特許 7585561 パーキンソン病およびパーキンソニズムに関連する他の疾患のための低用量プリドピジン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-11

(45)【発行日】2024-11-19

(54)【発明の名称】パーキンソン病およびパーキンソニズムに関連する他の疾患のための低用量プリドピジン

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/451 20060101AFI20241112BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20241112BHJP

【ＦＩ】

A61K31/451

A61P25/16

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2021544758

(86)(22)【出願日】2020-02-04

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-18

(86)【国際出願番号】 IL2020050134

(87)【国際公開番号】W WO2020161707

(87)【国際公開日】2020-08-13

【審査請求日】2021-08-16

(31)【優先権主張番号】62/800,803

(32)【優先日】2019-02-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】519062797

【氏名又は名称】プリレニア ニューロセラピューティクス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001379

【氏名又は名称】弁理士法人大島特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ヘイデン、マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ゲヴァ、ミカル

(72)【発明者】

【氏名】チェンチ、ニルソン・アンジェラ

【審査官】金子 亜希

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５０６５６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１３／０８６４２５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】2017 International Congress of Parkinson's Disease and Movement Disorders Late-Breaking Abstracts, MDS study Group Abstracts and Guided Poster Tour Information ，2017年

【文献】Mov Disord，2018年12月21日，34(5)，708-716

【文献】医学のあゆみ（別冊），2014年，2014(10):103-107

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／４５１

Ａ６１Ｐ ２５／１６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

パーキンソン病の進行の予防、治療、または緩徐化における使用のための医薬組成物であって、前記パーキンソン病がグルコセレブロシダーゼ変異に関連するパーキンソン病であり、当該医薬組成物は、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む、使用のための組成物。

【請求項2】

前記使用が、対象における神経変性を予防、治療、緩徐化、または逆転することを含む、請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項3】

前記対象における前記神経変性が、ＥＲストレスの増加、ニューロンミトコンドリア機能障害、自食作用流動の減少、血漿ＢＤＮＦレベルの減少、脳脊髄液ＢＤＮＦレベルの減少、ニューロンおよびＢＤＮＦ軸索輸送の減少として提示される、請求項２に記載の使用のための組成物。

【請求項4】

前記プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む前記医薬組成物が、少なくとも１日２回投与される、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項5】

前記プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む前記医薬組成物が、１日２回投与される、請求項４に記載の使用のための組成物。

【請求項6】

前記プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む前記医薬組成物が、１日３回投与される、請求項４に記載の使用のための組成物。

【請求項7】

前記プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む前記医薬組成物が、１日４回投与される、請求項４に記載の使用のための組成物。

【請求項8】

前記対象に対する前記プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む前記医薬組成物が全身投与される、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項9】

前記対象に対する前記プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む前記医薬組成物が経口投与される、請求項８に記載の使用のための組成物。

【請求項10】

前記プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む前記医薬組成物が、吸入可能な粉末、注射剤、液体、ゲル、固体、カプセルまたは錠剤からなる群から選択される形態で投与される、請求項９に記載の使用のための組成物。

【請求項11】

前記薬学的に許容されるプリドピジン塩がプリドピジン塩酸塩である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、対象に低用量のプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、パーキンソン病または他の疾患に関連するパーキンソニズムに罹患している対象を治療するための方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

プリドピジン（４－［３－（メチルスルホニル）フェニル］－１－プロピル－ピペリジン）（以前はＡＣＲ１６として知られる）は、ハンチントン病（ＨＤ）患者およびＨＤの動物モデルにおける運動機能を改善することがわかっている。その運動効果はもともとドーパミン受容体に対するその低親和性拮抗作用に起因していたが、ラットにおけるインビボＰＥＴ研究は、行動に関連する用量のプリドピジンがドーパミンＤ２／Ｄ３Ｒではなくシグマ－１受容体（Ｓ１Ｒ）を占めることを示している。これは、Ｄ２Ｒと比較してＳ１Ｒではるかに高い結合親和性を示すインビトロ結合親和性アッセイと一致している（Ｓ１ＲについてのＫｉ、約１００ｎＭ、Ｄ２ＲについてのＫｉ、１０～３０μＭおよびＤ３ＲについてのＫｉ、約１．６ｕＭ）。Ｓ１Ｒは、ミトコンドリア関連小胞体膜（ＭＡＭ）で豊富なリガンド作動性シャペロンタンパク質であり、細胞の防御および生存のいくつかの経路を支持する。Ｓ１Ｒは、抗アポトーシス遺伝子の上方調節、ミクログリアの活性化の減少、活性酸素種（ＲＯＳ）および一酸化窒素（ＮＯ）の生成の減少、栄養因子の分泌の増加を含む、複数の細胞メカニズムを調節する。

【0003】

パーキンソン病（ＰＤ）は、アルファ－シヌクレインの凝集、酸化ストレス、ミトコンドリア機能障害、および神経炎症の間の相互作用が中心的な病原性の役割を果たす加齢関連神経変性疾患である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本発明は、一態様において、１日あたり少なくとも１つの医薬組成物を対象に投与することを含む、パーキンソン病もしくはパーキンソン病に関連する別の疾患またはパーキンソニズムに関連する別の疾患またはそれらの症状の進行の予防、治療、または緩徐化を必要とする対象におけるそれを行うための方法を提供し、医薬組成物はプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含み、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は１日あたり１～１００ｍｇである。

【0005】

特定の実施形態において、方法は、対象の機能低下を予防、治療、緩徐化、または逆転することを含む。

【0006】

特定の実施形態において、対象の機能低下は、振戦、動作緩慢、硬直、姿勢の不安定性、日常生活の活動を含む統一パーキンソン病評価尺度パートＩＩ（ＵＰＤＲＳパートＩＩ）による低下、およびＰＤの修正版ホーエンおよびヤール分類による低下からなる群から選択される症状として提示される。

【0007】

特定の実施形態において、方法は、対象の認知機能低下を予防、治療、緩徐化、または逆転することを含む。

【0008】

特定の実施形態において、対象の認知機能低下は、知的機能障害、思考障害、うつ病、やる気の減少、イニシアチブの減少、発話障害、救済の増加、嚥下障害、手書きの障害および痛覚の増加からなる群から選択される症状として提示される。

【0009】

特定の実施形態において、方法は、対象における神経変性を予防、治療、緩徐化、または逆転することを含む。

【0010】

特定の実施形態において、対象における神経変性は、線維芽細胞ＧＣアーゼ活性の減少、ＥＲストレスの増加、ニューロンミトコンドリア機能障害、ニューロンミトコンドリアＲＯＳ産生の増加、自食作用流動の減少、ニューロンミトコンドリア速度の減少、マイトファジーの減少、血漿ＢＤＮＦレベルの減少、脳脊髄液（ＣＳＦ）ＢＤＮＦレベルの減少、ニューロンおよびＢＤＮＦ軸索輸送の減少、脳または脳脊髄液（ＣＳＦ）中のタンパク質凝集体の増加、脳炎症、ミクログリア活性化の増加、星状細胞活性化の増加、脳体積の減少、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）血漿レベルの増加、またはニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）脳脊髄液（ＣＳＦ）レベルの増加として提示される。

【0011】

特定の実施形態において、方法は、対象にプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を少なくとも１日２回投与することを含む。

【0012】

特定の実施形態において、方法は、対象にプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を１日２回投与することを含む。

【0013】

特定の実施形態において、方法は、対象にプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を１日３回投与することを含む。

【0014】

特定の実施形態において、方法は、対象にプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を１日４回投与することを含む。

【0015】

特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり１０～１００ｍｇである。

【0016】

特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり５０～１００ｍｇである。

【0017】

特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり８０～１００ｍｇである。

【0018】

特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり８０ｍｇである。

【0019】

特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり９０ｍｇである。

【0020】

特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり１００ｍｇである。

【0021】

特定の実施形態において、方法は、対象にプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を１日２回投与することを含み、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり８０～１００ｍｇである。

【0022】

特定の実施形態において、方法は、対象にプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を１日２回投与することを含み、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり９０ｍｇである。

【0023】

特定の実施形態において、方法は、対象にプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を１日２回投与することを含み、２つの医薬組成物のそれぞれは、異なる用量のプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含み、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は１日あたり９０ｍｇである。

【0024】

特定の実施形態において、方法は、対象に４５ｍｇのプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を１日２回投与することを含み、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり９０ｍｇである。

【0025】

特定の実施形態において、方法は、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を対象に全身投与することを含む。

【0026】

特定の実施形態において、方法は、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を対象に経口投与することを含む。

【0027】

特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物は、吸入可能な粉末、注射剤、液体、ゲル、固体、カプセルまたは錠剤からなる群から選択される形態で投与される。

【0028】

特定の実施形態において、薬学的に許容されるプリドピジン塩は、プリドピジン塩酸塩である。

【0029】

特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭型認知症、ゲルストマン－ストロイスラー－シャインカー症候群、リティコボディグ（Ｌｙｔｉｃｏ－ｂｏｄｉｇ）病（グアムのＡＬＳ複合体）、神経有棘赤血球症、神経セロイドリポフスチン症、オリーブ橋小脳萎縮症、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、ウィルソン病、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、およびピック病からなる群から選択される神経変性状態の一部であるか、またはそれに関連している。

【0030】

特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、パーキンソン病（ＰＤ）の一部であるか、またはそれに関連している。

【0031】

特定の実施形態において、ＰＤはグルコセレブロシダーゼ変異に関連している（ＰＤ－ＧＢＡ）。

【0032】

特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、多系統萎縮症（ＭＳＡ）の一部であるか、またはそれに関連している。

【0033】

特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）の一部であるか、またはそれに関連している。

【0034】

特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の一部であるか、またはそれに関連している。

【0035】

一実施形態において、本発明は、低用量のプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与し、それによって対象を治療することを含む、パーキンソン病（ＰＤ）の治療を必要とする対象におけるパーキンソン病を治療するための方法を対象とする。

【0036】

一実施形態において、本発明は、低用量のプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含み、それにより、ＰＤに罹患した対象における機能低下を緩徐化することを含む、ＰＤに罹患した対象における機能低下を緩徐化する方法を対象とする。

【0037】

一実施形態において、本発明は、低用量のプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含み、それにより、ＰＤに罹患した対象における機能的神経回復を誘発／促進することを含む、ＰＤに罹患した対象における機能的神経回復を誘導／促進する方法を対象とする。

【0038】

別の実施形態において、パーキンソニズムは、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）欠損症に関連するパーキンソン病（ＰＤ－ＧＢＡ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、またはレビー小体型認知症（ＬＢＤ）に関連している。

【0039】

別の実施形態において、プリドピジンはプリドピジン塩酸塩である。

【0040】

別の実施形態において、プリドピジンは経口投与される。

【0041】

別の実施形態において、プリドピジンは、吸入可能な粉末、注射剤、液体、ゲル、固体、カプセルまたは錠剤の形態で投与される。

【0042】

別の実施形態において、プリドピジンは定期的に投与される。

【0043】

別の実施形態において、プリドピジンは、１日１回よりも少ない頻度で投与される。

【0044】

別の実施形態において、プリドピジンは、１日あたり１用量２用量または３用量で投与される。

【0045】

別の実施形態において、プリドピジンは、１０ｍｇ／日～１００ｍｇ／日の間の１日用量で投与される。

【0046】

別の実施形態において、プリドピジンは、２０ｍｇ／日～９０ｍｇ／日の間の１日用量で投与される。

【0047】

別の実施形態において、プリドピジンは、４５ｍｇ／日～９０ｍｇ／日の間の１日用量で投与される。

【0048】

別の実施形態において、プリドピジンは、２０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の間の１日用量で投与される。

【図面の簡単な説明】

【0049】

本発明とみなされる主題は、本明細書の結論部分で特に指摘され、明確に特許請求される。しかしながら、本発明は、その目的、特徴、および利点とともに、構成および動作方法の両方に関して、添付の図面とともに読まれる場合、以下の詳細な説明を参照することによって最良に理解され得る。

【0050】

【図1A】低用量のプリドピジンの治療での行動の改善を示す図である。０．３または１ｍｇ／ｋｇのいずれかのプリドピジン（それぞれＰｒｉｄｏｐ ０．３またはＰｒｉｄｏｐ １ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水（群あたりｎ＝８～１２匹）で処置したマウスにおいて、自発的回転が週に１回評価された。結果は、１０分間のテストセッション中の自発的な同側回転の数として表される。低用量のプリドピジン（０．３ｍｇ／ｋｇ）は、すべてのテストで動物のパフォーマンスを改善した。反復測定ＡＮＯＶＡおよび事後ボンフェローニ検定を使用したこれらすべてのテストにおいて、低用量プリドピジン０．３ｍｇ／ｋｇ処置マウスについては全体的な有意差が見られたが、高用量１ｍｇ／ｋｇプリドピジン処理マウスについては見られなかった。自発的回転：ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．０００１ 時間、処置、相互作用、時間Ｆ（４，１６０）＝５０．４６、処置Ｆ（３，４０）＝１６．９７、相互作用Ｆ（１２，１６０）＝５．４３。

【図1B】低用量のプリドピジンの治療での行動の改善を示す図である。０．３または１ｍｇ／ｋｇのいずれかのプリドピジン（それぞれＰｒｉｄｏｐ ０．３またはＰｒｉｄｏｐ １ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水（群あたりｎ＝８～１２匹）で処置したマウスにおいて、前肢使用の非対称性（シリンダーテスト）が週に１回評価された。結果は、病変の反対側の足（左足）で実行された支持壁接触のパーセンテージとして表される。低用量のプリドピジン（０．３ｍｇ／ｋｇ）は、すべてのテストで動物のパフォーマンスを改善した。反復測定ＡＮＯＶＡおよび事後ボンフェローニ検定を使用したこれらすべてのテストにおいて、低用量プリドピジン０．３ｍｇ／ｋｇ処置マウスについては全体的な有意差が見られたが、高用量１ｍｇ／ｋｇプリドピジン処理マウスについては見られなかった。シリンダーテスト：ＡＮＯＶＡ ｐ＞０．０５ 相互作用、＜０．０００１ 時間および処置、時間Ｆ（４，１６０）＝８．７４、処置Ｆ（３，４０）＝２０．９６、相互作用Ｆ（１２，１６０）＝１．５２。

【図1C】低用量のプリドピジンの治療での行動の改善を示す図である。０．３または１ｍｇ／ｋｇのいずれかのプリドピジン（それぞれＰｒｉｄｏｐ ０．３またはＰｒｉｄｏｐ １ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水（群あたりｎ＝８～１２匹）で処置したマウスにおいて、前肢使用の非対称性（ステッピングテスト）が週に１回評価された。結果は、病変の反対側の足（左足）で実行された調整ステップのパーセンテージとして表される。低用量のプリドピジン（０．３ｍｇ／ｋｇ）は、すべてのテストで動物のパフォーマンスを改善した。反復測定ＡＮＯＶＡおよび事後ボンフェローニ検定を使用したこれらすべてのテストにおいて、低用量プリドピジン０．３ｍｇ／ｋｇ処置マウスについては全体的な有意差が見られたが、高用量１ｍｇ／ｋｇプリドピジン処理マウスについては見られなかった。ステッピングテスト：ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．００６ 相互作用、ｐ＝０．０００４ 時間、ｐ＜０．０００１ 処置、時間Ｆ（４，１６０）＝５．４６、処置Ｆ（３４０）＝７５．４４、相互作用Ｆ（１２，１６０）＝２．４４、ｐ＜０．０５、アスタリスク、対「生理食塩水」、番号記号、対「偽」、アンパサンド対「Ｐｒｉｄｏｐ １」。

【図2A】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での慢性処置（ただし、プリドピジン高用量１ｍｇ／ｋｇではない）が、神経組織学的回復を誘発することを示す図である。ＴＨ陽性細胞の立体解析学的カウントは、黒質緻密部（ＳＮｃ）において実行された（破線は分析に含まれる領域の輪郭を示している）。データは、病変と同側のＳＮｃ由来の細胞の総数を示している（ＳＮｃ全体の動物あたり７つの切片由来の平均±ＳＥＭ）。一元配置ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．０００１、Ｆ（３，３９）＝４４．２９、事後テューキー検定、ｐ＜０．０５ アスタリスク対生理食塩水、番号記号、対偽。

【図2B】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での慢性処置（ただし、プリドピジン高用量１ｍｇ／ｋｇではない）が、神経組織学的回復を誘発することを示す図である。ＴＨについて免疫染色された黒質切片の低倍率の顕微鏡写真であり、種々の群を表している。スケールバー１００μｍ。

【図2C】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での慢性処置（ただし、プリドピジン高用量１ｍｇ／ｋｇではない）が、神経組織学的回復を誘発することを示す図である。ＴＨについて免疫染色された黒質切片の低倍率の顕微鏡写真であり、種々の群を表している。スケールバー１００μｍ。

【図2D】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での慢性処置（ただし、プリドピジン高用量１ｍｇ／ｋｇではない）が、神経組織学的回復を誘発することを示す図である。ＴＨについて免疫染色された黒質切片の低倍率の顕微鏡写真であり、種々の群を表している。スケールバー１００μｍ。

【図2E】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での慢性処置（ただし、プリドピジン高用量１ｍｇ／ｋｇではない）が、神経組織学的回復を誘発することを示す図である。ＴＨについて免疫染色された黒質切片の低倍率の顕微鏡写真であり、種々の群を表している。スケールバー１００μｍ。

【図2F】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での慢性処置（ただし、プリドピジン高用量１ｍｇ／ｋｇではない）が、神経組織学的回復を誘発することを示す図である。線条体切片の低倍率顕微鏡写真、破線は、ＴＨ繊維密度の分析に含まれる領域を表している。同じ切片からの高倍率の挿入図は、種々の群間の繊維密度および形態の違いを示している（生理食塩水処置の場合）。スケールバー、２００μｍ。

【図2G】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での慢性処置（ただし、プリドピジン高用量１ｍｇ／ｋｇではない）が、神経組織学的回復を誘発することを示す図である。線条体切片の低倍率顕微鏡写真、破線は、ＴＨ繊維密度の分析に含まれる領域を表している。同じ切片からの高倍率の挿入図は、種々の群間の繊維密度および形態の違いを示している（０．３ｍｇ／ｋｇプリドピジンで処置したマウス）。スケールバー、２００μｍ。

【図2H】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での慢性処置（ただし、プリドピジン高用量１ｍｇ／ｋｇではない）が、神経組織学的回復を誘発することを示す図である。線条体切片の低倍率顕微鏡写真、破線は、ＴＨ繊維密度の分析に含まれる領域を表している。同じ切片からの高倍率の挿入図は、種々の群間の繊維密度および形態の違いを示している（１ｍｇ／ｋｇのプリドピジンで処置したマウス）。スケールバー、２００μｍ。

【図2I】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での慢性処置（ただし、プリドピジン高用量１ｍｇ／ｋｇではない）が、神経組織学的回復を誘発することを示す図である。線条体切片の低倍率顕微鏡写真、破線は、ＴＨ繊維密度の分析に含まれる領域を表している。無作為な試料領域で、高倍率で実行されたＴＨ陽性繊維の画像セグメンテーション分析。値は繊維ピクセル／試料領域を示し、ひげは各群における値の全範囲を包含する（中央値は水平線として示されている）。クラスカル－ウォリスおよび事後ダン検定、ｐ＝０．００９１、アスタリスク、ｐ＜０．０５ 対生理食塩水。

【図2J】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での慢性処置（ただし、プリドピジン高用量１ｍｇ／ｋｇではない）が、神経組織学的回復を誘発することを示す図である。線条体切片の低倍率顕微鏡写真、破線は、ＴＨ繊維密度の分析に含まれる領域を表している。腹外側線条体の断面積全体にわたるＴＨ免疫染色の光学密度分析、病変と同側の側由来のＯＤ値は、各動物の反対側の無傷の側由来のＯＤ値のパーセンテージとして表される（線条体全体の動物あたり４つの切片由来の平均±ＳＥＭ）。ＶＬ線条体、ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．０００２、Ｆ（２，３３）＝１１．３５。事後テューキー検定、ｐ＜０．０５アスタリスク、対生理食塩水、アンパサンド、対Ｐｒｉｄｏｐ １。

【図2K】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での慢性処置（ただし、プリドピジン高用量１ｍｇ／ｋｇではない）が、神経組織学的回復を誘発することを示す図である。線条体切片の低倍率顕微鏡写真、破線は、ＴＨ繊維密度の分析に含まれる領域を表している。背外側線条体の断面積全体にわたるＴＨ免疫染色の光学密度分析、病変と同側の側由来のＯＤ値は、各動物の反対側の無傷の側由来のＯＤ値のパーセンテージとして表される（線条体全体の動物あたり４つの切片由来の平均±ＳＥＭ）。ＤＬ線条体、ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．０３９、Ｆ（２，３３）＝３．５６。事後テューキー検定、ｐ＜０．０５アスタリスク、対生理食塩水、アンパサンド、対Ｐｒｉｄｏｐ １。

【図3A】高用量（１ｍｇ／ｋｇ）ではなくプリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での処置が、黒質線条体経路においてミクログリアの活性化を減少させることを示す図である。ＳＮｃにおけるＣＤ６８陽性ミクログリア細胞の数。０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンを受けたマウスは、黒質および線条体レベルの両方で、生理食塩水で処置された対照と比較して、有意に少ない数のＣＤ６８陽性細胞を示した。一元配置ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．０００２、Ｆ（３，２８）＝９．００５。

【図3B】高用量（１ｍｇ／ｋｇ）ではなくプリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での処置が、黒質線条体経路においてミクログリアの活性化を減少させることを示す図である。図３Ａに対応する顕微鏡写真。低倍率の顕微鏡写真は４倍の対物レンズの下で撮影されたのに対して、挿入図は２０倍の対物レンズの下で撮影された。スケールバー、１００μｍ。

【図3C】高用量（１ｍｇ／ｋｇ）ではなくプリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での処置が、黒質線条体経路においてミクログリアの活性化を減少させることを示す図である。図３Ａに対応する顕微鏡写真。低倍率の顕微鏡写真は４倍の対物レンズの下で撮影されたのに対して、挿入図は２０倍の対物レンズの下で撮影された。スケールバー、１００μｍ。

【図3D】高用量（１ｍｇ／ｋｇ）ではなくプリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での処置が、黒質線条体経路においてミクログリアの活性化を減少させることを示す図である。図３Ａに対応する顕微鏡写真。低倍率の顕微鏡写真は４倍の対物レンズの下で撮影されたのに対して、挿入図は２０倍の対物レンズの下で撮影された。スケールバー、１００μｍ。

【図3E】高用量（１ｍｇ／ｋｇ）ではなくプリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での処置が、黒質線条体経路においてミクログリアの活性化を減少させることを示す図である。図３Ａに対応する顕微鏡写真。低倍率の顕微鏡写真は４倍の対物レンズの下で撮影されたのに対して、挿入図は２０倍の対物レンズの下で撮影された。スケールバー、１００μｍ。

【図3F】高用量（１ｍｇ／ｋｇ）ではなくプリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での処置が、黒質線条体経路においてミクログリアの活性化を減少させることを示す図である。腹外側線条体におけるＣＤ６８陽性ミクログリア細胞の数。０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンを受けたマウスは、黒質および線条体レベルの両方で、生理食塩水で処置された対照と比較して、有意に少ない数のＣＤ６８陽性細胞を示した。一元配置ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．０００５、Ｆ（３，２８）＝８．０４９。事後テューキー検定、ｐ＜０．０５ アスタリスク、対生理食塩水、番号記号、対偽。

【図3G】高用量（１ｍｇ／ｋｇ）ではなくプリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での処置が、黒質線条体経路においてミクログリアの活性化を減少させることを示す図である。図３Ｆに対応する顕微鏡写真。低倍率の顕微鏡写真は４倍の対物レンズの下で撮影されたのに対して、挿入図は２０倍の対物レンズの下で撮影された。スケールバー、１００μｍ。

【図3H】高用量（１ｍｇ／ｋｇ）ではなくプリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での処置が、黒質線条体経路においてミクログリアの活性化を減少させることを示す図である。図３Ｆに対応する顕微鏡写真。低倍率の顕微鏡写真は４倍の対物レンズの下で撮影されたのに対して、挿入図は２０倍の対物レンズの下で撮影された。スケールバー、１００μｍ。

【図3I】高用量（１ｍｇ／ｋｇ）ではなくプリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での処置が、黒質線条体経路においてミクログリアの活性化を減少させることを示す図である。図３Ｆに対応する顕微鏡写真。低倍率の顕微鏡写真は４倍の対物レンズの下で撮影されたのに対して、挿入図は２０倍の対物レンズの下で撮影された。スケールバー、１００μｍ。

【図3J】高用量（１ｍｇ／ｋｇ）ではなくプリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での処置が、黒質線条体経路においてミクログリアの活性化を減少させることを示す図である。図３Ｆに対応する顕微鏡写真。低倍率の顕微鏡写真は４倍の対物レンズの下で撮影されたのに対して、挿入図は２０倍の対物レンズの下で撮影された。スケールバー、１００μｍ。

【図4A】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）は、Ｓ１Ｒを欠く６－ＯＨＤＡ損傷マウスにおいて運動障害を改善しないことを示す図である。自発的回転は、６－ＯＨＤＡ病変または偽病変を維持するＳ１Ｒ ＫＯマウスで週に１回評価され、その後０．３ｍｇ／ｋｇプリドピジン（Ｐｒｉｄｏｐ ０．３）または生理食塩水のいずれかで処置された（群あたりｎ＝８～１０匹）。結果は、１０分間のテストセッション中の自発的な同側回転の数として表される。反復測定ＡＮＯＶＡおよび事後ボンフェローニ検定：自発回転：ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．０００１ 時間、処置、相互作用、時間Ｆ（４，１０４）＝４５．３６、処置Ｆ（２，２６）＝１５．５４、相互作用Ｆ（８，１０４）＝１１．１５。

【図4B】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）は、Ｓ１Ｒを欠く６－ＯＨＤＡ損傷マウスにおいて運動障害を改善しないことを示す図である。前肢使用の非対称性（シリンダーテスト）は、６－ＯＨＤＡ病変または偽病変を維持するＳ１Ｒ ＫＯマウスで週に１回評価され、その後０．３ｍｇ／ｋｇプリドピジン（Ｐｒｉｄｏｐ ０．３）または生理食塩水のいずれかで処置された（群あたりｎ＝８～１０匹）。結果は、病変の反対側の足（左足）で実行された支持壁接触のパーセンテージとして表される。反復測定ＡＮＯＶＡおよび事後ボンフェローニ検定：シリンダーテスト：ＡＮＯＶＡ ｐ＞０．０５ 時間および相互作用、ｐ＜０．０００１ 処置、時間Ｆ（４，１０４）＝１．２３、処置Ｆ（２，２６）＝１．７６、相互作用Ｆ（８，１０４）＝０．３２。

【図4C】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）は、Ｓ１Ｒを欠く６－ＯＨＤＡ損傷マウスにおいて運動障害を改善しないことを示す図である。前肢使用の非対称性（ステッピングテスト）は、６－ＯＨＤＡ病変または偽病変を維持するＳ１Ｒ ＫＯマウスで週に１回評価され、その後０．３ｍｇ／ｋｇプリドピジン（Ｐｒｉｄｏｐ ０．３）または生理食塩水のいずれかで処置された（群あたりｎ＝８～１０匹）。結果は、病変の反対側の足（左足）で実行された調整ステップのパーセンテージとして表される。反復測定ＡＮＯＶＡおよび事後ボンフェローニ検定：ステッピングテスト：ＡＮＯＶＡ ｐ＞０．０５ 時間および相互作用、ｐ＜０．０００１ 処置、時間Ｆ（４，１０４）＝０．４６、処置Ｆ（２，２６）＝３４６．４、相互作用Ｆ（８，１０４）＝１．３５、ｐ＜０．０５、番号記号対「偽」。

【図5A】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）が、Ｓ１Ｒを欠く６－ＯＨＤＡ損傷マウスにおいて神経回復効果がないことを示す図である。Ｓ１Ｒ ＫＯマウスのＳＮｃにおけるＴＨ陽性細胞の立体解析学的カウント。図５Ａにおけるデータは、病変と同側のＳＮｃ由来の細胞の総数を示している（ＳＮｃ全体の動物あたり７つの切片由来の平均±ＳＥＭ）。一元配置ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．０００１、Ｆ（２，２６）＝４１．７３、事後ボンフェローニテスト、ｐ＜０．０５ 番号記号対偽群。

【図5B】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）が、Ｓ１Ｒを欠く６－ＯＨＤＡ損傷マウスにおいて神経回復効果がないことを示す図である。ＴＨに対して免疫染色された黒質切片の低倍率顕微鏡写真（破線は分析に含まれる領域の輪郭を示している）。スケールバー、１００μｍ。一元配置ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．０００１、Ｆ（２，２６）＝４１．７３、事後ボンフェローニテスト、ｐ＜０．０５ 番号記号対偽群。

【図5C】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）が、Ｓ１Ｒを欠く６－ＯＨＤＡ損傷マウスにおいて神経回復効果がないことを示す図である。ＴＨに対して免疫染色された黒質切片の低倍率顕微鏡写真（破線は分析に含まれる領域の輪郭を示している）。スケールバー、１００μｍ。一元配置ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．０００１、Ｆ（２，２６）＝４１．７３、事後ボンフェローニテスト、ｐ＜０．０５ 番号記号対偽群。

【図5D】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）が、Ｓ１Ｒを欠く６－ＯＨＤＡ損傷マウスにおいて神経回復効果がないことを示す図である。ＴＨに対して免疫染色された黒質切片の低倍率顕微鏡写真（破線は分析に含まれる領域の輪郭を示している）。スケールバー、１００μｍ。一元配置ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．０００１、Ｆ（２，２６）＝４１．７３、事後ボンフェローニテスト、ｐ＜０．０５ 番号記号対偽群。

【図5E】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）が、Ｓ１Ｒを欠く６－ＯＨＤＡ損傷マウスにおいて神経回復効果がないことを示す図である。外側線条体（破線で囲まれている）を通る無作為な試料領域で、高倍率で実行されたＴＨ陽性線維の画像セグメンテーション分析。値は繊維ピクセル／試料領域として表され、ひげは各群における値の全範囲を包含し、中央値はバーとして表示される。マンホイットニー検定、ｐ＝０．０８４。

【図5F】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）が、Ｓ１Ｒを欠く６－ＯＨＤＡ損傷マウスにおいて神経回復効果がないことを示す図である。腹外側線条体の断面積全体にわたるＴＨ免疫染色の光学密度（ＯＤ）。病変と同側由来のＯＤ値は、各動物の反対側の無傷の側由来のＯＤ値のパーセンテージとして表される（線条体全体の動物あたり４つの切片由来の平均±ＳＥＭ）。腹外側（ＶＬ）線条体、対応のないｔ検定、ｐ＝０．５１６。

【図5G】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）が、Ｓ１Ｒを欠く６－ＯＨＤＡ損傷マウスにおいて神経回復効果がないことを示す図である。背外側線条体の断面積全体にわたるＴＨ免疫染色の光学密度（ＯＤ）。病変と同側由来のＯＤ値は、各動物の反対側の無傷の側由来のＯＤ値のパーセンテージとして表される（線条体全体の動物あたり４つの切片由来の平均±ＳＥＭ）。背外側（ＤＬ）線条体、ｐ＝０．２１９。

【図5H】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）が、Ｓ１Ｒを欠く６－ＯＨＤＡ損傷マウスにおいて神経回復効果がないことを示す図である。生理食塩水処置由来のＴＨ免疫染色線条体切片の代表的な顕微鏡写真。スケールバー、２００μｍ。

【図5I】プリドピジン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）が、Ｓ１Ｒを欠く６－ＯＨＤＡ損傷マウスにおいて神経回復効果がないことを示す図である。プリドピジン－０．３ｍｇ／ｋｇ処置Ｓ１Ｒ ＫＯマウス由来のＴＨ免疫染色線条体切片の代表的な顕微鏡写真。スケールバー、２００μｍ。

【図6A】０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンでの処置が、栄養因子およびリン酸化されたＥＲＫ１／２を上方調節することを示す図である。５週間、０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジン（ｎ＝９）または生理食塩水（ｎ＝１１）で処置された６－ＯＨＤＡ損傷野生型マウス由来の線条体試料を使用したＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、およびリン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ）のウエスタンブロット分析。結果は、β－アクチンレベルに対して正規化され、プリドピジンで処置された動物由来のデータは、生理食塩水で処置された対照由来の値のパーセンテージとして示されている。対応のないｔ検定、線条体：ＧＤＮＦ ｐ＝０．００３。

【図6B】０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンでの処置が、栄養因子およびリン酸化されたＥＲＫ１／２を上方調節することを示す図である。５週間、０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジン（ｎ＝９）または生理食塩水（ｎ＝１１）で処置された６－ＯＨＤＡ損傷野生型マウス由来の線条体試料を使用したＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、およびリン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ）のウエスタンブロット分析。結果は、β－アクチンレベルに対して正規化され、プリドピジンで処置された動物由来のデータは、生理食塩水で処置された対照由来の値のパーセンテージとして示されている。対応のないｔ検定、線条体：ＢＤＮＦ ｐ＝０．０１３。

【図6C】０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンでの処置が、栄養因子およびリン酸化されたＥＲＫ１／２を上方調節することを示す図である。５週間、０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジン（ｎ＝９）または生理食塩水（ｎ＝１１）で処置された６－ＯＨＤＡ損傷野生型マウス由来の線条体試料を使用したＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、およびリン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ）のウエスタンブロット分析。結果は、β－アクチンレベルに対して正規化され、プリドピジンで処置された動物由来のデータは、生理食塩水で処置された対照由来の値のパーセンテージとして示されている。対応のないｔ検定、線条体：ｐＥＲＫ１／２ ｐ＝０．０４９。

【図6D】０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンでの処置が、栄養因子およびリン酸化されたＥＲＫ１／２を上方調節することを示す図である。５週間、０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジン（ｎ＝９）または生理食塩水（ｎ＝１１）で処置された６－ＯＨＤＡ損傷野生型マウス由来の黒質試料を使用したＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、およびリン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ）のウエスタンブロット分析。結果は、β－アクチンレベルに対して正規化され、プリドピジンで処置された動物由来のデータは、生理食塩水で処置された対照由来の値のパーセンテージとして示されている。対応のないｔ検定、黒質：ＧＤＮＦ ｐ＝０．７２。

【図6E】０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンでの処置が、栄養因子およびリン酸化されたＥＲＫ１／２を上方調節することを示す図である。５週間、０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジン（ｎ＝９）または生理食塩水（ｎ＝１１）で処置された６－ＯＨＤＡ損傷野生型マウス由来の黒質試料を使用したＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、およびリン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ）のウエスタンブロット分析。結果は、β－アクチンレベルに対して正規化され、プリドピジンで処置された動物由来のデータは、生理食塩水で処置された対照由来の値のパーセンテージとして示されている。対応のないｔ検定、黒質：ＢＤＮＦ ｐ＝０．０００８。

【図6F】０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンでの処置が、栄養因子およびリン酸化されたＥＲＫ１／２を上方調節することを示す図である。５週間、０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジン（ｎ＝９）または生理食塩水（ｎ＝１１）で処置された６－ＯＨＤＡ損傷野生型マウス由来の黒質試料を使用したＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、およびリン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ）のウエスタンブロット分析。結果は、β－アクチンレベルに対して正規化され、プリドピジンで処置された動物由来のデータは、生理食塩水で処置された対照由来の値のパーセンテージとして示されている。対応のないｔ検定、黒質：ｐＥＲＫ１／２ ｐ＝０．１０６。

【図7】プリドピジンによる初期ｍＨｔｔ誘発ＥＲストレスの用量依存的減少を示す図である。Ｈ２ａ－ＧＦＰは、ＳＴＨｄｈＱ７／７細胞においてＨｔｔ２０Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙまたはＨｔｔ９６Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ（エクソン１）と一時的に共発現された。Ｈ２ａ－ＧＦＰ凝集は、細胞ストレスのマーカーである。トランスフェクションの４時間後に細胞は、プリドピジンなしで処置され、またはプリドピジンの濃度を上げながら（０．０１μｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌに相当する０．０３～３μＭ）処置され、トランスフェクションの２４時間後に共焦点顕微鏡において画像化された。Ｈｔｔ９６Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ凝集体またはＨｔｔ２０Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙを有する個々の細胞（実験あたり約１５０細胞）の画像を、凝集体を有するまたは有しない未処置細胞と比較して定量化した。比較のために、１００％はＨｔｔ９６Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ凝集体を示す未処置細胞におけるＨ２ａ－ＧＦＰ相対強度を表し、０％はＨｔｔ９６Ｑ－ｃｈｅｒｒｙ凝集体を有さない未処置細胞におけるＨ２ａ－ＧＦＰ相対強度を表す。グラフは３回の実験の平均＋－ＳＥである。アスタリスクは、未処置と比較したＰ値、＜０．０５（＊）および＜０．０１（＊＊）を示す。

【図8】プリドピジンが、ベル型の用量反応曲線で、ｅＩＦ２α－リン酸化、小胞体ストレスの尺度を減少させることを示す図である。ＨＥＫ２９３細胞が、ｍｙｃ－Ｈｔｔ９６Ｑ（ひし形）またはｍｙｃ－Ｈｔｔ２０Ｑ（四角）でトランスフェクトされ、その後、プリドピジンの濃度を増加させながら（０．０１μｇ／ｍｌ～５０μｇ／ｍｌに相当する０．０３～１５０μＭ）２４時間処置された。総ｅＩＦ２ａに対するｅＩＦ２ａ－Ｐの比率がイムノブロットによって定量化された。

【図9】プリドピジンが、酸化ストレス後の皮質ＨＤニューロンにおけるミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）を増加させることを示す図である。変異ハンチンチンを発現する線条体ＷＴおよびＹＡＣ１２８ニューロンがプリドピジンで２４時間処置され、オリゴマイシンに加えてＦＣＣＰで脱分極した後のΔΨｍの変化を評価するためにＴＭＲＭが使用された（ｎ＝７～１０）。二元配置ＡＮＯＶＡは、線条体ニューロンにおけるプリドピジン処置の効果を明らかにした［Ｆ（２，１０７）＝３．２５７、ｐ＝０．０４２３］。

【図10】プリドピジンがＹＡＣ１２８ ＨＤ線条体ニューロンにおける活性酸素種（ＲＯＳ）を減少させることを示す図である。１μＭプリドピジンで処置された、または処置されていない線条体ニューロンが、ＭｉｔｏＰＹ１蛍光プローブでインキュベートされた。示されるように、ミトコンドリアのＨ_２Ｏ_２は、アンチマイシンＡ（Ａｎｔ Ａ、２μＭ）の前後に、スピニングディスク共焦点において記録された（ｎ＝４、約２０個の細胞／条件と考えられる）。スケールバー＝３０μＭ。二元配置ＡＮＯＶＡは、ミトコンドリアのＲＯＳ産生に対するプリドピジン処置の救済効果を明らかにする［Ｆ（１，３８９）＝１５．２４、ｐ＜０．０００１］。

【図11】プリドピジンがミトコンドリア速度を上げることを示す図である。軸索におけるミトコンドリア速度の定量分析は、０．１μＭプリドピジンの適用後のＷＴニューロンにおける加速された軸索輸送ミトコンドリア（ｎ＝粒子ステップ数）を明らかにする（Ｉｏｎｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９、図４Ｆから改変）。

【図12】プリドピジンがＢ１０４神経芽細胞腫細胞株におけるＢＤＮＦ分泌を増強することを示す図である。データはｐｇ／ｍｌで表される（平均６ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くダネット検定）。ＮＥ１００、シグマ－１受容体拮抗薬（１μＭ）。出典：Ｇｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１６。

【図13】プリドピジンが、Ｓ１Ｒを介したメカニズムでＡＬＳ運動ニューロンにおけるＢＤＮＦ軸索輸送を増強することを示す図である。軸索輸送を視覚化および分析するために、脊髄抽出物がマイクロ流体チャンバーの近位コンパートメントに播種され、軸索は溝を通して遠位コンパートメントまで成長させられた。Ｑドット－ＢＤＮＦ粒子は遠位チャンバーにのみ導入され、軸索を介したそれらの逆行性輸送は共焦点スピニングディスク顕微鏡で視覚化された。ＷＴ（左から１列目）またはＳＯＤ１Ｇ９３Ａ（左から２列目～４列目）ＭＮにおけるＱドット－ＢＤＮＦ粒子のための瞬間的な速度値の棒グラフはＳＯＤ１Ｇ９３Ａ ＭＮにおける速度が遅いことを示す。プリドピジンの適用は、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ ＭＮ（０．１μＭおよび１μＭ）の両方の瞬間的な速度を加速する。Ｓ１Ｒ－／－ＭＮ（左から５列目～７列目）は、ＢＤＮＦの軸索輸送の欠陥を明らかにする。０．１μＭまたは１μＭのいずれのプリドピジンもこれらの欠陥を回復することができなかった（ｎ＝ｑドット－ＢＤＮＦステップの数）。データは平均±ＳＥＭとして示されている。＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ値＜０．０１、＊＊＊ｐ値＜０．００１（ｎ＝６の独立した実験、各実験の試料サイズはバーに示されている、スチューデントのｔ検定）（Ｉｏｎｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９、図３Ｃから改変）。

【発明を実施するための形態】

【0051】

本発明は、一態様において、１日あたり少なくとも１つの医薬組成物を対象に投与することを含む、パーキンソン病もしくはパーキンソニズムに関連する別の疾患またはそれらの症状の進行の予防、治療、または緩徐化を必要とする対象におけるそれを行うための方法を提供し、医薬組成物はプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含み、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は１日あたり１～１００ｍｇである。

【0052】

特定の実施形態において、方法は、パーキンソン病の進行を予防、治療、または緩徐化するためのものである。特定の実施形態において、方法は、パーキンソニズムに関連する疾患の進行を予防、治療、または緩徐化するためのものである。特定の実施形態において、方法は、パーキンソン病の症状の進行を予防、治療、または緩徐化するためのものである。特定の実施形態において、方法は、パーキンソニズムに関連する疾患の症状の進行を予防、治療、または緩徐化するためのものである。特定の実施形態において、方法は、パーキンソニズムに関連する症状の進行を予防、治療、または緩徐化するためのものである。

【0053】

特定の実施形態において、方法は、対象の機能低下を予防、治療、緩徐化、または逆転することを含む。特定の実施形態において、方法は、対象の機能低下を予防することを含む。特定の実施形態において、方法は、対象の機能低下を治療することを含む。特定の実施形態において、方法は、対象の機能低下を緩徐化することを含む。特定の実施形態において、方法は、対象の機能低下を逆転することを含む。

【0054】

特定の実施形態において、対象の機能低下は、振戦、動作緩慢、硬直、姿勢の不安定性、日常生活の活動を含む統一パーキンソン病評価尺度パートＩＩ（ＵＰＤＲＳパートＩＩ）による低下、およびＰＤの修正版ホーエンおよびヤール分類による低下からなる群から選択される症状として提示される。特定の実施形態において、対象の機能低下は、振戦として提示される。特定の実施形態において、対象の機能低下は、動作緩慢として提示される。特定の実施形態において、対象の機能低下は、硬直として提示される。特定の実施形態において、対象の機能低下は、姿勢の不安定性として提示される。特定の実施形態において、対象の機能低下は、日常生活の活動を含む統一パーキンソン病評価尺度パートＩＩ（ＵＰＤＲＳパートＩＩ）による低下として提示される。特定の実施形態において、対象の機能低下は、ＰＤの修正版ホーエンおよびヤール分類による低下として提示される。

【0055】

特定の実施形態において、方法は、対象の認知機能低下を予防、治療、緩徐化、または逆転することを含む。特定の実施形態において、方法は、対象の認知機能低下を予防することを含む。特定の実施形態において、方法は、対象の認知機能低下を治療することを含む。特定の実施形態において、方法は、対象の認知機能低下を緩徐化することを含む。特定の実施形態において、方法は、対象の認知機能低下を逆転することを含む。

【0056】

特定の実施形態において、対象の認知機能低下は、知的機能障害、思考障害、うつ病、やる気の減少、イニシアチブの減少、発話障害、救済の増加、嚥下障害、手書きの障害および痛覚の増加からなる群から選択される症状として提示される。特定の実施形態において、対象の認知機能低下は、知的機能障害として提示される。特定の実施形態において、対象の認知機能低下は、思考障害として提示される。特定の実施形態において、対象の認知機能低下は、うつ病として提示される。特定の実施形態において、対象の認知機能低下は、やる気の減少として表される。特定の実施形態において、対象の認知機能低下は、イニシアチブの減少として提示される。特定の実施形態において、対象の認知機能低下は、発話障害として提示される。特定の実施形態において、対象の認知機能低下は、救済の増加として提示される。特定の実施形態において、対象の認知機能低下は、嚥下障害として提示される。特定の実施形態において、対象の認知機能低下は、手書きの障害を呈する。特定の実施形態において、対象の認知機能低下は、痛覚の増加として提示される。

【0057】

特定の実施形態において、方法は、対象における神経変性を予防、治療、緩徐化、または逆転することを含む。特定の実施形態において、方法は、対象における神経変性を予防することを含む。特定の実施形態において、方法は、対象における神経変性を治療することを含む。特定の実施形態において、方法は、対象における神経変性を緩徐化することを含む。特定の実施形態において、方法は、対象における神経変性を逆転することを含む。

【0058】

特定の実施形態において、対象における神経変性は、線維芽細胞ＧＣアーゼ活性の減少、ＥＲストレスの増加、ニューロンミトコンドリア機能障害、ニューロンミトコンドリアＲＯＳ産生の増加、自食作用流動の減少、ニューロンミトコンドリア速度の減少、マイトファジーの減少、血漿ＢＤＮＦレベルの減少、脳脊髄液（ＣＳＦ）ＢＤＮＦレベルの減少、ニューロンおよびＢＤＮＦ軸索輸送の減少、脳または脳脊髄液（ＣＳＦ）中のタンパク質凝集体の増加、脳炎症、ミクログリア活性化の増加、星状細胞活性化の増加、脳体積の減少、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）血漿レベルの増加、またはニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）脳脊髄液（ＣＳＦ）レベルの増加として提示される。

【0059】

特定の実施形態において、対象における神経変性は、線維芽細胞ＧＣアーゼ活性の減少として提示される。特定の実施形態において、対象における神経変性は、ＥＲストレスの増加として提示される。特定の実施形態において、対象における神経変性は、ニューロンミトコンドリア機能障害として提示される。特定の実施形態において、対象における神経変性は、ニューロンミトコンドリアＲＯＳ産生の増加として提示される。特定の実施形態において、対象における神経変性は、自食作用流動の減少として提示される。特定の実施形態において、対象における神経変性は、ニューロンミトコンドリア速度の減少として提示される。特定の実施形態において、対象における神経変性は、マイトファジーの減少として提示される。特定の実施形態において、対象における神経変性は、血漿ＢＤＮＦレベルの減少として提示される。特定の実施形態において、対象における神経変性は、脳脊髄液（ＣＳＦ）ＢＤＮＦレベルの減少として提示される。特定の実施形態において、対象における神経変性は、ニューロンおよびＢＤＮＦ軸索輸送の減少として提示される。特定の実施形態において、対象における神経変性は、脳または脳脊髄液（ＣＳＦ）中のタンパク質凝集体の増加として提示される。特定の実施形態において、対象における神経変性は、脳炎症として提示される。特定の実施形態において、対象における神経変性は、ミクログリア活性化の増加として提示される。特定の実施形態において、対象における神経変性は、星状細胞活性化の増加として提示される。特定の実施形態において、対象における神経変性は、脳体積の減少として提示される。特定の実施形態において、対象における神経変性は、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）血漿レベルの増加として提示される。特定の実施形態において、対象における神経変性は、神経フィラメント軽鎖（ＮＦＬ）脳脊髄液（ＣＳＦ）レベルの増加として提示される。

【0060】

特定の実施形態において、方法は、対象にプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を少なくとも１日２回投与することを含む。特定の実施形態において、方法は、対象にプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を少なくとも１日３回投与することを含む。特定の実施形態において、方法は、対象にプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を少なくとも１日４回投与することを含む。

【0061】

特定の実施形態において、方法は、対象にプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を１日２回投与することを含む。

【0062】

特定の実施形態において、方法は、対象にプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を１日３回投与することを含む。

【0063】

特定の実施形態において、方法は、対象にプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を１日４回投与することを含む。

【0064】

特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり１０～１００ｍｇである。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり２０～１００ｍｇである。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり３０～１００ｍｇである。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり４０～１００ｍｇである。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり５０～１００ｍｇである。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり６０～１００ｍｇである。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり７０～１００ｍｇである。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり８０～１００ｍｇである。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり９０～１００ｍｇである。

【0065】

特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり８０ｍｇである。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり８５ｍｇである。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり９０ｍｇである。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり９５ｍｇである。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり１００ｍｇである。

【0066】

特定の実施形態において、方法は、対象にプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を１日２回投与することを含み、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり８０～１００ｍｇである。特定の実施形態において、方法は、対象にプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を１日２回投与することを含み、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり８５～９５ｍｇである。

【0067】

特定の実施形態において、方法は、対象にプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を１日２回投与することを含み、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は、１日あたり９０ｍｇである。

【0068】

特定の実施形態において、方法は、対象にプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を１日２回投与することを含み、２つの医薬組成物のそれぞれは、異なる用量のプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含み、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は１日あたり９０ｍｇである。

【0069】

特定の実施形態において、方法は、対象に４５ｍｇのプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を１日２回投与することを含み、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩の総投与量は１日あたり９０ｍｇである。

【0070】

特定の実施形態において、方法は、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を対象に全身投与することを含む。

【0071】

特定の実施形態において、方法は、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を対象に経口投与することを含む。

【0072】

特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物は、吸入可能な粉末、注射剤、液体、ゲル、固体、カプセルまたは錠剤からなる群から選択される形態で投与される。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物は、粉末の形態で投与される。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物は、注射可能な材料の形態で投与される。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物は、液体の形態で投与される。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物は、ゲルの形態で投与される。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物は、固体の形態で投与される。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物は、カプセルの形態で投与される。特定の実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物は、錠剤の形態で投与される。

【0073】

特定の実施形態において、薬学的に許容されるプリドピジン塩は、プリドピジン塩酸塩である。

【0074】

特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭型認知症、ゲルストマン－ストロイスラー－シャインカー症候群、リティコボディグ（Ｌｙｔｉｃｏ－ｂｏｄｉｇ）病（グアムのＡＬＳ複合体）、神経有棘赤血球症、神経セロイドリポフスチン症、オリーブ橋小脳萎縮症、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、ウィルソン病、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、およびピック病からなる群から選択される神経変性状態の一部であるか、またはそれに関連している。

【0075】

特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、ＰＤの一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、ＭＳＡの一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、ＤＬＢの一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、ＡＬＳの一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、ＰＤＤの一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、ＨＤの一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、ＡＤの一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、ＰＳＰの一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、大脳皮質基底核変性症の一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、前頭側頭型認知症の一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、ゲルストマン－ストロイスラー－シャインカー症候群の一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、リティコボディグ病の一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、神経有棘赤血球症の一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、神経セロイドリポフスチン症の一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、オリーブ橋小脳萎縮症の一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、パントテン酸キナーゼ関連神経変性の一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、ウィルソン病の一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、ＣＢＤの一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、ピック病の一部であるか、またはそれに関連している。

【0076】

特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、パーキンソン病（ＰＤ）の一部であるか、またはそれに関連している。特定の実施形態において、ＰＤはＰＤ－ＧＢＡである。

【0077】

特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、多系統萎縮症（ＭＳＡ）の一部であるか、またはそれに関連している。

【0078】

特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）の一部であるか、またはそれに関連している。

【0079】

特定の実施形態において、パーキンソニズムまたはその症状は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の一部であるか、またはそれに関連している。

【0080】

本発明はさらに対象に低用量のプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を投与し、それによって対象を治療することを含む、ＰＤの低下の治療、阻害または低減を必要とする対象におけるそれを行うための方法を提供する。

【0081】

本発明はさらに、対象に低用量のプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を投与し、それによってＰＤに罹患した対象における機能低下を緩徐化することを含む、ＰＤに罹患した対象における機能低下を緩徐化する方法を提供する。

【0082】

本発明はさらに、対象に低用量のプリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を投与し、それによってＰＤに罹患した対象における機能的神経回復を誘発／促進することを含む、ＰＤに罹患した対象における機能的神経回復を誘発／促進する方法を提供する。

【0083】

別の実施形態において、本発明はさらに、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）変異に関連するパーキンソン病（ＰＤ）、ＧＢＡ欠乏症、多系統萎縮症（ＭＳＡ）またはレビー小体型認知症（ＬＢＤ）を治療する方法を提供する。別の実施形態において、本発明はさらに、ＧＢＡ突然変異に関連するＰＤを治療する方法を提供する。別の実施形態において、本発明はさらに、ＧＢＡ欠乏に関連するＰＤを治療する方法を提供する。別の実施形態において、本発明はさらに、多系統萎縮症（ＭＳＡ）に関連するパーキンソニズムを治療する方法を提供する。別の実施形態において、本発明はさらに、レビー小体型認知症（ＬＢＤ）に関連するパーキンソニズムを治療する方法を提供する。

【0084】

リソソーム加水分解酵素グルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）をコードするＧＢＡ遺伝子の変異は、パーキンソン病（ＰＤ）を発症する最も一般的な危険因子であり、ＰＤ患者の５～２０％が保因者である。ＰＤ－ＧＢＡ患者は発症年齢が若く、一般的なＰＤ患者集団よりも認知変化により関連する。

【0085】

ＰＤおよびＧＢＡ遺伝子における劣性変異によって引き起こされるリソソーム蓄積症ゴーシェ病（ＧＤ）との間には臨床的な関連性がある。ＧＤ患者および遺伝子保因者はＰＤを発症するリスクが高くなる。（１）ＥＲストレス、（２）ミトコンドリア機能障害、（３）自食作用の欠陥、（４）ＢＤＮＦレベルおよび軸索輸送の欠陥を含む、ＧＢＡ関連の神経変性に寄与するいくつかの細胞メカニズムが提案されている。

【0086】

パーキンソニズムは、ＭＳＡおよびＬＢＤの両方の初期の特徴である。ＭＳＡの症状には、運動障害（筋肉の制御もしくは動きの喪失もしくは制限、または可動性の制限）を含み、ＰＤと同様の振戦、硬直、および／または筋肉協調の喪失、発話および歩行（人の歩き方）の困難を含み得る。

【0087】

ＭＳＡは、男性および女性、およびすべての人種群を含む、まれな病気である。症状は５０代に現れる傾向があり、５年～１０年の経過の間に急速に進行し、運動機能が徐々に失われ、最終的にはベッドに閉じ込められる。現在、病気の進行を緩徐化することができる薬はなく、治療法もない。ＭＳＡには、歴史的にシャイドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、および線条体黒質変性症と呼ばれていた障害を含む。

【0088】

レビー小体型認知症（ＬＢＤ）は進行性の脳障害であり、レビー小体（アルファ－シヌクレインと呼ばれるタンパク質の異常な沈着物）が、ＰＤと同様の行動、認知、および運動を調節する脳の領域に蓄積する。

【0089】

一実施形態において、対象は、ヒト患者である。

【0090】

一実施形態において、プリドピジンは経口投与される。一実施形態において、プリドピジンは経口投与される。

【0091】

一実施形態において、プリドピジンは、吸入可能な粉末、注射剤、液体、ゲル、固体、カプセルまたは錠剤の形態で投与される。

【0092】

一実施形態において、プリドピジンは定期的に投与される。

【0093】

一実施形態において、プリドピジンは、１日１回よりも少ない頻度で投与される。一実施形態において、プリドピジンは毎日投与される。一実施形態において、プリドピジンは１日１回投与される。別の実施形態において、プリドピジンは、１日１回よりも頻繁に投与される。一実施形態において、プリドピジンは、１日２回または１日３回投与される。

【0094】

一実施形態において、１０ｍｇ／日～１００ｍｇ／日の間の低用量で投与されるプリドピジンの量。一実施形態において、投与されるプリドピジンの量は、２０ｍｇ／日～９０ｍｇ／日の間である。一実施形態において、投与されるプリドピジンの量は、４５ｍｇ／日～９０ｍｇ／日である。一実施形態において、投与されるプリドピジンの量は、２０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日である。別の実施形態において、投与されるプリドピジンの量は、約２０ｍｇ／日、２２．５ｍｇ／日、約４５ｍｇ／日、約６７．５ｍｇ／日、約９０ｍｇ／日、約１００ｍｇ／日である。一実施形態において、投与されるプリドピジンの量は、４５ｍｇ／日である。一実施形態において、投与されるプリドピジンの量は、９０ｍｇ／日である。

【0095】

一実施形態において、１日あたり１用量のプリドピジンの量が投与される。一実施形態において、１日あたり２用量のプリドピジンの量が投与される。

【0096】

一実施形態において、１用量で投与されるプリドピジンの量は、約１０ｍｇ、約２２．５ｍｇ、約４５ｍｇ、約６７．５ｍｇ、約９０ｍｇである。

【0097】

一実施形態において、１用量あたり４５ｍｇの量で、１日あたり２用量のプリドピジンの量が投与される。

【0098】

一実施形態において、プリドピジンの定期投与は、少なくとも３日、少なくとも３０日、少なくとも４２日、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、少なくとも２４週間、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも１５年、少なくとも２０年、少なくとも２５年、または３０年以上継続する。

【0099】

一実施形態において、プリドピジンは、対象における症状の発症を遅らせることによって対象を治療する。

【0100】

前述の実施形態について、本明細書に開示される各実施形態は、他の開示される実施形態のそれぞれに適用し得ると考えられる。さらに、方法の実施形態に列挙された要素は、本明細書に記載の医薬組成物、使用、およびパッケージの実施形態において使用され得、逆もまた同様である。

【0101】

用語

【0102】

本明細書で使用される場合、特に明記されていない限り、以下の各用語は、以下の定義を有するものである。

【0103】

本明細書で使用される場合、「プリドピジン」は、プリドピジン塩基またはその薬学的に許容される塩を意味する。

【0104】

本発明に従って使用するための活性化合物は、意図された投与に適した任意の形態で提供され得る。適切な形態には、薬学的に許容される塩、および本発明の化合物のプレドラッグ形態またはプロドラッグ形態が含まれる。

【0105】

「その塩」は、化合物の酸性または塩基性塩を作製することによって修飾された本化合物の塩である。この点での「薬学的に許容される塩」という用語は、薬学的使用に適した本発明の化合物の比較的非毒性の無機および有機酸または塩基付加塩を指す。薬学的に許容される塩は、当技術分野で周知および記載されている手順によって形成され得る。そのような塩を調製する１つの手段は、本発明の化合物を無機塩基で処理することによるものである。

【0106】

本発明の化合物の酸付加塩の例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、アコネート、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、ケイ皮酸塩、クエン酸塩、エンボネート、エナンテート、フマル酸塩、グルタミン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレン－２－スルホン酸塩、フタル酸塩、サリチル酸塩、ソルビン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トルエン－ｐ－スルホン酸塩などを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、プリドピジンは、ＨＣｌ塩または酒石酸塩などの薬学的に許容される塩である。好ましくは、本明細書に記載される本発明の任意の実施形態において、プリドピジンは、その塩酸塩の形態である。

【0107】

本明細書で使用される場合、ミリグラムで測定されるプリドピジンの「量」または「用量」は、調製物の形態にかかわらず調製物中に存在するプリドピジン（４－［３－（メチルスルホニル）フェニル］－１－プロピル－ピペリジン）のミリグラムを指す。例えば、「９０ｍｇのプリドピジン」を含む単位用量は、製剤の形態にかかわらず、製剤中のプリドピジンの量が９０ｍｇであることを意味する。したがって、塩、例えばプリドピジン塩酸塩の形態である場合、９０ｍｇのプリドピジンの用量を提供するために必要な塩形態の重量は、塩の存在のために９０ｍｇよりも大きいであろう。

【0108】

当業者が理解するように、「増加した」または「減少した」という用語は、患者の任意のタイプの症状を指す場合、対応する健康な対象、対応する健康な被験者の群、または患者自身の病歴における症状の存在および／または重症度と比較したものである。

【0109】

「機能低下」という用語は、いくつかの実施形態において、職業、財政、家事、必要とする低レベルの世話および日常生活動作（ＡＤＬ）を維持する対象の能力のうちの１つ以上を指す。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、職業、財政、家事、必要とする低レベルの世話および日常生活動作（ＡＤＬ）を維持する１つ以上の対象能力の予防、治療、緩徐化、または逆転の方法を提供する。

【0110】

追加の機能障害／身体障害評価は、ジスキネジア患者のＵＤｙｓＲＳスケールに組み込まれている。このスケールは、ＡＤＬを実行する患者の能力の直接観察を招く。ＵＤｙｓＲＳのパート３および４は、患者のＡＤＬ機能がどのように影響を受けるかについて説明している。

【0111】

「機能低下」という用語は、例えば、ＰＤ患者の場合、日常生活の活動を含む統一パーキンソン病評価尺度パートＩＩ（ＵＰＤＲＳパートＩＩ）による低下を含む。例えば、ＰＤの修正版ホーエンおよびヤール分類は、ステージ０（疾患の兆候なし）、ステージ１（片側性疾患）、ステージ１．５（片側性および軸性病変）、ステージ２（両側性疾患、バランスの障害なし）、ステージ２．５（軽度の両側性疾患、プルテストで回復）、ステージ３（軽度から中等度の両側性疾患、ある程度の姿勢の不安定性、身体的に独立）、ステージ４（重度の障害、まだ補助なしで歩行または立つことができる）、およびステージ５（車椅子に縛られているか、補助がない限り寝たきりである）。

【0112】

「日常生活動作」という用語は、さらにシュワブおよびイングランドの日常生活動作スケールによる低下を含む。これには、１００％（完全に独立している。遅さ、困難、または障害なしにすべての雑用を行うことができる。本質的に正常である。任意の困難を認識していない。）、９０％（完全に独立している。ある程度の遅さ、困難、障害を伴いすべての雑用を行うことができる。２倍の時間がかかる場合がある。困難に気づき始めている。）、８０％（ほとんどの雑用で完全に独立している。２倍の時間がかかる。困難および遅さを意識している。）、７０％（完全に独立しているわけではない。いくつかの雑用でより困難。中には３～４倍のかかるものもある。１日の大部分を雑用に費やす必要がある。）、６０％（一部の依存関係。ほとんどの雑用を行うことができるが、非常にゆっくりと多くの労力を要する。間違い、いくつか不可能である。）、５０％（より依存する。半分手伝い、遅い。すべての困難。）、４０％（非常に依存している。すべての雑用を支援できるが、単独ではほとんどできない。）、３０％（努力を払って、時々、単独でいくつかの雑用を行うか、単独で開始する。多くの助けが必要である。）、２０％（単独では何もできない。いくつかの雑用を少し助けることができる。重大な病人。）、１０％（完全に依存、無力。完全に病人。）、および０％（嚥下、膀胱、腸の機能などの単調な機能が機能していない。寝たきり。）。

【0113】

本明細書で使用される場合、「単位用量」、「複数の単位用量」および「単位剤形（複数可）」は、単一の薬物投与実体／実体（複数）を意味する。「単位用量」、「複数の単位用量」および「単位剤形（複数可）」は、錠剤、カプセル、ピル、粉末、および顆粒などの経口剤形のために調製され得る。

【0114】

本明細書で使用される場合、数値または範囲の文脈における「約」は、列挙または特許請求された数値または範囲の９０～１１０％を意味する。

【0115】

「対象への投与」または「（ヒト）患者への投与」とは、関連する症状、例えば病的状態を遅延、緩和、治癒、または軽減するために、対象／患者に薬剤、薬物、または治療薬を与える、調剤する、または適用することを意味する。経口投与は、本発明の化合物を対象に投与する１つの方法である。

【0116】

本発明による化合物は、基本形態または薬学的に許容される塩の形態で、好ましくは１つ以上のアジュバント、賦形剤、担体、緩衝液、希釈剤、および／または他の通常の医薬補助剤と一緒の医薬組成物で投与され得る。

【0117】

「薬学的に許容される担体」とは、合理的な利益／リスク比に見合った過度の有害な副作用（毒性、刺激、およびアレルギー反応など）なしにヒトおよび／または動物での使用に適した担体または賦形剤を指す。それは、本発明の化合物を対象に送達するための、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤またはビヒクルであり得る。

【0118】

投与は定期投与であり得る。本明細書で使用される場合、「定期的投与」は、ある期間によって分離された反復／周期的投与を意味する。投与間の期間は、その時々で一貫していることが好ましい。定期的な投与は、例えば、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、毎週、１週間に２回、１週間に３回、１週間に４回などの投与を含み得る。

【0119】

本明細書で使用される「治療する」または「治療」は、ＰＤに罹患した対象における身体的、精神的または感情的制限の緩和、軽減、重症度の減少、排除または実質的排除、または改善を包含する。治療とは、病気に関連する症状の遅延または予防、あるいは欠損の減少も指す。

【0120】

本明細書で使用される場合、目的を達成するのに有効な量のような「有効な」とは、この開示の方法で使用された場合に合理的な利益／リスク比に見合った過度の有害な副作用（毒性、刺激、またはアレルギー反応など）なしに示された治療反応をもたらすのに十分な成分の量を意味する。例えば、ＰＤの症状を治療するのに効果的な量。特定の有効量は、治療される特定の状態、患者の身体的状態、治療される哺乳動物の種類、治療の期間、併用療法の性質（もしあれば）、および採用される特定の製剤および化合物またはその誘導体の構造などの要因によって異なる。

【0121】

パラメータ範囲が提供される場合、その範囲内のすべての整数、およびその１０分の１もまた、本発明によって提供されることが理解される。例えば、「２２ｍｇ～３００．０ｍｇ」には、２２．０ｍｇ、２２．１ｍｇ、２２．２ｍｇ、２２．３ｍｇ、２２．４ｍｇなど、３００．０ｍｇまでを含む。

【0122】

本発明は、以下の実験の詳細を参照することによってよりよく理解されるであろうが、当業者は、特定の実施例が、その後に続く特許請求の範囲により完全に記載されるように、本発明の例示にすぎないことを容易に理解するであろう。

【0123】

実施例

【0124】

ヘミパーキンソン病のげっ歯類における潜在的なＳ１Ｒアゴニストとしてのプリドピジンの効果が研究された。線条体内６－ヒドロキシドーパミン（６－ＯＨＤＡ）病変を有するマウスはプリドピジンで５週間処置された。結果は、驚くべきことに、低用量（０．３ｍｇ／ｋｇなど）で、プリドピジンが線条体の神経可塑性経路の上方調節を伴う行動的および神経組織学的回復を生じさせることを示している。プリドピジン治療は、Ｓ１Ｒを欠く６－ＯＨＤＡ損傷マウスにおいてこれらの有益な効果のいずれも示さなかった。薬物動態データは、有効量（０．３ｍｇ／ｋｇ）で、プリドピジンの最大脳濃度（Ｃｍａｘ）が１１０ｎｇ／ｍｌであり、ドーパミン受容体ではなくＳ１Ｒに選択的に結合するのに十分な濃度であることを示している。これらの結果は、Ｓ１Ｒアゴニストのように作用することにより、プリドピジンが運動線条体において変性ドーパミンニューロンを保護し、機能的に顕著なレベルのドーパミン作動性線維を回復し得ることを示した最初ものである。

【0125】

方法

【0126】

動物

【0127】

この研究は雄のＣ５７Ｂｌ６Ｊマウスで実施された（体重は約２５ｇで、実験開始時は８～９週齢である）。合計６５匹の野生型マウスおよび５２匹のＳ１Ｒノックアウト（ＫＯ）マウスが使用された。Ｓ１Ｒノックアウトマウスおよび野生型同腹仔（両方の性別）は、Ｃ５７ＢＬ６Ｊバックグラウンドで飼育された。そのＳ１Ｒ ＫＯ系統は、Ｍｕｔａｎｔ Ｍｏｕｓｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ（ＭＭＲＲＣ）によって配布されたよく特徴付けられたＳｉｇｍａｒ１^{Ｇｔ（ＯＳＴ４２２７５６）Ｌｅｘ}マウス系統に由来する。マウスは、餌および水は自由摂取で１２時間の明暗サイクルで飼育された。飼育条件および実験的処置は、動物研究に関するＭａｌｍｏ－Ｌｕｎｄ倫理委員会によって承認された。

【0128】

６－ＯＨＤＡ病変

【0129】

病変は、以前に記載された手順［Ｆｒａｎｃａｒｄｏ Ｖ，Ｂｅｚ Ｆ，Ｗｉｅｌｏｃｈ Ｔ，Ｎｉｓｓｂｒａｎｄｔ Ｈ，Ｒｕｓｃｈｅｒ Ｋ，Ｃｅｎｃｉ ３３．ＭＡ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｍａ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｈａｓ ｎｅｕｒｏｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ． Ｂｒａｉｎ：Ａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０１４；１３７（Ｐｔ ７）：１９９８－２０１４］に従って実施された。簡単に説明すると、マウスは、イソフルラン（Ｉｓｏｂａ（登録商標）ｖｅｔ、Ａｐｏｔｅｋｓｂｏｌａｇｅｔ、Ｓｏｌｎａ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、１０８スウェーデン）で麻酔され、平らな頭蓋骨の位置で定位固定フレームに配置された。６－ＯＨＤＡ－ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、スウェーデン）は、１ミリリットルあたり３．２ｍｇの遊離塩基の濃度で０．０２％アスコルビン酸塩－生理食塩水に新たに溶解された。部位ごとに１マイクロリットルの毒素溶液を次の座標で右線条体に注入した（ブレグマ、矢状縫合、硬膜表面に対してｍｍで指定、Ｐａｘｉｎｏｓ ａｎｄ Ｆｒａｎｋｌｉｎ、２００１を参照）：ＡＰ＋１．０、ＭＬ－２．１、およびＤＶ－２．９、部位１、およびＡＰ＋０．３、ＭＬ－２．３、およびＤＶ－２．９、部位２。溶液はガラスキャピラリー（先端の直径約５０（１ｍ））を介して０．５（１Ｌ／ｍｉｎ）の速度で注入され、各注入後、キャピラリーは２ｍｉ間置いたままであった。

【0130】

処置

【0131】

プリドピジンは、使用直前に生理食塩水に溶解され、１日１回の皮下（ｓｃ）注射で０．１ｍＬ／１０ｇ体重の量で注射された。最初の注射は、病変手術の完了直後に行われた。最初の実験において、プリドピジンは０．３または１．０ｍｇ／ｋｇのいずれかで投与された。０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンのみが機能的に関連する神経回復を生じさせることを確認した後、この用量が残りの研究のために選択された。プリドピジンは常に午後２時頃に投与され、行動テストは常に午前９時～午前１０時３０分で実施された（プリドピジンの潜在的な運動効果による交絡因子を除外するために、このタイムラグは許容された）。

【0132】

行動テスト

【0133】

この研究に参加したすべてのマウスは、週に１回３つの行動テストを受けた。

【0134】

（ｉ）自発的回転活動

【0135】

片側黒質線条体除神経に起因する姿勢および自発運動の非対称性は、オープンフィールドでの自発的回転のテストを使用して評価された。このテストにおいて、動物は試験環境の新規性に応じて６－ＯＨＤＡ病変と同側に一時的に向きを変え、テストを繰り返すとすべての動物において回転反応が徐々に低下する［Ｆｒａｎｃａｒｄｏ Ｖ，Ｂｅｚ Ｆ，Ｗｉｅｌｏｃｈ Ｔ，Ｎｉｓｓｂｒａｎｄｔ Ｈ，Ｒｕｓｃｈｅｒ Ｋ，Ｃｅｎｃｉ ３３．ＭＡ．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ Ｌ－ＤＯＰＡ ｉｎ ｔｈｅ ６－ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ．２０１１；４２（３）：３２７－３４０］。

【0136】

簡潔に言うと、各マウスはオープンフィールド（５０×５０ｃｍ）の中央に個別に配置され、最大活動の期間に対応して、すぐに１０分間ビデオ録画された［Ｆｒａｎｃａｒｄｏ Ｖ，Ｒｅｃｃｈｉａ Ａ，Ｐｏｐｏｖｉｃ Ｎ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｄ，Ｎｉｓｓｂｒａｎｄｔ Ｈ，Ｃｅｎｃｉ ＭＡ．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ Ｌ－ＤＯＰＡ ｉｎ ｔｈｅ ６－ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ．２０１１；４２（３）：３２７－３４０］。全回転（３６０回転の連続）は、実験的に盲検化された調査員によってオフラインでカウントされた。データは、テストセッションごとに病変と同側の正味の完全に向きを変えた総数として表される。

【0137】

（ｉｉ）シリンダーテスト

【0138】

垂直な探索中の前肢使用の非対称性は、ヘミパーキンソン病のげっ歯類における前肢の無動の検証された尺度を提供する［Ｌｕｎｄｂｌａｄ Ｍ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｍ，Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｃ，Ｋｉｒｉｋ Ｄ，Ｗｉｅｒｕｐ Ｎ，Ｃｅｎｃｉ ＭＡ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｏｆ ａｋｉｎｅｓｉａ ａｎｄ ｄｙｓｋｉｎｅｓｉａ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００２；１５（１）：１２０－３２］。テストは、［Ｆｒａｎｃａｒｄｏ Ｖ，Ｂｅｚ Ｆ，Ｗｉｅｌｏｃｈ Ｔ，Ｎｉｓｓｂｒａｎｄｔ Ｈ，Ｒｕｓｃｈｅｒ Ｋ，Ｃｅｎｃｉ ３３．ＭＡ］のように実行された。簡潔に言うと、マウスは個別にガラスシリンダー１６１（直径１０ｃｍ、高さ１４ｃｍ）中に配置され、３～５分間ビデオ録画された。病変の反対側の足によって独立して実行された支持壁接触の数は、各セッションにおけるすべての支持壁接触のパーセンテージとして表された。

【0139】

（ｉｉｉ）ステッピングテスト

【0140】

実験者が課した動き中に調整ステップを実行する能力の障害（ステッピングテスト）は、ＰＤに関連する運動および姿勢の欠損の両方を反映している［Ｂｌｕｍｅ ＳＲ，Ｃａｓｓ ＤＫ，Ｔｓｅｎｇ ＫＹ．Ｓｔｅｐｐｉｎｇ ｔｅｓｔ ｉｎ ｍｉｃｅ：ａ ｒｅｌｉａｂｌｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｆｏｒｅｌｉｍｂ ａｋｉｎｅｓｉａ ｉｎ ＭＰＴＰ－ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００９；２１９（１）：２０８－１１．Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｃ，Ｂｅｎｔｌａｇｅ Ｃ，Ｎｉｋｋｈａｈ Ｇ，Ｓａｍｉｉ Ｍ，Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ Ａ．Ｉｎｔｒａｎｉｇｒａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｏｆ ＧＡＢＡ－ｒｉｃｈ ｓｔｒｉａｔａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｄｕｃｅ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｉｎｔｒａｓｔｒｉａｔａｌ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．１９９９；１５５（２）：１６５－８６］。マウスは、特注のプラスチック製の廊下（幅７ｃｍ、長さ１ｍ、高さ１０ｃｍの壁に挟まれた）の入り口に配置され、尾でそっと持ち上げられ、一定の速度（１ｍ／４ｓ）で後方に引っ張られた。各試験はビデオ録画され、映像は各前肢によって実行された調整ステップの数を数えるために使用された。マウスが（逃げたり探索したりするために）廊下の壁に向かって体を９０度回転させた試験は破棄された。各セッションにおいて、動物ごとに３つの有効な試験が得られるまでマウスはテストされた。結果は、総ステップ数に対する病変の反対側の前肢（左）によって実行されたステップのパーセンテージとして表された（セッションあたり３回の試験の平均）。

【0141】

脳の調製

【0142】

免疫組織化学に割り当てられたマウスは、最後のラグ／生理食塩水投与の翌日（最後の注射から約２０時間の間隔）に灌流固定された。動物は、ペントバルビタールナトリウム（２４０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で深く麻酔され、０．９％生理食塩水、続いて氷冷緩衝４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）で経心的に灌流された。迅速な抽出後、脳は、同じ固定剤に２時間浸し、氷冷リン酸緩衝２５％ショ糖溶液中で一晩組織凍害から保護された。３０個の冠状切片（厚さ１ｍ）がスライド式ミクロトームで切断され、非凍結溶液（０．１Ｍリン酸緩衝液中の３０％エチレングリコールおよび３０％グリセロール）中で－２０℃で保存した。

【0143】

ウエスタンブロット分析のために準備された動物は、頸椎脱臼によって安楽死させられ、彼らの脳は急速に抽出され、砕いたドライアイス上で凍結された。組織試料はクリオスタットチャンバー（－１４℃）中で解剖された。対軸方向レベルにまたがる冠状脳スライス、ブレグマに対して＋１．１８～－０．３４ｍｍは、マウスの脳形状コンテナを使用して抽出された。線条体は、メスの刃を使用して解剖された。黒質由来の組織試料は、ブレグマに対して体軸方向レベル－２．７０～－３．８０にまたがる直径２ｍｍの組織パンチャーで採取された。試料は、さらに分析するまで凍結された。

【0144】

定量的免疫組織化学

【0145】

免疫組織化学および定量分析は、チロシンヒドロキシラーゼに対する一次抗体［Ｍｙｓｏｎａ ＢＡ，Ｚｈａｏ Ｊ，Ｓｍｉｔｈ Ｓ，Ｂｏｌｌｉｎｇｅｒ ＫＥ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｉｇｍａ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ＢＤＮＦ ｉｎ ｔｈｅ ｖｉｓｕａｌ ｓｙｓｔｅｍ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１８；１６７：２５－３０］（Ｐｅｌ－Ｆｒｅｅｚ、Ｒｏｇｅｒｓ、ＡＲからのウサギ抗ＴＨ抗血清、１：１０００）およびＣｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ６８（ＣＤ６８）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、英国からのラット抗ＣＤ６８抗血清、１：１０００）を使用した確立されたプロトコル［Ｆｒａｎｃａｒｄｏ Ｖ、Ｂｅｚ Ｆ、Ｗｉｅｌｏｃｈ Ｔ、Ｎｉｓｓｂｒａｎｄｔ Ｈ、Ｒｕｓｃｈｅｒ Ｋ、Ｃｅｎｃｉ ３３．ＭＡ．．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ．２０１１；４２（３）：３２７－３４０］に従って実行された。定量分析は、以下の方法を使用して、実験的に盲検化された研究者によって実行された。

【0146】

黒質緻密部（ＳＮｃ）におけるＴＨ陽性細胞体の数は、［Ｗｅｓｔ ＭＪ．Ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｓｙｎａｐｓｅｓ：ｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｉａｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．１９９９；２２（２）：５１－６１］のように光学分留装置に従ってバイアスのない立体学を使用して決定された。

【0147】

分析は、ＮｅｗＣＡＳＴソフトウェア（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ）によって制御されるｘｙ電動ステージを備えたＮｉｋｏｎ ８０ｉ顕微鏡を使用して実行された。試料採取画分は、確立されたプロトコル［Ｆｒａｎｃａｒｄｏ Ｖ，Ｒｅｃｃｈｉａ Ａ，Ｐｏｐｏｖｉｃ Ｎ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｄ，Ｎｉｓｓｂｒａｎｄｔ Ｈ，Ｃｅｎｃｉ ＭＡ．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ Ｌ－ＤＯＰＡ ｉｎ ｔｈｅ ６－ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ．２０１１；４２（３）：３２７－３４０］に従って、動物ごとに片側あたり少なくとも１００ニューロンをカウントするように選択され、ＳＮｃにおけるＴＨ陽性ニューロンの総数は、光学分留装置式を使用して推定された。つまり、ニューロンの数＝１／ｓｓｆ（スライス試料採取画分）ｘ１／ａｓｆ（面積試料採取画分）ｘ１／ｔｓｆ（厚さ試料採取画分）ｘＥ（カウントされたオブジェクトの数）［Ｗｅｓｔ ＭＪ．Ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｓｙｎａｐｓｅｓ：ｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｉａｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．１９９９；２２（２）：５１－６１］。

【0148】

ＴＨ免疫反応性線維の密度は、画像セグメンテーションソフトウェア（ＶＩＳ、Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ、Ｈ０ｒｓｈｏｌｍ、デンマーク）を使用して、線条体の高度に除神経された外側部分において測定された。この目的のために、外側線条体は、明確に定義された解剖学的ランドマークを使用して、動物ごとに４つの体軸方向レベルにおいてＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ顕微鏡における低倍率（４倍の対物レンズ）で輪郭が描かれた（［Ｆｒａｎｃａｒｄｏ Ｖ，Ｒｅｃｃｈｉａ Ａ，Ｐｏｐｏｖｉｃ Ｎ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｄ，Ｎｉｓｓｂｒａｎｄｔ Ｈ，Ｃｅｎｃｉ ＭＡ．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ Ｌ－ＤＯＰＡ ｉｎ ｔｈｅ ６－ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ．２０１１；４２（３）：３２７－３４０］のように）。次に、自動無作為試料採取が１００倍の対物レンズの下で適用され、すべての切片において関心対象の構造の一定の割合（外側線条体断面積の１０％）をカバーした。画像は、デジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ７２）で捕捉され、マウスごとに２５～３０個の試料領域が取得された（領域サイズ、５７４２（ｉｍ^２））。各画像で、ベイジアンアルゴリズムベースのピクセル分類器を使用して、明確なＴＨ免疫陽性線維は、バックグランドオブジェクトから分離された［Ｗｅｓｔｉｎ ＪＥ，Ｌｉｎｄｇｒｅｎ ＨＳ，Ｇａｒｄｉ Ｊ，Ｎｙｅｎｇａａｒｄ ＪＲ，Ｂｒｕｎｄｉｎ Ｐ，Ｍｏｈａｐｅｌ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｓａｌ ｇａｎｇｌｉａ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ３，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ－Ｌ－ａｌａｎｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｙｓｋｉｎｅｓｉａ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：Ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００６；２６（３７）：９４４８－６１］。

【0149】

結果は、試料領域あたりのＴＨ免疫陽性ピクセルの総数（領域全体で平均化された）として表された。この群において存在する微細なドーパミン作動性繊維メッシュ（タイプＩ繊維、［Ｓｏｎｇ ＤＤ，Ｈａｂｅｒ ＳＮ．Ｓｔｒｉａｔａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｐａｒｔｉａｌ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｌｅｓｉｏｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：Ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２０００；２０（１３）：５１０２－１４］）のため、この分析は偽病変動物では実行されなかった、これは明確な軸索構造の解決を妨げた。無作為な試料領域でのＴＨ繊維の高倍率分析は、背外側および腹外側線条体全体にわたるＴＨ免疫染色の光学密度（Ｏ．Ｄ．）測定によって補完された。この方法は実際の繊維分析よりもはるかに感度が低くなるが［Ｆｒａｎｃａｒｄｏ Ｖ，Ｂｅｚ Ｆ，Ｗｉｅｌｏｃｈ Ｔ，Ｎｉｓｓｂｒａｎｄｔ Ｈ，Ｒｕｓｃｈｅｒ Ｋ，Ｃｅｎｃｉ ３３．ＭＡ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｍａ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｈａｓ ｎｅｕｒｏｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ．Ｂｒａｉｎ ：Ａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０１４；１３７（Ｐｔ ７）：１９９８－２０１４］、関心領域全体にわたる全体的な神経支配密度の指標を提供する。

【0150】

ＯＤ分析は、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して同じ体軸方向レベルで実行された［Ｆｒａｎｃａｒｄｏ Ｖ，Ｒｅｃｃｈｉａ Ａ，Ｐｏｐｏｖｉｃ Ｎ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｄ，Ｎｉｓｓｂｒａｎｄｔ Ｈ，Ｃｅｎｃｉ ＭＡ．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ Ｌ－ＤＯＰＡ ｉｎ ｔｈｅ ６－ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ．２０１１；４２（３）：３２７－３４０］。バックグラウンド値（各動物の脳梁で測定）を差し引いた後、病変と同側のＯＤを、同じ動物の無傷の側のＯＤのパーセンテージとして表した（無傷の側からの値は正常な神経支配密度を表す）［Ｆｒａｎｃａｒｄｏ Ｖ，Ｒｅｃｃｈｉａ Ａ，Ｐｏｐｏｖｉｃ Ｎ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｄ，Ｎｉｓｓｂｒａｎｄｔ Ｈ，Ｃｅｎｃｉ ＭＡ．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ Ｌ－ＤＯＰＡ ｉｎ ｔｈｅ ６－ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ．２０１１；４２（３）：３２７－３４０］。

【0151】

性活ミクログリアの形態を示すＣＤ６８免疫陽性細胞［Ｃｉｃｃｈｅｔｔｉ Ｆ，Ｂｒｏｗｎｅｌｌ ＡＬ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｋ，Ｃｈｅｎ ＹＩ，Ｌｉｖｎｉ Ｅ，Ｉｓａｃｓｏｎ Ｏ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｉｇｒｏｓｔｒｉａｔａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ６－ＯＨＤＡ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ＰＥＴ ｉｍａｇｉｎｇ．Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００２；１５（６）：９９１－８、Ｐｅｒｒｙ ＶＨ，Ｔｅｅｌｉｎｇ Ｊ．Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ａｎｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ：ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｐｒｉｍｉｎｇ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｈｒｏｎｉｃ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２０１３；３５（５）：６０１－１２］は、ＳＮｃの本体（ブレグマの後方の体軸方向レベル３．４０～３．６４に対応）および腹外側線条体（ブレグマの前方０．２６－０．０２）で手動でカウントされた。この目的のために、関心領域を描写するマスクは、４倍の倍率で定義され、試料領域（３６，９２１（サイズ１ｍ^２））は、ＮｅｗＣＡＳＴソフトウェア（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ）によって制御されるｘ－ｙ電動ステージを使用して４０倍の対物レンズの下でこのマスク内で無作為に採集された。病変と同側のＣＤ６８免疫陽性細胞の数は、反対側のＣＤ６８免疫陽性細胞のパーセンテージとして表された。

【0152】

ウエスタンブロット解析

【0153】

組織ホモジネートは、細胞溶解緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２．５ｍｍｏｌ／Ｌピロリン酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ｜３－グリセロールホスフェート、１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ３ＶＯ４、１１ｇ／ｍＬロイペプチン、および１ｍｍｏｌ／Ｌフェニルメチルスルホニルフルオリド）において調製された。２０マイクログラムのタンパク質を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離した。タンパク質は、ポリビニルジフルオリドメンブレンに転写され、ブロッキングバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１３６ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．６、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０、５％脱脂粉乳）でインキュベートされた。その後、次の一次抗体のうちのひとつを使用して、膜は４℃で一晩インキュベートされた：ウサギポリクローナル抗ＧＤＮＦ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、１：１０００）およびモノクローナル抗ＢＤＮＦ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、１：１０００）、Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４リン酸化ＥＲＫ１／２に対するウサギポリクローナル抗体（ｐ４４／４２－ＭＡＰＫ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、１：２０００）。適切な洗浄ステップに続いて、メンブレンはＨＲＰ結合二次抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、ドイツ、１：１５０００）とともにインキュベートされた。化学発光キット（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｗａｔｆｏｒｄ、Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、英国）を使用して信号が視覚化され、ＣＣＤカメラ（ＬＡＳ１０００システム、富士フィルム、東京、日本）を使用して画像が取得された。ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して、特定の免疫反応性バンドで光学密度が測定された。次に、メンブレンは剥がされ、｜－アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１：５０，０００）で再探査された。次に、特定のバンドの光学密度は同じレーンの｜－アクチンバンドで正規化された。

【0154】

プリドピジン脳組織結合

【0155】

プリドピジンの脳結合特性は、製造元のプロトコルに従って、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの急速平衡透析（ＲＥＤ）デバイスインサートを使用した急速平衡透析による新鮮なマウス脳ホモジネートを使用してインビトロで評価された。

【0156】

統計分析

【0157】

慢性処置期間にわたって記録された行動データは、反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）および事後ボンフェローニ検定を使用して比較された。残りのすべての分析は、対応のないｔ検定または１因子ＡＮＯＶＡおよび事後テューキー検定のいずれかを使用して実行された。線条体繊維密度は、これらのデータが正規分布していないため、ノンパラメトリック統計（クラスカル－ウォリスおよび事後ダン検定）を使用して分析された。特に明記しない限り、データは群平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。ＡＮＯＶＡの正確なｐおよびＦ値は図の凡例に報告されているが、事後のペアワイズ比較は有意または非有意のいずれかとして報告されている。すべての比較において、統計的有意性のレベルはｐ＜０．０５に設定されている。

【0158】

ＥＲストレス測定

【0159】

ＥＲストレスレベルは、ＥＲストレスの初期段階のタンパク質指標としてＨ２ａ－ＧＦＰを使用して測定され得る。Ｈ２ａ－ＧＦＰは誤って折りたたまれた分泌タンパク質であり、ＥＲストレスに応答して蓄積する。ＳＴＨｄｈＱ７／７は、７つのポリグルタミンリピート（野生型）を有するホモ接合型ヒト化ハンチンチン遺伝子（ＨＴＴ）を含むノックイントランスジェニックマウス由来の線条体由来細胞株である。ＳＴＨｄｈＱ７／７細胞は、Ｈｔｔ９６Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ（変異体、ＨＤ患者におけるＨｔｔの典型的な病原性発現を模倣）またはＨｔｔ２０Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ（正常）コンストラクトのいずれかでトランスフェクトされる。蛍光ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質に融合したｐｏｌｙＱ－拡張Ｈｔｔタンパク質（９６Ｑ）エクソン１が発現さえると、個々の細胞のけるタンパク質のレベルおよび凝集が蛍光顕微鏡を使用してモニターされ得る。

【0160】

ミトコンドリア機能障害の誘発および測定

【0161】

ＹＡＣ１２８ ＨＤマウス由来の皮質線条体ニューロンを１μＭプリドピジンで処理し、その後、アンチマイシンＡ（Ａｎｔ Ａ、細胞呼吸、特に酸化的リン酸化およびＡＴＰ産生を阻害する殺魚剤）で刺激してミトコンドリアの活性酸素種（ＲＯＳ）産生を誘発した。ミトコンドリア機能は、ミトコンドリア内Ｈ_２Ｏ_２のレベルを検出する蛍光プローブＭｉｔｏＰＹ１のレベルを測定することによりアッセイされた。ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）は、正に変化した蛍光プローブＴＭＲＭ（テトラメチルローダミンメチルエステル）を使用して、皮質および線条体ニューロンにおいて評価された。ニューロンは、Ｎａ^＋培地中で１５０ｎＭ ＴＭＲＭ（クエンチング条件）とともに３７℃で３０分間インキュベートされた。これらの条件下で、ミトコンドリアによるＴＭＲＭの保持は、Ｄｙ_ｍの変化を推定するために研究された。マイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ Ｇｅｍｉｎｉ ＥＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国）を使用して基底蛍光（５０３ｎｍ励起および５２５ｎｍ発光）が４分間記録された後、２．５μｇ／ｍＬオリゴマイシンとともに２．５μＭ ＦＣＣＰを添加して最大のミトコンドリア脱分極およびミトコンドリアプローブの放出を生じさせた。ＴＭＲＭ放出は、オリゴマイシン／ＦＣＣＰの添加前後の蛍光の違いに基づいて計算された。

【0162】

軸索輸送の視覚化および分析

【0163】

軸索輸送（ＡＴ）を視覚化および分析するために、ＷＴまたはＳＯＤ１Ｇ９３Ａ胚由来の脊髄抽出物がマイクロ流体チャンバーの近位コンパートメントに播種された。遠位コンパートメントにおける軸索にのみ導入されたＱドット－ＢＤＮＦ粒子の逆行性軸索輸送は、ライブイメージングを使用して追跡された。

【0164】

実施例１：プリドピジンは６－ＯＨＤＡ損傷マウスにおける行動回復を誘発する

【0165】

線条体内６－ＯＨＤＡ病変または偽病変を維持している野生型マウスは、病変の同じ日から始めて３５日間、プリドピジン（０．３または１．０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル溶液（「生理食塩水」）で毎日処置された。最終的な統計分析において、プリドピジンまたは生理食塩水で処置された偽病変動物は、それらが非常に類似した結果をもたらしたことを確認した後、１つの群（「偽」）にプールされた。群およびテストセッション間の自発的回転行動の比較は、処置および時点の間の全体的に有意な差を明らかにした（図１Ａ）。６－ＯＨＤＡが注射されたすべての群は、有意な同側回転バイアスを示し、これは、最初の週に最も顕著であり、その後、このテストで通常発生するように、すべての群で徐々に低下した［Ｆｒａｎｃａｒｄｏ Ｖ，Ｂｅｚ Ｆ，Ｗｉｅｌｏｃｈ Ｔ，Ｎｉｓｓｂｒａｎｄｔ Ｈ，Ｒｕｓｃｈｅｒ Ｋ，Ｃｅｎｃｉ ３３．ＭＡ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｍａ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｈａｓ ｎｅｕｒｏｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ． Ｂｒａｉｎ：Ａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０１４；１３７（Ｐｔ ７）：１９９８－２０１４、Ｆｒａｎｃａｒｄｏ Ｖ，Ｒｅｃｃｈｉａ Ａ，Ｐｏｐｏｖｉｃ Ｎ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｄ，Ｎｉｓｓｂｒａｎｄｔ Ｈ，Ｃｅｎｃｉ ＭＡ．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ Ｌ－ＤＯＰＡ ｉｎ ｔｈｅ ６－ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ．２０１１；４２（３）：３２７－３４０］。しかしながら、この低下の程度において群間で非常に有意な差があった（処置および時間の間の相互作用についてはｐ＜０．０００１、図１Ａを参照）。確かに、生理食塩水で処置された６－ＯＨＤＡ損傷マウスは、第１週から第５週および最終週まで偽損傷動物との有意差を維持したが、プリドピジンで治療されたマウスは、治療期間の終わりまでに偽損傷対照とはもはや異ならなかった（図１Ａ、５週目の薬物投与対偽の両方についてｐ＞０．０５）。

【0166】

さらに、０．３ｍｇ／ｋｇの用量を投与されたマウスは、ほとんどの試験セッション中に生理食塩水で治療された動物から明らかに分岐したため、２つの用量のプリドピジンの間に違いが認められた（１～３週目のプリドピジン０．３ｍｇ／ｋｇ対生理食塩水について＊ｐ＜０．０５）一方、１．０ｍｇ／ｋｇのプリドピジンで処置されたマウスは、最初のテストセッションでのみ生理食塩水群と異なった（図１Ａの週を参照、１ｍｇ／ｋｇのプリドピジン対生理食塩水についてｐ＜０．０５）。シリンダーテストにおいて、６－ＯＨＤＡ病変は、すべての処置群において反対側の前肢の使用で同様の欠損をもたらした（図１Ｂの１週目のデータを参照、生理食塩水処置されたマウスおよびプリドピジン処置されたマウスの両方で偽に対して約４０％の差およびｐ＜０．０５）。偽病変対照とのこの有意差は、３週目まで、すべての群で維持された（図１Ｂ）。その後、０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンで処置したマウスは目に見える改善を示し、４週目および５週目に偽対照値に匹敵するパフォーマンスレベルに達した（図１Ｂ、４週目、生理食塩水に対してｐ＜０．０５、偽に対してｐ＞０．０５、５週目、生理食塩水および１．０ｍｇ／ｋｇ用量の両方に対してｐ＜０．０５、および偽物に対してｐ＞０．０５）。対照的に、１．０ｍｇ／ｋｇのプリドピジンによる処置は、シリンダーテストで反対側前肢の使用を回復しなかった（図１Ｂの５週目を参照、プリドピジン－１および生理食塩水群の両方において偽に対して約３３％の差およびｐ＜０．０５）。ステッピングテストにおいても、群およびテストセッションの間に全体的に顕著な差が見られた（図１Ｃ）。病変によって誘発されたステッピング欠損は、最初はすべての群で重度であった（図１Ｃの１週目のデータを参照、生理食塩水およびプリドピジンで処置したマウスの両方において、偽に対して約６０％の差およびｐ＜０．０５）。６つすべて－ＯＨＤＡ損傷マウスは、処置の割り当てに関係なく、最初の２週間は有意な欠損を示し続けた。その後、０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンで処置された動物は徐々に改善を示し、４週目および５週目に生理食塩水で処置された群から顕著に逸脱した。偽の対照値には達していないが、０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンで処置されたマウスのパフォーマンスはビヒクルより約９４％改善された（処置期間の終わりまでに生理食塩水（図１Ｃの５週目を参照、）－生理食塩水およびプリドピジン－１の両方に対するプリドピジン－０．３についてｐ＜０．０５、偽に対してｐ＞０．０５）。１．０ｍｇ／ｋｇのプリドピジンを受けた動物は、最後の２週間でステッピングパフォーマンスが改善する傾向を示したが、生理食塩水で処置したマウスとの差は有意に達しなかった（図１Ｃ、５週目におけるプリドピジン－１および生理食塩水群を参照、偽に対してそれぞれ約４９％および約６３％の差、両方の比較についてｐ＜０．０５）。

【0167】

実施例２：プリドピジンは黒質線条体ドーパミンニューロンに対して神経保護および神経回復効果を有する

【0168】

ＳＮｃにおけるドーパミン作動性細胞体を数えるために偏りのない立体学が使用された。病変と同側において、生理食塩水で処理されたマウスは、黒質ＴＨ陽性ニューロンの約６５％の減少を示した（すなわち、生理食塩水で処理されたマウスの約１９６０細胞対偽病変対照の約５０７６細胞、ｐ＜０．０５、図２Ａ）。０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンで処置されたマウスは、生理食塩水処置と比較して約５５％の増加に対応する、有意な多数のＴＨ陽性ニューロン（約３０３４細胞）を示した（図２Ａ、＊ｐ＜０．０５）。高用量のプリドピジン（１．０ｍｇ／ｋｇ）は、ＳＮ網様部においてより高密度のＴＨ免疫陽性神経突起を生じさせたようにみえたが、ＳＮｃのドーパミン作動性細胞体の有意な保護を与えなかった（約１９０１細胞をカウント、生理食塩水に対してｐ＞０．０５）（図２Ｂおよび図２Ｄを参照）。

【0169】

線条体ＤＡ神経支配密度に対するプリドピジン処置の効果を調べるために、ＴＨ免疫陽性軸索線維が、外側尾状核－被殻にわたって断面積の推定１０％を無作為に試料採取することによって高倍率で測定された（図２Ｆにおいて斜線で囲まれている）。この分析は、無傷の線条体における明確な繊維を解像することが不可能であるため、偽病変マウスには適用され得なかった［Ｆｒａｎｃａｒｄｏ Ｖ，Ｂｅｚ Ｆ，Ｗｉｅｌｏｃｈ Ｔ，Ｎｉｓｓｂｒａｎｄｔ Ｈ，Ｒｕｓｃｈｅｒ Ｋ，Ｃｅｎｃｉ ３３．ＭＡ．、Ｓｏｎｇ ＤＤ，Ｈａｂｅｒ ＳＮ．Ｓｔｒｉａｔａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｐａｒｔｉａｌ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｌｅｓｉｏｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：Ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２０００；２０（１３）：５１０２－１４、Ｇｒａｎａｄｏ Ｎ，Ａｒｅｓ－Ｓａｎｔｏｓ Ｓ，Ｔｉｚａｂｉ Ｙ，Ｍｏｒａｔａｌｌａ Ｒ．Ｓｔｒｉａｔａｌ Ｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ ａｆｔｅｒ Ａｃｕｔｅ Ｍｅｔｈａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｅ．Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１８］。

【0170】

０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンでの慢性処置は、ＴＨ繊維プロファイルの数を著しく増強し（図２Ｆおよび図４Ｇを参照）、生理食塩水を注射した動物と比較して中央値が約１５倍増加した（図２Ｉ、ｐ＜０．０５）。プリドピジン０．３ｍｇ／ｋｇで処置されたすべての動物は、拡大した静脈瘤を抱える太くて高度に分岐した軸索の豊富さを示し（図２Ｇの挿入図）発芽反応を示す［Ｓｏｎｇ ＤＤ，Ｈａｂｅｒ ＳＮ．Ｓｔｒｉａｔａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｐａｒｔｉａｌ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｌｅｓｉｏｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：Ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２０００；２０（１３）：５１０２－１４、Ｇｒａｎａｄｏ Ｎ，Ａｒｅｓ－Ｓａｎｔｏｓ Ｓ，Ｔｉｚａｂｉ Ｙ，Ｍｏｒａｔａｌｌａ Ｒ．Ｓｔｒｉａｔａｌ Ｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ ａｆｔｅｒ Ａｃｕｔｅ Ｍｅｔｈａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｅ．Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１８］。明らかに豊富ではないが、１．０ｍｇ／ｋｇのプリドピジンで処置したマウスでも同様の形態学的特徴が見られたが（図２Ｈ）、この大量投与の効果は統計的有意性に達成しなかった（図２Ｉ、ｐ＞０．０５フォルプリドピジン－１対生理食塩水）。

【0171】

ＤＡ神経支配レベルの全体的な推定値は、これらの領域の全範囲にわたって腹外側線条体および背外側線条体のＴＨ免疫染色のＯＤを測定することによって得られた（図２Ｊ、図２Ｋ）。腹外側線条体において、０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンでの処置は、生理食塩水対照レベルを超えるＴＨ ＯＤの２倍超の増加をもたらした（ｐ＜０．０５）（図２Ｊ）。１ｍｇ／ｋｇのプリドピジンで処置されたマウスは、統計的有意性に達しない増加の傾向を示した（図２Ｊ）。０．３プリドピジンで処置された動物は、背外側線条体においてＴＨ ＯＤのわずかではあるが有意な増加を示し、１ｍｇ／ｋｇのプリドピジンで処置された動物は、やはり傾向のみを示した（図２Ｋ）。まとめると、これらの結果は、０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンによる処置が、高度に枯渇した外側線条体の顕著なドーパミン作動性再神経支配を伴って、黒質ＤＡ細胞体の部分的保護を提供したことを示している。後者の効果は、げっ歯類での前肢の使用を制御する領域である腹外側象限において特に顕著であった［Ｃｈａｎｇ ＪＷ，Ｗａｃｈｔｅｌ ＳＲ，Ｙｏｕｎｇ Ｄ，Ｋａｎｇ ＵＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ａｎａｔｏｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｐａｗ ａｄｊｕｓｔｉｎｇ ｓｔｅｐｓ ｉｎ ｒａｔ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｍｅｄｉａｌ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ｂｕｎｄｌｅ ａｎｄ ｓｔｒｉａｔａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９；８８（２）：６１７－２８、Ｃｏｕｓｉｎｓ ＭＳ，Ｓａｌａｍｏｎｅ ＪＤ．Ｓｋｉｌｌｅｄ ｍｏｔｏｒ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ ｒａｔｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖｅｎｔｒｏｌａｔｅｒａｌ ｓｔｒｉａｔａｌ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎｓ：ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１９９６；７３２（１－２）：１８６－９４］。高用量のプリドピジン（１ｍｇ／ｋｇ）は、どのパラメータに対しても有意な効果には達成しなかった。

【0172】

プリドピジン処置の神経回復効果は、それが関与する領域におけるミクログリア活性化の減少と一致するかどうか研究された。この目的のために、ＳＮｃおよび腹外側線条体のＣＤ６８免疫陽性ミクログリア細胞の数を数えた。この数は、０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンで処置したマウスの両方の領域で有意に減少した（図３Ａ、図３Ｆ、プリドピジン－０．３対生理食塩水についてｐ＜０．０５、偽に対してｐ＞０．０５）。高用量のプリドピジンで処置されたマウスは、ＳＮｃにおいて効果に向かう傾向を示したが（図３Ａ、偽に対してｐ＞０．０５）、腹外側線条体においては効果を示さなかった（図３Ｆ、偽に対してｐ＜０．０５、生理食塩水に対してｐ＞０．０５）。

【0173】

実施例３：プリドピジンによる処置はシグマ－１ＫＯマウスにおいて効果的ではない

【0174】

６－ＯＨＤＡ病変または偽病変を維持しているＳ１Ｒ ＫＯマウスにおけるプリドピジンの有効量（０．３ｍｇ／ｋｇ）が研究された。０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンまたは生理食塩水で処置されたＳ１Ｒ ＫＯ損傷マウスは、処置の５週間を通して同様のレベルの自発的回転（図４Ａ）およびシリンダーテスト（図４Ｂ）およびステッピングテスト（図４Ｃ）において前肢使用の非対称性を示した（すべてのテストおよびセッションにおいて、プリドピジン対生理食塩水についてｐ＞０．０５）。さらに、プリドピジンによる処置は、黒質ＤＡニューロン（図５Ａ）または線条体ＴＨ線維密度（図５Ｅ～図５Ｇ）のいずれにも硬貨を有しなかった（すべてのパラメータでプリドピジン対生理食塩水についてｐ＞０．０５）。これらのデータは、Ｓ１Ｒが存在しない場合、プリドピジンは、損傷した黒質線条体ＤＡ経路に対して修復作用を発揮し得ないことを明確に示している。

【0175】

この実験の興味深い付随的発見は、Ｓ１Ｒ ＫＯマウスが黒質線条体損傷の特徴的なパターンで６－ＯＨＤＡ病変に反応したことである。実際、野生型動物と比較して、６－ＯＨＤＡ損傷Ｓ１Ｒ ＫＯマウスは、ＳＮｃにおけるＤＡ細胞体の軽度の喪失を特徴付けていたが（約６１％の損失に代わって約２２％、図２Ａ対図５Ａにおける生理食塩水群を参照）、外側線条体のＴＨ繊維の低い密度を特徴付けた（ＫＯ対野生型マウスにおける中央値８９９対５８４２繊維ピクセル／試料面積、図２Ｉ対図５Ｅにおける生理食塩水群を参照）。

【0176】

Ｓ１Ｒ ＫＯマウスの黒質細胞体と比較した線条体ドーパミン作動性線維のより重度の変性は、野生型遺伝子型と比較して病変誘発性運動障害の明らかな違い、特に前肢のステッピングにおけるより重度の欠損と一致するそれほど重度ではない回転バイアス を説明する可能性がある（図１および図４を参照）。

【0177】

実施例４：プリドピジンは線条体において神経栄養因子を上方調節し、ＥＲＫ１／２を活性化する

【0178】

プリドピジン０．３ｍｇ／ｋｇによる前肢の使用の逐次の改善、および付随する誘発される線条体ＤＡ線維密度の増加は、栄養因子によって媒介される神経回復作用を示しており、その脳レベルはＳ１Ｒの薬理学的刺激により上昇し得る［Ｐｅｎａｓ Ｃ，Ｐａｓｃｕａｌ－Ｆｏｎｔ Ａ，Ｍａｎｃｕｓｏ Ｒ，Ｆｏｒｅｓ Ｊ，Ｃａｓａｓ Ｃ，Ｎａｖａｒｒｏ Ｘ．Ｓｉｇｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ ２－（４－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅｔｈｙｌ）１ ｐｈｅｎｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（Ｐｒｅ０８４）ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ＧＤＮＦ ａｎｄ ＢｉＰ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｒｏｏｔ ａｖｕｌｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．２０１１；２８（５）：８３１－４０； Ｆｒａｎｃａｒｄｏ Ｖ，Ｂｅｚ Ｆ，Ｗｉｅｌｏｃｈ Ｔ，Ｎｉｓｓｂｒａｎｄｔ Ｈ，Ｒｕｓｃｈｅｒ Ｋ，Ｃｅｎｃｉ ３３．ＭＡ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ Ｍ，Ｈａｙａｓｈｉ Ｔ，Ｕｒｆｅｒ Ｒ，Ｍｉｔａ Ｓ，Ｓｕ ＴＰ．Ｓｉｇｍａ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ．Ｓｙｎａｐｓｅ．２０１２；６６（７）：６３０－９］。

【0179】

ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、およびリン酸化ＥＲＫ１／２（ニューロトロフィンシグナル伝達の主要な細胞内エフェクター［Ｇａｒｃｉａ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＪＭ，Ｐｅｒｅｚ－Ｎａｖａｒｒｏ Ｅ，Ｇａｖａｌｄａ Ｎ，Ａｌｂｅｒｃｈ Ｊ．Ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ ａｒｂｏｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｔｒｉａｔａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｐ４２／ｐ４４ ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｐａｔｈｗａｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００６；８３（１）：６８－７９］）のウエスタンブロット分析は、線条体内６－ＯＨＤＡ病変を維持する野生型マウスの追加群において実施され、その後、０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンまたは生理食塩水で３５日目まで処置された。プリドピジンは、ＧＤＮＦおよびＢＤＮＦレベルの有意な線条体上方調節を促進した（生理食塩水に対してそれぞれ＋３７．６％および＋８０．８％、両方のマーカーについてｐ＜０．０５、図６Ａ、図６Ｃ）。ＳＮにおいて、ＢＤＮＦレベルのみが有意な増加を示した（生理食塩水に対して＋８８．５％、図６Ｄ、ｐ＜０．０５）。プリドピジン０．３ｍｇ／ｋｇでの処置はまた、リン酸化ＥＲＫ１／２の線条体および黒質レベルの増加を生じさせ（図６Ｅ、図６Ｆ）、これは線条体においてのみ有意に達した（生理食塩水に対して＋７１％、ｐ＜０．０５、図６Ｅ）。

【0180】

低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）の効果プロファイルは、外側線条体における黒質ＤＡ細胞体の保護およびドーパミン作動性線維密度の回復の両方を含む。この領域において、ＴＨ陽性線維ネットワークは軸索の再生の典型的な形態学的特徴を示した。これらの形態学的観察に加えて、前肢使用の緩やかな回復（プリドピジン処置の４週間後にのみ有意になった）は、機能回復の中心的なメカニズムとして発芽するＤＡ軸索末端の刺激を指している。この解釈は、線条体において０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンによって生じるＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、およびリン酸化ＥＲＫ１／２の有意な上方調節によってさらに裏付けられる。これらの要因は、インビトロおよびインビボの両方で黒質線条体ＤＡニューロンからの神経突起伸長を強く刺激する。

【0181】

高用量のプリドピジン（１ｍｇ／ｋｇ）は、ほとんどの行動および神経組織学的エンドポイントで全体的に効果がなかった。０．３ｍｇ／ｋｇのプリドピジンの神経回復効果がＳ１Ｒに依存するという明確な証拠は、Ｓ１Ｒにおけるこの用量を評価することによって得られた。

【0182】

実施例５：マウスにおけるプリドピジンの薬物動態

【0183】

マウスにおけるプリドピジンの薬物動態

【0184】

第１の薬物動態（ＰＫ）研究において、プリドピジンは、経口投与された（ｐ．ｏ．、これはヒトで使用される投与経路である）。この研究では、４用量のプリドピジン（０．３、３、１０、および３０ｍｇ／ｋｇ、用量あたりＮ＝２４匹）が雄のＣ５７Ｂｌ６マウスに強制経口投与により７日間投与された。血液および脳の試料は、次の時点で、投与群ごとに３匹の異なるマウスから収集された：薬物投与前（ｔ＝－１０分）および薬物投与後１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、および８時間。経口（ｐ．ｏ．）および皮下（ｓ．ｃ．）投与の間で薬物のＰＫプロファイルを比較するために第２の研究が実施された。ここで、ＰＫは、経口または皮下のいずれかで３０ｍｇ／ｋｇプリドピジン（水中のＨＣｌ塩当量）を７回毎日投与した後に検査された（Ｎ＝投与経路あたり２４匹のマウス）。血液および脳の試料は、以下の時点で、時点ごと、経路ごとに３匹の動物から収集された：投与前、最後の投与後１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、および８時間。

【0185】

血漿試料は、Ｋ_３－ＥＤＴＡチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ、カナダ）に配置され、１５００ｇで５分間遠心分離された。脳組織は収集され、それ以上のプロセスはなく凍結された。分析の前に、事前に秤量した脳試料は希釈され、ホモジナイズ溶液４ｍＬに対して３３０脳１ｇの比率で、０．３２Ｍスクロースを含む、ｐＨ７．４の０．０１Ｍリン酸緩衝液でホモジナイズした。

【0186】

プリドピジン血漿および脳濃度の定量化ならびに薬物動態分析

【0187】

プリドピジンおよびその内部標準であるＡＣＲ３５４（４－（３－（メチルスルホニル）フェニル）－１－（プロピルド７）－ピペリジニウムクロリド）は、ＥＤＴＡ血漿およびマウス脳ホモジネート（リン酸緩衝生理食塩水中１：３、ｐＨ７．４）からアセトニトリルへの液液抽出によって抽出された。簡単に説明すると、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＩＬ－２０ＡＣオートサンプラーおよびＳｈｉｍａｄｚｕ ＣＴＯ－２０ＡＣカラムオーブンを備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－２０ＡＤポンプで実行された。ＭＳ／ＭＳシステムは、エレクトロスプレーイオン化プローブを備えたＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ－５０００質量分析計（Ｔｏｒｏｎｔｏ、カナダ）であった。

【0188】

分析対象物のクロマトグラフィー分離は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｓｙｎｅｒｇｉ ２．５μＨｙｄｒｏ－ＲＰカラムで達成された。直線性は、０．３および３ｍｇ／ｋｇ用量群の血漿において２ｎｇ／ｍＬの定量下限（ＬＬＯＱ）で２～３０００ｎｇ／ｍＬであり、脳ホモジネートにおいて２ｎｇ／ｍＬのＬＬＯＱで２～３０００ｎｇ／ｍＬであり、高用量ではそれぞれ２ｎｇ／ｍＬおよび７５ｎｇ／ｍＬのＬＬＯＱで、血漿において２５～２０，０００ｎｇ／ｍＬおよび脳ホモジネートにおいて７５～６０，０００ｎｇ／ｍＬであった。品質管理（ＱＣ）試料の公称濃度（精度値）からのプリドピジン濃度の偏差は、すべての検量線で１５％未満であった。ＰＫパラメータは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．３を使用した血管外投与についての非コンパートメントモデリングにより、名目時間に従って、つまりスケジュールされた時点から±５％以内での群平均濃度－時間データを使用して計算された。１ｍｇ／ｋｇ投与後のプリドピジン曝露を推定するために、用量正規化曝露が使用された（表１を参照）。

【0189】

表１：Ｃ５７Ｂｌ６マウスへのプリドピジン投与後の血漿および脳への曝露。表は、プリドピジンの漸増用量（０．３、１、３、１０、および３０ｍｇ／ｋｇ）の投与後の血漿および脳中のプリドピジンの濃度を示している。最大Ｑ３濃度（Ｃｍａｘ）は、ミリリットルあたりのナノグラムおよびマイクロモルで表される。ＡＵＣ（特定の用量の後に全身循環に到達するプリドピジンの量に対応する曲線下面積）は、ｎｇ＊時間／ｍＬおよびｐＭ＊時間で表される。各データポイントは、３匹のマウスから得られた平均値を表す。１ｍｇ／ｋｇ用量についてのパラメータは、０．３、３、１０、および３０ｍｇ／ｋｇ群の平均Ｃｍａｘ／用量およびＡＵＣ０－ｌａｓｔ／用量値に基づいて外挿される。

【0190】

【表1】

【0191】

プリドピジンは、経口および皮下単一用量投与後に同様の血漿および脳ＰＫを示し、血漿におけるＣｍａｘについて１１７％およびＡＵＣ_０－ｔについて９０％、脳組織におけるＣｍａｘについて８８％およびＡＵＣ_０－ｔについて９６％の相対的な経口／皮下曝露比を示した。したがって、経口投与後のプリドピジン曝露データは、皮下投与によって達成された曝露を適正に表している。経口投与後の用量反応ＰＫ研究は、薬物の血漿および脳の曝露が用量に比例することを示した（表１）。血漿に対する脳の比率の測定は、プリドピジン濃度は、０．３ｍｇ／ｋｇの用量では血漿よりも脳において４～５倍高く、１～３０ｍｇ／ｋｇの用量範囲では２～３倍高いことが示された（脳対血漿におけるＣｍａｘおよびＡＵＣ値、表１を参照）。

【0192】

０．３および１ｍｇ／ｋｇのプリドピジンの投与は、それぞれ１１０および３３１ｎｇ／ｍＬの脳Ｃｍａｘ値（３９０ｎＭおよび１２００ｎＭに対応）をもたらし、０．２５時間の中央値Ｔｍａｘで発生し、対応するＡＵＣ_{０－ｌａｓｔ}値は１２０および３９２ｎｇ＊ｈ／ｍＬ（０．４３および１．４ｈ＊μＭに対応）であった。プリドピジンは、３時間後にはすでに脳の総レベルは３ｎｇ／ｍＬ（１１ｎＭに対応、そのうち約２ｎＭのみが遊離）に近づき、急速に除去された。プリドピジンの遊離画分は、市販のインビトロタンパク質結合アッセイを使用して決定された。０．３および１ｍｇ／ｋｇの用量では、脳組織中のプリドピジンの非結合（遊離）画分は約５０％と推定された。したがって、Ｃｍａｘでの脳遊離プリドピジン濃度は、０．３および１ｍｇ／ｋｇの用量について、それぞれ５５および１６５．５ｎｇ／ｍＬ（または１９５ｎＭおよび６００ｎＭ）に対応すると推定された。ラットＳ１Ｒへのプリドピジンの報告された結合親和性に基づくと（Ｋｉ６９．７ｎＭ、［Ｓａｈｌｈｏｌｍ Ｋ，Ａｒｈｅｍ Ｐ，Ｆｕｘｅ Ｋ，Ｍａｒｃｅｌｌｉｎｏ Ｄ．Ｔｈｅ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ ＡＣＲ１６ ａｎｄ（－）－ＯＳＵ６１６２ ｄｉｓｐｌａｙ ｎａｎｏｍｏｌａｒ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ａｔ ４２．ｔｈｅ ｓｉｇｍａ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２０１３；１８（１）：１２－４．］）、Ｃｍａｘで、０．３および１ｍｇ／ｋｇのプリドピジンの両方の用量でＳ１Ｒの１００％の占有率が得られることは妥当であるといえる。この濃度は、この用量では、これらがシグマ－１受容体に対してのみ選択的に結合することを示している。

【0193】

実施例６：ＧＢＡ関連ＰＤにおいてＧＣａｓｅ活性が低下する

【0194】

ＧＢＡは、リソソーム加水分解酵素グルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）をエンコードする。ＧＣａｓｅ活性は、ヒト対照線維芽細胞、ヘテロ接合性ＧＢＡ変異（Ｎ３７０Ｓ／ｗｔおよびＬ４４４Ｐ／ｗｔ）を有するＰＤ患者の線維芽細胞、および特発性（散発性）ＰＤ患者（ｉＰＤ）由来の線維芽細胞において測定された。ＧＣａｓｅ活性は、Ｎ３７０Ｓ／ｗｔおよびＬ４４４Ｐ／ｗｔ線維芽細胞においてそれぞれ３２％および３５％顕著に減少することが示された。ｉＰＤ線維芽細胞においてＧＣａｓｅ活性の喪失は見られなかったため、ＧＢＡ欠損症に関連するＰＤにはさまざまな作用機序が関与している（Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１６）。

【0195】

実施例７：小胞体ストレス

【0196】

誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積は、変異型ＧＢＡドーパミン作動性ニューロンにおけるＥＲストレスにつながる
ＥＲにおいて誤って折りたたまれたタンパク質が蓄積すると、タンパク質の再折り畳みに対する細胞の能力が過負荷になり、ＥＲストレスが誘発され得る。Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．において、ドーパミン作動性ニューロンは、健康な対照およびＧＢＡ－Ｎ３７０Ｓ変異を有するＰＤ患者から採取されたヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化された。２つのＥＲ常駐シャペロンタンパク質、Ｂｉｐ／ＧＲＰ７８およびカルレティキュリンのレベルは、対照由来のドーパミン作動性培養と比較した場合、ＧＢＡ－Ｎ３７０Ｓドーパミン作動性ニューロン培養における有意な上方調節を明らかにし、ＥＲストレスの増加を示している（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１６）。

【0197】

プリドピジンはｍＨｔｔ誘発性ＥＲストレスを減少させる

【0198】

変異型Ｈｔｔ９６Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ（拡張）コンストラクトでトランスフェクトされたＳＴＨｄｈＱ７／７細胞は、ＥＲストレスを示す高レベルの蓄積Ｈ２ａ－ＧＦＰとともに、目に見えるＨｔｔ９６Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ凝集体（通常は細胞ごとに１つの大きな凝集体）を示す。目に見える凝集体がないＨｔｔ２０Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ（正常）またはＨｔｔ９６Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙを発現するＳＴＨｄｈＱ７／７細胞は、低レベルのＨ２ａ－ＧＦＰ（ＥＲストレスなし）を示す。プリドピジンは、ｍＨｔｔ凝集体について陽性の細胞におけるＨ２ａ－ＧＦＰの蓄積を用量依存的に有意に減少させ、凝集体のない細胞またはＨｔｔ２０Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞のＨ２ａ－ＧＦＰレベルを変化させない（図７）。したがって、プリドピジンは、Ｈｔｔ誘発される小胞体ストレスを用量依存的に減少させる。

【0199】

ＥＲストレスに対するプリドピジンの効果は、翻訳開始因子ｅＩＦ２αのリン酸化レベルを評価することによってさらに研究された。ｅＩＦ２αのリン酸化はＥＲストレス応答の特徴である。Ｈｔｔ９６Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙを発現するＳＴＨｄｈＱ７／７細胞は、ｅＩＦ２α－リン酸化（ｅＩＦ２α－ｐ）における３．５倍の増加を示す。プリドピジンは、細胞のＥＲストレスの減少を示すｅＩＦ２α－Ｐ（ｅＩＦ２α－Ｐ／ｅＩＦ２αの比率）の有意な減少を示すが、高濃度では示さない（図８）。０．０３～３μＭの有効濃度は、４５ｍｇ ＢＩＤ以下のヒト用量（Ｃｍａｘ約２μＭ）と相関している。

【0200】

実施例８：ミトコンドリア機能障害

【0201】

ミトコンドリア機能は、変異ＧＢＡニューロンにおいて損なわれている

【0202】

ミトコンドリア機能は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（ＭｉｔｏＲｅｄ）を使用してミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ、ΔΨｍ）を測定することにより、変異ＧＢＡおよびＷＴニューロンにおいて評価された。総ミトコンドリア含有量は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（ＭｉｔｏＧｒｅｅｎ）を使用して決定された。ＷＴ対照と比較して、変異ＧＢＡニューロンはベースラインＭＭＰが低いことを示したが、総ミトコンドリア含有量は増加した。ＭｉｔｏＲｅｄおよびＭｉｔｏＧｒｅｅｎの比率は、対照よりも変異型ＧＢＡニューロンにおいて顕著に低く、ミトコンドリア機能の障害を裏付けている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１９）。

【0203】

ミトコンドリアのＲＯＳレベルは、ＭｉｔｏＳＯＸ Ｒｅｄ、ＲＯＳのミトコンドリア指標を使用して、生きている変異型ＧＢＡニューロンにおいても評価された。対照と比較して、変異型ＧＢＡニューロンは、スーパーオキシド産生の高いレベルを示すＭｉｔｏＳＯＸ Ｒｅｄ蛍光の増加を示した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１９）。

【0204】

ミトコンドリア輸送は、ＧＢＡ欠乏症の結果として、おそらくアルファ－シヌクレインタンパク質およびその凝集のレベルの上昇の結果として、さらに損なわれる。ミトコンドリアの動きは、外因性の野生型（ＷＴ）または変異型（Ａ３５Ｔ）α－シヌクレインが遺伝的に導入された海馬ニューロンにおいて分析された。ＷＴまたはＡ５３Ｔ ａ－シヌクレインの過剰発現は、ニューロンの神経突起に沿ったミトコンドリアの平均速度を大幅に低下させる（Ｘｉｅ ａｎｄ Ｃｈｕｎｇ ２０１２）。

【0205】

マイトファジーとしても知られる異常なまたは機能しないミトコンドリアのクリアランスは、ＧＢＡの欠乏の結果として中断される。マイトファジーは、ＣＣＣＰ（カルボニルシアニドｍ－クロロフェニルヒドラジン、ミトコンドリアの酸化的リン酸化の脱共役剤）によって変異型ＧＢＡニューロンにおいて誘発され、ＭｉｔｏＧｒｅｅｎ標識ミトコンドリアとＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ標識リソソームとの共局在を測定することによって評価された。変異型ＧＢＡニューロンは、ＷＴと比較してミトコンドリアおよびリソソームの共局在が少なく、マイトファジーの障害を示している（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１９）。

【0206】

プリドピジンはミトコンドリアのＲＯＳ産生を低下させる

【0207】

ＨＤマウスニューロンは、酸化的チャレンジに対する感受性の増加を示し、結果として、ＲＯＳのレベルが増加、不十分な抗酸化反応をもたらす。ＹＡＣ１２８ ＨＤマウス由来の線条体ニューロンは、ＲＯＳ産生を誘発する前に、１μＭのプリドピジン（≦４５ｍｇ ＢＩＤでのヒトへの曝露に関連）で処理された。プリドピジンは、ミトコンドリアによるＲＯＳ産生の強力および有意な減少を示す（図１０）。

【0208】

プリドピジンはミトコンドリアの速度を増加させる。ミトコンドリア輸送は、局所的に適用されたプリドピジン処理の有無にかかわらず、野生型運動ニューロンの軸索において評価され、プリドピジンが軸索におけるミトコンドリア輸送を加速することを明らかにした。０．１μＭの有効濃度は、４５ｍｇ ｂｉｄ未満のヒト用量での曝露と相関する（Ｉｏｎｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．２０１９）（図１１）。

【0209】

Ｓ１Ｒの遺伝的欠失は、マイトファジーの障害につながる。野生型（ＷＴ）網膜外植片におけるマイトファジープロセス中に、ミトコンドリアタンパク質ＶＤＡＣ１およびＴＩＭＭ２３の両方が同様の割合で大幅に減少する。ただし、Ｓ１Ｒ－／－網膜外植片において、これら２つのマーカーは減少せず、マイトファジーの誘発後に２～３倍に増加し、ＷＴと比較したＳ１Ｒ－／－細胞におけるミトコンドリアクリアランスの障害を示している（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１９）。したがって、プリドピジンによって正に調節されるＳ１Ｒ活性は、マイトファジーに不可欠である。

【0210】

実施例９：自食作用の欠陥

【0211】

ＧＢＡがｓｉＲＮＡによって遺伝的に削除されたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞において、自食作用流動は減少する。自食作用流動はＬＣ３Ｂ－ＩＩレベルによって測定される。対照と比較して高いレベルは、オートファゴソームのクリアランスがＧＢＡ欠損細胞において損なわれていることを示している（Ｍａｇａｌｈａｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１６）。

【0212】

自食作用の低下は、初代ラット皮質ニューロンにおけるα－シヌクレインの凝集につながる
シナプスタンパク質α－シヌクレインの蓄積および凝集は、ＰＤの病因において重要な役割を果たしている。不溶性画分におけるα－シヌクレインレベルの顕著な増加は、凝集体におけるその蓄積を示し、ホスホリパーゼＤ阻害剤の適用によって自食作用が減少したラット皮質細胞において観察された。アルファ－シヌクレインの凝集は、ＰＤおよびＰＤ－ＧＢＡの特徴であり、神経細胞死に直接関連している（Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．２０１４）。

【0213】

Ｓ１Ｒの活性化は自食作用活動を増強する

【0214】

Ｓ１Ｒアゴニストで処理されたＨｅＬａ細胞は、自食作用流動について評価された。Ｓ１Ｒの活性化は、対照条件と比較した場合、自食作用流動を有意に誘発する（Ｃｈｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ．２０１９）。

【0215】

実施例１０：ＢＤＮＦ

【0216】

ゴーシェ病（ＧＤ、ＧＢＡ変異）において血漿ＢＤＮＦレベルが低下する

【0217】

脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、神経系の発達および生存にとって重要であり、シナプス可塑性の鍵である。ＢＤＮＦレベルの低下は、ＰＤおよびＡＤなどの神経変性疾患に関連している。ＧＤ患者において、血漿におけるＢＤＮＦレベルも大幅に低下する（Ｖａｉｒｏ ｅｔ ａｌ．２０１５）。

【0218】

プリドピジンは、Ｓ１Ｒを介したメカニズムにおいてＢＤＮＦ分泌および軸索輸送を増強する

【0219】

１００ｎＭおよび１μＭのプリドピジンは、対照の未処理細胞と比較して、Ｂ１０４神経芽細胞腫細胞株におけるＢＤＮＦ分泌を増強した。細胞が既知のＳ１ＲアンタゴニストであるＮＥ１００と共培養された場合、ＢＤＮＦ分泌は阻害された（Ｇｅｖａ ｅｔ ａｌ．２０１６）（図１２）。１μＭの有効濃度は、ヒトの用量≦４５ｍｇ ｂｉｄと相関する。

【0220】

プリドピジン処置は、Ｓ１Ｒを介したメカニズムにおいてＡＬＳニューロンのＢＤＮＦ軸索輸送を救助する

【0221】

ＢＤＮＦ軸索輸送速度は、ＡＬＳ ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ運動ニューロンにおいて大幅に低下する。０．１および１μＭのプリドピジンでの培養物の処置は、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ運動ニューロンの速度を用量依存的に大幅に加速する。１μＭのプリドピジンは、ヒトの用量≦４５ｍｇ ｂｉｄと相関する。この効果は、Ｓ１Ｒが遺伝的に削除された運動ニューロンでは無効になり、Ｓ１Ｒに依存するメカニズムを示している（Ｉｏｎｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．２０１９）（図１３）。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図2I】

【図2J】

【図2K】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図3I】

【図3J】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図5H】

【図5I】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】