特許 7586456 血液脳関門透過、腫瘍標的化およびがん転移治療のための表面修飾メソポーラスシリカナノ粒子、その製造方法および使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-11

(45)【発行日】2024-11-19

(54)【発明の名称】血液脳関門透過、腫瘍標的化およびがん転移治療のための表面修飾メソポーラスシリカナノ粒子、その製造方法および使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/04 20060101AFI20241112BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20241112BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20241112BHJP

   B82Y 5/00 20110101ALI20241112BHJP

   B82Y 40/00 20110101ALI20241112BHJP

【ＦＩ】

A61K47/04

A61P35/00

A61P35/04

A61K9/14

A61K9/51

A61K47/10

A61K31/704

B82Y5/00

B82Y40/00

【請求項の数】 20

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2020080729

(22)【出願日】2020-04-30

(65)【公開番号】P2020200306

(43)【公開日】2020-12-17

【審査請求日】2023-03-14

(31)【優先権主張番号】62/843033

(32)【優先日】2019-05-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】520153567

【氏名又は名称】ナノ ターゲティング アンド セラピー バイオファーマ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000383

【氏名又は名称】弁理士法人エビス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ウー チェンスン

(72)【発明者】

【氏名】チェン イーピン

(72)【発明者】

【氏名】ウー スーハン

(72)【発明者】

【氏名】モウ チュンユエン

【審査官】長部 喜幸

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５３３５４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】Critical Features for Mesoporous Silica Nanoparticles Encapsulated into Erythrocytes，ACS Applied Materials & Interfaces，2019年01月09日，11, 5，4790-4798，https://doi.org/10.1021/acsami.8b18434

【文献】Re-examining the Size/Charge Paradigm: Differing in Vivo Characteristics of Size- and Charge-Matched Mesoporous Silica Nanoparticles，Journal of the American Chemical Society，2013年，135, 43，16030-16033，https://doi.org/10.1021/ja4082414

【文献】Targeted Treatment of Metastatic Breast Cancer by PLK1 siRNA Delivered by an Antioxidant Nanoparticle Platform，Mol Cancer Ther，2017年，16(4)，763-772，https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-16-0644

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ３１／００－３１／３２７

Ａ６１Ｋ３１／３３－３１／８０

Ａ６１Ｋ３３／００－３３／４４

Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９

Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

表面が有機修飾されたメソポーラスシリカナノ粒子であって、
ｐＨ７．４でのゼータ電位が－２２ｍＶ～＋２５ｍＶの範囲内であり、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で計測して２０ｎｍ～５０ｎｍの粒径を有し、
前記有機修飾は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分と、（１）正荷電基含有分子、（２）正荷電基含有オリゴマーおよび（３）正荷電基含有ポリマーのうちのいずれか１つとを含み、
前記（１）正荷電基含有分子、前記（２）正荷電基含有オリゴマーおよび前記（３）正荷電基含有ポリマーは、前記ＰＥＧの層内に隠され、
前記（１）正荷電基含有分子、前記（２）正荷電基含有オリゴマーおよび前記（３）正荷電基含有ポリマーに対する前記ＰＥＧ部分のモル比は、１５：１～２：１の範囲内である、
メソポーラスシリカナノ粒子。

【請求項2】

ＴＥＭで計測して２０ｎｍ～３０ｎｍの粒径を有する、請求項１に記載のメソポーラスシリカナノ粒子。

【請求項3】

ｐＨ７．４でのゼータ電位が－１５ｍＶ～＋７ｍＶの範囲内である、請求項１に記載のメソポーラスシリカナノ粒子。

【請求項4】

前記有機修飾は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、および、ＰＥＧ－ＰＰＧコポリマーから選ばれる物質によって導かれる、請求項１に記載のメソポーラスシリカナノ粒子。

【請求項5】

前記（１）正荷電基含有分子、前記（２）正荷電基含有オリゴマーおよび前記（３）正荷電基含有ポリマーのうちの何れか１つは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＴＡ）、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（ＥＤＰＴ）、Ｎ ^１ －（３－トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン；３－アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）および３－アミノプロピルトリエトキシシランから選択される、請求項１に記載のメソポーラスシリカナノ粒子。

【請求項6】

前記ナノ粒子の前記表面は、付加的なアルコキシルシラン末端（ポリ）アルキレン（ポリ）アミン；プロピルトリエトキシシラン、ブチルトリメトキシシラン、オクチルトリメトキシシラン、ジフェニルジエトキシシラン、ｎ－オクチルトリエトキシシラン、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、クロロメチルトリメトキシシラン、イソブチルトリエトキシシラン、エチルトリメトキシスチレンシラン、メチルトリエトキシシラン、フェニルトリエトキシシラン（ＰＴＥＯＳ）、フェニルトリメトキシシラン（ＰＴＭＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、エチルトリアセトキシシラン（ＥＴＡＳ）、Ｎ－（トリメトキシシリルプロピル）エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡＳ）、（３－トリヒドロキシシリル）プロピルメチルホスホン酸（ＴＨＰＭＰ）、メチルトリアセトキシシラン（ＭＴＡＳ）、（３－メルカトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）、双性イオン性シランなどの付加的なオルガノアルコキシシランから選ばれる少なくとも１つの表面改質剤から導かれる修飾をさらに含む、
請求項５に記載のメソポーラスシリカナノ粒子。

【請求項7】

前記（１）正荷電基含有分子、前記（２）正荷電基含有オリゴマーおよび前記（３）正荷電基含有ポリマーのうちのいずれか１つに対する前記ＰＥＧ部分のモル比は、１０：１～３：１の範囲内である、請求項１に記載のメソポーラスシリカナノ粒子。

【請求項8】

前記メソポーラスシリカナノ粒子は、前記メソポーラスシリカナノ粒子に載置される、および／または、装填される生理活性成分をさらに含む、請求項１に記載のメソポーラスシリカナノ粒子。

【請求項9】

前記生理活性成分は、小分子薬物、酵素およびタンパク薬物などのタンパク質、抗体、ワクチン、抗生物質、または、ヌクレオチド薬物から選ばれる、請求項８に記載のメソポーラスシリカナノ粒子。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか１項に記載の表面修飾を有するメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）を調製する方法であって、
（ａ）ミセルを形成するために十分な濃度の界面活性剤を含むアルカリ性溶液を供給するステップと、
（ｂ）前記アルカリ性溶液にシラン源を導入するステップと、
（ｃ）少なくとも１つのＰＥＧ修飾シランと、少なくとも１つの正荷電基含有シランとを含む表面改質剤を前記アルカリ性溶液に導入するステップであって、前記正荷電基含有シランに対する前記ＰＥＧ修飾シランのモル比は、１５：１～２：１の範囲内であるステップと、
（ｄ）前記アルカリ性溶液を水熱処理にかけるステップと、
（ｅ）生成物を収集するステップと、
（ｆ）前記生成物から残留界面活性剤を除去するステップと、
任意で、（ｇ）前記生成物を精製または洗浄するステップと、
を含む方法。

【請求項11】

前記界面活性剤は、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、または、その組み合わせを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記シラン源は、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、テトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）、ケイ酸ナトリウム、または、その混合物を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記ＰＥＧ修飾シランは、２－［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］－トリメトキシシラン（ＰＥＧ－トリメトキシシラン）であり、前記正荷電基含有シランは、トリメトキシシリルプロピル（ポリエチレンイミン）、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン、３－アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）および３－アミノプロピルトリエトキシシランから選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項14】

前記表面改質剤は、プロピルトリエトキシシラン、ブチルトリメトキシシラン、オクチルトリメトキシシラン、ジフェニルジエトキシシラン、ｎ－オクチルトリエトキシシラン、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、クロロメチルトリメトキシシラン、イソブチルトリエトキシシラン、エチルトリメトキシスチレンシラン、メチルトリエトキシシラン、フェニルトリエトキシシラン（ＰＴＥＯＳ）、フェニルトリメトキシシラン（ＰＴＭＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、エチルトリアセトキシシラン（ＥＴＡＳ）、Ｎ－（トリメトキシシリルプロピル）エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡＳ）、（３－トリヒドロキシシリル）プロピルメチルホスホン酸（ＴＨＰＭＰ）、メチルトリアセトキシシラン（ＭＴＡＳ）、（３－メルカトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）および双性イオン性シランから選ばれる少なくとも１つの薬剤をさらに含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項15】

前記シラン源は、ＴＥＯＳとＡＰＴＭＳとの混合物、ＴＨＰＭＰとＡＰＴＭＳとＴＥＯＳとの混合物、ＥＤＴＡＳとＡＰＴＭＳとＴＥＯＳとの混合物、ＰＴＥＯＳとＴＥＯＳとの混合物、または、ＰＴＭＯＳとＴＥＯＳとの混合物である、請求項１０に記載の方法。

【請求項16】

請求項１～９のいずれか１項に記載のメソポーラスシリカナノ粒子を含み、被検体に全身投与または局所投与される被検体の細胞転移阻害剤。

【請求項17】

前記メソポーラスシリカナノ粒子は、１０００ｍ^２／ｇ以下のＢＥＴ表面積を有する、請求項１６に記載の被検体の細胞転移阻害剤。

【請求項18】

前記メソポーラスシリカナノ粒子は、５００ｍ ^２ ／ｇ以下のＢＥＴ表面積を有する、請求項１６に記載の被検体の細胞転移阻害剤。

【請求項19】

前記細胞転移は、がん細胞転移である、請求項１６に記載の被検体の細胞転移阻害剤。

【請求項20】

前記細胞転移は、乳がん細胞転移である、請求項１６に記載の被検体の細胞転移阻害剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、がんを治療するための生理活性成分を運ぶドラッグデリバリーシステムとしての、または、がん転移を阻害するための活性薬剤としてのメソポーラスシリカナノ粒子に関する。

【背景技術】

【0002】

メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）は、細孔容積が大きく、化学的／熱的に安定し、積載能力が高く、表面特性を調整でき、生体適合性に優れるといった特有の物理的／化学的性質を有することから、ドラッグデリバリーシステムとしての大いなる可能性をもつと考えられてきた。ＭＳＮは、さまざまな種類の治療薬剤を標的部位に送達することができるので、過去１０年間、病気の治療に広く用いられてきた。病気の中でも、がんは、世界的に死因の２番目であり、２０１８年には、およそ９６０万人ががんで亡くなっている。ナノ粒子は、複数種類のがんを治癒させるという目的を果たしており、ナノ粒子の腫瘍標的化特性、および、制御された／持続的な薬物放出特性に基づく特殊な治療効果も実証されている。ナノ粒子の受動的な腫瘍標的化は、固形腫瘍の血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果、漏れやすい脈管構造、および、固形腫瘍内に有効なリンパ排液が欠如していることで、腫瘍内にナノ粒子が蓄積することによるものである。

【0003】

もう１つの課題は、血液脳関門（ＢＢＢ）によって治療薬剤の大部分の脳への輸送が制限されることが原因であるアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、脳腫瘍などのアンメットメディカルニーズの高い分野である中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患を治療することである。基本的に、１００％の高分子薬物、および、９５％以上の小分子薬物は、脳内に入ることができない。中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の治療に対するＢＢＢ制限を克服する潜在的な方法として、多用途のナノ粒子ドラッグデリバリーシステムが考えられる。

【0004】

さらに、がん患者のがんが転移すると、患者が死ぬ可能性が劇的に増大するので、がん転移が起きるのを予防する、阻害する、または、抑制することにより、がん、特に転移がんの患者の予後を良くすることが重要である。

【0005】

よって、ドラッグデリバリーシステムまたは活性成分としての改良されたメソポーラスシリカナノ粒子、および、そのようなメソポーラスシリカナノ粒子を合成する確実な方法が必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

本開示は、がんの治療および／またはＣＮＳ疾患の治療に適した腫瘍標的化特性および血液脳関門（ＢＢＢ）透過特性の両方を有するドラッグデリバリーシステムとしての特殊な修飾を有するメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）に関する。

【0007】

本開示は、また、がん転移を予防、阻害、または、抑制するための治療薬としての、特殊な修飾を有するメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）に関する。

【0008】

本開示は、上記の方法によって調製された生成物も提供する。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1A】３０ｎｍのＭＳＮ－ＰＥＧのＴＥＭ画像を示す。

【図1B】ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡ（２：１）のＴＥＭ画像を示す。

【図2】３０ｎｍのＭＳＮ－ＰＥＧについての、肝臓に対する腫瘍に蓄積した粒子の比率（腫瘍／肝臓）を示す。

【図3】３０ｎｍのＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡナノ粒子についての、肝臓に対する腫瘍に蓄積した粒子の比率（腫瘍／肝臓）を示す。

【図4A】二光子蛍光顕微鏡によって検出された脳血管における３０ｎｍのＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡの三次元画像を示す。

【図4B】二光子蛍光顕微鏡によって検出された脳血管における３０ｎｍのＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＨＰＭＰの三次元画像を示す。

【図5A】細胞移動を阻害する効果を評価するためのインビトロ検査の結果を示す。

【図5B】細胞移動を阻害する効果を評価するためのインビトロ検査の結果を示す。

【図6A】マウスに対するＭＳＮの毒性を評価するためのインビボ検査の結果を示す。

【図6B】マウスに対するＭＳＮの毒性を評価するためのインビボ検査の結果を示す。

【図7】乳がんの肺への転移を阻害する効果を評価するためのインビボ検査の結果を示す。

【図8】がん転移を阻害する効果を評価する発光図の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本開示内容の理解を容易にすべく、本明細書に用いられる用語を以下に定義する。

【0011】

明細書および請求項における単数形は、特に明示しない限り複数形も含む。また、記載のない限り、記載されたすべての例または例示のための単語（例えば、“などの”）は、本発明の範囲を限定するのではなく、本発明をよりわかりやすく例示するために用いているにすぎない。

【0012】

本明細書に記載されたいかなる数値範囲もすべての部分範囲を含むことが意図される、と理解されたい。例えば、“５０～７０℃”の範囲は、最小値である５０℃と最大値である７０℃との間のすべての部分範囲および特定の値を含み、例えば、５８℃～６７℃、５３℃～６２℃、６０℃、または、６８℃を含む。本開示の数値域は、連続しているので、最小値と最大値との間の各数値を含む。特に定めのない限り、本明細書に示されるさまざまな数値域は、おおよその範囲である。

【0013】

本発明によれば、用語“約”は、値をどのように測定または決定するかにもよるが、当業者によって測定された所定の値の許容偏差を意味する。

【0014】

本発明によれば、特に定めのない限り、本明細書で用いられる接頭辞“ナノ”は、約３００ｎｍ以下のサイズを意味する。特に定めのない限り、本明細書で用いられる接頭辞“メソ”は、国際純正応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）による定義とは異なり、約５ｎｍ以下のサイズを意味する。

【0015】

本発明によれば、本明細書で用いられる用語“シラン”は、ＳｉＨ_４の誘導体を指す。通常、４つの水素の少なくとも１つは、以下に記載されるようなアルキル、アルコキシル、アミノなどの置換基と置換される。本明細書で用いられる用語“アルコキシシラン”とは、ケイ素原子に直接結合した少なくとも１つのアルコキシル置換基を有するシランを指す。本明細書で用いられる用語“オルガノアルコキシシラン”とは、ケイ素原子に直接結合した少なくとも１つのアルコキシル置換基、および、少なくとも１つのヒドロカルビル置換基を有するシランを指す。本明細書にて用いられる用語“ケイ酸塩源”とは、例えば、オルトケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、テトラエチルオルトシリケート（テトラエトキシシラン、ＴＥＯＳ）、テトラメチルオルトシリケート、テトラプロピルオルトシリケートなどのオルトケイ酸の塩形態またはエステル形態として見なされ得る物質のことを指す。任意で、ヒドロカルビル置換基は、さらに置換されるか、または、ヘテロ原子に割り込まれてよい。

【0016】

本発明によれば、本明細書にて用いられる用語“ヒドロカルビル”とは、炭化水素から誘導される一価の基のことを指す。本明細書にて用いられる用語“炭化水素”とは、炭素原子および水素原子のみからなる分子のことを指す。炭化水素の例は、これらに限定されないが、（シクロ）アルカン、（シクロ）アルケン、アルカジエン、芳香族などを含む。ヒドロカルビルが上記のようにさらに置換される場合、置換基は、ハロゲン、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基などであってよい。ヒドロカルビルが上記のようにヘテロ原子に割り込まれる場合、ヘテロ原子は、Ｓ、Ｏ、または、Ｎであってよい。本発明によれば、ヒドロカルビルは、好ましくは１～３０の炭素原子からなる。

【0017】

本発明によれば、本明細書にて用いられる用語“アルキル”とは、好ましくは１～３０の炭素原子、より好ましくは１～２０の炭素原子からなる飽和、直鎖、または、分岐鎖アルキルのことを指す。アルキルの例は、これらに限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、２－エチルブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、１－メチルペンチル、１，３－ジメチルブチル、ｎ－ヘキシル、１－メチルヘキシル、ｎ－ヘプチル、イソヘプチル、１，１，３，３－テトラメチルブチル、１－メチルヘプチル、３－メチルヘプチル、ｎ－オクチル、２－エチルヘキシル、１，１，３－トリメチルヘキシル、１，１，３，３－テトラメチルペンチル、ノニル、デシル、ウンデシル、１－メチルウンデシル、ドデシル、１，１，３，３，５，５－ヘキサメチルヘキシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシルなどを含む。

【0018】

本発明によれば、用語“アルキレン”は、上記のようなアルキルの二価の基を指す。用語「短鎖」は、ラジカル、または、反復単位が主鎖に多くても６つ、好ましくは、多くても４つの炭素原子を含んでいることを表す。

【0019】

本発明によれば、本明細書にて用いられる用語“アルコキシル”または“アルコキシ”は、式“－Ｏ－アルキル”を有する基を意味する。この式における“アルキル”の定義は、上記のような“アルキル”の意味を有する。

【0020】

本発明によれば、本明細書にて用いられる用語“シクロアルキル”とは、３～１０の環炭素原子、より好ましくは３～８の環炭素原子、および、任意で環にアルキル置換基を含む飽和または一部不飽和の環状炭素ラジカルを意味する。シクロアルキルの例としては、これらに限定されないが、シクロプロピル、シクロプロペニル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、２－シクロヘキセン－１－イルなどが挙げられる。

【0021】

本発明によれば、本明細書にて用いられる用語“ハロゲン”または“ハロ”は、フッ素、塩素、臭素、または、ヨウ素を示す。

【0022】

本発明によれば、本明細書にて用いられる用語“アミノ”は、式－ＮＲ_１Ｒ_２からなる官能基を意味する。Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれハロゲンまたは上記のようなヒドロカルビル基を示している。

【0023】

本発明によれば、本明細書にて用いられる用語“水相”とは、水と実質的に混和できる位相を意味する。
水相の例としては、これらに限定されないが、水自体、水性緩衝液、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）水溶液、アルカノリック水溶液などが挙げられる。水相は、合成の需要、および／または、水相に存在する物質の安定性に基づき、酸性、中性、または、アルカリ性に調整されてよい。

【0024】

本発明によれば、本明細書にて用いられる用語“油相”とは、上記のような水相と実質的に混和しない位相を意味する。油相の例は、これらに限定されないが、ヘキサン、デカン、オクタン、ドデカン、シクロヘキサンなどの液体の置換または非置換（シクロ）アルカン、および、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの置換または非置換芳香族溶剤などが挙げられる。

【0025】

本発明によれば、本明細書にて用いられる用語“生理活性成分”とは、生物体内で活性を有する物質を指す。生理活性成分の例は、これに限定されないが、小分子薬物、酵素およびタンパク薬物などのタンパク質、抗体、ワクチン、抗生物質、または、ヌクレオチド薬物などが挙げられる。

【0026】

本発明によれば、本明細書にて用いられる用語“固体シリカナノ粒子”は、表面が非ポーラス、特に、非メソポア構造を有するシリカナノ粒子を指す。

【0027】

本発明は、ＭＳＮのインビトロおよびインビボ作用が、ＭＳＮの腫瘍標的化能力（例えばＥＰＲ効果）およびＢＢＢ透過性の決定因子としての、サイズ、形状、表面電荷、および、官能基の空間分布を含むＭＳＮの表面修飾および物理化学的性質によって制御され得る、という驚くべき発見をした。ＭＳＮの外面は、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、ＰＥＧ－ＰＰＧコポリマーなどの短鎖ポリ（アルキレングリコール）（ＰＡＧ）で修飾され、ＰＡＧ層内に隠れた帯電分子は、特定のＰＡＧ／帯電分子モル比で導入される。それらの修飾、空間的配置、および、電荷によって、生理的環境における最小限の非特異的結合、および、適正な循環時間を含むＭＳＮの特徴付けが明らかになり、ＭＳＮを血液から脳へと輸送することが可能になる。

【0028】

例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）などのポリ（アルキレングリコール）（ＰＡＧ）による修飾は、ＭＳＮが血清タンパク質に吸収されることを防ぎ、細網内皮系によるクリアランスを抑制することができる。ＭＳＮの特性（例えば表面特性など）を修飾するためにさらなる改質剤が導入され得る。ＰＥＧが表面改質剤として用いられ、改質剤がＰＥＧ層の深部に隠れているのではなく、外面に露出している場合、ＭＳＮは、生理的環境においてタンパク質または細胞と非特異性結合し、その結果、急速にインビボクリアランスし、腫瘍内には蓄積されないことが観察されている。

【0029】

したがって、本開示は、電荷変調分子、特に、正荷電基を有し、ＭＳＮの表面における長さがＰＥＧより短い改質剤を用いる。ペグ化ＭＳＮ（ＭＳＮ－ＰＥＧ）のＥＰＲ効果への表面電荷の影響を評価すべく、本開示は、ＭＳＮ－ＰＥＧに存在する帯電分子に対するＰＥＧの比率を変調することによってさまざまな表面電荷を有する、サイズ、形状、流体力学的径、および、空間分布対応型ＭＳＮを合成する。担腫瘍マウスにおけるＭＳＮの体内分布の研究により、ＭＳＮの投与および再循環の有効性に影響を及ぼす因子の１つは、ゼータ電位であることがわかった。例えば、修飾されたＭＳＮのゼータ電位（ｐＨ７．４の状態）は、－２２～＋２５ｍＶ、好ましくは、－２２～＋２１ｍＶ、－２１～＋２５ｍＶなどの範囲であり得る。一実施形態では、３０ｎｍのＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡ（ＰＥＧ、および、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＴＡ）で修飾したＭＳＮ）は、－２２～＋２１ｍＶ、好ましくは、－１５～＋１７ｍＶ、より好ましくは、約－１３～＋７ｍＶの範囲の、または、他の例では、＋４ｍＶまでのゼータ電位を有し、優れたＥＰＲ効果を示す（例えば、肝臓信号に対する腫瘍信号の比率（腫瘍／肝臓）は、１より大きく、腫瘍／肝臓値は、ＭＳＮ－ＰＥＧの腫瘍／肝臓値より大きい）。一実施形態では、５０ｎｍのＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡは、－２１～＋２５ｍＶ、好ましくは、－２１～＋１８ｍＶの範囲のゼータ電位（ｐＨ７．４の状態）を有し、優れたＥＰＲ効果を示す。

【0030】

表面修飾されたＭＳＮの腫瘍標的化能力（ＥＰＲ効果）に影響を及ぼす他の因子は、ＭＳＮにおける正荷電基に対するＰＥＧ基のモル比である。ＰＥＧ／正荷電基のモル比は、元素分析によって決定される。ＰＥＧ／正荷電基比は、特定の範囲内に収まり得る。一例では、比率は、０．５～１５、好ましくは、約２～１０、より好ましくは、２～６．５の範囲である。このような特定のＰＥＧ／荷電基比を有するＭＳＮは、優れたＥＰＲ効果を示し得ることが観察されかつ予想される。

【0031】

ドラッグデリバリーシステムとしての機能を果たすＭＳＮの有効性に影響を及ぼす他の因子は、これらに限定されないが、粒径、（表面）改質剤のタイプ、粒子の形態などを含む。

【0032】

本発明は、また、表面修飾ＭＳＮは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができるという驚くべき発見をした。ＢＢＢは、循環する血液からのイオンおよび分子の脳内への移動を制御し、脳に病原体および毒剤が侵入することを防ぐ中枢神経系の極めて重要な生理的障壁である。しかしながら、ＢＢＢには、脳疾患を治療する際に、ほとんどの薬物がＢＢＢによって妨げられるという問題点がある。ＢＢＢの問題を克服する従来の方法は、より小型の多用途ナノ粒子に限られており、ＢＢＢを通過するよう表面を機能化することが考えられる。しかしながら、ＢＢＢ透過を制御することへの、ナノ粒子のこれらの様々な特徴付けの効果は、未だ明らかにされていない。ＣＮＳ疾患へのドラッグデリバリーのためにＢＢＢ透過能力を有するユニークなシリカナノ粒子を開発すべく、本開示は、異なるサイズ、電荷、および、機能的リガンドを有するＭＳＮを合理的設計で合成した。

【0033】

したがって、本開示は、ＢＢＢを通過する能力を有する、表面電荷が特定の範囲であるＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡを実証する。一実施形態では、ｐＨ７．４の状態で－１５～＋２１ｍＶ、好ましくは、－１３～＋１７ｍＶ、より好ましくは、約－１３～＋７ｍＶの範囲（一例では６．４ｍＶ）のゼータ電位を有する３０ｎｍのＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡは、ＢＢＢを通過する能力を有する。上記のように、ＭＳＮの表面電荷は、異なる比率のＰＥＧ／帯電分子をＭＳＮに結合させることによって変調されることができ、帯電分子は、ＰＥＧ層内に存在する必要がある。ＭＳＮにおける正荷電基に対するＰＥＧ基のモル比であるＰＥＧ／正荷電基モル比は、元素分析によって決定される。ＰＥＧ／正荷電基比は、特定の範囲内に収まり得る。一例では、比率は、０．５～１５、好ましくは、約２～１０、より好ましくは、２～６．５の範囲（一例では６．１３）である。このようなＰＥＧ／荷電基比を有するＭＳＮは、優れたＢＢＢ透過性を示し得ることが観察されかつ予想される。

【0034】

ＥＰＲ効果およびＢＢＢ透過能力のどちらをも有するＭＳＮは、脳関連のがん、および、ＣＮＳ疾患の治療のための有望なドラッグデリバリーシステムとなる利点を示すであろう。示されるすべての例、材料、反応条件、または、パラメータは、本明細書に記載される例示的実施形態による材料または調製法を限定することを意図されない。

【0035】

表面修飾メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）およびその調製法

【0036】

一側面では、本開示は、表面が有機修飾され、ｐＨ７．４で－２２ｍＶ～＋２５ｍＶの範囲のゼータ電位を有し、粒径が５０ｎｍ以下であるメソポーラスシリカナノ粒子を提供する。有機修飾は、ポリ（エチレングリコール）部分と、少なくとも１つの正荷電基含有オリゴマー／ポリマー部分とを含む。正荷電基含有オリゴマー／ポリマー部分に対するポリ（エチレングリコール）部分のモル比は、元素分析によって決定され得る特定の範囲、例えば、０．５～１５の範囲内に収まり得る。

【0037】

一実施形態では、本開示のメソポーラスシリカナノ粒子は、３０ｎｍ以下の粒径を有する。

【0038】

一実施形態では、本開示のメソポーラスシリカナノ粒子は、ｐＨ７．４で－１５ｍＶ～＋４ｍＶの範囲のゼータ電位を有し、他の好適な実施形態では、ｐＨ７．４で－１３ｍＶ～＋７ｍＶの範囲のゼータ電位を有する。

【0039】

一実施形態では、本開示のメソポーラスシリカナノ粒子は、正荷電基含有オリゴマー／ポリマー部分に対するポリ（エチレングリコール）部分の比率が、２～６．５の特定の範囲である。

【0040】

一実施形態では、ＭＳＮの表面修飾は、バイオアベイラビリティを向上させる少なくとも１つの部分と、表面電荷の特性を調整する少なくとも１つの部分とを含む有機修飾を含む。一実施形態では、バイオアベイラビリティを向上させる部分は、表面改質剤から導かれるまたは表面改質剤によって導入される。一実施形態では、表面電荷の特性を調整する部分は、電荷変調分子、特に、正荷電基含有オリゴマー／ポリマーから導かれる。一実施形態では、正荷電基含有オリゴマー／ポリマーは、窒素含有オリゴマー／ポリマーであり得る。

【0041】

一実施形態では、有機修飾は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、ＰＥＧ－ＰＰＧコポリマーなどのポリ（アルキレングリコール）（ＰＡＧ）；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＴＡ）、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（ＥＤＰＴ）、Ｎ^１－（３－トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミンなどのアルコキシルシラン末端（ポリ）アルキレン（ポリ）アミン；３－アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）、プロピルトリエトキシシラン、ブチルトリメトキシシラン、オクチルトリメトキシシラン、ジフェニルジエトキシシラン、ｎ－オクチルトリエトキシシラン、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、クロロメチルトリメトキシシラン、イソブチルトリエトキシシラン、３－アミノプロピルトリエトキシシラン、エチルトリメトキシスチレンシラン、メチルトリエトキシシラン、フェニルトリエトキシシラン（ＰＴＥＯＳ）、フェニルトリメトキシシラン（ＰＴＭＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、エチルトリアセトキシシラン（ＥＴＡＳ）、Ｎ－（トリメトキシシリルプロピル）エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡＳ）、（３－トリヒドロキシシリル）プロピルメチルホスホン酸（ＴＨＰＭＰ）、メチルトリアセトキシシラン（ＭＴＡＳ）、（３－メルカトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）、双性イオン性シランなどのオルガノアルコキシシランから導かれるまたは選択される。

【0042】

一実施形態では、生理活性成分は、ナノ粒子に載置される。他の実施形態では、生理活性成分は、ナノ粒子内に装填される。さらなる他の実施形態では、生理活性成分は、ナノ粒子に載置されかつ装填される。

【0043】

メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）は、さまざまな有機官能基によって修飾され得る、明確に定義された構造および高密度の表面シラノール基を有する。異なるサイズのＭＳＮは、アンモニアを塩基触媒として調製される。粒径は、アンモニアの濃度、シラン源の量および濃度、反応温度などを調整することによって制御される。

【0044】

一側面では、ＭＳＮは、以下のステップにより調製され得る。（ａ）ミセルを形成するために十分な濃度の界面活性剤を含むアルカリ性溶液を供給するステップと、（ｂ）溶液にシラン源を導入するステップと、（ｃ）少なくとも１つのＰＥＧ修飾シランと、少なくとも１つの正荷電基含有シランとを含む表面改質剤を溶液に導入するステップと、（ｄ）溶液を水熱処理にかけるステップと、（ｅ）生成物を収集するステップと、（ｆ）生成物から残留界面活性剤を除去するステップと、任意で、（ｇ）生成物を精製または洗浄するステップ。

【0045】

例によって、密閉されたビーカー内の所望の温度（５０～６０℃）の１５０ｍＬの水酸化アンモニウム溶液（０．１～０．２Ｍ）に、０．２９ｇの臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を溶解した。１５分撹拌した後、密封膜を取り除き、溶液を勢いよく攪拌しながら（６００ｒｐｍ）、２．５ｍＬのエタノールを溶媒としたＲＩＴＣ（ローダミンイソチオシアネート）結合ＡＰＴＭＳ、および、２～２．５ｍＬのエタノールを溶媒としたＴＥＯＳ（０．８～０．９Ｍ）を加えた。１時間の撹拌の後、２ｍＬのエタノール中で、ＴＡシラン（Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド）に対するＰＥＧシランのモル比が異なる５５０μＬのＰＥＧシラン（２－［メトキシ(ポリエチレンオキシ)プロピル]-トリメトキシシラン)を反応させた（ＰＥＧ／ＴＡ比は１５：１，１０：１，７：１，３：１，２：１，１：２であり、ＴＡシランの量は０．０４～１．２ｍＬ）。混合物を３０分間撹拌した後、少なくとも１２時間は撹拌せずに、混合物を所望の温度（５０～６０℃）で熟成させた。その後、溶液を密封し、７０℃のオーブンに入れて２４時間水熱処理にかけた。合成したままのサンプルを洗浄し、遠心分離またはクロスフローシステムによって収集した。ＭＳＮの細孔内の界面活性剤を取り除くため、合成したままのサンプルを初回は６７８μＬ、２回目は４０μＬの塩酸（３７％）を含む４０ｍＬの酸性エタノール中で、それぞれ６０℃、抽出時間は１時間でインキュベートした。生成物を洗浄し、遠心分離またはクロスフローシステムで収集し、最終的に９０％エタノール中に保存した。異なる官能基で修飾したＭＳＮ－ＰＥＧを合成するためには、ＴＡシランをＰＥＩシラン、ＥＤＰＴＭＳＮシラン、または、他の官能基シランと置き換える。

【0046】

一実施形態では、シラン源は、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、テトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）、ケイ酸ナトリウム、または、その混合物を含む。一実施形態では、表面改質剤は、２－［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］－トリメトキシシラン（ＰＥＧ－トリメトキシシラン）、３－アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）、プロピルトリエトキシシラン、ブチルトリメトキシシラン、オクチルトリメトキシシラン、ジフェニルジエトキシシラン、ｎ－オクチルトリエトキシシラン、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、クロロメチルトリメトキシシラン、イソブチルトリエトキシシラン、３－アミノプロピルトリエトキシシラン、エチルトリメトキシスチレンシラン、メチルトリエトキシシラン、フェニルトリエトキシシラン（ＰＴＥＯＳ）、フェニルトリメトキシシラン（ＰＴＭＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、エチルトリアセトキシシラン（ＥＴＡＳ）、Ｎ－（トリメトキシシリルプロピル）エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡＳ）、（３－トリヒドロキシシリル）プロピルメチルホスホン酸（ＴＨＰＭＰ）、メチルトリアセトキシシラン（ＭＴＡＳ）、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン、トリメトキシシリルプロピル（ポリエチレンイミン）、Ｎ－トリメトキシシリルプロピル－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド、（３－メルカトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）、双性イオン性シラン、または、その混合物であってよい。

【0047】

ＭＳＮを調製するのに適した界面活性剤の例は、これらに限定されないが、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、および、非イオン界面活性剤が挙げられる。適切な界面活性剤は、ｐＨ値、イオン強度、温度、反応物、生成物などの反応条件に基づいて選択される。陽イオン界面活性剤の例は、これらに限定されないが、長鎖ヒドロカルビル基を有し、末端アミン基が、特定のｐＨ値を下回ると正電荷を有する、例えば、オクテニジン二塩酸塩などのｐＨ依存性第一級、第二級、または、第三級アミン（例えば、第一級および第二級アミンはｐＨ＜１０で正荷電する）および、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、および、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＯＤＡＢ）などの永久荷電第四級アンモニウム塩を含む。陰イオン界面活性剤の例は、これらに限定されないが、硫酸塩、スルホン酸塩、および、アンモニウムラウリル硫酸、ラウリル硫酸ナトリウム（ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＬＳまたはＳＤＳ）などのリン酸塩またはエステル、関連アルキルエーテル硫酸塩ラウレス硫酸ナトリウム（ラウレス硫酸ナトリウムまたはＳＬＥＳ）、ミレス硫酸ナトリウム、ドクサート（ジオクチルソジウムスルホサクシネート）、ペルフルオロオクタンスルホン酸（ＰＦＯＳ）、ペルフルオロブタンスルホン酸塩、アルキルアリールエーテルリン酸塩、アルキルエーテルリン酸塩などを含む。非イオン界面活性剤の例は、これらに限定されないが、ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、グルコシドアルキルエーテル、ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテル、グリセロールアルキルエステル、ポリプロピレングリコールアルキルエーテル、ブロックコポリマー、ポロキサマー、コカミドモノエタノールアミン（コカミドＭＥＡ）、コカミドジエタノールアミン（コカミドＤＥＡ）、酸化ラウリルジメチルアミン、または、ポリエトキシ化獣脂アミンを含む。

【0048】

ＭＳＮのサイズ

【0049】

アンモニアを塩基触媒として異なるサイズのＭＳＮが調製され得る。一側面では、ＭＳＮは、高希釈状態、すなわち、界面活性剤の濃度が低い状態で調製される。本開示では、ＭＳＮは、２０～２００ｎｍ、好ましくは２０～８０ｎｍ、より好ましくは２０～５０ｎｍ、さらに好ましくは３０～４０ｎｍの範囲の直径を有する。ＭＳＮのサイズは、アンモニウム濃度、アルコキシルシランの量および濃度、反応温度などを調整することによって制御され得る。理論に拘束されずに、アンモニア濃度が高いほど、ＭＳＮのサイズは大きくなり、アンモニア濃度が低いほど、ＭＳＮのサイズは小さくなり得る。アルコキシルシランの量が多いほど、ＭＳＮのサイズは大きくなり、アルコキシルシランの量が少ないほど、ＭＳＮのサイズは小さくなり得る。さまざまな実施形態では、０．１４～０．５ｇのＣＴＡＢを溶解した１５０ｍＬの水酸化アンモニウム溶液のアンモニウム濃度は、０．０５～１．５Ｍ、好ましくは、０．１～０．５Ｍ、より好ましくは、０．１～０．２５６Ｍであり、１５０ｍＬの水酸化アンモニウム溶液に添加されるアルコキシルシランの量は、１ｍＬ～５ｍＬ、好ましくは、１ｍＬ～３ｍＬ、より好ましくは、２ｍＬ～２．５ｍＬのエタノールを溶媒としたＴＥＯＳ（約０．８６２Ｍ）の範囲である。反応温度は、３０℃～６０℃、好ましくは４０℃～６０℃、より好ましくは５０℃～６０℃の範囲であり、これらの条件のいかなる組み合わせも本開示の一実施形態をなす。

【0050】

ＭＳＮの表面修飾

【0051】

ＭＳＮは、さまざまな有機官能基によって修飾され得る、明確に定義された構造および高密度の表面シラノール基を有する。官能基の例は、これらに限定されないが、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、ＰＥＧ－ＰＰＧコポリマーなどのポリ（アルキレングリコール）（ＰＡＧ）；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＴＡ）、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（ＥＤＰＴ）、Ｎ^１－（３－トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミンなどのアルコキシルシラン末端（ポリ）アルキレン（ポリ）アミン；３－アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）、プロピルトリエトキシシラン、ブチルトリメトキシシラン、オクチルトリメトキシシラン、ジフェニルジエトキシシラン、ｎ－オクチルトリエトキシシラン、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、クロロメチルトリメトキシシラン、イソブチルトリエトキシシラン、３－アミノプロピルトリエトキシシラン、エチルトリメトキシスチレンシラン、メチルトリエトキシシラン、フェニルトリエトキシシラン（ＰＴＥＯＳ）、フェニルトリメトキシシラン（ＰＴＭＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、エチルトリアセトキシシラン（ＥＴＡＳ）、Ｎ－（トリメトキシシリルプロピル）エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡＳ）、（３－トリヒドロキシシリル）プロピルメチルホスホン酸（ＴＨＰＭＰ）、メチルトリアセトキシシラン（ＭＴＡＳ）、（３－メルカトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）、双性イオン性シランなどのオルガノアルコキシシランが挙げられる。

【0052】

生物学的応用のために特に重要なナノ粒子のパラメータは、粒径および表面特性であり、循環半減期、薬物動態、および、ナノ粒子の生体内分布における重要な役割を果たすことが期待される。ＭＳＮのサイズは、体内における薬物動態および生体内分布に影響する。超小型のＭＳＮ（例えば、直径８ｎｍ未満）は、通常、腎臓ろ過によってすばやく取り除かれるが、それより大きいナノ粒子（例えば１５０ｎｍより大きい）は、肝臓または脾臓内に存在する。例えば、２０～１００ｎｍの範囲内の直径を有するナノ粒子は、より長い血中半減期を示し、これは、腫瘍血管系における開窓術によってナノ粒子の溢出傾向を促進する。さらに、小型（例えば５０ｎｍ未満）で血中半減期の長いナノ粒子は、ＢＢＢを通過する能力が高くなり得る。官能基で修飾したＭＳＮの表面は、ＭＳＮの性質およびそれによる生物学的応用能力も変えるだろう。例えば、ポリ（アルキレングリコール）（ＰＡＧ）の官能基修飾により、粒子は、培地によく懸濁し、免疫原性が低く、体内での循環期間が長くなり得る。表面修飾しないＭＳＮの表面は、通常、負の電荷を有するが、ＰＥＩ、アルコキシルシラン末端（ポリ）アルキレン（ポリ）アミン、または、アミン含有オルガノアルコキシシランによる修飾によって、粒子は、正のまたは弱い負の表面電荷を有するか、または表面上で電気的に中性になり得る。カルボキシル基、ホスホリル基、スルホン酸基含有オルガノアルコキシシランによる修飾によって、粒子は、強い負の電荷を有するようになり得る。また、粒子表面での官能基の組み合わせは、複数の表面特性をもたらすだろう。したがって、粒子のサイズおよび表面特性は、生物学的応用の目的に基づいて設計または最適化されることができる。

【0053】

生理活性成分

【0054】

疾患の治療のため、少なくとも１つの生理活性成分が、例えば、ＭＳＮ内の空間、または、ＭＳＮの表面に分布されるなど、ＭＳＮに載置、および／または、装填されてよい。
生理活性成分は、ＭＳＮのサイズ、および、該当する障害／疾患に基づいて適切に選択され得る。生理活性成分の例は、これらに限定されないが、エベロリムス、トラベクテジン、アブラキサン、ＴＬＫ ２８６、ＡＶ－２９９、ＤＮ－Ｉ０ｌ、パゾパニブ、ＧＳＫ６９０６９３、ＲＴＡ７４４、ＯＮ ０９１０．Ｎａ、ＡＺＤ ６２４４（ＡＲＲＹ－１４２８８６）、ＡＭＮ－１０７、ＴＫＩ－２５８、ＧＳＫ４６１３６４、ＡＺＤ １１５２、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＡＲＱ－１９７、ＭＫ－０４５７、ＭＬＮ８０５４、ＰＨＡ－７３９３５８、Ｒ－７６３、ＡＴ－９２６３、ＦＬＴ－３阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＥＧＦＲ－ＴＫ阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤、ＰＩＫ－１モジュレーター、Ｂｃｌ－２阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ｃ－ＭＥＴ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｃｄｋ阻害剤、ＥＧＦＲ ＴＫ阻害剤、ＩＧＦＲ－ＴＫ阻害剤、抗ＨＧＦ抗体、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、チェックポイント１または２阻害剤、接着斑キナーゼ阻害剤、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ｍｅｋ）阻害剤、ＶＥＧＦトラップ抗体、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサタニブ（ｄａｓａｔａｎｉｂ）、ニロチニブ、デカタニブ（ｄｅｃａｔａｎｉｂ）、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、Ｌｅｐ－ｅｔｕ、ノラトレキシド、ａｚｄ２１７１、バタブリン（ｂａｔａｂｕｌｉｎ）、オファツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テスミリフェン（ｔｅｓｍｉｌｉｆｅｎｅ）、オブリメルセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、Ｂｉｏ １１１、１３１－Ｉ－ＴＭ－６０１、ＡＬＴ－１１０、ＢＩＯ １４０、ＣＣ ８４９０、シレンギチド、ジャイマテカン、ＩＬ１３－ＰＥ３８ＱＱＲ、ＩＮＯ １００１、ＩＰｄＲ１ ＫＲＸ－０４０２、ルカントン、ＬＹ３１７６１５、ニューラジアブ（ｎｅｕｒａｄｉａｂ）、ビテスパン（ｖｉｔｅｓｐａｎ）、Ｒｔａ ７４４、Ｓｄｘ １０２、タランパネル、アトラセンタン、Ｘｒ ３１１、ロミデプシン、ＡＤＳ－１００３８０、スニチニブ、５－フルオロウラシル、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、５'－デオキシ－５－フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロミド、ＺＫ－３０４７０９、セリシクリブ（ｓｅｌｉｃｉｃｌｉｂ）；ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ－６２４４、カペシタビン、Ｌ－グルタミン酸Ｎ－［４－［２－（２－アミノ－４，７－ジヒドロ－４－オキソ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－イル）エチル］ベンゾイル］－二ナトリウム塩、七水和物、カンプトテシン、ＰＥＧ標識イリノテカン、タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）、エストラジオール、エストロゲン、結合型エストロゲン、ベバシズマブ、ＩＭＣ－１Ｃ１１、ＣＨＩＲ－２５８、３－［５－（メチルスルホニルピペラジンメチル）－インドリル］－キノロン、バタラニブ、ＡＧ－０１３７３６、ＡＶＥ－０００５、酢酸ゴセレリン、酢酸ロイプロリド、パモ酸トリプトレリン、酢酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、ＣＰ－７２４７１４；ＴＡＫ－１６５、ＨＫＩ－２７２、エルロチニブ、ラパチニブ（ｌａｐａｔａｎｉｂ）、カネルチニブ、ＡＢＸ－ＥＧＦ抗体、アービタックス、ＥＫＢ－５６９、ＰＫＩ－１６６、ＧＷ－５７２０１６、ロナファルニブ（Ｉｏｎａｆａｒｎｉｂ）、ＢＭＳ－２１４６６２、ティピファニブ；アミホスチン、ＮＶＰ－ＬＡＱ８２４、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ＦＫ－２２８、ＳＵ１１２４８、ソラフェニブ、ＫＲＮ９５１、アミノグルテチミド、アムサクリン（ａｒｎｓａｃｒｉｎｅ）、アナグレリド、Ｌ－アスパラギナーゼ、カルメット－ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、ロイプロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６－メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３－ｃｉｓ－レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスウリジン、５－デオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６－メルカプトプリン、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミスラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ－３、ネオバスタット（ｎｅｏｖａｓｔａｔ）、ＢＭＳ－２７５２９１、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン－１２、ＩＭ８６２、アンジオスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン（ｉｄｏｘｙｆｅｎｅ）、スピロノラクトン、フィナステリド、シメチジン（ｃｉｍｉｔｉｄｉｎｅ）、トラスツズマブ、デニロイキンジフチトクス、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｉｍｉｂ）、パクリタキセル、クレモホールフリーパクリタキセル、ドセタキセル、エポチロンＢ（ｅｐｉｔｈｉｌｏｎｅ Ｂ）、ＢＭＳ－２４７５５０、ＢＭＳ－３１０７０５、ドロロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン、ＥＲＡ－９２３、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソフォキシフェン、イドキシフェン、ＴＳＥ－４２４、ＨＭＲ－３３３９、ＺＫ１８６６１９、トポテカン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ ２２２５８４、ＶＸ－７４５、ＰＤ １８４３５２、ラパマイシン、４０－Ｏ－（２－ヒドロキシエチル）－ラパマイシン、テムシロリムス、ＡＰ－２３５７３、ＲＡＤ００１、ＡＢＴ－５７８、ＢＣ－２１０、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９３６４６、ワートマニン、ＺＭ３３６３７２、Ｌ－７７９，４５０、ＰＥＧ－フィルグラスチム、ダルベポエチン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ゾレドロネート（ｚｏｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）、プレドニゾン、セツキシマブ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒストレリン、ペグ化インターフェロンα－２ａ、インターフェロンα－２ａ、ペグ化インターフェロンα－２ｂ、インターフェロンα－２ｂ、アザシチジン、ＰＥＧ－Ｌ－アスパラギナーゼ、レナリドミド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、インターロイキン－１１、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、オールトランスレチノイン酸、ケトコナゾール、インターロイキン－２、メゲストロール、免疫グロブリン、ナイトロジェンマスタード、メチルプレドニソロン、イブリツモマブチウキセタン（ｉｂｒｉｔｇｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ）、アンドロゲン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、亜ヒ酸、コルチゾン、エチドロネート（ｅｄｉｔｒｏｎａｔｅ）、ミトタン、シクロスポリン、リポソームダウノルビシン、エドウィナ－アスパラギナーゼ（Ｅｄｗｉｎａ－ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ストロンチウム８９、カソピタント、ネツピタント（ｎｅｔｕｐｉｔａｎｔ）、ＮＫ－１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニソロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセトロン、トロピセトロン、ペグフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンアルファ、ダルベポエチンアルファが挙げられる。

【0055】

ＥＰＲ効果

【0056】

一般的に、ＥＰＲ効果による受動標的化は、ナノキャリアの長い循環時間に高度に依存する。高い透過性および保持（ＥＰＲ）効果に基づく腫瘍標的化へのアプローチは、（１）高密度のＰＥＧ化、（２）表面における官能基の空間的制御、（３）小さいメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）の生成、および、（４）タンパク質コロナ形成の制御であろう。特に重要な２つのパラメータは、粒径および表面特性であり、循環半減期、薬物動態、および、ナノ粒子の生体内分布における重要な役割を果たすことが期待される。一般的に、注入物質は、認識され、血清オプソニンによってすばやく結合され、その後、貪食され、肝臓および脾臓の両方に実質的に蓄積される（単核貪食細胞系としても知られる）。さらに、包括的な研究は、タンパク質コロナの中性は、標的化ナノ材料デリバリーの開発において重要な設計として強調し、表面不均一性における差が小さくても細胞および組織との相互作用を大きく異ならせる可能性があり得ることを証明した。したがって、ＥＰＲ効果によるナノメディシンの開発に成功するためには、タンパク質コロナ組成の制御および理解が重要になるだろう。

【0057】

ＢＢＢ透過効果

【0058】

血液脳関門（ＢＢＢ）は、脳内に輸送される治療薬の大部分を制限する。ナノメディシンは、ナノ粒子のサイズ、形状、表面電荷、共役配位子を変調してＢＢＢ透過を向上させることができる。例えば、トランスフェリン、ラクトフェリン、グルタチオン、および、低密度リポタンパク質受容体などの内皮細胞における受容体に結合する標的化リガンドに抱合されるナノ粒子も、ＢＢＢ透過を促進し得る。しかしながら、ナノ粒子の外面への標的化リガンドによる修飾は、血中のナノ粒子の懸濁および循環にも影響を及ぼし、ナノ粒子の血中クリアランスを加速させ得る。本発明では、ＢＢＢ透過能力を向上させるべく、ペグ化されたＭＳＮのサイズ、表面組成、および、ゼータ電位を変化させて制御しようとしている。それらの修飾、空間的配置、および、電荷によって、生理的環境における最小限の非特異的結合、および、適正な循環時間を含むＭＳＮの特徴付けが明らかになり、ＭＳＮを血液から脳へと輸送することが可能になる。

【0059】

がん転移の阻害

【0060】

がん転移は、がんを患う患者の死亡率を高めることになる。驚くべきことに、発明者等は、通常は活性成分を送達するためだけに用いられていたＭＳＮが、動物モデルを用いたインビトロ検査またはインビボ検査においてがん転移を阻害する効果をもたらし得るという発見をした。しかしながら、メソポーラスでない固体シリカナノ粒子（ＳＳＮ）は、このような効果をもたらし得ない。理論に拘束されずに、ＭＳＮの多孔質構造は、がん転移を阻害する効果に貢献し得るものの、ＭＳＭそれ自体がインサイチュで腫瘍増殖を阻害することはないだろう。

【0061】

よって、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）を被検体に投与するステップを含む、被検体の細胞転移を阻害する方法が提供される。一実施形態では、ＭＳＮは、ＰＥＧ表面修飾を有することにより、バイオアベイラビリティが向上する。一実施形態では、ＭＳＮは、ＰＥＧおよびＴＡ両方の表面修飾を有する。一実施形態では、ＭＳＮは、５０ｎｍ以下、好ましくは、３０ｎｍ以下の粒径を有する。一実施形態では、メソポーラスシリカナノ粒子は、１０００ｍ^２／ｇ以下、好ましくは、５００ｍ^２／ｇ以下のＢＥＴ表面積を有する。一実施形態では、細胞転移は、例えば、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、メラノーマ、腎臓がんなどのがん細胞転移である。一実施系形態では、投与経路は、全身または局所投与である。一実施形態では、ＭＳＮは、併用療法のために他の化学療法薬、または、生物学的医薬品と共に用いられ得る。

【0062】

ＭＳＮのプレコート

【0063】

ナノ粒子をプレコートするためにタンパク質コロナを使用することは、ナノ粒子の生体内分布を導く、または、非標的器官への不要な蓄積を避けるための代替的方法である。インビボでのＭＳＮの運命に関する一般的なタンパク質すべての生物学的機能が識別される。１つの試みは、予め処理した血漿でＭＳＮをプレコートすることであり、この血漿は、ナノ粒子の血中クリアランスを加速させる一因となるとみられているある特定のタンパク質が欠乏している。他の試みは、コロナで見つかった特定のタンパク質でＭＳＮをプレコートすることであり、このたんぱく質は、標的化能力を有するか、または、ナノ粒子にＢＢＢを通過させやすくすることができる。

【0064】

ＥＰＲ効果および／またはＢＢＢ透過効果に基づいて治療される見込みのある疾患は、これに限定されないが、脳関連のがん、および、ＣＮＳ関連のがんである。特定の疾患は、これらに限定されないが、聴神経腫、星細胞腫、脊索腫、ＣＮＳリンパ腫、頭蓋咽頭腫、脳幹グリオーマ、上衣腫、混合膠腫、視神経膠腫、上衣下腫、髄芽腫、髄膜腫、転移性脳腫瘍、乏突起膠腫、下垂体腫瘍、原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、他の脳関連症状（シスト、神経線維腫症、偽脳腫瘍、結節硬化）神経鞘腫、若年性毛様細胞性星細胞腫（ＪＰＡ）、松果体部腫瘍、および、ラブドイド腫瘍を含む。

【0065】

ＣＮＳ関連の疾患の例は、これらに限定されないが、嗜癖、くも膜嚢胞、注意欠如多動性障害（ＡＤＨＤ）、自閉症、双極性障害、カタレプシー、うつ病、脳炎、てんかん／発作、感染症、閉込め症候群、髄膜炎、偏頭痛、多発性硬化症、脊髄症、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、トゥレット症候群、ベル麻痺、脳性麻痺、てんかん、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、神経線維腫症、坐骨神経痛、帯状疱疹、および、卒中が挙げられる。

【0066】

ナノ粒子の輸送アッセイのためにインビトロＢＢＢモデルが用いられる。これは、インビボでのＢＢＢ機能を刺激するために脳毛細血管内皮細胞、脳周皮細胞、および、星状膠細胞を共培養する。さらに、マウスの脳血管および脳組織における粒子蓄積を二光子蛍光顕微鏡で直接観察するため、蛍光標識したＭＳＮが用いられる。

【0067】

以下の実施例は、本発明が属する技術の当業者が本発明をより良く理解できるように記載されたものであり、本発明の範囲を限定することは意図されない。
実施例

【0068】

材料、手順、および、テストモデル

【0069】

ＲＩＴＣ結合ＡＰＴＭＳの調製

【0070】

ＲＩＴＣにおけるイソチオシアネート基とＡＰＴＭＳにおけるアミノ基との反応によってＲＩＴＣがＡＰＴＭＳに結合した。本明細書中で使用されるＲＩＴＣ結合ＡＰＴＭＳは、５ｍＬのエタノール中に８ｍｇのＲＩＴＣを添加し、このエタノール－ＲＩＴＣ溶液に１０μＬのＡＰＴＭＳを導入することによって調製された。混合物を暗所で少なくとも３時間撹拌し、利用前に、ＲＩＴＣ結合ＡＰＴＭＳを得た。

【0071】

透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）

【0072】

シリカナノ粒子の外見を直接調査および検証するために、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いる。ＴＥＭ画像は、１００ｋＶの加速電圧で動作する透過型電子顕微鏡Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈ－７１００で撮影した。エタノール中に分散したサンプルを炭素被覆した銅格子に滴下し、ＴＥＭ観察のために空気中で乾燥させた。

【0073】

動的光散乱（ＤＬＳ）およびゼータ電位

【0074】

異なる溶液環境でのシリカナノ粒子のサイズ測定は、マルバーンゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン、イギリス）で動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて行なわれた。室温で、異なる溶液（ｐＨ７．４の水およびＰＢＳ緩衝液）に形成された（溶媒和）粒子のサイズを分析した。異なるｐＨ値の水溶液中のシリカナノ粒子の表面電荷（ゼータ電位）をＭＰＴ－２装置と組み合わせたマルバーンゼータサイザーナノＺＳによって測定し、サンプル溶液をｐＨ６～ｐＨ８で滴定し、異なるｐＨ点のデータを記録した。

【0075】

元素分析

【0076】

シリカナノ粒子における炭素、窒素、酸素、および、水素の質量百分率を元素分析計（エレメンター Ｖａｒｉｏ ＥＬ ｃｕｂｅ ＮＣＳＨ、ドイツ）によって決定した。

【0077】

ナノ粒子のＥＰＲ効果および生体内分布を検出するためのインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）

【0078】

ナノ粒子のインビボ生体内分布画像をＩＶＩＳイメージングシステム（Ｌｕｍｉｎａ）により得た。ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢）をバイオラスコから購入した。異所性移植のため、４Ｔ１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２５３９ＴＭ）腫瘍細胞を皮下注射して担腫瘍マウスを作製した。４Ｔ１細胞を２～３週間成長させた後、ＰＢＳ中のサンプルに静脈注射した。注射から２４時間後、主要器官（心臓、肺、脾臓、肝臓、および、腎臓）、腫瘍、尿、および、血液を注意深く収集し、収集したサンプルの蛍光画像、および、強度をＩＶＩＳイメージングシステムにより得た。

【0079】

インビトロモデルにおける血液脳関門（ＢＢＢ）

【0080】

ファーマコセル株式会社（長崎、日本）から購入したインビトロＢＢＢモデルは、平板培養した脳の内皮細胞、周皮細胞、および、星状膠細胞が播種されたトランスウェルインサートを含む１２ウェル培養皿を用い、三重細胞共培養によって構築される。実験に先立ち、ＢＢＢの培養皿を５％の二酸化炭素状態下、３７℃で４日間インキュベートすることによって細胞間の密着結合を高めた。電荷修飾ＭＳＮ－ＰＥＧナノ粒子を０．３ｍＬのアッセイ培地に懸濁し、（０．３３ｍｇ／ｍＬ）、その後、ＢＢＢ層の先端側に添加し、モデルを６時間および２４時間培養した。さらに、フルオレセインナトリウム（分子量３７６；ＮａＦｌｕｏ）を非特異的輸送マーカーとして作用させた。培養後、基底外側の培地を収集し、ＩＣＰ－ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析計）によってＳｉ濃度を検出した。

【0081】

脳血管におけるナノ粒子を検出するための二光子蛍光顕微鏡

【0082】

健康なＩＣＲマウス（２７～３０ｇ）に２００ｍｇ／ｋｇの電荷修飾ＭＳＮ－ＰＥＧナノ粒子を静脈注射し、調節可能な励起周波数（８００～１０００ｎｍ）を有する多光子顕微鏡（オリンパス ＦＶＭＰＥ－ＲＳ）によってマウスの耳たぶのダイナミックイメージングを行った。脳血管中をナノ粒子が循環しなくなってから、マウスに麻酔をかけ、開頭術を行った。本研究では、短期間で観察するために、脳の表面にカバーガラスを置く代わりに、生理食塩水を用いた。脳の血管系をイメージングするため、無菌食塩水に溶解した０．６ｍＬの２．５％（ｗ／ｖ）フルオレセインイソチオシアネートデキストラン（ＦＩＴＣデキストラン、分子量７０ｋＤａ）をマウスに静脈注射した。マウスの大脳における電荷修飾ＭＳＮ－ＰＥＧナノ粒子の深さプロフィール画像は、脳の表面下０～３００μｍ（軸間隔は１μｍ）から集められた。

【0083】

薬物動態、および、ｄｏｘ蓄積の定量化

【0084】

健康なＢＡＬＢ／ｃマウスに７．５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘまたはＤｏｘ＠ＮＴＴ０＿１８を単回静脈注射した。血漿および脳におけるＤｏｘ濃度を決定すべく、注射から１５分、３０分、６０分、１８０分、３６０分、および、１４４０分後にそれぞれ血液サンプルを採取し、サンプルを採取した後の動物をそれぞれ死亡させ、ＰＢＳで潅流して脳を採取した。分光光度計によりＤｏｘ濃度を決定するため、サンプル（血漿および脳のそれぞれ）からＤｏｘを抽出した。

【0085】

Ｕ８７グリオーマ動物モデル

【0086】

１０％のウシ胎仔血清および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロジェン）を追加した最小必須培地（ＭＥＭ）において、加湿された５％の二酸化炭素雰囲気の下、３７℃で、Ｕ８７－ＬＵＣグリオーマ細胞を培養した。細胞をトリプシン処理によって収穫し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１度洗浄し、後のマウス脳の線条体への移植のために、ＭＥＭ中に再懸濁（１×１０^５細胞／μＬ）した。無菌のメスのＮＵ／ＮＵマウス（５～７週齢）をバイオラスコ（台湾）から購入した。マウスを制御環境下に収容および維持し、全ての手順を、長庚大学動物委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｃｈａｎｇ Ｇｕｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の動物の飼養に関するガイドラインに従って実施した。Ｕ８７－ＬＵＣ腫瘍細胞を移植するに当たり、マウスには２％イソフルランガスで麻酔を行い、定位固定フレーム上に固定した。頭蓋冠を覆う皮膚の矢状切開を行い、露出させた頭蓋において、ブレグマの１．５ｍｍ前側かつ２ｍｍ外側に対し、２３Ｇの針を使用して孔を形成した。脳表面から２ｍｍ深部に、５μＬのＵ８７－ＬＵＣグリオーマ細胞懸濁液を注入した。注入は３分間行い、その後２分かけて針を引き抜いた。脳腫瘍の増殖をＩＶＩＳおよびＭＲＩでモニタした。

【0087】

実施例１

【0088】

ナノ粒子表面の官能基修飾に対してさまざまなＰＥＧ比率を有するメソポーラスシリカナノ粒子の調製

【0089】

メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）は、さまざまな有機官能基によって修飾され得る、明確に定義された構造および高密度の表面シラノール基を有する。異なるサイズのＭＳＮは、高希釈状態、すなわち、界面活性剤の濃度が低い状態で、アンモニアを塩基触媒として調製された。粒径は、アンモニア濃度、添加されるＴＥＯＳ量、および、反応温度を調整することによって制御された。ＭＳＮの表面に正荷電基を提供するため、例示的な電荷修飾剤としてＴＡシラン（Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド）を用いた。例によって、密閉されたビーカー内の所望の温度（５０～６０℃）の１５０ｍＬの水酸化アンモニウム溶液（０．１～０．２Ｍ）に、０．２９ｇのＣＴＡＢを溶解した。１５分撹拌した後、密封膜を取り除き、溶液を勢いよく攪拌しながら（６００ｒｐｍ）、２．５ｍＬのエタノールを溶媒としたＲＩＴＣ結合ＡＰＴＭＳ、および、２～２．５ｍＬのエタノールを溶媒としたＴＥＯＳ（０．８～０．９Ｍ）を加えた。１時間の撹拌の後、２ｍＬのエタノール中で、ＴＡシランに対するＰＥＧシランのモル比が異なる５５０μＬのＰＥＧシラン（２－［メトキシ(ポリエチレンオキシ)プロピル]-トリメトキシシラン)を反応させた（ＰＥＧ／ＴＡ比は１５：１，１０：１，７：１，３：１，２：１，１：２であり、ＴＡシランの量は０．０４～１．２ｍＬ）。混合物を３０分間撹拌した後、少なくとも１２時間は撹拌せずに、混合物を所望の温度（５０～６０℃）で熟成させた。その後、溶液を密封し、７０℃のオーブンに入れて２４時間水熱処理にかけた。合成したままのサンプルを洗浄し、遠心分離またはクロスフローシステムによって収集した。ＭＳＮの細孔内の界面活性剤を取り除くため、合成したままのサンプルを初回は６７８μＬ、２回目は４０μＬの塩酸（３７％）を含む４０ｍＬの酸性エタノール中で、それぞれ６０℃、抽出時間は１時間でインキュベートした。生成物を洗浄し、遠心分離またはクロスフローシステムで収集し、最終的に９０％エタノール中に保存した。異なる官能基で修飾したＭＳＮ－ＰＥＧを合成するために、ＴＡシランをＰＥＩシラン、ＥＤＰＴＭＳＮシラン、または、他の官能基シランと置き換えた。

【0090】

実施例２

【0091】

ＴＥＭおよびＤＬＳ測定

【0092】

実施例１で合成されたＭＳＮをＴＥＭ測定にかけ、結果を図１に示す。粒径、および、その標準偏差を表１に示す。ＴＥＭの結果では、さまざまな修飾を有する３０ｎｍのＭＳＮは、約２５～３５ｎｍの平均粒径を有し、さまざまな修飾を有する５０ｎｍのＭＳＮは、約４０～６０ｎｍの平均粒径を有し、どちらの粒径の標準偏差も小さく、そのことは、粒子の均一性に反映していることを示唆している。

【表1】

【0093】

異なる分解能環境の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されたさまざまな修飾を有するＭＳＮの粒径を表２に示す。ＤＬＳの結果は、すべてのＭＳＮが緩衝液中約３５ｎｍ～４５ｎｍ、または、５０～７０ｎｍの範囲内によく分散していることを示している。

【表2】

【0094】

元素分析

【0095】

ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡ合成過程では、ＭＳＮにおけるＰＥＧ／ＴＡ比を変調するための反応に、異なるモル比のＰＥＧシランおよびＴＡシランを用いた。ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡナノ粒子における官能基を定量化すべく、ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡナノ粒子の元素組成を元素分析器で測定した。ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡにおけるＴＡ基に対するＰＥＧ基のモル比（ＰＥＧ／ＴＡ）は、ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡ粒子の窒素および炭素の質量百分率から導かれる。元素分析から導かれたＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡ（１：２）、（２：１）、（１０：１）のＰＥＧ／ＴＡ比は、約０．６４、２．６７、および、６．１３である。

【0096】

実施例３

【0097】

生体内分布および腫瘍標的化能力への官能基の表面電荷および空間的配置の影響

【0098】

ＭＳＮは、ＥＰＲ効果に基づく優れた腫瘍標的化能力を示し、考慮すべきいくつかの重要な決定要因があることが実証されている。（１）粒径は、１００ｎｍ未満であり、好ましくは、約２０ｎｍ～５０ｎｍの範囲であり、例えば、約３０ｎｍである。（２）外面は、ＰＥＧで覆われる必要があり、修飾は、ＰＥＧ層内に隠される必要がある。
（３）表面電荷、および、ＰＥＧ／電荷修飾部分の比率は、特定の範囲内に限定する必要がある。官能基の空間的配置の、ＥＰＲ効果への影響を評価すべく、同様のサイズおよびゼータ電位を有するが正荷電分子の長さまたは分子量が異なるＭＳＮを合成した。ＭＳＮをＰＥＧ化するためのＰＥＧは、分子量４５９～５９１であり、表面修飾のための正荷電基は、トリメトキシシリルプロピル修飾したポリエチレンイミン（ＰＥＩシラン、分子量１５００～１８００）、Ｎ－トリメトキシシリルプロピル－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＴＡシラン、分子量２５８）、または、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（ＥＤＰＴＭＳ、分子量２２２）である。分子量がより大きいＰＥＩシランは、ＰＥＧ層を超えて外面に露出することが予想されるが、ＴＡおよびＥＤＰシランは、ＰＥＧシランより分子量が小さいので、鎖の長さが短くなり、ＴＡの第４級アミン、および、ＥＤＰの第１および第２級アミンは、ＰＥＧ層内に隠れることが予想される。ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＰＥＩ、ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡ、および、ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＥＤＰの合成的径（ＴＥＭ）、水および緩衝液中における流体力学的径（ＤＬＳ）、および、ゼータ電位は、ほぼ同一である（表３）。これらの粒子のＥＰＲ効果は、担腫瘍マウスの尾静脈から粒子を注射することによって検査される。注射後１日目に、腫瘍および器官への粒子の蓄積をＩＶＩＳによって決定した。ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡ、および、ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＥＤＰは、腫瘍内に強い蛍光信号を示し、肝臓の信号に対する腫瘍の信号の比率は、３を上回った。これは、粒子が腫瘍に蓄積し、優れたＥＰＲ効果があることを意味する。しかしながら、ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＰＥＩは、ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡと同様のサイズおよびゼータ電位を有するが、腫瘍に蓄積しない（表３）。ＥＰＲ効果を変調させるには、官能基がＰＥＧ層に隠れているだけでなく、ＭＳＮの表面電荷も重要である。ＰＥＧ化は、血液の循環および腫瘍内の蓄積を向上させることはよく知られているが、その向上は十分でない。粒子が蓄積する肝臓対腫瘍の比率（腫瘍／肝臓）は、３０ｎｍのＭＳＮ－ＰＥＧでは約１．２であり、５０ｎｍのＭＳＮ－ＰＥＧでは約０．３５である（図２）。表面官能基の組成およびゼータ電位を変調するための合成過程においてＴＡ対ＰＥＧ（ＰＥＧ／ＴＡ）のモル比を異ならせることにより、ＥＰＲ効果を著しく高めることができる。粒子の蓄積比の値（腫瘍／肝臓）は２～３上昇し、２～８．６倍の向上を示している。－１５～＋７ｍＶに上昇したゼータ電位（ｐＨ７．４の状態）を有する１５：１～２：１の比率のＰＥＧ／ＴＡ（合成過程における（ＰＥＧシラン／ＴＡシラン）で修飾された３０ｎｍのＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡナノ粒子は、ＭＳＮ－ＰＥＧ、ＭＳＮ－ＴＡ（ゼータ電位＋３１）、および、ＰＥＧ／ＴＡ（１：２）で修飾されたナノ粒子（ゼータ電位＋２１）より高い粒子蓄積比値（腫瘍／肝臓）を示している（図３）。ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡの粒径が５０ｎｍであり、ＰＥＧ／ＴＡ比が７：１～２：１であり、ゼータ電位（ｐＨ７．４の状態）が＋１２から＋１８ｍＶに上昇する場合も同様の結果が得られ、粒子は、５０ｎｍのＭＳＮ－ＰＥＧよりも高い腫瘍標的化能力を示した。結果は、ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡの表面電荷およびＰＥＧ／ＴＡ比が特定の範囲であるとナノ粒子の腫瘍標的化能力が高まることを示している。

【表3】

【0099】

実施例４

【0100】

ＢＢＢ透過能力への表面電荷の影響

【0101】

薬物輸送のＢＢＢ通過に有利なのは１００ｎｍ未満のナノ粒子であるため、脳へ治療薬を送達することは、未だに大きな課題である。本発明では、ＰＥＧ化されたＭＳＮのサイズ、組成、および、ゼータ電位の、ＢＢＢ透過への影響を、インビトロおよびインビボで調べた。異なる表面修飾を有する３つの異なるサイズ（１０、３０、５０ｎｍ）のＭＳＮを合成し、ラット（ウィスターラット）の脳毛細血管内皮細胞、脳周皮細胞、および、星状膠細胞の初代培養によって作製したインビトロＢＢＢモデルであるＢＢＢキットを用いてＢＢＢ透過能力を有する粒子をすばやくスクリーニングした。表面を正荷電ＴＡ分子で修飾した３０ｎｍのＰＥＧ化ＭＳＮは、インビトロアッセイにおいて、ＢＢＢの細胞層を比較的よく通過することを示した。インビボでのナノ粒子のＢＢＢ透過能力を理解すべく、二光子蛍光顕微鏡を用いて、マウスの脳の血管におけるナノ粒子の分布をモニタした。蛍光標識したナノ粒子を、尾静脈を介して投与した。注射から２日後、表面から０～３００μｍの深度内に位置する脳血管を検出した。一方、脈管構造をマッピングし、血管壁の境界を明らかにするため、ＦＩＴＣデキストランを静脈注射した。ナノ粒子からの蛍光信号がＦＩＴＣデキストランの信号（緑信号）と重なると、黄色信号または赤信号が現れ、ナノ粒子が血管内にないことを意味し、ＢＢＢを通過して脳組織に入ることができたことを意味する。脳血管の３Ｄ画像は、脳血管壁および脳組織領域に分布したＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡナノ粒子からの非常に多くの赤信号を示している（図４Ａ）。脳の組織切片におけるナノ粒子の分散パターンを観察することによって、ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡの脳内分布をさらに調べた。脳組織の異なる場所で、ナノ粒子を検出した。

【0102】

結果は、特定の範囲のＰＥＧ／ＴＡ比（１０：１～２：１）で修飾した３０ｎｍのＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡは、ＢＢＢを通過して脳組織内に入る可能性を示した。しかしながら、負荷電ＴＨＰＭＰ分子で修飾されたナノ粒子（ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＨＰＭＰ）は、ＢＢＢ透過能力を示さなかった（図４Ｂ）。インビボでのＢＢＢ透過能力を示すには、生理的環境において、ナノ粒子が最低限の非特異的結合および適切な循環時間を有さなくてはならない。さらに、ナノ粒子の生理化学的特性は、ＢＢＢ通過する通過メカニズムを決定する。これまで、内皮細胞によるレセプターまたは吸収性媒介トランスサイトーシス、および、内皮細胞間の密着結合を開くことを含む、ＢＢＢを通過するナノ粒子のメカニズムを説明してきたが、生体用途のためにＢＢＢ透過能力を有するナノ粒子を開発することは、まだ困難である。本発明では、官能基（ＴＡ分子）をＰＥＧ層内に隠し、ゼータ電位（ｐＨ７．４の状態）を－１３～＋２１ｍＶ（好ましくは約－１３～＋７ｍＶ）の範囲で変更するために表面のＰＥＧ／ＴＡ比を変調する（１０：１～１：２、好ましくは、約１０：１～２：１の範囲）することによって、ＣＮＳ疾患および脳腫瘍の治療薬を脳に送達するためにナノ粒子がＢＢＢを透過できるようになることを実証する。

【0103】

実施例５

【0104】

血漿および脳におけるＤｏｘおよびＤｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡの薬物動態

【0105】

ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡの血液循環時間の延長、および、ＢＢＢ透過能力向上の予備的定量化のため、化学療法薬であるドキソルビシン（Ｄｏｘ）の薬物動態を、ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡのカプセル化ありまたはなしで分析した。マウスに、静脈注射によってＤｏｘまたはＤｏｘ＠ＮＴＴ０＿１８（ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡ負荷Ｄｏｘ）を単回投与した（Ｄｏｘ投与量はすべて７．５ｍｇ／ｋｇ）。血漿および脳におけるＤｏｘ濃度を決定すべく、注射の１５、３０、６０、１８０、３６０、および、１４４０分後に血液サンプルを取り、各時点で動物を死亡させてＰＢＳで潅流した。血漿および脳からＤｏｘを抽出し、分光光度計を用いてＤｏｘ濃度を測定した。カプセル化されたＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡ有り、無しの血漿におけるＤｏｘの濃度対時間曲線も描いた。Ｄｏｘ溶液の注射後１５分を過ぎても血漿内のＤｏｘ濃度はほとんど検出できなかった（０．２μｇ／ｍＬ未満）が、Ｄｏｘ＠ＮＴＴ０＿１８を注射したマウスには６時間後もＤｏｘが存在していた。これらの潅流マウスにおける脳分析では、Ｄｏｘ＠ＮＴＴ０＿１８の投与の方が、Ｄｏｘ溶液の投与よりも、脳内におけるＤｏｘの蓄積が２～６．６倍も高いことを示した。これらの結果は、ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡナノ粒子にカプセル化されたＤｏｘが、血液循環時間を長くし、ＢＢＢ透過性を高め得ることを明らかにしている。

【0106】

実施例６

【0107】

脳腫瘍の治療のためのＤｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡ

【0108】

３０ｎｍのＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡ粒子は、腫瘍標的化（ＥＰＲ効果）およびＢＢＢ透過特性を有する。これは、脳腫瘍の治療のためのドラッグデリバリーナノキャリアとしてのＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡナノ粒子の利点である。Ｄｏｘは、多発性がんの治療に承認されるよく知られた抗がん剤である。Ｄｏｘは、インビトロでは、抗グリオーマ細胞活性を示すが、ＢＢＢを通過して脳内に入ることができなかった。また、Ｄｏｘは、脳がんの治療には承認されていない。我々のＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡナノ粒子は、脳がんの治療のためにＤｏｘを脳内に送達する可能性をもたらす。Ｄｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡは、ＤｏｘをＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡ溶液で１時間インキュベートし、水で２回洗浄してカプセル化されていないＤｏｘを取り除くことによって合成され、遠心分離によって収集された。インビボでのＤｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡの抗脳腫瘍の有効性を評価すべく、Ｕ８７－ＬＵＣ脳細胞をヌードマウスに直交異方性移植してＵ８７－ＬＵＣ異種移植マウスモデルとした。Ｕ８７－ＬＵＣ細胞は、インビボでの腫瘍細胞の定量化のための発光酵素を表し得る。腫瘍移植から４日後、同じＤｏｘ用量（１０ｍｇ／ｋｇ）のフリーＤｏｘおよびＤｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡと、約２５０ｍｇ／ｋｇのＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡとをそれぞれ、Ｕ８７－ＬＵＣ異種移植マウスモデルの尾静脈から４日ごとに３回投与し、調査期間中、体重および腫瘍サイズを測定した。治療期間中、ＤｏｘおよびＤｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡの腫瘍サイズは減少したが、Ｄｏｘの高毒性がマウスを弱らせ、宿主を死に至らしめた。それに対し、Ｄｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡで治療したマウスは、治療期間中に体重の減少が見られたが、投与を止めると回復した。Ｄｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡ治療群のマウスの脳のＭＲＩ画像は、１３日目に著しい腫瘍の収縮を示し、３４日目には、空所で示されるように腫瘍はほぼ検出できなくなった（図示せず）。Ｄｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡで治療されたマウスの寿命は、腫瘍が消滅したために著しく延びた。
ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡおよびＤｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡのＥＰＲ効果およびＢＢＢ透過能力を評価すべく、最後の注射から２４時間後にマウスを死亡させ、脳を収集し、凍結切片を調製するため固定した。脳組織および腫瘍におけるＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡおよびＤｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡの分布を、ナノ粒子で治療されたマウスの腫瘍切片から評価した。細胞の核を染色するためにＤＡＰＩを用い、ＤＡＰＩで染色した細胞の過形成領域によって腫瘍組織を識別した（青で示す）。ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡで治療したマウスは、腫瘍の中心および周辺にたくさんのナノ粒子（赤で示す）の蓄積が見られた。この現象は、ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡのＥＰＲ効果とＢＢＢ透過性の組み合わせによるものであり得る（図示せず）。Ｄｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡで治療したマウスの脳切片は、Ｄｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡの抗脳腫瘍効果により、腫瘍領域がＰＢＳ群のものよりはるかに小さいことを示した。ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡとＤｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡとは明らかに異なる。Ｄｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡは、腫瘍領域に蓄積されるだけでなく、腫瘍領域でない場所にもみられる。Ｄｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡの信号は、脳全体のさまざまな領域で検出できる（図示せず）。これらの結果は、腫瘍増殖中に漏れやすい脈管構造が形成されると、Ｄｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡのＥＰＲ効果は、生体内分布を支配し、Ｄｏｘを腫瘍領域に送達するので、腫瘍細胞を殺し、腫瘍を収縮させることを示している。一旦腫瘍が収縮してＥＰＲ効果が弱まると、Ｄｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡナノ粒子のＢＢＢ通過現象が容易に観察される。臨床例では、腫瘍周辺のがん細胞は、正常な脳組織に浸潤する可能性があり、そうなると治療薬の送達が困難になる。なぜなら、正常な領域のＢＢＢおよび血管は、インタクトであるため治療薬を遮断するからである。Ｄｏｘ＠ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡのＢＢＢ透過性は、浸潤するがん細胞を殺す、または、腫瘍除去手術後も残ったがん細胞を殺すためにＤｏｘをＢＢＢのインタクトな領域内に送達する可能性を有する。したがって、ドラッグデリバリーシステムとしてＥＰＲ効果およびＢＢＢ透過能力の両方を有するＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡは、がん、特に脳関連のがん、および、ＣＮＳ疾患の治療に有益である。

【0109】

実施例における材料、反応、条件、および、パラメータは、例示目的に過ぎず、材料または調製法を限定する意図はない。

【0110】

脳関連のがん、および、ＣＮＳ関連のがんの例は、これらに限定されないが、聴神経腫、星細胞腫、脊索腫、ＣＮＳリンパ腫、頭蓋咽頭腫、脳幹グリオーマ、上衣腫、混合膠腫、視神経膠腫、上衣下腫、髄芽腫、髄膜腫、転移性脳腫瘍、乏突起膠腫、下垂体腫瘍、原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、他の脳関連症状（シスト（嚢胞）、神経線維腫症、偽脳腫瘍、結節硬化）神経鞘腫、若年性毛様細胞性星細胞腫（ＪＰＡ）、松果体部腫瘍、および、ラブドイド腫瘍が挙げられる。

【0111】

ＣＮＳ関連の疾患の例は、これらに限定されないが、嗜癖、くも膜嚢胞、注意欠如多動性障害（ＡＤＨＤ）、自閉症、双極性障害、カタレプシー、うつ病、脳炎、てんかん／発作、感染症、閉込め症候群、髄膜炎、偏頭痛、多発性硬化症、脊髄症、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、トゥレット症候群、ベル麻痺、脳性麻痺、てんかん、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、神経線維腫症、坐骨神経痛、帯状疱疹、および、卒中が挙げられる。

【0112】

実施例７

【0113】

がん細胞転移を阻害するためのインビトロ検査

【0114】

ＭＳＮの治療によってがん転移を阻害する可能性を評価するために、創傷治癒アッセイを採用した。さまざまな表面修飾または粒径を有するＭＳＮ粒子をアッセイに用いる。固体シリカナノ粒子（ＳＳＮ）すなわち、実質的に孔のないナノ粒子も比較例としてアッセイに用いられる。創傷治癒アッセイは、以下の工程で行われる。ＩｂｉｄｉのＣｕｌｔｕｒｅ－Ｉｎｓｅｒｔｓ ２ウェルを２４ウェルプレートに移し、４Ｔ１細胞（２×１０^４細胞／ウェル）をＣｕｌｔｕｒｅ－Ｉｎｓｅｒｔｓの２つのコンパートメントに播種し、２４時間インキュベートした。インキュベート後、インサートを除去し、均一な創傷にした。ウェルをＰＢＳで２回洗浄して分離した細胞を除去し、１％のウシ胎仔血清、および、２００μｇ／ｍＬのＭＳＮまたはＳＳＮと共にＲＰＭＩ培地で培養した。０、１６、および、２４時間後に顕微鏡で画像を取得し、創傷部治癒率をＩｍａｇｅＪによりカウントした。パラメータの詳細を表４に示す。

【0115】

【表4】

【0116】

図５Ａは、１６時間後と２４時間後との、各サンプルの創傷部治癒率の比較を示す。結果は、さまざまな表面修飾およびサイズを有するＭＳＮは、細胞移動を阻害する効果を示したが、ＳＳＮにはそのような効果は見られなかった。

【0117】

ＭＳＮの治療によるがん転移阻害の可能性を評価するために、ボイデンチャンバアッセイも採用した。ＭＳＮの細胞移動阻害能力を評価すべく、細胞を２００μｇ／ｍＬのＭＳＮまたはＳＳＮで２４時間処理したのち、２×１０^５の４Ｔ１細胞／ウェルを６ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートした。その後、細胞を回収し、ボイデンチャンバ（７×１０^４細胞／ウェル）の上側に移した。ボイデンチャンバアッセイには中空のプラスチックチャンバを用い、一端側を多孔膜で密封し、チャンバをウェル上に設置し、ＲＰＭＩ培地を添加した。細胞をチャンバの上側に置き、細孔を介して膜の反対側に移動させた。２４時間後、細胞を４％のホルムアルデヒド溶液で固定し、０．５％のクリスタルバイオレットで染色した。チャンバの上側の移動しなかった細胞を消毒綿で取り除き、移動した細胞の画像を顕微鏡で撮影した。図５Ｂは、各サンプルの下層の細胞被覆部（移動細胞）のパーセントの比較を示す。結果は、ＰＥＧ修飾、および、上記のようなＴＡ修飾と組み合わせたＰＥＧ修飾を含む、さまざまな表面修飾、および、さまざまなサイズを有するＭＳＮは、細胞移動を阻害する効果を示したが、ＳＳＮではそのような効果は見られなかったことを示した。このような結果は、シリカナノ粒子のメソ多孔性が細胞移動を阻害する効果に寄与し得るという証拠となり得る。

【0118】

実施例８

【0119】

マウスへのインビボ検査

【0120】

ＭＳＮの治療効果を評価するためにマウスにインビボ検査を行った。１．５×１０^６のルシフェラーゼ－４Ｔ１がん細胞（ルシフェラーゼ標識乳がん細胞）を背中に移植したＢＡＬＢ／ｃマウスをインビボ検査モデルとして用いた。この自然がん転移モデルでは、移植した腫瘍が増殖するとすぐに、移植部位から二次的部位（転移部位：肺、リンパ節など）へとがん細胞が広がった。１２日目、１５日目、および、１８日目に、２５ｎｍのＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡをマウスに静脈注射（２００ｍｇ／ｋｇ）、または、腫瘍内投与（２０ｍｇ／ｋｇ）した。がん転移を追跡するため、２１日目、２８日目、３２日目、３５日目にＩＶＩＳシステムによって発光図を撮影した。３５日目に、マウスの肺を摘出し、墨で染色した。数分後、腫瘍組織が黒い肺における白い小節として現れる。腫瘍を数えることによって転移レベルを決定できる。週２回、マウスの体重および腫瘍体積を測定した。

【0121】

図６Ａは、各群で測定したマウスの体重がほぼ一定に維持されていることを示し、これはＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡがマウスに対して毒性を示し得ないことを意味する。その一方で、異なる日に測定された腫瘍体積は、インサイチュではＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡが腫瘍増殖を阻止できない可能性があることを示した。

【0122】

図７は、肺へのがん転移レベルの結果を示しており、ＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡの静脈注射および腫瘍内投与のいずれも転移を阻止することを示している。

【0123】

図８は、２５ｎｍのＭＳＮ－ＰＥＧ＋ＴＡを静脈注射または腫瘍内投与したマウスの背中から身体の他の部位（肺およびリンパ節）への転移レベルは、対照群のマウスより低いことを示す発光図である。

【0124】

当業者は、本出願の趣旨および範囲を逸脱することなく、本発明の教示および開示にさまざまな変更および修正がなされ得ることを理解すべきである。上記内容に基づき、それらの変更および修正は、添付の請求項および均等物において定義された範囲内に収まるという条件で、本願の範囲内に収まることが意図される。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】