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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-11
(45)【発行日】2024-11-19
(54)【発明の名称】慢性肉芽腫症の処置
(51)【国際特許分類】
C12N 15/86 20060101AFI20241112BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241112BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241112BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20241112BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20241112BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20241112BHJP
【ＦＩ】
C12N15/86 Z
C12N5/10 ZNA
A61P37/04
A61K35/15
A61K35/28
C12N5/071
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2022520041
(86)(22)【出願日】2020-10-02
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-08
(86)【国際出願番号】 EP2020077638
(87)【国際公開番号】W WO2021064164
(87)【国際公開日】2021-04-08
【審査請求日】2023-06-15
(31)【優先権主張番号】19201180.7
(32)【優先日】2019-10-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】501393966
【氏名又は名称】ウニヴェルジテート・チューリッヒ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＥＴ ＺＵＥＲＩＣＨ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ジラー， ウルリッヒ ヴォルフガング
(72)【発明者】
【氏名】ライヒェンバッハ， ヤニーネ
(72)【発明者】
【氏名】ハンゼラー， ヴァルター
【審査官】山内 達人
(56)【参考文献】
【文献】BRENDEL, C et al. ，Human miR223 promoter as a novel myelo-specific promoter for chronic grannulomatous disease gene therapy，Hum Gene Ther Methods，24(3)，2013年06月，pp.151-159
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
レンチウイルスベクターで形質導入され、単離されたヒト造血幹細胞または骨髄系前駆細胞であって、前記レンチウイルスベクターは、－ ｇｐ９１ｐｈｏｘおよびｐ４７ｐｈｏｘから選択されるポリペプチドをコードするコード核酸配列；
を、
－ 配列番号０１に記載のｍｉＲ２２３プロモーター配列
の転写制御下で含む、単離されたヒト造血幹細胞または骨髄系前駆細胞。
【請求項2】
前記レンチウイルスベクターは、配列番号０２に記載の核酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたヒト造血幹細胞または骨髄系前駆細胞。
【請求項3】
前記細胞は、ＣＤ３４陽性造血幹細胞である、請求項１または２のいずれか１項に記載のヒト造血幹細胞または骨髄系前駆細胞。
【請求項4】
治療用細胞調製物を調製するための方法であって、前記方法は、ａ． ｇｐ９１ｐｈｏｘおよびｐ４７ｐｈｏｘから選択されるポリペプチドをコードする欠陥遺伝子と関連する遺伝子欠陥と関連する慢性肉芽腫症に罹患している患者から単離された、造血幹細胞を含む細胞の調製物を提供する工程；
ｂ． 前記細胞の調製物を、以下：
ｉ． ｇｐ９１ｐｈｏｘおよびｐ４７ｐｈｏｘから選択されるポリペプチドをコードするコード核酸配列を；
ｉｉ． 配列番号０１に記載のｍｉＲ２２３プロモーター配列
の転写制御下で含むレンチウイルスベクターで形質導入する工程、
を包含する、方法。
【請求項5】
造血幹細胞を含む細胞の前記調製物が、ＣＤ３４陽性造血幹細胞の調製物である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
慢性肉芽腫症の処置または防止における使用のための、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離されたヒト造血幹細胞もしくは骨髄系前駆細胞、または請求項４または５に記載の方法によって得られる細胞調製物。
【請求項7】
前記細胞は、自家細胞である、請求項６に記載の慢性肉芽腫症の処置または防止において使用するための単離されたヒト造血幹細胞または骨髄系前駆細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、慢性肉芽腫症を処置するための手段および方法に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）は、サウジアラビアにおける１／１９．２３０（Ｓｕｌｉａｍａｎら． （２００９） Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ａｓｔｈｍａ， Ａｌｌｅｒｇｙ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２２， ２１－２６）からスウェーデンにおける１／４５０．０００（Ａｈｌｉｎら． （１９９５） Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒ ８４， １３８６－１３９４）の間の発生率を有する先天性の免疫不全症の群を構成する。上記疾患は、罹患患者の身体が細菌および真菌感染から自身を防御できないことから、人生の早い時期に現れる。平均余命は、抗生物質および抗真菌剤での生涯にわたる予防的処置にもかかわらず、強く損なわれる（Ｋｕｈｎｓら． （２０１０） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６３ （２７） ２６００－１０； ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら． （２００９） ＰｌｏＳ ｏｎｅ ４（４）： ｅ５２３４）。上記疾患の主要原因は、貪食細胞（顆粒球、単球、およびマクロファージ）が、貪食細胞のＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）オキシダーゼ酵素複合体内の欠陥に起因して、病原体不活性化のための活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する能力が大きく減少されるかまたはないことである。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ酵素複合体は、６個のサブユニット（ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘおよびＲａｃ２）からなる。全ＣＧＤ患者のうちの約６０％において、上記疾患は、Ｘ染色体上のｇｐ９１ｐｈｏｘサブユニットコード遺伝子（ＣＹＢＢ）内の変異によって引きおこされ、従って、Ｘ－ＣＧＤといわれる。患者のうちの別の約３０％は、常染色体劣性ＮＣＦ１遺伝子（ｐ４７ｐｈｏｘサブユニット）の変更（ＣＧＤのｐ４７ｐｈｏｘ欠損型）を提示する一方で、その症例のうちのわずか５％は、ｐ６７ｐｈｏｘおよびｐ２２ｐｈｏｘにおける常染色体劣性変異に起因する（Ｒｏｏｓら． （２００３） Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ ５： １３０７－１５）。
慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）は、サウジアラビアにおける１／１９．２３０（Ｓｕｌｉａｍａｎら． （２００９） Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ａｓｔｈｍａ， Ａｌｌｅｒｇｙ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２２， ２１－２６）からスウェーデンにおける１／４５０．０００（Ａｈｌｉｎら． （１９９５） Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒ ８４， １３８６－１３９４）の間の発生率を有する先天性の免疫不全症の群を構成する。上記疾患は、罹患患者の身体が細菌および真菌感染から自身を防御できないことから、人生の早い時期に現れる。平均余命は、抗生物質および抗真菌剤での生涯にわたる予防的処置にもかかわらず、強く損なわれる（Ｋｕｈｎｓら． （２０１０） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６３ （２７） ２６００－１０； ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら． （２００９） ＰｌｏＳ ｏｎｅ ４（４）： ｅ５２３４）。上記疾患の主要原因は、貪食細胞（顆粒球、単球、およびマクロファージ）が、貪食細胞のＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）オキシダーゼ酵素複合体内の欠陥に起因して、病原体不活性化のための活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する能力が大きく減少されるかまたはないことである。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ酵素複合体は、６個のサブユニット（ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘおよびＲａｃ２）からなる。全ＣＧＤ患者のうちの約６０％において、上記疾患は、Ｘ染色体上のｇｐ９１ｐｈｏｘサブユニットコード遺伝子（ＣＹＢＢ）内の変異によって引きおこされ、従って、Ｘ－ＣＧＤといわれる。患者のうちの別の約３０％は、常染色体劣性ＮＣＦ１遺伝子（ｐ４７ｐｈｏｘサブユニット）の変更（ＣＧＤのｐ４７ｐｈｏｘ欠損型）を提示する一方で、その症例のうちのわずか５％は、ｐ６７ｐｈｏｘおよびｐ２２ｐｈｏｘにおける常染色体劣性変異に起因する（Ｒｏｏｓら． （２００３） Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ ５： １３０７－１５）。
【0003】
遺伝子治療は、単一遺伝子疾患に罹患している患者の新たな処置選択肢である。現在の技術水準の遺伝子治療の原理は、変異した遺伝子の機能的バージョンを罹患細胞のゲノムに導入することである。現在の臨床アプローチは、アデノ随伴ウイルスベースのベクターによる、またはレトロウイルス（ガンマレトロウイルスまたはレンチウイルス）ベクターによる治療用遺伝子の送達に大きく依拠する。その変異した遺伝子の挿入される機能的バージョン（導入遺伝子）は、新たな遺伝子生成物の発現を生じ、これは、天然の遺伝子生成物の非存在を代償する。２０００年の最初の臨床上の成功以来、臨床上の成功が遺伝子治療のこの遺伝子追加アプローチによって達成された疾患数は、連続的に上昇している。
【0004】
デザイナーヌクレアーゼ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ方法論）の最新の発展は、配列特異的遺伝子改変（欠失または修復）、およびＤＮＡの配列特異的挿入を可能にする。治療目的での配列特異的遺伝子破壊は、臨床適用が既に見出されている（ＴＡＬＥＮ：Ｗ．Ｑｕａｓｉｍら．（２０１５）Ｂｌｏｏｄ １２６ ：２０１６；ＺＮＦ：ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＮＣＴ０２５００８４９およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９：Ｃｙｒａｎｏｓｋｉ Ｄ．ら．Ｎａｔｕｒｅ ５３９，４７９；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０３０５７９１２）。現在では、ジンクフィンガーヌクレアーゼのみが、血友病Ｂ、ＭＰＳ ＩおよびＭＰＳ ＩＩを治癒するために、配列特異的挿入に関して臨床的に評価される（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇａｍｏ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ－ｐｉｐｅｌｉｎｅ）。
【0005】
目下のところ、ＣＧＤの唯一の治癒的治療は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）一致ドナーからの同種異系造血幹細胞（ＨＳＣ）移植である。非血族の欧州系の家系の患者のうちの約７５％までに関しては、ＨＬＡ一致ドナーが同定され得る（Ｇｒａｇｅｒら． （２０１４） Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７１： ３３９－４８）。残りの２５％に関しては、自家ＨＳＣの遺伝子治療ベースの補正は、さらなる潜在的に治癒的な処置選択肢の代表である。
【0006】
ＣＧＤの遺伝子治療は、従って、ＨＬＡ一致ＨＳＣドナーがいない患者にとって合理的選択肢である。Ｘ連鎖性ＣＧＤの女性キャリアから学習されるように、２０％を上回るＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性は、健常表現型と関連し得る（Ｂｊｏｒｇｖｉｎｓｄｏｔｔｉｒら． （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９， ４１－４８； Ｋｕｈｎｓら． （２０１０） Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６３， ２６００－２６１０）。従って、およそ２０％のＮＡＰＤＨオキシダーゼ活性の遺伝子治療補正レベルは、臨床上の成功を達成するために十分と考えられる。
【0007】
Ｘ－ＣＧＤ患者の最初の臨床上成功したフェーズＩ／ＩＩ遺伝子治療治験は、２００４年にＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ＺｕｒｉｃｈおよびＪｏｈａｎｎ Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｇｏｅｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔによって開始された（ＮＣＴ ００９２７１３４； ＮＣＴ ００５６４７５９）。この治験の中では、２名の小児が、チューリッヒで処置され、２名の成人患者がフランクフルトで処置された。その遺伝子治療ベクターは、導入遺伝子としてのｇｐ９１ｐｈｏｘコードｃＤＮＡを有するＬＴＲ駆動性（非自己不活性化（ＳＩＮ））ガンマレトロウイルスベクターからなり、これは、遍在性の導入遺伝子発現を生じた。上記研究は、全４名の患者が既存の処置で難治性の感染症から回復したことから、臨床上成功した（Ｏｔｔら． （２００６） Ｎａｔ Ｍｅｄ １２： ４０１－４０９； Ｓｉｌｅｒら． （２０１５） Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １５： ４１６－４２７； Ｂｉａｎｃｈｉら． （２００９） Ｂｌｏｏｄ １１４： ２６１９－２６２２）。しかし、長期間の追跡から、２０１０年の治験の閉鎖をもたらす２件の重篤有害事象（ＳＡＥ）が明らかになった：
・トランス活性化： ウイルスベクターがＭＤＳ１－ＥＶＩ１遺伝子に隣接して組み込まれたクローンにおいて、ガンマレトロウイルスベクターの長い末端反復に存在するエンハンサー配列が、これらＨＳＣクローンの選択上の利点をもたらすＭＤＳ１－ＥＶＩ１がん原遺伝子のプロモーターと相互作用した（Ｅｖｉ１トランス活性化）。これは、４名の遺伝子治療処置した患者のうちの３名において、クローン優位（ｃｌｏｎａｌ ｄｏｍｉｎａｎｃｅ）、およびモノソミー７を伴うゲノム不安定性、および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の発生を引きおこした。
・サイレンシング： 上記ウイルスベクターのプロモーターは、徐々にメチル化され、これは、治療用導入遺伝子の発現の減少（導入遺伝子サイレンシング）を、およびＣＧＤの再出現をもたらした。
・トランス活性化： ウイルスベクターがＭＤＳ１－ＥＶＩ１遺伝子に隣接して組み込まれたクローンにおいて、ガンマレトロウイルスベクターの長い末端反復に存在するエンハンサー配列が、これらＨＳＣクローンの選択上の利点をもたらすＭＤＳ１－ＥＶＩ１がん原遺伝子のプロモーターと相互作用した（Ｅｖｉ１トランス活性化）。これは、４名の遺伝子治療処置した患者のうちの３名において、クローン優位（ｃｌｏｎａｌ ｄｏｍｉｎａｎｃｅ）、およびモノソミー７を伴うゲノム不安定性、および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の発生を引きおこした。
・サイレンシング： 上記ウイルスベクターのプロモーターは、徐々にメチル化され、これは、治療用導入遺伝子の発現の減少（導入遺伝子サイレンシング）を、およびＣＧＤの再出現をもたらした。
【0008】
これらのＳＥＡは、
（Ｉ）ＭＤＳ１－ＥＶＩ１遺伝子に近接したウイルスベクターの組み込みを防止する、異なる組み込みプロフィール（例えば、異なるウイルスベクターの使用）、
（ＩＩ）トランス活性化の場合に、ＨＳＣクローンの潜在的な選択上の利点を防止するために、組織特異的導入遺伝子発現（すなわち、導入遺伝子発現を必要とする骨髄系由来細胞においてのみであって、ただしＨＳＣにおいてではない）、および
（ＩＩＩ）長期間の有効性を促進するために、時間をわたっての導入遺伝子発現のサイレンシングの防止、
を伴うレンチウイルス自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターに基づいて、より安全な遺伝子治療ベクターの開発を義務付けた。
（Ｉ）ＭＤＳ１－ＥＶＩ１遺伝子に近接したウイルスベクターの組み込みを防止する、異なる組み込みプロフィール（例えば、異なるウイルスベクターの使用）、
（ＩＩ）トランス活性化の場合に、ＨＳＣクローンの潜在的な選択上の利点を防止するために、組織特異的導入遺伝子発現（すなわち、導入遺伝子発現を必要とする骨髄系由来細胞においてのみであって、ただしＨＳＣにおいてではない）、および
（ＩＩＩ）長期間の有効性を促進するために、時間をわたっての導入遺伝子発現のサイレンシングの防止、
を伴うレンチウイルス自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターに基づいて、より安全な遺伝子治療ベクターの開発を義務付けた。
【0009】
用語および定義
【0010】
用語「レンチウイルスベクター」とは、本明細書の文脈において使用される場合、レトロウイルスに由来し、ヒト遺伝子治療に適合させたビリオンまたはウイルスゲノムをいう。それは、コード配列およびヒト患者の細胞において作動可能なプロモーターを含む導入遺伝子を含む。レンチウイルス遺伝子治療は、当業者に周知である；そのトピックに関する近年の科学刊行物としては、Ｍｉｌｏｎｅ ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ， （２０１８） Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３２， １５２９－１５４１； Ｙａｎｉｅｚ－Ｍｕｎｉｏｚら． （２００６） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １２， ３４８－３５３； Ａｉｕｔｉら． （２０１３）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１（６１４８）， ＤＯＩ： １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３３１５１）が挙げられる。
【0011】
用語「機能的改変体」とは、本明細書の文脈において使用される場合、ポリペプチドをコードする遺伝子の改変体であって、ここでこの遺伝子の機能障害的または非機能的改変体が、上記患者に存在するが、上記機能障害的または非機能的改変体は、上記患者内で特定の生物学的機能に役立たないものをいう。健常個体の刺激された貪食細胞において、ｇｐ９１ｐｈｏｘタンパク質（ＣＹＢＢ遺伝子によってコードされる）、ｐ２２ｐｈｏｘタンパク質（ＣＹＢＡ遺伝子によってコードされる）、ｐ４７ｐｈｏｘタンパク質（ＮＣＦ１遺伝子によってコードされる）、ｐ４０ｐｈｏｘタンパク質（ＮＣＦ４遺伝子によってコードされる）、ｐ６７ｐｈｏｘタンパク質（ＮＣＦ２遺伝子によってコードされる）は、一緒になって、ＮＡＤＰＨオキシダーゼといわれる１つの酵素複合体を形成する。このＮＡＤＰＨオキシダーゼは、触媒活性を有し、活性酸素種（ＲＯＳ）の貪食細胞による生成に必須である。Ｒａｃ２タンパク質（ＲＡＣ２遺伝子によってコードされる）は、細胞刺激の際にＮＡＤＰＨオキシダーゼ酵素複合体の形成を誘導するために必要とされる。これらの遺伝子のうちのいずれかにおける変異は、誤って折りたたまれたタンパク質の合成または１つの遺伝子生成物の非存在を生じ得、これは最終的に、患者細胞が活性なＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体を形成できず、従って、それらがＲＯＳを生成できず、ＣＧＤ表現型を引きおこすことを生じる。遺伝子治療ベクターによってコードされる機能的改変体は、機能障害的または非機能的改変体を補完するかまたはこれに置き換わり、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ機能を回復させることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0012】
【文献】Ｓｕｌｉａｍａｎら． （２００９） Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ａｓｔｈｍａ， Ａｌｌｅｒｇｙ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２２， ２１－２６
【文献】Ａｈｌｉｎら． （１９９５） Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒ ８４， １３８６－１３９４
【文献】Ｋｕｈｎｓら． （２０１０） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６３ （２７） ２６００－１０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0013】
発明の要旨
この背景に基づいて、本発明の目的は、慢性肉芽腫症における遺伝的疾患の処置のための効率的手段を提供することである。
この背景に基づいて、本発明の目的は、慢性肉芽腫症における遺伝的疾患の処置のための効率的手段を提供することである。
【0014】
この目的は、独立請求項の主題によって、従属請求項に示されるさらなる有利な特徴とともに達成される。
【0015】
本発明の第１の局面は、単離されたヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）または前駆細胞、特に、ＣＤ－３４陽性造血幹細胞に関し、ここで上記幹細胞または前駆細胞は、レンチウイルスベクターで形質導入されて、骨髄系細胞へと分化し得る。上記レンチウイルスベクターは、
－ ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘおよびＲａｃ２を含む群から選択される機能障害的ポリペプチドの機能的改変体をコードする核酸配列；
を、
－ ヒト細胞において作動可能なプロモーター配列であって、ここで上記プロモーターは、ｍｉＲ２２３プロモーター配列（配列番号０１）を含むかまたはそれから本質的になるプロモーター配列、
の転写制御下で含む。
－ ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘおよびＲａｃ２を含む群から選択される機能障害的ポリペプチドの機能的改変体をコードする核酸配列；
を、
－ ヒト細胞において作動可能なプロモーター配列であって、ここで上記プロモーターは、ｍｉＲ２２３プロモーター配列（配列番号０１）を含むかまたはそれから本質的になるプロモーター配列、
の転写制御下で含む。
【0016】
ｍｉＲ２２３プロモーター配列（配列番号０１）
【化1】
【0017】
ある特定の実施形態において、上記細胞は、慢性肉芽腫症の処置のために提供され、上記ベクターは、ｇｐ９１ｐｈｏｘ（ＵｎｉＰｒｏｔ番号 Ｐ０４８３９）、ｐ２２ｐｈｏｘ（ＵｎｉＰｒｏｔ番号 Ｐ１３４９８）、ｐ４０ｐｈｏｘ（ＵｎｉＰｒｏｔ番号 Ｑ１５０８０）、ｐ４７ｐｈｏｘ（ＵｎｉＰｒｏｔ番号 Ｐ１４５９８）、ｐ６７ｐｈｏｘ（ＵｎｉＰｒｏｔ番号 Ｐ１９８７８）および／またはＲａｃ２（ＵｎｉＰｒｏｔ番号 Ｐ１５１５３）の機能的改変体または複数の機能的改変体をコードする核酸配列を含む。
【0018】
ある特定の実施形態において、上記ベクターは、レンチウイルスプロモーター／エンハンサーエレメントを含まない。
【0019】
用語「エンハンサーエレメント」とは、本明細書の文脈において、特定の配列、特に、プロモーター配列の転写が起こる可能性を増大させるように、アクチベータータンパク質によって結合され得る短い核酸配列をいう。
【0020】
上記ベクターは、アルファレトロウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベースのベクターに基づき得るかまたは由来し得る。本発明の遺伝子治療ベクターのある特定の実施形態において、上記ベクターは、レンチウイルスベクターに基づくかまたは由来する。
【0021】
本発明の遺伝子治療ベクターの１つの実施形態において、上記ベクターは、配列番号０２によって特徴づけられる核酸を含むかまたはそれから本質的になる。
【0022】
配列番号０２：
Ｌｅｎｔｉ＿ｍｉｒ２２３＿ｐ４７ｐｈｏｘ＿ＰＲＥ４＿ＫＡＮ（ＵＺＨ１ｐ４７ＣＧＤ） ８６８８ｂｐ（５’から３’方向においてフォントによって示される配列エレメント：）
小文字のフォント： ＣＭＶプロモーター； 小文字下線： レンチウイルスＬＴＲ： ５’Ｕ５； 小文字斜体： レンチウイルスリーダー配列； 大文字フォント： ｍｉＲ２２３プロモーター； 大文字下線： Ｋｏｚａｋ配列； 大文字斜体： ｐ４７ｐｈｏｘオープンリーディングフレーム； 小文字斜体下線： 制限部位； 小文字： ＷＰＲＥエレメント； 小文字斜体下線： 制限部位； 小文字下線： レンチウイルスＬＴＲ： ３’Ｕ３； 小文字斜体： レンチウイルスＬＴＲ： ３’Ｒ； 小文字斜体太字： レンチウイルスＬＴＲ： ３’Ｕ５； 小文字：
Ｌｅｎｔｉ＿ｍｉｒ２２３＿ｐ４７ｐｈｏｘ＿ＰＲＥ４＿ＫＡＮ（ＵＺＨ１ｐ４７ＣＧＤ） ８６８８ｂｐ（５’から３’方向においてフォントによって示される配列エレメント：）
小文字のフォント： ＣＭＶプロモーター； 小文字下線： レンチウイルスＬＴＲ： ５’Ｕ５； 小文字斜体： レンチウイルスリーダー配列； 大文字フォント： ｍｉＲ２２３プロモーター； 大文字下線： Ｋｏｚａｋ配列； 大文字斜体： ｐ４７ｐｈｏｘオープンリーディングフレーム； 小文字斜体下線： 制限部位； 小文字： ＷＰＲＥエレメント； 小文字斜体下線： 制限部位； 小文字下線： レンチウイルスＬＴＲ： ３’Ｕ３； 小文字斜体： レンチウイルスＬＴＲ： ３’Ｒ； 小文字斜体太字： レンチウイルスＬＴＲ： ３’Ｕ５； 小文字：
【化2-1】
【化2-2】
【化2-3】
【化2-4】
【0023】
上記幹細胞または前駆細胞は、ＣＧＤに罹患している患者から得られ、本発明の遺伝子治療ベクターで形質導入される。
【0024】
ある特定の実施形態において、本発明に従う単離されたヒト骨髄系幹細胞または前駆細胞は、ヒトＣＤ－３４陽性細胞である。長期間再生息する（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ）造血幹細胞は、ヒトＣＤ３４＋ 骨髄細胞集団において富化される一方で、正常成体マウスの長期間の生着能力を有する細胞は、Ｌｉｎ－、ｃ－ｋｉｔ＋、Ｓｃａ－１＋かつＣＤ３４－である（Ｓａｔｏ Ｔ．， Ｌａｖｅｒ Ｊ．Ｈ． ＆ Ｏｇａｗａ Ｍ． （１９９９） Ｂｌｏｏｄ ９４： ２５４８－２５５４）。ヒトおよびマウス幹細胞は、表面マーカー発現においてのみならず、細胞拡大増殖およびウイルス形質導入のための増殖条件（培地、サイトカイン…）においても異なる。
【0025】
本発明のさらなる局面は、単球またはマクロファージ細胞へと分化し得るヒト前駆細胞を製造する方法に関する。上記方法は、
－ ＣＧＤに罹患している患者から得られたＣＤ３４＋ ＨＳＣをエキソビボで提供する工程、および
－ 上記ＣＤ３４＋ ＨＳＣを、
○ ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘおよびＲａｃ２から選択されるポリペプチドの機能的改変体をコードするコード核酸配列であって；上記コード配列は、
○ ヒト細胞、特に骨髄系細胞において作動可能なプロモーター配列であって、ここで上記プロモーター配列は、ｍｉＲ２２３プロモーター配列（配列番号０１）を含むかまたはそれから本質的になるプロモーター配列、
の転写制御下にある、コード配列、
を含むレンチウイルスベクター
で形質導入する工程を包含する。
－ ＣＧＤに罹患している患者から得られたＣＤ３４＋ ＨＳＣをエキソビボで提供する工程、および
－ 上記ＣＤ３４＋ ＨＳＣを、
○ ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘおよびＲａｃ２から選択されるポリペプチドの機能的改変体をコードするコード核酸配列であって；上記コード配列は、
○ ヒト細胞、特に骨髄系細胞において作動可能なプロモーター配列であって、ここで上記プロモーター配列は、ｍｉＲ２２３プロモーター配列（配列番号０１）を含むかまたはそれから本質的になるプロモーター配列、
の転写制御下にある、コード配列、
を含むレンチウイルスベクター
で形質導入する工程を包含する。
【0026】
本発明はまた、慢性肉芽腫症と診断された患者の処置の方法に関する。この方法は、
－ 上記患者から単離されたＣＤ３４＋ ＨＳＣを提供する工程、
－ このＣＤ３４＋ ＨＳＣを、
○ ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘおよびＲａｃ２から選択されるポリペプチドの機能的改変体をコードするコード核酸配列であって；上記コード配列は、
○ ヒト細胞、特に骨髄系細胞において作動可能なプロモーター配列であって、ここで上記プロモーター配列は、ｍｉＲ２２３プロモーター配列（配列番号０１）を含むかまたはそれから本質的になるプロモーター配列、
の転写制御下にある、上記コード配列、
を含むレンチウイルスベクターで形質導入する工程、
－ 上記ＣＤ３４＋ ＨＳＣを上記患者に投与する工程、
を包含する。
－ 上記患者から単離されたＣＤ３４＋ ＨＳＣを提供する工程、
－ このＣＤ３４＋ ＨＳＣを、
○ ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘおよびＲａｃ２から選択されるポリペプチドの機能的改変体をコードするコード核酸配列であって；上記コード配列は、
○ ヒト細胞、特に骨髄系細胞において作動可能なプロモーター配列であって、ここで上記プロモーター配列は、ｍｉＲ２２３プロモーター配列（配列番号０１）を含むかまたはそれから本質的になるプロモーター配列、
の転写制御下にある、上記コード配列、
を含むレンチウイルスベクターで形質導入する工程、
－ 上記ＣＤ３４＋ ＨＳＣを上記患者に投与する工程、
を包含する。
【0027】
機能障害的ポリペプチドをコードする上記患者の天然の核酸配列（これは、ＣＧＤを引きおこす）は、ＣＤ３４＋ 細胞を本発明のベクターで形質導入することによって、機能的ポリペプチドをコードする「健常（ｈｅａｌｔｈｙ）」核酸配列によって補完される。そのように形質導入された（および補完された）ＨＳＣまたは前駆細胞は、次いで、患者の中に戻される。
【0028】
本発明のベクターは、骨髄系細胞（例えば、単球、マクロファージ、または好中球のような）へと分化し得る自家ＣＤ３４＋ ＨＳＣまたは造血前駆細胞を形質導入するために使用され得る。上記ＣＤ３４＋ 細胞は、上記遺伝的疾患に罹患している患者から得られる。形質導入されたＨＳＣは、分裂および骨髄系細胞への分化を受けるために、上記患者に戻される。
【0029】
本発明によって処置される遺伝的疾患は、慢性肉芽腫症であり、上記ベクター、あるいは骨髄系細胞、特に、単球／マクロファージもしくは好中球へと分化し得るＨＳＣまたは造血前駆細胞は、ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘおよびＲａｃ２を含む群から選択される遺伝子の機能的改変体または複数の機能的改変体をコードする核酸配列を含む。上記ＨＣＳまたは造血前駆細胞は、上記ベクターを含むかまたは上記ベクターによって形質導入される。
【0030】
本発明のさらなる局面によれば、骨髄系細胞におけるＣＧＤ表現型を補正するための方法が提供される。上記方法は、本発明のＨＣＳまたは造血前駆細胞を提供する工程、および本発明のＨＣＳまたは造血前駆細胞を、上記疾患に罹患している患者に投与する工程を包含する。
【0031】
ある特定の実施形態において、本発明のＨＣＳまたは造血前駆細胞は、ＨＣＳまたは造血前駆細胞を、ＣＧＤに罹患している患者から得、上記ＨＣＳまたは造血前駆細胞を、本明細書で特定されるベクターで形質導入することによって提供される。
【0032】
骨髄系細胞における遺伝的疾患は、ＣＧＤであり、上記患者から得られたＨＣＳまたは造血前駆細胞は、ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘおよび／またはＲａｃ２の機能的改変体または複数の機能的改変体をコードする核酸配列を含むベクターを含むかまたは上記ベクターで形質導入される。
【0033】
上記形質導入されたＨＣＳまたは造血前駆細胞は、次いで、上記患者に戻される。
【0034】
項目
１． レンチウイルスベクターで形質導入され、単離されたヒト造血幹細胞または骨髄系前駆細胞であって、上記レンチウイルスベクターは、
－ ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘおよびＲａｃ２から選択されるポリペプチドの機能的改変体をコードするコード核酸配列；を、
－ ヒト細胞、特に、骨髄系細胞において作動可能なプロモーター配列であって、ここで前記プロモーター配列は、ｍｉＲ２２３プロモーター配列（配列番号０１）を含むまたはそれから本質的になるプロモーター配列、
の転写制御下で含む、単離されたヒト造血幹細胞または骨髄系前駆細胞。
１． レンチウイルスベクターで形質導入され、単離されたヒト造血幹細胞または骨髄系前駆細胞であって、上記レンチウイルスベクターは、
－ ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘおよびＲａｃ２から選択されるポリペプチドの機能的改変体をコードするコード核酸配列；を、
－ ヒト細胞、特に、骨髄系細胞において作動可能なプロモーター配列であって、ここで前記プロモーター配列は、ｍｉＲ２２３プロモーター配列（配列番号０１）を含むまたはそれから本質的になるプロモーター配列、
の転写制御下で含む、単離されたヒト造血幹細胞または骨髄系前駆細胞。
【0035】
２． 前記レンチウイルスベクターは、配列番号０２によって特徴づけられる核酸配列を含むまたはそれから本質的になる、項目１に記載の単離されたヒト造血幹細胞または骨髄系前駆細胞。
【0036】
３． 前記細胞は、ＣＤ３４陽性造血幹細胞である、項目１または２のいずれか一項に記載のヒト造血幹細胞または骨髄系前駆細胞。
【0037】
４． 治療用細胞調製物を調製するための方法であって、前記方法は、
ａ． ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘおよびＲａｃ２から選択されるポリペプチドをコードする欠陥遺伝子と関連する遺伝子欠陥と関連する慢性肉芽腫症に罹患している患者から単離された、造血幹細胞を含む細胞の調製物、特に、ＣＤ３４陽性造血幹細胞の調製物を提供する工程；
ｂ．上記細胞の調製物を、
ｉ． ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘおよびＲａｃ２から選択されるポリペプチドの機能的改変体をコードするコード核酸配列；を、
ｉｉ． ヒト細胞、特に、骨髄系細胞において作動可能なプロモーター配列であって、ここで前記プロモーター配列は、ｍｉＲ２２３プロモーター配列（配列番号０１）を含むまたはそれから本質的になるプロモーター配列、
の転写制御下で含むレンチウイルスベクターで形質導入する工程、
を包含する、方法。
ａ． ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘおよびＲａｃ２から選択されるポリペプチドをコードする欠陥遺伝子と関連する遺伝子欠陥と関連する慢性肉芽腫症に罹患している患者から単離された、造血幹細胞を含む細胞の調製物、特に、ＣＤ３４陽性造血幹細胞の調製物を提供する工程；
ｂ．上記細胞の調製物を、
ｉ． ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘおよびＲａｃ２から選択されるポリペプチドの機能的改変体をコードするコード核酸配列；を、
ｉｉ． ヒト細胞、特に、骨髄系細胞において作動可能なプロモーター配列であって、ここで前記プロモーター配列は、ｍｉＲ２２３プロモーター配列（配列番号０１）を含むまたはそれから本質的になるプロモーター配列、
の転写制御下で含むレンチウイルスベクターで形質導入する工程、
を包含する、方法。
【0038】
５． 慢性肉芽腫症の処置または防止における使用のための、項目１～３のいずれか１項に記載の単離されたヒト造血幹細胞または骨髄系前駆細胞、または項目４に記載の方法によって得られる細胞調製物。
【0039】
６． 前記細胞は、自家細胞である、項目５に記載の慢性肉芽腫症の処置または防止における使用のための単離されたヒト造血幹細胞または骨髄系前駆細胞。
【0040】
本発明は、さらなる実施形態および利点が引き出され得る以下の例および図によってさらに例証される。これらの例は、本発明を例証することを意味するが、その範囲を限定することを意味するのではない。
【図面の簡単な説明】
【0041】
【0042】
【0043】
【0044】
【0045】
【実施例】
【0046】
実施例
【0047】
本発明は、特に、遺伝子治療ベクターにおけるｍｉＲ２２３プロモーターの使用が、トランス活性化および／またはエピジェネティック不活性化の公知の問題を有利に克服するという驚くべき知見に基づく。これは特に、常染色体劣性ｐ４７ｐｈｏｘ欠損ＣＧＤのためのＬＶ－ＳＩＮ遺伝子治療ベクターによって示された。注記すべきは、ｐ４７ｐｈｏｘ ＣＧＤ処置のためのｍｉＲ２２３プロモーターの制御下でｐ４７ｐｈｏｘをコードするレンチウイルスベクターでのヒトＨＳＣのレンチウイルス形質導入は、以前に一度も示されなかった。
【0048】
導入遺伝子発現を特徴づけるために前臨床的に利用されるベクター
高度に骨髄系特異的な導入遺伝子発現を確認するデータを、ガンマレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターで生成した。利用されるガンマレトロウイルスベクターの例は、図１に示される。ΔＬＮＧＦＲ－２Ａ－ｐ４７ｐｈｏｘ融合構築物は、ともに１個のｍＲＮＡ（ｖ）に由来する２種の別個のタンパク質（細胞質ｐ４７ｐｈｏｘ、および細胞表面上のΔＬＮＧＦＲ）を生じる。利用されるレンチウイルスベクターの例は、図２に示される。
高度に骨髄系特異的な導入遺伝子発現を確認するデータを、ガンマレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターで生成した。利用されるガンマレトロウイルスベクターの例は、図１に示される。ΔＬＮＧＦＲ－２Ａ－ｐ４７ｐｈｏｘ融合構築物は、ともに１個のｍＲＮＡ（ｖ）に由来する２種の別個のタンパク質（細胞質ｐ４７ｐｈｏｘ、および細胞表面上のΔＬＮＧＦＲ）を生じる。利用されるレンチウイルスベクターの例は、図２に示される。
【0049】
骨髄系細胞に発現を制限することによるＨＳＣにおけるトランス活性化の防止
動物試験において示されるｍｉＲ２２３プロモーター活性の骨髄系特異性
系統陰性骨髄細胞を、ｐ４７ｐｈｏｘ －／－ マウスから単離し、ｍｉＲ２２３プロモーター制御下にあるｐ４７ｐｈｏｘまたはΔＬＮＧＦＲ－２Ａ－ｐ４７融合構築物をコードするガンマレトロウイルスベクターで形質導入した（図１）。レシピエント ｐ４７ －／－ マウスを、致死的に照射し、形質導入した骨髄細胞を静脈内に再注入した。再注入の６週間後、ｐ４７ｐｈｏｘ発現およびＲＯＳ生成は、顆粒球において回復した。これは、形質導入した骨髄細胞の成功裡の生着を示す（Ｂｒｅｎｄｅｌら． （２０１３） Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２４： １５１－１５９）。
動物試験において示されるｍｉＲ２２３プロモーター活性の骨髄系特異性
系統陰性骨髄細胞を、ｐ４７ｐｈｏｘ －／－ マウスから単離し、ｍｉＲ２２３プロモーター制御下にあるｐ４７ｐｈｏｘまたはΔＬＮＧＦＲ－２Ａ－ｐ４７融合構築物をコードするガンマレトロウイルスベクターで形質導入した（図１）。レシピエント ｐ４７ －／－ マウスを、致死的に照射し、形質導入した骨髄細胞を静脈内に再注入した。再注入の６週間後、ｐ４７ｐｈｏｘ発現およびＲＯＳ生成は、顆粒球において回復した。これは、形質導入した骨髄細胞の成功裡の生着を示す（Ｂｒｅｎｄｅｌら． （２０１３） Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２４： １５１－１５９）。
【0050】
並行して、系統陰性骨髄細胞を、ｇｐ９１ｐｈｏｘ－／－ マウスから単離し、ｍｉＲ２２３プロモーター制御下でｇｐ９１ｐｈｏｘをコードするＬＶ－ＳＩＮベクターで形質導入した。レシピエント ｇｐ９１ｐｈｏｘ －／－ マウスを、致死的に照射し、形質導入した骨髄細胞を静脈内に再注入した。形質導入した細胞は生着し、これらマウスの末梢顆粒球において導入遺伝子発現およびＲＯＳ生成の回復をもたらした（Ｂｒｅｎｄｅｌら． （２０１３） 同書）。
【0051】
導入遺伝子発現の分析から、導入遺伝子発現をほぼ排他的に骨髄系細胞へと制限する両方の動物実験において、ｍｉＲ２２３プロモーターによって付与される驚くほどの系統特異性が明らかになった（Ｂｒｅｎｄｅｌら． （２０１３） 同書）。
【0052】
初代由来患者材料におけるｍｉＲ２２３で駆動された導入遺伝子発現による貪食細胞機能の回復
上述の動物実験において、ｍｉＲ２２３で駆動されたｇｐ９１ｐｈｏｘ発現（レンチウイルスベクター）およびｍｉＲ２２３で駆動されたｐ４７ｐｈｏｘ発現（ガンマレトロウイルスベクター）はともに、対応する動物モデルにおける遺伝子治療処置の際に貪食細胞においてＲＯＳ生成を回復させた。
上述の動物実験において、ｍｉＲ２２３で駆動されたｇｐ９１ｐｈｏｘ発現（レンチウイルスベクター）およびｍｉＲ２２３で駆動されたｐ４７ｐｈｏｘ発現（ガンマレトロウイルスベクター）はともに、対応する動物モデルにおける遺伝子治療処置の際に貪食細胞においてＲＯＳ生成を回復させた。
【0053】
ＲＯＳ生成の再構成およびＥ．ｃｏｌｉ殺滅の再構成を、ガンマレトロウイルスベクターでのＨＳＣの処置および細胞培養における細胞の分化の後に、ヒト顆粒球において試験した。生きている顆粒球において細胞質ｐ４７ｐｈｏｘ導入遺伝子発現を検出するために、本発明者らは、口蹄疫ウイルスに由来する２Ａ配列を介してｐ４７ｐｈｏｘに連結されたΔＬＮＧＦＲ表面マーカーからなる融合構築物をコードするガンマレトロウイルスベクターを生成した。この融合構築物は、１つの翻訳プロセスにおいて、１個のｍＲＮＡ転写物から２種のタンパク質： 細胞質ｐ４７ｐｈｏｘタンパク質およびΔＬＮＧＦＲ表面マーカーの合成をもたらす。この共発現は、ΔＬＮＧＦＲ表面染色によるｐ４７ｐｈｏｘの間接的検出を可能にする（Ｗｏｈｌｇｅｎｓｉｎｇｅｒら． （２０１０） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １７： １１９３－１１９９）。利用されるガンマレトロウイルスベクターにおいて、本発明者らは、この融合構築物を、構成的に活性なＳＦＦＶプロモーターまたはｍｉＲ２２３プロモーターいずれかの制御下で発現させた。
【0054】
本発明者らは、これらのガンマレトロウイルスベクターでｐ４７ｐｈｏｘ欠損ＣＧＤ患者のヒトＨＳＣを形質導入し、続いて、細胞培養において上記細胞を顆粒球へと分化させた。分化を、顆粒球ＣＤ１１ｂ表面マーカー発現のＦＡＣＳ測定によって確認した。ΔＬＮＧＦＲ表面マーカーの検出は、ｐ４７ｐｈｏｘ発現を間接的に示した。
【0055】
ＲＯＳ生成を、ＰＭＡでのまたはＥ．ｃｏｌｉでの細胞の刺激の際に、ジヒドロローダミン１２３酸化（ＤＨＲ）アッセイによって検出した。エキソビボで分化した顆粒球におけるＲＯＳ生成が、ΔＬＮＧＦＲ－陽性細胞においてのみ観察された（図３）。
【0056】
分化した（ＣＤ１１ｂ＋）かつΔＬＮＧＦＲ陽性顆粒球、ならびに分化しかつΔＬＮＧＦＲ陰性（形質導入していない）細胞を、ＦＡＣＳ選別によって単離し、Ｅ．ｃｏｌｉ殺滅アッセイに、記載されるように適用した（Ｏｔｔら． （２００６） Ｎａｔ Ｍｅｄ １２： ４０１－４０９）。このアッセイにおいて、成功裡のＥ．ｃｏｌｉ殺滅は、ＯＤ４２０ｎｍの上昇を生じる。重要なことには、ガンマレトロウイルス ＳＩＮ ｐ４７ｐｈｏｘ ｍｉＲ２２３ベクターを使用すると、ｐ４７ｐｈｏｘ導入遺伝子発現、ＲＯＳ生成およびＥ．ｃｏｌｉ殺滅は、導入遺伝子発現が、強い構成的に活性なＳＦＦＶプロモーターによって駆動されるガンマレトロウイルスＳＩＮ ｐ４７ｐｈｏｘベクターと類似の量へと回復した（図３）。
【0057】
図３は、ｍｉＲ２２３で駆動されたｐ４７ｐｈｏｘ発現が、ヒト顆粒球においてＲＯＳ生成およびＥ．ｃｏｌｉ殺滅を回復させることを示す。ｐ４７ｐｈｏｘ ＣＧＤ患者の系統陰性ＨＳＣを、ＳＦＦＶまたはｍｉＲ２２３プロモーター制御下で、ΔＬＮＧＦＲ／ｐ４７ｐｈｏｘ共発現構築物とともにガンマレトロウイルスで形質導入し、ＣＤ１１ｂ＋ 顆粒球へと分化させた。ΔＬＮＧＦＲ／ｐ４７ｐｈｏｘ発現顆粒球を、ＦＡＣＳ選別し、Ｅ．ｃｏｌｉ殺滅アッセイに適用した。ＯＤ４２０ｎｍの上昇は、Ｅ．ｃｏｌｉ殺滅の回復を示す。
【0058】
貪食細胞機能の回復はまた、初代由来ｐ４７ｐｈｏｘ ＣＧＤ患者材料においても示される。ｌｅｎｔｉ＿ｍｉＲ２２３＿ｐ４７＿ＷＰＲＥｍｕｔ６ベクター（図２および４）を使用して、ｐ４７ｐｈｏｘ欠損ＣＧＤ患者に由来する単球を形質導入した。形質導入した単球を、７日間にわたってマクロファージへと分化させたところ、ＣＤ１４＋／ＣＤ２０６＋ マクロファージを生じた。ｐ４７ｐｈｏｘ導入遺伝子発現を、細胞内ＦＡＣＳ染色によって確認し、ＰＭＡ刺激の際のＲＯＳ生成を、ニトロブルーテトラゾリウム（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｅｒａｚｏｌｉｕｍ）（ＮＢＴ）還元アッセイにおいて確認した（図４）。
【0059】
図４は、ｐ４７ｐｈｏｘ欠損ＣＧＤ患者のヒトマクロファージにおけるＲＯＳ生成の回復を図示する。ｐ４７ｐｈｏｘ ＣＧＤ患者の単球を、血液から単離し、上記ＬＶ－ＳＩＮ ｌｅｎｔｉ＿ｍｉＲ２２３＿ｐ４７＿ＷＰＲＥｍｕｔ６ベクターで形質導入し、マクロファージへと分化させた。ＣＤ１４＋／ＣＤ２０６＋ マクロファージへの分化およびｐ４７ｐｈｏｘ発現の回復を、ＦＡＣＳによって確認した（左）。ＰＭＡ刺激の際のＲＯＳ生成の回復を、ＮＢＴアッセイによって確認した。黄色の矢印： ＮＢＴ陽性、すなわち、ＲＯＳを生成するマクロファージ、白の矢印： ＮＢＴ陰性マクロファージ。
【0060】
導入遺伝子発現のエピジェネティック不活性化の防止
インビボでのおよび細胞培養におけるエピジェネティック不活性化の動態
最初の一時的に成功した臨床的Ｘ－ＣＧＤ遺伝子治療試験において、導入遺伝子発現を、ウイルスＬＴＲ内のガンマレトロウイルスプロモーター／エンハンサーによって駆動した。導入遺伝子発現のエピジェネティック不活性化は、遺伝子治療の約１年後に始まり、その後１．５年以内に遺伝子マーキングと遺伝子機能との間で増大しつつある矛盾を表した（Ｓｉｌｅｒら． （２０１５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５： ４１６－４２７）。利用したガンマレトロウイルスベクターのＬＴＲ内のプロモーター／エンハンサーの配列は、遍在的に活性なプロモーターとして種々のベクターにおいて利用されるＳＦＦＶプロモーター／エンハンサーに相当する。このＳＦＦＶプロモーターを、遺伝子治療処置の３ヶ月後および６ヶ月後に、ＣＧＤ動物においてエピジェネティック改変に対するその感受性に関して試験した。マウスにおけるＤＮＡメチル化によるエピジェネティックＳＦＦＶプロモーター不活性化は、３ヶ月後に既に検出可能であり、その後、経時的に増大した（Ｚｈａｎｇら． （２０１０） Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８： １６４０－４９）。
インビボでのおよび細胞培養におけるエピジェネティック不活性化の動態
最初の一時的に成功した臨床的Ｘ－ＣＧＤ遺伝子治療試験において、導入遺伝子発現を、ウイルスＬＴＲ内のガンマレトロウイルスプロモーター／エンハンサーによって駆動した。導入遺伝子発現のエピジェネティック不活性化は、遺伝子治療の約１年後に始まり、その後１．５年以内に遺伝子マーキングと遺伝子機能との間で増大しつつある矛盾を表した（Ｓｉｌｅｒら． （２０１５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５： ４１６－４２７）。利用したガンマレトロウイルスベクターのＬＴＲ内のプロモーター／エンハンサーの配列は、遍在的に活性なプロモーターとして種々のベクターにおいて利用されるＳＦＦＶプロモーター／エンハンサーに相当する。このＳＦＦＶプロモーターを、遺伝子治療処置の３ヶ月後および６ヶ月後に、ＣＧＤ動物においてエピジェネティック改変に対するその感受性に関して試験した。マウスにおけるＤＮＡメチル化によるエピジェネティックＳＦＦＶプロモーター不活性化は、３ヶ月後に既に検出可能であり、その後、経時的に増大した（Ｚｈａｎｇら． （２０１０） Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８： １６４０－４９）。
【0061】
胚性癌細胞株（Ｈｅら． （２００５） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９： １３４９７－５０８）、胚性幹細胞（Ｌｉｅｗら． （２００７） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５： １５２１－２８）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（Ｈｏｔｔａ ＆ Ｅｌｌｉｓ （２００８） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １０５： ９４０－８）のような非常に原始的な分化状態にある細胞は、それらの高度なＤＮＡメチル化活性に関して公知である。Ｐ１９胚性癌細胞によるレンチウイルスベクター内のＳＦＦＶプロモーターのエピジェネティック不活性化は、上記細胞の形質導入の６～１２日後に既に検出可能である（Ｚｈａｎｇら． （２０１０） 同書）。
【0062】
ｍｉＲ２２３プロモーターの新規な抗サイレンシング活性
本発明者らは、Ｐ１９細胞およびｐ４７ｐｈｏｘ ｉＰＳＣ細胞株においてＤＮＡメチル化へのｍｉＲ２２３プロモーターの感受性を試験した。
本発明者らは、Ｐ１９細胞およびｐ４７ｐｈｏｘ ｉＰＳＣ細胞株においてＤＮＡメチル化へのｍｉＲ２２３プロモーターの感受性を試験した。
【0063】
レンチウイルスベクター（図２）内では、ｍｉＲ２２３プロモーター内で平均５７．１％のＣｐＧおよびＳＦＦＶプロモーター内で７０％超のＣｐＧが、２０日後には、Ｐ１９細胞においてメチル化された（未公開データ）。Ｐ１９細胞は骨髄系系統へと（貪食細胞へと）分化できず、上記ｍｉＲ２２３プロモーターは骨髄系特異的プロモーターであるので、本発明者らは、ｐ４７ｐｈｏｘ ＣＧＤ患者由来ｉＰＳＣにおいてｍｉＲ２２３プロモーターの制御下でｐ４７ｐｈｏｘをコードするそれらのレンチウイルスベクターを試験した（ｉＰＳＣ ＣＧＤ１．１； Ｊｉａｎｇら． （２０１２） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３０： ５９９－６１１）。なぜならこれらの細胞は、高いＤＮＡメチル化活性を有し、貪食細胞へと増殖され得るからである。
【0064】
ｉＰＳＣ ＣＧＤ１．１細胞を、ｍｉＲ２２３プロモーターの制御下でｐ４７ｐｈｏｘをコードするレンチウイルスベクター（以下の表１を参照のこと）で、感染多重度２（ＭＯＩ ２、すなわち、細胞の２倍程度の多さのウイルス粒子）において形質導入した。
【0065】
形質導入後の＋１３日目に開始して、ｉＰＳＣを、先ず、「胚様体」へと増殖させ、さらに、単球を放出する「単球工場」へと増殖させた。次いで、最初の単球を、形質導入後の＋４３日目で開始して採取できた。採取した単球を、Ｍ－ＣＳＦを補充した培地中での７日間のインキュベーションによってマクロファージへとさらに分化させた。
【0066】
ゲノムあたりの平均の遺伝子治療ベクターコピー数（ＶＣＮ）を、ｉＰＳＣにおいて＋１６日目に、および採取した単球においては＋８５日目にｑＰＣＲによって決定した。ｐ４７ｐｈｏｘ発現を、ｉＰＳＣにおいて＋６日目、＋１０日目、＋１６日目、＋２０日目に、胚様体内のＣＤ１３３＋ 幹細胞においては＋２３日目に、胚様体中のＣＤ３８ｄｉｍ／ＣＤ３４＋ 細胞においては＋１０４日目に、ＣＤ１４＋ 細胞においては＋５２日目に、ＣＤ１５＋ 細胞においては＋４８日目に、ＣＤ２０６＋ 細胞においては＋６８日目に、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析によって定量した。ベクターコピー数あたりのｐ４７ｐｈｏｘ陽性細胞のパーセンテージ、およびｐ４７ｐｈｏｘ陽性細胞のＦＡＣＳ由来平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、個々の細胞集団におけるｍｉＲ２２３プロモーター活性を比較するために決定した。
【0067】
種々の分化ステージにおけるｐ４７ｐｈｏｘ発現分析から、幹細胞レベル（ｉＰＳＣ、ＣＤ１３３＋ 細胞、ＣＤ３４＋ 細胞）（ｎ＝６）に関する平均において、ｍｉＲ２２３で駆動されたｐ４７ｐｈｏｘ発現が、０．６７±０．３３（標準偏差）というベクターコピー数あたりのｐ４７陽性細胞のパーセンテージで、ほとんど検出可能でないことを明らかにした。骨髄系分化の際に、ｐ４７ｐｈｏｘ発現は、５．２６±０．６６というベクターコピー数あたりのｐ４７陽性細胞のパーセンテージで、強く増大した。ｐ４７ｐｈｏｘ発現細胞のパーセンテージにおけるこの上昇は、ＦＡＣＳシグナル強度（ＭＦＩ）における強い増大と並行して推移した。これは、幹細胞レベルから骨髄系細胞への分化の際に、ｍｉＲ２２３プロモーターの活性化を強く示す。
【0068】
形質導入したｐ４７ｐｈｏｘ ＣＧＤ ｉＰＳＣから生成した顆粒球、単球およびマクロファージにおけるｐ４７ｐｈｏｘ生成の遺伝子治療媒介性回復は、ジヒドロローダミン１２３酸化（ＤＨＲ）アッセイにおいて、およびニトロブルーテトラゾリウム還元（ＮＢＴ）アッセイにおいて明らかにされるように、ＲＯＳ生成の回復を生じた。
【0069】
ｉＰＳＣと骨髄系細胞（顆粒球、単球、マクロファージ）との間の種々の分化レベルに対するｍｉＲ２２３プロモーター活性の分析と並行して、上記遺伝子治療ベクター内のｍｉＲ２２３プロモーターの、および形質導入される細胞のゲノム内の内因性ｍｉＲ２２３プロモーター遺伝子のＤＮＡメチル化分析を、形質導入後の＋２０日目にｉＰＳＣにおいて、およびｉＰＳＣ形質導入後の＋８５日目の分化時の形質導入されたｉＰＳＣから得た単球において行った。サイレンシング感受性ＳＦＦＶプロモーターの制御下でｐ４７ｐｈｏｘを含むベクターで形質導入した際のｉＰＳＣおよびｉＰＳＣ由来の単球の分析は、コントロールとして供した。
【0070】
この分析（表１）から、幹細胞レベルでＰ１９細胞と並行して、ｍｉＲ２２３プロモーターをコードする遺伝子治療ベクター内で、および形質導入された細胞のゲノムにおける天然の内因性ｍｉＲ２２３遺伝子プロモーター内でｍｉＲ２２３プロモーターのＣｐＧジヌクレオチドの大部分（＞８０％）がメチル化されていることが明らかにされた。機能的レベルに関しては、ｐ４７ｐｈｏｘ発現分析によって示されるように、メチル化ｍｉＲ２２３プロモーターは不活性であった。
表１： ｉＰＳＣ（人工前駆幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ））レベル（＋２０日目）およびｉＰＳＣ形質導入後＋８５日目のｉＰＳＣ由来単球における遺伝子治療ベクターがコードしたｍｉＲ２２３プロモーターのおよび天然のｍｉＲ２２３遺伝子プロモーターのＤＮＡメチル化分析。サイレンシング感受性ＳＦＦＶプロモーターをコードするベクターを、コントロールとして供した。ｍｉＲ２２３プロモーターＤＮＡ脱メチル化における変化は、統計的に有意であった。
【表1】
【0071】
驚くべきことに、本発明者らは、分析した遺伝子治療ベクター内で最初にメチル化されたｍｉＲ２２３プロモーター、および天然のゲノムｍｉＲ２２３遺伝子プロモーターがともに、骨髄系分化の際に脱メチル化されることを見出した（表１）。
【0072】
プロモーター活性における上昇に並行して、ｍｉＲ２２３プロモーター内のＣｐＧジヌクレオチドメチル化のパーセンテージは、８７％から３１％へと低下した。
【0073】
本発明者らの以前のガンマレトロウイルスＸ－ＣＧＤ（ＣＧＤのｇｐ９１ｐｈｏｘ欠損型）臨床遺伝子治療治験では、導入遺伝子発現は、構成的に活性な（ＳＦＦＶ）プロモーターによって駆動した。遺伝子治療ベクターがコードしたプロモーターメチル化の段階的な増大は、治療有効性における臨床的に段階的な減少を経時的に引きおこした（Ｏｔｔら． （２００６） Ｎａｔ Ｍｅｄ １２： ４０１－４０９； Ｓｉｌｅｒら． （２０１５） Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １５： ４１６－４２７）。この治験では、構成的に活性なプロモーターが、ＨＳＣにおいてメチル化され、遺伝子治療ベクター内でプロモーターがメチル化された状態で、従って、治療用導入遺伝子発現が減少した状態で骨髄からのＨＳＣの放出を生じた。
【0074】
骨髄系特異的ｍｉＲ２２３プロモーターを遺伝子治療ベクター内で内部プロモーターとして利用すると、驚くべきことに観察されたメチル化パターンは、上記プロモーターが幹細胞レベルで不活性でありかつメチル化されていることを示す。分化の際にのみ、ｍｉＲ２２３プロモーターは活性化され、脱メチル化される。このことは、このプロモーターが、長期間の有効性を提供し得ることを強く示す。骨髄から放出されたＨＳＣに由来する骨髄系細胞の連続フラックスが存在することから、これらの新たに生成した細胞では、ｍｉＲ２２３プロモーターは、骨髄から放出される前に活発に脱メチル化される。
【0075】
プロモーターＤＮＡメチル化の動態
細胞培養実験において、本発明者らは、ガンマレトロウイルス形質導入によってヒトＣＤ３４＋ 骨髄細胞においてＳＦＦＶプロモーターを導入し、上記細胞を４週間培養し、その後にＤＮＡメチル化を定量した。本発明者らは、細胞培養において４週間後のヒトＣＤ３４＋ 細胞におけるＤＮＡメチル化の有意な量を検出できなかった（図５）。
細胞培養実験において、本発明者らは、ガンマレトロウイルス形質導入によってヒトＣＤ３４＋ 骨髄細胞においてＳＦＦＶプロモーターを導入し、上記細胞を４週間培養し、その後にＤＮＡメチル化を定量した。本発明者らは、細胞培養において４週間後のヒトＣＤ３４＋ 細胞におけるＤＮＡメチル化の有意な量を検出できなかった（図５）。
【0076】
マウス骨髄におけるインビボでのＳＦＦＶプロモーターのサイレンシングは、遺伝子治療の３ヶ月後に検出可能になり、以降３ヶ月間でさらに進行することが報告された（Ｚｈａｎｇら． （２０１０） 同書）。
【0077】
レトロウイルスベクターは、早期着床前胚、胚性幹（ＥＳ）細胞および胚性癌（ＥＣ）細胞を含む多能性幹細胞において直ぐにサイレンシングされると報告される（Ｐａｎｎｅｌｌ Ｄ， Ｅｌｌｉｓ Ｊ． （２００１） Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ １１： ２０５－２１７）。胚性癌細胞株Ｐ１９は、サイレンシングに対する遺伝子治療ベクター内のプロモーターの感受性を試験するために集中的に使用されている（Ｋｎｉｇｈｔら． （２０１２） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８６： ９０８８－９５； Ｂｒｅｎｄｅｌら． （２０１２） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９： １０１８－２９； Ｚｈａｎｇ， Ｓａｎｔｉｌｌｉ ＆ Ｔｈｒａｓｈｅｒ （２０１７） Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ７： １０２１３； Ｚｈａｎｇら． （２０１０） 同書）。ＳＦＦＶプロモーターのサイレンシングは、このモデルでは、１２～１７日後に既に終了されると一貫して報告されている。
【0078】
Ｐ１９細胞は、分化され得ないことから、このモデルは、組織特異的プロモーターを試験するために適合していない。一方で、レトロウイルス発現が、細胞培養において任意の細胞タイプへと分化される能力を有する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）においてサイレンシングされることは公知である（Ｍａｈｅｒａｌｉら． （２００７） Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １： ５５－７０； Ｏｋｉｔａ， Ｉｃｈｉｓａｋａ ＆ Ｙａｍａｎａｋａ （２００７） Ｎａｔｕｒｅ ４４８： ３１３－３１７； Ｗｅｒｎｉｇら． （２００７） Ｎａｔｕｒｅ ４４８： ３１８－３２４）。ｉＰＳＣを、ＣＧＤ患者材料から生成した。これらのｉＰＳＣは、患者材料において見出されるものと同じ遺伝的欠陥を有することが示された。上記細胞を、成熟単球およびマクロファージへと分化し得、非ＣＧＤ ｉＰＳＣに由来する単球およびマクロファージとは対照的に、上記ＣＧＤ ｉＰＳＣに由来する単球およびマクロファージは、ＣＧＤ患者に由来する単球およびマクロファージに関してあてはまるとおり、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を示さない（Ｊｉａｎｇら． （２０１２） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３０：５９９－６１１）。
【0079】
ＳＦＦＶプロモーターをＣＧＤ ｉＰＳＣへとレトロウイルスで導入する際に、ＳＦＦＶプロモーターは、ヒト骨髄ではインビボで、Ｘ－ＣＧＤ臨床試験において１０カ月後に始まってサイレンシングされ、マウス骨髄では３～６ヶ月後にサイレンシングされ、Ｐ１９細胞では１２～１７日後にサイレンシングされ、ＣＧＤ ｉＰＳＣでは２０日以内にサイレンシングされた（Ｈａｅｎｓｅｌｅｒら． （２０１８） Ｍａｔｔｅｒｓ； ｄｏｉ．： １０．１９１８５／ｍａｔｔｅｒｓ．２０１８０５０００００５）。ＳＦＦＶプロモーターを有するＣＧＤ ｉＰＳＣの分化の際に、ＳＦＦＶプロモーターで駆動された導入遺伝子発現は、最終分化した単球およびマクロファージにおいて強く減少した。このことは、１）ｉＰＳＣが、強力なプロモーターサイレンシング活性を有する、２）ＳＦＦＶプロモーターは、一旦サイレンシングされると、ｉＰＳＣから単球への細胞分化の際にもサイレンシングされたままである（Ｈａｅｎｓｅｌｅｒら． （２０１８） Ｍａｔｔｅｒｓ； ｄｏｉ．： １０．１９１８５／ｍａｔｔｅｒｓ．２０１８０５０００００５）ことを示す。ｉＰＳＣは、システムの開発のために使用されており、これは、ＳＦＦＶプロモーターのような遍在的に活性なプロモーターのサイレンシングを防止する。これらの抗サイレンシングシステムは、インスレーターの使用に（Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら． （２０１８） Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １３： １６－２８）または遍在性クロマチン開口エレメント（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｏｐｅｎｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＵＣＯＥ）の使用に（Ｐｆａｆｆら． （２０１３） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３１： ４８８－９９； Ａｃｋｅｒｍａｎｎら． （２０１４） Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３５： １５３１－４２； Ｈｏｆｆｍａｎｎら． （２０１７） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２４： ２９８－３０７）、主に基づいた。
【0080】
まとめると、ｉＰＳＣは、遺伝子治療ベクターメチル化の分析のための関連モデルであるが、このモデルは、サイレンシングに対する組織特異的プロモーターの感受性を分析するために一度も適用されてこなかった。
【0081】
組織特異的ｍｉＲ２２３プロモーターの、サイレンシングに対するその感受性に関する分析
ｍｉＲ２２３プロモーターのサイレンシングに対する感受性の分析のために、本発明者らは、ｐ４７ｐｈｏｘ欠損ＣＧＤに罹患している患者から発生され、ＣＧＤ表現型を示す単球およびマクロファージへと分化し得るｉＰＳＣ（ｐ４７ｐｈｏｘ ＣＧＤ ｉＰＳＣ）を利用した（Ｊｉａｎｇら． （２０１２） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３０：５９９－６１１）。
ｍｉＲ２２３プロモーターのサイレンシングに対する感受性の分析のために、本発明者らは、ｐ４７ｐｈｏｘ欠損ＣＧＤに罹患している患者から発生され、ＣＧＤ表現型を示す単球およびマクロファージへと分化し得るｉＰＳＣ（ｐ４７ｐｈｏｘ ＣＧＤ ｉＰＳＣ）を利用した（Ｊｉａｎｇら． （２０１２） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３０：５９９－６１１）。
【0082】
ｐ４７ｐｈｏｘ ＣＧＤ ｉＰＳＣを、本発明者らの遺伝子治療ベクター（ＵＺＨ１ｐ４７ＣＧＤ）で、またはＳＦＦＶプロモーターの構成的に活性なかつサイレンシング耐性のバージョンの制御下でｐ４７ｐｈｏｘをコードするレンチウイルスベクター（Ｌｅｎｔｉ ＵＣＯＥ １６６２ｆｗｄ ＳＦＦＶ ｐ４７）で、レンチウイルスで形質導入した（＋１日目）。形質導入したｉＰＳＣは、先ず、胚様体（ＥＢ）へと分化し、次いで、単球およびマクロファージへとさらに分化した。１細胞あたりの平均的なベクターコピー数（ＶＣＮ）を、ｑＰＣＲによって、形質導入後に、＋１６日目にｉＰＳＣにおいて、および＋８５日目に単球において決定した。導入遺伝子発現を、形質導入後に、＋２３日目に胚様体中のＣＤ１３３陽性幹細胞において、＋１０４日目に胚様体内のＣＤ３８ｄｉｍ／ＣＤ３４＋ 細胞（これは、ＨＳＣに匹敵する細胞である）において、＋５２日目に単球において、および＋６８日目にマクロファージにおいてモニターした。ｐ４７ｐｈｏｘ発現を、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１４およびＣＤ２０６表面染色との組み合わせにおいて、ｐ４７ｐｈｏｘタンパク質の細胞内染色の際のＦＡＣＳ分析によって検出した。形質導入効率における差異を補正するために、ｐ４７ｐｈｏｘ陽性細胞のパーセンテージを、ＶＣＮで除算した。
【0083】
ｐ４７ｐｈｏｘ導入遺伝子発現
ｉＰＳＣにおいて、およびｉＰＳＣに由来するＨＳＣのホモログ（すなわち、胚様体内のＣＤ３８ｄｉｍ／ＣＤ３４ｈｉｇｈ細胞（以降、この文脈において「ＨＳＣ」と称される）において、本発明者らの遺伝子治療ベクターＵＺＨ１ｐ４７ＣＧＤ内のｍｉＲ２２３プロモーターは、シグナル強度によって測定されるように顕著により弱いｐ４７ｐｈｏｘ導入遺伝子発現を、およびベクターコピー数あたりのｐ４７ｐｈｏｘ－陽性細胞の低いパーセンテージを生じた。対照的に、分化した単球およびマクロファージでは、シグナル強度およびベクターコピー数あたりのｐ４７ｐｈｏｘ陽性細胞のパーセンテージは、形質導入した細胞において高かった（以下の表２を参照のこと）。
表２： ベクターコピー数（ＣＶＮ）あたりのｐ４７ｐｈｏｘ陽性細胞のパーセンテージおよびフローサイトメトリー由来平均蛍光シグナル強度（ＭＦＩ）によって特徴づけられる、ｉＰＳＣおよびｉＰＳＣ由来細胞集団におけるｐ４７ｐｈｏｘ導入遺伝子発現を示す。ヒトｐ４７ｐｈｏｘ陰性ｉＰＳＣを、レンチウイルスで形質導入し、胚様体を介して単球およびマクロファージへと増殖させた。平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を、ｉＰＳＣにおいて、およびｉＰＳＣ由来単球において決定した。導入遺伝子発現を、ＣＤ１３３＋ 幹細胞において、胚様体内のＨＳＣ様ＣＤ３４＋ 細胞において、単球において、およびマクロファージにおいてモニターした。ｐ４７ｐｈｏｘ発現を、細胞内染色した際にＦＡＣＳ分析によって検出した。ｐ４７ｐｈｏｘ陽性細胞のパーセンテージを、ＶＣＮあたりのｐ４７陽性細胞のパーセンテージの計算によって、形質導入効率に関して正規化した。ｍｉＲ２２３で駆動されたｐ４７ｐｈｏｘ発現は、ＣＤ１３３＋ 細胞においておよびＣＤ３４＋ 細胞においてわずかな発現を、ならびにｐ４７ｐｈｏｘ陽性細胞のパーセントによって明らかにされるように分化の際に発現において、ＭＦＩにおいても同様に上昇を示した。
ｉＰＳＣにおいて、およびｉＰＳＣに由来するＨＳＣのホモログ（すなわち、胚様体内のＣＤ３８ｄｉｍ／ＣＤ３４ｈｉｇｈ細胞（以降、この文脈において「ＨＳＣ」と称される）において、本発明者らの遺伝子治療ベクターＵＺＨ１ｐ４７ＣＧＤ内のｍｉＲ２２３プロモーターは、シグナル強度によって測定されるように顕著により弱いｐ４７ｐｈｏｘ導入遺伝子発現を、およびベクターコピー数あたりのｐ４７ｐｈｏｘ－陽性細胞の低いパーセンテージを生じた。対照的に、分化した単球およびマクロファージでは、シグナル強度およびベクターコピー数あたりのｐ４７ｐｈｏｘ陽性細胞のパーセンテージは、形質導入した細胞において高かった（以下の表２を参照のこと）。
【表2】
【0084】
重要なことには、ｍｉＲ２２３プロモーターで駆動されたｐ４７ｐｈｏｘ発現は、幹細胞において、低いバックグラウンドシグナル（パーセント陽性細胞／ＶＣＮ）ならびに発現強度（ＭＦＩ）をもたらした。幹細胞における低いバックグラウンドシグナルは、ＵＺＨ１ｐ４７ＣＧＤ遺伝子治療ベクターの優れた安全性プロフィールを示す。
【0085】
健常ドナーのヒトＨＳＣを、ＳＦＦＶまたはｍｉＲ２２３プロモーターの制御下でＧＦＰをコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、続いて、液体細胞培養においてＣＤ１１ｂ陽性骨髄系細胞へと分化させた。ＧＦＰの発現を、ＦＡＣＳ分析によってヒトＨＳＣ由来ＣＤ１１ｂ陽性細胞において分析した。ＧＦＰ陽性ヒトＨＳＣ由来骨髄系細胞の検出（図６、非公開データ）は、０．０５というベクターコピー数（ＣＶＮ）と一致し、ＣＧＤ遺伝子治療処置に関して必要とされるとおりのヒトＨＳＣ由来骨髄系細胞においてｍｉＲ２２３プロモーターの導入遺伝子発現活性を示す。
【0086】
ＲＯＳ生成の再構成：
ＲＯＳ生成を、ＰＭＡ（単球）またはＰＭＡ＋ｆＭＬＰ（マクロファージ）での刺激の際に、ＤＨＲ酸化によって、およびＮＢＴ還元アッセイによって、単球およびマクロファージにおいてモニターした。ＤＨＲアッセイにおいて、非蛍光性ジヒドロローダミンは、ＲＯＳによる酸化の際に蛍光性に変化する。蛍光シグナル強度を、ＦＡＣＳ分析によって検出した。対応して、ＦＡＣＳ分析において、右側へのシフトは、ＲＯＳ生成の回復を示す。ＮＢＴアッセイでは、濃青色のホルマザン沈殿物の形成は、ＲＯＳ生成を示す。形質導入されていないＣＧＤ ｉＰＳＣに由来する単球／マクロファージを、陰性コントロールとして供した。ＣＧＤ ｉＰＳＣから得た単球／マクロファージを陽性コントロールとして供した。これは、ＳＦＦＶプロモーターの遍在的に活性なかつサイレンシング耐性のバージョンの制御下でｐ４７ｐｈｏｘをコードするベクター（Ｌｅｎｔｉ ＵＣＯＥ１６６２ｆｗｄ ＳＦＦＶ ｐ４７）で、形質導入した。
ＲＯＳ生成を、ＰＭＡ（単球）またはＰＭＡ＋ｆＭＬＰ（マクロファージ）での刺激の際に、ＤＨＲ酸化によって、およびＮＢＴ還元アッセイによって、単球およびマクロファージにおいてモニターした。ＤＨＲアッセイにおいて、非蛍光性ジヒドロローダミンは、ＲＯＳによる酸化の際に蛍光性に変化する。蛍光シグナル強度を、ＦＡＣＳ分析によって検出した。対応して、ＦＡＣＳ分析において、右側へのシフトは、ＲＯＳ生成の回復を示す。ＮＢＴアッセイでは、濃青色のホルマザン沈殿物の形成は、ＲＯＳ生成を示す。形質導入されていないＣＧＤ ｉＰＳＣに由来する単球／マクロファージを、陰性コントロールとして供した。ＣＧＤ ｉＰＳＣから得た単球／マクロファージを陽性コントロールとして供した。これは、ＳＦＦＶプロモーターの遍在的に活性なかつサイレンシング耐性のバージョンの制御下でｐ４７ｐｈｏｘをコードするベクター（Ｌｅｎｔｉ ＵＣＯＥ１６６２ｆｗｄ ＳＦＦＶ ｐ４７）で、形質導入した。
【0087】
本発明者らの遺伝子治療ベクターＵＺＨ１ｐ４７ＣＧＤによってｍｉＲ２２３で駆動されたｐ４７ｐｈｏｘ発現は、ＲＯＳ生成の再構成を生じ、従って、ＤＨＲアッセイにおいておよびＮＢＴアッセイにおいてともに可視化されるように、ＣＧＤ表現型の補正を生じた。
【0088】
ｉＰＳＣモデルにおけるサイレンシング（ＤＮＡメチル化）分析：
本発明者らは、それらの遺伝子治療ベクター（ＵＺＨ１ｐ４７ＣＧＤ）のメチル化に関して、および貪食細胞へのｉＰＳＣ分化の際の導入遺伝子発現活性に関して試験するために、ｐ４７－／－ ｉＰＳＣを利用した。ｐ４７ｐｈｏｘ陰性ｉＰＳＣを、レンチウイルスで形質導入し、単球へと増殖させた。ＤＮＡを、形質導入したｉＰＳＣ（＋２０日目）から、およびｉＰＳＣ由来単球（＋９７日目）から単離した。ＤＮＡメチル化分析のために、単離したＤＮＡを、亜硫酸水素ナトリウムに曝した（これは、非メチル化シトシンのみをウラシルへと変換する）。その後のＰＣＲ増幅は、ウラシルをチミジンへと変換する。元々の配列と亜硫酸水素塩での変換後の配列との比較は、ＤＮＡメチル化を明らかにする。すなわち、全てのメチル化配列において、シトシンが、配列決定によって検出されるのに対して、非メチル化配列では、チミジンが検出される。
本発明者らは、それらの遺伝子治療ベクター（ＵＺＨ１ｐ４７ＣＧＤ）のメチル化に関して、および貪食細胞へのｉＰＳＣ分化の際の導入遺伝子発現活性に関して試験するために、ｐ４７－／－ ｉＰＳＣを利用した。ｐ４７ｐｈｏｘ陰性ｉＰＳＣを、レンチウイルスで形質導入し、単球へと増殖させた。ＤＮＡを、形質導入したｉＰＳＣ（＋２０日目）から、およびｉＰＳＣ由来単球（＋９７日目）から単離した。ＤＮＡメチル化分析のために、単離したＤＮＡを、亜硫酸水素ナトリウムに曝した（これは、非メチル化シトシンのみをウラシルへと変換する）。その後のＰＣＲ増幅は、ウラシルをチミジンへと変換する。元々の配列と亜硫酸水素塩での変換後の配列との比較は、ＤＮＡメチル化を明らかにする。すなわち、全てのメチル化配列において、シトシンが、配列決定によって検出されるのに対して、非メチル化配列では、チミジンが検出される。
【0089】
ＤＮＡメチル化分析を、ｍｉＲ２２３制御下でｐ４７ｐｈｏｘをコードする遺伝子治療ベクター（ＵＺＨ１ｐ４７ＣＧＤ）での形質導入の際に、ｉＰＳＣおよびｉＰＳＣ由来単球において行った。メチル化分析は、全ｍｉＲ２２３プロモーター配列、およびｐ４７ｐｈｏｘ導入遺伝子の一部を網羅した。さらに、本発明者らは、ｉＰＳＣゲノムの天然のｍｉＲ２２３遺伝子プロモーター配列のＤＮＡメチル化を分析した。
【0090】
重要なことには、ｉＰＳＣでは、ウイルスがコードしたｍｉＲ２２３プロモーター、および天然のｍｉＲ２２３プロモーターの両方が、２０日以内にほぼ完全にメチル化された。よって、ＣＤ１３３＋ ｉＰＳＣにおいて、およびｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ 幹細胞において、ｐ４７ｐｈｏｘ導入遺伝子発現は、極めて低かった（上記の表１を参照のこと）。
【0091】
ｉＰＳＣレベルに対しても、単球においても、遺伝子治療ベクターがコードしたｍｉＲ２２３プロモーター配列と天然のｍｉＲ２２３プロモーターとの間のメチル化の程度に、有意差はなかった。驚くべきことに、かつＳＦＦＶプロモーターで得た結果（Ｈａｅｎｓｅｌｅｒら． （２０１８） Ｍａｔｔｅｒｓ； ｄｏｉ．： １０．１９１８５／ｍａｔｔｅｒｓ．２０１８０５０００００５）とは対照的に、本発明者らは、ｉＰＳＣから最終分化した細胞への分化の際に、ウイルスのおよび天然のｍｉＲ２２３プロモーター両方のメチル化が有意に低下することを見出した。これは、分化の際の（表１）、および従って活性化の際の（表２）、活性な脱メチル化を示す。長期間のインビボ状況に外挿すると、この知見は、休止状態のＨＳＣにおいてサイレンシングされるように、ｍｉＲ２２３プロモーターの長期間の活性を示し、ｍｉＲ２２３プロモーターは、ＨＳＣ活性化および分化の際に活性になると予測される。先に言及されたように、ＳＦＦＶの、またはＣｈｉｍプロモーター（Ｚｈａｎｇ， Ｓａｎｔｉｌｌｉ ＆ Ｔｈｒａｓｈｅｒ （２０１７） Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７： １０２１３）のサイレンシングを防止し得るＵＣＯＥベースのシステムが、開発された。しかし、上記ＵＣＯＥシステムは、レトロウイルス遺伝子治療ベクター内に埋め込まれており、レトロウイルス組み込み部位の近くにおいてＤＮＡのＤＮＡメチル化を変化させるというリスクを、ＨＳＣにおいても同様に有する。この活性は、ＨＳＣでは、全ての結果において遺伝子治療ベクターの組み込み部位に近いがん遺伝子を活性化し得る。ＵＣＯＥシステムとは対照的に、幹細胞において、および分化の際にのみ周囲のメチル化パターンに適合されたベクターＵＺＨ１ｐ４７ＣＧＤ内のｍｉＲ２２３プロモーターは、脱メチル化された。これは、顕著に安全な特徴である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】