▶ バイリ－バイオ（チェンドゥ）ファーマスーティカル シーオー．，エルティーディー．の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-11
(45)【発行日】2024-11-19
(54)【発明の名称】抗ＴＲＯＰ２抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20241112BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241112BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241112BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241112BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241112BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241112BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241112BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241112BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241112BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20241112BHJP
A61K 51/10 20060101ALI20241112BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20241112BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20241112BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P35/00
A61K39/395 T
A61K39/395 L
A61K47/68
A61K51/10 200
A61K51/10 100
A61K49/00
C12P21/08
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2022579053
(86)(22)【出願日】2021-06-18
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-18
(86)【国際出願番号】 CN2021100903
(87)【国際公開番号】W WO2021259162
(87)【国際公開日】2021-12-30
【審査請求日】2023-02-17
(31)【優先権主張番号】202010573040.0
(32)【優先日】2020-06-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】522263714
【氏名又は名称】バイリ－バイオ（チェンドゥ）ファーマスーティカル シーオー．，エルティーディー．
【住所又は居所原語表記】１３９ Ｂａｉｌｉ Ｒｏａｄ， Ｗｅｎｊｉａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｃｈｅｎｇｄｕ， Ｓｉｃｈｕａｎ ６１１１３０， ｔｈｅ Ｐｅｏｐｌｅ’ ｓ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001139
【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人
(74)【代理人】
【識別番号】100130328
【弁理士】
【氏名又は名称】奥野 彰彦
(74)【代理人】
【識別番号】100130672
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 寛之
(72)【発明者】
【氏名】ツー， イ
(72)【発明者】
【氏名】チョン， ヨン
(72)【発明者】
【氏名】ジョー， シー
(72)【発明者】
【氏名】ディン， ミュラン
(72)【発明者】
【氏名】ウェン， ズン
【審査官】山内 達人
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１５－２２１７９３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／０９８０９９（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
Ａ６１Ｐ
Ａ６１Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＴＲＯＰ２抗体又はそのＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片の１つであって、前記抗体は、重鎖及び軽鎖からなり、
前記抗体は、配列番号１３に示される配列を有する重鎖及び配列番号１４に示される配列を有する軽鎖からなることを特徴とする、抗ＴＲＯＰ２抗体又はそのＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片の１つ。
【請求項2】
前記重鎖に含まれるアミノ酸は、それぞれ配列番号１、２及び３のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み、
前記軽鎖に含まれるアミノ酸は、それぞれ配列番号７、８及び９のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗ＴＲＯＰ２抗体又はそのＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片の１つ。
【請求項3】
モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の抗ＴＲＯＰ２抗体又はそのＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片の１つ。
【請求項4】
マウス由来であることを特徴とする、請求項１に記載の抗ＴＲＯＰ２抗体又はそのＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片の１つ。
【請求項5】
請求項１に記載の抗ＴＲＯＰ２抗体又はそのＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片の１つをコードする、核酸。
【請求項6】
前記核酸は、配列番号３３及び配列番号３４を含むことを特徴とする、請求項５に記載の核酸。
【請求項7】
請求項５又は６に記載の核酸に相補的な核酸。
【請求項8】
請求項６又は７に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項9】
請求項８に記載の発現ベクターを含む宿主。
【請求項10】
請求項１に記載の抗ＴＲＯＰ２抗体又はそのＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片の１つを産生可能な請求項８に記載の発現ベクター及び請求項９に記載の宿主。
【請求項11】
請求項１から４のいずれか１項に記載の抗ＴＲＯＰ２抗体又はそのＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片の１つを含む、悪性腫瘍を診断又は治療するための医薬組成物。
【請求項12】
請求項１１に記載の医薬組成物における抗ＴＲＯＰ２抗体又はそのＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片の１つに結合するアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗悪性腫瘍薬、有糸分裂阻害剤、クロマチン機能阻害剤、抗血管新生剤、抗アンドロゲン剤、抗エストロゲン剤又は免疫調節剤又は放射性元素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒトＴＲＯＰ２タンパク質に特異的に結合可能な抗体に関し、特にマウス、キメラ、及びヒト化起源のモノクローナル抗体、並びにこれらの抗体をコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列に関する。本発明は、これらの抗体を診断試薬又は薬物として悪性腫瘍或いは受容体過剰発現に関連するいかなる疾患を診断及び／又は治療的処理する使用も含む。
【背景技術】
【0002】
ＴＲＯＰ２タンパク質は、トロホブラスト抗原２（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ａｎｔｉｇｅｎ ２）、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２（ｔｕｍｏｕ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ２）とも呼ばれ、染色体１ｐ３２位のシングルコピー遺伝子ＴＡＣＳＴＤ２によってコードされる。対応するｍＲＮＡは、３６ｋＤａ新生ポリペプチドを合成し、Ｎ末端グリコシル化されて単一膜貫通ドメインを有する単量体膜タンパク質を形成する（Ａｎｎｉｅ Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
【0003】
ＴＲＯＰ２の細胞内領域配列（長さ：２６アミノ酸）には、３０３位のセリン部位がある。この部位は、種間で高度に保存され（Ｂａｓｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ａｎｎｉｅ Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１５）、ＰＫＣキナーゼによってリン酸化され、シグナル伝達分子ＰＩＰ２の結合部位になるとともに、下流の細胞質カルシウム濃度の上昇を刺激することができる（Ｓｅｗｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ａｌｂｅｒｔｉ．ｅｔ ａｌ．，１９９９）。細胞質領域を欠くＴｒｏｐ２がインビトロ細胞株で過剰発現すると、このタンパク質は、その成長刺激機能を奪われ、他のシグナル伝達経路に対するＴｒｏｐ２細胞質領域の刺激効果を示している（Ｇｕｅｒｒａ．ｅｔ ａｌ）。Ｔｒｏｐ２の細胞外領域には、ＥＧＦ成長因子に結合可能な構造ドメインが含まれ、ＥＧＦを傍受してＩＧＦ－１Ｒ／Ａｋｔシグナル伝達経路の活性をダウンレギュレートすることができる。そのため、Ｔｒｏｐ２発現の減少は、ＩＧＦ－１Ｒ／Ａｋｔシグナル伝達経路を逆に活性化する可能性がある（Ｌｉｎ．ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ａｎｎｉｅ Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
【0004】
Ｔｒｏｐ２は、腫瘍形成の促進において重要な役割を果たしている。Ｔｒｏｐ２の過剰発現は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の腫瘍形成能を顕著に増強することができる（Ｗａｎｇ．ｅｔ ａｌ．，２００８）。Ｔｒｏｐ２は上皮間葉転換（ＥＭＴ）にも影響を与え、がん細胞の移動と浸潤の能力を高めることができる（Ｔｒｅｒｏｔｏｌａ．ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｌｉ．ｅｔ ａｌ．，２０１７）。このプロセスは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ シグナル伝達経路に影響を与えることによって達成され得る。Ｔｒｏｐ２を過剰発現する胆嚢がん細胞では、Ａｋｔリン酸化の活性化が大幅に増加する一方、Ｔｒｏｐ２の発現をノックダウンすると、このシグナル伝達経路の活性を阻害することができる（Ｌｉ．ｅｔ ａｌ．，２０１７）。また、Ｔｒｏｐ２の過剰発現は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の活性も刺激し、膵臓がん細胞の増殖をアップレギュレートし、担がんマウスの腫瘍の進行を促進する（Ｃｕｂａｓ．ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
【0005】
Ｔｒｏｐ２タンパク質の発現は、胚発生及び成人期の乳房、腎臓、膵臓などの一連の表皮由来組織で見られる（Ａｎｎｉｅ Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１５）。しかし、対応する正常組織の腫瘍では、Ｔｒｏｐ２タンパク質の発現が顕著に増加し、動物モデルにおける腫瘍増殖の進行と正の相関がある（Ｔｒｅｒｏｔｏｌａ．ｅｔ ａｌ．，２０１３）。Ｔｒｏｐ２遺伝子配列自体は変異も増幅もしていないため、がんにおけるＴｒｏｐ２発現のアップレギュレーションは、転写調節レベルの刺激によるものと考えられている（Ｔｒｅｒｏｔｏｌａ．ｅｔ ａｌ．，２０１３）。様々なタイプの実質腫瘍を有する患者では、このタンパク質の過剰発現は通常、腫瘍の予後不良を示す（Ｚｅｎｇ．ｅｔ ａｌ．，２０１６）。胆嚢がん（Ｃｈｅｎ．ｅｔ ａｌ．，２０１４）、胃腸がん（Ｍｕｈｌｍａｎｎ．ｅｔ ａｌ．，２００９）、肺門胆管がん（Ｎｉｎｇ．ｅｔ ａｌ．，２０１３）及び膵臓がん（Ｆｏｎｇ．ｅｔ ａｌ．，２００８）では、Ｔｒｏｐ２高発現疾患患者の生存率が大幅に低下した。様々ながんにおけるＴｒｏｐ２の高レベル発現と患者の生存率への重大な影響を考慮すると、このタンパク質はがん治療の潜在的な標的であると考えられている。
【0006】
既知の抗体薬物には、Ｔｒｏｐ２標的に対する毒素結合抗体（ＡＤＣ）であるＩＭＭＵ－１３２がある（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ．ｅｔ ａｌ．，２０１５）。このＡＤＣの抗体ＲＳ７は、ハイブリドーマの調製と、肺がん細胞膜粗抽出物及びマウス骨髄腫細胞で免疫化したマウス脾臓リンパ球の融合スクリーニングによって得られた（Ｓｔｅｉｎ．ｅｔ ａｌ．，１９９０）。粗抽出物では、ＲＳ７が結合した抗原はＴｒｏｐ２であることが判明された（Ｓｔｅｉｎ．ｅｔ ａｌ．，１９９４）。ＲＳ７抗体自体は様々ながん細胞によってエンドサイトーシスされる可能性があるため、ＲＳ７抗体はＡＤＣの調製に適用される可能性がある（Ｓｔｅｉｎ．ｅｔ ａｌ．，１９９３）。マウス由来のＲＳ７を順次ヒト化した後、ＲＳ７のヒト化バージョンを使用して抗体結合薬を調製し、鎖間スルフヒドリルカップリングによりトポイソメラーゼ阻害剤であるＳＮ－３８薬をロードした（Ｍｏｏｎ，ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓａｈｏｔａ．ｅｔ ａｌ．，２０１７）。最近の臨床第Ｉ相データでは、ＩＭＭＵ－１３２は複数のがん、特にトリプルネガティブ乳がんの治療に臨床的に有効であることが示されました（Ｓｔａｒｏｄｕｂ．ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｓａｈｏｔａ ａｎｄ Ｖａｈｄａｔ．，２０１７）。
【0007】
本出願に開示される情報は、治療の分野に関するものであり、具体的には、本出願に記載されるキメラ抗体又はヒト化抗体は、ヒトＩＩ型栄養芽層抗原タンパク質（Ｔｒｏｐ２）に結合することができ、ターゲティング抗体インコ抗体結合薬物療法における抗体標的機能を有する。
【発明の概要】
【0008】
本発明は、天然抗体に関しない。本発明に係る抗体は、マウス免疫化、同定及び単離手段により得られるか、又は遺伝子組換えにより得られる。本発明によれば、保護対象は抗体、機能的断片又は誘導体である。前記抗体は、少なくとも１つのＣＤＲを含み、そのアミノ酸配列は、配列番号１から配列番号１２に由来する。
【0009】
いずれかの抗体断片又は誘導体は、少なくとも１つのＣＤＲを含み、かつこのＣＤＲの配列が配列番号１から配列番号１２と少なくとも８０％の同一性、好ましくは８５％、９０％、９５％又は９８％の同一性を有する場合、本発明の同等物であるため、本発明の一部であると理解されるべきである。
【0010】
より具体的には、本発明に記載の抗体、その機能的断片の１つ、又は誘導体は、重鎖を含み、前記重鎖は、少なくとも１つのＣＤＲを含み、前記ＣＤＲは、配列番号１から配列番号６から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0011】
より具体的には、本発明に記載の抗体、その機能的断片の１つ、又は誘導体は、軽鎖を含み、前記軽鎖は、少なくとも１つのＣＤＲを含み、前記ＣＤＲは、配列番号７から配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0012】
前記態様によれば、より具体的な第１実施形態において、本発明に記載の抗体、その機能的断片の１つ、又は誘導体は、重鎖を含み、前記重鎖は、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。
【0013】
より具体的には、第１実施形態によれば、前記抗体、その機能的断片の１つ、又は誘導体は、重鎖を含み、前記重鎖の配列において、キメラ抗体は配列番号１３に示される配列を含み、ヒト化抗体は配列番号１７に示される配列を含む。
【0014】
前記態様によれば、より具体的な第１実施形態において、本発明に記載の抗体、その機能的断片の１つ、又は誘導体は、軽鎖を含み、前記軽鎖は、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。
【0015】
より具体的には、第１実施形態によれば、前記抗体、その機能的断片の１つ、又は誘導体は、軽鎖を含み、前記軽鎖の配列において、キメラ抗体は配列番号１４に示される配列を含み、ヒト化抗体は配列番号１８に示される配列を含む。
【0016】
前記態様によれば、より具体的な第２具体実施形態において、本発明に記載の抗体、その機能的断片の１つ、又は誘導体は、重鎖を含み、前記重鎖は、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。
【0017】
より具体的には、第２実施形態によれば、前記抗体、その機能的断片の１つ、又は誘導体は、重鎖を含み、前記重鎖の配列において、キメラ抗体は配列番号１５に示される配列を含み、ヒト化抗体は配列番号１９に示される配列を含む。
【0018】
前記態様によれば、より具体的な第２実施形態において、本発明に記載の抗体、その機能的断片の１つ、又は誘導体は、軽鎖を含み、前記軽鎖は、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む。
【0019】
より具体的には、第２実施形態によれば、前記抗体、その機能的断片の１つ、又は誘導体は、軽鎖を含み、前記軽鎖の配列において、キメラ抗体は、配列番号１６に示される配列を含み、ヒト化抗体は、配列番号２０に示される配列を含む。
【0020】
本発明の別の態様において、本発明は、単離されたＤＮＡに関する。下記のＤＮＡ配列の核酸から選択される。それぞれの核酸がコードするアミノ酸配は、上記の配列番号１から配列番号２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列である。
【0021】
より具体的には、下記のＤＮＡ配列から選択される核酸を含む。
第１実施形態は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９に示される核酸配列を含む。
第２実施形態は、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２に示される核酸配列を含む。
第１実施形態は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９に示される核酸配列を含む。
第２実施形態は、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２に示される核酸配列を含む。
【0022】
より具体的には、
第１具体実施形態のキメラ抗体配列は、配列番号３３及び配列番号３４に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、ヒト化抗体配列は、配列番号３７及び配列番号３８に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
第２実施形態のキメラ抗体配列は、配列番号３５及び配列番号３６に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、ヒト化抗体配列は、配列番号３９及び配列番号４０に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
第１具体実施形態のキメラ抗体配列は、配列番号３３及び配列番号３４に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、ヒト化抗体配列は、配列番号３７及び配列番号３８に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
第２実施形態のキメラ抗体配列は、配列番号３５及び配列番号３６に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、ヒト化抗体配列は、配列番号３９及び配列番号４０に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】４Ｄ３軽鎖、重鎖可変領域配列のＣＤＲ領域認識と二次元構造図である。
【図2】７Ｆ１１軽鎖、重鎖可変領域配列のＣＤＲ領域認識と二次元構造図である。
【図3】ｃｈ４Ｄ３、ｃｈ７Ｆ１１のＥＬＩＳＡ結合曲線である。
【図4】ｃｈ４Ｄ３及びｃｈ７Ｆ１１の細胞表面結合活性図である。
【図5】ＢＸＰＣ－３生細胞上でのｃｈ４Ｄ３及びｃｈ７Ｆ１１抗体のエンドサイトーシス活性図である。
【図6】４Ｄ３マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域配列のヒト化前後のヒト性スコア（ｈｕｍａｎｎｅｓｓ；Ｚ－ｓｃｏｒｅ）の変化図である。
【図7】７Ｆ１１マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域配列のヒト化前後のヒト性スコア（ｈｕｍａｎｎｅｓｓ；Ｚ－ｓｃｏｒｅ）の変化図である。
【図8】４Ｄ３ヒト化抗体とキメラ抗体の同等希釈濃度下での結合曲線図である。
【図9】７日目（Ａ）、１４日目（Ｂ）、２１日目（Ｃ）での４Ｄ３ヒト化抗体のＳＥＣ検出の結果を示す図である。
【図10】７Ｆ１１ヒト化抗体とキメラ抗体の同等希釈濃度下での結合曲線図である。
【図11】７日目（Ａ）、１４日目（Ｂ）、２１日目（Ｃ）での７Ｆ１１ヒト化抗体のＳＥＣ検出の結果を示す図である。
【図12】４Ｄ３ヒト化ビオチン抗体と、０．０２～５０ｕｇ／ｍｌのｃｈ４Ｄ３及びｈｕ４Ｄ３抗体のそれぞれの結合エピトープとの競合結果を示す図である。
【図13】７Ｆ１１ヒト化ビオチン抗体と、０．０２～５０ｕｇ／ｍｌのｃｈ７Ｆ１１及びｈｕ７Ｆ１１抗体のそれぞれの結合エピトープとの競合結果を示す図である。
【図14】３種類の細胞におけるｈｕ７Ｆ１１抗体の結合データである。
【図15】３種類の細胞におけるＨｕ４Ｄ３抗体の結合データである。
【図16】３種類の細胞におけるｈｕ７Ｆ１１抗体のエンドサイトーシスデータである。
【図17】３種類の細胞におけるＨｕ４Ｄ３抗体のエンドサイトーシスデータである。
【発明を実施するための形態】
【0024】
実施例１：ＴＲＯＰ２抗原による６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの免疫化
ＴＲＯＰ２細胞外領域発現ベクターを構築し、浮遊細胞２９３Ｆを用いてミリグラムレベルのＴＲＯＰ２タンパク質を一過性発現した。６－８週齢のマウスを選択し、下表に示される免疫化用量（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｓｅ）及び時点でＴＲＯＰ２抗原の皮下免疫化を行い、３回免疫化後に血漿力価が最も高いマウスを選択して最終免疫化を行った。免疫化プロセスを下表１に示す。
ＴＲＯＰ２細胞外領域発現ベクターを構築し、浮遊細胞２９３Ｆを用いてミリグラムレベルのＴＲＯＰ２タンパク質を一過性発現した。６－８週齢のマウスを選択し、下表に示される免疫化用量（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｓｅ）及び時点でＴＲＯＰ２抗原の皮下免疫化を行い、３回免疫化後に血漿力価が最も高いマウスを選択して最終免疫化を行った。免疫化プロセスを下表１に示す。
【表1】
【0025】
実施例２：免疫化マウスの脾臓細胞のインビトロ融合
マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０をＤＭＥＭ＋ＦＢＳ １０％完全培地中で事前に培養し、融合前にパスツールピペットを用いて５ｘ１０７個のＳＰ２／０細胞を取り、１０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、３７℃で予熱した無血清ＤＭＥＭで残留血清を洗浄し、ＫＭマウス腹腔内のフィーダー細胞を採取し、５ｘ１０３個／１００ｕｌ／ウェルの細胞量でフィーダー細胞を９６ウェルプレートにプレーティングした。最終免疫化後の３日目に眼から採血し、最終免疫化されたマウスを安楽死させ、７５％アルコールに浸した後、無菌手術台に置き、脾臓組織を摘出した。予熱した無血清ＤＭＥＭで脾臓細胞をピペッティングし、脾臓細胞の１／２を取って計数し、脾臓細胞：ＳＰ２／０細胞の数量比１：１～１０：１で混合し、遠心分離後、残留ＤＭＥＭを吸引して除去した。１ｍｌの予熱ＰＥＧ－１４５０を加えて均一に混合し、３ｍｉｎ後、３５ｍｌの予熱したＤＭＥＭ培地を加えて希釈して停止させた。細胞を１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、その後、ＨＡＴスクリーニング培地で細胞を再懸濁させ、１０枚の９６ウェルプレートに接種した。
マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０をＤＭＥＭ＋ＦＢＳ １０％完全培地中で事前に培養し、融合前にパスツールピペットを用いて５ｘ１０７個のＳＰ２／０細胞を取り、１０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、３７℃で予熱した無血清ＤＭＥＭで残留血清を洗浄し、ＫＭマウス腹腔内のフィーダー細胞を採取し、５ｘ１０３個／１００ｕｌ／ウェルの細胞量でフィーダー細胞を９６ウェルプレートにプレーティングした。最終免疫化後の３日目に眼から採血し、最終免疫化されたマウスを安楽死させ、７５％アルコールに浸した後、無菌手術台に置き、脾臓組織を摘出した。予熱した無血清ＤＭＥＭで脾臓細胞をピペッティングし、脾臓細胞の１／２を取って計数し、脾臓細胞：ＳＰ２／０細胞の数量比１：１～１０：１で混合し、遠心分離後、残留ＤＭＥＭを吸引して除去した。１ｍｌの予熱ＰＥＧ－１４５０を加えて均一に混合し、３ｍｉｎ後、３５ｍｌの予熱したＤＭＥＭ培地を加えて希釈して停止させた。細胞を１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、その後、ＨＡＴスクリーニング培地で細胞を再懸濁させ、１０枚の９６ウェルプレートに接種した。
【0026】
実施例３：ハイブリドーマ細胞上清の陽性検出
融合の７～１０日後、細胞クローンの形成状況を観察した。上清検出の前日にＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地で培地を交換した。濃度２ｕｇ／ｍｌのＴＲＯＰ２抗原でＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。検出の当日に、無菌手術台でマルチチャンネル電動ピペットを用いて９６ウェルプレートから培地上清を吸引し、対応するＥＬＩＳＡプレートのウェルに加えた。ＥＬＩＳＡプレートを３７℃で１ｈｒインキュベートした後、ＰＢＳＴでウェルプレートを３回洗浄し、１：５０００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウス抗体を加えた。３７℃で１ｈｒインキュベートした後、ＰＢＳＴで３回希釈した。ＴＭＢ基質発色現像液を調製し、各ウェルに５０ｕｌを加え、室温条件下で５～１０ｍｉｎ反応させた。その後、５０ｕｌ／ウェルで２Ｍ硫酸溶液を加えて発色を停止させた。マイクロタイタープレートのＯＤ４５０値に従って、陽性クローンをスクリーニングした。
融合の７～１０日後、細胞クローンの形成状況を観察した。上清検出の前日にＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地で培地を交換した。濃度２ｕｇ／ｍｌのＴＲＯＰ２抗原でＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。検出の当日に、無菌手術台でマルチチャンネル電動ピペットを用いて９６ウェルプレートから培地上清を吸引し、対応するＥＬＩＳＡプレートのウェルに加えた。ＥＬＩＳＡプレートを３７℃で１ｈｒインキュベートした後、ＰＢＳＴでウェルプレートを３回洗浄し、１：５０００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウス抗体を加えた。３７℃で１ｈｒインキュベートした後、ＰＢＳＴで３回希釈した。ＴＭＢ基質発色現像液を調製し、各ウェルに５０ｕｌを加え、室温条件下で５～１０ｍｉｎ反応させた。その後、５０ｕｌ／ウェルで２Ｍ硫酸溶液を加えて発色を停止させた。マイクロタイタープレートのＯＤ４５０値に従って、陽性クローンをスクリーニングした。
【0027】
実施例４：陽性細胞株のサブクローンスクリーニング
ＯＤ４５０値が比較的高い融合細胞プレートのウェルを標識し、２日以内に培養を続けた。実施例２の方法によりフィーダー細胞をプレーティングし、２００ｕｌピペットチップを用いて陽性細胞を均一にピペッティングし、５ｕｌ以下の細胞懸濁液を取ってサブクローニングを行った。１００ｕｌに希釈し、１００ｕｌ／ウェルのフィーダー細胞懸濁液を含む９６ウェルプレートの最初のウェルに加えた。Ａ１からＨ１への方向において１００ｕｌの体積で最後の列まで均等にピペッティングし、さらに、マルチチャンネル電動ピペットを用いて１００ｕｌを吸い取ってＡ１からＡ１２への方向において最後の列まで均等にピペッティングした。ウェルプレートを７～１０日培養し、単一クローンが形成されたプレートウェルを標識し、実施例の方法を参照して上清陽性検出を行った。
ＯＤ４５０値が比較的高い融合細胞プレートのウェルを標識し、２日以内に培養を続けた。実施例２の方法によりフィーダー細胞をプレーティングし、２００ｕｌピペットチップを用いて陽性細胞を均一にピペッティングし、５ｕｌ以下の細胞懸濁液を取ってサブクローニングを行った。１００ｕｌに希釈し、１００ｕｌ／ウェルのフィーダー細胞懸濁液を含む９６ウェルプレートの最初のウェルに加えた。Ａ１からＨ１への方向において１００ｕｌの体積で最後の列まで均等にピペッティングし、さらに、マルチチャンネル電動ピペットを用いて１００ｕｌを吸い取ってＡ１からＡ１２への方向において最後の列まで均等にピペッティングした。ウェルプレートを７～１０日培養し、単一クローンが形成されたプレートウェルを標識し、実施例の方法を参照して上清陽性検出を行った。
【0028】
実施例５：腹水でのモノクローナル抗体の調製
腹水調製の７日前にＢａｌｂ／ｃマウスに１ｍｌ／匹でパラフィン油を腹腔内注射した。次に、最初のサブクローニング後に陽性率が安定したモノクローナル細胞を採取して拡大培養した。６ウェルプレートの少なくとも１つのウェルサイズに増殖したときに細胞を収集した。１０００ｇで３ｍｉｎ遠心分離し、リン酸緩衝液で細胞を３回洗浄した。各マウスに１～２ｘ１０６個注射する量で調製した。マウスを７～１０日飼育し、マウス腹腔を観察した。１８ゲージ滅菌針を用いて腹水を採取し、１４０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離して腹水上清を収集した。得られた上清をｐｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇアフィニティーカラムにより精製し、４Ｄ３及び７Ｆ１１細胞株のモノクローナル抗体を得た。
腹水調製の７日前にＢａｌｂ／ｃマウスに１ｍｌ／匹でパラフィン油を腹腔内注射した。次に、最初のサブクローニング後に陽性率が安定したモノクローナル細胞を採取して拡大培養した。６ウェルプレートの少なくとも１つのウェルサイズに増殖したときに細胞を収集した。１０００ｇで３ｍｉｎ遠心分離し、リン酸緩衝液で細胞を３回洗浄した。各マウスに１～２ｘ１０６個注射する量で調製した。マウスを７～１０日飼育し、マウス腹腔を観察した。１８ゲージ滅菌針を用いて腹水を採取し、１４０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離して腹水上清を収集した。得られた上清をｐｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇアフィニティーカラムにより精製し、４Ｄ３及び７Ｆ１１細胞株のモノクローナル抗体を得た。
【0029】
実施例６：４Ｄ３抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のコード配列の取得
モノクローナル細胞株を６ウェルプレート中で培養し、コンフルエンスが９０～１００％に達したときにｔｒｉｚｏｌで細胞を収取した。ＲＮａｓｅフリーの環境で総ＲＮＡを抽出し、ｏｌｉｇｏ ｄＴを逆転写プライマーとしてｃＤＮＡライブラリーを合成した。このｃＤＮＡライブラリーは、ターミナルトランスフェラーゼＴｄＴにより５'末端にｄＧＴＰを付加した後、ＰＣＲテンプレートとして使用された。上流プライマーがｏｌｉｇｏ ｄＣであり、下流プライマーが抗体の軽鎖及び重鎖の５'末端ＣＨ１の定常領域に対応するプライマーペアを用いて、高忠実度酵素ｐｒｉｍｅｒＳＴＡＲを通じて可変領域遺伝子の５'－ＲＡＣＥ増幅を実行した。ＰＣＲ産物をＤＮＡアガロースゲル電気泳動で分析し、長さが約７５０ｂｐのＤＮＡ断片を回収して下流ＴＡクローニングを行った。コロニーＰＣＲにより陽性と同定された菌株を配列決定した。オンラインＩＭＧＴデータベースにより、得られた配列に対して配列アラインメント及び可変領域配列の二次元マッピングを行った。
モノクローナル細胞株を６ウェルプレート中で培養し、コンフルエンスが９０～１００％に達したときにｔｒｉｚｏｌで細胞を収取した。ＲＮａｓｅフリーの環境で総ＲＮＡを抽出し、ｏｌｉｇｏ ｄＴを逆転写プライマーとしてｃＤＮＡライブラリーを合成した。このｃＤＮＡライブラリーは、ターミナルトランスフェラーゼＴｄＴにより５'末端にｄＧＴＰを付加した後、ＰＣＲテンプレートとして使用された。上流プライマーがｏｌｉｇｏ ｄＣであり、下流プライマーが抗体の軽鎖及び重鎖の５'末端ＣＨ１の定常領域に対応するプライマーペアを用いて、高忠実度酵素ｐｒｉｍｅｒＳＴＡＲを通じて可変領域遺伝子の５'－ＲＡＣＥ増幅を実行した。ＰＣＲ産物をＤＮＡアガロースゲル電気泳動で分析し、長さが約７５０ｂｐのＤＮＡ断片を回収して下流ＴＡクローニングを行った。コロニーＰＣＲにより陽性と同定された菌株を配列決定した。オンラインＩＭＧＴデータベースにより、得られた配列に対して配列アラインメント及び可変領域配列の二次元マッピングを行った。
【0030】
実施例７：７Ｆ１１抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のコード配列の取得
実施例６の操作を参照して７Ｆ１１クローンの軽鎖及び重鎖可変領域配列を得た（図２）。
実施例６の操作を参照して７Ｆ１１クローンの軽鎖及び重鎖可変領域配列を得た（図２）。
【0031】
実施例８：抗体の発現及び精製
ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ ２９３－Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）浮遊細胞を用いて抗体を発現した。トランスフェクションの前日、６×１０５個／ｍＬの密度で細胞を３００ｍＬのＦ１７完全培地（ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ Ｆ１７発現培地、Ｇｉｂｃｏ社）の１Ｌ振とうフラスコに接種し、３７℃、５％ＣＯ２、１２０ｒｐｍで細胞培養シェーカー中で一晩培養した。翌日、ＰＥＩを用いて抗体発現プラスミドをトランスフェクトした（プラスミド：ＰＥＩ＝２：１）。トランスフェクションの１日後、２．５％（ｖ／ｖ）でＴＮ１フィード培地を加え、引く続き４日培養した後、遠心分離して上清を収集した。得られた発現上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ，ＧＥ社）により０．１Ｍクエン酸（ｐＨ３．０）で溶出し、捕捉した抗体を１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）（１／１０（ｖ／ｖ））でｐＨ７．０に調整し、さらにゲル濾過クロマトグラフィーカラムＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ社）によりポリマー及びエンドトキシンなどの不純物を除去し、抗体緩衝液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に変更した。このように得られた抗体は、標的抗体モノマー（ＰＯＩ％）が９９％を超え、その後の実験に使用された。
ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ ２９３－Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）浮遊細胞を用いて抗体を発現した。トランスフェクションの前日、６×１０５個／ｍＬの密度で細胞を３００ｍＬのＦ１７完全培地（ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ Ｆ１７発現培地、Ｇｉｂｃｏ社）の１Ｌ振とうフラスコに接種し、３７℃、５％ＣＯ２、１２０ｒｐｍで細胞培養シェーカー中で一晩培養した。翌日、ＰＥＩを用いて抗体発現プラスミドをトランスフェクトした（プラスミド：ＰＥＩ＝２：１）。トランスフェクションの１日後、２．５％（ｖ／ｖ）でＴＮ１フィード培地を加え、引く続き４日培養した後、遠心分離して上清を収集した。得られた発現上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ，ＧＥ社）により０．１Ｍクエン酸（ｐＨ３．０）で溶出し、捕捉した抗体を１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）（１／１０（ｖ／ｖ））でｐＨ７．０に調整し、さらにゲル濾過クロマトグラフィーカラムＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ社）によりポリマー及びエンドトキシンなどの不純物を除去し、抗体緩衝液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に変更した。このように得られた抗体は、標的抗体モノマー（ＰＯＩ％）が９９％を超え、その後の実験に使用された。
【0032】
実施例９：ＥＬＩＳＡ方法による抗体親和性の評価
可変領域遺伝子をヒト抗体定常領域を含む発現プラスミドにクローニングし、実施例８を参照して真核細胞２９３Ｆを一過性トランスフェクトして分泌された４Ｄ３と７Ｆ１１キメラ抗体を精製した。キメラ抗体を５０ｕｇ／ｍｌ濃度に希釈し、ＴＲＯＰ２コーティングＥＬＩＳＡプレートのＡ１～Ｈ１ウェルに加え、Ａ１からＡ１２への方向において３倍体積水平希釈を行い、３７℃で１ｈｒインキュベートした後、洗浄し、マウス抗ヒトＦｃ ＨＲＰ標識抗体を加え、３７℃でインキュベートした後、発色させた。
図３から分かるように、４Ｄ３と７Ｆ１１はいずれも良好な相対親和性を有する。ＥＣ５０（Ｂ４）：０．０４７ｕｇ／ｍｌ；ＥＣ５０（Ｂ７）：０．０７１ｕｇ／ｍｌ。
可変領域遺伝子をヒト抗体定常領域を含む発現プラスミドにクローニングし、実施例８を参照して真核細胞２９３Ｆを一過性トランスフェクトして分泌された４Ｄ３と７Ｆ１１キメラ抗体を精製した。キメラ抗体を５０ｕｇ／ｍｌ濃度に希釈し、ＴＲＯＰ２コーティングＥＬＩＳＡプレートのＡ１～Ｈ１ウェルに加え、Ａ１からＡ１２への方向において３倍体積水平希釈を行い、３７℃で１ｈｒインキュベートした後、洗浄し、マウス抗ヒトＦｃ ＨＲＰ標識抗体を加え、３７℃でインキュベートした後、発色させた。
図３から分かるように、４Ｄ３と７Ｆ１１はいずれも良好な相対親和性を有する。ＥＣ５０（Ｂ４）：０．０４７ｕｇ／ｍｌ；ＥＣ５０（Ｂ７）：０．０７１ｕｇ／ｍｌ。
【0033】
実施例１０：細胞免疫蛍光法による抗体生物活性の評価
ＢＸＰＣ－３細胞をプレートし、９６ウェル細胞培養プレート内の細胞コンフルエンスが４０～５０％に達するように２４～４８ｈｒ増殖させた。実験当日に上清を吸引して除去し、２回洗浄した。３％ ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を加え、３７℃で１ｈｒブロッキングした。キメラ抗体及びｈＲＳ７抗体を１０ｕｇ／ｍｌに希釈し、３７℃で１ｈインキュベートし、一次抗体溶液を吸引して除去し、４回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド溶液（１００μＬ／ウェル）を加えて室温で２０ｍｉｎ静置し、２回洗浄した後、１：８００の比率で１％ＢＳＡ溶液を用いて二次抗体を希釈した（１００ｕｌ／ウェル）。二次抗体懸濁液を吸引して除去し、４回洗浄し、２μｇ／ｍｌ濃度のＤＡＰＩ染色液を１００μＬ／ウェルで加え、室温、暗所で５ｍｉｎインキュベートした。ＤＡＰＩ染色液を吸引して除去し、４回洗浄した後、１×ＤＰＢＳ溶液を１００μＬ／ウェルで加え、蛍光顕微鏡下で観察し、撮影して実験結果を記録した。
図４：同じ抗体濃度及び処理条件下でのｃｈ４Ｄ３及びｃｈ７Ｆ１１の細胞表面結合活性。
ＢＸＰＣ－３細胞をプレートし、９６ウェル細胞培養プレート内の細胞コンフルエンスが４０～５０％に達するように２４～４８ｈｒ増殖させた。実験当日に上清を吸引して除去し、２回洗浄した。３％ ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を加え、３７℃で１ｈｒブロッキングした。キメラ抗体及びｈＲＳ７抗体を１０ｕｇ／ｍｌに希釈し、３７℃で１ｈインキュベートし、一次抗体溶液を吸引して除去し、４回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド溶液（１００μＬ／ウェル）を加えて室温で２０ｍｉｎ静置し、２回洗浄した後、１：８００の比率で１％ＢＳＡ溶液を用いて二次抗体を希釈した（１００ｕｌ／ウェル）。二次抗体懸濁液を吸引して除去し、４回洗浄し、２μｇ／ｍｌ濃度のＤＡＰＩ染色液を１００μＬ／ウェルで加え、室温、暗所で５ｍｉｎインキュベートした。ＤＡＰＩ染色液を吸引して除去し、４回洗浄した後、１×ＤＰＢＳ溶液を１００μＬ／ウェルで加え、蛍光顕微鏡下で観察し、撮影して実験結果を記録した。
図４：同じ抗体濃度及び処理条件下でのｃｈ４Ｄ３及びｃｈ７Ｆ１１の細胞表面結合活性。
【0034】
実施例１１：細胞エンドサイトーシス法による抗体の生物学的活性の評価
実施例１０の方法を参照してＢＸＰＣ－３細胞をプレーティングした。実験当日に細胞培養液を吸引して除去し、ＰＢＳ溶液を加え、２回洗浄した。１％ＦＢＳを含む培地を使用し、キメラ抗体及びｈＲＳ７抗体を１０ｕｇ／ｍｌに希釈して４℃で１ｈインキュベートし、一次抗体溶液を吸引して除去し、検出される細胞を培養するための完全培地を加え、３７℃で１ｈｒインキュベートした。細胞培地を吸引して除去し、４回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド溶液を加え、１００μＬ／ウェルで２０ｍｉｎ静置した。２回洗浄した後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含む３％ＢＳＡブロッキング溶液（１００μＬ／ウェル）を加え、室温で１ｈ静置した。パンチング液を吸引して除去し、２回洗浄した。１：８００の比率で抗ヒトＩｇＧ蛍光二次抗体を希釈し（１００μＬ／ウェル）、３７℃で１ｈインキュベートした。蛍光二次抗体溶液を吸引して除去し、４回洗浄した後、ＤＡＰＩ染色を行い、室温、暗所で１５ｍｉｎ静置した。４回洗浄し、１×ＤＰＢＳ溶液を１００μＬ／ウェルで加え、蛍光顕微鏡下で蛍光染色結果を観察した（図４、５）。
実施例１０の方法を参照してＢＸＰＣ－３細胞をプレーティングした。実験当日に細胞培養液を吸引して除去し、ＰＢＳ溶液を加え、２回洗浄した。１％ＦＢＳを含む培地を使用し、キメラ抗体及びｈＲＳ７抗体を１０ｕｇ／ｍｌに希釈して４℃で１ｈインキュベートし、一次抗体溶液を吸引して除去し、検出される細胞を培養するための完全培地を加え、３７℃で１ｈｒインキュベートした。細胞培地を吸引して除去し、４回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド溶液を加え、１００μＬ／ウェルで２０ｍｉｎ静置した。２回洗浄した後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含む３％ＢＳＡブロッキング溶液（１００μＬ／ウェル）を加え、室温で１ｈ静置した。パンチング液を吸引して除去し、２回洗浄した。１：８００の比率で抗ヒトＩｇＧ蛍光二次抗体を希釈し（１００μＬ／ウェル）、３７℃で１ｈインキュベートした。蛍光二次抗体溶液を吸引して除去し、４回洗浄した後、ＤＡＰＩ染色を行い、室温、暗所で１５ｍｉｎ静置した。４回洗浄し、１×ＤＰＢＳ溶液を１００μＬ／ウェルで加え、蛍光顕微鏡下で蛍光染色結果を観察した（図４、５）。
【0035】
実施例１２：４Ｄ３ヒト化配列の改造
４Ｄ３可変領域の核酸配列のシーケンシング結果を取得し、配列をウェブサイトＩＭＧＴによって提供されるＶ－ＱＵＥＳＴ配列チェックウィンドウ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ）に入力して軽鎖及び重鎖可変領域の配列特徴（３つのＣＤＲ領域配列と４つのＦＲ領域配列、及び最も密接に関連する生殖細胞系遺伝子ファミリー配列）を得た。在ＩＭＧＴ－ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎアミノ酸チェックウィンドウで、配列類似性が最も高いヒト生殖系列遺伝子ファミリー配列を検索した。４Ｄ３軽鎖は、ヒトＩＧＫＶ１－２７＊０１＋ＩＧＫＪ２＊０２ファミリー配列に対応し、４Ｄ３重鎖は、ヒトＩＧＨＶ１－３＊０１＋ＩＧＨＪ４＊０１ファミリー配列に対応した。ヒト生殖系列遺伝子配列のＣＤＲ領域を４Ｄ３軽鎖及び重鎖のＣＤＲに置き換え、ＩＭＧＴ－Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｑｕｅｒｙを用いて抗体構造の情報をチェックした。最終的に４Ｄ３－Ｈｕｍバージョンの軽鎖及び重鎖ヒト化配列を得た。４Ｄ３マウス配列及びヒト化配列をオンラインウェブサイトに入力してヒト抗体の類似性スコアを評価した。
図６では、青線はマウス抗体ライブラリーのＺ－ｓｃｏｒｅ分布範囲と頻度を示し、緑線はヒト抗体ライブラリーのＺ－ｓｃｏｒｅ分布範囲と頻度を示し、赤色直線は４Ｄ３軽鎖及び重鎖によって得られたＺ－ｓｃｏｒｅを示す。ヒト化した後、４Ｄ３のＺ－ｓｃｏｒｅ値は顕著に高くなった。
４Ｄ３可変領域の核酸配列のシーケンシング結果を取得し、配列をウェブサイトＩＭＧＴによって提供されるＶ－ＱＵＥＳＴ配列チェックウィンドウ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ）に入力して軽鎖及び重鎖可変領域の配列特徴（３つのＣＤＲ領域配列と４つのＦＲ領域配列、及び最も密接に関連する生殖細胞系遺伝子ファミリー配列）を得た。在ＩＭＧＴ－ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎアミノ酸チェックウィンドウで、配列類似性が最も高いヒト生殖系列遺伝子ファミリー配列を検索した。４Ｄ３軽鎖は、ヒトＩＧＫＶ１－２７＊０１＋ＩＧＫＪ２＊０２ファミリー配列に対応し、４Ｄ３重鎖は、ヒトＩＧＨＶ１－３＊０１＋ＩＧＨＪ４＊０１ファミリー配列に対応した。ヒト生殖系列遺伝子配列のＣＤＲ領域を４Ｄ３軽鎖及び重鎖のＣＤＲに置き換え、ＩＭＧＴ－Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｑｕｅｒｙを用いて抗体構造の情報をチェックした。最終的に４Ｄ３－Ｈｕｍバージョンの軽鎖及び重鎖ヒト化配列を得た。４Ｄ３マウス配列及びヒト化配列をオンラインウェブサイトに入力してヒト抗体の類似性スコアを評価した。
図６では、青線はマウス抗体ライブラリーのＺ－ｓｃｏｒｅ分布範囲と頻度を示し、緑線はヒト抗体ライブラリーのＺ－ｓｃｏｒｅ分布範囲と頻度を示し、赤色直線は４Ｄ３軽鎖及び重鎖によって得られたＺ－ｓｃｏｒｅを示す。ヒト化した後、４Ｄ３のＺ－ｓｃｏｒｅ値は顕著に高くなった。
【0036】
実施例１３：７Ｆ１１ヒト化配列の改造
実施例１２を参照して７Ｆ１１マウス抗体の軽鎖及び重鎖ヒト化配列を得た。７Ｆ１１マウス配列、ヒト化配列をオンラインウェブサイトに入力してヒト抗体の類似性スコアを評価した。
図７では、青線はマウス抗体ライブラリーのＺ－ｓｃｏｒｅ分布範囲と頻度を示し、緑線はヒト抗体ライブラリーのＺ－ｓｃｏｒｅ分布範囲と頻度を示し、赤色直線は４Ｄ３軽鎖及び重鎖によって得られたＺ－ｓｃｏｒｅ値を示す。ヒト化した後、７Ｆ１１のＺ－ｓｃｏｒｅ値は顕著に高くなった。
実施例１２を参照して７Ｆ１１マウス抗体の軽鎖及び重鎖ヒト化配列を得た。７Ｆ１１マウス配列、ヒト化配列をオンラインウェブサイトに入力してヒト抗体の類似性スコアを評価した。
図７では、青線はマウス抗体ライブラリーのＺ－ｓｃｏｒｅ分布範囲と頻度を示し、緑線はヒト抗体ライブラリーのＺ－ｓｃｏｒｅ分布範囲と頻度を示し、赤色直線は４Ｄ３軽鎖及び重鎖によって得られたＺ－ｓｃｏｒｅ値を示す。ヒト化した後、７Ｆ１１のＺ－ｓｃｏｒｅ値は顕著に高くなった。
【0037】
実施例１４：４Ｄ３ヒト化抗体の相対親和性分析
４Ｄ３ヒト化抗体配列を真核発現ベクターにクローニングし、実施例８を参照して真核細胞２９３Ｆに一過性にトランスフェクトした。精製後の抗体を２ｕｇ／ｍｌに希釈し、ヒト化前のマウス抗体と共にＴＲＯＰ２コーティングＥＬＩＳＡプレートのＡ１～Ｈ１ウェルに加え、さらにＡ１～Ａ１２方向において３倍希釈し、３７℃で１ｈｒインキュベートして洗浄し、抗ヒトＦｃのＨＲＰ標識抗体を加え、３７℃でインキュベートした後、発色させた。最後に、ＥＣ５０と曲線形状に応じてｃｈ４Ｄ３抗体とｈｕｍ４Ｄ３抗体の相対的な親和性を比較した。
図８：ＥＣ５０（４Ｄ３－キメラ）：０．０５６ｕｇ／ｍｌ；ＥＣ５０（４Ｄ３－ヒト化）：０．０５０２ｕｇ／ｍｌ。
４Ｄ３ヒト化抗体配列を真核発現ベクターにクローニングし、実施例８を参照して真核細胞２９３Ｆに一過性にトランスフェクトした。精製後の抗体を２ｕｇ／ｍｌに希釈し、ヒト化前のマウス抗体と共にＴＲＯＰ２コーティングＥＬＩＳＡプレートのＡ１～Ｈ１ウェルに加え、さらにＡ１～Ａ１２方向において３倍希釈し、３７℃で１ｈｒインキュベートして洗浄し、抗ヒトＦｃのＨＲＰ標識抗体を加え、３７℃でインキュベートした後、発色させた。最後に、ＥＣ５０と曲線形状に応じてｃｈ４Ｄ３抗体とｈｕｍ４Ｄ３抗体の相対的な親和性を比較した。
図８：ＥＣ５０（４Ｄ３－キメラ）：０．０５６ｕｇ／ｍｌ；ＥＣ５０（４Ｄ３－ヒト化）：０．０５０２ｕｇ／ｍｌ。
【0038】
実施例１５：４Ｄ３ヒト化抗体の熱安定性分析
精製したｈｕｍ４Ｄ３抗体を透析し、ＰＢＳ緩衝液で透析し、最終濃度を２ｍｇ／ｍｌにし、７０ｕｌ／チューブで２つのバッチ（３チューブ／バッチ）に分けた。２つのバッチのサンプルをそれぞれ４℃及び３７℃で静置し、０日目、７日目、１４日目にそれぞれサンプルチューブを取り出した。サンプルをＳＥＣ分析に使用して抗体の分解と凝集状況を評価した。
図９：７日目（図９Ａ）、１４日目（図９Ｂ）、２１日目（図９Ｃ）における４Ｄ３ヒト化抗体のＳＥＣ検出結果である。３７℃条件下の各時点での４Ｄ３ヒト化抗体のモノマーと凝集体及び検出分子に対する比率（％）を図９Ｄに示す。
精製したｈｕｍ４Ｄ３抗体を透析し、ＰＢＳ緩衝液で透析し、最終濃度を２ｍｇ／ｍｌにし、７０ｕｌ／チューブで２つのバッチ（３チューブ／バッチ）に分けた。２つのバッチのサンプルをそれぞれ４℃及び３７℃で静置し、０日目、７日目、１４日目にそれぞれサンプルチューブを取り出した。サンプルをＳＥＣ分析に使用して抗体の分解と凝集状況を評価した。
図９：７日目（図９Ａ）、１４日目（図９Ｂ）、２１日目（図９Ｃ）における４Ｄ３ヒト化抗体のＳＥＣ検出結果である。３７℃条件下の各時点での４Ｄ３ヒト化抗体のモノマーと凝集体及び検出分子に対する比率（％）を図９Ｄに示す。
【0039】
実施例１６：７Ｆ１１ヒト化抗体の相対親和性及び結合エピトープの一貫性の分析
実施例１４を参照して７Ｆ１１ヒト化抗体の相対親和性を評価した。
図１０：７Ｆ１１ヒト化抗体及びキメラ抗体の同等希釈濃度での結合曲線である。ＥＣ５０（７Ｆ１１－キメラ）：０．０６１ｕｇ／ｍｌ；ＥＣ５０（７Ｆ１１－ヒト化）：０．０６０１ｕｇ／ｍｌ。
実施例１４を参照して７Ｆ１１ヒト化抗体の相対親和性を評価した。
図１０：７Ｆ１１ヒト化抗体及びキメラ抗体の同等希釈濃度での結合曲線である。ＥＣ５０（７Ｆ１１－キメラ）：０．０６１ｕｇ／ｍｌ；ＥＣ５０（７Ｆ１１－ヒト化）：０．０６０１ｕｇ／ｍｌ。
【0040】
実施例１７：７Ｆ１１ヒト化抗体の熱安定性分析
実施例１５を参照して７Ｆ１１ヒト化抗体の熱安定性を分析した。
図１１：７日目（図１１Ａ）、１４日目（図１１Ｂ）、２１日目（図１１Ｃ）における７Ｆ１１ヒト化抗体のＳＥＣ検出結果である。３７℃条件下の各時点での７Ｆ１１ヒト化抗体のモノマーと凝集体及び検出分子に対する比率（％）を図１１Ｄに示す。
実施例１５を参照して７Ｆ１１ヒト化抗体の熱安定性を分析した。
図１１：７日目（図１１Ａ）、１４日目（図１１Ｂ）、２１日目（図１１Ｃ）における７Ｆ１１ヒト化抗体のＳＥＣ検出結果である。３７℃条件下の各時点での７Ｆ１１ヒト化抗体のモノマーと凝集体及び検出分子に対する比率（％）を図１１Ｄに示す。
【0041】
実施例１８：ヒト化抗体と親抗体の抗原親和性の分析
Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ光学分析技術プラットフォームを用いて抗体－抗原結合の絶対親和性を評価した。この方法では、ビオチン標識抗原をストレプトアビジンバイオセンサーチップの表面に固定化し、ベースラインを１８０秒間平衡化し、その後、溶液濃度勾配で希釈された抗体と３０秒間結合することでチップの光学的厚さを増加させた。その結果、波長シフト（Δλ）が生じ、３０秒の解離段階に入った。Ｔｒｏｐ２抗原と対応する抗体との間の相互作用をリアルタイムで測定し、各濃度での結合特異性、結合速度、解離速度又はサンプル濃度を精密で正確に測定した。少なくとも５つの濃度勾配でのｋ－ｏｎ値とｋ－ｏｆｆ値をまとめて、ＫＤ結合定数を得た。
Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ光学分析技術プラットフォームを用いて抗体－抗原結合の絶対親和性を評価した。この方法では、ビオチン標識抗原をストレプトアビジンバイオセンサーチップの表面に固定化し、ベースラインを１８０秒間平衡化し、その後、溶液濃度勾配で希釈された抗体と３０秒間結合することでチップの光学的厚さを増加させた。その結果、波長シフト（Δλ）が生じ、３０秒の解離段階に入った。Ｔｒｏｐ２抗原と対応する抗体との間の相互作用をリアルタイムで測定し、各濃度での結合特異性、結合速度、解離速度又はサンプル濃度を精密で正確に測定した。少なくとも５つの濃度勾配でのｋ－ｏｎ値とｋ－ｏｆｆ値をまとめて、ＫＤ結合定数を得た。
【表2】
【0042】
実施例１９：４Ｄ３ヒト化抗体及び嵌合抗体の活性分析及び結合エピトープの一貫性の分析
４Ｄ３ヒト化抗体をビオチンで標識し、ＥＬＩＳＡにより結合曲線の変曲点値を測定した結果、０．５ｎｇ／ｍｌであった。０．５ｎｇ／ｍｌの４Ｄ３ビオチン標識抗体を含むＥＬＩＳＡブロッキング溶液を調製し、この溶液を用いて５０ｕｇ／ｍｌの競合抗体４Ｄ３キメラ及び４Ｄ３ヒト化を調製した。ビオチン標識抗体及び競合抗体を含む溶液を１５０ｕｌ／ウェルでＡ１～Ａ１２に加え、５０ｕｌを吸い出してＢ２～Ｂ１２に加え、事前に添加した１００ｕｌのビオチン抗体溶液と十分に混合し、さらに順に３倍を希釈してＨ１～Ｈ１２に加え、３７℃で１ｈｒインキュベートした後、洗浄し、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体をインキュベートし、３７℃で１ｈｒインキュベートした後、３回洗浄し、２５ｍｉｎ発色させ、値を読み取った。
図１２：４Ｄ３ヒト化ビオチン抗体はそれぞれ０．０２～５０ｕｇ／ｍｌのｃｈ４Ｄ３及びｈｕｍ４Ｄ３抗体と競合することを示す。２つの競合抗体は、同じ程度の競合活性を示し、エピトープが一致した。ＥＣ５０（ｃｈ４Ｄ３）：０．３３６ｕｇ／ｍｌ。ＥＣ５０（ｈｕｍ４Ｄ３）：０．３２６ｕｇ／ｍｌ
４Ｄ３ヒト化抗体をビオチンで標識し、ＥＬＩＳＡにより結合曲線の変曲点値を測定した結果、０．５ｎｇ／ｍｌであった。０．５ｎｇ／ｍｌの４Ｄ３ビオチン標識抗体を含むＥＬＩＳＡブロッキング溶液を調製し、この溶液を用いて５０ｕｇ／ｍｌの競合抗体４Ｄ３キメラ及び４Ｄ３ヒト化を調製した。ビオチン標識抗体及び競合抗体を含む溶液を１５０ｕｌ／ウェルでＡ１～Ａ１２に加え、５０ｕｌを吸い出してＢ２～Ｂ１２に加え、事前に添加した１００ｕｌのビオチン抗体溶液と十分に混合し、さらに順に３倍を希釈してＨ１～Ｈ１２に加え、３７℃で１ｈｒインキュベートした後、洗浄し、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体をインキュベートし、３７℃で１ｈｒインキュベートした後、３回洗浄し、２５ｍｉｎ発色させ、値を読み取った。
図１２：４Ｄ３ヒト化ビオチン抗体はそれぞれ０．０２～５０ｕｇ／ｍｌのｃｈ４Ｄ３及びｈｕｍ４Ｄ３抗体と競合することを示す。２つの競合抗体は、同じ程度の競合活性を示し、エピトープが一致した。ＥＣ５０（ｃｈ４Ｄ３）：０．３３６ｕｇ／ｍｌ。ＥＣ５０（ｈｕｍ４Ｄ３）：０．３２６ｕｇ／ｍｌ
【0043】
実施例２０：７Ｆ１１ヒト化抗体、ヒト化抗体及びキメラ抗体の活性分析及び結合エピトープ一貫性の分析
実施例１８を参照して７Ｆ１１のエピトープ競合活性及び結合エピトープ一貫性を分析した。
図１３：７Ｆ１１ヒト化ビオチン抗体はそれぞれ０．０２～５０ｕｇ／ｍｌのｃｈ７Ｆ１１及びｈｕｍ７Ｆ１１抗体と競合した。２つの競合抗体は、同じ程度の競合活性を示し、エピトープが一致した。ＥＣ５０（ｃｈ７Ｆ１１）：０．７３２ｕｇ／ｍｌ。ＥＣ５０（ｈｕｍ７Ｆ１１）：０．８５６ｕｇ／ｍｌ。
実施例１８を参照して７Ｆ１１のエピトープ競合活性及び結合エピトープ一貫性を分析した。
図１３：７Ｆ１１ヒト化ビオチン抗体はそれぞれ０．０２～５０ｕｇ／ｍｌのｃｈ７Ｆ１１及びｈｕｍ７Ｆ１１抗体と競合した。２つの競合抗体は、同じ程度の競合活性を示し、エピトープが一致した。ＥＣ５０（ｃｈ７Ｆ１１）：０．７３２ｕｇ／ｍｌ。ＥＣ５０（ｈｕｍ７Ｆ１１）：０．８５６ｕｇ／ｍｌ。
【0044】
実施例２１：ヒト化抗体ｈｕ７Ｆ１１＆ｈｕ４Ｄ３の細胞結合及びエンドサイトーシス実験
ＨＥＫ２９３細胞を陰性細胞とし、ＢＸＰＣ－３及びＭＣＦ－７細胞を陽性細胞として用いて、勾配濃度での各抗体の結合とエンドサイトーシスを試験した。細胞結合試験では、４℃で１ｈｒ結合させた後、通常のＦＩＴＣ標識蛍光二次抗体を加え、フローサイトメトリーでデータを収集した。
ＨＥＫ２９３細胞を陰性細胞とし、ＢＸＰＣ－３及びＭＣＦ－７細胞を陽性細胞として用いて、勾配濃度での各抗体の結合とエンドサイトーシスを試験した。細胞結合試験では、４℃で１ｈｒ結合させた後、通常のＦＩＴＣ標識蛍光二次抗体を加え、フローサイトメトリーでデータを収集した。
【0045】
エンドサイトーシス試験では、酸感受性の低分子染色であるＰｈｒｏｄｏ－Ｒｅｄヤギ抗ヒト二次抗体を使用し、各濃度の一次抗体と共にインキュベートして複合体を形成した後、各細胞系と共に１６ｈｒインキュベートした。その後、サンプリングし、９６ウェルプレートの各ウェルに少なくとも１００００この細胞を接種し、フローサイトメーターによりデータを収集して分析した。各濃度での細胞の遠赤色光チャネルにおける平均蛍光強度値を統計し、抗体濃度を横座標としてエンドサイトーシス程度曲線を作成した。
【0046】
３種類の細胞におけるｈｕ７Ｆ１１とＨｕ４Ｄ３抗体の結合程度を比較した結果、ＢｘＰＣ－３細胞の結合程度が最も高かった。３種類の細胞におけるｈｕ７Ｆ１１とＨｕ４Ｄ３抗体のエンドサイトーシス程度を比較した結果、ＢｘＰＣ－３細胞のエンドサイトーシス程度が最も高かった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】