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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-08
(45)【発行日】2024-11-18
(54)【発明の名称】皮膚表上脂質検体内部標準遺伝子
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20241111BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2023197905
(22)【出願日】2023-11-22
(65)【公開番号】P2024076370
(43)【公開日】2024-06-05
【審査請求日】2024-05-15
(31)【優先権主張番号】P 2022187310
(32)【優先日】2022-11-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】岩村 真恵子
(72)【発明者】
【氏名】上田 優衣
(72)【発明者】
【氏名】桑野 哲矢
(72)【発明者】
【氏名】布施 千絵
(72)【発明者】
【氏名】志摩 恭子
【審査官】斉藤 貴子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２２／２２０２９８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０２１／２２１１３８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１０－５１４４４１（ＪＰ，Ａ）
【文献】BMC Molecular Biology，2008年，9:69
【文献】The Plant Genome，2008年，Vol.1, No.1，pp.44-54
【文献】Fish Physiol. Biochem.，2015年，Vol.41，pp.397-412
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－１／７０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＰＣＲにおいてＡＲＦ１、ＲＰＬ３０及びＦＡＵからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を内部標準遺伝子として用いることを含む、乳幼児の皮膚表上脂質検体における目的遺伝子の発現量を測定する方法。
【請求項2】
目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項3】
被験乳幼児から採取した皮膚表上脂質検体からＲＮＡを抽出すること；
抽出されたＲＮＡを基にして目的遺伝子を増幅すること；
抽出されたＲＮＡを基にして内部標準遺伝子を増幅すること；及び
目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出すること、
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項4】
前記内部標準遺伝子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、請求項１～３のいずれか１項記載の方法に用いられる乳幼児の皮膚表上脂質検体における目的遺伝子の発現量の測定用キット。
【請求項5】
ＡＲＦ１、ＲＰＬ３０及びＦＡＵからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の、ＰＣＲを用いた乳幼児の皮膚表上脂質検体における目的遺伝子の発現量の測定における内部標準遺伝子としての使用。
【請求項6】
前記目的遺伝子の発現量の測定が、目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出することを含む、請求項５記載の使用。
【請求項7】
前記目的遺伝子の発現量の測定が、
被験乳幼児から採取した皮膚表上脂質検体からＲＮＡを抽出すること；
抽出されたＲＮＡを基にして目的遺伝子を増幅すること；
抽出されたＲＮＡを基にして内部標準遺伝子を増幅すること；及び
目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出すること、
を含む、請求項５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、皮膚表上脂質検体内部標準遺伝子及びこれを用いる遺伝子発現量測定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
検体に含まれる目的遺伝子の発現解析には、以前にはノーザンブロット法が用いられていたが、近年では、簡便性に優れ、微量なＤＮＡ又はＲＮＡからでも解析可能なリアルタイムＰＣＲ法に代表されるＰＣＲ法が汎用されている。リアルタイムＰＣＲ法による目的遺伝子の発現量の定量解析にあたっては、大きく分けて絶対定量法及び相対定量法が用いられる。絶対定量法は、コピー数等の絶対量が既知の標準サンプルから検量線を作成し、これを利用して検体中の目的遺伝子の発現量の絶対量を定量する手法である。これに対し、相対定量法は、検体中の目的遺伝子の発現量を内部標準遺伝子の発現量で補正し、目的遺伝子の相対的な発現量を定量する手法である。
【0003】
内部標準遺伝子は、組織間や実験系により発現量が変動しない遺伝子であることが重要であり、一般的にはＧＡＰＤＨやＡＣＴＢといったハウスキーピング遺伝子が用いられる。しかしながら、ハウスキーピング遺伝子であっても、組織によって発現が変動し、内部標準遺伝子として機能し得ない場合があることが報告されている（非特許文献１及び２）。
【0004】
表皮角化細胞を用いた研究においては、ＧＡＰＤＨ、１Ｂ１５、ＲＰＬＰ０、ａｃｔｉｎ、ｔｕｂｕｌｉｎをはじめとするハウスキーピング遺伝子が内部標準遺伝子として利用されてきたが、ＲＰＬＰ０は内部標準遺伝子として有用であるものの、全てのハウスキーピング遺伝子が内部標準遺伝子として適しているわけではないことが報告されている（非特許文献３）。
一方、特許文献１には、皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）に被験体の皮膚細胞に由来するＲＮＡが含まれていること、ＳＳＬに含まれるＲＮＡが生体の遺伝子発現解析用の試料として有用であること、ＳＳＬから表皮、汗腺、毛包及び皮脂腺のマーカー遺伝子が検出できることが記載されている。しかし、ＳＳＬを用いた遺伝子発現解析における適切な内部標準遺伝子については明らかになっていない。
一方、特許文献１には、皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）に被験体の皮膚細胞に由来するＲＮＡが含まれていること、ＳＳＬに含まれるＲＮＡが生体の遺伝子発現解析用の試料として有用であること、ＳＳＬから表皮、汗腺、毛包及び皮脂腺のマーカー遺伝子が検出できることが記載されている。しかし、ＳＳＬを用いた遺伝子発現解析における適切な内部標準遺伝子については明らかになっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】国際公開公報第２０１８／００８３１９号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】Journal of Investigative Dermatology, 2009, 129(3):535-537
【文献】Acta Biochem Biophys Sin, 2014, 46(4):330-337
【文献】Journal of Investigative Dermatology, 2009, 129(3):770-773
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、乳幼児のＳＳＬに含まれる目的遺伝子の発現量をより正確に測定するための内部標準遺伝子と、該内部標準遺伝子を用いる乳幼児のＳＳＬに含まれる目的遺伝子の発現量の測定方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、乳幼児のＳＳＬ検体の網羅的遺伝子発現データを分析することにより、検体間の発現変動が小さい３０遺伝子を見出し、該遺伝子が定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）における内部標準遺伝子として優れていることを見出した。
【0009】
すなわち、本発明は、以下の（１）～（３）に係るものである。
（１）ＰＣＲにおいて下記表１に示される遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を内部標準遺伝子として用いることを含む、乳幼児のＳＳＬ検体に含まれる目的遺伝子の発現量を測定する方法。
（２）前記内部標準遺伝子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、（１）の方法に用いられる乳幼児のＳＳＬ検体に含まれる目的遺伝子の発現量の測定用キット。
（３）下記表１に示される遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の、ＰＣＲを用いた乳幼児のＳＳＬ検体に含まれる目的遺伝子の発現量の測定における内部標準遺伝子としての使用。
（１）ＰＣＲにおいて下記表１に示される遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を内部標準遺伝子として用いることを含む、乳幼児のＳＳＬ検体に含まれる目的遺伝子の発現量を測定する方法。
（２）前記内部標準遺伝子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、（１）の方法に用いられる乳幼児のＳＳＬ検体に含まれる目的遺伝子の発現量の測定用キット。
（３）下記表１に示される遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の、ＰＣＲを用いた乳幼児のＳＳＬ検体に含まれる目的遺伝子の発現量の測定における内部標準遺伝子としての使用。
【発明の効果】
【0010】
本発明の内部標準遺伝子は、乳幼児のＳＳＬ検体間における発現変動が小さく、特に一般的に内部標準遺伝子として使用される公知のハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ及びＡＣＴＢと比較して発現変動が小さい。ｑＰＣＲにおける内部標準遺伝子として該内部標準遺伝子を用いることで、乳幼児のＳＳＬに含まれる目的遺伝子の発現量をより正確に測定することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【0012】
本明細書において、「核酸」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」と云う用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれ、ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎｏｎ-ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
【0013】
本明細書において、「遺伝子」とは、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡの他、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、当該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片を包含するものであって、ＤＮＡを構成する塩基の配列情報の中に、何らかの生物学的情報が含まれているものを意味する。
また、当該「遺伝子」は特定の塩基配列で表される「遺伝子」だけではなく、これらの同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型等の変異体、及び誘導体をコードする核酸が包含される。
本明細書中に開示される遺伝子の名称（Ｇｅｎｅ Ｓｙｍｂｏｌ）及びＧｅｎｅ ＩＤは、ＮＣＢＩ（[www.ncbi.nlm.nih.gov/]）に記載のあるＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｙｍｂｏｌ及びＧｅｎｅ ＩＤに従う。
また、当該「遺伝子」は特定の塩基配列で表される「遺伝子」だけではなく、これらの同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型等の変異体、及び誘導体をコードする核酸が包含される。
本明細書中に開示される遺伝子の名称（Ｇｅｎｅ Ｓｙｍｂｏｌ）及びＧｅｎｅ ＩＤは、ＮＣＢＩ（[www.ncbi.nlm.nih.gov/]）に記載のあるＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｙｍｂｏｌ及びＧｅｎｅ ＩＤに従う。
【0014】
本明細書において、「内部標準遺伝子」とは、内在性コントロール遺伝子やリファレンス遺伝子ともいい、遺伝子発現解析において目的遺伝子の発現量の補正（標準化）の基準となる遺伝子のことを意味する。「補正」は、典型的には、目的遺伝子の発現量を内部標準遺伝子の発現量で割ることにより為される。「発現量」又は「量」は、発現の絶対量及び他の遺伝子の発現量等に対する相対発現量を包含する。
また、本明細書において、「ハウスキーピング遺伝子」とは、細胞の維持や増殖に不可欠な遺伝子であって、多くの組織や細胞に共通して一定量発現する遺伝子のことを意味する。一般的なハウスキーピング遺伝子としては、例えば、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ等が知られている（Genome Analysis, 2003, 19(7):362-365参照）。
また、本明細書において、「ハウスキーピング遺伝子」とは、細胞の維持や増殖に不可欠な遺伝子であって、多くの組織や細胞に共通して一定量発現する遺伝子のことを意味する。一般的なハウスキーピング遺伝子としては、例えば、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ等が知られている（Genome Analysis, 2003, 19(7):362-365参照）。
【0015】
本明細書において、「乳幼児」とは、広義には第２次性徴が開始する前の「小児」、具体的には１５歳以下の小児を含めた概念であり、好ましくは小学校就学前の小児・乳幼児、具体的には０歳から６歳までの乳幼児を指し、より好ましくは０～６９か月齢の乳幼児を指す。
【0016】
本明細書において、「皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。ＳＳＬは、皮膚細胞で発現したＲＮＡを含む（前記特許文献１参照）。本明細書において、被験乳幼児から採取したＳＳＬをＳＳＬ検体ともいう。
【0017】
本明細書において、「皮膚」とは、特に限定しない限り、角層、表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺などの組織を含む領域の総称である。
【0018】
本発明の表１に示される３０種の遺伝子は、後述する実施例に示すように、被験乳幼児間でＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量の変動が小さいことが見出された遺伝子である。
【0019】
【表1】
【0020】
表１に示される３０遺伝子は、乳幼児男女２６１名の被験者のＳＳＬから抽出されたＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）を基に、正規化手法としてＲＬＥ法を用いて、遺伝子検出率が７０％以上の遺伝子を解析対象として発現量のデータを正規化した結果、安定発現を認めた遺伝子である。発現安定性の評価には、ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅを指標として使用した。「ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅ」とは、分布の平均値からの測定値のずれを示し、測定値と分布の平均値の差を分布の標準偏差で割ることで算出される変動係数（ＣＶ）を標準化して得られる値（Ｚ－ｓｃｏｒｅ）であり、ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅの値が小さい程、遺伝子発現のバラつきが小さいことを示している（ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅ自体の平均値は０、標準偏差は１である）。本発明では、ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅを発現安定性の評価指標とし、これが－１．８７４以下の遺伝子を安定発現している遺伝子と判定した。上記３０遺伝子は、後記の実施例に示すように、一般的に内部標準遺伝子として好適とされる公知のハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ（ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅ：－１．８１３）及びＡＣＴＢ（ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅ：－１．８７４）、さらに表皮角化細胞の遺伝子発現解析における内部標準遺伝子として好適なＲＰＬＰ０（ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅ：－１．８５９）と比較して、ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅが同等かそれよりも小さく、ＳＳＬにおいて安定発現していることが確認された。
したがって、斯かる３０遺伝子からなる群より選択される遺伝子は、乳幼児のＳＳＬに含まれる目的遺伝子の発現量を測定する際の、ｑＰＣＲにおける内部標準遺伝子（以下、本発明の内部標準遺伝子ともいう）として使用できる。内部標準遺伝子としては、いずれか１遺伝子を単独で用いてもよいし、２以上の遺伝子を組み合わせて用いてもよい。
したがって、斯かる３０遺伝子からなる群より選択される遺伝子は、乳幼児のＳＳＬに含まれる目的遺伝子の発現量を測定する際の、ｑＰＣＲにおける内部標準遺伝子（以下、本発明の内部標準遺伝子ともいう）として使用できる。内部標準遺伝子としては、いずれか１遺伝子を単独で用いてもよいし、２以上の遺伝子を組み合わせて用いてもよい。
【0021】
本発明の内部標準遺伝子は、好ましくはＰＣＢＰ２、ＲＰＬ３０、ＡＲＰＣ２、ＵＢＡ５２、ＲＡＢ７Ａ、ＲＡＣ１、ＡＲＬ８Ｂ、ＲＰＬ３２、ＰＣＢＰ１、ＢＺＷ１、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＲＰＳ８、ＦＡＵ、ＲＰＬ４、ＥＥＦ１Ｇ、及びＡＲＦ１の１６遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子であり、より好ましくはＡＲＦ１、ＲＰＬ３０及びＦＡＵより選択される少なくとも１種の遺伝子であり、さらに好ましくはＡＲＦ１又はＲＰＬ３０であり、よりさらに好ましくはＡＲＦ１である。
【0022】
また、上記３０遺伝子のうち、ＰＣＢＰ２、ＲＰＬ３０、ＵＢＡ５２、ＲＡＢ７Ａ、ＡＲＬ８Ｂ、ＰＣＢＰ１、ＢＺＷ１、ＲＰＳ８、ＲＰＬ４、ＥＥＦ１Ｇ、ＦＴＬ、ＲＰＬ１２、ＣＬＩＣ１、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１、ＰＳＡＰ、及びＣＤ６３の１６遺伝子は、これまでにハウスキーピング遺伝子であるとの報告がない遺伝子であり、内部標準遺伝子として機能し得ることは全く意外であった。よって、一実施形態において、本発明の内部標準遺伝子は、好ましくは上記１６遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子であり、より好ましくはＰＣＢＰ２、ＲＰＬ３０、ＵＢＡ５２、ＲＡＢ７Ａ、ＡＲＬ８Ｂ、ＰＣＢＰ１、ＢＺＷ１、ＲＰＳ８、ＲＰＬ４、及びＥＥＦ１Ｇの１０遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子であり、さらに好ましくはＲＰＬ３０である。
【0023】
なお、本発明の内部標準遺伝子には、遺伝子発現解析における内部標準となり得る限り、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子も包含される。ここで、実質的に同一の塩基配列とは、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴを用い、期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３の条件にて検索をした場合、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性があることを意味する。
【0024】
本発明の内部標準遺伝子は、乳幼児のＳＳＬ検体に含まれる目的遺伝子の発現量の測定方法（以下、本発明の方法ともいう）に好適に用いられる。一実施形態において、本発明の方法は、乳幼児のＳＳＬ検体について、目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出することを含む。好ましい一実施形態において、本発明の方法は、乳幼児のＳＳＬ検体について、目的遺伝子を増幅すること、内部標準遺伝子を増幅すること、及び目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出することを含む。より好ましい一実施形態において、本発明の方法は、被験乳幼児から採取したＳＳＬ検体からＲＮＡを抽出すること、抽出されたＲＮＡを基にして目的遺伝子を増幅すること、抽出されたＲＮＡを基にして内部標準遺伝子を増幅すること、及び目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出することを含む。
【0025】
本発明において、目的遺伝子は、特に限定されず、乳幼児のＳＳＬ検体に含まれ得る遺伝子であればよく、１種であっても２種以上であってもよい。
【0026】
被験乳幼児の皮膚からのＳＳＬの採取には、皮膚からのＳＳＬの回収又は除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するＳＳＬ吸収性素材、ＳＳＬ接着性素材、又は皮膚からＳＳＬをこすり落とす器具を使用することができる。ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材としては、ＳＳＬに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのＳＳＬの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へＳＳＬを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へＳＳＬを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりＳＳＬをこすり落として回収する方法、等が挙げられる。ＳＳＬの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたＳＳＬ吸収性素材を用いてもよい。一方、ＳＳＬ吸収性素材は、水溶性の高い溶媒や水分を含んでいるとＳＳＬの吸着が阻害されるため、水溶性の高い溶媒や水分の含有量が少ないことが好ましい。ＳＳＬ吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。ＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、特に限定されず、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚が挙げられ、皮脂の分泌が多い部位、例えば顔の皮膚が好ましい。
【0027】
被験乳幼児から採取されたＲＮＡ含有ＳＳＬ検体は、直ちに後述のＲＮＡ抽出工程に用いられてもよく、又は、一定期間保存されてもよい。採取されたＳＳＬ検体は、含有するＲＮＡの分解を極力抑えるために、採取後できるだけ速やかに低温条件で保存することが好ましい。本発明における該ＲＮＡ含有ＳＳＬの保存の温度条件は、０℃以下であればよく、好ましくは－２０±２０℃～－８０±２０℃、より好ましくは－２０±１０℃～－８０±１０℃、さらに好ましくは－２０±２０℃～－４０±２０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃～－４０±１０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃、さらに好ましくは－２０±５℃である。該ＲＮＡ含有ＳＳＬ検体の該低温条件での保存の期間は、特に限定されないが、好ましくは１２ヶ月以下、例えば６時間以上１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、例えば１日間以上６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下、例えば３日間以上３ヶ月以下である。
【0028】
本発明の方法においては、好ましい態様として、乳幼児のＳＳＬ検体に含まれるＲＮＡを抽出し、逆転写によりｃＤＮＡに変換し、該ｃＤＮＡを鋳型として目的遺伝子及び内部標準遺伝子をＰＣＲで増幅した後、その増幅産物が測定される。
ＳＳＬからのＲＮＡの抽出には、生体試料からのＲＮＡの抽出又は精製に通常使用される方法、例えば、フェノール/クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）等のカラムを用いた方法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、ＩＳＯＧＥＮ等の市販のＲＮＡ抽出試薬による抽出等を用いることができる。
ＳＳＬからのＲＮＡの抽出には、生体試料からのＲＮＡの抽出又は精製に通常使用される方法、例えば、フェノール/クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）等のカラムを用いた方法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、ＩＳＯＧＥＮ等の市販のＲＮＡ抽出試薬による抽出等を用いることができる。
【0029】
該逆転写には、解析したい特定のＲＮＡを標的としたプライマーを用いてもよいが、より包括的な核酸の保存及び解析のためにはランダムプライマーを用いることが好ましい。該逆転写には、一般的な逆転写酵素又は逆転写試薬キットを使用することができる。好適には、正確性及び効率性の高い逆転写酵素又は逆転写試薬キットが用いられ、その例としては、Ｍ－ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びその改変体、あるいは市販の逆転写酵素又は逆転写試薬キット、例えばＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（タカラバイオ社）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられる。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が好ましく用いられる。
該逆転写における伸長反応は、温度を好ましくは４２℃±１℃、より好ましくは４２℃±０．５℃、さらに好ましくは４２℃±０．２５℃に調整し、一方、反応時間を好ましくは６０分間以上、より好ましくは８０～１２０分間に調整するのが好ましい。
該逆転写における伸長反応は、温度を好ましくは４２℃±１℃、より好ましくは４２℃±０．５℃、さらに好ましくは４２℃±０．２５℃に調整し、一方、反応時間を好ましくは６０分間以上、より好ましくは８０～１２０分間に調整するのが好ましい。
【0030】
逆転写で得られたｃＤＮＡを鋳型とした目的遺伝子又は内部標準遺伝子の増幅は、当該分野で通常用いられるＰＣＲの手順に従って実施することができる。ＰＣＲの手法としては、ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ（定量ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ；ｑＰＣＲ）ともいう）、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ等が挙げられる。
ここで、逆転写によるｃＤＮＡ合成（ＲＴ）及びＰＣＲは、１ステップで行ってもよく、２ステップで行ってもよく、目的に応じていずれかを適宜選択すればよい。１ステップＲＴ－ＰＣＲは、単一チューブ内でＲＴ及びＰＣＲの一連の反応を連続的に行うもので、簡便性に優れ、ＲＴとＰＣＲの操作間のコンタミネーションを防止することができる。一方、２ステップＲＴ－ＰＣＲでは、ＲＴにランダムプライマーを使用することができるため、単一のＲＮＡ検体から複数の目的遺伝子の発現量を測定することができる。ＲＴ－ＰＣＲにおけるＰＣＲとしては、上記のＰＣＲと同様のものが挙げられる。
ここで、逆転写によるｃＤＮＡ合成（ＲＴ）及びＰＣＲは、１ステップで行ってもよく、２ステップで行ってもよく、目的に応じていずれかを適宜選択すればよい。１ステップＲＴ－ＰＣＲは、単一チューブ内でＲＴ及びＰＣＲの一連の反応を連続的に行うもので、簡便性に優れ、ＲＴとＰＣＲの操作間のコンタミネーションを防止することができる。一方、２ステップＲＴ－ＰＣＲでは、ＲＴにランダムプライマーを使用することができるため、単一のＲＮＡ検体から複数の目的遺伝子の発現量を測定することができる。ＲＴ－ＰＣＲにおけるＰＣＲとしては、上記のＰＣＲと同様のものが挙げられる。
【0031】
ＰＣＲでは、解析したい特定のＤＮＡを標的としたプライマーペアを用いて該特定のＤＮＡのみを増幅してもよいが、複数のプライマーペアを用いて複数のＤＮＡを同時に増幅してもよい。複数のＤＮＡを同時に増幅する手法としては、マルチプレックスＰＣＲ及びマルチプレックスリアルタイムＰＣＲが挙げられる。鋳型ＤＮＡ量の誤差を抑制してより正確に発現量を測定できる点で、目的遺伝子及び内部標準遺伝子を同時に増幅するマルチプレックス解析を行うことが好ましい。かかるマルチプレックス解析は、市販のキット（例えば、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズジャパン株式会社等）を用いて実施することができる。
増幅産物の検出には、増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、予めＲＩ、蛍光物質等で標識しておいたプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法等を用いることができる。
増幅産物の検出には、増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、予めＲＩ、蛍光物質等で標識しておいたプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法等を用いることができる。
【0032】
本発明においては、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の手法として、ＰＣＲの増幅産物量をリアルタイムでモニターし解析するリアルタイムＰＣＲ又はマルチプレックスリアルタイムＰＣＲを用いるのが、迅速性、簡便性及び定量性の点から好ましい。リアルタイムＰＣＲ又はマルチプレックスリアルタイムＰＣＲにおける増幅産物の検出法としては、当該分野で通常用いられる方法、例えば、インターカレーター法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法等が挙げられる。
【0033】
インターカレーター法は、二本鎖ＤＮＡに入り込むことで蛍光を発する物質（インターカレーター、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標） ＧｒｅｅｎＩ等）をＰＣＲ反応系に共存させ、増幅産物の生成に伴って増加する蛍光を検出することで増幅産物量をモニターする方法である。
【0034】
ＴａｑＭａｎプローブ法は、５’末端を蛍光物質（ＦＡＭ等）で、３’末端をクエンチャー物質（ＴＡＭＲＡ等）で修飾した標的配列特異的なオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）をＰＣＲ反応系に共存させる方法である。該方法では、ＴａｑＭａｎプローブがＰＣＲ反応のアニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、この状態では、プローブ上にクエンチャー物質が存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。次いで、伸長反応ステップのときに、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのもつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが分解されると、蛍光物質がプローブから遊離し、クエンチャー物質による抑制が解除されて蛍光を発する。該蛍光を検出することで増幅産物量をモニターすることができる。
【0035】
ＰＣＲの条件は、特に限定されず、ＰＣＲ毎に最適条件を定めればよいが、例えば、以下の条件が挙げられる。
１）２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの熱変性：温度は好ましくは９４～９９℃で、時間は１０～６０秒間である。
２）アニーリング：温度は、通常５０℃以上、好ましくは５２℃以上、より好ましくは５５℃以上であり、通常６５℃以下、好ましくは６３℃以下、より好ましくは６０℃以下である。また、通常５０～６５℃、好ましくは５２～６３℃、より好ましくは５５～６０℃である。時間は、通常５秒以上、好ましくは１０秒以上であり、通常２分以下、好ましくは１分以下である。また、通常５秒～２分、好ましくは１０秒～１分である。
３）ＤＮＡ伸長反応：温度は、通常６５℃以上、好ましくは６８℃以上であり、通常７４℃以下、好ましくは７２℃以下である。また、通常６５～７４℃程度、好ましくは６８～７２℃である。時間は、通常５秒以上、好ましくは１０秒以上であり、通常２分以下、好ましくは１分以下である。また、通常５秒～２分、好ましくは１０秒～１分である。
ここで、アニーリングとＤＮＡ伸長反応は分けずに同時に行うことも可能である。
上記１）～３）の反応を１サイクルとして、これを通常３０サイクル以上、好ましくは３５サイクル以上、また、通常５０サイクル以下、好ましくは４５サイクル以下で行えばよい。
上記のような温度及び時間での逆転写及びＰＣＲは、一般的にＰＣＲに使用されるサーマルサイクラー又はサーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化したリアルタイムＰＣＲ専用の装置を用いて行うことができる。
１）２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの熱変性：温度は好ましくは９４～９９℃で、時間は１０～６０秒間である。
２）アニーリング：温度は、通常５０℃以上、好ましくは５２℃以上、より好ましくは５５℃以上であり、通常６５℃以下、好ましくは６３℃以下、より好ましくは６０℃以下である。また、通常５０～６５℃、好ましくは５２～６３℃、より好ましくは５５～６０℃である。時間は、通常５秒以上、好ましくは１０秒以上であり、通常２分以下、好ましくは１分以下である。また、通常５秒～２分、好ましくは１０秒～１分である。
３）ＤＮＡ伸長反応：温度は、通常６５℃以上、好ましくは６８℃以上であり、通常７４℃以下、好ましくは７２℃以下である。また、通常６５～７４℃程度、好ましくは６８～７２℃である。時間は、通常５秒以上、好ましくは１０秒以上であり、通常２分以下、好ましくは１分以下である。また、通常５秒～２分、好ましくは１０秒～１分である。
ここで、アニーリングとＤＮＡ伸長反応は分けずに同時に行うことも可能である。
上記１）～３）の反応を１サイクルとして、これを通常３０サイクル以上、好ましくは３５サイクル以上、また、通常５０サイクル以下、好ましくは４５サイクル以下で行えばよい。
上記のような温度及び時間での逆転写及びＰＣＲは、一般的にＰＣＲに使用されるサーマルサイクラー又はサーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化したリアルタイムＰＣＲ専用の装置を用いて行うことができる。
【0036】
ＰＣＲの増幅産物の鎖長は、ＰＣＲの増幅時間の短縮等の要素を勘案して適宜選択することができる。例えば、ＰＣＲ増幅産物の鎖長は、１０００ｂｐ以下が好ましく、７００ｂｐ以下がより好ましく、５００ｂｐ以下がさらに好ましい。一方、ＰＣＲ増幅産物の鎖長は、ＰＣＲにおける非特異的ハイブリダイズを避けられる１５塩基付近のプライマーを使用する場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長である３０～４０ｂｐが下限となり、５０ｂｐ以上が好ましく、１００ｂｐ以上がより好ましい。また、ＰＣＲ増幅産物の鎖長は、３０～１０００ｂｐが好ましく、５０～７００ｂｐがより好ましく、１００～５００ｂｐがさらに好ましい。
【0037】
上記の測定に用いられるプローブ又はプライマー、すなわち、目的遺伝子、内部標準遺伝子、又はそれらに由来する核酸を特異的に認識し増幅するためのプライマー、又は該目的遺伝子、内部標準遺伝子、又はそれらに由来する核酸を特異的に検出するためのプローブがこれに該当するが、これらは、該目的遺伝子又は内部標準遺伝子を構成する塩基配列に基づいて設計することができる。ここで「特異的に認識する」とは、例えばＲＴ－ＰＣＲ法において、実質的に目的遺伝子、内部標準遺伝子又はそれに由来する核酸のみが増幅される如く、該検出物又は生成物が該遺伝子又はそれに由来する核酸であると判断できることを意味する。
具体的には、本発明の目的遺伝子又は内部標準遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ又はその相補鎖に相補的な一定数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、当該一定数の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の塩基配列上の同一性を有すればよい。塩基配列の同一性は、前記ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、本発明の目的遺伝子又は内部標準遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
なお、ここで、「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、通常標識したものが用いられる。
具体的には、本発明の目的遺伝子又は内部標準遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ又はその相補鎖に相補的な一定数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、当該一定数の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の塩基配列上の同一性を有すればよい。塩基配列の同一性は、前記ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、本発明の目的遺伝子又は内部標準遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
なお、ここで、「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、通常標識したものが用いられる。
【0038】
ＰＣＲの鋳型ＤＮＡ量が微量である場合や標的配列に類似する配列が多い場合には、ネステッドＰＣＲにより増幅産物の収率及び特異性を高めることができる。ネステッドＰＣＲでは、第１のプライマーペアを用いて１ラウンド目のＰＣＲを行い、標的配列を増幅し、次いで増幅産物を鋳型として第１のプライマーペアによる増幅領域の内側に設計された第２のプライマーペアを用いて２ラウンド目のＰＣＲを行い、増幅産物を得ることができる。定量性の点から、２ラウンドのＰＣＲのうち少なくとも２ラウンド目のＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲ又はマルチプレックスリアルタイムＰＣＲとするのが好ましい。
【0039】
斯くして、乳幼児のＳＳＬ検体から抽出されたＲＮＡを基にして、目的遺伝子及び内部標準遺伝子が増幅され、該増幅産物に基づいて目的遺伝子の発現量が算出される。目的遺伝子の発現量は、当該分野で通常用いられる相対定量法に従って算出することができる。該相対定量法としては、例えば、目的遺伝子の増幅産物と内部標準遺伝子の増幅産物を電気泳動に供し、ゲル上のバンドの濃さを比較して、内部標準遺伝子に対する目的遺伝子の相対発現量を算出する手法、リアルタイムＰＣＲの相対定量の手法として公知の検量線法、－ΔＣｔ法、ΔΔＣｔ法（比較Ｃｔ法）等が挙げられる。相対定量法のうち、検量線が不要である点で－ΔＣｔ法又はΔΔＣｔ法が好ましい。
【0040】
相対定量の手法として検量線法を用いる場合は、例えば、下記のように相対定量を行えばよい。まず、標準サンプルの希釈系列を調製し、これを鋳型として目的遺伝子及び内部標準遺伝子のそれぞれをＰＣＲで増幅し、Ｃｔ値を求める。ここで、Ｃｔ値とは、ＰＣＲの増幅産物量が一定量に達するときのサイクル数（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）を意味する。ＰＣＲでは、理論的には１サイクルごとに増幅産物が２倍ずつ増えるため、標準サンプルの濃度と決定したＣｔ値をプロットすると、両者は直線で表される関係となり、これを検量線として用いることができる。次いで、検体についても、同条件下でＰＣＲを行い、Ｃｔ値を求め、この値と検量線から、検体中の目的遺伝子及び内部標準遺伝子の定量結果を得る。さらに、目的遺伝子の定量結果を内部標準遺伝子の定量結果で割ることで、目的遺伝子の発現量を内部標準遺伝子の発現量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出する。目的遺伝子の発現量は、検体間の発現量の差を把握しやすいように、ある検体の結果を１とした場合の相対量として表してもよい。
【0041】
相対定量の手法として－ΔＣｔ法を用いる場合は、例えば、下記のように相対定量を行えばよい。まず、検体Ａ中の目的遺伝子及び内部標準遺伝子のそれぞれをＰＣＲで増幅し、Ｃｔ値を求め、目的遺伝子のＣｔ値と内部標準遺伝子のＣｔ値の差（ΔＣｔ）を算出する。ここで、ΔＣｔは、目的遺伝子の定量結果を内部標準遺伝子の定量結果で補正した値である。比較対象の検体Ｂについても、同条件下でＰＣＲを行い、Ｃｔ値及びΔＣｔを求める。次いで、得られたΔＣｔを、式（２-ΔCt）に代入し、算出された相対発現量に基づき、検体ＡとＢの間の発現量の比較を行う。
【0042】
相対定量の手法としてΔΔＣｔ法を用いる場合は、例えば、下記のように相対定量を行えばよい。まず、検体Ａ中の目的遺伝子及び内部標準遺伝子のそれぞれをＰＣＲで増幅し、Ｃｔ値を求め、目的遺伝子のＣｔ値と内部標準遺伝子のＣｔ値の差（ΔＣｔ）を算出する。ここで、ΔＣｔは、目的遺伝子の定量結果を内部標準遺伝子の定量結果で補正した値である。比較対象の検体Ｂについても、同条件下でＰＣＲを行い、Ｃｔ値及びΔＣｔを求める。次いで、検体ＡのΔＣｔと検体ＢのΔＣｔの差（ΔΔＣｔ）を求める。ここで、ΔΔＣｔは、検体間の目的遺伝子の発現量の差を反映する値である。さらに、得られたΔΔＣｔを、式（２-ΔΔCt）に代入する。ここで得られる値は、検体Ａにおける目的遺伝子の発現量が検体Ｂにおける目的遺伝子の発現量より何倍発現が高いか又は低いかを示す。すなわち、検体Ａの目的遺伝子の発現量は、検体Ｂにおける発現量を１とした場合の相対量として表される。
【0043】
本発明の方法に用いられる乳幼児のＳＳＬ検体に含まれる目的遺伝子の発現量の測定用キットは、被験乳幼児から採取したＳＳＬにおける本発明の内部標準遺伝子の発現量を測定するための検査試薬を含有するものである。具体的には、本発明の内部標準遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的に結合（ハイブリダイズ）するオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ用のプライマー又はプローブ）を含む、核酸増幅、ハイブリダイゼーションのための試薬等が挙げられる。当該キットに包含されるオリゴヌクレオチドは、上述したとおり公知の方法により得ることができる。
また、当該キットには、上記核酸の他、検量線作成用標準サンプル、ＲＴ試薬、ＰＣＲ試薬、標識試薬、緩衝液や、試験に必要な器具やコントロール、ＳＳＬを採取するための用具（例えば、ＳＳＬを採取するための脂取りフィルムなど）、採取したＳＳＬを保存するための試薬、保存用の容器、採取したＳＳＬからＲＮＡを抽出・精製するための試薬等を含むことができる。
また、当該キットには、上記核酸の他、検量線作成用標準サンプル、ＲＴ試薬、ＰＣＲ試薬、標識試薬、緩衝液や、試験に必要な器具やコントロール、ＳＳＬを採取するための用具（例えば、ＳＳＬを採取するための脂取りフィルムなど）、採取したＳＳＬを保存するための試薬、保存用の容器、採取したＳＳＬからＲＮＡを抽出・精製するための試薬等を含むことができる。
【0044】
上述した実施形態に関し、本発明においてはさらに以下の態様が開示される。
＜１＞ＰＣＲにおいて下記表２に示される遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を内部標準遺伝子として用いることを含む、乳幼児の皮膚表上脂質検体に含まれる目的遺伝子の発現量を測定する方法。
＜１＞ＰＣＲにおいて下記表２に示される遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を内部標準遺伝子として用いることを含む、乳幼児の皮膚表上脂質検体に含まれる目的遺伝子の発現量を測定する方法。
【0045】
【表2】
【0046】
＜２＞目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出すること、をさらに含む、＜１＞の方法。
＜３＞目的遺伝子を増幅すること；
内部標準遺伝子を増幅すること；及び
目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出すること、をさらに含む、＜１＞の方法。
＜４＞被験乳幼児から採取した皮膚表上脂質検体からＲＮＡを抽出すること；
抽出されたＲＮＡを基にして目的遺伝子を増幅すること；
抽出されたＲＮＡを基にして内部標準遺伝子を増幅すること；及び
目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出すること、をさらに含む、＜１＞の方法。
＜５＞被験乳幼児から採取した皮膚表上脂質検体からＲＮＡを抽出すること；
抽出されたＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成すること；
得られたｃＤＮＡを鋳型として目的遺伝子を増幅すること；
得られたｃＤＮＡを鋳型として内部標準遺伝子を増幅すること；及び
目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出すること、をさらに含む、＜１＞の方法。
＜６＞前記内部標準遺伝子が好ましくはＰＣＢＰ２、ＲＰＬ３０、ＡＲＰＣ２、ＵＢＡ５２、ＲＡＢ７Ａ、ＲＡＣ１、ＡＲＬ８Ｂ、ＲＰＬ３２、ＰＣＢＰ１、ＢＺＷ１、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＲＰＳ８、ＦＡＵ、ＲＰＬ４、ＥＥＦ１Ｇ、及びＡＲＦ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子、より好ましくはＡＲＦ１、ＲＰＬ３０及びＦＡＵより選択される少なくとも１種の遺伝子であり、さらに好ましくはＡＲＦ１又はＲＰＬ３０であり、よりさらに好ましくはＡＲＦ１である、＜１＞～＜５＞のいずれかの方法。
＜７＞前記内部標準遺伝子が好ましくはＰＣＢＰ２、ＲＰＬ３０、ＵＢＡ５２、ＲＡＢ７Ａ、ＡＲＬ８Ｂ、ＰＣＢＰ１、ＢＺＷ１、ＲＰＳ８、ＲＰＬ４、ＥＥＦ１Ｇ、ＦＴＬ、ＲＰＬ１２、ＣＬＩＣ１、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１、ＰＳＡＰ、及びＣＤ６３からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子、より好ましくはＰＣＢＰ２、ＲＰＬ３０、ＵＢＡ５２、ＲＡＢ７Ａ、ＡＲＬ８Ｂ、ＰＣＢＰ１、ＢＺＷ１、ＲＰＳ８、ＲＰＬ４、及びＥＥＦ１Ｇからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子であり、さらに好ましくはＲＰＬ３０である、＜１＞～＜５＞のいずれかの方法。
＜８＞前記目的遺伝子及び前記内部標準遺伝子をｑＰＣＲにより、好ましくはマルチプレックスｑＰＣＲにより増幅するものである、＜１＞～＜７＞のいずれかの方法。
＜９＞前記内部標準遺伝子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、＜１＞～＜８＞のいずれかの方法に用いられる乳幼児の皮膚表上脂質検体に含まれる目的遺伝子の発現量の測定用キット。
＜３＞目的遺伝子を増幅すること；
内部標準遺伝子を増幅すること；及び
目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出すること、をさらに含む、＜１＞の方法。
＜４＞被験乳幼児から採取した皮膚表上脂質検体からＲＮＡを抽出すること；
抽出されたＲＮＡを基にして目的遺伝子を増幅すること；
抽出されたＲＮＡを基にして内部標準遺伝子を増幅すること；及び
目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出すること、をさらに含む、＜１＞の方法。
＜５＞被験乳幼児から採取した皮膚表上脂質検体からＲＮＡを抽出すること；
抽出されたＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成すること；
得られたｃＤＮＡを鋳型として目的遺伝子を増幅すること；
得られたｃＤＮＡを鋳型として内部標準遺伝子を増幅すること；及び
目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出すること、をさらに含む、＜１＞の方法。
＜６＞前記内部標準遺伝子が好ましくはＰＣＢＰ２、ＲＰＬ３０、ＡＲＰＣ２、ＵＢＡ５２、ＲＡＢ７Ａ、ＲＡＣ１、ＡＲＬ８Ｂ、ＲＰＬ３２、ＰＣＢＰ１、ＢＺＷ１、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＲＰＳ８、ＦＡＵ、ＲＰＬ４、ＥＥＦ１Ｇ、及びＡＲＦ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子、より好ましくはＡＲＦ１、ＲＰＬ３０及びＦＡＵより選択される少なくとも１種の遺伝子であり、さらに好ましくはＡＲＦ１又はＲＰＬ３０であり、よりさらに好ましくはＡＲＦ１である、＜１＞～＜５＞のいずれかの方法。
＜７＞前記内部標準遺伝子が好ましくはＰＣＢＰ２、ＲＰＬ３０、ＵＢＡ５２、ＲＡＢ７Ａ、ＡＲＬ８Ｂ、ＰＣＢＰ１、ＢＺＷ１、ＲＰＳ８、ＲＰＬ４、ＥＥＦ１Ｇ、ＦＴＬ、ＲＰＬ１２、ＣＬＩＣ１、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１、ＰＳＡＰ、及びＣＤ６３からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子、より好ましくはＰＣＢＰ２、ＲＰＬ３０、ＵＢＡ５２、ＲＡＢ７Ａ、ＡＲＬ８Ｂ、ＰＣＢＰ１、ＢＺＷ１、ＲＰＳ８、ＲＰＬ４、及びＥＥＦ１Ｇからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子であり、さらに好ましくはＲＰＬ３０である、＜１＞～＜５＞のいずれかの方法。
＜８＞前記目的遺伝子及び前記内部標準遺伝子をｑＰＣＲにより、好ましくはマルチプレックスｑＰＣＲにより増幅するものである、＜１＞～＜７＞のいずれかの方法。
＜９＞前記内部標準遺伝子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、＜１＞～＜８＞のいずれかの方法に用いられる乳幼児の皮膚表上脂質検体に含まれる目的遺伝子の発現量の測定用キット。
【0047】
＜１０＞前記表２に示される遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の、ＰＣＲを用いた乳幼児の皮膚表上脂質検体に含まれる目的遺伝子の発現量の測定における内部標準遺伝子としての使用。
＜１１＞前記目的遺伝子の発現量の測定が、目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出すること、をさらに含む、＜１０＞の使用。
＜１２＞前記目的遺伝子の発現量の測定が、
目的遺伝子を増幅すること；
内部標準遺伝子を増幅すること；及び
目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出すること、をさらに含む、＜１０＞の使用。
＜１３＞前記目的遺伝子の発現量の測定が、
被験乳幼児から採取した皮膚表上脂質検体からＲＮＡを抽出すること；
抽出されたＲＮＡを基にして目的遺伝子を増幅すること；
抽出されたＲＮＡを基にして内部標準遺伝子を増幅すること；及び
目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出すること、をさらに含む、＜１０＞の使用。
＜１４＞前記目的遺伝子の発現量の測定が、
被験乳幼児から採取した皮膚表上脂質検体からＲＮＡを抽出すること；
抽出されたＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成すること；
得られたｃＤＮＡを鋳型として目的遺伝子を増幅すること；
得られたｃＤＮＡを鋳型として内部標準遺伝子を増幅すること；及び
目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出すること、をさらに含む、＜１０＞の使用。
＜１５＞前記内部標準遺伝子が好ましくはＰＣＢＰ２、ＲＰＬ３０、ＡＲＰＣ２、ＵＢＡ５２、ＲＡＢ７Ａ、ＲＡＣ１、ＡＲＬ８Ｂ、ＲＰＬ３２、ＰＣＢＰ１、ＢＺＷ１、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＲＰＳ８、ＦＡＵ、ＲＰＬ４、ＥＥＦ１Ｇ、及びＡＲＦ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子、より好ましくはＡＲＦ１、ＲＰＬ３０及びＦＡＵより選択される少なくとも１種の遺伝子であり、さらに好ましくはＡＲＦ１又はＲＰＬ３０であり、よりさらに好ましくはＡＲＦ１である、＜１０＞～＜１４＞のいずれかの使用。
＜１６＞前記内部標準遺伝子が好ましくはＰＣＢＰ２、ＲＰＬ３０、ＵＢＡ５２、ＲＡＢ７Ａ、ＡＲＬ８Ｂ、ＰＣＢＰ１、ＢＺＷ１、ＲＰＳ８、ＲＰＬ４、ＥＥＦ１Ｇ、ＦＴＬ、ＲＰＬ１２、ＣＬＩＣ１、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１、ＰＳＡＰ、及びＣＤ６３からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子、より好ましくはＰＣＢＰ２、ＲＰＬ３０、ＵＢＡ５２、ＲＡＢ７Ａ、ＡＲＬ８Ｂ、ＰＣＢＰ１、ＢＺＷ１、ＲＰＳ８、ＲＰＬ４、及びＥＥＦ１Ｇからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子であり、さらに好ましくはＲＰＬ３０である、＜１０＞～＜１４＞のいずれかの使用。
＜１７＞前記目的遺伝子及び前記内部標準遺伝子をｑＰＣＲにより、好ましくはマルチプレックスｑＰＣＲにより増幅するものである、＜１０＞～＜１６＞のいずれかの使用。
＜１１＞前記目的遺伝子の発現量の測定が、目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出すること、をさらに含む、＜１０＞の使用。
＜１２＞前記目的遺伝子の発現量の測定が、
目的遺伝子を増幅すること；
内部標準遺伝子を増幅すること；及び
目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出すること、をさらに含む、＜１０＞の使用。
＜１３＞前記目的遺伝子の発現量の測定が、
被験乳幼児から採取した皮膚表上脂質検体からＲＮＡを抽出すること；
抽出されたＲＮＡを基にして目的遺伝子を増幅すること；
抽出されたＲＮＡを基にして内部標準遺伝子を増幅すること；及び
目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出すること、をさらに含む、＜１０＞の使用。
＜１４＞前記目的遺伝子の発現量の測定が、
被験乳幼児から採取した皮膚表上脂質検体からＲＮＡを抽出すること；
抽出されたＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成すること；
得られたｃＤＮＡを鋳型として目的遺伝子を増幅すること；
得られたｃＤＮＡを鋳型として内部標準遺伝子を増幅すること；及び
目的遺伝子の増幅産物の量を内部標準遺伝子の増幅産物の量で補正し、目的遺伝子の発現量を算出すること、をさらに含む、＜１０＞の使用。
＜１５＞前記内部標準遺伝子が好ましくはＰＣＢＰ２、ＲＰＬ３０、ＡＲＰＣ２、ＵＢＡ５２、ＲＡＢ７Ａ、ＲＡＣ１、ＡＲＬ８Ｂ、ＲＰＬ３２、ＰＣＢＰ１、ＢＺＷ１、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＲＰＳ８、ＦＡＵ、ＲＰＬ４、ＥＥＦ１Ｇ、及びＡＲＦ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子、より好ましくはＡＲＦ１、ＲＰＬ３０及びＦＡＵより選択される少なくとも１種の遺伝子であり、さらに好ましくはＡＲＦ１又はＲＰＬ３０であり、よりさらに好ましくはＡＲＦ１である、＜１０＞～＜１４＞のいずれかの使用。
＜１６＞前記内部標準遺伝子が好ましくはＰＣＢＰ２、ＲＰＬ３０、ＵＢＡ５２、ＲＡＢ７Ａ、ＡＲＬ８Ｂ、ＰＣＢＰ１、ＢＺＷ１、ＲＰＳ８、ＲＰＬ４、ＥＥＦ１Ｇ、ＦＴＬ、ＲＰＬ１２、ＣＬＩＣ１、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１、ＰＳＡＰ、及びＣＤ６３からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子、より好ましくはＰＣＢＰ２、ＲＰＬ３０、ＵＢＡ５２、ＲＡＢ７Ａ、ＡＲＬ８Ｂ、ＰＣＢＰ１、ＢＺＷ１、ＲＰＳ８、ＲＰＬ４、及びＥＥＦ１Ｇからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子であり、さらに好ましくはＲＰＬ３０である、＜１０＞～＜１４＞のいずれかの使用。
＜１７＞前記目的遺伝子及び前記内部標準遺伝子をｑＰＣＲにより、好ましくはマルチプレックスｑＰＣＲにより増幅するものである、＜１０＞～＜１６＞のいずれかの使用。
【実施例】
【0048】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0049】
実施例１ ＳＳＬの採取、ＲＮＡ抽出、及び網羅的遺伝子発現解析
１）被験者
乳幼児男女２６１名（０～６９か月齢）を被験者とした。
２）ＳＳＬの採取
あぶらとりフィルム（５．０ｃｍ×８．０ｃｍ、３Ｍ社）を用いて、被験者の顔全体から皮膚表上脂質（ＳＳＬ）を採取した。皮脂のクロスコンタミネーションを防ぐ為、被験者ごとに採取者のラボグローブは交換した。皮脂を採取したあぶらとりフィルムはただちに１ｇのモレキュラーシーブスを含むＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅの遠沈管（ＡＧＣテクノグラス、遠沈管Ｍｉｎｉ ２５ｍＬ）、或いは１ｇのモレキュラーシーブスを含む５ｍＬチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ ５ｍＬ，ＰＣＲ ｃｌｅａｎ）に入れ、ドライアイス上あるいは－２０℃に静置し、その後－８０℃にて保管した。
３）ＲＮＡ抽出及びシーケンシング
上記２）の皮脂を採取したあぶらとりフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを元に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。
得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、ライブラリーを調製した。
調製したライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。シーケンシングで得られた各リード配列をヒトゲノムのリファレンス配列であるｈｇ１９ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ＥＲＣＣ ｖ１に対して遺伝子マッピングすることで、各リード配列の由来する遺伝子を決定した。
１）被験者
乳幼児男女２６１名（０～６９か月齢）を被験者とした。
２）ＳＳＬの採取
あぶらとりフィルム（５．０ｃｍ×８．０ｃｍ、３Ｍ社）を用いて、被験者の顔全体から皮膚表上脂質（ＳＳＬ）を採取した。皮脂のクロスコンタミネーションを防ぐ為、被験者ごとに採取者のラボグローブは交換した。皮脂を採取したあぶらとりフィルムはただちに１ｇのモレキュラーシーブスを含むＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅの遠沈管（ＡＧＣテクノグラス、遠沈管Ｍｉｎｉ ２５ｍＬ）、或いは１ｇのモレキュラーシーブスを含む５ｍＬチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ ５ｍＬ，ＰＣＲ ｃｌｅａｎ）に入れ、ドライアイス上あるいは－２０℃に静置し、その後－８０℃にて保管した。
３）ＲＮＡ抽出及びシーケンシング
上記２）の皮脂を採取したあぶらとりフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを元に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。
得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、ライブラリーを調製した。
調製したライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。シーケンシングで得られた各リード配列をヒトゲノムのリファレンス配列であるｈｇ１９ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ＥＲＣＣ ｖ１に対して遺伝子マッピングすることで、各リード配列の由来する遺伝子を決定した。
【0050】
実施例２ 内部標準遺伝子の同定
実施例１で得られたデータを基に、以下の解析を行った。
検出率７０％以上の遺伝子を解析対象とし（Ｇｅｎｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）、ＲＬＥ法にて正規化を行った。ＲＬＥ法は、Ｓｉｚｅ ｆａｃｔｏｒと呼ばれる係数を計算し、この係数を利用して各サンプルのリードカウントデータを正規化する手法である。正規化後の補正データにおいて一定割合の安定発現を認める遺伝子を選抜した。遺伝子の発現安定性は、ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅを利用して評価した。補正データにおいて、ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅが－１以下であるより発現安定性が高い遺伝子を抽出した結果、１６３６種の遺伝子が抽出された。これらＣＶ Ｚ－Ｓｃｏｒｅ≦－１を認める遺伝子は、解析対象遺伝子のうち発現変動の小さい上位１８．８８％に該当していた。一般的に内部標準遺伝子として使用されるＧＡＰＤＨ及びＡＣＴＢのＣＶ Ｚ－Ｓｃｏｒｅは、ＧＡＰＤＨ＝－１．８１３、ＡＣＴＢ＝－１．８７４であった。また、表皮角化細胞の遺伝子発現解析における内部標準遺伝子として好適とされるＲＰＬＰ０のＣＶ Ｚ－Ｓｃｏｒｅは、－１．８５９であった。
そこで発現安定性が高い前記のＣＶ Ｚ－Ｓｃｏｒｅ≦－１の遺伝子のうち、ＡＣＴＢと比較して、ＣＶ Ｚ－Ｓｃｏｒｅが同等かそれよりも小さく、安定的に発現している遺伝子をさらに選抜し、計３０種の遺伝子を同定した（表３）。表中、ハウスキーピング遺伝子として報告があるものに＊印を付す（Genome Analysis, 2003, 19(7):362-365参照)。
該３０種の遺伝子は、乳幼児のＳＳＬ由来のＲＮＡにおいてより安定的に発現している遺伝子であり、乳幼児のＳＳＬを解析対象試料としてその遺伝子発現を解析する場合において内部標準遺伝子として使用可能であることが示された。
実施例１で得られたデータを基に、以下の解析を行った。
検出率７０％以上の遺伝子を解析対象とし（Ｇｅｎｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）、ＲＬＥ法にて正規化を行った。ＲＬＥ法は、Ｓｉｚｅ ｆａｃｔｏｒと呼ばれる係数を計算し、この係数を利用して各サンプルのリードカウントデータを正規化する手法である。正規化後の補正データにおいて一定割合の安定発現を認める遺伝子を選抜した。遺伝子の発現安定性は、ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅを利用して評価した。補正データにおいて、ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅが－１以下であるより発現安定性が高い遺伝子を抽出した結果、１６３６種の遺伝子が抽出された。これらＣＶ Ｚ－Ｓｃｏｒｅ≦－１を認める遺伝子は、解析対象遺伝子のうち発現変動の小さい上位１８．８８％に該当していた。一般的に内部標準遺伝子として使用されるＧＡＰＤＨ及びＡＣＴＢのＣＶ Ｚ－Ｓｃｏｒｅは、ＧＡＰＤＨ＝－１．８１３、ＡＣＴＢ＝－１．８７４であった。また、表皮角化細胞の遺伝子発現解析における内部標準遺伝子として好適とされるＲＰＬＰ０のＣＶ Ｚ－Ｓｃｏｒｅは、－１．８５９であった。
そこで発現安定性が高い前記のＣＶ Ｚ－Ｓｃｏｒｅ≦－１の遺伝子のうち、ＡＣＴＢと比較して、ＣＶ Ｚ－Ｓｃｏｒｅが同等かそれよりも小さく、安定的に発現している遺伝子をさらに選抜し、計３０種の遺伝子を同定した（表３）。表中、ハウスキーピング遺伝子として報告があるものに＊印を付す（Genome Analysis, 2003, 19(7):362-365参照)。
該３０種の遺伝子は、乳幼児のＳＳＬ由来のＲＮＡにおいてより安定的に発現している遺伝子であり、乳幼児のＳＳＬを解析対象試料としてその遺伝子発現を解析する場合において内部標準遺伝子として使用可能であることが示された。
【0051】
【表3】
【0052】
実施例３ リアルタイムＰＣＲデータとＮＧＳデータの相関性の確認１
１５名の乳幼児（３～８か月齢）から皮脂を採取し、ＲＮＡ抽出及び精製を行った。ＳＳＬ－ＲＮＡとＲＴ Ｍｉｘとを混合し逆転写を行い、得られた逆転写反応物からマルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した（１ｓｔ ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ、Iｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ）。Ａｍｐｕｒｅ ＸＰを利用し、得られた１ｓｔ ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ産物を精製した。得られた精製産物を次世代シーケンサー解析用とリアルタイムＰＣＲ測定用とに分割した。片方の精製産物は、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、次世代シーケンサー解析により網羅的遺伝子発現情報を取得し、ＮＧＳデータとした。分割したもう一方の１ｓｔ ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ精製産物は、リアルタイムＰＣＲ測定のテンプレートとし、１ｓｔ ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ増幅領域の内側に設計したプライマー（ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）を用いて、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。１５サンプルそれぞれについて、目的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）として選定した１４種の遺伝子及び内部標準遺伝子（ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｅｎｅ）としてＡＲＦ１のＣｔ値を取得した。Ｃｔ値の差分（ΔＣｔ値；ΔＣｔ＝Ｃｔ＿target gene－Ｃｔ＿control gene）を算出し、ｑＰＣＲデータとした。１４種の目的遺伝子に関して、ｑＰＣＲデータとＮＧＳデータ（Ｌｏｇ2（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ＋１））間のデータ相関性を確認した結果、有意に正相関しており（Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ｒａｎｋ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ＝０．７８０、ｐ－ｖａｌｕｅ＜０．０１）、ＡＲＦ１補正で算出したｑＰＣＲデータがＮＧＳデータと同等であることが確認された。
１５名の乳幼児（３～８か月齢）から皮脂を採取し、ＲＮＡ抽出及び精製を行った。ＳＳＬ－ＲＮＡとＲＴ Ｍｉｘとを混合し逆転写を行い、得られた逆転写反応物からマルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した（１ｓｔ ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ、Iｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ）。Ａｍｐｕｒｅ ＸＰを利用し、得られた１ｓｔ ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ産物を精製した。得られた精製産物を次世代シーケンサー解析用とリアルタイムＰＣＲ測定用とに分割した。片方の精製産物は、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、次世代シーケンサー解析により網羅的遺伝子発現情報を取得し、ＮＧＳデータとした。分割したもう一方の１ｓｔ ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ精製産物は、リアルタイムＰＣＲ測定のテンプレートとし、１ｓｔ ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ増幅領域の内側に設計したプライマー（ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）を用いて、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。１５サンプルそれぞれについて、目的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）として選定した１４種の遺伝子及び内部標準遺伝子（ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｅｎｅ）としてＡＲＦ１のＣｔ値を取得した。Ｃｔ値の差分（ΔＣｔ値；ΔＣｔ＝Ｃｔ＿target gene－Ｃｔ＿control gene）を算出し、ｑＰＣＲデータとした。１４種の目的遺伝子に関して、ｑＰＣＲデータとＮＧＳデータ（Ｌｏｇ2（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ＋１））間のデータ相関性を確認した結果、有意に正相関しており（Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ｒａｎｋ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ＝０．７８０、ｐ－ｖａｌｕｅ＜０．０１）、ＡＲＦ１補正で算出したｑＰＣＲデータがＮＧＳデータと同等であることが確認された。
【0053】
実施例４ リアルタイムＰＣＲデータとＮＧＳデータの相関性の確認２
１６名の乳幼児（３～２４か月齢）から皮脂を採取し、ＲＮＡ抽出及び精製を行った。ＳＳＬ－ＲＮＡとＲＴ Ｍｉｘとを混合し逆転写を行い、得られた逆転写反応物からマルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した（１ｓｔ ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ、Iｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ）。Ａｍｐｕｒｅ ＸＰを利用し、得られた１ｓｔ ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ産物を精製した。得られた精製産物を次世代シーケンサー解析用とリアルタイムＰＣＲ測定用とに分割した。片方の精製産物は、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、次世代シーケンサー解析により網羅的遺伝子発現情報を取得し、ＮＧＳデータとした。分割したもう一方の１ｓｔ ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ精製産物は、リアルタイムＰＣＲ測定のテンプレートとし、１ｓｔ ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ増幅領域の内側に設計したプライマー（ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）を用いて、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。１６サンプルそれぞれについて、目的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）として選定した１４種の遺伝子及び内部標準遺伝子（ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｅｎｅ）として６種の遺伝子(ＡＲＦ１、ＦＡＵ、ＲＰＬ３０、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＲＰＬＰ０)のＣｔ値を取得した。６種の内部標準遺伝子それぞれについて、Ｃｔ値の差分（ΔＣｔ値：Ｃｔ＿target gene―Ｃｔ＿control gene）を算出し、ｑＰＣＲデータ（以下、ΔＡＲＦ１、ΔＦＡＵ、ΔＲＰＬ３０、ΔＧＡＰＤＨ、ΔＡＣＴＢ、ΔＲＰＬＰ０と記す）とした。１４種の目的遺伝子に関して、ｑＰＣＲデータとＮＧＳデータ（Ｌｏｇ２（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ＋１））間のデータ相関性を確認した。下記表４に示すように、本発明のＳＳＬ内部標準遺伝子として選抜されたＡＲＦ１（ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅ＝―１．９００）、ＦＡＵ（ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅ＝―１．９０５）、ＲＰＬ３０（ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅ＝―１．９６０）を内部標準として用いたｑＰＣＲデータ(ΔＡＲＦ１、ΔＦＡＵ、ΔＲＰＬ３０)は、一般的に内部標準遺伝子として利用されているＧＡＰＤＨ（ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅ＝―１．８１３）やＡＣＴＢ（ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅ＝―１．８７４）、表皮角化細胞の遺伝子発現解析における内部標準遺伝子として好適とされるＰＲＬＰ０（ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅ＝―１．８５９）を内部標準としたｑＰＣＲデータ(ΔＧＡＰＤＨ、ΔＡＣＴＢ、ΔＲＰＬＰ０)と比較して、目的遺伝子のＰＣＲ定量データ全体の相関性が向上しており、乳幼児の皮膚表上脂質検体に含まれる目的遺伝子の発現量を測定する場合において、内部標準遺伝子としてより優れていることが確認された。
１６名の乳幼児（３～２４か月齢）から皮脂を採取し、ＲＮＡ抽出及び精製を行った。ＳＳＬ－ＲＮＡとＲＴ Ｍｉｘとを混合し逆転写を行い、得られた逆転写反応物からマルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した（１ｓｔ ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ、Iｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ）。Ａｍｐｕｒｅ ＸＰを利用し、得られた１ｓｔ ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ産物を精製した。得られた精製産物を次世代シーケンサー解析用とリアルタイムＰＣＲ測定用とに分割した。片方の精製産物は、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、次世代シーケンサー解析により網羅的遺伝子発現情報を取得し、ＮＧＳデータとした。分割したもう一方の１ｓｔ ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ精製産物は、リアルタイムＰＣＲ測定のテンプレートとし、１ｓｔ ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ増幅領域の内側に設計したプライマー（ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）を用いて、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。１６サンプルそれぞれについて、目的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）として選定した１４種の遺伝子及び内部標準遺伝子（ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｅｎｅ）として６種の遺伝子(ＡＲＦ１、ＦＡＵ、ＲＰＬ３０、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＲＰＬＰ０)のＣｔ値を取得した。６種の内部標準遺伝子それぞれについて、Ｃｔ値の差分（ΔＣｔ値：Ｃｔ＿target gene―Ｃｔ＿control gene）を算出し、ｑＰＣＲデータ（以下、ΔＡＲＦ１、ΔＦＡＵ、ΔＲＰＬ３０、ΔＧＡＰＤＨ、ΔＡＣＴＢ、ΔＲＰＬＰ０と記す）とした。１４種の目的遺伝子に関して、ｑＰＣＲデータとＮＧＳデータ（Ｌｏｇ２（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ＋１））間のデータ相関性を確認した。下記表４に示すように、本発明のＳＳＬ内部標準遺伝子として選抜されたＡＲＦ１（ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅ＝―１．９００）、ＦＡＵ（ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅ＝―１．９０５）、ＲＰＬ３０（ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅ＝―１．９６０）を内部標準として用いたｑＰＣＲデータ(ΔＡＲＦ１、ΔＦＡＵ、ΔＲＰＬ３０)は、一般的に内部標準遺伝子として利用されているＧＡＰＤＨ（ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅ＝―１．８１３）やＡＣＴＢ（ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅ＝―１．８７４）、表皮角化細胞の遺伝子発現解析における内部標準遺伝子として好適とされるＰＲＬＰ０（ＣＶ Ｚ－ｓｃｏｒｅ＝―１．８５９）を内部標準としたｑＰＣＲデータ(ΔＧＡＰＤＨ、ΔＡＣＴＢ、ΔＲＰＬＰ０)と比較して、目的遺伝子のＰＣＲ定量データ全体の相関性が向上しており、乳幼児の皮膚表上脂質検体に含まれる目的遺伝子の発現量を測定する場合において、内部標準遺伝子としてより優れていることが確認された。
【0054】
【表4】