特許 7586779 試料観察方法およびカートリッジ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-11

(45)【発行日】2024-11-19

(54)【発明の名称】試料観察方法およびカートリッジ

(51)【国際特許分類】

   H01J 37/20 20060101AFI20241112BHJP

   H01J 37/26 20060101ALI20241112BHJP

   G01N 1/42 20060101ALI20241112BHJP

   G01N 1/32 20060101ALI20241112BHJP

   G01N 1/28 20060101ALI20241112BHJP

【ＦＩ】

H01J37/20 E

H01J37/26

H01J37/20 C

H01J37/20 B

G01N1/42

G01N1/32 B

G01N1/28 G

G01N1/28 F

G01N1/28 J

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2021104683

(22)【出願日】2021-06-24

(65)【公開番号】P2023003547

(43)【公開日】2023-01-17

【審査請求日】2024-02-19

(73)【特許権者】

【識別番号】000004271

【氏名又は名称】日本電子株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100090387

【弁理士】

【氏名又は名称】布施 行夫

(74)【代理人】

【識別番号】100090398

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 美千栄

(74)【代理人】

【識別番号】100161540

【弁理士】

【氏名又は名称】吉田 良伸

(72)【発明者】

【氏名】水野 議覚

(72)【発明者】

【氏名】永沼 朋之

(72)【発明者】

【氏名】飯島 寛文

【審査官】佐藤 海

(56)【参考文献】

【文献】特開２００１－０１５０５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０２０／１１９９５６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１４－５０１９０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０００－１４６７８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１３－００８６３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１５－０８８２３７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｈ０１Ｊ ３７／００－３７／３６

Ｇ０１Ｎ １／００－１／４４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料を凍結させて透過電子顕微鏡で観察する試料観察方法であって、
カートリッジで凍結した前記試料を支持する工程と、
前記カートリッジに支持された前記試料を光学顕微鏡で観察し、観察対象の位置情報を取得する工程と、
前記カートリッジを集束イオンビーム装置に導入し、前記位置情報に基づいて前記試料を加工する工程と、
前記カートリッジを前記透過電子顕微鏡に導入し、加工された前記試料を前記透過電子顕微鏡で観察する工程と、
を含む、試料観察方法。

【請求項2】

請求項１において、
凍結試料支持体に支持された前記試料を凍結装置で凍結させる工程を含み、
前記カートリッジで凍結した前記試料を支持する工程では、前記凍結試料支持体を、前記カートリッジの第１取付け部に取付け、
前記試料を加工する工程では、
前記位置情報に基づいて前記凍結試料支持体に支持された前記試料を加工し、
加工された前記試料を、前記カートリッジの第２取付け部に取付けられた電子顕微鏡用試料支持体に移し、
前記電子顕微鏡用試料支持体に支持された前記試料を加工して、前記試料を薄片化する、試料観察方法。

【請求項3】

請求項２において、
前記試料を加工する工程では、加工された前記試料を、前記集束イオンビーム装置に搭載されたマニピュレータを用いて前記電子顕微鏡用試料支持体に移す、試料観察方法。

【請求項4】

請求項１において、
電子顕微鏡用試料支持体に支持された前記試料を凍結させる工程を含み、
前記カートリッジで凍結した前記試料を支持する工程では、前記電子顕微鏡用試料支持
体を、前記カートリッジの取付け部に取付ける、試料観察方法。

【請求項5】

請求項２ないし４のいずれか１項において、
前記カートリッジには、前記集束イオンビーム装置において集束イオンビームを前記試料に照射するための切り欠きと、前記透過電子顕微鏡において電子線を通過させるための貫通孔と、が設けられ、
前記切り欠きには、前記切り欠きを跨ぐ梁部が設けられている、試料観察方法。

【請求項6】

請求項５において、
前記カートリッジは、ベースを含み、
前記ベースは、前記切り欠きを規定する２つの面を有し、
前記２つの面は、前記切り欠きを挟み、
前記梁部は、前記２つの面を接続している、試料観察方法。

【請求項7】

請求項２ないし４のいずれか１項において、
前記カートリッジは、ベースを含み、前記電子顕微鏡用試料支持体を前記ベースの上面に対して傾けて支持する、試料観察方法。

【請求項8】

請求項５ないし７のいずれか１項において、
前記透過電子顕微鏡は、
試料室と、
仕切弁を介して前記試料室に接続された試料交換室と、
前記カートリッジを前記試料交換室と前記試料室との間で搬送する搬送装置と、
を含む、試料観察方法。

【請求項9】

ベースと、
前記ベースに設けられ、電子顕微鏡用試料支持体が取り付けられる取付け部と、
を含み、
前記ベースには、集束イオンビーム装置において集束イオンビームを試料に照射するための切り欠きと、透過電子顕微鏡において電子線を通過させるための貫通孔と、
が設けられ、
前記切り欠きには、前記切り欠きを跨ぐ梁部が設けられている、カートリッジ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料観察方法およびカートリッジに関する。

【背景技術】

【0002】

透過電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope、ＴＥＭ）において、含水率の高い生物試料は、そのままでは観察できないため、例えば、凍結して観察を行う。このように、凍結した試料を染色などを行わずに電子顕微鏡に導入して観察するクライオ電子顕微鏡法が注目されている。

【0003】

例えば、特許文献１には、冷却された試料が固定されたカートリッジを試料交換室から試料室に自動で搬送できる搬送装置を備えたクライオ電子顕微鏡が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特開２０１５－０８８２３７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

このようなクライオ電子顕微鏡法で試料を観察するためには、例えば、まず、試料を冷却装置で冷却して凍結させ、試料を加工装置で薄片化する。そして、薄片化した試料を透過電子顕微鏡に導入して観察を行う。

【0006】

このように、試料を観察するためには、試料を凍結してから観察するまで、複数の処理装置で処理を行わなければならない。各処理装置は、ステージやホルダーが異なるため、試料を凍結してから観察するまで、試料の載せ替えを行う必要がある。試料を載せかえる際には、作業者は、試料を支持するＴＥＭ用グリッドなどを、ピンセットなどを用いて取り扱わなければならない。ＴＥＭ用グリッドなどの試料支持体は、薄く、かつ、小さいため、作業の難易度が高い。また、このような作業では、試料が脱落したり、破損したりするおそれがある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明に係る試料観察方法の一態様は、
試料を凍結させて透過電子顕微鏡で観察する試料観察方法であって、
カートリッジで凍結した前記試料を支持する工程と、
前記カートリッジに支持された前記試料を光学顕微鏡で観察し、観察対象の位置情報を取得する工程と、
前記カートリッジを集束イオンビーム装置に導入し、前記位置情報に基づいて前記試料を加工する工程と、
前記カートリッジを前記透過電子顕微鏡に導入し、加工された前記試料を前記透過電子顕微鏡で観察する工程と、
を含む。

【0008】

このような試料観察方法では、光学顕微鏡で試料を観察してから加工された試料を透過電子顕微鏡で観察するまで、試料はカートリッジに支持されている。そのため、作業者は、試料や試料支持体を、直接取り扱わなくてもよいため、透過電子顕微鏡用の試料を容易に作製できる。さらに、作製された試料を容易に透過電子顕微鏡に導入できる。

【0009】

本発明に係るカートリッジの一態様は、
ベースと、
前記ベースに設けられ、電子顕微鏡用試料支持体が取り付けられる取付け部と、
を含み、
前記ベースには、集束イオンビーム装置において集束イオンビームを試料に照射するための切り欠きと、透過電子顕微鏡において電子線を通過させるための貫通孔と、
が設けられ、
前記切り欠きには、前記切り欠きを跨ぐ梁部が設けられている。

【0010】

このようなカートリッジでは、光学顕微鏡で試料を観察してから加工された試料を透過電子顕微鏡で観察するまで、試料を支持できる。さらに、このようなカートリッジでは、切り欠きに梁部が設けられているため、カートリッジの強度を向上できる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】第１実施形態に係る試料観察方法で用いられるカートリッジを模式的に示す斜視図。

【図2】第１実施形態に係る試料観察方法で用いられるＴＥＭ用の冷却試料ホルダーを模式的に示す断面図。

【図3】第１実施形態に係る試料観察方法の一例を示すフローチャート。

【図4】試料を凍結する工程を説明するための図。

【図5】試料を凍結する工程を説明するための図。

【図6】試料をカートリッジで支持する工程を模式的に示す斜視図。

【図7】集束イオンビーム装置を模式的に示す斜視図。

【図8】集束イオンビーム装置で試料を加工している様子を模式的に示す斜視図。

【図9】集束イオンビーム装置で試料を加工している様子を模式的に示す斜視図。

【図10】透過電子顕微鏡を模式的に示す図。

【図11】カートリッジで支持された試料を模式的に示す図。

【図12】カートリッジの変形例を模式的に示す図。

【図13】第２実施形態に係る試料観察方法で用いられるカートリッジを模式的に示す斜視図。

【図14】第２実施形態に係る試料観察方法の一例を示すフローチャート。

【図15】試料をカートリッジで支持する工程を模式的に示す斜視図。

【図16】集束イオンビームで試料を加工している様子を模式的に示す図。

【図17】薄片化された試料を模式的に示す図。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本発明の好適な実施形態について図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説
明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。

【0015】

１． 第１実施形態
１．１． カートリッジ
まず、第１実施形態に係る試料観察方法で用いられるカートリッジについて、図面を参照しながら説明する。図１は、第１実施形態に係る試料観察方法で用いられるカートリッジ１００を模式的に示す斜視図である。

【0016】

カートリッジ１００は、図１に示すように、ベース１１０と、固定溝１２０と、第１取付け部１３０と、第２取付け部１４０と、を含む。

【0017】

ベース１１０は、板状の部材である。ベース１１０には、固定溝１２０と、第１取付け部１３０、および第２取付け部１４０が設けられている。

【0018】

固定溝１２０は、カートリッジ１００を、後述する図２に示すＴＥＭ用の冷却試料ホルダー２００に装着するための溝である。冷却試料ホルダー２００については後述する。

【0019】

第１取付け部１３０は、凍結試料支持体をカートリッジ１００に取り付け可能に構成されている。凍結試料支持体は、第１取付け部１３０によってベース１１０に装着される。第１取付け部１３０は、例えば、ベース１１０に設けられた凹部を含み、当該凹部に凍結試料支持体を嵌め込むことで凍結試料支持体がベース１１０に装着される。凍結試料支持体は、凍結装置で試料を凍結させる際に、試料を支持するための支持体である。凍結試料支持体は、例えば、凍結用ディッシュである。

【0020】

第２取付け部１４０は、ＴＥＭ用試料支持体をカートリッジ１００に取付け可能に構成されている。ＴＥＭ用試料支持体は、第２取付け部１４０によってベース１１０に装着される。第２取付け部１４０は、例えば、ベース１１０に設けられた凹部を含み、当該凹部にＴＥＭ用試料支持体を嵌め込むことでＴＥＭ用試料支持体がベース１１０に装着される。ＴＥＭ用試料支持体は、ＴＥＭ用の試料を支持するための支持体である。ＴＥＭ用試料支持体は、例えば、ＴＥＭ用グリッド、集束イオンビーム装置で使用可能な切り欠きグリッドなどである。

【0021】

第２取付け部１４０にＴＥＭ用試料支持体を取り付けた場合、ＴＥＭ用試料支持体に支持された試料は、例えば、ベース１１０の厚さ方向において、ベース１１０の中心に位置する。すなわち、第２取付け部１４０にＴＥＭ用試料支持体を取り付けた場合、試料とベース１１０の上面１１０ａとの間の距離は、試料とベース１１０の下面１１０ｂとの間の距離と等しい。

【0022】

カートリッジ１００には、図１に示すように、集束イオンビーム装置において集束イオンビームを試料に照射するための切り欠き１５０と、透過電子顕微鏡において電子線を通過させるための貫通孔１６０と、が設けられている。

【0023】

切り欠き１５０は、ベース１１０の側面１０２を切り欠いて形成されている。切り欠き１５０は、第２取付け部１４０の凹部に接続されている。そのため、第２取付け部１４０に取り付けられたＴＥＭ用試料支持体に支持された試料に、切り欠き１５０を通して、集束イオンビームを照射できる。

【0024】

ベース１１０は、切り欠き１５０を規定する第１面１１１、第２面１１２、第３面１１３、および第４面１１４を有している。第１面１１１および第４面１１４は、ベース１１０の側面１０２に接続されている。第２面１１２は、第１面１１１と第２取付け部１４０を規定する面を接続している。第３面１１３は、第４面１１４と第２取付け部１４０を規定する面を接続している。

【0025】

切り欠き１５０には、切り欠き１５０を跨ぐ梁部１７０が設けられている。梁部１７０は、切り欠き１５０を規定する複数の面のうち、切り欠き１５０を挟む２つの面を接続している。第１面１１１と第４面１１４は、切り欠き１５０を挟む２つの面であり、梁部１７０は、第１面１１１と第４面１１４を接続している。

【0026】

切り欠き１５０に梁部１７０を設けることによって、例えば切り欠き１５０に梁部１７０を設けない場合と比べて、カートリッジ１００の強度を向上できる。

【0027】

貫通孔１６０は、第２取付け部１４０の凹部の底面に設けられている。透過電子顕微鏡において、第２取付け部１４０に取り付けられたＴＥＭ用試料支持体に支持された試料に電子線を照射すると、試料を通過した電子線は貫通孔１６０を通過する。

【0028】

１．２． 冷却試料ホルダー
次に、第１実施形態に係る試料観察方法で用いられるＴＥＭ用の冷却試料ホルダーについて、図面を参照しながら説明する。図２は、第１実施形態に係る試料観察方法で用いられるＴＥＭ用の冷却試料ホルダー２００を模式的に示す断面図である。

【0029】

冷却試料ホルダー２００は、凍結した試料を冷却できる試料ホルダーである。冷却試料ホルダー２００を用いることによって、凍結した試料を溶解させることなく保持できる。冷却試料ホルダー２００は、図２に示すように、カートリッジ保持部２１０と、熱伝導体２２０と、タンク２３０と、カバー２４０と、を含む。

【0030】

カートリッジ保持部２１０は、冷却試料ホルダー２００の先端に設けられている。カートリッジ保持部２１０では、カートリッジ１００を保持できる。カートリッジ保持部２１０は、例えば、カートリッジ１００の固定溝１２０に、不図示の留め具を差し込むことで、カートリッジ１００を保持する。

【0031】

タンク２３０には、冷却媒体が収容されている。冷却媒体としては、例えば、液体窒素を用いることができる。熱伝導体２２０は、熱伝導率の高い材料からなる。熱伝導体２２０の一端は、タンク２３０の冷却媒体に接続され、熱伝導体２２０の他端は、カートリッジ保持部２１０に接続されている。そのため、カートリッジ１００を冷却できる。

【0032】

カバー２４０は、カートリッジ保持部２１０に保持されたカートリッジ１００を覆っている。カバー２４０でカートリッジ１００を覆うことによって、カートリッジ１００やカートリッジ１００に支持された試料に霜が付着することを防ぐことができる。

【0033】

１．３． 試料観察方法
次に、第１実施形態に試料観察方法について説明する。図３は、第１実施形態に係る試料観察方法の一例を示すフローチャートである。

【0034】

１．３．１． 試料を凍結する工程Ｓ１００
まず、試料を凍結する。試料は、例えば、細胞、タンパク質、ウイルス、脂質分子などの生物試料である。含水率の高い生物試料を凍結することによって、染色などを行わずに、透過電子顕微鏡で観察できる。

【0035】

試料の凍結は、凍結装置を用いて行われる。凍結装置としては、例えば、高圧凍結装置
を用いることができる。高圧凍結装置では、試料に圧力を加えて凍結させることによって、大気圧下での凍結に比べて、試料のより深くまで非晶質に水を凍結できる。

【0036】

図４および図５は、試料２を凍結する工程を説明するための図である。

【0037】

図４に示すように、まず、２つの凍結試料支持体１０で試料２を挟む。次に、試料２を挟んだ２つの凍結試料支持体１０を高圧凍結装置にセットする。次に、高圧凍結装置で試料２を凍結する。次に、２つの凍結試料支持体１０に挟まれた試料２を、冷却割断装置で割断する。これにより、図５に示すように、凍結試料支持体１０に支持された試料２を得ることができる。冷却割断装置で試料２を割断することによって、試料２に平坦な面を形成できる。これにより、集束イオンビームを用いて試料２を加工しやすくなる。

【0038】

冷却割断装置では、試料２への霜の付着を防ぐために、真空中または窒素ガス雰囲気に試料２が配置される。図５に示す凍結試料支持体１０に支持された試料２は、液体窒素カップに収容され、ワークステーションに搬送される。

【0039】

１．３．２． 試料をカートリッジで支持する工程Ｓ１０２
図６は、試料２をカートリッジ１００で支持する工程Ｓ１０２を模式的に示す斜視図である。

【0040】

図６に示すように、凍結試料支持体１０に支持された試料２をカートリッジ１００に装着する。ワークステーションにおいて、凍結試料支持体１０を第１取付け部１３０に取り付ける。ワークステーションの作業スペースは、液体窒素が充填されており、試料２に霜を付着させることなく、凍結試料支持体１０をカートリッジ１００に取り付けることができる。

【0041】

なお、凍結試料支持体１０をカートリッジ１００に取り付ける前に、あらかじめカートリッジ１００の第２取付け部１４０にＴＥＭ用試料支持体２０を取り付けておく。

【0042】

このように、本工程において、凍結した試料２とＴＥＭ用試料支持体２０の両方がカートリッジ１００に装着される。そのため、これ以降の工程では、作業者はカートリッジ１００を取り扱えばよく、試料２やＴＥＭ用試料支持体２０を直接取り扱わなくてもよい。

【0043】

１．３．３． 光学顕微鏡で試料を観察する工程Ｓ１０４
凍結した試料２およびＴＥＭ用試料支持体２０を支持したカートリッジ１００を光学顕微鏡に搬送し、カートリッジ１００を光学顕微鏡のステージに取り付ける。なお、ワークステーションから光学顕微鏡へのカートリッジ１００の搬送は、液体窒素カップを用いて行われる。

【0044】

光学顕微鏡のステージは、カートリッジ１００を搭載可能である。光学顕微鏡のステージは、液体窒素タンクに接続されており、カートリッジ１００を冷却できる。ステージに搭載されたカートリッジ１００は、例えば、加圧状態の窒素ガス雰囲気に置かれる。これにより、試料２に霜を付着させることなく、光学顕微鏡で試料２を観察できる。

【0045】

光学顕微鏡では、試料２を観察し、観察対象の位置情報を取得する。観察対象の位置は、例えば、カートリッジ１００に設けられた、複数のアライメントマーカーによって特定できる。具体的には、光学顕微鏡において、各アライメントマーカーの位置にステージを移動させ、各アライメントマーカーのステージ座標を記録する。次に、観察対象の位置にステージを移動させ、観察対象のステージ座標を記録する。このようにして、観察対象の位置情報を取得する。観察対象の位置情報は、例えば、各アライメントマーカーのステー
ジ座標と、観察対象のステージ座標と、を含む。なお、アライメントマーカーは、ＴＥＭ用試料支持体２０に設けられていてもよい。

【0046】

例えば、試料２を観察するための光学顕微鏡として、蛍光顕微鏡を用いてもよい。蛍光顕微鏡では、試料２から発せられた蛍光を観察できる。

【0047】

１．３．４． カートリッジを冷却試料ホルダーに取り付ける工程Ｓ１０６
光学顕微鏡で観察対象の位置情報を取得した後、液体窒素カップを用いてカートリッジ１００を光学顕微鏡からワークステーションに搬送する。ワークステーションにおいて、カートリッジ１００を図２に示す冷却試料ホルダー２００に装着する。具体的には、ワークステーションにおいて、液体窒素中でカートリッジ１００を冷却試料ホルダー２００のカートリッジ保持部２１０に取り付ける。カートリッジ保持部２１０にカートリッジ１００を取付けた後、カバー２４０でカートリッジ１００を覆う。カートリッジ保持部２１０は、タンク２３０と熱的に接続されているため、冷却試料ホルダー２００で保持されたカートリッジ１００は冷却される。

【0048】

１．３．５． 集束イオンビーム装置で試料を板状に加工する工程Ｓ１０８
集束イオンビーム装置の処理室に冷却試料ホルダー２００を用いてカートリッジ１００を搬送する。そして、集束イオンビーム装置を用いて、試料２を加工する。

【0049】

図７は、集束イオンビーム装置３００を模式的に示す斜視図である。集束イオンビーム装置３００は、図７に示すように、電子ビーム鏡筒３１０と、ガスインジェクションシステム３２０と、集束イオンビーム鏡筒３３０と、マニピュレータシステム３４０と、処理室３５０と、搬送ロッド３６０と、試料室３７０と、を含む。

【0050】

集束イオンビーム装置３００は、電子ビーム鏡筒３１０および集束イオンビーム鏡筒３３０を備えており、集束イオンビームによる試料２の加工、および走査電子顕微鏡による試料２の観察が可能である。

【0051】

試料２の加工は、図７に示すように、まず、処理室３５０に冷却試料ホルダー２００を挿入し、処理室３５０内のテーブルにカートリッジ１００を装着する。カートリッジ１００をテーブルに装着した後、冷却試料ホルダー２００を引き抜く。処理室３５０は真空状態に保たれており、テーブルは液体窒素タンクに接続されているため、処理室３５０内においても試料２は、凍結した状態を維持できる。

【0052】

処理室３５０において、凍結した試料２に導電性コーティングを行う。処理室３５０は、試料室３７０とは独立した排気系で真空状態が維持されている。そのため、処理室３５０のみにアルゴンガスを流して、試料２に対してスパッタコーティングを行うことができる。

【0053】

試料２に対してコーティングを行った後、搬送ロッド３６０を用いて、カートリッジ１００を処理室３５０から試料室３７０に搬送する。試料室３７０に搬送されたカートリッジ１００は、試料室３７０内に配置された冷却ステージに固定される。

【0054】

図８および図９は、集束イオンビーム装置３００で試料２を加工している様子を模式的に示す斜視図である。

【0055】

図８に示すように、観察対象の位置情報に基づいて試料２を加工する。例えば、走査電子顕微鏡（電子ビーム鏡筒３１０）でカートリッジ１００を観察することによってカートリッジ１００に設けられたアライメントマーカーを探し、各アライメントマーカーのステ
ージ座標を記録する。記録したステージ座標と、観察対象の位置情報（各アライメントマーカーの位置情報）と、を比較して、観察対象の集束イオンビーム装置３００におけるステージ座標を求める。

【0056】

なお、上記では、観察対象の位置あわせの際に、アライメントマーカーを電子線を用いたＳＥＭ像で確認する場合について説明したが、アライメントマーカーをイオンビームを用いたＳＩＭ（Scanning Ion Microscope）像で確認してもよい。

【0057】

観察対象のステージ座標を特定できたら、特定されたステージ座標に試料２を移動させる。そして、集束イオンビーム鏡筒３３０から集束イオンビームを試料２に照射し、試料２を加工する。

【0058】

試料２の加工では、まず、試料２に保護膜としてのデポジション膜を成膜する。具体的には、ガスインジェクションシステム３２０のノズルを試料２の近傍に配置し、試料２にＰｔの有機系化合物ガスを吹き付ける。これにより、試料２の表面にデポジション膜を成膜できる。試料２の表面に保護膜を成膜することによって、加工中の観察対象へのダメージを低減できる。

【0059】

なお、低温では電子ビームまたはイオンビームを用いたＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition）法による成膜を行うことができないため、上記のように、低温の試料２にガスを吹き付けて成膜を行う。

【0060】

次に、集束イオンビームを用いて試料２を加工する。具体的には、まず、集束イオンビームを用いて、試料２の一部を板状に加工する。次に、集束イオンビームを用いて、板状部分の底部と側面を切り落とす。このとき、側面の全部を切り落とさずに、板状部分と試料２の残りの部分とがつながった状態にする。

【0061】

１．３．６． 試料をマニピュレータでＴＥＭ用試料支持体に移す工程Ｓ１１０
次に、マニピュレータシステム３４０を用いて、板状の試料２を凍結試料支持体１０からＴＥＭ用試料支持体２０に移す。

【0062】

具体的には、まず、マニピュレータ３４２の先端を試料２の板状部分に固定し、マニピュレータ３４２と板状部分を接続する。次に、集束イオンビームを用いて板状部分と試料２の残りの部分とがつながった部分を切り落とし、板状部分を分離する。次に、図９に示すように、マニピュレータ３４２で板状部分を凍結試料支持体１０上からＴＥＭ用試料支持体２０上に搬送する。次に、板状部分をＴＥＭ用試料支持体２０上に接続し、マニピュレータ３４２と板状部分の接続部分を切り離す。以上の工程により、板状の試料２をＴＥＭ用試料支持体２０に移すことができる。

【0063】

１．３．７． 集束イオンビーム装置で試料を薄片化する工程Ｓ１１２
次に、ＴＥＭ用試料支持体２０に支持された試料２を集束イオンビームで薄片化する。試料２を薄片化することによって、試料２を透過電子顕微鏡で観察できる。

【0064】

試料２の薄片化が完了した後、搬送ロッド３６０でカートリッジ１００を試料室３７０から処理室３５０に搬送する。処理室３５０に冷却試料ホルダー２００を挿入し、処理室３５０からカートリッジ１００を搬出する。

【0065】

なお、処理室３５０において、薄片化した試料２に導電性膜のコーティングを行ってもよい。これにより、透過電子顕微鏡で試料２を観察する際のチャージによる試料ドリフトを低減できる。

【0066】

１．３．８． 透過電子顕微鏡で試料を観察する工程Ｓ１１４
ワークステーションにおいて、冷却試料ホルダー２００からカートリッジ１００を取り外し、取り外したカートリッジ１００をマガジンに装填する。カートリッジ１００が装填されたマガジンを透過電子顕微鏡に取り付ける。これにより、カートリッジ１００を透過電子顕微鏡に導入できる。この結果、試料２の観察対象を透過電子顕微鏡で観察できる。

【0067】

図１０は、透過電子顕微鏡４００を模式的に示す図である。

【0068】

透過電子顕微鏡４００は、試料２を透過した電子線でＴＥＭ像を結像する。透過電子顕微鏡４００は、試料２を冷却しながら観察可能なクライオ電顕である。透過電子顕微鏡４００は、図１０に示すように、仕切弁４２０と、搬送装置４３０と、搬送装置４４０と、仕切弁４５０と、試料ホルダー４６０と、を含む。

【0069】

仕切弁４２０は、試料交換室４０４と液体窒素カップ４１０との間を仕切る弁である。液体窒素カップ４１０は、仕切弁４２０を介して、試料交換室４０４に装着される。搬送装置４３０は、液体窒素カップ４１０と試料交換室４０４との間でマガジン４１２を搬送する。マガジン４１２は、複数のカートリッジ１００を保持可能である。搬送装置４４０は、カートリッジ１００を、試料交換室４０４と試料室４０２との間で搬送する。仕切弁４５０は、試料交換室４０４と試料室４０２との間を仕切る弁である。試料ホルダー４６０は、試料２を冷却しながら保持できる。

【0070】

透過電子顕微鏡４００において、カートリッジ１００を試料室４０２に導入する場合、まず、カートリッジ１００が取り付けられたマガジン４１２を収容する液体窒素カップ４１０を、仕切弁４２０を介して試料交換室４０４に取付ける。仕切弁４２０を開いた後、搬送装置４３０でマガジン４１２を掴み、マガジン４１２を試料交換室４０４に導入する。試料交換室４０４において、搬送装置４４０でマガジン４１２に取り付けられたカートリッジ１００を掴む。仕切弁４５０を開いて、搬送装置４４０でカートリッジ１００を試料交換室４０４から試料室４０２に搬送する。試料室４０２においてカートリッジ１００を試料ホルダー４６０に受け渡す。これにより、試料室４０２にカートリッジ１００、すなわち、試料２を導入できる。

【0071】

試料室４０２では、試料２に電子線が照射される。これにより、ＴＥＭ像を取得できる。

【0072】

ここで、透過電子顕微鏡４００では、上述したように、カートリッジ１００は搬送装置４４０で搬送される。搬送装置４４０でカートリッジ１００をマガジン４１２に収容する際や、搬送装置４４０と試料ホルダー４６０との間でカートリッジ１００を受け渡す際に、カートリッジ１００に力が加わってしまう。

【0073】

例えば、カートリッジ１００の切り欠き１５０に梁部１７０が無い場合、カートリッジ１００の切り欠き１５０が設けられた部分の強度が低いため、カートリッジ１００が変形してしまう場合があった。これに対して、カートリッジ１００では、切り欠き１５０に梁部１７０が設けられているため、カートリッジ１００の強度が高く、カートリッジ１００の変形を防ぐことができる。

【0074】

なお、透過電子顕微鏡は、例えば、冷却試料ホルダー２００を直接挿入できるように構成されていてもよい。これにより、容易に、薄片化された試料２を透過電子顕微鏡に導入できる。

【0075】

図１１は、カートリッジ１００に支持された試料２を模式的に示す図である。

【0076】

図１１に示すように、試料２は、ＴＥＭ用試料支持体２０で支持される。ＴＥＭ用試料支持体２０は、第２取付け部１４０に取付けられている。ここで、カートリッジ１００には、切り欠き１５０が設けられているため、試料２を集束イオンビームで加工できる。さらに、カートリッジ１００には、貫通孔１６０が設けられているため、透過電子顕微鏡において試料２を観察できる。

【0077】

１．４． 効果
第１実施形態に係る試料観察方法は、カートリッジ１００で凍結した試料２を支持する工程と、カートリッジ１００に支持された試料２を光学顕微鏡で観察し、観察対象の位置情報を取得する工程と、カートリッジ１００を集束イオンビーム装置３００に導入し、観察対象の位置情報に基づいて試料２を加工する工程と、カートリッジ１００を透過電子顕微鏡に導入し、加工された試料２を透過電子顕微鏡で観察する工程と、を含む。このように第１実施形態に係る試料観察方法では、光学顕微鏡で試料２を観察してから透過電子顕微鏡で加工された試料２を観察するまで、試料２はカートリッジ１００に支持されている。そのため、作業者は、直接、試料２や試料支持体を取り扱わなくてもよいため、透過電子顕微鏡用の試料を容易に作製できる。さらに、作製された試料を容易に透過電子顕微鏡に導入できる。

【0078】

例えば、カートリッジ１００を用いない場合、作業者が、試料２が支持されたグリッドをＦＩＢ用試料ホルダーに載せ、加工終了後には、ＦＩＢ用試料ホルダーからＴＥＭ用試料ホルダーにグリッドを載せ替えなければならなかった。

【0079】

第１実施形態に係る試料観察方法では、このような作業が不要であり、容易に透過電子顕微鏡用の試料を作製できる。

【0080】

第１実施形態に係る試料観察方法は、凍結試料支持体１０に支持された試料２を凍結装置で凍結させる工程を含み、カートリッジ１００で凍結した試料２を支持する工程では、凍結試料支持体１０を、カートリッジ１００の第１取付け部１３０に取付け、試料２を加工する工程では、観察対象の位置情報に基づいて凍結試料支持体１０に支持された試料２を加工し、加工された試料２をカートリッジ１００の第２取付け部１４０に取付けられたＴＥＭ用試料支持体２０に移し、ＴＥＭ用試料支持体２０に支持された試料２を加工して、試料２を薄片化する。

【0081】

このように、第１実施形態に係る試料観察方法では、凍結装置で試料２を凍結させた後、カートリッジ１００で凍結した試料２を支持してから透過電子顕微鏡による観察まで、試料２は、カートリッジ１００に支持されている。そのため、作業者がＴＥＭ用グリッドなどの試料支持体を直接取り扱う必要がない。

【0082】

また、カートリッジ１００には、凍結試料支持体１０およびＴＥＭ用試料支持体２０の両方があらかじめ取り付けられている。そのため、各処理装置間の座標の共有が容易である。

【0083】

例えば、カートリッジ１００を用いない場合、ＦＩＢ用試料ホルダーからＴＥＭ用試料ホルダーにグリッドを載せ替える際には、グリッドの回転を考慮して座標を共有しなければならなかった。これは、一般的に、グリッドは円形であり、ＴＥＭ用試料ホルダーにグリッドを取付ける際には、グリッドには回転の自由度があるためである。

【0084】

これに対して、カートリッジ１００を用いた場合、ＴＥＭ用試料支持体２０は、カート
リッジ１００に固定されているため、座標を共有する際にグリッドの回転を考慮しなくてもよい。また、カートリッジ１００には、凍結試料支持体１０およびＴＥＭ用試料支持体２０の両方があらかじめ取付けられているため、共通のアライメントマーカーを用いることができる。したがって、座標の共有が容易である。

【0085】

第１実施形態に係る試料観察方法では、試料２を加工する工程において、加工された試料２を、集束イオンビーム装置３００に搭載されたマニピュレータ３４２を用いてＴＥＭ用試料支持体２０に移す。そのため、より確実に、試料２を凍結試料支持体１０からＴＥＭ用試料支持体２０に移すことができる。

【0086】

第１実施形態に係る試料観察方法では、カートリッジ１００には、集束イオンビーム装置３００において集束イオンビームを試料２に照射するための切り欠き１５０と、透過電子顕微鏡において電子線を通過させるための貫通孔１６０と、が設けられ、切り欠き１５０には、切り欠き１５０を跨ぐ梁部１７０が設けられている。そのため、カートリッジ１００の強度を向上できる。

【0087】

また、梁部１７０を設けることによって梁部１７０を設けない場合と比べて、輻射熱による試料２の温度の上昇を低減できる。

【0088】

カートリッジ１００のベース１１０は、切り欠き１５０を規定する第１面１１１および第４面１１４を有し、第１面１１１および第４面１１４は切り欠き１５０を挟み、梁部１７０は、第１面１１１と第４面１１４を接続している。そのため、カートリッジ１００の強度を向上できる。

【0089】

第１実施形態に係る試料観察方法では、透過電子顕微鏡は、試料室４０２と、仕切弁４５０を介して試料室４０２に接続された試料交換室４０４と、カートリッジ１００を試料交換室４０４と試料室４０２との間で搬送する搬送装置４４０と、を含む。カートリッジ１００には、切り欠き１５０を跨ぐ梁部１７０が設けられているため、搬送装置４４０でカートリッジ１００を搬送しても、カートリッジ１００の変形を防ぐことができる。

【0090】

カートリッジ１００は、ベース１１０と、ベース１１０に設けられ、ＴＥＭ用試料支持体２０が取り付けられる第２取付け部１４０と、を含む。また、ベース１１０には、集束イオンビーム装置３００において集束イオンビームを試料２に照射するための切り欠き１５０と、透過電子顕微鏡４００において電子線を通過させるための貫通孔１６０と、が設けられ、切り欠き１５０には、切り欠き１５０を跨ぐ梁部１７０が設けられている。

【0091】

カートリッジ１００を用いることで、光学顕微鏡で試料を観察してから加工された試料を透過電子顕微鏡で観察するまで、試料を支持できる。さらに、カートリッジ１００では、切り欠き１５０に梁部１７０が設けられているため、カートリッジ１００の強度を向上できる。これにより、例えば、透過電子顕微鏡において、搬送装置４４０でカートリッジ１００を搬送しても、カートリッジ１００の変形を防ぐことができる。

【0092】

１．５． 変形例
図１２は、カートリッジ１００の変形例を模式的に示す図である。図１２は、図１１に対応している。

【0093】

図１２に示すように、カートリッジ１００は、切り欠き１５０を有していなくてもよい。図１２に示すカートリッジ１００では、第２取付け部１４０がＴＥＭ用試料支持体２０をベース１１０の上面１１０ａに対して傾けて支持している。これにより、切り欠き１５０を設けなくても、ベース１１０が集束イオンビームを遮らない。したがって、カートリ
ッジ１００では、試料２を集束イオンビームで加工でき、かつ、透過電子顕微鏡で加工された試料２を観察できる。

【0094】

図１２に示すカートリッジ１００でも、上述した図１および図１１に示すカートリッジ１００と同様の作用効果を奏することができる。

【0095】

２． 第２実施形態
２．１． カートリッジ
次に、第２実施形態に係る試料観察方法について説明する。まず、第２実施形態に係る試料観察方法で用いられるカートリッジについて図面を参照しながら説明する。

【0096】

図１３は、第２実施形態に係る試料観察方法で用いられるカートリッジ５００を模式的に示す斜視図である。図１３に示すカートリッジ５００において、上述した図１に示すカートリッジ１００の構成部材と同様の機能を有する部材については同一の符号を付し、その詳細な説明を省略する。

【0097】

図１３に示すように、カートリッジ５００は、凍結試料支持体１０を取り付けるための取付け部（第１取付け部１３０）を有していない。

【0098】

２．２． 試料観察方法
図１４は、第２実施形態に係る試料観察方法の一例を示すフローチャートである。以下、第２実施形態に係る試料観察方法について、第１実施形態に係る試料観察方法の例と異なる点について説明し、同様の点については説明を省略する。

【0099】

２．２．１． 試料を凍結する工程Ｓ２００
第２実施形態に係る試料観察方法では、グリッド（ＴＥＭ用試料支持体の一例）に滴下した試料や、グリッド上で培養した試料を凍結する。例えば、グリッドに試料を滴下し、液体エタンなどにグリッドごと投入して試料を凍結する。凍結した試料は、液体窒素カップでワークステーションに搬送する。

【0100】

２．２．２． 試料をカートリッジで支持する工程Ｓ２０２
図１５は、試料２をカートリッジ５００で支持する工程Ｓ２０２を模式的に示す斜視図である。

【0101】

ワークステーションにおいて、凍結した試料２を保持するグリッド２２を、第２取付け部１４０（以下、単に「取付け部１４０」ともいう）に取り付ける。第１実施形態と同様に、これ以降の工程では、カートリッジ５００のみを取り扱えばよく、作業者が試料２やグリッド２２を直接取り扱う必要がない。

【0102】

２．２．３． 光学顕微鏡で試料を観察する工程Ｓ２０４
カートリッジ５００を光学顕微鏡のステージに取り付けて、光学顕微鏡で試料２を観察し、観察対象の位置情報を取得する。本工程Ｓ２０４は、上述した図３に示す光学顕微鏡で試料２を観察する工程Ｓ１０４と同様に行われる。

【0103】

２．２．４． カートリッジを冷却試料ホルダーに取り付ける工程Ｓ２０６
カートリッジ５００を冷却試料ホルダー２００に取り付ける。本工程Ｓ２０６は、上述した図３に示すカートリッジ１００を冷却試料ホルダー２００に取り付ける工程Ｓ１０６と同様に行われる。

【0104】

２．２．５． 集束イオンビーム装置で試料を薄片化する工程Ｓ２０８
図１６は、集束イオンビームで試料２を加工している様子を模式的に示す図である。

【0105】

図１６に示すように、グリッド２２上の試料２に対して集束イオンビームＦＩＢを照射し、試料２を薄片化する。例えば、グリッド２２の上面に対して１０°程度傾斜した角度から集束イオンビームＦＩＢを入射させて加工を行う。

【0106】

このように、第２実施形態では、グリッド２２上で試料２を凍結させ、グリッド２２上で試料２を加工するため、試料２をマニピュレータでＴＥＭ用試料支持体に移す工程Ｓ１１０を行わなくてよい。

【0107】

２．２．６． 透過電子顕微鏡で試料を観察する工程Ｓ２１０
透過電子顕微鏡にカートリッジ１００を導入し、試料２の観察対象を透過電子顕微鏡で観察する。本工程は、上述した図３に示す透過電子顕微鏡４００で試料２を観察する工程Ｓ１１４と同様に行われる。

【0108】

図１７は、薄片化された試料２を模式的に示す図である。

【0109】

図１７に示すように、試料２は、薄片２ａと、薄片２ａを保持する塊２ｂと、を含む。上記の工程Ｓ２０８において、試料２を加工することによって、薄片２ａと、薄片２ａの両側に位置する塊２ｂと、が形成される。

【0110】

ここで、透過電子顕微鏡で試料２を観察する際には、透過電子顕微鏡の試料ステージの傾斜軸Ｌが２つの塊２ｂを通り薄片２ａの中心を通るように、カートリッジ５００を試料ステージに装着することが望ましい。これにより、傾斜軸Ｌまわりに試料２を傾斜させたときに、薄片２ａが塊２ｂの影になって視野が制限されてしまうことを防ぐことができる。

【0111】

第２実施形態に係る試料観察方法では、グリッド２２をカートリッジ５００で支持した状態で、集束イオンビーム装置３００による試料２の加工および透過電子顕微鏡による試料２の観察ができる。そのため、集束イオンビーム装置３００による試料２の加工時の向きと、透過電子顕微鏡による試料２の観察時の向きと、を合わせることが容易である。したがって、薄片２ａに対して傾斜軸Ｌがずれて塊２ｂで視野が制限されてしまうことを防ぐことができる。

【0112】

２．３． 効果
第２実施形態に係る試料観察方法は、上述した第１実施形態に係る試料観察方法と同様の作用効果を奏することができる。

【0113】

第２実施形態に係る試料観察方法では、グリッド２２に支持された試料２を凍結させる工程を含み、カートリッジ５００で凍結した試料２を支持する工程では、グリッド２２を、カートリッジ５００の取付け部１４０に取り付ける。そのため、試料２を凍結試料支持体１０からＴＥＭ用試料支持体２０に移す工程が不要となり、より容易に試料を作製できる。

【0114】

カートリッジ５００は、ベース１１０と、ベース１１０に設けられ、グリッド２２が取り付けられる取付け部１４０と、を含み、取付け部１４０は、グリッド２２を、ベース１１０の上面１１０ａに対して傾けて支持する。そのため、例えば、ベース１１０に切り欠きを設けた場合と比べて、カートリッジ５００の強度を向上できる。

【0115】

本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらに種々の変形が可能であ
る。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成を含む。実質的に同一の構成とは、例えば、機能、方法、及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成である。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。

【符号の説明】

【0116】

２…試料、２ａ…薄片、２ｂ…塊、１０…凍結試料支持体、２０…ＴＥＭ用試料支持体、２２…グリッド、１００…カートリッジ、１０２…側面、１１０…ベース、１１０ａ…上面、１１１…第１面、１１２…第２面、１１３…第３面、１１４…第４面、１２０…固定溝、１３０…第１取付け部、１４０…第２取付け部、１５０…切り欠き、１６０…貫通孔、１７０…梁部、２００…冷却試料ホルダー、２１０…カートリッジ保持部、２２０…熱伝導体、２３０…タンク、２４０…カバー、３００…集束イオンビーム装置、３１０…電子ビーム鏡筒、３２０…ガスインジェクションシステム、３３０…集束イオンビーム鏡筒、３４０…マニピュレータシステム、３４２…マニピュレータ、３５０…処理室、３６０…搬送ロッド、３７０…試料室、４００…透過電子顕微鏡、４０２…試料室、４０４…試料交換室、４１０…液体窒素カップ、４１２…マガジン、４２０…仕切弁、４３０…搬送装置、４４０…搬送装置、４５０…仕切弁、４６０…試料ホルダー、５００…カートリッジ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】