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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-07
(45)【発行日】2024-11-15
(54)【発明の名称】血小板放出システム及び血小板放出方法
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20241108BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20241108BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A
C12N5/078
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2022519721
(86)(22)【出願日】2020-10-12
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-20
(86)【国際出願番号】 EP2020078639
(87)【国際公開番号】W WO2021069747
(87)【国際公開日】2021-04-15
【審査請求日】2023-10-12
(31)【優先権主張番号】1911303
(32)【優先日】2019-10-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(73)【特許権者】
【識別番号】522122802
【氏名又は名称】エタブリスモン フランセ デュ サン
(73)【特許権者】
【識別番号】522122813
【氏名又は名称】アヴィニョン ユニベルシテ
(73)【特許権者】
【識別番号】591100596
【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル
(73)【特許権者】
【識別番号】509228260
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・ストラスブール
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ドゥ サクラメント，ヴァランタン
(72)【発明者】
【氏名】ナップ，ヤニック
(72)【発明者】
【氏名】マロ，リア
(72)【発明者】
【氏名】ストラッセル，カトリーヌ
【審査官】村松 宏紀
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／０７７９６４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／１６４０４０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／００９３６４（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｍ、Ｃ１２Ｎ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞質の伸展部（Ｃｋ）を含む巨核球細胞（Ｍｋ）を特に含む流体（Ｆ）から血小板を放出するためのシステム（１）であって、当該システム（１）は、－ 次のものを具備してなるデバイス（２）、即ち、
・第１開口（１６）及び第２開口（１８）を備える血小板放出リザーバ（１０）、
・前記第１開口（１６）のレベルに取り付けられると共に、前記流体（Ｆ）を前記リザーバ（１０）へと注入するように適合されている第１流体接続要素（２０）であって、前記流体を血小板放出リザーバ（１０）へと注入するための開口部（２２）、及び前記開口部（２２）に向かって狭窄する部分（２４）を備えており、前記注入開口部（２２）と前記リザーバ（１０）間に断面の急拡大部分が存在する、第１流体接続要素（２０）、
並びに、
・前記第２開口（１８）のレベルに取り付けられた第２流体接続要素（３０）であって、流体を排出するための開口部（３２）を備えている、第２流体接続要素（３０）、
を具備してなるデバイス（２）と、
－ 第２流体接続要素（３０）又は第１流体接続要素（２０）により前記リザーバ（１０）と流体連通している、流体（Ｆ）を圧送するためのデバイス（６０）と、
－ 前記圧送デバイス（６０）用の電力供給モジュール（６２）と、
－ 前記注入開口部（２２）と前記排出開口部（３２）との間で前記流体（Ｆ）の連続流れを発生させると共に、前記リザーバ（１０）内部で渦の擾乱を発生させて、巨核球細胞（Ｍｋ）の細胞質の伸展部（Ｃｋ）の断片化を引き起こすように設計された１つ又は複数の血小板放出シークエンスを実践するべく、前記圧送デバイス（６０）用の前記電力供給モジュール（６２）を制御するように構成されたプログラミングシステム（７０）と、
を備える、ことを特徴とするシステム。
【請求項2】
前記狭窄部（２４）が円錐形である、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
前記第１流体接続要素（２０）が長手方向軸（Ｘ１）を含み、前記第２流体接続要素（３０）が長手方向軸（Ｘ２）を含み、前記長手方向軸（Ｘ１，Ｘ２）が交差状態又は平行状態にあり、且つ非ゼロの距離（ｄ）だけ離間している、請求項１に記載のシステム。
【請求項4】
前記注入開口部（２２）が１ｍｍ未満の開口径を有し、前記リザーバ（１０）の断面幅に対する前記注入開口部（２２）の開口径の比率が０．０２～０．１である、請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項5】
前記リザーバ（１０）の断面幅に対する前記注入開口部（２２）の開口径の比率が０．０５である、請求項４に記載のシステム。
【請求項6】
前記排出開口部（３２）が１ｍｍ未満の開口径を有し、前記リザーバ（１０）の断面幅に対する前記排出開口部（３２）の開口径の比率が０．０２～０．１である、請求項１～５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項7】
前記リザーバ（１０）の断面幅に対する前記排出開口部（３２）の開口径の比率が０．０５である、請求項６に記載のシステム。
【請求項8】
前記リザーバ（１０）が球体形状を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項9】
前記リザーバ（１０）に供給するための前記第１流体接続要素（２０）に接続されている、流体（Ｆ）を貯蔵するための供給源リザーバ（４０）、および、前記リザーバ（１０）から吸引されるよう意図されている前記流体を回収するために、前記第２流体接続要素（３０）に接続されている、流体（Ｆ）を受容するためのリザーバ（５０）、
を備えてなる、請求項１～８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項10】
前記圧送デバイス（６０）が、前記受容リザーバ（５０）内に配置されている、請求項９に記載のシステム。
【請求項11】
前記第２流体接続要素（３０）は、前記圧送デバイス（６０）に向かって流体を排出するための、前記開口部（３２）から広がっている部分（３４）を更に備える、請求項１～１０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか一項に記載のシステム（１）であって、当該システムは、少なくとも１つの他のデバイス（２´´）を備え、前記他のデバイス（２´´）は、
－ 第１開口（１６´´）及び第２開口（１８´´）を備える血小板放出リザーバ（１０´´）、
－ 前記第１開口（１６´´）のレベルに取り付けられると共に、前記流体（Ｆ）を前記リザーバ（１０´´）の内部に注入するように適合されている第１流体接続要素（２０´´）であって、前記流体を注入するための開口部（２２´´）及び前記流体（Ｆ）を加速可能とする第１狭窄部（２４´´）を備え、前記第１狭窄部（２４´´）が前記注入開口部（２２´´）上に開口している、第１流体接続要素（２０´´）、並びに、
－ 前記第２開口（１８´´）のレベルに取り付けられた第２流体接続要素（３０´´）であって、流体を排出するための開口部（３２´´）を備えている、第２流体接続要素（３０´´）、
を備え、
前記他のデバイス（２´´）が、第１のデバイス（２）に平行に配置されると共に、前記他のデバイスの第２流体接続要素（３０´´）によって前記圧送デバイスに接続されている、ことを特徴とするシステム。
【請求項13】
請求項１～１１のいずれか一項に記載のシステム（１）であって、当該システムは、少なくとも１つの他のデバイス（２´）を備え、前記デバイス（２´）は、
－ 第１開口（１６´）及び第２開口（１８´）を備える血小板放出リザーバ（１０´）、
－ 前記第１開口（１６´）のレベルに取り付けられると共に、前記流体（Ｆ）を前記リザーバ（１０´）の内部に注入するように適合されている第１流体接続要素（２０´）であって、前記流体を注入するための開口部（２２´）及び前記流体（Ｆ）を加速可能とする第１狭窄部（２４´）を備え、前記第１狭窄部（２４´）が前記注入開口部（２２´）上へと開口している、第１流体接続要素（２０´）、並びに、
－ 前記第２開口（１８´）のレベルに取り付けられた第２流体接続要素（３０´）であって、流体を排出するための開口部（３２´）を備えている、第２流体接続要素（３０´）、
を備え、
前記他のデバイス（２´）が、第１のデバイス（２）に直列に配置されると共に、前記他のデバイス（２´）の第２流体接続要素（３０´）が、前記第１のデバイス（２）の第１流体接続要素（２０）と流体連通している、ことを特徴とするシステム。
【請求項14】
細胞質の伸展部（Ｃｋ）を含む巨核球細胞（Ｍｋ）を特に含む流体（Ｆ）から血小板（Ｐ）を放出するための方法（５）であって、当該方法は、請求項１～１３のいずれか一項に記載のシステム（１）により実施されると共に、以下の工程を含む、即ち、流体（Ｆ）に懸濁されている巨核球細胞（Ｍｋ）を含む前記流体（Ｆ）を提供する工程であって、前記巨核球細胞（Ｍｋ）が細胞質の伸展部（Ｃｋ）を含んでなる、工程（１００）と、
圧送デバイス（６０）に電力供給を行う工程（２００）と、
１つ又は複数の血小板放出シークエンスを開始させるように、プログラミングシステム（７０）を制御する工程（３００）と、
を含み、
前記血小板放出シークエンスまたは各前記血小板放出シークエンスは、
注入開口部（２２）と排出開口部（３２）の間で流体（Ｆ）の連続流れを発生させると共に、リザーバ（１０）内部に渦の擾乱を発生させて、巨核球細胞（Ｍｋ）の細胞質の伸展部（Ｃｋ）の断片化を引き起こすべく実行される、ことを特徴とする方法。
【請求項15】
前記工程（２００）の間、前記デバイス（２、２´、２´´）内には、－１０ｋＰａ～－５０ｋＰａの相対真空が発生する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、特に巨核球前駆細胞、細胞質の伸展部を含む巨核球細胞を含む流体から血小板を放出するためのシステムに関する。本発明はまた、前述のシステムなどの多数のシステムに供給される組立体（アセンブリ）に関する。最後に、本発明はこうしたシステムにより血小板の連続放出を行うための方法に関する。本発明はより特定的には、工業規模での血小板のインビトロ産生に適合する。
【背景技術】
【0002】
血小板放出のインビトロ産生は、様々な医療用途で増大しつつある需要に合致している。現在、こうした特定の目的を意図したシステムには本質的に２種類のカテゴリがある。すなわち、マイクロ流体システム及び「リザーバ」システムである。血小板の放出を意図しているこうしたシステムのカテゴリは、流れの必要性を示すインサイチュ(in situ)で行われた知見に由来する。
【0003】
リザーバシステムの一例は、特許文献１に説明されている。このシステムは、処理される流体を撹拌するための手段を伴って提供されている。これは、特に巨核球細胞を含む流体のためのリザーバ、及び流体を撹拌するための少なくとも１つの手段を備えており、ここでの撹拌により、血小板の放出が発生する。この撹拌は、リザーバ自体の内部にて、例えば垂直往復パドルによって発生する。こうしたシステムの主な欠点は、上記のように得られた血小板の品質を保証する条件下で操作するのに適合していないことである。この理由としては、外部環境及びその環境に存在する汚染源から血小板が単離されておらず、そのため医療用途には不適となることが挙げられる。
【0004】
マイクロ流体システムはその名称が示すように、一般には、別々の機能を実施するための特定の配置で相互接続されているリザーバとチャネルのネットワークを含む、マイクロメートル寸法（数十ミクロンから最大で数百ミクロン）のシステムである。古典的には、これらのシステムは巨核球細胞及び巨核球の培養、及び任意選択的には血小板放出に充てられる場所を備える。この場所は、血小板の抽出／回収するように構成されたチャネルのネットワークに接続されている。こうしたシステムは、その大半が生体模倣型であるが、血小板産生を増大させるために生理学的環境を模倣しようとする。
【0005】
これらのサイズが小さいことに起因して、これらのマイクロ流体システムには固有の２つの制限が存在する。１点目は、このシステムにより得られ得る血小板流量は低量であり、典型的には１時間あたり数百マイクロリットル（μＬ／時間）である。一例としては、２００μＬ／時間の流量を有するシステムは、仮に１０Ｌの流体を処理するには、５０，０００時間、すなわち５．７年を必要とする。したがって同等の総流量を得るには、並行して複数のシステムに接続する必要がある。しかし上記の例では必要とされるシステムの数は非常に多く、５０，０００システムが必要となり、システムの複雑性は更に増大することになる。最良の状態を考えたとしても、こうしたシステムは、ある程度限られた体積の流体サンプルにのみ適している。
【0006】
２点目としては、文献に説明されているマイクロ流体デバイスは全て、巨核球を「固定」(fix)する機構／方法を実践しており、こうして血小板を抽出する。この固定相は多くの場合、薬物又は化学コーティング化合物の使用に基づいているが、そのことが欠点である。
【0007】
直近では、ピペット操作を使用して巨核球細胞から血小板を放出するための新規方法が開発されている。こうした方法は、非特許文献１にて説明されている。こうした方法では、血小板を放出するためのプロセスはピペット操作の直接的な結果である。ピペット操作は、ピペット操作が血小板の放出に必要となる撹拌状態を作り出すために必要な回数繰り返されることを除いては、巨核球細胞を含む培養液のサンプルをピペットにより採取するという点で従来型のピペット操作と類似している。この方法の結果として、血小板は処理済みの流体中に検出され、血小板の放出に対するピペット操作の能力を検証し、かつこのピペット操作を非常に容易に実践した。ただし、この方法は大規模での操作には適していない。この理由としては、ピペット操作が元々手動での操作であり、それゆえに限られた体積の流体を処理することのみに適していることが挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】国際公開ＷＯ２０１９０９３６４号（Ａ１）
【非特許文献】
【0009】
【文献】Ｓｔｒａｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．“Ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｈｉｇｈ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｐｒｏｐａｌｅｔｓ”，Ｂｌｏｏｄ，Ｍａｙ ５，２０１６，ｖｏｌ．１２７，ｎｏ１８
【発明の概要】
【0010】
本発明は、前述の欠点を克服することを可能とするものであり、最終的には、特に、細胞質の伸展部を含む巨核球細胞を含む流体から血小板を放出するためのシステムを提案するものである。そして、当該システムは、
－ デバイスであって、
・第１開口及び第２開口を備える血小板放出リザーバと、
・当該第１開口のレベル（高さ）に取り付けられ、当該流体を当該リザーバへと注入するように適合されている第１流体接続要素であって、流体を血小板放出リザーバへと注入するための開口部、及び当該開口部に向かって狭窄している部分を備え、注入開口部とリザーバ間の断面の急拡大部分が存在する第１流体接続要素と、
・当該第１開口のレベル（高さ）に取り付けられた第２流体接続要素であって、流体を排出するための開口部を備える、第２流体接続要素と、を備える、デバイス、
－ 第２流体接続要素又は第１流体接続要素により、リザーバと流体連通している流体を圧送するためのデバイス、
－ 圧送デバイスのための電力供給モジュール、並びに、
－ 巨核球細胞の細胞質の伸展部を断片化させるリザーバ内で、当該注入開口部と当該排出開口部との間での流体の連続流れ、及び渦の擾乱を発生させるように設計されている１つ又は複数の血小板放出シークエンスを実践するため、圧送デバイスのための電力供給モジュールを制御するように構成されたプログラミングシステム、
を備えている。
－ デバイスであって、
・第１開口及び第２開口を備える血小板放出リザーバと、
・当該第１開口のレベル（高さ）に取り付けられ、当該流体を当該リザーバへと注入するように適合されている第１流体接続要素であって、流体を血小板放出リザーバへと注入するための開口部、及び当該開口部に向かって狭窄している部分を備え、注入開口部とリザーバ間の断面の急拡大部分が存在する第１流体接続要素と、
・当該第１開口のレベル（高さ）に取り付けられた第２流体接続要素であって、流体を排出するための開口部を備える、第２流体接続要素と、を備える、デバイス、
－ 第２流体接続要素又は第１流体接続要素により、リザーバと流体連通している流体を圧送するためのデバイス、
－ 圧送デバイスのための電力供給モジュール、並びに、
－ 巨核球細胞の細胞質の伸展部を断片化させるリザーバ内で、当該注入開口部と当該排出開口部との間での流体の連続流れ、及び渦の擾乱を発生させるように設計されている１つ又は複数の血小板放出シークエンスを実践するため、圧送デバイスのための電力供給モジュールを制御するように構成されたプログラミングシステム、
を備えている。
【0011】
本発明に従うシステムはしたがって、ピペットにより手動で実施されるピペット操作プロセスを再現するように構成されている。それゆえ、血小板の連続的かつ自動的な放出が可能となる。
【0012】
更に注目すべき点は、本発明が大規模で実践されるという事実である。本発明によるシステムの幾何学的形状により、大容量の流体を高流量（１時間あたり数リットルといった数値）で処理することが可能となる。こうした形状によって、このシステムは工業規模での使用に特に適した状態となる。
【0013】
加えてこのシステムにより、手動でのピペット操作により得られた血小板と少なくとも同等である、巨核球細胞から放出された多数の血小板を得ることが可能であり、このことによってシステムを特に高い血小板放出効率を有する状態とする。これは、システムの要素の形状、すなわち特に第１流体接続要素の円錐形とリザーバの大きい寸法との相乗効果、及び圧送デバイスにより発生した流速に主に起因して達成される。これにより、リザーバ内の巨核球のサイズで渦の擾乱を発生させることが可能となる。
【0014】
一緒に又は別々に取り上げられ得る本発明の様々な特徴によれば、
－ 狭窄部は円錐形であり、
－ 第１接続要素は長手方向軸を含み、第２接続要素は長手方向軸を含み、当該長手方向軸は交差又は平行状態のいずれかであり、したがって非ゼロ距離ｄだけ離され；
－ 注入開口部が１ｍｍ未満の開口直径を有し；
－ リザーバの断面の幅に対する注入開口部の開口径の比が０．０２～０．１であり；
－ リザーバの断面の幅に対する注入開口部の開口径の比が０．０５であり；
－ 排出開口部が１ｍｍ未満の開口径を有し、リザーバの断面の幅に対する排出開口部の開口径の比が０．０２～０．１であり；
－ リザーバの断面の幅に対する排出開口部の開口径の比が０．０５であり：
－ リザーバは球状を有し；
－ システムは、流体の貯蔵用の供給源リザーバを備え、このリザーバは血小板放出用のリザーバを供給するための第１流体接続要素に接続され；
－ システムは、血小板放出用のリザーバから吸引されることを意図されている当該流体を回収するため、第２流体接続要素に接続されている、流体を受容するためのリザーバを備え；
－ 圧送デバイスは受容リザーバ内に配置され；
－ 当該第２接続要素は、圧送デバイスに向かって流体を排出するため、当該開口部から広がっている部分を更に備え；
－ システムは、その他のデバイスを１つ備えるが、当該他のデバイスが、
・第１開口及び第２開口を備える血小板放出リザーバ、
・当該第１開口のレベル（高さ）に取り付けられ、当該リザーバ内部に当該流体を注入するように適合されている第１流体接続要素であって、流体を注入するための開口部、及び流体を蓄積させることが可能であるようにするための第１狭窄部を備え、当該第１狭窄部は、当該注入開口部上に開口している、第１流体接続要素、
・当該第２開口のレベル（高さ）に取り付けられた第２流体接続要素であって、流体を排出するための開口部を備える、第２流体接続要素、を備え、
当該他のデバイスが、第１デバイスに並行して配置され、かつ当該他のデバイスの第２デバイスにより圧送デバイスに接続され、
－ システムは別のデバイスを備え、当該他の（別の）デバイスが、
・第１開口及び第２開口を備える血小板放出リザーバ、
・当該第１開口のレベル（高さ）に取り付けられ、当該リザーバの内部で当該流体を注入するように適合されている第１流体接続要素であって、流体を注入するための開口部、及び流体を加速可能とするために第１狭窄部を備え、当該第１狭窄部が当該注入開口部上に開口している、第１流体接続要素、
・当該第２開口のレベル（高さ）に取り付けられている第２流体接続要素であって、流体を排出するための開口部を備える、第２流体接続要素、を備え、
当該他のデバイスは第１のデバイスと連続して配列されており、当該他のデバイスの当該第２接続要素は、当該他のデバイスの当該第２接続要素が、当該第１デバイスの当該第１流体接続要素と流体連通している。
－ 狭窄部は円錐形であり、
－ 第１接続要素は長手方向軸を含み、第２接続要素は長手方向軸を含み、当該長手方向軸は交差又は平行状態のいずれかであり、したがって非ゼロ距離ｄだけ離され；
－ 注入開口部が１ｍｍ未満の開口直径を有し；
－ リザーバの断面の幅に対する注入開口部の開口径の比が０．０２～０．１であり；
－ リザーバの断面の幅に対する注入開口部の開口径の比が０．０５であり；
－ 排出開口部が１ｍｍ未満の開口径を有し、リザーバの断面の幅に対する排出開口部の開口径の比が０．０２～０．１であり；
－ リザーバの断面の幅に対する排出開口部の開口径の比が０．０５であり：
－ リザーバは球状を有し；
－ システムは、流体の貯蔵用の供給源リザーバを備え、このリザーバは血小板放出用のリザーバを供給するための第１流体接続要素に接続され；
－ システムは、血小板放出用のリザーバから吸引されることを意図されている当該流体を回収するため、第２流体接続要素に接続されている、流体を受容するためのリザーバを備え；
－ 圧送デバイスは受容リザーバ内に配置され；
－ 当該第２接続要素は、圧送デバイスに向かって流体を排出するため、当該開口部から広がっている部分を更に備え；
－ システムは、その他のデバイスを１つ備えるが、当該他のデバイスが、
・第１開口及び第２開口を備える血小板放出リザーバ、
・当該第１開口のレベル（高さ）に取り付けられ、当該リザーバ内部に当該流体を注入するように適合されている第１流体接続要素であって、流体を注入するための開口部、及び流体を蓄積させることが可能であるようにするための第１狭窄部を備え、当該第１狭窄部は、当該注入開口部上に開口している、第１流体接続要素、
・当該第２開口のレベル（高さ）に取り付けられた第２流体接続要素であって、流体を排出するための開口部を備える、第２流体接続要素、を備え、
当該他のデバイスが、第１デバイスに並行して配置され、かつ当該他のデバイスの第２デバイスにより圧送デバイスに接続され、
－ システムは別のデバイスを備え、当該他の（別の）デバイスが、
・第１開口及び第２開口を備える血小板放出リザーバ、
・当該第１開口のレベル（高さ）に取り付けられ、当該リザーバの内部で当該流体を注入するように適合されている第１流体接続要素であって、流体を注入するための開口部、及び流体を加速可能とするために第１狭窄部を備え、当該第１狭窄部が当該注入開口部上に開口している、第１流体接続要素、
・当該第２開口のレベル（高さ）に取り付けられている第２流体接続要素であって、流体を排出するための開口部を備える、第２流体接続要素、を備え、
当該他のデバイスは第１のデバイスと連続して配列されており、当該他のデバイスの当該第２接続要素は、当該他のデバイスの当該第２接続要素が、当該第１デバイスの当該第１流体接続要素と流体連通している。
【0015】
本発明は更に、特に、細胞質の伸展部を含む巨核球細胞を含む流体から血小板を放出するための方法に関し、当該方法が、前述の通りのシステムにより実践され、且つ、以下の工程：（即ち）
（１００）当該流体に懸濁されている巨核球細胞を含む流体を提供する工程であって、当該巨核球細胞が細胞質の伸展部を含む、工程と、
（２００）圧送デバイスに電力供給を行う工程と、
（３００）１つ以上の血小板放出シークエンスを開始させるように、プログラミングシステムを制御する工程と、を含み、
この血小板放出シークエンス又は各血小板放出シークエンスは、巨核球細胞の細胞質の伸展部の断片化を引き起こすように、当該注入開口部と当該排出開口部の間で流体の連続流れを発生させ、リザーバ内部に渦の擾乱を発生させるべく実行される。
（１００）当該流体に懸濁されている巨核球細胞を含む流体を提供する工程であって、当該巨核球細胞が細胞質の伸展部を含む、工程と、
（２００）圧送デバイスに電力供給を行う工程と、
（３００）１つ以上の血小板放出シークエンスを開始させるように、プログラミングシステムを制御する工程と、を含み、
この血小板放出シークエンス又は各血小板放出シークエンスは、巨核球細胞の細胞質の伸展部の断片化を引き起こすように、当該注入開口部と当該排出開口部の間で流体の連続流れを発生させ、リザーバ内部に渦の擾乱を発生させるべく実行される。
【0016】
有利には、工程（２００）中、－１０ｋＰａ～－５０ｋＰａである相対真空がデバイス内に発生する。
【0017】
本発明の更なる目的、特徴及び利点は、添付の図面を参照することで、以下の説明にて更に明確となるだろう。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1a】本発明の第１の実施形態によるシステムの概略図であり、流体用のリザーバは側面図による断面図にて示されている。
【図2a】連続して接続されている多数のデバイスを備える、本発明の第２の実施形態によるシステムの概略図である。
【図2b】連続して接続されている５つのデバイスを備える、本発明によるシステムの分解図を示す。
【図2d】並行して接続されている多数のデバイスを備える、本発明の第３の実施形態による組立体の概略図である。
【図3a】本発明による方法の概略図である。
【図4a】前駆血小板巨核球細胞を示す。
【図4b】本発明による血小板放出方法の後に得られた血小板を示す。
【図5a】ピペットの使用により、及び、当該システム内での相対真空の関数としての、本発明によるシステムの使用により得られた血小板放出の効率を示す比較図である。
【図5b】天然血小板（中空棒）及び培養された血小板（中実棒）に関して、－３０ｋＰａの圧力で得られた血小板の機能性の分析である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
【0020】
問題に挙がっている流体Ｆは、例えば巨核球前駆細胞、巨核球を含む分化の異なる段階の不死化株細胞又は非不死化株細胞から得られた細胞の集団を含有する培地である。巨核球又は巨核球細胞は大きな血球（最大１００μｍであり、培養液中では３０μｍ）であり、成熟時には、細胞質の伸展部又は前駆血小板と呼ばれる長い伸展部を有する。
【0021】
血小板の形成に関与する機構は、未だ多くの研究の主題である。とりわけ、血小板放出は、Ｍｋ巨核球及び／又は細胞質の伸展部Ｃｋを血小板へと断片化するプロセス中に生じる。これは、血流の力に起因して血液中に自然に生じる、高度に強調したインビボプロセスである。巨核球Ｍｋは前駆細胞であるため、極めて重要な役割を担う。ただし、体内の血小板放出のプロセスはほとんど説明されていない状態のままであり、経内皮通過及び血小板の形成における血流の正確な役割について、依然として多くの疑問が存在している。このプロセスは、マイクロ流体システムによりインビトロで再現され、いくつかのインビボ機構は、マイクロ流体実験により実証されることが可能であった。このプロセスはまた、ピペットにより手動で、又は本明細書の導入部分で提示されているデバイスなどによって、インビトロで再現され得る。更にこのプロセスにより、血小板の放出に関与する機構を良好に理解することが可能となる（Ｓｔｒａｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．２０１６）。インビトロでの血小板の産生により、血小板の形成に関与する機構の良好な理解がもたらされる。ただし一般には、血小板の放出の効率はインビボで得られるものよりも低い。本発明により提案されるデバイスにより、システム１を使用する連続運動により交換される、ピペット操作中に発生する往復運動を再現することなく、Ｓｔｒａｓｓｅｌ ｅｔ ａｌにより開示される手動ピペット操作によって血小板放出プロセスを模倣することが可能となる。したがって、本発明は、工業規模での巨核球Ｍｋ及び／又は細胞質の伸展部Ｃｋの断片化プロセスを再現することを目的としており、これにより大容量の流体Ｆ（１時間あたり数リットル）を処理することが可能となる。
【0022】
本発明によるシステム１は、以下のセクションで説明されるであろう、デバイス２、圧送デバイス（ポンプデバイス）６０及びプログラミングシステム７０を備える。
【0023】
デバイス２は、血小板放出のリザーバ１０、第１流体接続要素２０及び第２流体接続要素３０を備える。
【0024】
血小板放出のリザーバ１０（以降、「リザーバ１０」と称する）は、ミリメートル～センチメートルの長手方向寸法を有する。これはすなわち、１ｍｍ～数ｃｍの長手方向寸法である。比較のため、本発明によるシステム１のリザーバ１０の最小寸法は、従来型マイクロ流体システムの最大寸法である。こうすることで、リザーバ１０は公知のマイクロ流体システムより大きなリザーバ及びより大きな許容量となる。
【0025】
図１ａに示される例示的な実施形態では、リザーバ１０は球形形状である。このリザーバ１０は、流体Ｆがその内部で循環可能である空洞１４を区切っている球状壁１２を備える。空洞は、流体Ｆの循環用ゾーンであることに加え、流体Ｆの乱流をもたらす領域である。これはすなわち、少なくとも巨核球Ｍｋのサイズに等しいサイズの渦の擾乱の形成をもたらすということである。言い換えれば、空洞１４は、前述の通り、一方ではその寸法によって、他方ではその内部体積によって、その中で渦の擾乱の形成をもたらすように構成されている。ただし、リザーバ１０は、例えば、平行六面体、円筒形などの任意の他の形状のものであり得る。最も重要なことは、当該リザーバ１０は、渦の擾乱の形成をもたらすのに十分な寸法の空洞１４を備えるということである。例えば、巨核球Ｍｋを含む流体Ｆについて、読者がここまでで確認したように、巨核球Ｍｋのサイズは培養液中で３０μｍに達し得る。それゆえ、この流体Ｆが例えば数百、又は数千の多数の巨核球細胞Ｍｋを含むため、空洞１４は更に大きな寸法（ミリメートル～センチメートル）を有する。
【0026】
壁１２は、少なくとも第１開口１６及び第２開口１８を備える。第１開口１６は、第１接続要素２０との流体接続専用であり、一方で第２開口１８は、第２接続要素３０との流体接続専用である。好ましくは、システム１が閉鎖されることから、これらは壁１２では専用の開口を形成する。
【0027】
第１流体接続要素２０は、流体Ｆをリザーバ１０に供給するための手段である。言い換えれば、これはリザーバ１０内で流体Ｆのための入口である。第１流体接続要素は、リザーバ１０の第１開口１６のレベル（高さ）に取り付けられる。これは、流体の流れの方向に関しては、接続部分２６、狭窄部２４、及び流体の注入の開口部（オリフィス）２２をこの順で備える。それゆえ、狭窄部２４は注入開口部（注入オリフィス）２２上に開口する。こうした理由から、接続部分２６は、以下により良好に理解されるが、必要不可欠なものではないという点に留意されたい。したがって、図１ａに示される例示的な実施形態では、第１流体接続要素２０は接続部分２６により第１開口１６のレベル（高さ）に取り付けられるが、他の構成ではリザーバ１０に取り付けられてもよい。実際に、第１流体接続要素は、注入開口部２２を用いるのと同様に、狭窄部２４によっても非常に容易にとりつけられ得る。後者の構成では、注入開口部２２は壁１２のレベル（高さ）に配置されているが、リザーバの第１開口１６に対応（すなわち、ここに一致）することができることが理解されるだろう。
【0028】
上記で言及したように、部分２４は狭窄している。部分２４は、接続部分２６から、又は代替的には接続部分２６が存在しない際には、流体を注入する開口部２２に向かって第１接続要素２０の終端から狭窄するという点で狭窄している。言い換えれば、部分２４は、当該開口部２２の中心を通過している当該第１接続要素２０の長手方向軸Ｘ１に対する流れの方向で狭窄する。当該部分２４の狭窄形状は、流体Ｆをベンチュリによって加速させることが可能である。付随的に、リザーバ１０に入る流体Ｆはそれゆえに、口広げ加工を有さない部分２４を通りシステム１に入る流体と比較すると速度が高い。
【0029】
有利には、接続部分２６からの狭窄部２４、又は代替的には接続部分２６が存在しない際には、流体を注入する開口部２２に向かう第１接続要素２０の終端からの狭窄部２４は、実質的には連続したものであってもよい。狭窄部の連続により、摩擦を低減することが可能となり、流体の加速度を更に増大させる。この点に関しては、狭窄部２４は円錐形であってもよい。有利には、円錐部２４を使用することで、その多くが市販されている管状（すなわち円筒形）の流体接続手段との接続を容易にする。例として、部分２４はピラミッド形状、四面体形状を有してもよい。最も重要な点として、狭窄部２４は、流体を注入する開口部２２に向かって第１接続要素２０の接続部分２６から狭窄している。この場合、リザーバ１０へと排出されると、この流体Ｆは第１流体接続要素２０、特に注入開口部２２とリザーバ１０との間に存在している断面における差分により、大幅に減速する。
【0030】
実際に、注入開口部２２は有利には、球状型の場合には、リザーバ１０の直径と比較すると、非常に小さいサイズの開口径を有する。ただし、この直径はリザーバ１０に残存している粒子（すなわち、巨核球の断片化から本質的に生じる、血小板Ｐ及び他の生成物Ｄｋ）のサイズ以上である。好ましくは、開口径は１ｍｍ以下であるが、一方では読者が確認してきたように、リザーバ１０はミリメートル～センチメートルの範囲で長手方向寸法を有し、いずれにせよ開口部２２の直径よりもはるかに大きい。この点で、注入開口部２２の形状は制限されていないことに留意されたい。ここで重要な点としては、当該注入開口部２２のサイズである。
【0031】
それゆえ、急激な断面拡大部が注入開口部２２とリザーバ１０の間に存在する。この急激な拡大部は特異点に相当しており、流体Ｆの特異な流れプロファイルの上昇を生じさせる。前述のように、流体Ｆは注入開口部２２を通り狭窄部２４外で加速され、それにより、この特異点に起因して、注入開口部２２からリザーバを通過する際に圧力降下を受ける（すなわち減速する）。リザーバ１０の直径、又はより一般にはリザーバ１０の断面幅に対する注入開口部２２の直径の比率ＲＥが１よりも小さければ小さいほど、特異点はより大きくなり、かつ圧力降下は大きくなる。これは比率が増大する場合には逆もまた同様である。既に実践された本発明によるシステム１の一例は、１６ｍｍと等しい直径を有するリザーバ１０と、０．８ｍｍと等しい直径（それゆえ、ＲＥは０．０５に等しい）を有する注入開口部２２を備える。こうしたシステム１により血小板放出効率の向上が可能となる場合、１ｍｍ未満の開口径を有する注入開口部２２について流体Ｆから血小板を放出するためには、０．０２～０．１のリザーバの断面幅に対する開口部２２の開口径の比率ＲＥもまた想定され得る。有利には、ＲＥは１ｍｍ未満の開口径で０．０４～０．０８である。より有利には、ＲＥは１ｍｍ未満の開口径で０．０４～０．０６である。こうした理由から、更により有利には、ＲＥは０．０５に等しい。事実として、後者の場合では、血小板効率の放出の効率はより良好である。
【0032】
ただし、以下に説明されるように、流体Ｆがリザーバ１０に入る際には減速し、この用語の忠実な意味では（レイノルズ数は、そのサイズがリザーバ１０のサイズに近似する渦中央では０、注入開口部２２のレベル（高さ）では１５００の間で変化する）層流レジームを維持するが、圧送デバイス６０により発生する流体が変位することから、当該リザーバ１０内では不動ではない。それゆえリザーバ１０は、単なる流体Ｆが通る場所に過ぎず、当該流体Ｆを貯蔵する場所、すなわちシステム１の動作時に流体が停滞するような場所ではない。
【0033】
この点に関しては、血小板の放出のリザーバ１０に加え、システム１は、リザーバに供給するため、第１流体接続要素２０に接続されている流体Ｆを貯蔵するための供給源リザーバ４０もまた備えてもよいという点に留意されたい。そのため、流体Ｆは第１要素２０を通過する前に供給源リザーバ４０に貯蔵されてもよいが、これは必須事項ではない。したがって、リザーバ４０は、流れの方向においてシステム１の最上流要素である。
【0034】
加えて、システム１はまた、流体Ｆを受容するリザーバ５０を備えてもよい。流体を受容するリザーバ５０は、リザーバから吸引された当該流体を回収するための第２流体接続要素３０に接続されている。供給源リザーバ４０とは対照的に、受容リザーバ５０は、流れの方向におけるシステム１の最下流要素である。後者の配置は、第２流体接続要素３０に関し、この後に説明されるだろう。
【0035】
それゆえ、リザーバ１０は、システム１が流れの方向においてその上流に供給源リザーバ４０、及びその下流に受容リザーバ５０を備えてもよいという点で、重要であると見なされる。
【0036】
次に、第２流体接続要素３０は、リザーバ１０の外側に流体Ｆを排出するための手段であり、そのため、流体Ｆの出口チャネルを形成する。これは、その終端のうち一方を介して、受容リザーバ５０と流体連通している。加えて、第２流体接続要素は、リザーバの第２開口１８のレベル（高さ）に取り付けられる。これは、流体Ｆの流れの方向において順番に、流体を排出する開口部（オリフィス）３２、排出部３４、及び接続部分３６を備える。第２流体接続要素は、方向は異なっているがリザーバ１０に対する第１流体接続要素と同様であり、同様の構造を有する（例えば、血小板放出のリザーバ１０に対する排出開口部（排出オリフィス）３２のサイズ）。
【0037】
こうした理由から、流れの幾何学的形状はリザーバ１０／排出開口部３２界面では異なっており、これは主に特異点の種類に起因する。注入開口部２２／リザーバ１０界面とは対照的に、直径（又は該当する場合にはリザーバ１０の周囲）が排出開口部３２の直径よりもはるかに大きいことから、特異点は流れの方向での断面の急激な狭窄に存在する。接続リザーバ１０及び排出開口部３２の寸法を考慮した場合、こうした特異点は、リザーバ１０から第２流体接続要素３０まで流体Ｆが通過するにつれ、流体Ｆにより受ける圧力降下を更に増大させる。ただしこれは、以下でより詳細に説明されるように、圧送デバイス６０により発生した流体変位により緩和される。この特異点により、断面の急激な狭窄が流体Ｆにとっての障壁として作用し、この障壁がリザーバから直接ではないにしてもリザーバ１０から速やかに出ることを防止するため、リザーバ１０内部の流体の滞留時間を増大させることが可能となる。こうすることによる直接的な結果は、流体Ｆの滞留時間が増大するにつれ、リザーバ１０内部にて乱流又は渦の擾乱が形成されるのを促進することである。
【0038】
更には、リザーバ１０内部での流体Ｆの滞留時間は、排出開口部３２に対して注入開口部２２をオフセットさせることにより、更に有利には増大可能である。実際に、注入開口部２２及び開口部３２は２本の軸により支えられているが、この平面は傾いている。すなわち、図１ｂの例に示されるように、この平面は水平又は垂直のどちらでもない。この点に関して、図１ｃに示され、図２ｂにて線に囲まれた領域Ｒの拡大図に提示され、かつ上記にて言及されるように、第１接続要素２０は長手方向軸Ｘ１を備える。長手方向軸Ｘ１は、注入開口部２２を通過している第１流体接続要素２０の中心軸である。続いて第２流体接続要素３０は、当該第２流体接続要素３０に対して長手方向軸Ｘ１と同様の方法で配置されている長手方向軸Ｘ２を備える。２本の長手方向軸Ｘ１及びＸ２は交差又は平行状態であってもよい。流体Ｆの滞留時間を増大させ、渦の擾乱を増大させるため、有利には、当該長手方向軸は非ゼロ（の）距離ｄだけ離される。この構成により、リザーバ１０に「気泡が存在しない」状態で充填されることもまた可能となる。実際に、流体Ｆは吸引により注入開口部２２を通って入るが、当該リザーバ１０中に含有されている空気が全て吸い出されると、流体Ｆは排出開口部を通って出る。
【0039】
そのため、排出開口部３２は、長手方向軸Ｘ１及びＸ２に直交する軸Ｙの方向にて、非ゼロ距離ｄだけ注入開口部２２から離される。好ましくは、この距離ｄは３～４ｍｍである。ただし、当該開口部２２、３２は軸Ｙの方向にて距離ｄだけ離されてもよいが、これらは同一平面及び／又は平面ＸＺにて軸Ｘの方向にて距離ｄ´だけ離されても良い。軸Ｚは（図の平面外の）断面の方向にて軸Ｘに直交している。この中で、図１ｃの断面図は、第１開口１６及び第２開口１８、並びに注入開口部２２及び排出開口部３２がそれぞれ、（軸Ｚに直行する）異なる断面中に配置され得ることから誤解される可能性がある。
【0040】
流れの幾何学的形状が前述の特異点によって実質的に変化し、そうすることで要素の形状によりこれが変化する場合には、この形状は流速によっても変化する。デバイス２の要素の形状及び流速はしたがって相乗的に作用し、こうした流れの幾何学的形状を得る。加えて、これにより、公知のデバイスと比較すると効率が向上した状態で、巨核球細胞Ｍｋからの血小板Ｐの連続放出が可能となる。読者らはここより後の部分でこの点に再び戻る。
【0041】
この点に関して、前述にて言及されるように、システム１には圧送デバイス６０が設けられる（図１ｂ参照）。圧送デバイス６０は血小板放出のリザーバ１０と流体連通している。こうすることで、リザーバ１０内に含有されている流体Ｆを移動させることが可能となる。流体の変位はデバイス２内での陥没（降圧）に起因する可能性があるが、後により詳細に確認されるように、流体の排出に起因する可能性も存在する。ここで重要な点としては、流体Ｆは、圧送デバイス６０が存在していない場合に有する速度よりも速い速度で流れ得るという点である。圧送デバイス６０は例えば、真空ポンプ又は一般には、陥没（降圧）若しくはデバイス２内での流体の排出を発生させるのに適合した任意のデバイスである。例えば、圧送デバイス６０はベーンポンプであるが、これは本発明の範囲を限定しようとするものでは決してない。
【0042】
代替的には、圧送デバイス６０は流れの方向において、第１流体接続要素２０、好ましくは供給源リザーバ４０の上流に配置されてもよい。この点に関して、流体移動又はリザーバ４０内での過剰圧力を使う圧送デバイス６０を提供してもよい。この構成では、流体Ｆは所望の流れの方向で排出され、狭窄部２４、注入開口部２２、リザーバ１０及び排出開口部３２を通り連続して流れる。これは、それぞれの特異点から生じる流れの幾何学的形状に適合している。ただし、流体移動圧送デバイス６０（ギアポンプ、蠕動ポンプなど）の使用は、プロセスが開始される前であっても巨核球細胞をほぼ分解させるため、血小板の放出には不利益であり得る。この種類の圧送デバイス６０の使用は、排出型デバイスもまた考えられ得ることから、必須ではない。一般には、流体移動ポンプは例外である可能性があるが、任意の種類の圧送デバイス６０が使用されてもよい。
【0043】
圧送デバイス６０は、第２流体接続要素３０によりリザーバ１０と流体連通することが可能である。好ましくは、第２流体接続要素は受容リザーバ５０内に配置されている。このように配置されることにより、圧送デバイス６０は流体Ｆの流れの方向で第２流体接続要素３０の下流に結果的に配置されている。こうすることで、デバイス２の特異点を最大限活用することが可能となり、リザーバ１０、特にその空洞１４内部に渦の擾乱を形成させるプロセスを向上させる。
【0044】
この点に関して、ここで第２接続要素３０の排出部３４に戻る。有利には、第２接続要素３０は排出開口部３２から広がっていてもよいが、これは必須ではない。こうすることでリザーバ１０内部に渦の擾乱を形成させることが可能である。排出部３４の口広げ加工は、その断面が圧送デバイス６０の方向で（すなわち流れの方向で）流体を排出する開口部３２から拡大しているという事実に起因するという点に留意されたい。排出部３４の口広げ加工により、第２接続要素３０の下流に配置される場合には、圧送デバイス６０が流体をより効率的に移動させることが可能となる。これは単純に、第２接続要素３０が、排出開口部３２と当該第２要素３０のもう一方の終端との間の距離として画定されているその全体の長さにわたって排出開口部３２の断面領域に等しい断面領域を有する場合には、圧送ポンプは効率的ではないことが理由である。実際には、上記で言及されるように、排出開口部３２は最大で１ｍｍの直径を有する。この口広げ加工はしたがって、より効率よい吸引を可能とする以外には重要ではない。
【0045】
システム１は、圧送デバイス６０の電力供給モジュール６２を更に備える。電力供給モジュール６２により、圧送デバイス６０をモータとして作用させ、流体Ｆを移動させることが可能となる。加えて、電力供給モジュール６２により圧送デバイス６０により送達される電力、及び当業者が理解するであろう任意の他の有用なパラメータを調節することが可能となる。更には、好ましくは、圧送デバイス６０によって送達される電力によってシステム１内部での流体Ｆの変位速度を調節可能とし、３７ｍＬ／分～１２０ｍＬ／分以上の流体Ｆの流量を得ることができるように、電力供給モジュール６２は構成されている。ただし、以下で確認されるように、これは流体の流量に影響する唯一のパラメータではない。更には、システム１には、電力供給モジュール６２により送達される電力の関数としてリザーバ１０内部の流体の流量を制御するためのフローメータ（流量計）が装備されてもよい。一例としては、こうしたフローメータは供給源リザーバ４０とリザーバ１０との間に配置され得る。更には、電力供給モジュール６２は、圧送デバイス６０に非常に近接して配置される必要はない。これは取り外され得る。
【0046】
システム１は、巨核球細胞Ｍｋの細胞質の伸展部Ｃｋの断片化を引き起こすため、当該注入開口部２２と当該排出開口部３２との間の流体Ｆの連続流れ、及びリザーバ１０内部での渦の擾乱を発生させるために実行される１つ以上の血小板放出シークエンスを実践するべく、圧送デバイス６０用の電力供給モジュール６２を制御するように構成されたプログラミングシステム７０を更に備える。プログラミングシステム７０は、当該血小板放出シークエンスを実践するためにプログラムを実行するように適合された少なくとも１つ以上のプロセッサを備える。以下で説明されるように、血小板放出シークエンスはその持続期間、数などにおいて変更されてもよい。とはいえ、電力供給モジュール６２は工業用途向けのこういったプログラミングシステム７０により制御され得る一方で、操作者により手動で同様に制御され得るという点に留意されたい。
【0047】
図２ａ～図２ｄを参照すると、本発明の第２実施形態及び第３実施形態では、システム１は、第１のデバイス２に加えて、多数の更なるデバイス２´又は２´´を備える。他のデバイス２´及び２´´は、前述したデバイス２と同一である。点線矢印線は、システムにおける流体Ｆの運動の方向を示す。
【0048】
図２ａ～図２ｃに示される本発明によるシステム１の第２実施形態では、デバイス２は他のデバイス２´に連続して（直列に）接続されている。デバイス２、２´は互いに流体連通している。好ましくは、更なるデバイス２´の数は、デバイス２、２´の総数が１～５台であるように、１～４台である。こうした構成では、非常に有利には、システム１により特異点の数を大幅に増大させ、そうすることで血小板放出の効率を更に向上させることが可能となる。実際に、流体Ｆが別のデバイス２´を通過するたびに血小板放出の効率が増大するように、これはシステム１内部の乱流の数と他のデバイス２´の数とをかけ合わせられる。
【0049】
こうした組立体（アセンブリ）の一実施形態の一例は、図２ｂに示されている。これは、連続して（直列に）取り付けられている５台のデバイス２、２´を備える。リザーバ１０´、開口１６´（開口１８´は対向しており、可視化されていない）は区別されている。リザーバ１０´は、これらが任意の所望の形状の空洞１４を有する妨げとならない立方体形状の外殻を有する。ここではリザーバ１０´は球状である。示されている実施形態では、リザーバ１０´には気泡を脱泡するために煙突９´が設けられている。ただしこれは必須ではない。接続要素２０´、３０´、少なくともそれらのそれぞれの部分２４´、３４´及び開口部２２´、３２´は組立部分に形成されており、これらはリザーバ１０´の両側に配置されている。開口部２２´、３２´は位置合わせされていない。これはすなわち、互いにデバイス２´について、これらの開口部が流体Ｆの流れの方向に互いからオフセットされている。
【0050】
この点に関して、１つ以上のリザーバ１０、１０´、前述の組立要素及び接続要素２０、２０´、３０、３０´は、先行技術に公知の任意の適切な製造方法により製造されてもよいこともまた述べられ得る。この場合では、デバイス２、２´は、３Ｄ印刷により製造され、ねじ留めにより組み立てられた。この点に関して、デバイス２、２´はそれらの組み立てを可能とする連結手段を備えてもよい。好ましくは、これらの連結手段はポリエーテルイミド（ＰＥＩ）樹脂、又は光重合性樹脂（歯科矯正器具で使用されるものなど）から作製されている。好ましくは、これは本発明によるシステム１が使用されることになる国の薬局方に準じる材料である。材料はＡＮＳＭ（Ａｇｅｎｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｓｅｃｕｒｉｔｅ ｄｕ Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ ｅｔ ｄｅｓ Ｐｒｏｄｕｉｔｓ ｄｅ Ｓａｎｔｅ、フランス医薬品規制当局）、ＥＭＡ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ、欧州医薬品庁）、日本のＰＭＤＡ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ａｇｅｎｃｙ、医薬品医療機器総合機構）又はＦＤＡ（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、米国食品医薬品局）及び／又は米国のＵＳＰ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ、米国薬局方）などにより認証され得る。例えば、米国での使用については、デバイスは好ましくはＵＳＰ ＶＩ（ＶＩはＵＳＰクラスを指す）として分類されている生体適合性材料から作製されてもよい。ＵＳＰに基づくクラス試験は、材料の生体適合性を決定するための最も一般的な試験方法の１つである。ＵＳＰには６つのクラスが存在し、ＶＩが最も厳格である。クラスＶＩ試験は、プラスチックから放出される化学物質により生じる有害な反応又は長期身体的影響が存在しないと保証することを意図している。これらの特異性及びデバイス２´が閉鎖しているという事実を理由として、これらは医療用途に特異的な流体の処理に特に良好に適合している。
【0051】
こうした構成はまた、最適に配置されている間、システムの効率を向上させるという点でも有利である。実際に、デバイス２、２´ごとに圧送デバイス６０及び電力供給６２を設ける代わりに、これらの要素は２つ、３つ、又はそれ以上のデバイス２、２´に共有される。実際に、圧送デバイス６０が第１デバイス２の第２流体接続要素３０により当該第１デバイス２と流体連通している間、ここまでで確認されるように、他のデバイス２´は、他のデバイス２´に先行するデバイス２、２´の第１接続要素２０、２０´に直接接続されている。言い換えれば、第１のデバイス２のみが圧送デバイス６０に接続されている。
【0052】
例えば第１のデバイス２に直接接続されている第１の他のデバイス２´を考える。当該第１の他のデバイス２´の第２流体接続要素３０´は、当該第１デバイス２の当該第１流体接続要素２０と流体連通している。好ましくは、この流体連通は直接的である。そのためこれは、第１デバイス２を介して圧送デバイス６０と間接的に流体連通している。ここで、第１の他のデバイス２´と直接接続されている第２の他のデバイス２´を考える。当該第２の他のデバイス２´の第２流体接続要素３０´は、当該第１の他のデバイス２´の当該第１流体接続要素２０´と流体連通している。これはまた、他の連続するデバイス２´にも適用される。
【0053】
他の種類の組立体（すなわち、圧送デバイス６０のデバイス２、２´への接続）は、本発明の発明概念を尊重しつつ、デバイス２、２´を連続して（直列に）接続するように想定され得る。
【0054】
第１の実施形態について確認されているものと同様に、第２の実施形態によるシステム１は、圧送デバイス６０に加えて、圧送デバイス６０用の電力供給モジュール６２及び関連するプログラミングシステム７０を備えるという点に留意されたい。流れの幾何学的形状は、こうしたシステム１では変更されない。事実として、単一デバイス２の回路に陥没（降圧）又は排出が発生する代わりに、流速が全てのデバイス２´に伝播することから、これは維持される。
【0055】
こうすることで、使用される圧送デバイス６０に応じ、吸引力又は排出力に適合させること、より正確には、最も離れたデバイス２´に対して流体の十分な変位が得られるように吸引力又は排出力を増大させることが必要とされ得る。ただし、吸引力又は排出力が過剰に高すぎる場合には、効率は流体流量、それゆえ吸引力又は排出力の定義範囲内でのみ最適であることから、血小板放出の効率は逆に悪影響を受ける可能性がある。したがって、使用される圧送デバイス６０によってシステム１内で一定の圧力を維持することができない場合には、この制約に従い上記の適合を行うことが適切である。現在市場で入手可能な大半の圧送デバイスは、一般にはこうした問題を回避可能である。
【0056】
圧送デバイス６０、電力供給モジュール６２及びプログラミングシステム７０について上記にて言及されているものと同様の方式で、全体のシステム１について、このシステム１が１つのデバイス２、又は該当する場合には多数のデバイス２を備えるかどうかに関わらず、単一の供給源リザーバ４０及び単一の受容リザーバ５０のみを提供することもまた可能である。こうした実施形態は例えば、図２ｃに示されている。この例示的な実施形態において、供給源リザーバ４０及び受容リザーバ５０は可撓性のあるバッグから成る。供給源リザーバ４０は、最も上流にある（すなわち、流体回路にて第１のデバイス２から最も遠く離れている）他のデバイス２´と流体連通している。受容リザーバ５０に関しては、圧送デバイス６０と同様、これは第２流体接続要素３０により第１のデバイス２と流体連通している。有利には、圧送デバイス６０は受容リザーバ５０内に配置され得るということに留意されたい。
【0057】
図２ｄに示される本発明の第３の実施形態では、システム１は平行に（並列に）接続されているデバイス２、２´´を備える。すなわち、第１デバイス２は他のデバイス２´´と平行に（並列に）接続されている。この構成では、デバイス２、２´´は互いに接続されていない。言い換えれば、これらのデバイスは互いに独立している。各デバイス２、２´´はそれゆえ、他のデバイスと独立して動作する。１つ以上のデバイス２´´の好ましい数は限定されていない。デバイス２´´の数が増大すればするほど、処理される流体の量は増大し得る。例えば、平行に（並列に）接続されている３つのデバイス２、２´´を備えるシステム１について、１時間あたり約３リットルの流体Ｆを処理することが可能であり、こうすることで、先行技術で公知であるデバイス以上に考えられ得る利点を本発明にもたらす。この構成により、処理される流体Ｆの体積に準じて操作する際には、デバイス２、２´´の数を適合させることが可能となる。より大きい体積の供給源リザーバ４０が提供され得るが、これは必要とされていない。代替的には、処理される流体を連続して送達するための手段が提供され得る。
【0058】
任意の場合では、図２ｂの代替的な実施形態と同様に、圧送デバイス６０，電力供給モジュール６２及びプログラミングシステム７０は、全てのデバイスについて相互的である。ただしこの場合には、圧送デバイス６０は、１組の接続部により全てのデバイス２、２´´と流体連通している状態に置かれ得る。他の種類の組立体は、本発明の発明概念を尊重しつつ、デバイス２、２´´を平行に（並列に）取り付けるように想定され得る。
【0059】
更には、本発明のシステム１は、本発明の発明概念に重ねて沿うことで、追加的な機能を統合するために適合され得る。例えば、Ｙ字形状を有する管はリザーバ１０の入口に設けられ得る。この管により、確認されるように、渦の擾乱を発生させるように構成されているリザーバ１０内部で２種類の流体Ｆを循環させてこれを混合させる。
【0060】
本発明は更に、細胞質の伸展部Ｃｋを含む巨核球細胞Ｍｋを含む流体Ｆから、血小板Ｐを放出するための方法５に関する。本発明による方法５により、以下のセクションにて詳細に説明されるように、血小板を放出するために巨核球Ｍｋ、及び／又は細胞質の伸展部Ｃｋを断片化させることを可能にする。この点に関して、方法５は、前述の通りシステム１により実践（実施）される。
【0061】
図３ａ及び図３ｂを参照すると、方法５の第１工程１００中に巨核球Ｍｋを含む流体Ｆが提供される。好ましくは、流体Ｆはこの目的のために提供されている供給源リザーバ４０中に貯蔵されている。問題に上がっている流体Ｆは、例えば患者、特に患者の骨髄から採取された流体、又は細胞培養により得られた流体である。任意の場合には、この流体Ｆは巨核球Ｍｋを含み、血小板はこの巨核球Ｍｋから放出され得る。ただし、流体Ｆが何であれ、巨核球Ｍｋが当該流体Ｆ中に懸濁されるという点、及び流体の粘度に応じて巨核球が異なって分布しているという点に留意されたい。
【0062】
処理され得る流体Ｆと、それに付随する、放出され得る血小板の工業的な量を考慮すると、予備的な細胞培養工程は、所望の量の流体Ｆ及び前駆体（すなわち、巨核球）を得る目的で考えられ得る。この細胞培養工程の目的は、巨核球Ｍｋの成熟化及びそれらの増大（すなわち、それらの増殖）を可能とすることである。フランス特許文献ＦＲ第３０３９１６６号は、より詳細に細胞培養プロセスを説明している。
【0063】
例えば、流体Ｆ中に使用されている巨核球Ｍｋは、不死化又は非不死化ＣＤ３４＋前駆細胞に由来する巨核球である。こうした巨核球Ｍｋの前培養工程は、合計で１１～１７日間継続する２つの段階を含み得る。５～９日間継続する第１段階中、巨核球Ｍｋは、例えば以下の薬剤：血清を含まない培地、ＴＰＯを含有するサイトカインカクテル、ＩＬ－６及びＩＬ－９、並びにＡｈＲアンタゴニスト、並びにＬＤＬ（ＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激し、かつ巨核球形成の経路にこの細胞を関与させるように意図された低密度リポタンパク質）を含む混合物と共に培養される。ＡｈＲは有利には、巨核球Ｍｋの成熟化を刺激する。およそ６～８日間継続するこの培養工程の第２段階では、得られた細胞はＳＲ１とトロンボポエチンの混合物、ＴＰＯ、及び任意選択的には第１段階を参照すると上記にて列挙されるような他の薬剤と共に培養される。得られた細胞は巨核球を含むが、これは排他的ではない点に留意されたい。加えて、全ての細胞が巨核球を生じるわけではないという点に留意されたい。これらの段階は所望される細胞の数、使用される薬剤などに応じ、より長い時間又はより短い時間継続し得る。
【0064】
この予備工程は本発明の主題ではなく、かつその一部を形成することもないため、これについて更に説明されることはない。本発明は、流体Ｆから血小板を放出させるための方法を提案することに限定されており、任意の培養工程を含む方法は提案されていない。任意の場合では、この細胞培養段階の終わりに前駆血小板巨核球（すなわち、前駆血小板と共に提供される巨核球）が得られる。これらは、簡略さを目的として、本発明では巨核球Ｍｋと単純に称される。こうした細胞は図４ａに示されている。これらの細胞は、巨核球体から伸展部を形成する前駆血小板を伴い、巨核球体を含む。細胞質の伸展部は微小管のネットワークにより支持されており、将来的に血小板となるものを予め形成するボタン状の血小板にて終結する。工程１００で提供された流体Ｆはこうした前駆血小板巨核球を含む。
【0065】
【0066】
工程２００中、圧送デバイス６０のための電力供給モジュール６２の電力は、吸引力又は排出力を調節するように設定され得る。具体的には、流体Ｆの得られた流量が３７ｍＬ／分～１２０ｍＬ分以上になるように調節されなければならない。本発明によるシステム１のデバイスを作製する材料に応じて、流体流量は著しく増大させることが可能であるという点に留意されたい。これは、本発明による方法で最大の血小板放出効率を得るための最適な流量範囲である。適用される電力は、圧送デバイス６０に使用される材料に本質的に依存している。
【0067】
工程３００中、プログラミングシステム７０は、上記にて定義されるような１つ以上の血小板放出シークエンスを開始させるように制御されている。有利には、プログラミングシステム７０は電力供給モジュール６２を制御することが可能である。このプログラミングシステム７０により、血小板Ｐ放出シークエンスの時間及びその数の全体を制御することもまた可能である。血小板放出シークエンスは、所望の体積の流体を処理するため、ユーザが望む限り継続可能である。
【0068】
前述のセクションで説明されるプログラミングシステム７０が、電力供給された圧送デバイス６２を用いて操作される際には、陥没（降圧）、又は構成によっては排出が１つ以上のデバイス２、２´、２´´中に発生する。「陥没（降圧）」は、１つ以上のデバイス２、２´、２´´における圧力が大気圧よりも低下することを意味しており、これはすなわち、これ／これらが相対真空に供されることを意味している。「排出」は、例えばエジェクタ又はコンプレッサといった排出ポンプにより流体Ｆを移動するといった事実に相当する。この陥没（降圧）又はこの排出の結果として、流体Ｆの連続流れ（すなわち変位）は、システム１内で供給源リザーバ４０から受容リザーバ５０へと生じる。好ましくは、陥没（降圧）、適切である場合には排出速度、及び流体Ｆの流量が実質的に一定の状態に保たれるよう、圧送デバイス６０の吸引力又は排出力もまた、方法５の間は一定に維持されるという点に留意されたい。しかしこの状態は、最適な血小板放出効率を得ることを可能とする制限内で方法を実践している間の電力変化を妨げることがない。
【0069】
１つ以上のシステム２、２´、２´´内で陥没（降圧）又は排出が発生するとすぐ、プログラミングシステム７０における更なる動作なしに、流体は、陥没（降圧）又は排出が維持される限りは連続的に生じる異なる段階（すなわち、３０２、３０４及び３０６）を経由する。これらの段階は、１つ以上のシステム２、２´、２´´における流体変位による直接的な結果である。段階３０２は、流体Ｆがリザーバ１０に入る前の段階に相当し、段階３０４は流体Ｆがリザーバ１０に存在する際の段階に相当し、段階３０６は流体Ｆがリザーバ１０から外に吸い出された後の段階に相当する。言い換えれば、流体Ｆの一部が処理されている際に、同時に流体Ｆの別の部分がリザーバ１０で処理され、別の部分は、流体回路に沿ってリザーバ１０の上流で（すなわち、第１接続要素２０又は供給源リザーバ４０で）処理されることになることから、段階３０２、３０４及び３０６は実際のところは同時に生じる。
【0070】
段階３０２の間、流体Ｆは第１流体接続要素２０を通って吸引される。デバイス内部の圧力は一定に維持されているため、流体Ｆの速度は、当該狭窄部２４の口広げ加工といったほかならぬ事実に起因して、この流体Ｆが狭窄部２４を通過するにつれ増大する。こうすることで流体Ｆは注入開口部２２を介してリザーバ１０へと排出される。注入開口部２２／リザーバ１０界面に存在する急激な断面拡大部に起因する特異点により、流体Ｆがリザーバ１０に入る際に流体Ｆの減速が生じる。
【0071】
段階３０４の間、流体Ｆは、リザーバ１０を通って流れ、空洞１４の制限の範囲内で圧送デバイス６０により発生した陥没（降圧）又は排出を受ける。実際に、開口部２２／リザーバ１０界面に存在している特異点により流体は減速されるものの、この陥没（降圧）又は排出が理由で移動し続けている。流体はリザーバ外部へと直接流れないが、こうすることで、渦の擾乱といった形式で当該流体の循環が可能となる。実際に、システム１は、リザーバ１０の流体Ｆの滞留時間が擾乱を生み出すのに十分であるように構成されている。上記にて説明されるように、排出開口部３２に対する大きいサイズのリザーバ１０の特異点により、十分な滞留時間が得られる。以下にて説明されるように流体Ｆの経路における排出開口部３２に対し、注入開口部２２の位置を有利にはずらすことによって滞留時間もまた増大し得るが、これはわずかな程度である。
【0072】
これらの条件下では、巨核球とおよそ同じサイズの渦の擾乱が作り出される。こうした渦の流れにより、巨核球Ｍｋ及びそれらの細胞質の伸展部Ｃｋ（前駆血小板）を断片化することが可能であり、血小板Ｐの放出を生じさせる。同時に、巨核球の断片化から生じる他の生成物Ｄｋが産生される。これらの生成物は前駆血小板の破片であり、巨核球Ｍｋの無傷の本体、又は細胞質片である。流体Ｆは各血小板放出シークエンスに関して経時的に連続して処理されることから、上記の現象は連続して再現され、血小板は連続して放出される。まとめると、リザーバ１０に入る流体Ｆは細胞質の伸展部を含む巨核球細胞Ｍｋを含むが、リザーバ１０から出る流体Ｆは本質的には血小板Ｐ及び他の生成物Ｄｋを含む。この点に関して、図２ａ～図２ｃに示されるように、連続するデバイス２、２´を備えるシステム１を使用することで、有利には、方法５に従い未だ無処理である巨核球の割合を低減させることが可能となる。流体Ｆがデバイス２´で循環するたびに、この流体Ｆは擾乱を受ける。したがって、単一デバイス２を備えるシステム１と比較すると、連続するシステム１の効率はより高いことは頭に留めておく必要がある。
【0073】
段階３０６の間、巨核球の断片化から生じる血小板Ｐ及び他の生成物を備えた流体Ｆは、排出開口部３２を通って、より一般には第２流体接続要素３０を通って吸引される。こうすることで、流体Ｆは受容リザーバ５０に到達し、もし存在するならば圧送デバイス６０に到達する。
【0074】
工程４００の間、１つ以上のシークエンスは、プログラミングシステム７０を用いて電力供給モジュール６２の電源を切ることにより停止される。
【0075】
これらの段階は、本発明によるシステム１に存在する任意の他のデバイス２´及び／又は２´´で同様に生じる。
【0076】
血小板を放出するために、流体の流量は有利には、３７ｍＬ／分～１２０ｍＬ／分以上でなければならない。これらの流量値は、６度の測定の平均を表す平均値である。図５ａは、本発明による方法を実践することで（灰色の棒）及びピペット（黒色棒）により発生した相対真空の関数として、複数のキャリブレーションチューブ（ＢＤ Ｔｒｕｃｏｕｎ（登録商標）Ｔｕｂｅｓ）、又は５０００本に等しい計数管の、血小板数の放出を示す。相対真空は特に、キロパスカル（ｋＰａ）で表現される。陥没（降圧）又は排出が１つ以上のデバイス２、２´、２´´で一切発生しない際には、血小板放出効率は非常に低い状態を維持する（非常に薄い灰色）。－１０ｋＰａと同等の相対真空では、上記にて言及されるように３７ｍＬ／分の最小値が得られる。こうした相対真空では、血小板放出効率は増大し、放出された血小板の数は５，０００本の管あたり１０，０００個を超える。この血小板放出の効率は、依然として相対的に低い。相対真空が増大するにつれて、血小板放出の効率は増大する。相対真空が－３０ｋＰａと同等の際には、１２０ｍＬ／分である上記に言及された値が得られる。放出された血小板の数は、５，０００本の巨核球管あたり２０，０００個超である。図５ａで示されるように、得られた血小板放出効率は、従来の手動でピペットを使用して得られるものに近く、更に高いこともある。これは、満足のいく放出効率を得るために、システム１に発生する陥没（降圧）又は流体排出の重要性を示している。ここで示されている例示的な実施形態において、相対真空が－３０ｋＰａである場合には、これは－３０ｋＰａ、すなわち最大５０ｋＰａを超えて増大し得る。得られた流体流量は、１２０ｍＬ／分をはるかに上回る。
【0077】
これは、本発明の例示的実施形態で使用される１つ以上のデバイス２、２´、２´´の特性に起因する。実際に、流量を調節するために、圧送デバイス６０の吸引力又は排出力、注入開口部２２のサイズ及び排出開口部３２のサイズ、更には流体Ｆが実際にそこを通って通過する１つ以上のデバイス２、２´、２´´の要素の表面状態との間に妥協点を見出さねばならないが、これは本発明の制限の範囲内である。この最後の態様を考えると、表面状態（ミクロでの表面粗さ、表面粗さなど）が流体Ｆに制約を及ぼす影響が大きくなればなるほど、流体Ｆは減速し、その逆もまたあり得る。より高い血小板放出効率を得るためには、例えば表面状態が調節され得る。これは、流体Ｆがそこを通って流れる１つ以上のデバイス２、２´、２´´の要素を製造するのに用いられる材料を変性させることによって、マイクロメートル規模で構造の制御を可能とする他の製造方法を用いることによって、更には例えば血漿又はアルブミンなどの化合物をチャンバに注ぐことによって、行われ得る。
【0078】
図５ｂは、天然血小板（中空棒）及び培養された血小板（中実棒）に関して、－３０ｋＰａの圧力で得られた血小板の機能性の分析を示す。この相対真空では、およそ８％の天然血小板及びおよそ１０％の不活性化培養された血小板は、糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを発現する。約１２％の天然血小板及び約１６％のＣＲＰ型アゴニスト（コラーゲン関連ペプチド）で活性化された培養血小板は、糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを発現する。最後に、約３０％の天然血小板及び約２２％のＴＲＡＰ型アゴニスト（トロンビン受容体－活性化ペプチド）で活性化された培養血小板は、糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを発現する。本発明による方法により得られた血小板はしたがって、良好に活性化され結果的には機能的である。
【符号の説明】
【0079】
１ システム
２ （第１の）デバイス
２´ 他のデバイス
２´´ 他のデバイス
１０ 血小板放出リザーバ
１６ 第１開口
１８ 第２開口
２０ 第１流体接続要素
２２ 注入開口部（注入オリフィス）
２４ 狭窄部
３０ 第２流体接続要素
３２ 排出開口部（排出オリフィス）
３４ 広がっている部分（排出部）
４０ 供給源リザーバ
５０ 受容リザーバ
６０ 圧送デバイス（ポンプデバイス）
６２ 電力供給モジュール
２ （第１の）デバイス
２´ 他のデバイス
２´´ 他のデバイス
１０ 血小板放出リザーバ
１６ 第１開口
１８ 第２開口
２０ 第１流体接続要素
２２ 注入開口部（注入オリフィス）
２４ 狭窄部
３０ 第２流体接続要素
３２ 排出開口部（排出オリフィス）
３４ 広がっている部分（排出部）
４０ 供給源リザーバ
５０ 受容リザーバ
６０ 圧送デバイス（ポンプデバイス）
６２ 電力供給モジュール
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図3a】
【図3b】
【図4a】
【図4b】
【図5a】
【図5b】
