特許 7586886 改善されたｍＲＮＡ装填脂質ナノ粒子、およびそれを作製するプロセス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-11

(45)【発行日】2024-11-19

(54)【発明の名称】改善されたｍＲＮＡ装填脂質ナノ粒子、およびそれを作製するプロセス

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7105 20060101AFI20241112BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 47/32 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20241112BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7105

A61K48/00

A61K47/24

A61K9/127

A61K9/51

A61K47/32

A61K47/28

A61K47/26

A61K38/00

A61K39/00 G

【請求項の数】 32

(21)【出願番号】P 2022500900

(86)(22)【出願日】2020-07-08

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-27

(86)【国際出願番号】 US2020041122

(87)【国際公開番号】W WO2021007278

(87)【国際公開日】2021-01-14

【審査請求日】2023-06-22

(31)【優先権主張番号】62/871,513

(32)【優先日】2019-07-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517316797

【氏名又は名称】トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】カーブ， シュリラング

(72)【発明者】

【氏名】サロード， アシシュ

(72)【発明者】

【氏名】デローサ， フランク

【審査官】榎本 佳予子

(56)【参考文献】

【文献】欧州特許出願公開第０３３１５１２５（ＥＰ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／０８９８０１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１８－５１９２８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特許第７４８３２９４（ＪＰ，Ｂ２）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９

Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２

Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８

Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｍＲＮＡの送達を必要とする対象にそれを行うための組成物であって、脂質ナノ粒子を含み、前記脂質ナノ粒子が、１つ以上のカチオン性脂質と、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質と、１つ以上のヘルパー脂質とを含み、前記ｍＲＮＡを封入しており、前記１つ以上のヘルパー脂質の少なくとも１つが、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）を含み、ＤＥＰＥは、前記脂質ナノ粒子中に、総脂質の２５モルパーセント～３５モルパーセントの濃度で存在する、組成物。

【請求項2】

前記対象への前記組成物の投与が、１つ以上の異なるヘルパー脂質を含み、かつＤＥＰＥを含まないことを除いて同じ脂質成分および量を有する脂質ナノ粒子を含む第２の組成物中の同じｍＲＮＡの発現と比較して、前記ｍＲＮＡの発現の強化をもたらす、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記１つ以上の異なるヘルパー脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、および／またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

発現が前記脂質ナノ粒子の第２の組成物と比較して少なくとも２倍強化される、請求項２または３に記載の組成物。

【請求項5】

前記１つ以上のカチオン性脂質の少なくとも１つが、各々Ｃ₁₀－Ｃ₁₆の鎖長の１～４つのアルキル鎖を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記１つ以上のカチオン性脂質の少なくとも１つが、４つの脂肪族鎖を含むリピドイドである、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

前記１つ以上のカチオン性脂質の少なくとも１つが、以下の式のカチオン性脂質、

【化1】

またはその薬学的に許容される塩であるか、またはそれを含み、
式中、Ｒ¹およびＲ²が各々独立して、ＨまたはＣ₁－Ｃ₆脂肪族であり、ｍが各々独立して、１～４の値を有する整数であり、Ａが各々独立して、共有結合またはアリーレンであり、Ｌ¹が各々独立して、エステル、チオエステル、ジスルフィド、または無水物基であり、Ｌ²が各々独立して、Ｃ₂－Ｃ₁₀脂肪族であり、Ｘ¹が各々独立して、ＨまたはＯＨであり、Ｒ³が各々独立して、Ｃ₆－Ｃ₂₀脂肪族である、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

Ｒ³が各々独立して、Ｃ₈－Ｃ₁₆脂肪族である、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記１つ以上のカチオン性脂質の少なくとも１つが、化合物１であるか、またはそれを含む、請求項７に記載の組成物。

【請求項10】

前記１つ以上のカチオン性脂質の少なくとも１つが、ｃＫＫ－Ｅ１２であるか、またはそれを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

前記１つ以上のカチオン性脂質の少なくとも１つが、ＩＣＥ（イミダゾールコレステロールエステル）であるか、またはそれを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

前記１つ以上のＰＥＧ修飾脂質の少なくとも１つが、Ｃ₆－Ｃ₂₀の鎖長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した最大５ｋＤａの鎖長のポリ（エチレン）グリコール鎖であるか、またはそれを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

前記ナノ粒子が１つ以上のステロールをさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

前記１つ以上のステロールの少なくとも１つがコレステロールベースの脂質を含む、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記コレステロールベースの脂質がコレステロールおよび／またはＰＥＧ化コレステロールである、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

前記ｍＲＮＡが、ペプチドまたはポリペプチドをコードする、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

前記ｍＲＮＡが全身に送達され、翻訳されたペプチドまたはポリペプチドが投与後２４時間以上の時点で肝臓または血清中で検出可能である、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項１６に記載の組成物。

【請求項19】

前記治療用ポリペプチドが、（ａ）抗体軽鎖もしくは抗体重鎖、または（ｂ）前記対象
に存在しないまたは欠乏しているポリペプチドである、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

前記ｍＲＮＡがペプチドをコードする、請求項１６に記載の組成物。

【請求項21】

前記ペプチドが抗原である、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子を調製するための方法であって、
（ａ）１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質、および１つ以上のヘルパー脂質の混合物であって、前記１つ以上のヘルパー脂質の少なくとも１つが、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）を含み、ＤＥＰＥは、該混合物中の総脂質の２５モルパーセント～３５モルパーセントの濃度で存在する混合物を提供することと、
（ｂ）工程（ａ）で提供された前記混合物から脂質ナノ粒子を形成することと、を含み、
前記方法が、前記ｍＲＮＡを前記脂質ナノ粒子に封入することをさらに含み、封入が、工程（ｂ）での前記脂質ナノ粒子の形成前または形成後に行われる、方法。

【請求項23】

前記ｍＲＮＡを封入する前記脂質ナノ粒子が安定している、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記ヘルパー脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、および／またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つを含まない、請求項２２または２３に記載の方法。

【請求項25】

前記混合物中の前記１つ以上のＰＥＧ修飾脂質の少なくとも１つが、Ｃ₆－Ｃ₂₀の鎖長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した最大５ｋＤａの鎖長のポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記混合物が１つ以上のステロールをさらに含む、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記１つ以上のステロールの少なくとも１つがコレステロールベースの脂質を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記コレステロールベースの脂質がコレステロールおよび／またはＰＥＧ化コレステロールである、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記ｍＲＮＡが、治療用ペプチドまたはポリペプチドをコードする、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記ｍＲＮＡが、予め形成された脂質ナノ粒子中に封入される、請求項２２～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記方法が、前記ｍＲＮＡの封入前および／または封入後に、前記脂質ナノ粒子を接線流濾過（ＴＦＦ）に供することをさらに含む、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記方法が、前記脂質ナノ粒子をトレハロース溶液中で製剤化することをさらに含む、請求項２２～３１のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月８日に出願された米国仮出願第６２／８７１，５１３号に対する優先権を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、脂質媒介性ｍＲＮＡ送達、ならびにその脂質化合物およびそのような化合物を含む組成物に関する。特に、本発明は、そのような化合物および組成物の方法および使用、ならびにそのような化合物および組成物を作製するためのプロセスに関する。

【背景技術】

【0003】

メッセンジャーＲＮＡ療法（ＭＲＴ）は、様々な疾患の治療または予防にますます重要なアプローチとなっている。ＭＲＴは、療法を必要とする対象の体内でｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生を提供するために、対象にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与することを伴う。脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡの効率的なインビボ送達のためにｍＲＮＡを封入するために使用され得る。

【0004】

脂質ナノ粒子を使用してｍＲＮＡの細胞内送達および／または発現を強化することができる、新規の方法および組成物の特定に多くの努力がなされており、これは、スケーラブルかつ費用効率の高い製造プロセスに適合され得る。同時に、ｍＲＮＡの細胞内送達および／または発現に対するあらゆるそのような強化はまた、脂質媒介性ｍＲＮＡ送達に関連する組成物の安全性および忍容性を維持または改善することが重要である。

【0005】

１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質、およびｍＲＮＡを封入する１つ以上のヘルパー脂質を含む多成分脂質ナノ粒子は、インビボでｍＲＮＡの送達および発現を達成するのに特に有効であることが見出されている。近年の研究の具体的な焦点は、ｍＲＮＡ送達のための新しいカチオン性脂質の発見である。多成分脂質ナノ粒子の他の成分は、ほとんどまたは全く注目されていない。ｍＲＮＡの細胞内送達および／または発現を達成するために、脂質ナノ粒子のｍＲＮＡ送達を改善する継続的な必要性がある。同時に、新しい脂質ナノ粒子製剤は、安全性および忍容性を維持または改善することが望ましい。

【発明の概要】

【0006】

発明者らは驚くべきことに、ｍＲＮＡを封入する多成分リポソームのヘルパー脂質成分を最適化することによって、インビボでのｍＲＮＡの送達および／または発現が、劇的に改善され得ることを発見した。具体的には、本発明は、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質、および１つ以上のヘルパー脂質を含むｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子製剤中のヘルパー脂質としての１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）の存在が、ヘルパー脂質のうちの１つとしてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む従来のリポソームと比較して、インビボでのｍＲＮＡの送達および／または発現を２倍超増加させることができる。ＤＥＰＥ含有脂質ナノ粒子は、安全性および忍容性（ＡＬＴおよびＡＳＴなどの肝毒性マーカーによって評価される）に関して、同等のＤＯＰＥ含有脂質ナノ粒子であった。

【0007】

したがって、ｍＲＮＡの送達を必要とする対象にそれを行うための脂質ナノ粒子を提供することが本発明の一態様であり、脂質ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質と、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質と、ｍＲＮＡを封入する１つ以上のヘルパー脂質とを含み、１つ以上のヘルパー脂質は、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）を含む。脂質ナノ粒子中のＤＥＰＥは、対象に投与されたときにｍＲＮＡの発現の強化を提供する。

【0008】

本発明の実施形態では、ＤＥＰＥ １，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）は、以下の構造：

【化1】

または以下の構造によって構造的に表される：

【化2】

。

【0009】

本発明の実施形態では、ｍＲＮＡの発現の強化は、異なる１つ以上のヘルパー脂質を含み、かつＤＥＰＥを含まないことを除いて同じ脂質成分および量を有する第２の脂質ナノ粒子由来の同じｍＲＮＡの発現と比較してより高い。ある特定の実施形態では、発現の強化は、第２の脂質ナノ粒子と比較して２倍以上増加する。いくつかの実施形態では、第２の脂質ナノ粒子中の異なる１つ以上のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、および／またはそれらの組み合わせを含む。

【0010】

ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子中のＤＥＰＥは、脂質ナノ粒子中の総脂質の少なくとも０．５モルパーセントの濃度、例えば、０．５モルパーセント～５０モルパーセントの濃度、特に１０モルパーセント～４５モルパーセントの濃度で存在する。より典型的には、脂質ナノ粒子中のＤＥＰＥは、脂質ナノ粒子中の総脂質の２５モルパーセント～３５モルパーセントの濃度で存在する。

【0011】

ある特定の実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、ｃＫＫ－Ｅ１２であるか、またはそれを含む。

【0012】

ある特定の実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、ＩＣＥ（イミダゾールコレステロールエステル）であるか、またはそれを含む。

【0013】

ある特定の実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、以下の式のカチオン性脂質、

【化3】

またはその薬学的に許容される塩であるか、またはそれを含み、
式中、Ｒ^１およびＲ^２が各々独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６脂肪族であり、ｍが各々独立して、１～４の値を有する整数であり、Ａが各々独立して、共有結合またはアリーレンであり、Ｌ^１が各々独立して、エステル、チオエステル、ジスルフィド、または無水物基であり、Ｌ^２が各々独立して、Ｃ_２－Ｃ_１０脂肪族であり、Ｘ^１が各々独立して、ＨまたはＯＨであり、Ｒ^３が各々独立して、Ｃ_６－Ｃ_２０脂肪族である。特定の実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、以下の化合物、

【化4】

またはその薬学的に許容される塩であるか、またはそれを含む。別の実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、以下の化合物、

【化5】

またはその薬学的に許容される塩であるか、またはそれを含む。別の実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、以下の化合物、

【化6】

【0014】

またはその薬学的に許容される塩であるか、またはそれを含む。ある特定の実施形態では、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質は、Ｃ_６－Ｃ_２０の鎖長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した最大５ｋＤａの鎖長のポリ（エチレン）グリコール鎖であるか、またはそれを含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入し、かつヘルパー脂質としてＤＥＰＥを含む脂質ナノ粒子は、Ｃ_６－Ｃ_２０の鎖長のアルキル鎖を含むカチオン性脂質も含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、各々Ｃ_８－Ｃ_１６の鎖長の１～４個のアルキル鎖を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、各々Ｃ_１０－Ｃ_１６の鎖長の１～４個のアルキル鎖を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、各々Ｃ_１０－Ｃ_１４の鎖長の１～４個のアルキル鎖を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、各々Ｃ_１０の鎖長の１～４個のアルキル鎖を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、各々Ｃ_１２の鎖長の１～４個のアルキル鎖を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、各々Ｃ_１６の鎖長の１～４個のアルキル鎖を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入し、かつヘルパー脂質としてＤＥＰＥを含む脂質ナノ粒子は、各々Ｃ_６－Ｃ_２０の鎖長の１～４個の脂肪族鎖を含むカチオン性脂質も含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、各々Ｃ_８－Ｃ_１６の鎖長の１～４個の脂肪族鎖を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、各々Ｃ_１０－Ｃ_１４の鎖長の１～４個の脂肪族鎖を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、各々Ｃ_１０の鎖長の１～４個の脂肪族鎖を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、各々Ｃ_１２の鎖長の１～４個の脂肪族鎖を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、各々Ｃ_１６の鎖長の脂肪族鎖を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入し、かつヘルパー脂質としてＤＥＰＥを含む脂質ナノ粒子は、リピドイドであるか、またはそれを含む１つ以上のカチオン性脂質も含む。いくつかの実施形態では、リピドイドは、４つの脂肪族鎖を含む。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖は各々独立して、Ｃ_６－Ｃ_２０の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖は各々独立して、Ｃ_８－Ｃ_１６の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖は各々独立して、Ｃ_１０－Ｃ_１４の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖は各々独立して、Ｃ_１０またはＣ_１２の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖のすべてが、Ｃ_６の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖のすべてが、Ｃ_８の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖のすべてが、Ｃ_１０の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖のすべてが、Ｃ_１２の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖のすべてが、Ｃ_１４の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖のすべてが、Ｃ_１６の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖のすべてが、Ｃ_１８の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖のすべてが、Ｃ_２０の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖のうちの少なくとも２つが、Ｃ_６の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖のうちの少なくとも２つが、Ｃ_８の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖のうちの少なくとも２つが、Ｃ_１０の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖のうちの少なくとも２つが、Ｃ_１２の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖のうちの少なくとも２つが、Ｃ_１４の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖のうちの少なくとも２つが、Ｃ_１６の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖のうちの少なくとも２つが、Ｃ_１８の鎖長である。いくつかの実施形態では、４つのリピドイド脂肪族鎖のうちの少なくとも２つが、Ｃ_２０の鎖長である。

【0018】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入し、かつヘルパー脂質としてＤＥＰＥを含む脂質ナノ粒子は、Ｃ_６－Ｃ_２０の鎖長のアルキル鎖を含むリピドイドも含む。いくつかの実施形態では、リピドイドは、各々Ｃ_８－Ｃ_１６の鎖長のアルキル鎖を含む。いくつかの実施形態では、リピドイドは、各々Ｃ_１０－Ｃ_１４の鎖長のアルキル鎖を含む。いくつかの実施形態では、リピドイドは、各々Ｃ_１０の鎖長のアルキル鎖を含む。いくつかの実施形態では、リピドイドは、各々Ｃ_１２の鎖長のアルキル鎖を含む。いくつかの実施形態では、リピドイドは、各々Ｃ_１６の鎖長のアルキル鎖を含む。

【0019】

ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、１つ以上のステロールをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のステロールは、コレステロールベースの脂質、例えば、コレステロールまたはＰＥＧ化コレステロールであるか、またはそれを含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、およびｍＲＮＡを封入する１つ以上のコレステロールベースの脂質を含む。例えば、本発明の典型的な実施形態では、脂質ナノ粒子の脂質成分は、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、化合物１、化合物２、または化合物３）、ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、非カチオン性脂質（ＤＥＰＥ）、およびコレステロールベースの脂質（例えば、コレステロール）を含む４つのタイプの脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のカチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロールベースの脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率は、約３０～６０：２５～３５：２０～３０：１～１５であり得る。

【0021】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の脂質成分は、カチオン性脂質（例えば、ＩＣＥ）、ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、および非カチオン性脂質（ＤＥＰＥ）を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率は、約５０～６０：４５～３０：５～１０であり得る。

【0022】

本発明の脂質ナノ粒子によって送達されるｍＲＮＡは、インビボで治療用タンパク質に翻訳されるタンパク質をコードするｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、タンパク質をコードするｍＲＮＡは、ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、抗体軽鎖または抗体重鎖である。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、対象に存在しないまたは欠乏しているポリペプチドである。ある特定の実施形態では、タンパク質をコードするｍＲＮＡは、ペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ペプチドは、抗原である。

【0023】

別の態様では、本発明は、ｍＲＮＡの改善された送達を必要とする対象にそれを行うための方法を提供し、本方法は、対象に、１つ以上のカチオン性脂質と、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質と、１つ以上のヘルパー脂質とを含むｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子を投与することを含み、１つ以上のヘルパー脂質は、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）を含む。脂質ナノ粒子中のＤＥＰＥは、対象に投与されたときにｍＲＮＡの発現の強化を提供する。

【0024】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、インビボで治療用タンパク質またはペプチドに翻訳されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、タンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡは、全身に送達される。いくつかの実施形態では、翻訳されたタンパク質またはペプチドは、投与後６時間以上の時点で肝臓中で検出可能である。いくつかの実施形態では、翻訳されたタンパク質またはペプチドは、投与後１２時間以上の時点で肝臓中で検出可能である。いくつかの実施形態では、翻訳されたタンパク質またはペプチドは、投与後１８時間以上の時点で肝臓中で検出可能である。いくつかの実施形態では、翻訳されたタンパク質またはペプチドは、投与後２４時間以上の時点で肝臓中で検出可能である。いくつかの実施形態では、翻訳されたタンパク質またはペプチドは、投与後３６時間以上の時点で肝臓中で検出可能である。いくつかの実施形態では、翻訳されたタンパク質またはペプチドは、投与後４８時間以上の時点で肝臓中で検出可能である。いくつかの実施形態では、翻訳されたタンパク質またはペプチドは、投与後７２時間以上の時点で肝臓中で検出可能である。いくつかの実施形態では、翻訳されたタンパク質またはペプチドは、投与後６時間以上の時点で血清中で検出可能である。いくつかの実施形態では、翻訳されたタンパク質またはペプチドは、投与後１２時間以上の時点で血清中で検出可能である。いくつかの実施形態では、翻訳されたタンパク質またはペプチドは、投与後１８時間以上の時点で血清中で検出可能である。いくつかの実施形態では、翻訳されたタンパク質またはペプチドは、投与後２４時間以上の時点で血清中で検出可能である。いくつかの実施形態では、翻訳されたタンパク質またはペプチドは、投与後３６時間以上の時点で血清中で検出可能である。いくつかの実施形態では、翻訳されたタンパク質またはペプチドは、投与後４８時間以上の時点で血清中で検出可能である。いくつかの実施形態では、翻訳されたタンパク質またはペプチドは、投与後７２時間以上の時点で肝臓中で検出可能である。

【0025】

さらなる態様では、本発明は、対象における疾患または障害を治療または予防する方法で使用するための、１つ以上のカチオン性脂質と、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質と、１つ以上のヘルパー脂質（１つ以上のヘルパー脂質は、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）を含む）とを含むｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子を提供し、ｍＲＮＡは、対象における疾患または障害を治療または予防するのに好適なペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。関連する態様では、本発明は、対象における疾患または障害を治療または予防するための薬剤の製造における、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子の使用に関し、脂質ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質と、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質と、１つ以上のヘルパー脂質（前述の１つ以上のヘルパー脂質は、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）を含む）とを含み、ｍＲＮＡは、対象における疾患または障害を治療または予防するのに好適なペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。一実施形態では、ｍＲＮＡは、対象に存在しないまたは欠乏しているポリペプチドまたはタンパク質をコードし、疾患または障害は、前述のポリペプチドまたはタンパク質の欠乏である。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、抗体軽鎖または抗体重鎖をコードし、対象は、前述の軽鎖または前述の重鎖を含む抗体を対象に投与することによって治療可能である疾患または障害に罹患している。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードし、前述のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、疾患または障害を治療または予防するために、前述の対象に免疫応答を誘導することができる。

【0026】

発明者らはまた、ＤＥＰＥをヘルパー脂質として使用することで、ＤＯＰＥがヘルパー脂質のうちの１つとして使用される場合に安定したリポソームを形成しない多成分製剤を製剤化することが可能となることも見出した。したがって、なおさらなる態様では、本発明は、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子を調製するための方法を提供し、本方法は、（ａ）１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質、および１つ以上のヘルパー脂質（前述の１つ以上のヘルパー脂質は、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）を含む）の混合物を提供することと、（ｂ）工程（ａ）で提供された混合物から脂質ナノ粒子を形成することとを含み、本方法は、ｍＲＮＡを脂質ナノ粒子に封入することをさらに含み、封入は、工程（ｂ）での脂質ナノ粒子の形成前または形成後に行われ得る。ｍＲＮＡを封入する得られた脂質ナノ粒子は安定している。一実施形態では、本発明に従って脂質ナノ粒子を調製するための方法は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、およびそれらの組み合わせから選択される１つ以上のヘルパー脂質の使用を特に除外する。一実施形態では、ＤＥＰＥは、１０モルパーセント～５０モルパーセントの濃度で混合物中に存在する。一実施形態では、混合物中の１つ以上のＰＥＧ修飾脂質は、Ｃ_６－Ｃ_２０の鎖長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した最大５ｋＤａの鎖長のポリ（エチレン）グリコール鎖を含む。一実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質、および１つ以上のヘルパー脂質の混合物は、コレステロールベースの脂質などの１つ以上のステロールをさらに含む。一実施形態では、コレステロールベースの脂質は、コレステロールおよび／またはＰＥＧ化コレステロールである。一実施形態では、ｍＲＮＡは、治療用ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、予め形成された脂質ナノ粒子に封入される。いくつかの実施形態では、本発明に従って脂質ナノ粒子を調製するための方法は、ｍＲＮＡの封入の前および／または後に、脂質ナノ粒子を接線流濾過（ＴＦＦ）に供することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、トレハロース溶液中で脂質ナノ粒子を製剤化することをさらに含む。

【0027】

いかなる特定の理論によっても束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、ＤＥＰＥ誘導体、特に、変化する脂質鎖長または組成物を有するＤＥＰＥ誘導体が、ＤＥＰＥに関して本明細書に記載されるのと同じ利点を提供すると考えている。便宜上、本発明の前述の要約および詳細な説明は、ＤＥＰＥのみに言及する。しかしながら、ＤＥＰＥの脂質鎖に対するわずかな変化が、その優れた特性に影響を与えないこと、およびそのようなＤＥＰＥ誘導体が、本発明内に明示的に含まれることが理解されるべきである。

【0028】

本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の発明を実施するための形態、図面、および特許請求の範囲において明らかになる。しかしながら、発明を実施するための形態、図面、および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を指しているが、単に例示として与えられるものあり、限定するものでないことを理解されたい。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、当業者には明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】ＤＥＰＥおよび他のヘルパー脂質を含むｍＲＮＡ ＬＮＰにおけるＥＰＯタンパク質発現の例示的なグラフ表示を示す。

【図2】ＤＥＰＥおよび他のヘルパー脂質を含むｍＲＮＡ ＬＮＰについての、血清ＡＬＴおよびＡＳＴの投与後レベルの例示的なグラフ表示を示す。

【発明を実施するための形態】

【0030】

以下の実施形態およびその態様は、範囲を限定するのではなく、例示的であり、かつ説明に役立つよう意図されるシステム、組成物、および方法と併せて記載および図示されている。

【0031】

定義
本発明は、ｍＲＮＡ治療用組成物を生成するための脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤に封入されたｍＲＮＡを製造するための改善されたプロセスを提供する。

【0032】

本発明がより容易に理解されるように、ある特定の用語が最初に以下に定義される。以下の用語および他の用語の追加の定義は、本明細書全体に記載される。

【0033】

アミノ酸：本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、その最も広い意味で、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般構造Ｈ_２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は合成アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸はＤ－アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸はＬ－アミノ酸である。「標準アミノ酸」とは、天然に存在するペプチドに一般に見られる２０個の標準Ｌ－アミノ酸のうちのいずれかを指す。「非標準アミノ酸」とは、それが合成的に調製されるか天然源から得られるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書で使用される場合、「合成アミノ酸」は、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、および／または置換を含むが、これらに限定されない化学的に修飾されたアミノ酸を包含する。ペプチド中のカルボキシ末端アミノ酸および／またはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基、および／またはそれらの活性に悪影響を及ぼすことなくペプチドの循環半減期を変化させることができる他の化学基との置換によって修飾され得る。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与し得る。アミノ酸は、１つ以上の化学的実体（例えば、メチル基、酢酸基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分など）との会合などの１つまたは翻訳後修飾を含み得る。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸および／またはペプチドのアミノ酸残基を指し得る。この用語が遊離アミノ酸を指すか、ペプチドの残基を指すかは、それが使用される文脈から明らかになるであろう。

【0034】

動物：本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」とは、任意の発育段階のヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」とは、任意の発育段階の非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物には、哺乳動物、鳥、爬虫類、両生類、魚、昆虫、および／または寄生虫が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、および／またはクローンであり得る。

【0035】

およそまたは約：本明細書で使用される場合、目的とする１つ以上の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、明記された参照値と同様の値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別途明記されない限り、または別途文脈から明らかでない限り、明記された参照値のいずれかの方向（より大きいかまたは小さい）に、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満に含まれる値の範囲（かかる数が可能な値の１００％を超える場合を除く）を指す。

【0036】

組み合わせること：本明細書で使用される場合、「組み合わせること」という用語は、混合またはブレンドと互換的に使用される。組み合わせることとは、同じ溶液中に、別個の特性を有する離散ＬＮＰ粒子をまとめること、例えば、ｍＲＮＡ－ＬＮＰおよび空のＬＮＰ組成物を組み合わせて、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物を得ることを指す。いくつかの実施形態では、２つのＬＮＰを組み合わせせることは、組み合わせられる成分の特定の比率で実施される。いくつかの実施形態では、組み合わせることから得られた結果として生じる組成物は、その成分のいずれか一方または両方とは異なる特性を有する。

【0037】

送達：本明細書で使用される場合、「送達」という用語は、局所送達および全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされたタンパク質またはペプチドが発現され、標的組織内で保持される状況（「局所分布」または「局所送達」とも称される）、およびｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされたタンパク質またはペプチドが発現され、患者の循環系（例えば、血清）に分泌され、全身に分布し、他の組織によって取り込まれる状況（「全身分布」または「全身送達」とも称される）を包含する。

【0038】

有効性：本明細書で使用される場合、「有効性」という用語、または文法的等価物は、関連するタンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡの送達に関連する、生物学的に関連するエンドポイントの改善を指す。いくつかの実施形態では、生物学的エンドポイントは、投与後のある特定の時点での塩化アンモニウム負荷に対する保護である。

【0039】

封入：本明細書で使用される場合、「封入」という用語、または文法的等価物は、ナノ粒子内に個々のｍＲＮＡ分子を閉じ込めるプロセスを指す。

【0040】

発現：本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡの「発現」は、ペプチド（例えば、抗原）、ポリペプチド、またはタンパク質（例えば、酵素）へのｍＲＮＡの翻訳を指し、また文脈によって示されるように、ペプチド、ポリペプチド、または完全に組み立てられたタンパク質（例えば、酵素）の翻訳後修飾も含み得る。本出願では、「発現」および「産生」という用語、ならびに文法的等価物は、互換的に使用される。

【0041】

改善する、増加する、または低減する：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加する」、もしくは「低減する」という用語、または文法的等価物は、本明細書に記載される治療の開始前の同じ個体における測定値、または本明細書に記載される治療の不在下での対照試料もしくは対象（または複数の対照試料もしくは対象）における測定値などの、ベースライン測定値に対する値を指す。「対照試料」は、試験物品を除き、試験試料と同じ条件に供された試料である。「対照対象」は、治療されている対象と同じ疾患形態に罹患しており、治療されている対象とほぼ同じ年齢である対象である。

【0042】

不純物：本明細書で使用される場合、用語「不純物」は、限定された量の液体、気体、または固体内の物質を指し、これは標的物質または化合物の化学組成とは異なる。不純物は、混入物とも呼ばれる。

【0043】

インビトロ：本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内というよりむしろ、人工環境下で、例えば、試験管または反応容器内、細胞培養下などで生じる事象を指す。

【0044】

インビボ：本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物などの多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞ベースの系の文脈では、この用語は、（例えば、インビトロ系とは対照的に）生きている細胞内で生じる事象を指すために使用され得る。

【0045】

単離された：本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、（１）（自然界および／または実験的環境にかかわらず）最初に産生されたときに会合していた成分のうちの少なくともいくつかから分離しており、かつ／または（２）人工的に産生、調製、および／もしくは製造された物質および／または実体を指す。単離された物質および／または実体は、それらが最初に会合していた他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。本明細書で使用される場合、単離された物質および／または実体の純度パーセントの計算は、賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水など）を含むべきではない。

【0046】

局所分布または局所送達：本明細書において使用される場合、用語「局所分布」、「局所送達」、または文法的等価物は、組織特異的な送達または分布を指す。典型的には、局所分布または局所送達は、ｍＲＮＡによってコードされるペプチドまたはタンパク質（例えば、酵素）が、細胞内でまたは患者の循環系への侵入を回避する限定された分泌物と共に、翻訳および発現されることを必要とする。

【0047】

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも１つのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用されるｍＲＮＡは、修飾されたＲＮＡおよび修飾されていないＲＮＡの両方を包含する。ｍＲＮＡは、１つ以上のコード領域および非コード領域を含有し得る。ｍＲＮＡは、天然供給源から精製され得、組換え発現系を使用して産生され得、任意に、精製、化学合成などが行われ得る。必要に応じて、例えば、化学的に合成された分子の場合、ｍＲＮＡは、化学修飾された塩基または糖、骨格修飾などを有する類似体などのヌクレオシド類似体を含み得る。ｍＲＮＡ配列は、別段指示されない限り、５’から３’の方向に提示される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、プソイドウリジン、および５－メチルシチジン）、化学修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）、介在塩基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ ｂａｓｅ）、修飾された糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、および／もしくは修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホルアミダイト結合）であるか、またはそれを含む。

【0048】

核酸：本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、その最も広範な意味で、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれ得る化合物および／または物質である。いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡ、ならびに一本鎖および／もしくは二本鎖のＤＮＡならびに／またはｃＤＮＡを包含する。さらに、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語、および／または類似の用語は、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル骨格以外を有する類似体を含む。

【0049】

患者：本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、例えば、実験、診断、予防、美容、および／または治療目的のために、提供される組成物が投与され得る任意の生物を指す。典型的な患者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、および／またはヒトなどの哺乳動物）が含まれる。いくつかの実施形態では、患者は、ヒトである。ヒトには、出生前形態および出生後形態が含まれる。

【0050】

薬学的に許容される：本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、炎症刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、合理的なベネフィット／リスクの比率に見合う、ヒトおよび動物の組織と接触した使用に好適な物質を指す。

【0051】

薬学的に許容される塩：薬学的に許容される塩は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：１－１９において薬学的に許容される塩を詳細に記載している。本発明の化合物の薬学的に許容される塩としては、好適な無機酸および有機酸ならびに無機塩基および有機塩基に由来するものが挙げられる。薬学的に許容される非毒性酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸などの無機酸と形成されたアミノ基の塩、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、もしくはマロン酸などの有機酸と形成されたアミノ基の塩、またはイオン交換などの当該技術分野で使用されている他の方法を使用して形成されたアミノ基の塩である。他の薬学的に許容される塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。適切な塩基に由来する塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、およびＮ^＋（Ｃ_１－４アルキル）_４塩が挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどを含む。さらなる薬学的に許容される塩は、適切な場合、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、スルホン酸塩、およびアリールスルホン酸塩などの対イオンを使用して形成された非毒性アンモニウムカチオン、四級アンモニウムカチオン、およびアミンカチオンを含む。さらなる薬学的に許容される塩は、適切な求電子剤、例えば、四級化アルキル化アミノ塩を形成するためのハロゲン化アルキルを使用して、アミンの四級化から形成された塩を含む。

【0052】

効力：本明細書で使用される場合、用語「効力」または文法的等価物は、ｍＲＮＡがコードするタンパク質もしくはペプチドの発現のレベル、および／または得られた生物学的効果を指す。

【0053】

塩：本明細書で使用される場合、用語「塩」は、酸と塩基との間の中和反応から生じるか、または生じ得るイオン化合物を指す。

【0054】

全身分布または全身送達：本明細書で使用される場合、「全身分布」、「全身送達」という用語、または文法的同義語は、全身または生物全体に影響する送達または分布機構またはアプローチを指す。典型的には、全身分布または全身送達は、身体の循環系、例えば、血流を介して成し遂げられる。「局所分布または送達」の定義と比較される。

【0055】

対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を指す。ヒトには、出生前形態および出生後形態が含まれる。多くの実施形態では、対象は、ヒトである。対象は、患者であり得、疾患の診断または治療のために医療提供者を受診するヒトを指す。「対象」という用語は、本明細書で「個体」または「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患または障害に罹患し得るか、またはそれに罹り易いが、疾患または障害の症状を呈する場合も呈さない場合もある。

【0056】

実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的とする特徴または特性の全またはほぼ全範囲または程度を呈する質的状態を指す。生物学分野の当業者であれば、生物学的および化学的現象が、完了すること、および／または完了に至ること、または絶対的結果を達成もしくは回避することが、仮にあったとしてもめったにないことを理解するであろう。したがって、用語「実質的に」は、多くの生物学的および化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために本明細書で使用される。

【0057】

標的組織：本明細書で使用される場合、「標的組織」という用語は、治療される疾患に影響される任意の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的組織には、疾患に関連する病態、症状、または特徴を呈する組織が含まれる。

【0058】

治療指数：本明細書で使用される場合、「治療指数」とは、血液中の薬物が毒性となる濃度、およびそれが有効である濃度の比率である。治療指標が大きいほど、薬剤は安全である。

【0059】

治療すること：本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、または「治療すること」という用語は、特定の疾患、障害、および／もしくは状態の１つ以上の症状もしくは特徴を部分的にまたは完全に緩和する、改善する、軽減する、抑制する、予防する、その発症を遅延させる、その重症度を低減する、および／またはその発生率を低減するために使用される任意の方法を指す。治療は、疾患の兆候を呈せず、かつ／または疾患の初期の兆候のみを呈する対象に、その疾患に関連する病態を発症させるリスクを減少させる目的のために投与され得る。

【0060】

収率：本明細書で使用される場合、用語「収率」は、開始材料としての総ｍＲＮＡと比較して、封入後に回収されたｍＲＮＡのパーセンテージを指す。いくつかの実施形態では、用語「回収」は、用語「収率」と互換的に使用される。

【0061】

脂肪族：本明細書で使用される場合、脂肪族という用語は、Ｃ_１－Ｃ_４０炭化水素を指し、飽和炭化水素および不飽和炭化水素の両方を含む。脂肪族は、直鎖状、分岐状、または環状であり得る。例えば、Ｃ_１－Ｃ_２０脂肪族には、Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル（例えば、直鎖状または分岐状Ｃ_１－Ｃ_２０飽和アルキル）、Ｃ_２－Ｃ_２０アルケニル（例えば、直鎖状または分岐状Ｃ_４－Ｃ_２０ジエニル、直鎖状または分岐状Ｃ_６－Ｃ_２０トリエニル等）、およびＣ_２－Ｃ_２０アルキニル（例えば、直鎖状または分岐状Ｃ_２－Ｃ_２０アルキニル）が含まれ得る。Ｃ_１－Ｃ_２０脂肪族には、Ｃ_３－Ｃ_２０環状脂肪族（例えば、Ｃ_３－Ｃ_２０シクロアルキル、Ｃ_４－Ｃ_２０シクロアルケニル、またはＣ_８－Ｃ_２０シクロアルキニル）が含まれ得る。ある特定の実施形態では、脂肪族は、１つ以上の環状脂肪族および／または１つ以上のヘテロ原子、例えば、酸素、窒素、または硫黄を含み得、任意に、アルキル、ハロ、アルコキシル、ヒドロキシ、アミノ、アリール、エーテル、エステル、またはアミドなどの１つ以上の置換基で置換され得る。脂肪族基は、非置換であるか、または本明細書に記載の１つ以上の置換基で置換されている。例えば、脂肪族は、ハロゲン、－ＣＯＲ’、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２Ｒ’、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＯＲ’、－ＯＣＯＲ’、－ＯＣＯ_２Ｒ’、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ’、－Ｎ（Ｒ’）_２、－ＳＲ’、または－ＳＯ_２Ｒ’のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、または６つの独立して選択される置換基）で置換され得、式中、Ｒ’の各事例が独立して、Ｃ_１－Ｃ_２０脂肪族（例えば、Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１５アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、またはＣ_１－Ｃ_３アルキル）である。複数の実施形態では、Ｒ’は独立して、非置換アルキル（例えば、非置換Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１５アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、またはＣ_１－Ｃ_３アルキル）である。複数の実施形態では、Ｒ’は独立して、非置換Ｃ_１－Ｃ_３アルキルである。複数の実施形態では、脂肪族は、非置換である。複数の実施形態では、脂肪族は、いずれのヘテロ原子も含まない。

【0062】

アルキル：本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、非環状直鎖状および分岐状炭化水素基を意味し、例えば、「Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル」とは、１～２０個の炭素を有するアルキル基を指す。アルキル基は、直鎖状または分岐状であり得る。アルキル基の例には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチルヘキシル、イソヘキシル等が挙げられるが、これらに限定されない。他のアルキル基は、本開示の利益を考慮して、当業者に容易に明らかである。アルキル基は、非置換であり得るか、または本明細書に記載の１つ以上の置換基で置換され得る。例えば、アルキル基は、ハロゲン、－ＣＯＲ’、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２Ｒ’、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＯＲ’、－ＯＣＯＲ’、－ＯＣＯ_２Ｒ’、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ’、－Ｎ（Ｒ’）_２、－ＳＲ’、または－ＳＯ_２Ｒ’のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、または６つの独立して選択される置換基）で置換され得、式中、Ｒ’の各事例が独立して、Ｃ_１－Ｃ_２０脂肪族（例えば、Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１５アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、またはＣ_１－Ｃ_３アルキル）である。複数の実施形態では、Ｒ’は独立して、非置換アルキル（例えば、非置換Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１５アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、またはＣ_１－Ｃ_３アルキル）である。複数の実施形態では、Ｒ’は独立して、非置換Ｃ_１－Ｃ_３アルキルである。複数の実施形態では、アルキルは、（例えば、本明細書に記載の１、２、３、４、５、または６つの置換基で）置換されている。複数の実施形態では、アルキル基は、－ＯＨ基で置換され、本明細書で「ヒドロキシアルキル」基とも称され得、ここで、接頭辞は－ＯＨ基を示し、「アルキル」は本明細書に記載されるとおりである。

【0063】

アルケニル：本明細書で使用される場合、「アルケニル」とは、鎖に沿って任意の安定した点で生じ得る１つ以上の不飽和炭素－炭素二重結合を有する任意の直鎖状または分岐状炭化水素鎖を意味し、例えば、「Ｃ_２－Ｃ_２０アルケニル」とは、２～２０個の炭素を有するアルケニル基を指す。例えば、アルケニル基には、プロプ－２－エニル、ブタ－２－エニル、ブタ－３－エニル、２－メチルプロプ－２－エニル、ヘキサ－２－エニル、ヘキサ－５－エニル、２，３－ジメチルブタ－２－エニル等が含まれる。複数の実施形態では、アルケニルは、１、２、または３つの炭素－炭素二重結合を含む。複数の実施形態では、アルケニルは、単一の炭素－炭素二重結合を含む。複数の実施形態では、複数の二重結合（例えば、２つまたは３つ）が共役している。アルケニル基は、非置換であり得るか、または本明細書に記載の１つ以上の置換基で置換され得る。例えば、アルケニル基は、ハロゲン、－ＣＯＲ’、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２Ｒ’、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＯＲ’、－ＯＣＯＲ’、－ＯＣＯ_２Ｒ’、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ’、－Ｎ（Ｒ’）_２、－ＳＲ’、または－ＳＯ_２Ｒ’のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、または６つの独立して選択される置換基）で置換され得、式中、Ｒ’の各事例が独立して、Ｃ_１－Ｃ_２０脂肪族（例えば、Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１５アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、またはＣ_１－Ｃ_３アルキル）である。複数の実施形態では、Ｒ’は独立して、非置換アルキル（例えば、非置換Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１５アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、またはＣ_１－Ｃ_３アルキル）である。複数の実施形態では、Ｒ’は独立して、非置換Ｃ_１－Ｃ_３アルキルである。複数の実施形態では、アルケニルは、非置換である。複数の実施形態では、アルケニルは、（例えば、本明細書に記載の１、２、３、４、５、または６つの置換基で）置換されている。複数の実施形態では、アルケニル基は、－ＯＨ基で置換され、本明細書で「ヒドロキシアルケニル」基とも称され得、ここで、接頭辞は－ＯＨ基を示し、「アルケニル」は本明細書に記載されるとおりである。

【0064】

アルキニル：本明細書で使用される場合、「アルキニル」とは、鎖に沿って任意の安定した点で生じる１つ以上の炭素－炭素三重結合を有する直鎖状配置または分岐状配置のいずれかの任意の炭化水素鎖を意味し、例えば、「Ｃ_２－Ｃ_２０アルキニル」は、２～２０個の炭素を有するアルキニル基を指す。アルキニル基の例には、プロプ－２－イニル、ブタ－２－イニル、ブタ－３－イニル、ペンタ－２－イニル、３－メチルペンタ－４－イニル、ヘキサ－２－イニル、ヘキサ－５－イニル等が挙げられる。複数の実施形態では、アルキニルは、１つの炭素－炭素三重結合を含む。アルキニル基は、非置換であり得るか、または本明細書に記載の１つ以上の置換基で置換され得る。例えば、アルキニル基は、ハロゲン、－ＣＯＲ’、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２Ｒ’、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＯＲ’、－ＯＣＯＲ’、－ＯＣＯ_２Ｒ’、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ’、－Ｎ（Ｒ’）_２、－ＳＲ’、または－ＳＯ_２Ｒ’のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、または６つの独立して選択される置換基）で置換され得、式中、Ｒ’の各事例が独立して、Ｃ_１－Ｃ_２０脂肪族（例えば、Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１５アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、またはＣ_１－Ｃ_３アルキル）である。複数の実施形態では、Ｒ’は独立して、非置換アルキル（例えば、非置換Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１５アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、またはＣ_１－Ｃ_３アルキル）である。複数の実施形態では、Ｒ’は独立して、非置換Ｃ_１－Ｃ_３アルキルである。複数の実施形態では、アルキニルは、非置換である。複数の実施形態では、アルキニルは、（例えば、本明細書に記載の１、２、３、４、５、または６つの置換基で）置換されている。

【0065】

アリール：「アラルキル」の場合と同様に、単独でまたはより大きい部分の一部として使用される「アリール」という用語は、合計６～１４個の環員を有する単環式、二環式、または三環式炭素環構造を意味し、前述の環構造は、分子の残りと単一の結合点を有し、その系内の少なくとも１つの環は芳香族であり、その系内の各環は４～７個の環員を含む。複数の実施形態では、アリール基は、６個の環炭素原子を有する（「Ｃ_６アリール」、例えば、フェニル）。いくつかの実施形態では、アリール基は、１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ_１０アリール」、例えば、１－ナフチルおよび２－ナフチルなどのナフチル）。いくつかの実施形態では、アリール基は、１４個の環炭素原子を有する（「Ｃ_１４アリール」、例えば、アントラシル（ａｎｔｈｒａｃｙｌ））。「アリール」は環系も含み、この場合において上記に定義されるようにアリール環は１つ以上の炭素環基またはヘテロシクリル基と縮合され、この場合において結合ラジカルまたは結合点はアリール環上にあり、そうした例では、炭素原子数は続いてアリール環系の炭素数を指定する。アリールの例としては、フェニル、ナフチル、およびアントラセンが挙げられる。

【0066】

アリーレン：本明細書において使用される場合、「アリーレン」という用語は、二価のアリール基を指す（すなわち、分子に対し、２つの結合点を有する）。アリーレンの例としては、フェニレン（例えば、非置換フェニレンまたは置換フェニレン）が挙げられる。

【0067】

本発明の組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、ＬＮＰおよびｍＲＮＡを含む組成物を提供し、これは、対象に投与されたとき、対象の耐性またはストレスレベルを変化させることなく、インビボで有意により高レベルのｍＲＮＡ発現を誘導する。耐性またはストレスは、肝酵素アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）および／またはアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の上昇によって決定される。いくつかの実施形態では、特定の製剤は、とりわけ、製造プロセスの容易さ、例えば、共通の予め形成されたＬＮＰストック溶液の利用などの、製造上の利点を提供する。

【0068】

本発明の観察は、工程（ａ）でｍＲＮＡを予め形成された空のＬＮＰと混合することによって形成されたｍＲＮＡ－ＬＮＰが、工程（ｂ）で予め形成されたＬＮＰとさらに組み合わせられて、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物を形成した場合、得られた組成物の効力が、工程（ａ）のｍＲＮＡ－ＬＮＰと比較して大幅に増加することを明らかにした。予め形成されたＬＮＰが空であり（すなわち、ｍＲＮＡを含まない）、ｍＲＮＡ－ＬＮＰと同じ脂質成分を含む場合でも、効力の増加が観察されるため、これは特に注目すべきである。さらに、予め形成されたＬＮＰが、ポリヌクレオチドトランスフェクションの不十分な促進因子であることが知られている中性脂質のみを含む場合でも、ｍＲＮＡコードタンパク質の発現の増加が観察される。

【0069】

したがって、インビボでの忍容性を損なうことなく、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物の効力の増加が達成可能であるという事実は、治療設計の観点から本発明の方法の顕著な利点である。

【0070】

本発明のこの態様は、少なくとも２つの重要な利点を可能にする：（ｉ）１用量当たり、ｍＲＮＡ治療用組成物中のより低い量のｍＲＮＡを提供すること、または投与頻度を減少させて同じ生物学的効果を達成し、それにより、組成物の治療指数を増加させること、および（ｉｉ）１つ以上の予め形成されたＬＮＰがバルクで調製され、本発明に記載される所望の製剤を達成するための複数の混合および組み合わせ工程に利用可能にされ得る、容易、柔軟、拡張可能、かつ／またはハイスループットな製造プロセスを開発すること。

【0071】

本発明は、ｍＲＮＡを予め形成された空のＬＮＰと混合することによって調製されたｍＲＮＡ－ＬＮＰが、予め形成されたＬＮＰとさらに組み合わせられるプロセスを提供し、本発明の得られたｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物は、ｍＲＮＡコードタンパク質のインビボ発現の増加をもたらす。いくつかの態様では、このプロセスは、（ａ）ｍＲＮＡ－ＬＮＰの形成を可能にする条件下で、予め形成された空のＬＮＰをｍＲＮＡと混合することと、（ｂ）工程（ａ）で形成されたｍＲＮＡ－ＬＮＰを予め形成されたＬＮＰと混み合わせ、それにより、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子を含む組成物を製造することとを含む製造プロセスである。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくともカチオン性脂質、非カチオン性脂質、およびＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を有するかまたは有しない、中性脂質を含み得る。

【0072】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、タンパク質またはペプチドをコードする。

【0073】

いくつかの実施形態では、工程（ｂ）で予め形成されたＬＮＰは、空のＬＮＰである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）で予め形成されたＬＮＰは、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）で予め形成されたＬＮＰは、タンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）で予め形成されたＬＮＰは、工程（ａ）で形成されたｍＲＮＡ－ＬＮＰと同じタンパク質またはポリペプチドをコードする同じｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）で予め形成されたＬＮＰは、工程（ａ）で形成されたｍＲＮＡ－ＬＮＰ中とは異なるタンパク質またはポリペプチドをコードする異なるｍＲＮＡを含む。

【0074】

いくつかの実施形態では、工程（ａ）の空のＬＮＰおよび工程（ｂ）で予め形成されたＬＮＰは、別個の不均質な脂質ナノ粒子である。例えば、工程（ａ）の空のＬＮＰは、カチオン性脂質ＨＧＴ－５００３を含んでもよく、工程（ｂ）で予め形成されたＬＮＰは、カチオン性脂質ＩＣＥを含む。別の例では、工程（ａ）の空のＬＮＰは、カチオン性脂質ＩＣＥを含んでもよく、工程（ｂ）で予め形成されたＬＮＰは、カチオン性脂質ＤＯＴＡＰを含む。さらに別の例では、工程（ａ）の空のＬＮＰは、カチオン性脂質ＨＧＴ－４００１を含んでもよく、工程（ｂ）で予め形成されたＬＮＰは、カチオン性脂質ｃｋｋ－Ｅ１２を含む。ＬＮＰに好適な様々な脂質、およびそれらを生成するための方法は、以下のそれぞれのセクションに記載され、ＬＮＰを形成する脂質の任意の組み合わせが本明細書で企図される。

【0075】

一実施形態では、工程（ｂ）で生成されたｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物は、第１の脂質ナノ粒子と第２の脂質ナノ粒子とを含み得、第１の脂質ナノ粒子と第２の脂質ナノ粒子は、同一の脂質組成物を有し、少なくとも一部の第１の脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡを含む。一実施形態では、工程（ｂ）で生成されたｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物は、第１の脂質ナノ粒子と第２の脂質ナノ粒子とを含み得、第１の脂質ナノ粒子と第２の脂質ナノ粒子は、別個の脂質組成物を有する。例えば、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物は、カチオン性脂質ＩＣＥを含む第１の脂質ナノ粒子、およびカチオン性脂質ＤＯＴＡＰを含む第２の脂質ナノ粒子を含んでもよい。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）で生成されたｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物は、カチオン性脂質Ｃ１２－２００を含む第１の脂質ナノ粒子、およびカチオン性脂質ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡを含む第２の脂質ナノ粒子を含んでもよい。したがって、以下のそれぞれのセクションに記載されるＬＮＰを生成するのに好適な様々な脂質の任意の組み合わせが、本明細書で企図される。

【0076】

いくつかの実施形態では、工程（ａ）の空のＬＮＰまたは工程（ｂ）の予め形成されたＬＮＰのいずれかは、カチオン性脂質を含まない。いくつかの実施形態では、空のＬＮＰまたは予め形成されたＬＮＰのいずれかは、中性脂質および／またはＰＥＧ修飾脂質を含む。

【0077】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
本発明はとりわけ、ｍＲＮＡ治療薬のための組成物を提供し、ｍＲＮＡは、インビボでの効率的な細胞取り込みおよびプロセシングのための送達ビヒクルに封入される。本明細書で使用される場合、「送達ビヒクル」、「移入ビヒクル」、「ナノ粒子」という用語、または文法的同義語は、互換的に使用される。送達ビヒクルは、１つ以上の追加の核酸、担体、標的化リガンドもしくは安定化試薬と組み合わせて、または好適な賦形剤と混合されている薬理組成物中で製剤化されてもよい。薬物の製剤化および投与の技術は、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎで知ることができる。特定の送達ビヒクルは、標的細胞への核酸のトランスフェクションを促進するその能力に基づいて選択される。

【0078】

いくつかの実施形態では、好適な送達ビヒクルは、リポソーム送達ビヒクルであり、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）またはリポソームである。いくつかの実施形態では、リポソームは、１つ以上のカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、リポソームは、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、１つ以上のコレステロールベースの脂質、および１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、リポソームは、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、および１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、リポソームは、４つ以下の別個の脂質成分を含む。いくつかの実施形態では、リポソームは、３つ以下の別個の脂質成分を含む。いくつかの実施形態では、１つの別個の脂質成分は、ステロールベースのカチオン性脂質である。典型的な実施形態では、本発明のＬＮＰは、ｍＲＮＡを封入するリポソームである。好適なリポソームの脂質成分は、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、化合物１、化合物２、または化合物３）、非カチオン性脂質（ＤＥＰＥ）、コレステロールベースの脂質（例えば、コレステロール）、およびＰＥＧ修飾脂質（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）を含む。あるいは、好適なリポソームの脂質成分は、ステロールベースのカチオン性脂質（例えば、ＩＣＥ）、非カチオン性脂質（ＤＥＰＥ）、およびＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）を含む。

【0079】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のＤＥＰＥは、ＤＥＰＥ含有脂質ナノ粒子と（脂質成分および個々の脂質成分のモル比に関して）組成物において他の点で同一であるＤＯＰＥ含有脂質ナノ粒子と比較して、タンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡの発現の強化を提供する。いくつかの実施形態では、ＤＥＰＥ含有脂質ナノ粒子によって送達されるｍＲＮＡコードタンパク質の発現は、ＤＯＰＥ含有脂質ナノ粒子と比較して少なくとも２倍強化される。ｍＲＮＡの発現の強化は、例えば尾静脈注射によって、試験動物（例えば、マウス）に、ＤＥＰＥ含有脂質ナノ粒子、および異なるヘルパー脂質（例えば、ＤＯＰＥ）を有する同一に製剤化された脂質ナノ粒子を投与し、１つ以上の時点において（例えば、投与の４、６、８、１２、１８、または２４時間後に）ｍＲＮＡの発現を監視することによって決定され得る。

【0080】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、インビボで治療用タンパク質に翻訳されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、タンパク質をコードするｍＲＮＡは、ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、抗体軽鎖または抗体重鎖である。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、ｍＲＮＡが投与される対象に存在しないまたは欠乏している。いくつかの実施形態では、タンパク質をコードするｍＲＮＡは、ペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ペプチドは、抗原である。

【0081】

いくつかの実施形態では、本発明のＤＥＰＥ含有脂質ナノ粒子は、対象に投与されたときに安全かつ耐容性である。例えば、本発明のＤＥＰＥ含有脂質ナノ粒子は、対象に投与されたときに、いかなる識別可能な肝毒性ももたらさない。肝毒性を評価するための好適なマーカーは、ＡＬＴおよびＡＳＴである。

【0082】

カチオン性脂質
本明細書で使用される場合、語句「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を有する多数の脂質種のうちのいずれかを指す。

【0083】

本発明の組成物および方法に使用するための好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１０／１４４７４０号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル ４－（ジメチルアミノ）ブタノエート：

【化7】

およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0084】

本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１３／１４９１４０号に記載のイオン化可能なカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のうちの１つのカチオン性脂質：

【化8】

またはその薬学的に許容可能な塩を含み、式中、Ｒ_１およびＲ_２が各々独立して、水素、任意に置換される可変飽和または不飽和Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル、および任意に置換される可変飽和または不飽和Ｃ_６－Ｃ_２０アシルからなる群から選択され、Ｌ_１およびＬ_２が各々独立して、水素、任意に置換されるＣ_１－Ｃ_３０アルキル、任意に置換される可変不飽和Ｃ_１－Ｃ_３０アルケニル、および任意に置換されるＣ_１－Ｃ_３０アルキニルからなる群から選択され、ｍおよびｏが各々独立して、ゼロおよび任意の正の整数（例えば、ｍは３）からなる群から選択され、ｎが、ゼロまたは任意の正の整数（例えば、ｎは１）である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する、カチオン性脂質（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－ｌ－イル）テトラコサ－１５，１８－ジエン－１－アミン（「ＨＧＴ５０００」）：

【化9】

およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－４，１５，１８－トリエン－ｌ－アミン（「ＨＧＴ５００１」）：

【化10】

およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質および（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－５，１５，１８－トリエン－１－アミン（「ＨＧＴ５００２」）：

【化11】

およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0085】

本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１０／０５３５７２号にアミノアルコールリピドイドとして記載のカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化12】

およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法で使用されるリピドイドは、市販のアミンをリポフィリカクリレート、アクリルアミド、またはエポキシドと反応させることによって合成される。いくつかの実施形態では、リピドイドは、アミン８６（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン）およびアミン８７（Ｎ－（３－アミノプロピル）ジエタンアミン）に由来する。リピドイドは、核酸送達試薬の潜在的な新しいクラスとしていくつかの利点を有する：（ｉ）リピドイドを合成するために使用される化学が単純かつ経済的である、（ｉｉ）構造多様性のライブラリがすでに開発されている、（ｉｉｉ）送達系の構造と機能との間の相関が、リピドイドのライブラリのスクリーニングから蓄積された大きいデータセットから構築され得る。これらの反応の単純化は、アミンのタイプ、ならびにテール（または炭素アーム鎖）の鎖長およびタイプ（アクリルアミド／アクリレート／エポキシド）を変化させることによって、リピドイドの構造的に多様なライブラリを構築することを可能にした。

【0087】

いくつかの実施形態では、リピドイドは、約２～２０個の炭素アーム鎖を含む。いくつかの実施形態では、リピドイドは、約５～１８個の炭素アーム鎖を含む。いくつかの実施形態では、リピドイドは、約１０～１６個の炭素アーム鎖を含む。いくつかの実施形態では、リピドイドは、約１０～１４個の炭素アーム鎖を含む。いくつかの実施形態では、リピドイドは、約１０～１２個の炭素アーム鎖を含む。いくつかの実施形態では、リピドイドは、約１０個の炭素アーム鎖を含む。いくつかの実施形態では、リピドイドは、約１２個の炭素アーム鎖を含む。いくつかの実施形態では、リピドイドは、約１４個の炭素アーム鎖を含む。いくつかの実施形態では、リピドイドは、約１６個の炭素アーム鎖を含む。

【0088】

本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１６／１１８７２５号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化13】

およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0089】

本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１６／１１８７２４号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化14】

およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0090】

本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、１４，２５－ジトリデシル１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタンの式を有するカチオン性脂質、およびその薬学的に許容される塩が挙げられる。

【0091】

本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１３／０６３４６８号および同第２０１６／２０５６９１号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：

【化15】

またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｒ^Ｌの各事例が独立して、任意に置換されるＣ_６－Ｃ_４０アルケニルである。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化16】

およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化17】

およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化18】

およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化19】

およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0092】

本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１５／１８４２５６号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：

【化20】

またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｘが各々独立して、ＯまたはＳであり、Ｙが各々独立して、ＯまたはＳであり、ｍが各々独立して、０～２０であり、ｎが各々独立して、１～６であり、Ｒ_Ａが各々独立して、水素、任意に置換されるＣ１－５０アルキル、任意に置換されるＣ２－５０アルケニル、任意に置換されるＣ２－５０アルキニル、任意に置換されるＣ３－１０カルボシクリル、任意に置換される３～１４員ヘテロシクリル、任意に置換されるＣ６－１４アリール、任意に置換される５～１４員ヘテロアリールまたはハロゲンであり、Ｒ_Ｂが各々独立して、水素、任意に置換されるＣ１－５０アルキル、任意に置換されるＣ２－５０アルケニル、任意に置換されるＣ２－５０アルキニル、任意に置換されるＣ３－１０カルボシクリル、任意に置換される３～１４員ヘテロシクリル、任意に置換されるＣ６－１４アリール、任意に置換される５～１４員ヘテロアリール、またはハロゲンである。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質、「ターゲット２３」：

【化21】

およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0093】

本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１６／００４２０２号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化22】

またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化23】

またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化24】

またはその薬学的に許容される塩を含む。

【0094】

本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６２／７５８，１７９号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：

【化25】

またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｒ^１およびＲ^２が各々独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６脂肪族であり、ｍが各々独立して、１～４の値を有する整数であり、Ａが各々独立して、共有結合またはアリーレンであり、Ｌ^１が各々独立して、エステル、チオエステル、ジスルフィド、または無水物基であり、Ｌ^２が各々独立して、Ｃ_２－Ｃ_１０脂肪族であり、Ｘ^１が各々独立して、ＨまたはＯＨであり、Ｒ^３が各々独立して、Ｃ_６－Ｃ_２０脂肪族である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：

【化26】

またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：

【化27】

またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：

【化28】

またはその薬学的に許容される塩を含む。

【0095】

本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ．ＭｃＣｌｅｌｌａｎ，Ｍ．Ｃ．Ｋｉｎｇ，Ｃｅｌｌ ２０１０，１４１，２１０－２１７およびＷｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１４）５：４２７７に記載のカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化29】

およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0096】

本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１５／１９９９５２号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化30】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化31】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化32】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化33】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化34】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化35】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化36】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化37】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化38】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化39】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化40】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化41】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化42】

およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0097】

本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１７／００４１４３号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化43】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化44】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化45】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化46】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化47】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化48】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化49】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化50】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化51】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化52】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化53】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化54】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化55】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化56】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化57】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化58】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化59】

およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0098】

本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１７／０７５５３１号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：

【化60】

またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｌ^１またはＬ^２の一方が、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ^１またはＬ^２の他方が、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、もしくは－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、または直接結合であり、Ｇ^１およびＧ^２が各々独立して、非置換Ｃ_１－Ｃ_１２アルキレンまたはＣ_１－Ｃ_１２アルケニレンであり、Ｇ^３が、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキレン、Ｃ_１－Ｃ_２４アルケニレン、Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキレン、Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルケニレンであり、Ｒ^ａが、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^１およびＲ^２が各々独立して、Ｃ_６－Ｃ_２４アルキルまたはＣ_６－Ｃ_２４アルケニルであり、Ｒ^３が、Ｈ、ＯＲ^５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^４、または－ＮＲ^５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^４であり、Ｒ^４が、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^５が、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、ｘが、０、１、または２である。

【0099】

本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１７／１１７５２８号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化61】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化62】

およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化63】

およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0100】

本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１７／０４９２４５号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、以下の式のうちの１つの化合物：

【化64】

ならびにその薬学的に許容される塩を含む。これら４つの式のうちのいずれか１つにおいて、Ｒ_４は、独立して、－（ＣＨ_２）_ｎＱおよび－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲから選択され、Ｑは、－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ_３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、および複素環からなる群から選択され、ｎは、１、２、または３である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化65】

およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化66】

およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化67】

およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化68】

およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0101】

本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１７／１７３０５４号および同第２０１５／０９５３４０号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化69】

およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化70】

およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化71】

およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化72】

およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0102】

本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１２／１７０８８９号に記載の切断可能なカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質を含み、

【化73】

式中、Ｒ_１は、イミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、任意に置換されるアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノなどのアルキルアミノ）、およびピリジルからなる群から選択され、式中、Ｒ_２は、以下の２つの式のうちの１つからなる群から選択され、

【化74】

式中、Ｒ_３およびＲ_４が各々独立して、任意に置換される可変飽和または不飽和Ｃ_６－Ｃ_２０アルキルおよび任意に置換される可変飽和または不飽和Ｃ_６－Ｃ_２０アシルからなる群から選択され、ｎが、０または任意の正の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上）である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００１」：

【化75】

およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００２」：

【化76】

およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００３」：

【化77】

およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００４」：

【化78】

およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００５」：

【化79】

およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0103】

本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、２０１８年５月１６日に出願され、参照により本明細書に組み込まれる、米国仮出願第６２／６７２，１９４号に記載の切断可能なカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、一般式のうちのいずれか、または米国仮出願第６２／６７２，１９４号に記載の構造（１ａ）～（２１ａ）および（１ｂ）～（２１ｂ）ならびに（２２）～（２３７）のうちのいずれかである、カチオン性脂質を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、式（Ｉ’）による構造を有するカチオン性脂質であって、

【化80】

式中、
Ｒ^Ｘが独立して、－Ｈ、－Ｌ^１－Ｒ^１、または－Ｌ^５Ａ－Ｌ^５Ｂ－Ｂ’であり、
Ｌ^１、Ｌ^２、およびＬ^３が各々独立して、共有結合、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^Ｌ－であり、
Ｌ^４ＡおよびＬ^５Ａが各々独立して、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^Ｌ－であり、
Ｌ^４ＢおよびＬ^５Ｂが各々独立して、Ｃ_１－Ｃ_２０アルキレン、Ｃ_２－Ｃ_２０アルケニレン、またはＣ_２－Ｃ_２０アルキニレンであり、
ＢおよびＢ’が各々、ＮＲ^４Ｒ^５または５～１０員窒素含有ヘテロアリールであり、
Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３が各々独立して、Ｃ_６－Ｃ_３０アルキル、Ｃ_６－Ｃ_３０アルケニル、またはＣ_６－Ｃ_３０アルキニルであり、
Ｒ^４およびＲ^５が各々独立して、水素、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、Ｃ_２－Ｃ_１０アルケニル、またはＣ_２－Ｃ_１０アルキニルであり、
Ｒ^Ｌが各々独立して、水素、Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル、Ｃ_２－Ｃ_２０アルケニル、またはＣ_２－Ｃ_２０アルキニルである、カチオン性脂質を含む。
ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する６２／６７２，１９４の化合物（１３９）であるカチオン性脂質を含む：

【化81】

【0104】

いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、カチオン性脂質、Ｎ－［ｌ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）を含む。（参照により本明細書に援用される、（Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号）。本発明の組成物および方法のために好適な他のカチオン性脂質は、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎｅｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ）（「ＤＯＧＳ」）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパンアミニウム（「ＤＯＳＰＡ」）（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）；米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、ｌ，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、ｌ，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）を含む。

【0105】

本発明の組成物および方法に好適な追加の例示的なカチオン性脂質はまた、ｌ，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＳＤＭＡ」）；１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＯＤＭＡ」）、１，２－ジリノレイロキシオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＬｉｎＤＭＡ」）、ｌ，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＬｅｎＤＭＡ」）、Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）、Ｎ－（ｌ，２－ジミリチルチルオキシプロップ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－ｌ－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエンオキシ）プロパン（「ＣＬｉｎＤＭＡ」）；２－［５’－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチｌ－ｌ－（シス，シス－９’，ｌ－２’－オクタデカジエンオキシ）プロパン（「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」）；Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（「ＤＭＯＢＡ」）；１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」）；２，３－ジリノレオイロイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピルアミン（「ＤＬｉｎＤＡＰ」）、ｌ，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」）；ｌ，２－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」）；２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［ｌ，３］－ジオキソラン（「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ」）；２－（（８－［（３Ｐ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ」）；（２Ｒ）－２－（（８－［（３ベータ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）」）；（２Ｓ）－２－（（８－［（３Ｐ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ、ｆｓｌ－ジメチ３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）」）；２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［ｌ，３］－ジオキソラン（「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ」）、および２－（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，ｌ２－ジエン－１－イル）－ｌ，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン（「ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ」）を含む（本明細書に参照によって援用される国際公開第２０１０／０４２８７７号参照；Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２－１７６（２０１０））。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６－２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３－１００７（２００５）；国際特許公開第２００５／１２１３４８号）。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質のうちの１つ以上は、イミダゾール部分、ジアルキルアミノ部分、またはグアニジニウム部分のうちの少なくとも１つを含む。

【0106】

いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法に好適な１つ以上のカチオン性脂質としては、２，２－ジリノレイ１－４－ジメチルアミノエチ１－［１，３］－ジオキソラン（「ＸＴＣ」）、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（「ＡＬＮＹ－１００」）、および／または４，７，１３－トリス（３－オキソ－３－（ウンデシルアミノ）プロピル）－Ｎ１，Ｎ１６－ジウンデシル－４，７，１０，１３－テトラアザヘキサデカン－１，１６－ジアミド（「ＮＣ９８－５」）が挙げられる。

【0107】

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子の重量で測定して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する１つ以上のカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子のモル％で測定して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する１つ以上のカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子の重量で測定して、約３０～７０％（例えば、約３０～６５％、約３０～６０％、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する１つ以上のカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子のモル％で測定して、約３０～７０％（例えば、約３０～６５％、約３０～６０％、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する１つ以上のカチオン性脂質を含む

【0108】

いくつかの実施形態では、ステロール系カチオン性脂質が、本明細書に記載のカチオン性脂質の代わりに、または本明細書に記載のカチオン性脂質に加えて使用されてもよい。好適なステロール系カチオン性脂質は、ジアルキルアミノ含有ステロール系カチオン性脂質、イミダゾール含有ステロール系カチオン性脂質、およびグアニジニウム含有ステロール系カチオン性脂質である。例えば、ある特定の実施形態は、イミダゾールを含む１つ以上のステロール系カチオン性脂質、例えば、以下の構造（Ｉ）により示される、イミダゾールコレステロールエステルまたは「ＩＣＥ」脂質（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル ３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエートを含む、組成物を対象とする。ある特定の実施形態では、機能性タンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の送達のための脂質ナノ粒子は、１つ以上のイミダゾール系カチオン性脂質、例えば、以下の構造により示される、イミダゾールコレステロールエステルまたは「ＩＣＥ」脂質（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル ３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエートを含み得る。

【化82】

【0109】

いくつかの実施形態では、リポソーム中のカチオン性脂質の割合は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、または７０％超であり得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、リポソームの約３０～５０重量％（例えば、約３０～４５重量％、約３０～４０重量％、約３５～５０重量％、約３５～４５重量％、または約３５～４０重量％）を構成する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ＩＣＥ脂質）は、モル比でリポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％を構成する。

【0110】

非カチオン性脂質
本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という語句は、本明細書において「ヘルパー脂質」とも称される、任意の中性脂質、両性イオン性脂質、またはアニオン性脂質を指す。本明細書で使用される場合、語句「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の負電荷を運ぶ多数の脂質種のいずれかを指す。

【0111】

本発明は、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）を含む１つ以上の非カチオン性ヘルパー脂質を含む、ｍＲＮＡ－ＬＮＰに関する。いくつかの実施形態では、ＤＥＰＥは、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ中の唯一の非カチオン性ヘルパー脂質である。他の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰのヘルパー脂質部分は、ＤＥＰＥおよびコレステロールを含む。

【0112】

いかなる特定の理論によっても束縛されることを望むものではないが、その脂質鎖長または組成においてＤＥＰＥとは異なる特定のＤＥＰＥ誘導体も、本発明内に含まれる。例えば、本発明者らは、１０～２０の炭素鎖長のアルキル鎖またはアルケン鎖が、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの形成に特に好適であることを見出した。いくつかの実施形態では、１６～２０の炭素鎖長のアルキル鎖またはアルケン鎖を有するＤＥＰＥ誘導体が特に好ましい。あるいは、例えば１０、１２、または１４個の炭素を有するものなど、１０～１４の炭素鎖長のアルキル鎖またはアルケン鎖を有するＤＥＰＥ誘導体が本発明の実施に特に好適であり得る。

【0113】

ｍＲＮＡ－ＬＮＰに含まれ得る他の非カチオン性脂質またはヘルパー脂質としては、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、ガングリオシド、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0114】

いくつかの実施形態では、こうした非カチオン性脂質は、単独で使用され得るが、好ましくは他の脂質、例えば、カチオン性脂質と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、リポソームに存在する総脂質の約５％～約９０％、または約１０％～約７０％のモル比を含み得る。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、中性脂質、すなわち、組成物が製剤化および／または投与される条件下で正味の電荷を保有しない脂質である。いくつかの実施形態では、リポソーム中の非カチオン性脂質の割合は、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、または４０％超であり得る。

【0115】

コレステロールベースの脂質
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、リポソーム組成物）は、１つ以上のコレステロールベースの脂質を含む。例えば、本発明を実施するための好適なコレステロールベースの脂質は、コレステロールである。他の好適なコレステロールベースの脂質としては、例えば、ＤＣ－Ｃｈｏｌ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキシアミドコレステロール）、１，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）、Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３，１３９（１９９７）、米国特許第５，７４４，３３５号）、またはイミダゾールコレステロールエステル（ＩＣＥ）が挙げられる。

【0116】

いくつかの実施形態では、コレステロールベースの脂質は、リポソーム中に存在する総脂質の約１％～約３０％、または約５％～約２０％のモル比（モル％）で存在し得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のコレステロールベースの脂質のパーセンテージは、約５モル％超、約１０モル％超、約２０モル％超、約３０モル％超、または約４０モル％超であり得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のコレステロールベースの脂質のパーセンテージは、約５モル％以下、約１０モル％以下、約２０モル％以下、約３０モル％以下、または約４０モル％以下であり得る。

【0117】

いくつかの実施形態では、コレステロールベースの脂質は、リポソーム中に存在する総脂質の約１％～約３０％、または約５％～約２０％の重量比（重量％）で存在し得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のコレステロールベースの脂質のパーセンテージは、約５重量％超、約１０重量％超、約２０重量％超、約３０重量％超、または約４０重量％超であり得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のコレステロールベースの脂質のパーセンテージは、約５重量％以下、約１０重量％以下、約２０重量％以下、約３０重量％以下、または約４０重量％以下であり得る。

【0118】

ＰＥＧ化脂質
いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、本明細書においてＰＥＧ修飾脂質とも称される１つ以上のＰＥＧ化脂質を含む。本発明を実施するのに好適なＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化脂質は、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）である。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質、およびＮ－オクタノイル－スフィンゴシン－ｌ－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）－２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ－２０００セラミド）を含む誘導体化セラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）などの誘導体化脂質の使用も、本発明によって企図される。企図されるＰＥＧ修飾脂質は、Ｃ_６－Ｃ_２０の鎖長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した最大２ｋＤａ、最大３ｋＤａ、最大４ｋＤａ、または最大５ｋＤａの鎖長のポリエチレングリコール鎖を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ－２Ｋである。いくつかの実施形態では、特に有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ_１４またはＣ_１８）を有するＰＥＧセラミドである。こうした成分の付加は、複合体の凝集を阻止することができ、また循環寿命を増加させ、脂質－核酸組成物の標的組織への送達を増加させるための手段を提供することができる（Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５－２３７）。あるいは、これらの成分はインビボで製剤の外へと速やかに交換されるように選択され得る（米国特許第５，８８５，６１３号を参照のこと）。特定の有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ_１４またはＣ_１８）を有するＰＥＧ－セラミドである。本発明のＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化された脂質は、リポソーム移入ビヒクルに存在する総脂質の約０％～約２０％、約０．５％～約２０％、約１％～約１５％、約４％～約１０％、または約２％のモル比を含み得る。

【0119】

ＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化脂質は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の約０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、または５％以下を構成し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、重量またはモル濃度で、好適な脂質溶液中の総脂質の約５％以下を構成し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、重量またはモル濃度で、好適な脂質溶液中の総脂質の約４％以下を構成し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、典型的には、重量またはモル濃度で、好適な脂質溶液中の総脂質の３％以下を構成する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、典型的には、重量またはモル濃度で、好適な脂質溶液中の総脂質の２％以下を構成する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、典型的には、重量またはモル濃度で、好適な脂質溶液中の総脂質の１％以下を構成する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、重量またはモル濃度で、好適な脂質溶液中の総脂質の約１～５％、約１～４％、約１～３％、または約１～２％を構成する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、重量またはモル濃度で、好適な脂質溶液中の総脂質の０．０１－３％（例えば、約０．０１～２．５％、０．０１～２％、０．０１～１．５％、０．０１～１％）を構成する。

【0120】

モル脂質比
様々な実施形態によれば、脂質ナノ粒子を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および／またはＰＥＧ修飾脂質の選択、ならびにかかる脂質の互いに対する相対モル割合の選択は、選択される脂質の特徴、対象とする標的細胞の性質、送達されるｍＲＮＡの特徴に基づく。さらなる考慮すべき事項には、例えば、アルキル鎖の飽和度、ならびに選択された脂質のサイズ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、融合性、および忍容性が含まれる。したがって、モル比はそれらに応じて調節され得る。

【0121】

予め形成された脂質ナノ粒子を調製するために使用され得、かつそれらに含まれる脂質、すなわち、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、および任意にコレステロールの様々な組み合わせが、文献および本明細書に記載される。例えば、好適な脂質溶液は、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＤＥＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、Ｃ１２－２００、ＤＥＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、ＨＧＴ５０００、ＤＥＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、ＨＧＴ５００１、ＤＥＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＤＰＰＣ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、Ｃ１２－２００、ＤＰＰＣ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、ＨＧＴ５０００、ＤＰＰＣ、ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、ＨＧＴ５００１、ＤＰＰＣ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、またはＩＣＥ、ＤＥＰＥ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含有し得る。脂質のさらなる組み合わせは、当該技術分野、例えば、「Ｎｏｖｅｌ ＩＣＥ－ｂａｓｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍＲＮＡ」と題する、ＷＯ ２０１８／０８９７９０として公開された、２０１７年１１月１０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１７／６１１００、「ＰｏｌｙＡｎｉｏｎｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」と題する、ＷＯ ２０１８／１６５２５７として公開された、２０１８年３月７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１８／２１２９２、「Ｐｏｌｙ （Ｐｈｏｓｐｈｏｅｓｔｅｒｓ） ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」と題する、２０１８年６月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１８／３６９２０、「Ｔｈｉｏｅｓｔｅｒ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ」と題する、２０１８年５月２４日に出願された米国仮出願第６２／６７６，１４７号、「Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ａ Ｓｔｅｒｏｉｄａｌ Ｍｏｉｅｔｙ」と題する、２０１８年５月３０日に出願された米国仮出願第６２／６７７，８２１号、「Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ」と題する、２０１８年５月３０日に出願された米国仮出願第６２／６７７，８０９号、「Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ」と題する、２０１８年５月３０日に出願された米国仮出願第６２／６７７，８１８号、「Ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ」と題する、２０１８年５月３０日に出願された米国仮出願第６２／６７７，８２８号、「Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ」と題する、２０１８年５月３０日に出願された米国仮出願第６２／６７７，８５１号、「Ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ」と題する、２０１８年５月３０日に出願された米国仮出願第６２／６７７，８５５号に記載され、それらの開示は、参照によりそれらの完全な範囲が本明細書に含まれる。

【0122】

様々な実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、化合物１、化合物２、もしくは化合物３、Ｃ１２－２００、ＩＣＥ、および／またはＨＧＴ４００３）は、モル比でリポソームの約３０～６０％（例えば、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、化合物１、化合物２、もしくは化合物３、Ｃ１２－２００、ＩＣＥ、および／またはＨＧＴ４００３）の割合は、モル比でリポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、または約６０％以上である。

【0123】

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロールベースの脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率は、それぞれ、約３０～６０：２５～３５：２０～３０：１～１５であり得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロールベースの脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率は、それぞれ、およそ４０：３０：２０：１０である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロールベースの脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率は、それぞれ、およそ４０：３０：２５：５である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロールベースの脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率は、それぞれ、およそ４０：３２：２５：３である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロールベースの脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率は、およそ５０：２５：２０：５である。いくつかの実施形態では、ステロール脂質：非カチオン性脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率は、５０：４５：５である。いくつかの実施形態では、ステロール脂質：非カチオン性脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率は、５０：４０：１０である。いくつかの実施形態では、ステロール脂質：非カチオン性脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率は、５５：４０：５である。いくつかの実施形態では、ステロール脂質：非カチオン性脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率は、５５：３５：１０である。いくつかの実施形態では、ステロール脂質：非カチオン性脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率は、６０：３５：５である。いくつかの実施形態では、ステロール脂質：非カチオン性脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率は、６０：３０：１０である。

【0124】

いくつかの実施形態では、本発明に好適なリポソームは、ＩＣＥとＤＥＰＥとを、１：１超のＩＣＥ：ＤＥＰＥのモル比で含む。いくつかの実施形態では、ＩＣＥ：ＤＥＰＥのモル比は、２．５：１未満である。いくつかの実施形態では、ＩＣＥ：ＤＥＰＥのモル比は、１：１～２．５：１である。いくつかの実施形態では、ＩＣＥ：ＤＥＰＥのモル比は、およそ１．５：１である。いくつかの実施形態では、ＩＣＥ：ＤＥＰＥのモル比は、およそ１．７：１である。いくつかの実施形態では、ＩＣＥ：ＤＥＰＥのモル比は、およそ２：１である。いくつかの実施形態では、本発明に好適なリポソームは、ＩＣＥとＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋとを、１０：１超のＩＣＥ：ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋのモル比で含む。いくつかの実施形態では、ＩＣＥ：ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋのモル比は、１６：１未満である。いくつかの実施形態では、ＩＣＥ：ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋのモル比は、およそ１２：１である。いくつかの実施形態では、ＩＣＥ：ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋのモル比は、およそ１４：１である。いくつかの実施形態では、本発明に好適なリポソームは、ＤＥＰＥとＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋとを、５：１超のＤＥＰＥ：ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋのモル比で含む。いくつかの実施形態では、ＤＥＰＥ：ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋのモル比は、１１：１未満である。いくつかの実施形態では、ＤＥＰＥ：ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋのモル比は、およそ７：１である。いくつかの実施形態では、ＤＥＰＥ：ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋのモル比は、およそ１０：１である。

【0125】

いくつかの実施形態では、本発明に好適なリポソームは、ＩＣＥと、ＤＥＰＥと、ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋとを、５０：４５：５のＩＣＥ：ＤＥＰＥ：ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋのモル比で含む。いくつかの実施形態では、本発明に好適なリポソームは、ＩＣＥと、ＤＥＰＥと、ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋとを、５０：４０：１０のＩＣＥ：ＤＥＰＥ：ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋのモル比で含む。いくつかの実施形態では、本発明に好適なリポソームは、ＩＣＥと、ＤＥＰＥと、ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋとを、５５：４０：５のＩＣＥ：ＤＥＰＥ：ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋのモル比で含む。いくつかの実施形態では、本発明に好適なリポソームは、ＩＣＥと、ＤＥＰＥと、ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋとを、５５：３５：１０のＩＣＥ：ＤＥＰＥ：ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋのモル比で含む。いくつかの実施形態では、本発明に好適なリポソームは、ＩＣＥと、ＤＥＰＥと、ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋとを、６０：３５：５のＩＣＥ：ＤＥＰＥ：ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋのモル比で含む。いくつかの実施形態では、本発明に好適なリポソームは、ＩＣＥと、ＤＥＰＥと、ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋとを、６０：３０：１０のＩＣＥ：ＤＥＰＥ：ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋのモル比で含む。

【0126】

ポリマー
いくつかの実施形態では、好適な送達ビヒクルは、担体としてポリマーを使用して、単独でまたは本明細書に記載される様々な脂質を含む他の担体と組み合わせて製剤化される。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるリポソーム送達ビヒクルは、ポリマーを含むナノ粒子も包含する。好適なポリマーとして、例えば、ポリアクリレート類、ポリアルキシアノアクリレート類、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー類、ポリカプロラクトン類、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン類、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化ＰＬＬ、およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が挙げられ得る。ＰＥＩを含む場合、ＰＥＩは１０～４０ｋＤａの範囲の分子量を有する分岐状ＰＥＩ、例えば、２５ｋＤａの分岐状ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ＃４０８７２７）であり得る。

【0127】

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
本発明は、任意のｍＲＮＡを封入するために使用され得る。ｍＲＮＡは、典型的には、ＤＮＡからリボソームに情報を運ぶＲＮＡの種類と考えられている。典型的には、真核生物において、ｍＲＮＡプロセシングは、５’末端上に「キャップ」を、３’末端上に「尾部」を付加することを含む。典型的なキャップは、７－メチルグアノシンキャップであり、これは、最初に転写されたヌクレオチドへの５’－５’－三リン酸結合を介して連結されたグアノシンである。キャップの存在は、大半の真核細胞に見られるヌクレアーゼへの耐性を提供するのに重要である。尾部の付加は、典型的にはポリアデニル化事象であり、これによりポリアデニリル部分がｍＲＮＡ分子の３’末端に付加される。この「尾部」の存在は、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護する役割を果たす。メッセンジャーＲＮＡは、タンパク質を構成する一連のアミノ酸にリボソームによって翻訳される。

【0128】

ｍＲＮＡは、様々な既知の方法のうちのいずれかによって合成され得る。例えば、本発明によるｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成され得る。簡潔には、ＩＶＴは、典型的には、プロモーター、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含み得る緩衝系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮａｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ、および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を含有する線状もしくは環状ＤＮＡ鋳型を用いて実施される。正確な条件は、具体的な用途によって変動するであろう。

【0129】

いくつかの実施形態では、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ合成中に使用された様々な酵素および他の試薬を含む望ましくない不純物を除去するために、製剤および封入前に精製され得る。

【0130】

本発明を使用して、様々な長さのｍＲＮＡを製剤および封入し得る。いくつかの実施形態では、本発明を使用して、長さ約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ ６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、または２０ｋｂ以上のインビトロで合成されたｍＲＮＡを製剤および封入し得る。いくつかの実施形態では、本発明を使用して、長さ約１～２０ｋｂ、約１～１５ｋｂ、約１～１０ｋｂ、約５～２０ｋｂ、約５～１５ｋｂ、約５～１２ｋｂ、約５～１０ｋｂ、約８～２０ｋｂ、または約８～１５ｋｂの範囲のインビトロで合成されたｍＲＮＡを製剤および封入し得る。

【0131】

本発明を使用して、修飾されていないｍＲＮＡ、または典型的に安定性を強化する１つ以上の修飾を含むｍＲＮＡを製剤および封入し得る。いくつかの実施形態では、修飾は、修飾ヌクレオチド、修飾糖リン酸骨格、ならびに５’および／または３’非翻訳領域から選択される。

【0132】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの修飾は、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含み得る。本発明による修飾されたｍＲＮＡは、例えば、骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、プリン類（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））もしくはピリミジン類（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））を含むがこれらに限定されない、天然に存在するヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体（修飾ヌクレオチド）、ならびに、例えば、１－メチルアデニン、２－メチルアデニン、２－メチルチオ－Ｎ－６－イソペンテニル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデニン、Ｎ６－イソペンテニル－アデニン、２－チオ－シトシン、３－メチル－シトシン、４－アセチル－シトシン、５－メチル－シトシン、２，６－ジアミノプリン、１－メチル－グアニン、２－メチル－グアニン、２，２－ジメチル－グアニン、７－メチル－グアニン、イノシン、１－メチル－イノシン、シュードウラシル（５－ウラシル）、ジヒドロウラシル、２－チオ－ウラシル、４－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－ウラシル、５－フルオロ－ウラシル、５－ブロモ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル、５－メチル－２－チオ－ウラシル、５－メチル－ウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチルアミノメチル－ウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５’－メトキシカルボニルメチル－ウラシル、５－メトキシ－ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、１－メチル－シュードウラシル、ケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ベータ－Ｄ－マンノシル－ケオシン、ワイブトキソシン、ならびにホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７－デアザグアノシン、５－メチルシトシン、シュードウリジン、５－メチルシチジン、およびイノシンなどの、プリン類およびピリミジン類の修飾ヌクレオチド類似体または誘導体として合成され得る。そのような類似体の調製は、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号、および同第５，７００，６４２号から当業者に既知であり、その開示は、参照によりその全範囲が本明細書に含まれる。

【0133】

典型的には、ｍＲＮＡ合成は、５’末端上に「キャップ」を、３’末端上に「尾部」を付加することを含む。キャップの存在は、大半の真核細胞に見られるヌクレアーゼへの耐性を提供するのに重要である。「尾部」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護する役割を果たす。

【0134】

したがって、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には、以下のように付加される。最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが、５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの１つを除去し、２つの末端リン酸を残す。次いで、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）が、グアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加され、５’５’５三リン酸結合をもたらす。次いで、グアニンの７－窒素が、メチルトランスフェラーゼによってメチル化される。２’－Ｏ－メチル化はまた、７－メチルグアノシン三リン酸残基の後の第１の塩基および／または第２の塩基で生じ得る。キャップ構造の例としては、ｍ７ＧｐｐｐＮｐ－ＲＮＡ、ｍ７ＧｐｐｐＮｍｐ－ＲＮＡ、およびｍ７ＧｐｐｐＮｍｐＮｍｐ－ＲＮＡ（式中、ｍは、２’－Ｏメチル残基を指す）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0135】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’および／または３’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす１つ以上の要素、例えば、鉄応答性要素を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、約５０～５００ヌクレオチド長であり得る。

【0136】

いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞におけるｍＲＮＡの位置安定性に影響するタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの１つ以上の結合部位のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、５０～５００ヌクレオチド長以上であり得る。

【0137】

インビトロ転写反応からもたらされたｍＲＮＡが、いくつかの実施形態で望ましい場合があるが、細菌、真菌、植物、および／または動物から産生されたｍＲＮＡを含むｍＲＮＡの他の供給源が、本発明の範囲内であることが企図されている。

【0138】

本発明は、多様なタンパク質をコードするｍＲＮＡを製剤および封入するために使用され得る。本発明に好適なｍＲＮＡの非限定的な例としては、脊髄運動ニューロン１（ＳＭＮ）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、嚢胞性線維症膜貫通型コンダクタンス受容体（ＣＦＴＲ）およびホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）をコードするｍＲＮＡが挙げられる。本明細書に開示される例示的なｍＲＮＡ配列を以下に挙げる：

【0139】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形成
ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子を調製するための方法も提供され、本方法は、（ａ）１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質、および１つ以上のヘルパー脂質（前述の１つ以上のヘルパー脂質は、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）を含む）の混合物を提供することと、（ｂ）工程（ａ）で提供された混合物から脂質ナノ粒子を形成することとを含み、本方法は、ｍＲＮＡを脂質ナノ粒子に封入することをさらに含み、封入は、工程（ｂ）での脂質ナノ粒子の形成前または形成後に行われ得る。ｍＲＮＡを封入する得られた脂質ナノ粒子は、安定している（例えば、凍結融解の前および後でｍＲＮＡの同じ封入を維持するか、または凍結融解の前および後でｍＲＮＡの同じ封入の１０％以内を維持する）。一実施形態では、本発明に従って脂質ナノ粒子を調製するための方法は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、およびそれらの組み合わせから選択される１つ以上のヘルパー脂質の使用を特に除外する。

【0140】

様々な封入プロセスが、公開済みの米国特許出願第２０１１／０２４４０２６号、公開済みの米国特許出願第２０１６／００３８４３２号、公開済みの米国特許出願第２０１８／０１５３８２２号、公開済みの米国特許出願第２０１８／０１２５９８９号、および２０１９年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／８７７，５９７号に記載され、本発明を実施するために使用され得、それらのすべてが参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、プロセスＡとは、ＵＳ ２０１６／００３８４３２に記載されるように、最初に脂質を脂質ナノ粒子へと予め形成することなく、ｍＲＮＡを脂質の混合物と混合することによってｍＲＮＡを封入する従来的な方法を指す。本明細書で使用される場合、プロセスＢまたは「再混合」は、ＵＳ ２０１８／０１５３８２２に記載されるように、予め形成された脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと混合することによって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入するプロセスを指す。「ステップダウン再混合」または「ステップアップ再混合」は、米国仮特許出願第６３／０２１，３１９号に記載されるように、「再混合」プロセスを基礎とする改善されたプロセスである。「ステップダウン再混合」は、予め形成された空の脂質ナノ粒子の懸濁液を、順次添加されるｍＲＮＡの溶液のバッチと混合することを伴う。ｍＲＮＡ溶液バッチの各添加は、カチオン性脂質：ｍＲＮＡ（「Ｎ／Ｐ」）の異なるモル比（高いＮ／Ｐ比から始まる）を有する中間体混合物をもたらし、最終製剤中でより低いＮ／Ｐ比まで減少する。「ステップアップ再混合」では、カチオン性脂質：ｍＲＮＡの等モル比から始まって、予め形成された空の脂質ナノ粒子の懸濁液がｍＲＮＡ溶液にバッチで添加される。例えば、４（カチオン性脂質）：１（ｍＲＮＡ）の比に達するまで、４つのバッチの予め形成された空の脂質ナノ粒子が添加される。

【0141】

一実施形態では、ＤＥＰＥは、１０モルパーセント～５０モルパーセントの濃度で混合物中に存在する。より典型的には、混合物中のＤＥＰＥは、混合物中の総脂質の２５モルパーセント～３５モルパーセントの濃度で存在する。一実施形態では、混合物中の１つ以上のＰＥＧ修飾脂質は、Ｃ_６－Ｃ_２０の鎖長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した最大５ｋＤａの鎖長のポリ（エチレン）グリコール鎖を含む。一実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質、および１つ以上のヘルパー脂質の混合物は、コレステロールベースの脂質などの１つ以上のステロールをさらに含む。一実施形態では、コレステロールベースの脂質は、コレステロールおよび／またはＰＥＧ化コレステロールである。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質：ヘルパー脂質：コレステロールベースの脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率は、それぞれ、約３０～６０：２５～３５：２０～３０：１～１５であり得る。

【0142】

いくつかの実施形態では、空の予め形成された脂質ナノ粒子は、エタノール中に溶解した脂質を水溶液と混合することによって形成される（脂質溶液）。いくつかの実施形態では、脂質は、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、および１つ以上のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質は、１つ以上のコレステロール脂質も含む。いくつかの実施形態では、脂質は、エタノールストック溶液中に存在する。予め形成された脂質ナノ粒子は、それらの脂質の混合によって形成される。一般に、いくつかの実施形態では、溶解した脂質を含有する脂質溶液および水性または緩衝溶液は、脂質がｍＲＮＡなしのナノ粒子（すなわち、空の予め形成された脂質ナノ粒子）を形成することができるように、溶液に混合される。

【0143】

脂質溶液
本発明によれば、脂質溶液は、ｍＲＮＡの封入のために脂質ナノ粒子を形成するのに好適な脂質の混合物を含有する。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液はエタノール系である。例えば、好適な脂質溶液は、純エタノール（すなわち、１００％エタノール）に溶解された所望の脂質の混合物を含有してもよい。別の実施形態では、好適な脂質溶液はイソプロピルアルコール系である。別の実施形態では、好適な脂質溶液はジメチルスルホキシド系である。別の実施形態では、好適な脂質溶液は、エタノール、イソプロピルアルコール、およびジメチルスルホキシドを含むがこれらに限定されない好適な溶媒の混合物である。

【0144】

好適な脂質溶液は、様々な濃度で所望の脂質の混合物を含有してもよい。例えば、好適な脂質溶液は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０２ｍｇ／ｍＬ、０．０３ｍｇ／ｍＬ、０．０４ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、０．０７ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ、０．０９ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ、６．０ｍｇ／ｍＬ、７．０ｍｇ／ｍＬ、８．０ｍｇ／ｍＬ、９．０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、または１００ｍｇ／ｍＬの総濃度の所望の脂質の混合物を含有してもよい。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、約０．１～１００ｍｇ／ｍＬ、０．５～９０ｍｇ／ｍＬ、１．０～８０ｍｇ／ｍＬ、１．０～７０ｍｇ／ｍＬ、１．０～６０ｍｇ／ｍＬ、１．０～５０ｍｇ／ｍＬ、１．０～４０ｍｇ／ｍＬ、１．０～３０ｍｇ／ｍＬ、１．０～２０ｍｇ／ｍＬ、１．０～１５ｍｇ／ｍＬ、１．０～１０ｍｇ／ｍＬ、１．０～９ｍｇ／ｍＬ、１．０～８ｍｇ／ｍＬ、１．０～７ｍｇ／ｍＬ、１．０～６ｍｇ／ｍＬ、または１．０～５ｍｇ／ｍＬの範囲の総濃度の所望の脂質を含有してもよい。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、最高約１００ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、または１０ｍｇ／ｍＬの総濃度の所望の脂質の混合物を含有してもよい。

【0145】

任意の所望の脂質は、ｍＲＮＡの封入に好適な任意の比率で混合され得る。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、カチオン性脂質、ヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質および／もしくはコレステロール脂質）ならびに／またはＰＥＧ化脂質を含む所望の脂質の混合物を含有する。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上のヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質および／またはコレステロール脂質）ならびに１つ以上のＰＥＧ化脂質を含む所望の脂質の混合物を含有する。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、１つ以上の中性脂質、１つ以上のヘルパー脂質、および１つ以上のＰＥＧ化脂質を含む所望の脂質の混合物を含有する。

【0146】

いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子製剤を作製する際に使用される空の（すなわち、ｍＲＮＡのない）予め形成された脂質ナノ粒子製剤は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％トレハロース溶液中に安定して凍結され得る。いくつかの実施形態では、空の脂質ナノ粒子にｍＲＮＡを添加すると、下流の精製または処理を必要としない最終製剤が得られ、凍結形態で安定的に保存され得る。

【0147】

ｍＲＮＡ－ＬＮＰの形成
本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡ装填脂質ナノ粒子（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）の形成のためのプロセスは、「ｍＲＮＡ封入化」という用語またはその文法的変形と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、ｍＲＮＡ溶液を脂質ナノ粒子と混合することによって形成され、ｍＲＮＡ溶液および／または脂質溶液は、混合前に周囲温度よりも高い所定温度に加熱される（２０１５年７月２日に出願された「Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ」と題する米国特許出願公開第１４／７９０，５６２号、および２０１４年７月２日に出願された米国仮特許出願第６２／０２０，１６３号を参照されたく、これらの開示は、それらの全体が本明細書に組み込まれる）。

【0148】

典型的には、任意の所望の脂質が、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの形成に好適な任意の比率で混合され得る。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、カチオン性脂質、ヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質および／もしくはコレステロール脂質）ならびに／またはＰＥＧ化脂質を含む所望の脂質の混合物を含有する。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上のヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質および／またはコレステロール脂質）ならびに１つ以上のＰＥＧ化脂質を含む所望の脂質の混合物を含有する。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、１つ以上の中性脂質、１つ以上のヘルパー脂質、および１つ以上のＰＥＧ化脂質を含む所望の脂質の混合物を含有する。

【0149】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液および予め形成された脂質ナノ粒子溶液は、ｍＲＮＡが脂質ナノ粒子に封入されるように、溶液に混合される。こうした溶液は、製剤または封入溶液とも呼ばれる。予め形成された脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと混合することによってｍＲＮＡを封入するためのプロセスは、ＷＯ２０１８／０８９８０１として公開され、かつ米国特許出願第１５／８０９，６８号と同時に出願された、２０１７年１１月１０日にＰＣＴ／ＵＳ１７／６１１１３として出願された以前の発明にすでに記載されており、両方とも、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｍＲＮＡ－Ｌｏａｄｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」と題されている。その出願の内容全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。

【0150】

好適な製剤または封入溶液は、エタノールなどの溶媒を含む。例えば、好適な製剤または封入溶液は、約１０％エタノール、約１５％エタノール、約２０％エタノール、約２５％エタノール、約３０％エタノール、約３５％エタノール、または約４０％エタノールを含む。いくつかの実施形態では、好適な製剤または封入溶液は、イソプロピルアルコールなどの溶媒を含む。例えば、好適な製剤または封入溶液は、約１０％イソプロピルアルコール、約１５％イソプロピルアルコール、約２０％イソプロピルアルコール、約２５％イソプロピルアルコール、約３０％イソプロピルアルコール、約３５％イソプロピルアルコール、または約４０％イソプロピルアルコールを含む。

【0151】

いくつかの実施形態では、好適な製剤または封入溶液は、ジメチルスルホキシドなどの溶媒を含む。例えば、好適な製剤または封入溶液は、約１０％ジメチルスルホキシド、約１５％ジメチルスルホキシド、約２０％ジメチルスルホキシド、約２５％ジメチルスルホキシド、約３０％ジメチルスルホキシド、約３５％ジメチルスルホキシド、または約４０％ジメチルスルホキシドを含む。

【0152】

いくつかの実施形態では、好適な製剤または封入溶液は、緩衝剤または塩も含み得る。例示的な緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびリン酸ナトリウムを含み得る。例示的な塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カリウムを含み得る。いくつかの実施形態では、この新規のナノ粒子製剤を作製する際に使用される空の予め形成された脂質ナノ粒子製剤は、１０％トレハロース溶液中で安定して凍結され得る。

【0153】

いくつかの実施形態では、エタノール、クエン酸緩衝液、および他の不安定化剤は、ｍＲＮＡの添加中に存在せず、そのため製剤は、いかなるさらなる下流処理も必要としない。いくつかの実施形態では、この新規のプロセスによって調製される脂質ナノ粒子製剤は、トレハロース溶液中に予め形成された脂質ナノ粒子を含む。不安定化剤の欠如およびトレヘロース溶液の安定性は、製剤のスケールアップおよびｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子の生成の容易さを増加させる。

【0154】

ｍＲＮＡ溶液
ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが脂質ナノ粒子に封入され得るように、脂質溶液と混合されるべき溶液中で提供され得る。好適なｍＲＮＡ溶液は、１ｍｇ／ｍＬ未満の様々な濃度で封入されるべきｍＲＮＡを含有する任意の水溶液であり得る。例えば、好適なｍＲＮＡ溶液は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０２ｍｇ／ｍＬ、０．０３ｍｇ／ｍＬ、０．０４ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、０．０７ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ、０．０９ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．１５ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、または１．０ｍｇ／ｍＬの濃度またはそれ未満でｍＲＮＡを含有してもよい。

【0155】

典型的には、好適なｍＲＮＡ溶液は、緩衝剤および／または塩も含み得る。一般に、緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびリン酸ナトリウムを含み得る。いくつかの実施形態では、緩衝剤の好適な濃度は、約０．１ｍＭ～１００ｍＭ、０．５ｍＭ～９０ｍＭ、１．０ｍＭ～８０ｍＭ、２ｍＭ～７０ｍＭ、３ｍＭ～６０ｍＭ、４ｍＭ～５０ｍＭ、５ｍＭ～４０ｍＭ、６ｍＭ～３０ｍＭ、７ｍＭ～２０ｍＭ、８ｍＭ～１５ｍＭ、または９～１２ｍＭの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、緩衝剤の好適な濃度は、約０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、または５０ｍＭ以上である。

【0156】

例示的な塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カリウムを含み得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中の塩の好適な濃度は、約１ｍＭ～５００ｍＭ、５ｍＭ～４００ｍＭ、１０ｍＭ～３５０ｍＭ、１５ｍＭ～３００ｍＭ、２０ｍＭ～２５０ｍＭ、３０ｍＭ～２００ｍＭ、４０ｍＭ～１９０ｍＭ、５０ｍＭ～１８０ｍＭ、５０ｍＭ～１７０ｍＭ、５０ｍＭ～１６０ｍＭ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ、または５０ｍＭ～１００ｍＭの範囲であり得る。好適なｍＲＮＡ溶液中の塩濃度は、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または１００ｍＭ以上である。

【0157】

いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ溶液は、約３．５～６．５、３．５～６．０、３．５～５．５、３．５～５．０、３．５～４．５、４．０～５．５、４．０～５．０、４．０～４．９、４．０～４．８、４．０～４．７、４．０～４．６、または４．０～４．５の範囲のｐＨを有してもよい。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ溶液は、約３．５、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．１、６．３、および６．５以下のｐＨを有してもよい。

【0158】

本発明に好適なｍＲＮＡ溶液を調製するために、様々な方法を使用してもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、本明細書に記載される緩衝溶液中に直接溶解されてもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、封入のために脂質溶液と混合する前に、ｍＲＮＡストック溶液を緩衝溶液と混合することにより生成され得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、封入のために脂質溶液と混合する直前に、ｍＲＮＡストック溶液を緩衝溶液と混合することにより生成され得る。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡストック溶液は、約０．２ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．２ｍｇ／ｍＬ、１．４ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、または１．６ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍｇ／ｍＬ、４．５ｍｇ／ｍＬ、または５．０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で水中にｍＲＮＡを含有してもよい。

【0159】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、ポンプを使用して緩衝液と混合される。例示的ポンプとしては、ギアポンプ、蠕動ポンプ、および遠心ポンプが挙げられるがこれらに限定されない。

【0160】

典型的には、緩衝溶液は、ｍＲＮＡストック溶液のものよりも速い速度で混合される。例えば、緩衝溶液は、ｍＲＮＡストック溶液の速度よりも少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍または２０倍の速度で混合されてもよい。いくつかの実施形態では、本発明に従うプロセスは、クエン酸緩衝液をｍＲＮＡストック溶液と混合することによってｍＲＮＡ溶液を最初に生成する工程を含む。ある特定の実施形態では、好適なクエン酸緩衝液は、約１０Ｍｍのクエン酸塩、約１５０ＭｍのＮａＣｌ、約４．５のｐＨを含む。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡストック溶液は、約１ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、または約１００ｍｇ／ｍＬ以上の濃度でｍＲＮＡを含有する。

【0161】

いくつかの実施形態では、クエン酸緩衝液は、約１００～３００ｍＬ／分、３００～６００ｍＬ／分、６００～１２００ｍＬ／分、１２００～２４００ｍＬ／分、２４００～３６００ｍＬ／分、３６００～４８００ｍＬ／分、または４８００～６０００ｍＬ／分の範囲の流量で混合される。いくつかの実施形態では、クエン酸緩衝液は、約２２０ｍＬ／分、約６００ｍＬ／分、約１２００ｍＬ／分、約２４００ｍＬ／分、約３６００ｍＬ／分、約４８００ｍＬ／分、または約６０００ｍＬ／分の流量で混合される。

【0162】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約１０～３０ｍＬ／分、約３０～６０ｍＬ／分、約６０～１２０ｍＬ／分、約１２０～２４０ｍＬ／分、約２４０～３６０ｍＬ／分、約３６０～４８０ｍＬ／分、または約４８０～６００ｍＬ／分の範囲の流量で混合される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約２０ｍＬ／分、約４０ｍＬ／分、約６０ｍＬ／分、約８０ｍＬ／分、約１００ｍＬ／分、約２００ｍＬ／分、約３００ｍＬ／分、約４００ｍＬ／分、約５００ｍＬ／分、または約６００ｍＬ／分の流量で混合される。

【0163】

いくつかの実施形態では、緩衝溶液は、約１００～６０００ｍＬ／分（例えば、約１００～３００ｍＬ／分、３００～６００ｍＬ／分、６００～１２００ｍＬ／分、１２００～２４００ｍＬ／分、２４００～３６００ｍＬ／分、３６００～４８００ｍＬ／分、４８００～６０００ｍＬ／分、または６０～４２０ｍＬ／分）の流量で混合される。いくつかの実施形態では、緩衝溶液は、約６０ｍＬ／分、１００ｍＬ／分、１４０ｍＬ／分、１８０ｍＬ／分、２２０ｍＬ／分、２６０ｍＬ／分、３００ｍＬ／分、３４０ｍＬ／分、３８０ｍＬ／分、４２０ｍＬ／分、４８０ｍＬ／分、５４０ｍＬ／分、６００ｍＬ／分、１２００ｍＬ／分、２４００ｍＬ／分、３６００ｍＬ／分、４８００ｍＬ／分、または６０００ｍＬ／分以上の流量で混合される。

【0164】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約１０～６００ｍＬ／分（例えば、約５～５０ｍＬ／分、約１０～３０ｍＬ／分、約３０～６０ｍＬ／分、約６０～１２０ｍＬ／分、約１２０～２４０ｍＬ／分、約２４０～３６０ｍＬ／分、約３６０～４８０ｍＬ／分、または約４８０～６００ｍＬ／分）の範囲の流量で混合される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約５ｍＬ／分、１０ｍＬ／分、１５ｍＬ／分、２０ｍＬ／分、２５ｍＬ／分、３０ｍＬ／分、３５ｍＬ／分、４０ｍＬ／分、４５ｍＬ／分、５０ｍＬ／分、６０ｍＬ／分、８０ｍＬ／分、１００ｍＬ／分、２００ｍＬ／分、３００ｍＬ／分、４００ｍＬ／分、５００ｍＬ／分、または６００ｍＬ／分以上の流量で混合される。

【0165】

いくつかの実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子およびｍＲＮＡは、ポンプシステムを使用して混合される。いくつかの実施形態では、ポンプシステムは、パルスレスフローポンプを含む。いくつかの実施形態では、ポンプシステムは、ギアポンプである。いくつかの実施形態では、好適なポンプは、蠕動ポンプである。いくつかの実施形態では、好適なポンプは、遠心ポンプである。いくつかの実施形態では、ポンプシステムを使用するプロセスは、大規模で実施される。例えば、いくつかの実施形態では、プロセスは、本明細書に記載されるポンプを使用して、少なくとも約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、または１０００ｍｇのｍＲＮＡの溶液を、予め形成された脂質ナノ粒子の溶液と混合して、脂質ナノ粒子に封入されたｍＲＮＡを生成することを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを予め形成された脂質ナノ粒子と混合するプロセスは、少なくとも約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、または１０００ｍｇの封入されたｍＲＮＡを含有する、本発明による組成物を提供する。

【0166】

いくつかの実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液は、約２５～７５ｍＬ／分、約７５～２００ｍＬ／分、約２００～３５０ｍＬ／分、約３５０～５００ｍＬ／分、約５００～６５０ｍＬ／分、約６５０～８５０ｍＬ／分、または約８５０～１０００ｍＬ／分の範囲の流量で混合される。いくつかの実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液は、約５０ｍＬ／分、約１００ｍＬ／分、約１５０ｍＬ／分、約２００ｍＬ／分、約２５０ｍＬ／分、約３００ｍＬ／分、約３５０ｍＬ／分、約４００ｍＬ／分、約４５０ｍＬ／分、約５００ｍＬ／分、約５５０ｍＬ／分、約６００ｍＬ／分、約６５０ｍＬ／分、約７００ｍＬ／分、約７５０ｍＬ／分、約８００ｍＬ／分、約８５０ｍＬ／分、約９００ｍＬ／分、約９５０ｍＬ／分、または約１０００ｍＬ／分の流量で混合される。

【0167】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、約２５～７５ｍＬ／分、約７５～２００ｍＬ／分、約２００～３５０ｍＬ／分、約３５０～５００ｍＬ／分、約５００～６５０ｍＬ／分、約６５０～８５０ｍＬ／分、または約８５０～１０００ｍＬ／分の範囲の流量で、溶液中で混合される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、約５０ｍＬ／分、約１００ｍＬ／分、約１５０ｍＬ／分、約２００ｍＬ／分、約２５０ｍＬ／分、約３００ｍＬ／分、約３５０ｍＬ／分、約４００ｍＬ／分、約４５０ｍＬ／分、約５００ｍＬ／分、約５５０ｍＬ／分、約６００ｍＬ／分、約６５０ｍＬ／分、約７００ｍＬ／分、約７５０ｍＬ／分、約８００ｍＬ／分、約８５０ｍＬ／分、約９００ｍＬ／分、約９５０ｍＬ／分、または約１０００ｍＬ／分の流量で、溶液中で混合される。

【0168】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子を、予め形成された脂質粒子と組み合わせる工程は、ポンプシステムを使用して実施される。そのような組み合わせは、ポンプを使用して実施され得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子は、予め形成された脂質ナノ粒子と混合され、約２５～７５ｍＬ／分ｍＲＮＡ、約７５～２００ｍＬ／分、約２００～３５０ｍＬ／分、約３５０～５００ｍＬ／分、約５００～６５０ｍＬ／分、約６５０～８５０ｍＬ／分、または約８５０～１０００ｍＬ／分の範囲の流量で混合される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、約５０ｍＬ／分、約１００ｍＬ／分、約１５０ｍＬ／分、約２００ｍＬ／分、約２５０ｍＬ／分、約３００ｍＬ／分、約３５０ｍＬ／分、約４００ｍＬ／分、約４５０ｍＬ／分、約５００ｍＬ／分、約５５０ｍＬ／分、約６００ｍＬ／分、約６５０ｍＬ／分、約７００ｍＬ／分、約７５０ｍＬ／分、約８００ｍＬ／分、約８５０ｍＬ／分、約９００ｍＬ／分、約９５０ｍＬ／分、または約１０００ｍＬ／分の流量で、溶液中で混合される。

【0169】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子およびｍＲＮＡの混合は、ポンプなしで実施される。

【0170】

いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、１つ以上の溶液を周囲温度よりも高い温度に加熱する（またはその温度に維持する）（すなわち、熱源からの熱を溶液に適用する）工程を含み、１つ以上の溶液は、予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液、ｍＲＮＡを含む溶液、および脂質ナノ粒子により封入されたｍＲＮＡを含む混合溶液である。いくつかの実施形態では、プロセスは、混合工程の前に、ｍＲＮＡ溶液および予め形成された脂質ナノ粒子溶液の一方または両方を加熱する工程を含む。いくつかの実施形態では、プロセスは、混合工程中、予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液、ｍＲＮＡを含む溶液、および脂質ナノ粒子により封入されたｍＲＮＡを含む溶液のうちの１つ以上１つ以上を加熱することを含む。いくつかの実施形態では、プロセスは、混合工程の後、脂質ナノ粒子により封入されたｍＲＮＡを加熱する工程を含む。いくつかの実施形態では、溶液の１つ以上が加熱される（または溶液の１つ以上が維持される）温度は、約３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、もしくは７０℃であるか、またはそれより高い。いくつかの実施形態では、溶液の１つ以上が加熱される温度は、約２５～７０℃、約３０～７０℃、約３５～７０℃、約４０～７０℃、約４５～７０℃、約５０～７０℃、または約６０～７０℃の範囲である。いくつかの実施形態では、溶液の１つ以上が加熱される周囲温度よりも高い温度は、約６５℃である。

【0171】

いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液、ｍＲＮＡを含む溶液、および脂質ナノ粒子により封入されたｍＲＮＡを含む混合溶液のうちの１つ以上を周囲温度で維持する（すなわち、熱源からの熱を溶液に適用しない）ことを含む。いくつかの実施形態では、プロセスは、混合工程の前に、ｍＲＮＡ溶液および予め形成された脂質ナノ粒子溶液の一方または両方を周囲温度で維持する工程を含む。いくつかの実施形態では、プロセスは、混合工程中に、予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液、ｍＲＮＡを含む溶液、および脂質ナノ粒子により封入されたｍＲＮＡを含む溶液の１つ以上１つ以上を周囲温度で維持することを含む。いくつかの実施形態では、プロセスは、混合工程の後、脂質ナノ粒子により封入されたｍＲＮＡを周囲温度で維持する工程を含む。いくつかの実施形態では、溶液のうちの１つ以上が維持される周囲温度は、約３５℃、３０℃、２５℃、２０℃、または１６℃以下である。いくつかの実施形態では、溶液のうちの１つ以上が維持される周囲温度は、約１５～３５℃、約１５～３０℃、約１５～２５℃、約１５～２０℃、約２０～３５℃、約２５～３５℃、約３０～３５℃、約２０～３０℃、約２５～３０℃、または約２０～２５℃の範囲である。いくつかの実施形態では、溶液のうちの１つ以上が維持される周囲温度は、２０～２５℃である。

【0172】

いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液およびｍＲＮＡを含む溶液を混合して、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子を形成する工程を周囲温度で実施することを含む。

【0173】

いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％は、サイズ約１５０ｎｍ未満（例えば、約１４５ｎｍ未満、約１４０ｎｍ未満、約１３５ｎｍ未満、約１３０ｎｍ未満、約１２５ｎｍ未満、約１２０ｎｍ未満、約１１５ｎｍ未満、約１１０ｎｍ未満、約１０５ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約９５ｎｍ未満、約９０ｎｍ未満、約８５ｎｍ未満、約８０ｎｍ未満、約７５ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満、約６５ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５５ｎｍ、または約５０ｎｍ）を有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的にすべては、１５０ｎｍ未満（例えば、約１４５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、または約５０ｎｍ）のサイズを有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％より多くは、５０～１５０ｎｍの範囲のサイズを有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的にすべては、５０～１５０ｎｍの範囲のサイズを有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％より多くは、８０～１５０ｎｍの範囲のサイズを有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的にすべては、８０～１５０ｎｍの範囲のサイズを有する。

【0174】

いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える封入率をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明に従うプロセスは、ｍＲＮＡの６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える回収をもたらす。

【0175】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と２０：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、または１：２０の比率で組み合わせられる。脂質ナノ粒子を組み合わせるプロセスは、脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと混合することについての上述のとおりである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と２０：１の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と１９：１の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と１５：１の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と１０：１の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と９：１の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と８：１の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と７：１の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と６：１の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と５：１の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と４：１の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と３：１の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と２：１の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と１：１の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と１：２の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と１：３の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と１：４の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と１：５の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と１：６の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と１：７の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と１：８の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と１：９の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と１：１０の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と１：１２の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と１：１５の比率で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、プロセスの工程（ｂ）で予め形成された脂質粒子と１：２０の比率で組み合わせられる。

【0176】

精製
いくつかの実施形態では、空の予め形成された脂質ナノ粒子またはｍＲＮＡ－ＬＮＰは、精製および／または濃縮される。様々な精製方法を使用してもよい。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、接線流濾過（ＴＦＦ）プロセスによって精製される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、重力ベースの全量濾過（ＮＦＦ）によって精製される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、任意の他の好適な濾過プロセスによって精製される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、遠心分離によって精製される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、クロマトグラフィー方法によって精製される。

【0177】

医薬製剤および治療的使用
ｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む組成物は、例えば、ＰＢＳなどの所望の緩衝液中で製剤化されてもよい。

【0178】

本発明によるプロセスは、より高い効力および有効性のｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物をもたらし、それにより、より低い用量を可能にし、それにより、治療指数を正の方向にシフトさせる。いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、小さい粒径（例えば、１５０ｎｍ未満）を有する均質なｍＲＮＡ－ＬＮＰをもたらす。

【0179】

したがって、本発明は、本明細書に記載されるｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物中の精製されたナノ粒子の大部分、すなわち、精製されたナノ粒子の約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超は、約１５０ｎｍ未満（例えば、約１４５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、または約８０ｎｍ）のサイズを有する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの実質的にすべてが、約１５０ｎｍ未満（例えば、約１４５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、または約８０ｎｍ）のサイズを有する。１００ｎｍ未満のサイズを有する脂質ナノ粒子は、肝臓の小孔を通って浸透し、肝細胞へのアクセスを得ることができるため、特に好適である。同様に、約１００ｎｍ以下のサイズを有する脂質ナノ粒子は、容易に噴霧され、噴霧を使用して対象に投与されたときに肺内に深く浸透することができる。

【0180】

さらに、細い粒径範囲を有するより均質なナノ粒子が、本発明のプロセスによって達成される。例えば、本発明によって提供される組成物中のナノ粒子の約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超が、約７５～１５０ｎｍ（例えば、約７５～１４５ｎｍ、約７５～１４０ｎｍ、約７５～１３５ｎｍ、約７５～１３０ｎｍ、約７５～１２５ｎｍ、約７５～１２０ｎｍ、約７５～１１５ｎｍ、約７５～１１０ｎｍ、約７５～１０５ｎｍ、約７５～１００ｎｍ、約７５～９５ｎｍ、約７５～９０ｎｍ、または７５～８５ｎｍ）の範囲のサイズを有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的にすべてが、約７５～１５０ｎｍ（例えば、約７５～１４５ｎｍ、約７５～１４０ｎｍ、約７５～１３５ｎｍ、約７５～１３０ｎｍ、約７５～１２５ｎｍ、約７５～１２０ｎｍ、約７５～１１５ｎｍ、約７５～１１０ｎｍ、約７５～１０５ｎｍ、約７５～１００ｎｍ、約７５～９５ｎｍ、約７５～９０ｎｍ、または７５～８５ｎｍ）の範囲のサイズを有する。

【0181】

いくつかの実施形態では、本発明により提供される組成物中のナノ粒子の、分子のサイズの分散性、または分子のサイズの不均一性の測定値（ＰＤＩ）は、約０．２３未満（例えば、約０．２３、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．１０、０．０９、または０．０８未満）である。特定の実施形態では、ＰＤＩは約０．１６未満である。

【0182】

いくつかの実施形態では、本発明による組成物には、少なくとも約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、または１０００ｍｇの封入されたｍＲＮＡが含まれる。いくつかの実施形態では、本発明に従うプロセスは、ｍＲＮＡの６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える回収をもたらす。

【0183】

いくつかの実施形態では、本発明の組成物中のｍＲＮＡは、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の完全性を保持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１００％の完全性を有する。

【0184】

いくつかの実施形態では、本発明による組成物は、特定の用量の組成物を対象に投与するために製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の組成物は、約５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ、または５ｍｇ／ｋｇ未満のｍＲＮＡ（すなわち、４ｍｇ／ｋｇ未満のｍＲＮＡ、３ｍｇ／ｋｇ未満、２ｍｇ／ｋｇ未満、１．０ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．０１６ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、および０．０１６ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ）の用量濃度で製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の組成物は、４ｍｇ／ｋｇ未満のｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の用量濃度で製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の組成物は、３ｍｇ／ｋｇ未満のｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の用量濃度で製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の組成物は、２ｍｇ／ｋｇ未満のｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の用量濃度で製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の組成物は、１ｍｇ／ｋｇ未満のｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の用量濃度で製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の組成物は、０．６ｍｇ／ｋｇ未満のｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の用量濃度で製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の組成物は、０．５ｍｇ／ｋｇ未満のｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の用量濃度で製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の組成物は、０．３ｍｇ／ｋｇ未満のｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の用量濃度で製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の組成物は、０．２ｍｇ／ｋｇ未満のｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の用量濃度で製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の組成物は、０．１ｍｇ／ｋｇ未満のｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の用量濃度で製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の組成物は、０．０．０８ｍｇ／ｋｇ未満のｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の用量濃度で製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の組成物は、０．０６ｍｇ／ｋｇ未満のｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の用量濃度で製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の組成物は、０．０．０５ｍｇ／ｋｇ未満のｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の用量濃度で製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の組成物は、０．０１ｍｇ／ｋｇ未満のｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の用量濃度で製剤化される。

【0185】

ある特定の実施形態では、治療効果をもたらすために必要なｍＲＮＡの量は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％、または９９％低減される。ある特定の実施形態では、治療効果をもたらすために必要なポリヌクレオチドの量は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍、または２５倍以上低減される。

【0186】

したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、ヒト対象への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡを含む治療用組成物は、対象の肺または肺細胞における送達に使用される。ある特定の実施形態では、本発明は、対象に欠乏し得るまたは非機能性であり得る内因性タンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、対象に欠乏し得るまたは非機能性であり得る内因性タンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0187】

ある特定の実施形態では、本発明は、対象の肺または肺細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、ＣＦＴＲをコードするｍＲＮＡを製造するための方法において有用である。ＣＦＴＲ ｍＲＮＡは、嚢胞性線維症を治療するための治療用組成物として、必要とする対象の肺に送達される。

【0188】

ある特定の実施形態では、本発明は、対象の肝臓または肝臓細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。そのようなペプチドおよびポリペプチドとしては、尿素サイクル障害に関連するもの、リソソーム貯蔵障害に関連するもの、グリコーゲン貯蔵障害に関連するもの、アミノ酸代謝障害に関連するもの、脂質代謝もしくは線維性障害に関連するもの、メチルマロン酸血症に関連するもの、または濃縮された全長ｍＲＮＡの肝臓もしくは肝臓細胞への送達もしくはそれを用いた治療が治療上の利益を提供する任意の他の代謝性障害に関連するものを挙げることができる。

【0189】

ある特定の実施形態では、本発明は、尿素サイクル障害に関連するタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルギニノコハク酸シンテターゼ１タンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、カルバモイルリン酸シンテターゼＩタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルギニノコハク酸リアーゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルギナーゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0190】

ある特定の実施形態では、本発明は、リソソーム貯蔵障害に関連するタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルファガラクトシダーゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グルコセレブロシダーゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、イズロン酸－２－スルファターゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、イズロニダーゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ｎ－アセチル－アルファ－Ｄ－グルコサミニダーゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヘパランＮ－スルファターゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ガラクトサミン－６スルファターゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ベータ－ガラクトシダーゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、リソソームリパーゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アリールスルファターゼＢ（Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ）タンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0191】

ある特定の実施形態では、本発明は、グリコーゲン貯蔵障害に関連するタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、酸アルファ－グルコシダーゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）タンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、肝臓グリコーゲンホスホリラーゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、筋ホスホグリセリン酸ムターゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グリコーゲン脱分岐酵素をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0192】

ある特定の実施形態では、本発明は、アミノ酸代謝に関連するタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、オキサラーゼ（ｏｘａｌａｓｅ）アラニン－グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0193】

ある特定の実施形態では、本発明は、脂質代謝または線維性障害に関連するタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰａｓｅリン脂質輸送８Ｂ１（ＡＴＰ８Ｂ１）タンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、１つ以上のＮＦ－カッパＢ阻害剤、例えば、Ｉ－カッパＢアルファ、インターフェロン関連発生制御因子１（ＩＦＲＤ１）、およびサーチュイン１（ＳＩＲＴ１）のうちの１つ以上をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＰＰＡＲ－ガンマタンパク質または活性バリアントをコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0194】

ある特定の実施形態では、本発明は、メチルマロン酸血症に関連するタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、メチルマロニルＣｏＡムターゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0195】

ある特定の実施形態では、本発明は、肝臓への送達またはその治療が治療的利益を提供することができる精製されたｍＲＮＡを含む治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ７Ｂタンパク質、別名、ウィルソン病タンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ酵素をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、および第Ｘ因子などの１つまたは凝固酵素をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）タンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0196】

ある特定の実施形態では、本発明は、対象の心血管状態もしくは心血管細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、血管内皮成長因子Ａタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、リラクシンタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、骨形成タンパク質－９タンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、骨形成タンパク質－２受容体タンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0197】

ある特定の実施形態では、本発明は、対象の筋肉または筋肉細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ジストロフィンタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フラタキシンタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、対象の心筋または心筋細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、筋肉組織または筋肉細胞におけるカリウムチャネルおよびナトリウムチャネルの一方または両方を調節するタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、筋肉組織または筋肉細胞におけるＫｖ７．１チャネルを調節するタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、筋肉組織または筋肉細胞におけるＮａｖ１．５チャネルを調節するタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0198】

ある特定の実施形態では、本発明は、対象の神経系または神経系細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、生存運動ニューロン１タンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、生存運動ニューロン２タンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フラタキシンタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＤメンバー１（ＡＢＣＤ１）タンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＬＮ３タンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0199】

ある特定の実施形態では、本発明は、対象の血液もしくは骨髄または血液もしくは骨髄細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ベータ－グロビンタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、ブルトンチロシンキナーゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、１つまたは複数の凝固酵素、例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、および第Ｘ因子をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0200】

ある特定の実施形態では、本発明は、対象の腎臓または腎臓細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＩＶ型コラーゲンアルファ５鎖（ＣＯＬ４Ａ５）タンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0201】

ある特定の実施形態では、本発明は、対象の眼または眼細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）タンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、レチノスキシンタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａ（ＲＰＥ６５）タンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、２９０ｋＤａ中心体タンパク質（ＣＥＰ２９０）をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0202】

ある特定の実施形態では、本発明は、対象または対象の細胞用のワクチンの送達またはそれを用いた治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、ウイルスなどの感染病原体由来の抗原をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インフルエンザウイルス由来の抗原をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス由来の抗原をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、狂犬病ウイルス由来の抗原をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、サイトメガロウイルス由来の抗原をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ロタウイルス由来の抗原をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはＣ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス由来の抗原をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトパピローマウイルス由来の抗原をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、単純ヘルペスウイルス１型または単純ヘルペスウイルス２型などの単純ヘルペスウイルス由来の抗原をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス１型またはヒト免疫不全ウイルス２型などのヒト免疫不全ウイルス由来の抗原をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトメタニューモウイルス由来の抗原をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトパラインフルエンザウイルス１型、ヒトパラインフルエンザウイルス２型、またはヒトパラインフルエンザウイルス３型などのヒトパラインフルエンザウイルス由来の抗原をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、マラリアウイルス由来の抗原をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ジカウイルス由来の抗原をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、チクングニア由来の抗原をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0203】

ある特定の実施形態では、本発明は、対象のがんに関連する抗原または対象のがん細胞から特定された抗原をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、対象自身のがん細胞から決定された抗原をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための、すなわち、個別化がんワクチンを提供するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、変異ＫＲＡＳ遺伝子から発現した抗原をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0204】

ある特定の実施形態では、本発明は、抗体をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、二重特異性抗体であり得る。ある特定の実施形態では、抗体は、融合タンパク質の一部であり得る。いくつかの実施形態では、プロセスの工程（ｂ）における２つの別個のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、抗体の軽鎖および重鎖をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物は、異なる脂質組成物を含み、かつ抗体の軽鎖または重鎖をコードするｍＲＮＡを封入する、非同一性ＬＮＰの組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態では、本発明は、ＯＸ４０に対する抗体をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦに対する抗体をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、組織壊死因子アルファに対する抗体をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に対する抗体をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ１９に対する抗体をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0205】

ある特定の実施形態では、本発明は、免疫調節剤をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インターロイキン１２をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インターロイキン２３をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インターロイキン３６ガンマをコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、１つ以上のインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質の構成的に活性なバリアントをコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0206】

ある特定の実施形態では、本発明は、エンドヌクレアーゼをコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ｃａｓ ９タンパク質などのＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、メガヌクレアーゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。

【0207】

ある特定の実施形態では、本発明は、眼疾患を治療するためのペプチドまたはタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、レチノスキシンをコードする精製されたｍＲＮＡを含む、治療用組成物を生成するために使用される。

【実施例】

【0208】

本発明のある特定の化合物、組成物、および方法について、ある特定の実施形態に従って具体的に説明してきたが、以下の実施例は、本発明を単に説明するという役割を果たすものであり、それを制限することを意図するものではない。本発明のある特定の化合物、組成物、および方法について、ある特定の実施形態に従って具体的に説明してきたが、以下の実施例は、本発明を単に説明するという役割を果たすものであり、それを制限することを意図するものではない。

【0209】

以下の実施例に記載されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ試験物品は、別段の指定がない限り、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上のヘルパー脂質（例えば、ＤＥＰＥまたはＤＯＰＥなどの非カチオン性脂質）、１つ以上のＰＥＧ化脂質、および任意にｍＲＮＡを封入するように設計されたコレステロールなどの１つ以上のステロールを用いる、異なる比の多成分脂質混合物中に封入されたｍＲＮＡを含有する。

【0210】

実施例１．ｍＲＮＡの調製
ｍＲＮＡのインビトロ転写
別段の記載がない限り、Ｔ７ポリメラーゼまたはＳＰ６ポリメラーゼのいずれかを使用して、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介してｍＲＮＡを合成した。簡潔に述べると、ＳＰ６ポリメラーゼＩＶＴ反応では、転写されたｍＲＮＡの各グラムについて、ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ、５ｍＭのＮＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ、および反応緩衝液（１０×－２５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭのスピルミジン、５０ｍＭのＮａＣｌ）と、２０ｍｇの線状化二本鎖ＤＮＡプラスミドを含有する反応物を、ＲＮａｓｅを含まない水で調製し、次いで、３７Ｃで、６０分間でインキュベートした。次に、反応をＤＮａｓｅ ＩおよびＤＮａｓｅ Ｉ緩衝液（１０ｘ－１００ｍＭのトリス－ＨＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２および２５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ７．６）の添加によりクエンチして、精製のための調製において二本鎖ＤＮＡ鋳型の消化を促進した。

【0211】

ｍＲＮＡの５’キャッピング
別段の記載がない限り、ＩＶＴ転写ｍＲＮＡは、ＩＶＴ反応の一部としてキャップ構造を含めるか、またはその後の酵素的工程で、その５’末端でキャップされた。ＩＶＴ反応の一部としてのキャッピングについては、キャップ類似体を、新生ＲＮＡ鎖の最初の「塩基」として組み込むことができる。キャップ類似体は、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、Ｃａｐ２、^ｍ６Ａ_ｍ、または非天然キャップであってもよい。あるいは、キャップのないかつ精製されたインビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡは、ＩＶＴ後に酵素的に修飾されて、例えば、グアニル酸トランスフェラーゼを使用する５’Ｎ^７－メチルグアニル酸キャップ０構造の付加により、およびＦｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．“Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｃａｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２００５，８６，１２３９－１２４９に記載されているように、２’Ｏ－メチルトランスフェラーゼを使用してＣａｐ１構造をもたらす最後から２番目のヌクレオチドの２’Ｏ位置でのメチル基の付加により、キャップを含むことができる。

【0212】

ｍＲＮＡの３’テーリング
別段の記載がない限り、ＩＶＴ転写されたｍＲＮＡは、その３’末端で、線状化プラスミドにテール鋳型を含めることによってテーリングされ、これは、ＩＶＴ反応の一部として、またはその後の酵素的工程でｍＲＮＡをテーリングする。ＩＶＴ反応の一部としてのテーリングについては、ポリＡテールまたは類似の適切なテールが、ＩＶＴプロセスの一部としてｍＲＮＡ上に形成されるように、ポリＴまたは類似のテーリング機能をｐＤＮＡ鋳型に組み込むことが行われる。あるいは、ポリＡテールは、ＩＶＴ反応の後に、例えば、ポリＡポリメラーゼを使用して、ＩＶＴ産生ｍＲＮＡの３’末端に酵素的に付加することができる。

【0213】

実施例２．脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の調製およびｍＲＮＡの封入
ＬＮＰ調製、およびカチオン性脂質として化合物３を含むＬＮＰ中のｍＲＮＡの封入を、プロセスＢに従って実施した。プロセスＢは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１８／１５３８２２号にさらに記載されており、これは、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。上述のように、ＬＮＰ調製物は、実施例１に記載されるように得られた１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上のヘルパー脂質（例えば、ＤＥＰＥまたはＤＯＰＥなどの非カチオン性脂質）、１つ以上のＰＥＧ化脂質、およびｍＲＮＡを封入するよう設計されたコレステロールなどの１つ以上のステロールを含む多成分脂質混合物であった。

【0214】

本明細書で使用される場合、プロセスＡは、ＬＮＰが脂質の多成分混合物から形成され、ｍＲＮＡが単一工程でＬＮＰを形成するものに封入される従来的なプロセスを指す。

【0215】

プロセスＢは、予め形成されたＬＮＰをｍＲＮＡと混合することによってｍＲＮＡを封入するプロセスを指す。予め形成されたＬＮＰを、ｍＲＮＡの非存在下で、エタノールなどの溶媒中に溶解された多成分脂質混合物を、クエン酸緩衝液で瞬間的に混合することによって最初に調製した。これらの２つの流れの混合により、空の脂質ナノ粒子が形成され、これは、自己集合プロセスであった。得られた製剤は、アルコールを含有するクエン酸緩衝液中の空の脂質ナノ粒子をもたらし、これを、緩衝液交換（例えば、接線流濾過（ＴＦＦ）によって）して、１０％重量／体積のトレハロース溶液緩衝液中に空の脂質ナノ粒子をもたらした。次いで、水溶液中の空の脂質ナノ粒子およびｍＲＮＡを混合して、脂質ナノ粒子内に封入されたｍＲＮＡを形成した。

【0216】

具体的には、空の脂質ナノ粒子を調製するために、表２－１に記載される比で、カチオン性脂質としての化合物３、ＰＥＧ修飾脂質としてのＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、およびコレステロールと共に、ＤＥＰＥまたはＤＯＰＥのいずれかをヘルパー脂質として使用した。

【表2-1】

【0217】

驚くべきことに、カチオン性脂質として化合物３を含むこれらの多成分脂質混合物を、非カチオン性ヘルパー脂質としてＤＯＰＥを使用して製剤化することはできなかったが、ＤＯＰＥの代わりに非カチオン性ヘルパー脂質としてＤＥＰＥを使用したときに、安定したリポソームを形成したことが見出された。

【0218】

実施例３．ＤＥＰＥを含むＬＮＰにおけるｍＲＮＡのインビボ生成の強化
本実施例は、ヘルパー脂質としてＤＥＰＥを含むＬＮＰを使用した、ＬＮＰにより封入されたｍＲＮＡの予想外の効力の増加を示す。

【0219】

ＥＰＯをコードするｍＲＮＡを、実施例１に記載されるように合成した。実施例２に記載されるプロセスＢを使用して、ｍＲＮＡを、異なるヘルパー脂質を含んだが、他の点では同じであったＬＮＰに封入した（以下の表３－１を参照されたい）。具体的には、各ｍＲＮＡにより封入されたＬＮＰは、異なるヘルパー脂質を含んだが、同じカチオン性脂質（化合物１）、同じＰＥＧ修飾脂質（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、同じステロール化合物（コレステロール）、それらの脂質の同じモル比、同じｍＲＮＡ（ＥＰＯ ｍＲＮＡ）、同じＮ／Ｐ比＝４（すなわち、カチオン性脂質：ｍＲＮＡのモル比）、同じｍＲＮＡ濃度（０．２ｍｇ／ｍＬ）を含み、同じプロセス（プロセスＢ）に従って調製された。得られるｍＲＮＡ－ＬＮＰの特徴を表３－１に示す。

【表3-1】

【0220】

異なるヘルパー脂質を含むＬＮＰに封入されたｍＲＮＡを含む４つの試験物品（表３－１の１～４）の各々を、５ｍＬ／ｋｇの用量体積の１ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡの用量で、尾静脈注射によってマウスに静脈内投与した（ｎ＝５、ＣＤ－１マウスの６～８週齢）。投与後６時間で、尾部小片によって中間の全血を採取した。投与後２４時間で、すべての動物を安楽死させ、続いて、開胸および最終採血を行った。血清試料中のヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）レベルを、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍカタログ番号ＤＥＰ００）によって、製造業者の指示に従って決定した。さらに、血清ＡＬＴおよびＡＳＴレベルを、標準的な技術に従ってＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＰＯタンパク質発現およびＡＬＴ／ＡＳＴ結果を、表３－２に示し、それぞれ図１および図２にグラフ表示する。

【表3-2】

【0221】

表３－２および図１に示されるように、ヘルパー脂質としてＤＥＰＥを含むｍＲＮＡ ＬＮＰは、他のヘルパー脂質を含むが、他の点では同じであったｍＲＮＡ ＬＮＰからのタンパク質発現と比較して、顕著に高いインビボタンパク質発現をもたらした。具体的には、投与後６時間で、ＤＥＰＥを含むｍＲＮＡ ＬＮＰは、同じ時点で、ＤＥＰＥ以外のヘルパー脂質、例えば、ＤＯＰＥ、ＤＬＯＰＥ、またはＰＯＰＥを含むｍＲＮＡ ＬＮＰからのタンパク質発現の１００％超、すなわち２倍超に強化されたインビボタンパク質発現をもたらした。同様に、投与後２４時間で、ＤＥＰＥを含むｍＲＮＡ ＬＮＰは、同じ時点で、ＤＥＰＥ以外のヘルパー脂質、例えば、ＤＯＰＥ、ＤＬＯＰＥ、またはＰＯＰＥを含むｍＲＮＡ ＬＮＰからのタンパク質発現の１００％超、すなわち２倍超に強化されたインビボタンパク質発現をもたらした。

【0222】

さらに、表３－２および図２にも示されるように、投与後２４時間でのＡＬＴおよびＡＳＴレベルは、ヘルパー脂質に関係なく、すべてのｍＲＮＡ ＬＮＰについて実質的に類似しており、ヘルパー脂質としてＤＥＰＥを含むｍＲＮＡ ＬＮＰが、ＤＥＰＥ以外のヘルパー脂質、例えば、ＤＯＰＥ、ＤＬＯＰＥ、またはＰＯＰＥを含むｍＲＮＡ ＬＮＰと類似の安全性および忍容性を有し、同時に、顕著により強力であることを示した。

【0223】

実施例４．ヘルパー脂質としてＤＥＰＥまたはＤＯＰＥを使用した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の調製
本実施例は、ｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）製剤中でヘルパー脂質としてＤＥＰＥを使用することが、ヘルパー脂質として（ＤＯＰＥ）を含む従来のリポソームと比較して、インビボでのｍＲＮＡからのタンパク質発現の最大２倍超の増加をもたらすことができることを示す。また、ヘルパー脂質としてＤＥＰＥを含むｍＲＮＡ－ＬＮＰが、ヘルパー脂質としてＤＯＰＥを含む同じｍＲＮＡ－ＬＮＰと比較して、封入効率の増加をもらしたことも観察された。特に、異なるカチオン性脂質を含む多種多様なｍＲＮＡ－ＬＮＰにわたって、この強化された発現およびこの強化された封入効率が観察された。

【0224】

これらの研究では、ＯＴＣをコードするｍＲＮＡを、ヘルパー脂質としてＤＥＰＥまたはＤＯＰＥ、および表４に列挙される様々なカチオン性脂質を含むＬＮＰに封入した。表４に記載される各カチオン性脂質は、各脂質の記載における終わりの２桁の数字によって示されるように、Ｃ_１０、Ｃ_１２、Ｃ_１４、またはＣ_１６の鎖長の４個のアルキル鎖を含んだ。カチオン性脂質：ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ：コレステロール：ヘルパー脂質のモル比は、約４０：３：２５：３２であった。研究のインビボ部分について、各製剤化されたｍＲＮＡ－ＬＮＰの１ｍｇ／ｋｇを、尾静脈注射を介してマウスに送達した。２４時間で、マウスを屠殺し、ＯＴＣをコードするｍＲＮＡのインビボ発現を、各マウスからの肝臓ホモジネートから評価した。平均タンパク質発現を以下の表に提供する。

【表4】

【0225】

表４は、ＤＯＰＥと比較して、ヘルパー脂質としてＤＥＰＥを使用したときに、封入効率がより高かったことを示す。さらに、驚くべきことに、カチオン性脂質として特定のリピドイドを含む多成分脂質混合物は、ＤＯＰＥを使用しても製剤化することができなかったが、ＤＥＰＥをヘルパー脂質として使用したときに安定したリポソームを形成したことを観察した。表４はまた、ヘルパー脂質としてＤＥＰＥを含むｍＲＮＡ ＬＮＰが、ＤＯＰＥヘルパー脂質を含むが、他の点では同じであったｍＲＮＡ ＬＮＰからのタンパク質発現と比較して、顕著に高いインビボタンパク質発現を示したことを実証する。これは、様々なカチオン性脂質をＬＮＰ中で使用した場合に当てはまった。

【0226】

実施例５．他のヘルパー脂質と比較した、ヘルパー脂質としてＤＥＰＥを使用することによるインビボタンパク質発現の強化
本実施例は、ｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）製剤中でヘルパー脂質としてＤＥＰＥを使用することが、ｍＲＮＡ－ＬＮＰを調製するために使用される様々な封入プロセスにわたって、他のタイプのヘルパー脂質を使用する脂質ナノ粒子と比較して、インビボでのｍＲＮＡの発現を増加させることができることを示す。

【0227】

これらの研究では、ＯＴＣをコードするｍＲＮＡを、表５－１、表５－２、表５－３、および表５－４に示されるモル脂質比で、ＰＥＧ修飾脂質としてＤＭＧ－ＰＥＧ－２０００、カチオン性脂質としてｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２、コレステロール、およびＤＥＰＥを含むいくつかの異なるヘルパー脂質のうちの１つを含むＬＮＰ（Ｎ／Ｐ＝４）で封入した。各ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤を、４つの異なる封入プロセスのうちの１つ：表５－１に記載される製剤については従来のプロセス、表５－２に記載される製剤については再混合プロセス、表５－３に記載される製剤についてはステップアップ再混合プロセス、または表５－４に記載される製剤についてはステップダウン再混合プロセスを使用することによって調製した。ｍＲＮＡ－ＬＮＰを、ＬＮＰサイズ、多分散性、および封入パーセントについて評価し、各々の結果を以下の表に示す。研究のインビボ部分について、各製剤化されたｍＲＮＡ－ＬＮＰの１ｍｇ／ｋｇを、尾静脈注射を介してマウス（ｎ＝５）に送達した。２４時間で、マウスを屠殺し、ＯＴＣをコードするｍＲＮＡのインビボ発現を、各マウスからの肝臓ホモジネートから評価した。平均タンパク質発現を以下の表に示す。

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【表5-4】

【0228】

表５－１、表５－２、表５－３、および表５－４は各々、ＬＮＰに封入され、マウスの群に送達されたｍＲＮＡによる２４時間後のタンパク質発現のレベルを示す。示されるように、ヘルパー脂質ＤＯＰＥまたはＤＥＰＥを用いて調製されたＬＮＰのみが、異なる封入プロセスにわたってタンパク質発現に関して効力をもたらした。特に、ｍＲＮＡ－ＬＮＰを調製するために使用される封入プロセスに関係なく、ＤＥＰＥを、ヘルパー脂質を使用してＬＮＰを調製したときに、インビボタンパク質発現が最高であった。

【0229】

当業者であれば理解することができるように、ヘルパー脂質としてＤＥＰＥを含むｍＲＮＡ ＬＮＰのこの有意に増加した効力、しかし同様の安全性および有効性は、治療剤としてのｍＲＮＡの送達に有意な利点をもたらす。

【0230】

等価物
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または日常的な実験作業を越えない手法を使用して確認できるであろう。本発明の範囲は、上記の記載を限定することを意図しないが、むしろ以下の特許請求の範囲に記述されるとおりである。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ｍＲＮＡの送達を必要とする対象にそれを行うための脂質ナノ粒子であって、前記脂質ナノ粒子が、１つ以上のカチオン性脂質と、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質と、前記ｍＲＮＡを封入する１つ以上のヘルパー脂質と、を含み、前記１つ以上のヘルパー脂質が、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）を含む、脂質ナノ粒子。
（項目２）
前記対象への前記脂質ナノ粒子の投与が、異なる１つ以上のヘルパー脂質を含み、かつＤＥＰＥを含まないことを除いて同じ脂質成分および量を有する第２の脂質ナノ粒子中の同じｍＲＮＡの発現と比較して、前記ｍＲＮＡの発現の強化をもたらす、項目１に記載の脂質ナノ粒子。
（項目３）
前記異なる１つ以上のヘルパー脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、および／またはそれらの組み合わせを含む、項目２に記載の脂質ナノ粒子。
（項目４）
発現が前記第２の脂質ナノ粒子と比較して少なくとも２倍強化される、項目２または３に記載の脂質ナノ粒子。
（項目５）
前記脂質ナノ粒子中の前記ＤＥＰＥが、１０モルパーセント～５０モルパーセントの濃度で存在する、項目１～４のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
（項目６）
前記１つ以上のカチオン性脂質が、各々Ｃ _１０ －Ｃ _１６ の鎖長の１～４つのアルキル鎖であるか、またはそれらを含む、項目１～５のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
（項目７）
前記１つ以上のカチオン性脂質が、４つの脂肪族鎖を含むリピドイドである、項目１～５のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
（項目８）
前記１つ以上のカチオン性脂質が、以下の式のカチオン性脂質、

【化83】

またはその薬学的に許容される塩であるか、またはそれを含み、
式中、Ｒ ^１ およびＲ ^２ が各々独立して、ＨまたはＣ _１ －Ｃ _６ 脂肪族であり、ｍが各々独立して、１～４の値を有する整数であり、Ａが各々独立して、共有結合またはアリーレンであり、Ｌ ^１ が各々独立して、エステル、チオエステル、ジスルフィド、または無水物基であり、Ｌ ^２ が各々独立して、Ｃ _２ －Ｃ _１０ 脂肪族であり、Ｘ ^１ が各々独立して、ＨまたはＯＨであり、Ｒ ^３ が各々独立して、Ｃ _６ －Ｃ _２０ 脂肪族である、項目７に記載の脂質ナノ粒子。
（項目９）
Ｒ ^３ が各々独立して、Ｃ _８ －Ｃ _１６ 脂肪族である、項目８に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１０）
前記１つ以上のＰＥＧ修飾脂質が、Ｃ _６ －Ｃ _２０ の鎖長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した最大５ｋＤａの鎖長のポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、項目１～９のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
（項目１１）
１つ以上のステロールをさらに含む、項目１～１０のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
（項目１２）
前記１つ以上のステロールがコレステロールベースの脂質を含む、項目１１に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１３）
前記コレステロールベースの脂質がコレステロールおよび／またはＰＥＧ化コレステロールである、項目１２に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１４）
前記ｍＲＮＡが、インビボで治療用タンパク質またはペプチドに翻訳されるタンパク質をコードするｍＲＮＡである、項目１～１３のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
（項目１５）
前記タンパク質またはペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが全身に送達され、前記翻訳されたタンパク質またはペプチドが投与後２４時間以上の時点で肝臓または血清中で検出可能である、項目１４に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１６）
前記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、項目１５に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１７）
前記治療用ポリペプチドが、（ａ）抗体軽鎖もしくは抗体重鎖であるか、または（ｂ）前記対象に存在しないまたは欠乏しているポリペプチドである、項目１６に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１８）
タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡがペプチドをコードする、項目１４に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１９）
前記ペプチドが抗原である、項目１８に記載の脂質ナノ粒子。
（項目２０）
ｍＲＮＡの送達を必要とする対象にそれを行うための方法であって、前記対象に、１つ以上のカチオン性脂質と、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質と、前記ｍＲＮＡを封入する１つ以上のヘルパー脂質と、を含む脂質ナノ粒子を投与することを含み、前記１つ以上のヘルパー脂質が、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）を含む、方法。
（項目２１）
前記対象への前記脂質ナノ粒子の投与が、異なる１つ以上のヘルパー脂質を含み、かつＤＥＰＥを含まないことを除いて同じ脂質成分および量を有する第２の脂質ナノ粒子由来の同じｍＲＮＡの発現と比較して、前記ｍＲＮＡの発現の強化をもたらす、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記異なる１つ以上のヘルパー脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、および／またはそれらの組み合わせを含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
発現が前記第２の脂質ナノ粒子と比較して少なくとも２倍強化される、項目２１または２２に記載の脂質ナノ粒子。
（項目２４）
前記脂質ナノ粒子中の前記ＤＥＰＥが、１０モルパーセント～５０モルパーセントの濃度で存在する、項目２０～２３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
（項目２５）
前記１つ以上のカチオン性脂質が、ｃＫＫ－Ｅ１２であるか、またはそれを含む、項目２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記１つ以上のカチオン性脂質が、ＩＣＥ（イミダゾールコレステロールエステル）であるか、またはそれを含む、項目２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記１つ以上のカチオン性脂質が、以下の式のカチオン性脂質、

【化84】

またはその薬学的に許容される塩であるか、またはそれを含み、
式中、Ｒ ^１ およびＲ ^２ が各々独立して、ＨまたはＣ _１ －Ｃ _６ 脂肪族であり、ｍが各々独立して、１～４の値を有する整数であり、Ａが各々独立して、共有結合またはアリーレンであり、Ｌ ^１ が各々独立して、エステル、チオエステル、ジスルフィド、または無水物基であり、Ｌ ^２ が各々独立して、Ｃ _２ －Ｃ _１０ 脂肪族であり、Ｘ ^１ が各々独立して、ＨまたはＯＨであり、Ｒ ^３ が各々独立して、Ｃ _６ －Ｃ _２０ 脂肪族である、項目２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記１つ以上のカチオン性脂質が、化合物１であるか、またはそれを含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記１つ以上のＰＥＧ修飾脂質が、Ｃ _６ －Ｃ _２０ の鎖長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した最大５ｋＤａの鎖長のポリ（エチレン）グリコール鎖であるか、またはそれを含む、項目２０～２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
１つ以上のステロールをさらに含む、項目２０～２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記１つ以上のステロールがコレステロールベースの脂質を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記コレステロールベースの脂質がコレステロールおよび／またはＰＥＧ化コレステロールである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記ｍＲＮＡが、インビボで治療用タンパク質に翻訳されるタンパク質をコードするｍＲＮＡである、項目２１～３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡがポリペプチドである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記治療用ポリペプチドが、（ａ）抗体軽鎖もしくは抗体重鎖、または（ｂ）前記対象に存在しないまたは欠乏しているポリペプチドである、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡがペプチドである、項目３３に記載の方法。
（項目３８）
前記ペプチドが抗原である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子を調製するための方法であって、
（ａ）１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質、および１つ以上のヘルパー脂質の混合物を提供することであって、前記１つ以上のヘルパー脂質が、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）を含む、提供することと、
（ｂ）工程（ａ）で提供された前記混合物から脂質ナノ粒子を形成することと、を含み、
前記方法が、前記ｍＲＮＡを前記脂質ナノ粒子に封入することをさらに含み、封入が、工程（ｂ）での前記脂質ナノ粒子の形成前または形成後に行われる、方法。
（項目４０）
前記ｍＲＮＡを封入する前記脂質ナノ粒子が安定している、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記１つ以上のヘルパー脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、および／またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つを含まない、項目３９または４０に記載の方法。
（項目４２）
前記ＤＥＰＥが、１０モルパーセント～５０モルパーセントの濃度で混合物中に存在する、項目３９～４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記混合物中の前記１つ以上のＰＥＧ修飾脂質が、Ｃ _６ －Ｃ _２０ の鎖長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した最大５ｋＤａの鎖長のポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、項目３９～４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記混合物が１つ以上のステロールをさらに含む、項目３９～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記１つ以上のステロールがコレステロールベースの脂質を含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記コレステロールベースの脂質がコレステロールおよび／またはＰＥＧ化コレステロールである、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ｍＲＮＡが、治療用ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする、項目３９～４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記ｍＲＮＡが、予め形成された脂質ナノ粒子中に封入される、項目３９～４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記方法が、前記ｍＲＮＡの封入前および／または封入後に、前記脂質ナノ粒子を接線流濾過（ＴＦＦ）に供することをさらに含む、項目３９～４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記方法が、前記脂質ナノ粒子をトレハロース溶液中で製剤化することをさらに含む、項目３９～４９のいずれか一項に記載の方法。

【図1】

【図2】