0018】
（１６）式（Ｖ）：
（式中、各記号は前記と同意義である。）で示される化合物。
【化27】
（式中、各記号は前記と同意義である。）で示される化合物。
【0019】
（１７）式（ＶＩＩＩ）：
（式中、各記号は前記と同意義である。）で示される化合物。
【化28】
（式中、各記号は前記と同意義である。）で示される化合物。
【発明の効果】
【0020】
アシル脂質を導入予定の窒素原子に結合する二つの水素原子を保護基により置換した本発明のアミダイトを利用する本発明の二分岐脂質結合オリゴヌクレオチドの製造方法及びその条件は、副生成物の生成を抑え、確実に目的とする最終物を得るために有用である。つまり、本発明の製造方法は、医薬品等、高品質が要求される製品を合成する際、非常に有用である。
特に、式（Ｉ）で示される化合物又はその塩である中間体は結晶であり、品質コントロール（純度の分析、不純物量の制御及び管理等）が可能である。該中間体を用いて、二分岐脂質結合オリゴヌクレオチドの合成を効率的に行うことができる。
特に、式（Ｉ）で示される化合物又はその塩である中間体は結晶であり、品質コントロール（純度の分析、不純物量の制御及び管理等）が可能である。該中間体を用いて、二分岐脂質結合オリゴヌクレオチドの合成を効率的に行うことができる。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。
本発明においては、当該分野で公知の遺伝子操作方法の使用が可能である。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｆｏｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （２０１２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （２０１２）に記載された方法等が挙げられる。
本発明においては、当該分野で公知の遺伝子操作方法の使用が可能である。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｆｏｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （２０１２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （２０１２）に記載された方法等が挙げられる。
【0022】
以下に本明細書中で使用する各用語を説明する。なお、本明細書中、各用語は単独で使用されている場合も、又は他の用語と一緒になって使用されている場合も、同一の意義を有する。
【0023】
「ハロゲン」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子を包含する。特にフッ素原子及び塩素原子が好ましい。
【0024】
「アルキル」とは、炭素数１～１５、好ましくは炭素数１～１０、より好ましくは炭素数１～６、さらに好ましくは炭素数１～４の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｎ－へプチル、イソヘプチル、ｎ－オクチル、イソオクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル等が挙げられる。
「アルキル」の好ましい態様として、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル又はｎ－ペンチルが挙げられる。
なお、式（ＶＩ）中のＲＸ１及び式（ＩＸ）中のＲＸ２における「アルキル」は、炭素数１～５０、炭素数１～４０、炭素数１～３０、より好ましくは炭素数８～３０、さらに好ましくは炭素数１２～３０の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。
「アルキル」の好ましい態様として、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル又はｎ－ペンチルが挙げられる。
なお、式（ＶＩ）中のＲＸ１及び式（ＩＸ）中のＲＸ２における「アルキル」は、炭素数１～５０、炭素数１～４０、炭素数１～３０、より好ましくは炭素数８～３０、さらに好ましくは炭素数１２～３０の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。
【0025】
「アルケニル」とは、任意の位置に１以上の二重結合を有する、炭素数２～１５、好ましくは炭素数２～１０、より好ましくは炭素数２～６、さらに好ましくは炭素数２～４の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。例えば、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、プレニル、ブタジエニル、ペンテニル、イソペンテニル、ペンタジエニル、ヘキセニル、イソヘキセニル、ヘキサジエニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル等が挙げられる。
「アルケニル」の好ましい態様として、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル又はブテニルが挙げられる。
なお、式（ＶＩ）中のＲＸ１及び式（ＩＸ）中のＲＸ２における「アルケニル」は、任意の位置に１以上の二重結合を有する、炭素数２～５０、炭素数２～４０、炭素数２～３０、より好ましくは炭素数８～３０、さらに好ましくは１２～３０の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。
「アルケニル」の好ましい態様として、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル又はブテニルが挙げられる。
なお、式（ＶＩ）中のＲＸ１及び式（ＩＸ）中のＲＸ２における「アルケニル」は、任意の位置に１以上の二重結合を有する、炭素数２～５０、炭素数２～４０、炭素数２～３０、より好ましくは炭素数８～３０、さらに好ましくは１２～３０の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。
【0026】
「アルキニル」とは、任意の位置に１以上の三重結合を有する、炭素数２～１０、好ましくは炭素数２～８、さらに好ましくは炭素数２～６、さらに好ましくは炭素数２～４の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。さらに任意の位置に二重結合を有していてもよい。例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニル等を包含する。
「アルキニル」の好ましい態様として、エチニル、プロピニル、ブチニル又はペンチニルが挙げられる。
「アルキニル」の好ましい態様として、エチニル、プロピニル、ブチニル又はペンチニルが挙げられる。
【0027】
「芳香族炭素環式基」とは、単環又は２環以上の、環状芳香族炭化水素基を意味する。例えば、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル等が挙げられる。
「芳香族炭素環式基」の好ましい態様として、フェニルが挙げられる。
「芳香族炭素環式基」の好ましい態様として、フェニルが挙げられる。
【0028】
「置換アルキル」、「置換アルケニル」及び「置換アルキニル」の置換基としては、次の置換基が挙げられる。任意の位置の炭素原子が次の置換基から選択される１以上の基と結合していてもよい。
置換基：ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシイミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、モノアルキルカルボニルアミノ、ジアルキルカルボニルアミノ、モノアルキルスルホニルアミノ、ジアルキルスルホニルアミノ、アルキルイミノ、アルケニルイミノ、アルキニルイミノ、アルキルカルボニルイミノ、アルケニルカルボニルイミノ、アルキニルカルボニルイミノ、アルキルオキシイミノ、アルケニルオキシイミノ、アルキニルオキシイミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アルキルスルファニル、アルケニルスルファニル、アルキニルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環オキシ、非芳香族炭素環オキシ、芳香族複素環オキシ、非芳香族複素環オキシ、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル、非芳香族複素環カルボニル、芳香族炭素環オキシカルボニル、非芳香族炭素環オキシカルボニル、芳香族複素環オキシカルボニル、非芳香族複素環オキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルオキシ、非芳香族炭素環アルキルオキシ、芳香族複素環アルキルオキシ、非芳香族複素環アルキルオキシ、芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルアミノ、非芳香族炭素環アルキルアミノ、芳香族複素環アルキルアミノ、非芳香族複素環アルキルアミノ、芳香族炭素環スルファニル、非芳香族炭素環スルファニル、芳香族複素環スルファニル、非芳香族複素環スルファニル、非芳香族炭素環スルホニル、芳香族炭素環スルホニル、芳香族複素環スルホニル及び非芳香族複素環スルホニル。
置換基：ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシイミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、モノアルキルカルボニルアミノ、ジアルキルカルボニルアミノ、モノアルキルスルホニルアミノ、ジアルキルスルホニルアミノ、アルキルイミノ、アルケニルイミノ、アルキニルイミノ、アルキルカルボニルイミノ、アルケニルカルボニルイミノ、アルキニルカルボニルイミノ、アルキルオキシイミノ、アルケニルオキシイミノ、アルキニルオキシイミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アルキルスルファニル、アルケニルスルファニル、アルキニルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環オキシ、非芳香族炭素環オキシ、芳香族複素環オキシ、非芳香族複素環オキシ、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル、非芳香族複素環カルボニル、芳香族炭素環オキシカルボニル、非芳香族炭素環オキシカルボニル、芳香族複素環オキシカルボニル、非芳香族複素環オキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルオキシ、非芳香族炭素環アルキルオキシ、芳香族複素環アルキルオキシ、非芳香族複素環アルキルオキシ、芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルアミノ、非芳香族炭素環アルキルアミノ、芳香族複素環アルキルアミノ、非芳香族複素環アルキルアミノ、芳香族炭素環スルファニル、非芳香族炭素環スルファニル、芳香族複素環スルファニル、非芳香族複素環スルファニル、非芳香族炭素環スルホニル、芳香族炭素環スルホニル、芳香族複素環スルホニル及び非芳香族複素環スルホニル。
【0029】
「置換芳香族炭素環」、「置換非芳香族炭素環」、「置換芳香族複素環」及び「置換非芳香族複素環」の環上の置換基としては、次の置換基が挙げられる。環上の任意の位置の原子が次の置換基から選択される１以上の基と結合していてもよい。
置換基：ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシイミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルキルオキシ、アルキルオキシアルキル、アルキルオキシアルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、モノアルキルカルボニルアミノ、ジアルキルカルボニルアミノ、モノアルキルスルホニルアミノ、ジアルキルスルホニルアミノ、アルキルイミノ、アルケニルイミノ、アルキニルイミノ、アルキルカルボニルイミノ、アルケニルカルボニルイミノ、アルキニルカルボニルイミノ、アルキルオキシイミノ、アルケニルオキシイミノ、アルキニルオキシイミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アルキルスルファニル、アルケニルスルファニル、アルキニルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環オキシ、非芳香族炭素環オキシ、芳香族複素環オキシ、非芳香族複素環オキシ、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル、非芳香族複素環カルボニル、芳香族炭素環オキシカルボニル、非芳香族炭素環オキシカルボニル、芳香族複素環オキシカルボニル、非芳香族複素環オキシカルボニル、芳香族炭素環アルキル、非芳香族炭素環アルキル、芳香族複素環アルキル、非芳香族複素環アルキル、芳香族炭素環アルキルオキシ、非芳香族炭素環アルキルオキシ、芳香族複素環アルキルオキシ、非芳香族複素環アルキルオキシ、芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルオキシアルキル、非芳香族炭素環アルキルオキシアルキル、芳香族複素環アルキルオキシアルキル、非芳香族複素環アルキルオキシアルキル、芳香族炭素環アルキルアミノ、非芳香族炭素環アルキルアミノ、芳香族複素環アルキルアミノ、非芳香族複素環アルキルアミノ、芳香族炭素環スルファニル、非芳香族炭素環スルファニル、芳香族複素環スルファニル、非芳香族複素環スルファニル、非芳香族炭素環スルホニル、芳香族炭素環スルホニル、芳香族複素環スルホニル及び非芳香族複素環スルホニル。
置換基：ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシイミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルキルオキシ、アルキルオキシアルキル、アルキルオキシアルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、モノアルキルカルボニルアミノ、ジアルキルカルボニルアミノ、モノアルキルスルホニルアミノ、ジアルキルスルホニルアミノ、アルキルイミノ、アルケニルイミノ、アルキニルイミノ、アルキルカルボニルイミノ、アルケニルカルボニルイミノ、アルキニルカルボニルイミノ、アルキルオキシイミノ、アルケニルオキシイミノ、アルキニルオキシイミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アルキルスルファニル、アルケニルスルファニル、アルキニルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環オキシ、非芳香族炭素環オキシ、芳香族複素環オキシ、非芳香族複素環オキシ、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル、非芳香族複素環カルボニル、芳香族炭素環オキシカルボニル、非芳香族炭素環オキシカルボニル、芳香族複素環オキシカルボニル、非芳香族複素環オキシカルボニル、芳香族炭素環アルキル、非芳香族炭素環アルキル、芳香族複素環アルキル、非芳香族複素環アルキル、芳香族炭素環アルキルオキシ、非芳香族炭素環アルキルオキシ、芳香族複素環アルキルオキシ、非芳香族複素環アルキルオキシ、芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルオキシアルキル、非芳香族炭素環アルキルオキシアルキル、芳香族複素環アルキルオキシアルキル、非芳香族複素環アルキルオキシアルキル、芳香族炭素環アルキルアミノ、非芳香族炭素環アルキルアミノ、芳香族複素環アルキルアミノ、非芳香族複素環アルキルアミノ、芳香族炭素環スルファニル、非芳香族炭素環スルファニル、芳香族複素環スルファニル、非芳香族複素環スルファニル、非芳香族炭素環スルホニル、芳香族炭素環スルホニル、芳香族複素環スルホニル及び非芳香族複素環スルホニル。
【0030】
本発明の二分岐脂質結合オリゴヌクレオチドの製造方法としては、上記（４）～（１３）に記載の方法が挙げられる。
【0031】
上記（４）に記載の本発明の製造方法を以下に示す。
（式中、各記号は前記と同意義である。）
【化29】
（式中、各記号は前記と同意義である。）
【0032】
上記（５）に記載の本発明の製造方法に関し、式（Ｖ）で示される化合物から後の工程を以下に示す。式（Ｖ）で示される化合物を得る工程までは、上記（４）の場合と同様である。
（式中、各記号は前記と同意義である）
【化30】
（式中、各記号は前記と同意義である）
【0033】
１．オリゴヌクレオチドの合成
式（ＩＩ）で示される化合物又はその塩と式（ＩＩＩ）で示されるオリゴヌクレオチドを反応させ、式（ＩＶ）で示される化合物を得る。合成法として、ホスホロアミダイトを用いた固相合成法を用いることができる。例えば、下記実施例、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２，１８５９－１８６２ （１９８１）等に開示されている。具体的には、市販の核酸自動合成装置（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（Ｃｙｔｉｖａ社）製、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、（株）大日本精機製等）によってまず、式（ＩＩＩ）で示される化合物を合成し、最終サイクルにおいて、式（ＩＩ）で示される化合物又はその塩を導入することにより、式（ＩＶ）で示される化合物を容易に合成することができる。
式（ＩＩ）で示される化合物又はその塩と式（ＩＩＩ）で示されるオリゴヌクレオチドを反応させ、式（ＩＶ）で示される化合物を得る。合成法として、ホスホロアミダイトを用いた固相合成法を用いることができる。例えば、下記実施例、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２，１８５９－１８６２ （１９８１）等に開示されている。具体的には、市販の核酸自動合成装置（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（Ｃｙｔｉｖａ社）製、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、（株）大日本精機製等）によってまず、式（ＩＩＩ）で示される化合物を合成し、最終サイクルにおいて、式（ＩＩ）で示される化合物又はその塩を導入することにより、式（ＩＶ）で示される化合物を容易に合成することができる。
【0034】
「固相担体」とは、オリゴヌクレオチドの固相合成に使用される、オリゴヌクレオチドを担持可能で反応溶媒に不溶な固体の支持体である。当分野で一般に使用されている市販品は本発明の製造方法において、固相担体として使用することができ、また、必要に応じてこれら市販品の担体表面に存在する官能基に適当な修飾を加えることもできる。
式（ＩＩ）で示される化合物又はその塩は、本明細書に記載の化合物（ａ）に、各保護基（Ｐｒｏ１、Ｐｒｏ２、Ｐｒｏ３及びＰｒｏ４）を導入することにより、製造することができる。
式（ＩＩ）で示される化合物又はその塩は、本明細書に記載の化合物（ａ）に、各保護基（Ｐｒｏ１、Ｐｒｏ２、Ｐｒｏ３及びＰｒｏ４）を導入することにより、製造することができる。
【0035】
「オリゴヌクレオチド」とは、同一又は異なるヌクレオシドが複数個結合したヌクレオチドを意味する。
本発明における「オリゴヌクレオチド」の配列や修飾は特に限定されない。ＤＮＡ、ＲＮＡ又は核酸塩基、糖若しくはヌクレオシド間結合に当該分野で公知の修飾を有するヌクレオチドを含む核酸等を使用することができる。また、オリゴヌクレオチドの鎖長は特に限定されないが、例えば、８～５０塩基、８～４０塩基、８～３０塩基、１０～２５塩基又は１５～２５塩基である。
本発明における「オリゴヌクレオチド」の配列や修飾は特に限定されない。ＤＮＡ、ＲＮＡ又は核酸塩基、糖若しくはヌクレオシド間結合に当該分野で公知の修飾を有するヌクレオチドを含む核酸等を使用することができる。また、オリゴヌクレオチドの鎖長は特に限定されないが、例えば、８～５０塩基、８～４０塩基、８～３０塩基、１０～２５塩基又は１５～２５塩基である。
【0036】
本明細書において式（ＩＩＩ）～（Ｖ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（Ｘ）及び（ＸＩ）中の「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」の左に結合しているＯはオリゴヌクレオチド配列の３’末端の酸素原子を意味し、右に結合しているＯはオリゴヌクレオチド配列の５’末端の酸素原子を意味する。
該「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」としては、二分岐脂質を結合する必要があるオリゴヌクレオチドであれば、特に限定されない。例えば、特許文献１記載のＣｐＧオリゴヌクレオチド、特許文献２及び３に記載の「ＣｐＧオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含むオリゴヌクレオチド」、特許文献４記載の「標的遺伝子の発現抑制活性を有するオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等二本鎖オリゴヌクレオチドのうちの一本鎖、アンチセンスオリゴヌクレオチド等）」が挙げられる。二分岐脂質を結合させることにより、該脂質が結合したオリゴヌクレオチド又は該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含むオリゴヌクレオチドの医薬としての活性（アジュバントの場合の免疫賦活活性、核酸医薬の場合の標的遺伝子の発現抑制活性等）を向上させることができる。
該「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」としては、二分岐脂質を結合する必要があるオリゴヌクレオチドであれば、特に限定されない。例えば、特許文献１記載のＣｐＧオリゴヌクレオチド、特許文献２及び３に記載の「ＣｐＧオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含むオリゴヌクレオチド」、特許文献４記載の「標的遺伝子の発現抑制活性を有するオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等二本鎖オリゴヌクレオチドのうちの一本鎖、アンチセンスオリゴヌクレオチド等）」が挙げられる。二分岐脂質を結合させることにより、該脂質が結合したオリゴヌクレオチド又は該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含むオリゴヌクレオチドの医薬としての活性（アジュバントの場合の免疫賦活活性、核酸医薬の場合の標的遺伝子の発現抑制活性等）を向上させることができる。
【0037】
なお、本明細書において、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）及び（ＸＩ）中の「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」中のアデニン、グアニン又はシトシン中のアミノ部分及びリン酸中のヒドロキシ部分は、副反応防止のため、保護基で保護されている。保護基としては、当該分野で通常用いられる保護基を利用することができる。例えば、アミノの保護基としては、ピバロイル、ピバロイロキシメチル、トリフルオロアセチル、フェノキシアセチル、４－イソプロピルフェノキシアセチル、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル、アセチル、ベンゾイル、イソブチリル、ジメチルアミノメチレン９－フルオレニルメチルオキシカルボニル等が挙げられる。好ましくは、フェノキシアセチル、４－イソプロピルフェノキシアセチル、アセチル、ベンゾイル、イソブチリル又はジメチルホルムアミジニル基である。アデニンのアミノ部分の保護基としては、特にベンゾイル基が好ましい。グアニンのアミノ部分の保護基としては、特にジメチルアミノメチレン基又はイソブチリル基が好ましい。シトシンのアミノ部分の保護基としては、ベンゾイル基又はアセチル基が好ましく、特にアセチル基が好ましい。リン酸のヒドロキシ基の保護基としては２－シアノエチル等が挙げられる。
【0038】
Ｐｒｏ１、Ｐｒｏ２、Ｐｒｏ３及びＰｒｏ４の「保護基」としては、核酸合成の際に安定してアミノを保護し得るものであれば、特に限定されない。具体的には、酸性又は中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解及び光分解のような化学的方法により開裂し得る保護基をいい、例えば、ホルミル、置換又は非置換のアルキルカルボニル、置換又は非置換の芳香族炭素環カルボニル、置換又は非置換のアルコキシカルボニル、置換又は非置換のアルケニルオキシカルボニル等が挙げられる。
【0039】
「Ｐｒｏ１及びＰｒｏ２又はＰｒｏ３及びＰｒｏ４は一緒になって保護基を形成する」とは、Ｐｒｏ１及びＰｒｏ２又はＰｒｏ３及びＰｒｏ４が一緒になって含窒素環を含む保護基を形成することを意味する。当該保護基は特に限定されないが、例えば、
（式中、各記号は前記と同意義である）で示される基が挙げられる。
【化31】
（式中、各記号は前記と同意義である）で示される基が挙げられる。
【0040】
式（ＩＩ）で示される化合物としては、以下の態様が好ましい。
ｍとしては、０～５の整数のうち、０～２が好ましく、特に１が好ましい。
ｎとしては、０～５の整数のうち、１又は２が好ましく、特に１が好ましい。
ｐとしては、０～５の整数のうち、０又は１が好ましく、特に０が好ましい。
Ｙとしては、式（Ｙ－１）で示される基、式（Ｙ－２）で示される基又は式（Ｙ－３）で示される基が挙げられる。
Ｒ４は好ましくはアルキル又はシアノアルキルである。Ｒ５は好ましくはアルキルである。
式（Ｙ－１）として、例えば、式：－Ｐ（ＯＣ２Ｈ４ＣＮ）（Ｎ（ｉ－Ｐｒ）２）で示される基（式中、ｉ－Ｐｒはイソプロピルを意味する。）が挙げられる。
Ｒ６は好ましくはＯであり、Ｒ７は好ましくは水素原子である。
式（Ｙ－２）として、例えば、式：－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２で示される基が挙げられる。
Ｒ８は好ましくはＯであり、Ｒ９は好ましくは水素原子である。
式（Ｙ－３）として、例えば、式：－Ｐ（＝Ｏ）Ｈ（ＯＨ）で示される基で示される基が挙げられる。
ｍとしては、０～５の整数のうち、０～２が好ましく、特に１が好ましい。
ｎとしては、０～５の整数のうち、１又は２が好ましく、特に１が好ましい。
ｐとしては、０～５の整数のうち、０又は１が好ましく、特に０が好ましい。
Ｙとしては、式（Ｙ－１）で示される基、式（Ｙ－２）で示される基又は式（Ｙ－３）で示される基が挙げられる。
Ｒ４は好ましくはアルキル又はシアノアルキルである。Ｒ５は好ましくはアルキルである。
式（Ｙ－１）として、例えば、式：－Ｐ（ＯＣ２Ｈ４ＣＮ）（Ｎ（ｉ－Ｐｒ）２）で示される基（式中、ｉ－Ｐｒはイソプロピルを意味する。）が挙げられる。
Ｒ６は好ましくはＯであり、Ｒ７は好ましくは水素原子である。
式（Ｙ－２）として、例えば、式：－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２で示される基が挙げられる。
Ｒ８は好ましくはＯであり、Ｒ９は好ましくは水素原子である。
式（Ｙ－３）として、例えば、式：－Ｐ（＝Ｏ）Ｈ（ＯＨ）で示される基で示される基が挙げられる。
【0041】
式（ＩＩ）で示される化合物として、特に好ましくは、式（Ｉ）で示される化合物及びその塩である。さらに好ましくは、上記（２）又は（３）に記載の化合物又はその塩が挙げられる。
【0042】
式（Ｉ）で示される化合物としては、以下の態様が好ましい。
Ａ及びＢとしては、それぞれ独立して
である場合が好ましい。
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、好ましくはＯである。
Ｙとしては、式（Ｙ－１）で示される基が好ましい。
式（Ｉ）で示される化合物として、特に好ましくは、以下に記載の式で示される化合物又はその塩である。
Ａ及びＢとしては、それぞれ独立して
【化32】
である場合が好ましい。
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、好ましくはＯである。
Ｙとしては、式（Ｙ－１）で示される基が好ましい。
式（Ｉ）で示される化合物として、特に好ましくは、以下に記載の式で示される化合物又はその塩である。
【化33】
【0043】
本発明の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の一つ以上の水素、炭素又は他の原子は、水素、炭素又は他の原子の同位体で置換され得る。
例えば、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物は、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物のすべての放射性標識体を包含する。式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物のそのような「放射性標識化」、「放射性標識体」等は、それぞれが本発明に包含され、代謝薬物動態研究ならびに結合アッセイにおける研究及び／又は診断ツールとして有用である。本発明の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物に組み込まれ得る同位体の例としては、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、及び３６Ｃｌのように、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、及び塩素が包含される。本発明の放射性標識化合物は、当該技術分野で周知の方法で調製できる。例えば、式（Ｉ）又は（ＩＩ）のトリチウム標識化合物は、例えば、トリチウムを用いた触媒的脱ハロゲン化反応によって、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の特定の化合物にトリチウムを導入することで調製できる。この方法は、適切な触媒、例えばＰｄ／Ｃの存在下、塩基の存在又は非存在下で、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物が適切にハロゲン置換された前駆体とトリチウムガスとを反応させることを包含してもよい。他のトリチウム標識化合物を調製するための適切な方法としては、文書Ｉｓｏｔｏｐｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｖｏｌ． １， Ｌａｂｅｌｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ （Ｐａｒｔ Ａ）， Ｃｈａｐｔｅｒ ６ （１９８７年）を参照にできる。１４Ｃ－標識化合物は、１４Ｃ炭素を有する原料を用いることによって調製できる。
例えば、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物は、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物のすべての放射性標識体を包含する。式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物のそのような「放射性標識化」、「放射性標識体」等は、それぞれが本発明に包含され、代謝薬物動態研究ならびに結合アッセイにおける研究及び／又は診断ツールとして有用である。本発明の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物に組み込まれ得る同位体の例としては、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、及び３６Ｃｌのように、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、及び塩素が包含される。本発明の放射性標識化合物は、当該技術分野で周知の方法で調製できる。例えば、式（Ｉ）又は（ＩＩ）のトリチウム標識化合物は、例えば、トリチウムを用いた触媒的脱ハロゲン化反応によって、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の特定の化合物にトリチウムを導入することで調製できる。この方法は、適切な触媒、例えばＰｄ／Ｃの存在下、塩基の存在又は非存在下で、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物が適切にハロゲン置換された前駆体とトリチウムガスとを反応させることを包含してもよい。他のトリチウム標識化合物を調製するための適切な方法としては、文書Ｉｓｏｔｏｐｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｖｏｌ． １， Ｌａｂｅｌｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ （Ｐａｒｔ Ａ）， Ｃｈａｐｔｅｒ ６ （１９８７年）を参照にできる。１４Ｃ－標識化合物は、１４Ｃ炭素を有する原料を用いることによって調製できる。
【0044】
式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の塩としては、以下の塩が挙げられる。
塩基性塩として、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ブロカイン塩、メグルミン塩、ジエタノールアミン塩又はエチレンジアミン塩等の脂肪族アミン塩；Ｎ，Ｎ－ジベンジルエチレンジアミン、ベネタミン塩等のアラルキルアミン塩；ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等のヘテロ環芳香族アミン塩；テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩；アルギニン塩、リジン塩等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。
酸性塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；安息香酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩；メタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸等が挙げられる。本明細書中の酸付加塩は、上記酸性塩を含む。
塩基性塩として、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ブロカイン塩、メグルミン塩、ジエタノールアミン塩又はエチレンジアミン塩等の脂肪族アミン塩；Ｎ，Ｎ－ジベンジルエチレンジアミン、ベネタミン塩等のアラルキルアミン塩；ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等のヘテロ環芳香族アミン塩；テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩；アルギニン塩、リジン塩等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。
酸性塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；安息香酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩；メタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸等が挙げられる。本明細書中の酸付加塩は、上記酸性塩を含む。
【0045】
式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物又はその塩は、溶媒和物及び／又は結晶多形を形成する場合があり、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物はそのような各種の溶媒和物及び結晶多形も包含する。溶媒和物とは、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物又はその塩の溶媒和物を意味し、例えば、アルコール（例：エタノール）和物、水和物、トルエン和物等が挙げられる。水和物としては、一水和物、二水和物等を挙げることができる。「溶媒和物」は、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物に対し、任意の数の溶媒分子（例えば、水分子等）と配位していてもよい。式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物又はその塩を、大気中に放置することにより、水分を吸収し、吸着水が付着する場合や、水和物を形成する場合がある。また、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物又はその塩を、再結晶することでそれらの結晶多形を形成する場合がある。
【0046】
本発明の式（Ｉ）で示される化合物の一般的製造法を以下に例示する。抽出、精製等は、通常の有機化学の実験で行う処理を行えばよい。
式（Ｉ）で示される化合物中、ＡとＢが同一である場合の製造方法の一例を以下に示す。
（式中、各記号は式（Ｉ）と同意義である。）
式（Ｉ）で示される化合物中、ＡとＢが同一である場合の製造方法の一例を以下に示す。
【化34】
（式中、各記号は式（Ｉ）と同意義である。）
【0047】
工程１－１
化合物（ｂ）にアセトニトリルを加えて攪拌する。トリエチルアミンを加えた後、化合物（ａ）をアセトニトリルに溶解した溶液及びアセトニトリルを加える。激しく撹拌し、固体をろ取する。得られる固体をアセトニトリルで洗浄後、乾燥し、化合物（ｃ）を得る。
化合物（ｂ）にアセトニトリルを加えて攪拌する。トリエチルアミンを加えた後、化合物（ａ）をアセトニトリルに溶解した溶液及びアセトニトリルを加える。激しく撹拌し、固体をろ取する。得られる固体をアセトニトリルで洗浄後、乾燥し、化合物（ｃ）を得る。
【0048】
工程２－１
Ｎ－メチルピロリドンに工程１－１で得られる化合物（ｃ）及びＮ－メチルピロリドンを加えて攪拌する。Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを加えた後、化合物（ｄ）及びＮ－メチルピロリドンを加える。室温で攪拌し、水道水を加えて、さらに攪拌する。水道水を加えた後、攪拌する。その後、水道水をさらに加え、攪拌し、固体をろ取する。得られる固体を２－プロパノールで洗浄後、乾燥し、化合物（Ｉ－１）を得る。
Ｎ－メチルピロリドンに工程１－１で得られる化合物（ｃ）及びＮ－メチルピロリドンを加えて攪拌する。Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを加えた後、化合物（ｄ）及びＮ－メチルピロリドンを加える。室温で攪拌し、水道水を加えて、さらに攪拌する。水道水を加えた後、攪拌する。その後、水道水をさらに加え、攪拌し、固体をろ取する。得られる固体を２－プロパノールで洗浄後、乾燥し、化合物（Ｉ－１）を得る。
【0049】
式（Ｉ）で示される化合物中、ＡとＢが異なる場合の製造方法の一例を以下に示す。
（式中、Ｒ１－１及びＲ１－２は式（Ｉ）のＲ１と同意義、Ｘ１－１及びＸ１－２は式（Ｉ）のＸ１と同意義、Ｘ２－１及びＸ２－２は式（Ｉ）のＸ２と同意義、ｑ－１及びｑ－２は式（Ｉ）のｑと同意義、その他各記号は式（Ｉ）と同意義である。）
【化35】
【0050】
工程１－２
上記工程１－１において、加える化合物（ｂ）の量を減らすことにより、化合物（ｅ）を得る。次に、化合物（ｅ）に化合物（ｆ）を加え、化合物（ｇ）を得る。
工程２－２
得られる化合物（ｇ）を用いて上記工程２－１と同様の方法で、化合物（Ｉ－２）を得る。
化合物（ｂ）や（ｆ）の代わりに、式：
で示される化合物を用いることができる。
上記工程１－１において、加える化合物（ｂ）の量を減らすことにより、化合物（ｅ）を得る。次に、化合物（ｅ）に化合物（ｆ）を加え、化合物（ｇ）を得る。
工程２－２
得られる化合物（ｇ）を用いて上記工程２－１と同様の方法で、化合物（Ｉ－２）を得る。
化合物（ｂ）や（ｆ）の代わりに、式：
【化36】
で示される化合物を用いることができる。
【0051】
２．樹脂からの切り出し、塩基及びリン酸の脱保護
切断試薬及び脱保護剤の存在下で、式（ＩＶ）で示される化合物中の保護基（オリゴヌクレオチド中の塩基及びリン酸の保護基も含む）を脱保護し、かつ、固相担体からの切り出しを行い、式（Ｖ）で示される化合物を得る。
切断試薬及び脱保護剤の存在下で、式（ＩＶ）で示される化合物中の保護基（オリゴヌクレオチド中の塩基及びリン酸の保護基も含む）を脱保護し、かつ、固相担体からの切り出しを行い、式（Ｖ）で示される化合物を得る。
【0052】
脱保護及び固相担体からの切り出しの工程は、同時に実施することもでき、同じ試薬を用いて又は２種以上の試薬を使用して実施され得る。また、異なった温度において、かつ、異なった試薬を使用して実施され得る。
「切断試薬及び脱保護剤」は、オリゴヌクレオチドを固相担体から切り出し及び／又は保護基を脱保護する作用を有する試薬であれば、当該分野で通常用いられる試薬を利用することができる。例えば、アンモニア、アミン類等が挙げられる。好ましくはブチルアミン及び／又はベンジルアミンを含む。特に好ましくはｎ－ブチルアミン又はベンジルアミンを含む。さらに、オリゴヌクレオチドの配列中にシトシンを有する場合は、シトシンのアミノ基がアセチル基で保護されたアミダイトを使用してオリゴヌクレオチドを合成した上で、ｎ－ブチルアミン又はベンジルアミンを含む切断試薬及び脱保護剤を用いることが好ましい。
なお、まず、ジエチルアミンを使用して式（ＩＶ）で示される化合物中のＲ１２に含まれる保護基を除去し、その後、式（ＩＶ）で示される化合物中のその他の保護基の脱保護及び固相担体からの切り出しを行うこともできる。
「切断試薬及び脱保護剤」は、オリゴヌクレオチドを固相担体から切り出し及び／又は保護基を脱保護する作用を有する試薬であれば、当該分野で通常用いられる試薬を利用することができる。例えば、アンモニア、アミン類等が挙げられる。好ましくはブチルアミン及び／又はベンジルアミンを含む。特に好ましくはｎ－ブチルアミン又はベンジルアミンを含む。さらに、オリゴヌクレオチドの配列中にシトシンを有する場合は、シトシンのアミノ基がアセチル基で保護されたアミダイトを使用してオリゴヌクレオチドを合成した上で、ｎ－ブチルアミン又はベンジルアミンを含む切断試薬及び脱保護剤を用いることが好ましい。
なお、まず、ジエチルアミンを使用して式（ＩＶ）で示される化合物中のＲ１２に含まれる保護基を除去し、その後、式（ＩＶ）で示される化合物中のその他の保護基の脱保護及び固相担体からの切り出しを行うこともできる。
【0053】
３．脂質の導入（アシル化反応）
式（Ｖ）で示される化合物に、式（ＶＩ）で示される化合物を反応させることにより、式（ＶＩＩ）で示される化合物を得る。
また、式（Ｖ）で示される化合物に、式（ＶＩ）で示される化合物を反応させることにより、式（ＶＩＩＩ）で示される化合物を得、式（ＩＸ）で示される化合物を反応させることにより、式（Ｘ）で示される化合物を得る。
式（Ｖ）で示される化合物に、式（ＶＩ）で示される化合物を反応させることにより、式（ＶＩＩ）で示される化合物を得る。
また、式（Ｖ）で示される化合物に、式（ＶＩ）で示される化合物を反応させることにより、式（ＶＩＩＩ）で示される化合物を得、式（ＩＸ）で示される化合物を反応させることにより、式（Ｘ）で示される化合物を得る。
【0054】
上記脂質の導入の工程において、式（Ｖ）で示される化合物に、式（ＶＩ）で示される化合物を反応させる前に、化合物（Ｖ）を有機溶媒により洗浄することが好ましい。
「有機溶媒」としては、ヘキサン、ヘプタン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、シクロプロピルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、アニソール、トルエン、メチルイソブチルケトン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ－ブチル、ｎ－ブタノール、ジクロロメタン、クロロホルム等が挙げられる。特に好ましくは、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルである。
「有機溶媒」としては、ヘキサン、ヘプタン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、シクロプロピルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、アニソール、トルエン、メチルイソブチルケトン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ－ブチル、ｎ－ブタノール、ジクロロメタン、クロロホルム等が挙げられる。特に好ましくは、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルである。
【0055】
ＲＸ１は、アルキル又はアルケニルであり、好ましくは、炭素数８～３０のアルキル又は炭素数８～３０のアルケニルである。
ＲＸ２は、アルキル又はアルケニルであり、好ましくは、炭素数１～２９のアルキル又は炭素数２～２９のアルケニルである。さらに、ＲＸ２のアルキル又はアルケニルの炭素数が、ＲＸ１のアルキル又はアルケニルの炭素数より少ないことが好ましい。
ＲＸ２は、アルキル又はアルケニルであり、好ましくは、炭素数１～２９のアルキル又は炭素数２～２９のアルケニルである。さらに、ＲＸ２のアルキル又はアルケニルの炭素数が、ＲＸ１のアルキル又はアルケニルの炭素数より少ないことが好ましい。
【0056】
Ｌ１及びＬ２の「脱離基」としては、カルボン酸とアミンの縮合に際して脱離する置換基であれば、特に限定されない。例えば、ハロゲン、置換若しくは非置換のアルキルイミノ、置換若しくは非置換のアルキルカルボニルオキシ、置換若しくは非置換のアルキルスルホニルオキシ、置換又は非置換の芳香族炭素環オキシ、置換又は非置換の非芳香族炭素環オキシ、置換又は非置換の芳香族複素環オキシ、置換又は非置換の非芳香族複素環オキシ、置換又は非置換の芳香族炭素環カルボニルオキシ、換又は非置換の芳香族炭素環スルホニルオキシ、置換又は非置換の芳香族炭素環アルキルスルホニルオキシ等が挙げられる。好ましくはハロゲン、アセチルオキシ、ベンゾイルオキシ、メタンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、パラトルエンスルホニルオキシ、オルトニトロベンゼンスルホニルオキシ、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルバミミドイルオキシ、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルバミミドイルオキシ、（Ｎ－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）－Ｎ’－エチルカルバミミドイルオキシ、Ｎ－スクシンイミジルオキシ等である。特に好ましくは、Ｎ－スクシンイミジルオキシである。
本工程において、縮合剤を使用することができる。縮合剤としては、カルボキシル基とアミノ基の縮合に使用されるアミド縮合剤を用いることができる。例えば、カルボジイミド類（例えば、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、ジフェニルリン酸アジド、ＢＯＰ試薬（例えば、ＢＯＰ、ＰｙＢｏｐ、ＴＢＴＵ等）、ＨＢＴＵ、ＤＭＴ－ＭＭ、１，１’－カルボニルビス－１Ｈ－イミダゾール、２－クロロ１，３－ジメチルイミダゾリウムクロリド、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドナトリウム等である。好ましくは、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドナトリウム等）である。特に好ましくは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド又はＮ、Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミドである。
Ｌ１又はＬ２がＯＨの場合は、縮合剤を使用することが好ましい。
本工程において、縮合剤を使用することができる。縮合剤としては、カルボキシル基とアミノ基の縮合に使用されるアミド縮合剤を用いることができる。例えば、カルボジイミド類（例えば、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、ジフェニルリン酸アジド、ＢＯＰ試薬（例えば、ＢＯＰ、ＰｙＢｏｐ、ＴＢＴＵ等）、ＨＢＴＵ、ＤＭＴ－ＭＭ、１，１’－カルボニルビス－１Ｈ－イミダゾール、２－クロロ１，３－ジメチルイミダゾリウムクロリド、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドナトリウム等である。好ましくは、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドナトリウム等）である。特に好ましくは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド又はＮ、Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミドである。
Ｌ１又はＬ２がＯＨの場合は、縮合剤を使用することが好ましい。
【0057】
本発明の製造方法を用いて得られた二分岐脂質結合オリゴヌクレオチド（一本鎖）は、例えば、アンチセンス等の核酸医薬品として用いることができる。
【0058】
４．二本鎖オリゴヌクレオチドの調製
上記Ａ～Ｃの製造方法を用いて得られた化合物（ＶＩＩ）又は（Ｘ）のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含むオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、二本鎖のオリゴヌクレオチドを得る。
アニーリングするオリゴヌクレオチドは、化合物（ＶＩＩ）又は（Ｘ）中のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする限りにおいて、１又は数個の塩基の分短くてもよい。また、ハイブリダイズする部位の片側又は両側に１又は数個の塩基が付加することにより、化合物（ＶＩＩ）又は（Ｘ）中のオリゴヌクレオチドより長くてもよい。
「１又は数個の塩基」とは、１～１０個、１～５個、１～３個又は１若しくは２個の塩基を意味している。
アニーリングするオリゴヌクレオチドの好ましい長さは化合物（ＶＩＩ）又は（Ｘ）中のオリゴヌクレオチドの長さに依存する。例えば、化合物（ＶＩＩ）又は（Ｘ）中のオリゴヌクレオチドの鎖の長さに対して５０％以上の長さ、６０％以上の長さ、７０％以上の長さ、５０～１００％の長さ、６０～１００％の長さ、７０～１００％の長さである。特に好ましくは化合物（ＶＩＩ）又は（Ｘ）中のオリゴヌクレオチドの鎖の長さに対して５０～１００％の長さである。
上記Ａ～Ｃの製造方法を用いて得られた化合物（ＶＩＩ）又は（Ｘ）のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含むオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、二本鎖のオリゴヌクレオチドを得る。
アニーリングするオリゴヌクレオチドは、化合物（ＶＩＩ）又は（Ｘ）中のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする限りにおいて、１又は数個の塩基の分短くてもよい。また、ハイブリダイズする部位の片側又は両側に１又は数個の塩基が付加することにより、化合物（ＶＩＩ）又は（Ｘ）中のオリゴヌクレオチドより長くてもよい。
「１又は数個の塩基」とは、１～１０個、１～５個、１～３個又は１若しくは２個の塩基を意味している。
アニーリングするオリゴヌクレオチドの好ましい長さは化合物（ＶＩＩ）又は（Ｘ）中のオリゴヌクレオチドの長さに依存する。例えば、化合物（ＶＩＩ）又は（Ｘ）中のオリゴヌクレオチドの鎖の長さに対して５０％以上の長さ、６０％以上の長さ、７０％以上の長さ、５０～１００％の長さ、６０～１００％の長さ、７０～１００％の長さである。特に好ましくは化合物（ＶＩＩ）又は（Ｘ）中のオリゴヌクレオチドの鎖の長さに対して５０～１００％の長さである。
【0059】
アニーリングするオリゴヌクレオチドは、化合物（ＶＩＩ）又は（Ｘ）中のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできる限り、ハイブリダイズする部位において、１又は数個のミスマッチが存在するものも含まれる。例えば、ハイブリダイズする部位が、標的配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ここで、相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３－４１０（１９９０）．）の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、スコアで類似度が示される。
ここで、相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３－４１０（１９９０）．）の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、スコアで類似度が示される。
【0060】
「ストリンジェントな条件」とは、ある塩基配列が特定配列とハイブリット（いわゆる特異的ハイブリット）を形成し、同等の機能を有しない塩基配列は該特定配列とハイブリット（いわゆる非特異的ハイブリット）を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション反応及び洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液及び洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）又は６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。ハイブリダイゼーション方法としては、当該分野において周知慣用な手法、例えば、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることができる。具体的には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【0061】
「１又は数個のミスマッチ」とは、１～５個、好ましくは１～３個、さらに好ましくは１又は２個のミスマッチを意味している。
【0062】
本発明の製造方法を用いて得られた二分岐脂質結合オリゴヌクレオチド（二本鎖）は、例えば、上記（１０）のように、特許文献２～４記載の二分岐脂質結合オリゴヌクレオチドの製造方法として利用することができる。
【0063】
別に言及がなければ、本明細書中及び特許請求の範囲記載の数値はおおよその値である。数値の変動は、装置キャリブレーション、装置エラー、物質の純度、結晶サイズ、サンプルサイズ、その他の因子に起因する。
【0064】
本発明化合物の各種の置換基は、（１） Ａｌａｎ Ｒ．Ｋａｔｒｉｓｚｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （２） Ａｌａｎ Ｒ．Ｋａｔｒｉｓｚｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＩＩ （３） ＲＯＤＤ’Ｓ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＣＡＲＢＯＮ ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ ＶＯＬＵＭＥ ＩＶ ＨＥＴＥＲＯＣＹＣＬＩＣ ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ等を参考にして、導入することができる。
【実施例】
【0065】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
実施例で得られた化合物のＮＭＲ分析は４００ＭＨｚ超電導核磁気共鳴装置で行い、ＣＤＣｌ３を用いて測定した。
実施例で得られた化合物のＮＭＲ分析は４００ＭＨｚ超電導核磁気共鳴装置で行い、ＣＤＣｌ３を用いて測定した。
【0066】
実施例１ 本発明の中間体（アミダイト）を用いた二分岐脂質結合オリゴヌクレオチドの合成
１）アミダイトの合成
１）アミダイトの合成
【化37】
【0067】
工程１
化合物２（１３３．７６ｇ、６１０．２２ｍｍｏｌ）にアセトニトリル（６００ｍＬ）を加えて攪拌した。トリエチルアミン（３０．８７ｇ、３０５．０７ｍｍｏｌ）を加えた後、化合物１（２５．００ｇ、２７７．３８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１２５ｍＬ）に溶解した溶液及びアセトニトリル（２５ｍＬ）を加えた。室温で激しく２．５時間撹拌し、固体をろ取した。得られた固体をアセトニトリル（３００ｍＬ）で洗浄後、乾燥し、白色固体として化合物３（７２．７３ｇ、２０７．６ｍｍｏｌ）を得た。
化合物２（１３３．７６ｇ、６１０．２２ｍｍｏｌ）にアセトニトリル（６００ｍＬ）を加えて攪拌した。トリエチルアミン（３０．８７ｇ、３０５．０７ｍｍｏｌ）を加えた後、化合物１（２５．００ｇ、２７７．３８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１２５ｍＬ）に溶解した溶液及びアセトニトリル（２５ｍＬ）を加えた。室温で激しく２．５時間撹拌し、固体をろ取した。得られた固体をアセトニトリル（３００ｍＬ）で洗浄後、乾燥し、白色固体として化合物３（７２．７３ｇ、２０７．６ｍｍｏｌ）を得た。
【0068】
ＵＰＬＣ分析は以下の条件を用いた。
移動相：［Ａ］は６０ｍＭアンモニア―酢酸アンモニウム含有緩衝溶液（ｐＨ８．０）［Ｂ］はアセトニトリル
グラジエント：１２分間で１５％－５０％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行った後、３分間で５０％－９５％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、１分間、９５％溶媒［Ｂ］を維持した。
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ Ｐｈｅｎｙｌ（１．７μｍ、ｉ．ｄ．２．１ｘ１００ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）
流速：０．３ ｍＬ／分
ＵＶ検出波長：２９５ｎｍ
移動相：［Ａ］は６０ｍＭアンモニア―酢酸アンモニウム含有緩衝溶液（ｐＨ８．０）［Ｂ］はアセトニトリル
グラジエント：１２分間で１５％－５０％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行った後、３分間で５０％－９５％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、１分間、９５％溶媒［Ｂ］を維持した。
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ Ｐｈｅｎｙｌ（１．７μｍ、ｉ．ｄ．２．１ｘ１００ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）
流速：０．３ ｍＬ／分
ＵＶ検出波長：２９５ｎｍ
【0069】
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．８５－７．９０ （ｍ、 ４Ｈ）、 ７．７２－７．７６ （ｍ、 ４Ｈ）、 ４．２８－４．３４ （ｍ、 １Ｈ）、 ３．８３－３．９３ （ｍ、 ４Ｈ）、 ３．１２ （ｄ、 １Ｈ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：４２．２１、 ６８．７５、 １２３．５３、 １３１．９４、 １３４．１９、 １６８．６８．
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ） ： ３５１ （Ｍ＋１）、 ３７３ （Ｍ＋２３）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：４２．２１、 ６８．７５、 １２３．５３、 １３１．９４、 １３４．１９、 １６８．６８．
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ） ： ３５１ （Ｍ＋１）、 ３７３ （Ｍ＋２３）．
【0070】
工程２
Ｎ－メチルピロリドン（２２０ｍＬ）に化合物３（２０．００ｇ、５７．０９ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルピロリドン（１０ｍＬ）を加えて攪拌した。Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２０．６８ｇ、１６０．０１ｍｍｏｌ）を加えた後、化合物４（２１．６２ｇ、９１．３５ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルピロリドン（１０ｍＬ）を加えた。２３℃で１．５時間攪拌し、水道水（２０．００ｇ）を加えて、さらに０．５時間攪拌した。水道水（５０．００ｇ）を１５分間かけて加えた後、２時間攪拌した。その後、水道水（７０．０２ｇ）を２２分間かけて加え、１．５時間攪拌し、固体をろ取した。得られた固体を２－プロパノール（８０ｍＬ）で洗浄後、乾燥し、白色固体として化合物５（２７．８３ｇ、５０．５５ｍｍｏｌ）を得た。
Ｎ－メチルピロリドン（２２０ｍＬ）に化合物３（２０．００ｇ、５７．０９ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルピロリドン（１０ｍＬ）を加えて攪拌した。Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２０．６８ｇ、１６０．０１ｍｍｏｌ）を加えた後、化合物４（２１．６２ｇ、９１．３５ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルピロリドン（１０ｍＬ）を加えた。２３℃で１．５時間攪拌し、水道水（２０．００ｇ）を加えて、さらに０．５時間攪拌した。水道水（５０．００ｇ）を１５分間かけて加えた後、２時間攪拌した。その後、水道水（７０．０２ｇ）を２２分間かけて加え、１．５時間攪拌し、固体をろ取した。得られた固体を２－プロパノール（８０ｍＬ）で洗浄後、乾燥し、白色固体として化合物５（２７．８３ｇ、５０．５５ｍｍｏｌ）を得た。
【0071】
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．８２－７．８８ （ｍ、 ４Ｈ）、 ７．７０－７．７．７６ （ｍ、 ４Ｈ）、 ４．４０－４．４９ （ｍ、 １Ｈ）、 ３．９４－４．０７ （ｍ、 ２Ｈ）、 ３．６６－３．８０ （ｍ、 ３Ｈ）、 ３．３８－３．５６ （ｍ、 ３Ｈ）、 ２．３８－２．５２ （ｍ、 ２Ｈ）、 ０．９７－１．０１ （ｍ、 １２Ｈ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１９．８ （ｄ、 Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ）、 ２４．１９、 ２４．２４、 ２４．４７、 ２４．５３、 ４１．２， ４１．３、 ４１．４、 ４３．０、 ４３．１、 ５８．２ （ｄ、 Ｊ ＝ ２１．１ Ｈｚ）、 ６８．３ （ｄ、 Ｊ ＝ １０．９ Ｈｚ）、 １１７．４、 １２３．２、 １２３．３、 １３２．１、 １３２．２、 １３３．９７、 １３４．０２、 １６８．０、 １６８．１．
３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１４９．３
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ） ： ５５１ （Ｍ＋１）、 ５７３ （Ｍ＋２３）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１９．８ （ｄ、 Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ）、 ２４．１９、 ２４．２４、 ２４．４７、 ２４．５３、 ４１．２， ４１．３、 ４１．４、 ４３．０、 ４３．１、 ５８．２ （ｄ、 Ｊ ＝ ２１．１ Ｈｚ）、 ６８．３ （ｄ、 Ｊ ＝ １０．９ Ｈｚ）、 １１７．４、 １２３．２、 １２３．３、 １３２．１、 １３２．２、 １３３．９７、 １３４．０２、 １６８．０、 １６８．１．
３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１４９．３
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ） ： ５５１ （Ｍ＋１）、 ５７３ （Ｍ＋２３）．
【0072】
２）脂質結合オリゴヌクレオチドの合成
ＵＰＬＣ分析は以下の条件を用いた。
移動相：［Ａ］は２００ｍＭ１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール、８ｍＭトリエチルアミン含有水溶液［Ｂ］は２００ｍＭ１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール、８ｍＭトリエチルアミン含有メタノール溶液
グラジエント：７．２９分間で５％－２６％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行った後、１．２１分間で２６％－５５％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、３．６４分間で５５％－９５％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、２．８６分間、９５％溶媒［Ｂ］を維持した。
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４、３００Å（１．７μｍ、ｉ．ｄ．２．１ｘ５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）
流速：０．５１ ｍＬ／分
ＵＶ検出波長：２５４ｎｍ
カラム温度：４５℃
ＵＰＬＣ分析は以下の条件を用いた。
移動相：［Ａ］は２００ｍＭ１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール、８ｍＭトリエチルアミン含有水溶液［Ｂ］は２００ｍＭ１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール、８ｍＭトリエチルアミン含有メタノール溶液
グラジエント：７．２９分間で５％－２６％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行った後、１．２１分間で２６％－５５％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、３．６４分間で５５％－９５％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、２．８６分間、９５％溶媒［Ｂ］を維持した。
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４、３００Å（１．７μｍ、ｉ．ｄ．２．１ｘ５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）
流速：０．５１ ｍＬ／分
ＵＶ検出波長：２５４ｎｍ
カラム温度：４５℃
【0073】
【化38】
（式中、各記号は前記と同意義であり、ｎ’は６～２８の整数である。）
【0074】
２－１） オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドは核酸自動合成装置であるＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｃｙｔｉｖａ））、ＮＳ－８－Ｉ（大日本精機）、ＮＳ－８－ＩＩ（大日本精機）を用いて、ホスホロアミダイト法により合成した。カップリング時間は３分間とし、１つのモノマーの縮合に２当量～１０当量のアミダイト体を用いた。得られた化合物６に対し、最終サイクルでは、導入するモノマーとして５当量の化合物５を０．２Ｍアセトニトリル溶液に調製して加え、カップリング時間は６０分間とし、化合物７を得た。
なお、ＰＯ酸化をする場合には０．０２Ｍ Ｏｘｉｄｉｚｅｒ（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヨウ素／ピリジン／水／＝１２．７／９／１（ｗ／ｖ／ｖ）を使用し、ＰＳ酸化をする場合には０．２Ｍ キサンタンヒドリドのピリジン溶液、５０ｍＭ ＤＤＴＴ（（ジメチルアミノ－メチリデン）アミノ－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオン）のアセトニトリル／３－ピコリン１／１（ｖ／ｖ）、１／４（ｖ／ｖ）、アセトニトリル／ピリジン１／４（ｖ／ｖ）溶液を用いた。活性化剤はＢＴＴ ａｃｔｉｖａｔｏｒ（５－ベンジルチオ）－１Ｈ－テトラゾール）（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＥＴＴ ａｃｔｉｖａｔｏｒ（５－エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール）（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）、キャッピング試薬はＣａｐＡ、ＣａｐＢ（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。脱トリチル化試薬はＤｅｂ（３ｗ／ｖ％ＴＣＡ ＣＨ２Ｃｌ２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（和光純薬）、Ｄｅｂ（３ｗ／ｖ％ Ｄｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、Ｔｏｌｕｅｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を使用した。
オリゴヌクレオチドは核酸自動合成装置であるＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｃｙｔｉｖａ））、ＮＳ－８－Ｉ（大日本精機）、ＮＳ－８－ＩＩ（大日本精機）を用いて、ホスホロアミダイト法により合成した。カップリング時間は３分間とし、１つのモノマーの縮合に２当量～１０当量のアミダイト体を用いた。得られた化合物６に対し、最終サイクルでは、導入するモノマーとして５当量の化合物５を０．２Ｍアセトニトリル溶液に調製して加え、カップリング時間は６０分間とし、化合物７を得た。
なお、ＰＯ酸化をする場合には０．０２Ｍ Ｏｘｉｄｉｚｅｒ（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヨウ素／ピリジン／水／＝１２．７／９／１（ｗ／ｖ／ｖ）を使用し、ＰＳ酸化をする場合には０．２Ｍ キサンタンヒドリドのピリジン溶液、５０ｍＭ ＤＤＴＴ（（ジメチルアミノ－メチリデン）アミノ－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオン）のアセトニトリル／３－ピコリン１／１（ｖ／ｖ）、１／４（ｖ／ｖ）、アセトニトリル／ピリジン１／４（ｖ／ｖ）溶液を用いた。活性化剤はＢＴＴ ａｃｔｉｖａｔｏｒ（５－ベンジルチオ）－１Ｈ－テトラゾール）（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＥＴＴ ａｃｔｉｖａｔｏｒ（５－エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール）（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）、キャッピング試薬はＣａｐＡ、ＣａｐＢ（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。脱トリチル化試薬はＤｅｂ（３ｗ／ｖ％ＴＣＡ ＣＨ２Ｃｌ２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（和光純薬）、Ｄｅｂ（３ｗ／ｖ％ Ｄｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、Ｔｏｌｕｅｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を使用した。
【0075】
２－２） 樹脂からの切り出し、塩基及びリン酸の脱保護
化合物８の固相担体からの切り出し、オリゴヌクレオチド中のアデニンのアミノ基を保護するベンゾイル基、グアニンのアミノ基を保護するイソブチリル基、シトシンのアミノ基を保護するアセチル基及びリン酸のヒドロキシ基を保護する２－シアノエチル基の脱保護、並びにフタロイル基の脱保護は、アンモニア水及びｎ－ブチルアミンを用いて、室温下で４時間、５５℃で２時間激しく攪拌した。
また、別の方法として、アンモニア水及びベンジルアミンを用いて、室温下で４時間、５５℃で４時間激しく攪拌した。
なお、「２－４）脂質の導入」において、アミン類が残存すると目的の脂質導入反応が停止することが明らかとなった。しかし、ベンジルアミンを使用した場合、本項に記載する分液操作による洗浄及び「２－３）化合物８の精製」においてＵＶ検出器（２５４ｎｍ）によりベンジルアミンの残存を追跡及び管理することができた。
また、本項に記載する分液操作において、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを用いて洗浄することによりアミン類を除去することが効率的であった。具体的には、反応混合物から切り出し後の樹脂をろ別し、得られた樹脂を水、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで洗浄した。ろ液及び洗液を合併した溶液を、分液操作によりメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで洗浄後、減圧下で７５％程度の重量になるまで濃縮し、化合物８の粗製溶液を得た。
化合物８の固相担体からの切り出し、オリゴヌクレオチド中のアデニンのアミノ基を保護するベンゾイル基、グアニンのアミノ基を保護するイソブチリル基、シトシンのアミノ基を保護するアセチル基及びリン酸のヒドロキシ基を保護する２－シアノエチル基の脱保護、並びにフタロイル基の脱保護は、アンモニア水及びｎ－ブチルアミンを用いて、室温下で４時間、５５℃で２時間激しく攪拌した。
また、別の方法として、アンモニア水及びベンジルアミンを用いて、室温下で４時間、５５℃で４時間激しく攪拌した。
なお、「２－４）脂質の導入」において、アミン類が残存すると目的の脂質導入反応が停止することが明らかとなった。しかし、ベンジルアミンを使用した場合、本項に記載する分液操作による洗浄及び「２－３）化合物８の精製」においてＵＶ検出器（２５４ｎｍ）によりベンジルアミンの残存を追跡及び管理することができた。
また、本項に記載する分液操作において、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを用いて洗浄することによりアミン類を除去することが効率的であった。具体的には、反応混合物から切り出し後の樹脂をろ別し、得られた樹脂を水、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで洗浄した。ろ液及び洗液を合併した溶液を、分液操作によりメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで洗浄後、減圧下で７５％程度の重量になるまで濃縮し、化合物８の粗製溶液を得た。
【0076】
２－３） 化合物８の精製
化合物８の粗製溶液を以下の条件により逆相液体クロマトグラフィーにより精製した。得られたフラクションを集め、減圧下で８０％程度の重量になるまで濃縮し、化合物８の溶液を得た。
（精製条件）
移動相：［Ａ］は１００ｍＭ酢酸ナトリウム含有水溶液［Ｂ］はアセトニトリル
グラジエント：５９分間、０％溶媒［Ｂ］を維持した後、１分間で０％－５％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、３０分間で５％－９０％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、１０分間、９５％溶媒［Ｂ］を維持した。
カラム：Ｔｒｉａｒｔ Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｃ１８－Ｓ（１２ｎｍ、ｉ．ｄ．１０ｘ２５０ｍｍ）（ＹＭＣ）
流速：５ｍＬ／分
ＵＶ検出波長：２５４ｎｍ
カラム温度：２５℃
化合物８の粗製溶液を以下の条件により逆相液体クロマトグラフィーにより精製した。得られたフラクションを集め、減圧下で８０％程度の重量になるまで濃縮し、化合物８の溶液を得た。
（精製条件）
移動相：［Ａ］は１００ｍＭ酢酸ナトリウム含有水溶液［Ｂ］はアセトニトリル
グラジエント：５９分間、０％溶媒［Ｂ］を維持した後、１分間で０％－５％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、３０分間で５％－９０％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、１０分間、９５％溶媒［Ｂ］を維持した。
カラム：Ｔｒｉａｒｔ Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｃ１８－Ｓ（１２ｎｍ、ｉ．ｄ．１０ｘ２５０ｍｍ）（ＹＭＣ）
流速：５ｍＬ／分
ＵＶ検出波長：２５４ｎｍ
カラム温度：２５℃
【0077】
２－４） 脂質の導入
化合物９－ｎ’（例えば、ｎ’＝１８、アラキジン酸）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド及びＮ、Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミドをＮ－メチロピロリドンに溶解し、５０℃で２時間攪拌した後、Ｎ－メチロピロリドンで希釈し、上記化合物８の溶液を加えた。室温で２時間攪拌した後、エタノール及び１Ｍ酢酸ナトリウム含有水溶液を加え固体をろ別した。得られた固体をエタノール及びメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで洗浄し、洗液をろ液と合併した。
化合物９－ｎ’（例えば、ｎ’＝１８、アラキジン酸）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド及びＮ、Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミドをＮ－メチロピロリドンに溶解し、５０℃で２時間攪拌した後、Ｎ－メチロピロリドンで希釈し、上記化合物８の溶液を加えた。室温で２時間攪拌した後、エタノール及び１Ｍ酢酸ナトリウム含有水溶液を加え固体をろ別した。得られた固体をエタノール及びメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで洗浄し、洗液をろ液と合併した。
【0078】
３） 化合物１０－ｎ’の精製、脱塩、凍結乾燥
得られた固体を特許文献２の実施例１のＥ）精製、Ｆ）精製オリゴヌクレオチドの脱塩及び凍結乾燥に記載の方法と同様の方法に付し、化合物１０－ｎ’を合成する。
得られた固体を特許文献２の実施例１のＥ）精製、Ｆ）精製オリゴヌクレオチドの脱塩及び凍結乾燥に記載の方法と同様の方法に付し、化合物１０－ｎ’を合成する。
【0079】
４） 二本鎖オリゴヌクレオチドの調製
特許文献２の実施例１のＩ）二本鎖オリゴヌクレオチドの調製に記載の方法により、化合物１０－ｎ’とハイブリダイズ可能な配列を含むオリゴヌクレオチドを合成し、化合物１０－ｎ’とアニーリングして二本鎖核酸を調整し、化合物ＸＩ－１～ＸＩ－６を得る。
特許文献２の実施例１のＩ）二本鎖オリゴヌクレオチドの調製に記載の方法により、化合物１０－ｎ’とハイブリダイズ可能な配列を含むオリゴヌクレオチドを合成し、化合物１０－ｎ’とアニーリングして二本鎖核酸を調整し、化合物ＸＩ－１～ＸＩ－６を得る。
【0080】
【表1】
【0081】
また、同様の方法で、特許文献４の表１４記載のｓｉＲＮＡ－４及びｓｉＲＮＡ－５を得る。
【0082】
実施例２ 本発明の中間体（アミダイト）の物性
化合物５と以下の比較化合物（特許文献２及び３記載の化合物４－１８、特許文献４記載の化合物５－１８）について、物性の比較を行った。
化合物５と以下の比較化合物（特許文献２及び３記載の化合物４－１８、特許文献４記載の化合物５－１８）について、物性の比較を行った。
【化39】
【0083】
１）粉末Ｘ線回折
日本薬局方の一般試験法に記載された粉末Ｘ線回折測定法に従い、粉末Ｘ線回折測定を行った。測定条件を以下に示す。
（装置）
リガク社製ＭｉｎｉＦｌｅｘ６００ＲＩＮＴ－ＴＴＲＩＩＩ
（操作方法）
検出器：高速一次元検出器（Ｄ／ｔｅＸ Ｕｌｔｒａ２）及び可変ナイフエッジ
測定法：反射法
光源の種類：Ｃｕ管球
使用波長：ＣｕＫα線
管電流：１５ｍＡ
管電圧：４０Ｋｖ
試料プレート：無反射板 （シリコン）
Ｘ線の入射角（θ）：４－４０°、サンプリング幅：０．０２°
（結果）
化合物５：下記の回折パターンが観測された。
粉末Ｘ線回折２θ（°）：４．５、８．９、９．７、９．９、１１．４、１２．０、１３．５、１４．３、１８．０、１９．２、１９．５、２０．０、２０．７、２１．７、２１．９、２２．９、２８．９、２９．２
比較化合物： ブロードなハローパターンを示した。
２）ＵＶ吸収
液体クロマトグラフィーの検出器をフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器として、得られたクロマトグラムで各化合物に対応するピークについてＵＶスペクトル及びピーク面積値を測定し、各化合物のモル吸光度係数の大きさの相対的な違いを見積もった。測定条件を以下に示す。
（装置）
ＨＰＬＣシステム：島津製作所社製Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２ ＵＨＰＬＣ
検出器：ＳＰＤ－Ｍ３０Ａ（ＰＤＡ）、測定波長域：１９０～４００ ｎｍ
（操作方法）
化合物５：
移動相：［Ａ］は１０ｍＭギ酸アンモニウム含有水溶液［Ｂ］はアセトニトリル
グラジエント：１７分間で５％－９５％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行った後、３分間、９５％溶媒［Ｂ］を維持した。
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ（３．５μｍ、ｉ．ｄ．４．６ｘ１５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）
流速：１．０ ｍＬ／分
試料溶液濃度：約０．４８ ｍｇ／ｍＬ
注入量：１０μＬ
比較化合物：
移動相：５％アセトニトリル含有水溶液
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標）ＨＩＬＩＣ（５．０μｍ、ｉ．ｄ．４．６ｘ２５０ｍｍ）（ナカライテスク）
流速：１．０ ｍＬ／分
試料溶液濃度：約１０ ｍｇ／ｍＬ
注入量：１μＬ
（結果）
化合物５：極大吸収波長 ２２１ｎｍ
比較化合物：極大吸収波長 １９５ｎｍ（一般的なＵＶ検出器を用いた分析に際し、実用的な波長域である＞２１０ｎｍに極大吸収波長は見られない）。
化合物５の２２１ｎｍにおけるモル吸光係数は比較化合物の１９５ｎｍにおけるモル吸光係数の約５倍であることが見積もられた。また、化合物５の２２１ｎｍにおけるモル吸光係数は比較化合物の２２１ｎｍにおけるモル吸光係数の約４０倍であることが見積もられた。
３）安定性
化合物５の分析は以下の条件を用いた。
移動相：［Ａ］は６０ｍＭアンモニア―酢酸アンモニウム含有緩衝溶液（ｐＨ８．０）［Ｂ］はアセトニトリル
グラジエント：０．５分間、１５％溶媒［Ｂ］を維持した後、２．５分間で１５％－５０％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、９分間で５０％－６５％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、３分間で６５％－９５％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、１分間、９５％溶媒［Ｂ］を維持した。
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ Ｐｈｅｎｙｌ（１．７μｍ、ｉ．ｄ．２．１ｘ１００ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）
流速：０．３ ｍＬ／分
ＵＶ検出波長：２９５ｎｍ
比較化合物の分析は以下の条件を用いた。
移動相：［Ａ］は１０ｍＭギ酸アンモニウム含有水溶液［Ｂ］はメタノール
グラジエント：９７％溶媒［Ｂ］を２０分維持した。
カラム：Ｔｒｉａｒｔ（登録商標）Ｃ８（３μｍ、ｉ．ｄ．４．６ｘ１００ｍｍ）（ＹＭＣ）
流速：１．０ｍＬ／分
注入量：１０μＬ
検出器：コロナＣＡＤ、コロナＣＡＤ検出条件：６０Ｈｚ、ＢＣＤ極性＋、圧力３５±１ｐｓｉ、トータル流量１．５３ｍＬ／分
（結果）
化合物５（４０℃）： ９９．６％（初期）→９９．６％（７日後）→９９．７％（５０日後）
比較化合物（－２０℃）： ５４．３％ （初期）→ ４２．０％ （７１日後）→ ３３．８％（７箇月後）
日本薬局方の一般試験法に記載された粉末Ｘ線回折測定法に従い、粉末Ｘ線回折測定を行った。測定条件を以下に示す。
（装置）
リガク社製ＭｉｎｉＦｌｅｘ６００ＲＩＮＴ－ＴＴＲＩＩＩ
（操作方法）
検出器：高速一次元検出器（Ｄ／ｔｅＸ Ｕｌｔｒａ２）及び可変ナイフエッジ
測定法：反射法
光源の種類：Ｃｕ管球
使用波長：ＣｕＫα線
管電流：１５ｍＡ
管電圧：４０Ｋｖ
試料プレート：無反射板 （シリコン）
Ｘ線の入射角（θ）：４－４０°、サンプリング幅：０．０２°
（結果）
化合物５：下記の回折パターンが観測された。
粉末Ｘ線回折２θ（°）：４．５、８．９、９．７、９．９、１１．４、１２．０、１３．５、１４．３、１８．０、１９．２、１９．５、２０．０、２０．７、２１．７、２１．９、２２．９、２８．９、２９．２
比較化合物： ブロードなハローパターンを示した。
２）ＵＶ吸収
液体クロマトグラフィーの検出器をフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器として、得られたクロマトグラムで各化合物に対応するピークについてＵＶスペクトル及びピーク面積値を測定し、各化合物のモル吸光度係数の大きさの相対的な違いを見積もった。測定条件を以下に示す。
（装置）
ＨＰＬＣシステム：島津製作所社製Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２ ＵＨＰＬＣ
検出器：ＳＰＤ－Ｍ３０Ａ（ＰＤＡ）、測定波長域：１９０～４００ ｎｍ
（操作方法）
化合物５：
移動相：［Ａ］は１０ｍＭギ酸アンモニウム含有水溶液［Ｂ］はアセトニトリル
グラジエント：１７分間で５％－９５％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行った後、３分間、９５％溶媒［Ｂ］を維持した。
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ（３．５μｍ、ｉ．ｄ．４．６ｘ１５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）
流速：１．０ ｍＬ／分
試料溶液濃度：約０．４８ ｍｇ／ｍＬ
注入量：１０μＬ
比較化合物：
移動相：５％アセトニトリル含有水溶液
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標）ＨＩＬＩＣ（５．０μｍ、ｉ．ｄ．４．６ｘ２５０ｍｍ）（ナカライテスク）
流速：１．０ ｍＬ／分
試料溶液濃度：約１０ ｍｇ／ｍＬ
注入量：１μＬ
（結果）
化合物５：極大吸収波長 ２２１ｎｍ
比較化合物：極大吸収波長 １９５ｎｍ（一般的なＵＶ検出器を用いた分析に際し、実用的な波長域である＞２１０ｎｍに極大吸収波長は見られない）。
化合物５の２２１ｎｍにおけるモル吸光係数は比較化合物の１９５ｎｍにおけるモル吸光係数の約５倍であることが見積もられた。また、化合物５の２２１ｎｍにおけるモル吸光係数は比較化合物の２２１ｎｍにおけるモル吸光係数の約４０倍であることが見積もられた。
３）安定性
化合物５の分析は以下の条件を用いた。
移動相：［Ａ］は６０ｍＭアンモニア―酢酸アンモニウム含有緩衝溶液（ｐＨ８．０）［Ｂ］はアセトニトリル
グラジエント：０．５分間、１５％溶媒［Ｂ］を維持した後、２．５分間で１５％－５０％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、９分間で５０％－６５％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、３分間で６５％－９５％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、１分間、９５％溶媒［Ｂ］を維持した。
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ Ｐｈｅｎｙｌ（１．７μｍ、ｉ．ｄ．２．１ｘ１００ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）
流速：０．３ ｍＬ／分
ＵＶ検出波長：２９５ｎｍ
比較化合物の分析は以下の条件を用いた。
移動相：［Ａ］は１０ｍＭギ酸アンモニウム含有水溶液［Ｂ］はメタノール
グラジエント：９７％溶媒［Ｂ］を２０分維持した。
カラム：Ｔｒｉａｒｔ（登録商標）Ｃ８（３μｍ、ｉ．ｄ．４．６ｘ１００ｍｍ）（ＹＭＣ）
流速：１．０ｍＬ／分
注入量：１０μＬ
検出器：コロナＣＡＤ、コロナＣＡＤ検出条件：６０Ｈｚ、ＢＣＤ極性＋、圧力３５±１ｐｓｉ、トータル流量１．５３ｍＬ／分
（結果）
化合物５（４０℃）： ９９．６％（初期）→９９．６％（７日後）→９９．７％（５０日後）
比較化合物（－２０℃）： ５４．３％ （初期）→ ４２．０％ （７１日後）→ ３３．８％（７箇月後）
【産業上の利用可能性】
【0084】
本発明の製造方法を用いて、高品質な二分岐脂質結合オリゴヌクレオチドを効率的に製造することができる。本発明の中間体は該製造方法に特に有用である。
【配列表】