7587200 免疫グロブリン結合性ポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-12

(45)【発行日】2024-11-20

(54)【発明の名称】免疫グロブリン結合性ポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/31 20060101AFI20241113BHJP

   C07K 17/02 20060101ALI20241113BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241113BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241113BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241113BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241113BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241113BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20241113BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20241113BHJP

   C07K 1/22 20060101ALI20241113BHJP

【ＦＩ】

C07K14/31 ZNA

C07K17/02

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

C12N15/31

C07K1/22

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2020138896

(22)【出願日】2020-08-19

(65)【公開番号】P2022034943

(43)【公開日】2022-03-04

【審査請求日】2023-05-24

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001047

【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】岩瀬 瑛大

(72)【発明者】

【氏名】山中 直紀

(72)【発明者】

【氏名】寺尾 陽介

【審査官】岡部 佐知子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１７－５３３９２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／０２２７５９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／０３４０００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／０９３４３９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２００７－２５２３６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５０８１１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特許第７４３２８１３（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】特許第７３６３１３４（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】特開２０２２－０３４９４６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｐ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの改変された免疫グロブリン結合ドメインを含む免疫グロブリン結合性ポリペプチドであって、前記改変された免疫グロブリン結合ドメインが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。

【請求項2】

請求項１に記載の免疫グロブリン結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

【請求項3】

請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項4】

請求項２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３に記載の発現ベクターを含む、遺伝子組換え宿主。

【請求項5】

宿主が大腸菌である、請求項４に記載の遺伝子組換え宿主。

【請求項6】

請求項４または５に記載の遺伝子組換え宿主を培養し、請求項１に記載の免疫グロブリン結合性ポリペプチドを発現させる工程と、発現した前記ポリペプチドを回収する工程とを含む、免疫グロブリン結合性ポリペプチドの製造方法。

【請求項7】

不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化した請求項１に記載の免疫グロブリン結合性ポリペプチドとを含む、免疫グロブリン吸着剤。

【請求項8】

請求項７に記載の吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加し当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、前記溶液中に含まれる免疫グロブリンの分離方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫グロブリンに特異的に結合するポリペプチドに関する。より詳しくは、本発明は、免疫グロブリン吸着量に優れた前記ポリペプチドに関する。

【背景技術】

【0002】

抗体医薬は生体内の免疫機能を担う分子である抗体（免疫グロブリン）を利用した医薬である。抗体医薬は抗体が有する可変領域の多様性により標的分子に対し高い特異性と親和性をもって結合する。そのため抗体医薬は副作用が少なく、また、近年では適応疾患が広がってきていることもあり市場が急速に拡大している。

【0003】

抗体医薬の製造は培養工程と精製工程を含み、培養工程では生産性を向上させるために抗体産生細胞の改質や培養条件の最適化が図られている。また、精製工程では粗精製としてアフィニティークロマトグラフィーが採用され、その後の中間精製、最終精製、およびウイルス除去を経て製剤化される。

【0004】

精製工程では、不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化した抗体分子を特異的に認識するタンパク質（リガンド）とを含む、アフィニティー吸着剤も用いられている。前記リガンドとして、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（以下、ＳｐＡと略）や連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来のＰｒｏｔｅｉｎ Ｇなどが多く用いられている。

【0005】

抗体医薬を製造する際は、その生産コストを低く保つため、これらアフィニティー担体は複数回使用され、使用後は当該担体に残存した不純物を除去する工程を行なう。前記不純物を除去する工程では、通常、水酸化ナトリウムを用いた定置洗浄を行ない、アフィニティー担体を再生させる。従って前記リガンドタンパク質は、前記再生工程を行なっても、抗体への結合性が維持されるだけの化学的安定性を有する必要がある。

【0006】

化学的安定性を有する、アフィニティー担体で用いられるリガンドタンパク質の一例として、ＳｐＡのドメインＣのアミノ酸配列を利用したアルカリ安定クロマトグラフィーリガンド（特許文献１）や、ＳｐＡのドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＺのうち、いずれかのドメインの一部のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列から構成されるアフィニティークロマトリガンド（特許文献２）が挙げられる。また、ＳｐＡのドメインＣにおいてリジンを他のアミノ酸に置換することで、化学的安定性が向上することが知られている（特許文献３）。また、ドメインＺにおいて２９番目のグリシンをアラニンに置換することで、構造が安定化することが知られている（非特許文献１）。

【0007】

一方で、抗体医薬の生産性向上の観点から、アフィニティー吸着材当たりの抗体吸着量の増加も求められている。抗体吸着量を向上させたリガンドとして、免疫グロブリン結合ドメインをタンデムに連結したポリペプチド（非特許文献２）や、リンカーを介して免疫グロブリン結合ドメインを二つ以上連結したポリペプチド（特許文献４）が開示されている。このように抗体吸着量が向上した免疫グロブリン結合性ポリペプチドが求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【文献】特表２０１０－５０４７５４号公報

【文献】特開２０１２－２５４９８１号公報

【文献】ＷＯ２０１２／１３３３４２号

【文献】ＷＯ２０１５／０３４０００号

【非特許文献】

【0009】

【文献】Ｂｊｏｒｎ Ｎｉｌｓｓｏｎ他，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１（２），１０７－１１３，１９８７

【文献】Ｆｒｅｉｈｅｒｒ ｖｏｎ Ｒｏｍａｎ Ｍ他，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，（１３４７），８０－８６，２０１４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明の課題は、免疫グロブリン結合活性を有し、かつ免疫グロブリン吸着量が向上した免疫グロブリン結合性ポリペプチド、および不溶性担体と当該不溶性担体に固定化した前記ポリペプチドとを含む免疫グロブリン吸着剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＳｐＡ）の免疫グロブリン結合性ドメインにおいて少なくとも、黄色ブドウ球菌由来ＳｐＡのドメインＣ（配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるドメイン）の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基を、トリプトファンに置換することによって、免疫グロブリン吸着量が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。

【0012】

すなわち、本発明は以下の［１］から［１３］に示す態様を包含する。

【0013】

［１］ ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの改変された免疫グロブリン結合ドメインを含む免疫グロブリン結合性ポリペプチドであって、免疫グロブリン結合ドメインの改変が配列番号１の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基のトリプトファンへの置換を含むポリペプチド。

【0014】

［２］ 改変された免疫グロブリン結合ドメインが、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する、［１］に記載の免疫グロブリン結合性ポリペプチド：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において５０番目のリジンがトリプトファンに置換されたアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において５０番目のリジンがトリプトファンに置換され、さらに、５０番目以外の１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、ならびに／または付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列またはその部分配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、配列番号１の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基がトリプトファンに置換されているアミノ酸配列。

【0015】

［３］ 改変された免疫グロブリン結合ドメインが、さらに、
配列番号１の３５番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換、および
配列番号１の４９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のメチオニンへの置換
を含む、［１］または［２］に記載の免疫グロブリン結合性ポリペプチド。

【0016】

［４］ 改変された免疫グロブリン結合ドメインが、さらに、
配列番号１の３５番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換、
配列番号１の４９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のメチオニンへの置換、および
配列番号１の１１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換
を含む、［１］または［２］に記載の免疫グロブリン結合性ポリペプチド。

【0017】

［５］ 改変された免疫グロブリン結合ドメインが、さらに、
配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換、
配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換、
配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のバリンへの置換、
配列番号１の１５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、
配列番号１の２１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のチロシンへの置換、
配列番号１の２９番目のグリシンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、
配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基のグリシンへの置換、
配列番号１の４０番目のバリンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、
配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基のロイシンへの置換、および
配列番号１の５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換
を含む、［１］から［４］のいずれかに記載の免疫グロブリン結合性ポリペプチド。

【0018】

［６］ 改変された免疫グロブリン結合ドメインが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、［１］に記載のペプチド。

【0019】

［７］ ［１］から［６］のいずれかに記載の免疫グロブリン結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

【0020】

［８］ ［７］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【0021】

［９］ ［７］に記載のポリヌクレオチドまたは［８］に記載の発現ベクターを含む、遺伝子組換え宿主。

【0022】

［１０］ 宿主が大腸菌である、［９］に記載の遺伝子組換え宿主。

【0023】

［１１］ ［９］または［１０］に記載の遺伝子組換え宿主を培養し、［１］から［６］のいずれかに記載の免疫グロブリン結合性ポリペプチドを発現させる工程と、発現した前記ポリペプチドを回収する工程とを含む、免疫グロブリン結合性ポリペプチドの製造方法。

【0024】

［１２］ 不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化した［１］から［６］のいずれかに記載の免疫グロブリン結合性ポリペプチドとを含む、免疫グロブリン吸着剤。

【0025】

［１３］ ［１２］に記載の吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加し当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、前記溶液中に含まれる免疫グロブリンの分離方法。

【発明の効果】

【0026】

本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドにおいては少なくとも、配列番号１の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基のトリプトファンへの置換を導入することによって、免疫グロブリン吸着量が向上している。したがって、抗体（免疫グロブリン）分離用吸着剤を構成するリガンドポリペプチドとして有用である。

【発明を実施するための形態】

【0027】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0028】

本発明は、ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの改変された免疫グロブリン結合ドメイン（以下「改変型免疫グロブリン結合ドメイン」とも称する）を含み、免疫グロブリン結合ドメインの改変が配列番号１の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基のトリプトファンへの置換を含む免疫グロブリン結合性ポリペプチドに関する。

【0029】

本発明において「免疫グロブリン結合性」とは、免疫グロブリンに対する結合性を意味し、「免疫グロブリン結合活性」または「抗体結合活性」とも称する。また、免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合性であってもよい。「免疫グロブリン結合性ポリペプチド」とは、免疫グロブリン結合性を有するポリペプチドを意味する。なお、任意のポリペプチドが免疫グロブリン結合性を有するか否かは、当業者であれば、公知の手法、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法を用い測定することにより判定できる。

【0030】

本発明において、後述の本発明にかかるアミノ酸置換（Ｌｙｓ５０Ｔｒｐ等）が導入されることにより改変される「免疫グロブリン結合ドメイン」とは、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（以下、ＳｐＡと略）の免疫グロブリン結合ドメインを意味する。

【0031】

ＳｐＡの由来であるブドウ球菌属細菌としては、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）が挙げられる。免疫グロブリン結合ドメインとしては、ドメインＣ、ドメインＥ、ドメインＤ、ドメインＡ、ドメインＢ／Ｚが挙げられる。免疫グロブリン結合ドメインとしては、特に、ドメインＣが挙げられる。黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＣとしては、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の２７０番目から３２７番目までのアミノ酸残基が挙げられる。当該ドメインＣのアミノ酸配列を配列番号１に示す。また黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＥとしては、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の３７番目から９２番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチドが挙げられる。当該ドメインＥのアミノ酸配列を配列番号４に示す。また黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＤとしては、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の９３番目から１５３番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチドが挙げられる。当該ドメインＤのアミノ酸配列を配列番号５に示す。また黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＡとしては、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の１５４番目から２１１番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチドが挙げられる。当該ドメインＡのアミノ酸配列を配列番号６に示す。また黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＢとしては、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の２１２番目から２６９番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチドが挙げられる。当該ドメインＢのアミノ酸配列を配列番号７に示す。また黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＺとしては、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。

【0032】

後述のＬｙｓ５０Ｔｒｐ等が導入されることにより改変される、本発明にかかるＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインは、前述の特定のアミノ酸配列のような、天然に見出される配列であってもよく、またそのバリアント（ｖａｒｉａｎｔ）配列であってもよい。

【0033】

バリアント配列としては、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメイン（例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列）において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列が挙げられる。

【0034】

前記「１もしくは数個」とは、アミノ酸残基のポリペプチドの立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１から３０個、１から２０個、１から１０個、１から９個、１から８個、１から７個、１から６個、１から５個、１から４個、１から３個、１から２個、１個のいずれかを意味する。前記のアミノ酸残基の置換の一例としては、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が挙げられる。保守的置換の場合、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でポリペプチドの機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間での置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。また、前記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加には、例えば、ポリペプチドまたはそれをコードする遺伝子が由来する微生物の個体差や種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ミュータント（ｍｕｔａｎｔ）またはバリアント（ｖａｒｉａｎｔ））によって生じるものも含まれる。

【0035】

また、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインのバリアント配列としては、前記ドメインのアミノ酸配列（例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列）またはその部分配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列も挙げられる。前記「相同性」とは、類似性（Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよく、特に同一性を意味してもよい。アミノ酸配列間の「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。アミノ酸配列間の「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。側鎖の性質が類似したアミノ酸残基については前述した通りである。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラムを利用して決定できる。前記「高い相同性」とは、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を意味してよい。

【0036】

本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドは、上述のＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインにおいて、少なくとも配列番号１の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基のトリプトファンへの置換が導入されたことにより改変されたポリペプチドである。

【0037】

なお、本発明において、「配列番号１のα番目のアミノ酸」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端から数えてα位の位置に存在するアミノ酸を意味する。あるアミノ酸配列における「配列番号１のα番目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基」とは、あるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当該あるアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアライメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）において配列番号１に示すアミノ酸配列におけるα番目のアミノ酸と同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。前記アライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のアライメントプログラムを利用して実施できる。また、本発明において「Ｘａａ_１αＸａａ_２」とは、配列番号１のα番目のＸａａ_１に相当するアミノ酸残基のＸａａ_２への置換を意味する。すなわち、「配列番号１の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基のトリプトファンへの置換」は、Ｌｙｓ５０Ｔｒｐとも表記される。

【0038】

本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドは、改変型免疫グロブリン結合ドメインにおいて、Ｌｙｓ５０Ｔｒｐ以外の他のアミノ酸置換をさらに有してもよい（Ｌｙｓ５０Ｔｒｐ及び他のアミノ酸置換を「本発明にかかるアミノ酸置換」又は「Ｌｙｓ５０Ｔｒｐ等」とも総称する）。他のアミノ酸置換としては、Ａｓｎ１１Ａｒｇ、Ｌｙｓ３５ＡｒｇおよびＬｙｓ４９Ｍｅｔのうちいずれか１つ以上のアミノ酸置換が挙げられる。また、Ａｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのうちいずれか１つ以上のアミノ酸置換、ならびに／または構造安定性が増すことが知られているＧｌｙ２９Ａｌａのアミノ酸置換（Ｂｊｏｒｎ Ｎｉｌｓｓｏｎ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１（２），１０７－１１３，１９８７）が、前記他のアミノ酸置換として、改変型免疫グロブリン結合ドメインに導入されていてもよい。また、他のアミノ酸置換としては、Ａｓｐ２Ｇｌｕ、Ａｓｐ３Ｉｌｅ、Ａｓｐ３Ｔｈｒ、Ａｓｐ４Ｔｈｒ、Ａｓｎ１１Ｔｙｒ、Ｓｅｒ３９Ｃｙｓ、Ｇｌｕ４７Ｖａｌ、Ｌｙｓ５８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ５８ＶａｌおよびＬｙｓ５８Ａｓｎのうちいずれか１つ以上のアミノ酸置換も挙げられる。

【0039】

本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドが、Ｌｙｓ５０Ｔｒｐ以外の他のアミノ酸置換（Ａｓｎ１１Ａｒｇ等）を２つまたはそれ以上有する場合、当該他のアミノ酸置換の組み合わせは特に制限されないが、前記他のアミノ酸置換の組み合わせとして、具体的には、
Ｌｙｓ３５ＡｒｇおよびＬｙｓ４９Ｍｅｔのアミノ酸置換、
Ａｓｎ１１Ａｒｇ、Ｌｙｓ３５ＡｒｇおよびＬｙｓ４９Ｍｅｔのアミノ酸置換、
Ａｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ａｒｇ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｌｙｓ３５Ａｒｇ、Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２Ｌｅｕ、Ｌｙｓ４９ＭｅｔおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換、
が挙げられる。

【0040】

本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドとして、より具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列において、Ａｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ａｒｇ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｌｙｓ３５Ａｒｇ、Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２Ｌｅｕ、Ｌｙｓ４９Ｍｅｔ、Ｌｙｓ５０ＴｒｐおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換が導入された、改変型免疫グロブリン結合ドメイン（配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む改変型免疫グロブリン結合ドメイン）が挙げられる。

【0041】

なお、配列番号３に記載のアミノ酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換が導入された配列（配列番号２に記載のアミノ酸配列）に、Ａｓｎ１１Ａｒｇ、Ｌｙｓ３５Ａｒｇ、Ｌｙｓ４９ＭｅｔおよびＬｙｓ５０Ｔｒｐのアミノ酸置換がさらに導入された配列である。

【0042】

本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドは、上述の改変型免疫グロブリン結合ドメインを１個のみ含んでいてもよく、改変型免疫グロブリン結合ドメインを複数個含んでいてもよい。本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドは、例えば、改変型免疫グロブリン結合ドメインを２個以上、３個以上、４個以上、または５個以上含んでいてもよく、１０個以下、７個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下含んでいてもよく、それらの矛盾しない組み合わせの個数含んでいてもよい。本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドが複数個の改変型免疫グロブリン結合ドメインを含む場合、それら複数個の改変型免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列は同一であってもよく、そうでなくてもよい。それら複数個の改変型免疫グロブリン結合ドメインは、例えば、適切なリンカーを介して互いに連結されていてよい。なお、かかるリンカーとして、その配列および長さ等に関し、特に制限はないが、例えば、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ等の繰り返し単位が複数連結されてなるリンカーが挙げられる。また、最も一般的なリンカーとしては、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒを３回繰り返してなるリンカーが挙げられる。

【0043】

本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドは、選択した免疫グロブリン結合ドメイン由来の改変型免疫グロブリン結合ドメインに加えて、他の免疫グロブリン結合ドメインの一部および／またはＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメイン以外の領域の一部を含んでいてもよい。例えば、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドがドメインＣ由来の改変型免疫グロブリン結合ドメインを含む場合、さらに、ＳｐＡのドメインＣのＮ末端側領域（ドメインＥ、ドメインＤ、ドメインＡ、ドメインＢ／Ｚ）の一部を含んでいてもよく、またＳｐＡのドメインＣのＣ末端側領域の一部を含んでいてもよい。

【0044】

本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドは、改変型免疫グロブリン結合ドメインのみからなるものであってもよく、他のアミノ酸配列（例えばオリゴペプチド）をさらに含んでいてもよい。例えば、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドにおいて、改変型免疫グロブリン結合ドメインのＮ末端側およびＣ末端側の少なくともいずれか一方に他のアミノ酸配列が付加されていてもよい。

【0045】

他のアミノ酸配列は、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドの免疫グロブリン結合性や安定性を損なわない限り、例えば、その種類、長さ等は、特に制限されない。より具体的には、目的物を特異的に検出または分離する目的で、ポリヒスチジンやポリアルギニン等のポリペプチドを、改変型免疫グロブリン結合ドメインの末端に直接または間接的に付加することが挙げられる。また、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドをクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する目的で、リジンやシステインを含むオリゴペプチド等を、改変型免疫グロブリン結合ドメインの末端に直接または間接的に付加することが挙げられる。

【0046】

本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドが前記のような他のアミノ酸配列を含む場合、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドは、例えば、予め他のアミノ酸配列を含む形態で製造されてもよいし、別途製造された前記のような他のアミノ酸配列が付加されてもよい。本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドが前記のような他のアミノ酸配列を含む場合、典型的には、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドは、前記のような他のアミノ酸配列を含む本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドの全長アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドから発現させることで製造できる。すなわち、例えば、他のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチド（例えば他のアミノ酸配列を含まないもの）をコードするポリヌクレオチドとを、他のアミノ酸配列が本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドのＮ末端側またはＣ末端側に付加されるように連結し、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドを発現させてもよい。また例えば、化学的に合成した他のアミノ酸配列を本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチド（例えば他のアミノ酸配列を含まないもの）のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させてもよい。

【0047】

本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドは、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから発現させることで製造できる。本明細書では、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、「本発明のポリヌクレオチド」ともいう。本発明のポリヌクレオチドは、具体的には、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであってよい。

【0048】

本発明のポリヌクレオチドは、例えば、化学合成法、またはＰＣＲ法等のＤＮＡ増幅法により取得できる。ＤＮＡ増幅法は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列等の増幅すべきヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを鋳型として実施できる。鋳型とするポリヌクレオチドとしては、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドを発現する生物のゲノムＤＮＡ、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドのｃＤＮＡ、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドのアミノ酸配列からの変換により設計できる。アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際には、標準のコドンテーブルを使用できるが、本発明のポリヌクレオチドで形質転換する宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ）であるため）、それらのコドンを避けるように変換してよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のウェブサイトにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。

【0049】

また本発明のポリヌクレオチドは、例えば、上述の免疫グロブリン結合ドメイン（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列またはそのバリアント配列を含む免疫グロブリン結合ドメイン）をコードするポリヌクレオチドに、当該ドメインがＬｙｓ５０Ｔｒｐ等のアミノ酸置換を有するように変異を導入することによっても、取得できる。免疫グロブリン結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、例えば、化学合成法、またはＰＣＲ法等のＤＮＡ増幅法で取得できる。本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドが、その改変型免疫グロブリン結合ドメインにおいて２以上のアミノ酸置換を有している場合、それらのアミノ酸置換は、例えば、同時に、または順次、導入されてよい。例えば、免疫グロブリン結合性ドメインをコードするポリヌクレオチドに、当該ドメインにおいて２箇所以上の本発明にかかるアミノ酸置換を有するように変異を導入してもよい。また、ある位置のアミノ酸残基を２回以上改変してもよい。例えば、既にＡｓｎ１１Ｌｙｓのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性ポリペプチドをさらにＡｓｎ１１Ａｒｇのアミノ酸置換を導入してもよい。

【0050】

またポリヌクレオチドは、前記例示したアミノ酸置換を生じる変異に限られず、バリアント配列の構築のための変異等の任意の変異を導入して、本発明のポリヌクレオチドまたはそれを取得するための材料として利用してよい。

【0051】

ポリヌクレオチドへ変異を導入する方法としては、エラープローンＰＣＲ法が挙げられる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、ポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に制限されない。例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ_２を０．０１から１０ｍＭ（好ましくは０．１から１ｍＭ）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入できる。

【0052】

また、ポリヌクレオチドへ変異を導入する方法としては、インバースＰＣＲ法も挙げられる。インバースＰＣＲ法は、まず目的とする遺伝子を挿入したポリヌクレオチドを変性させた後、変異プライマーをアニーリングさせ、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行なう。伸長したポリヌクレオチドを制限酵素ＤｐｎＩを用いて選択的に切断し、新たに合成された遺伝子をリン酸化、ライゲーションを実施し、環化させることでポリヌクレオチドに変異を導入できる。

【0053】

さらにポリヌクレオチドへ変異を導入する方法としては、前述したエラープローンＰＣＲ法やインバースＰＣＲ法以外にも、ポリヌクレオチドに変異原となる薬剤を作用させること、または、ポリヌクレオチドに紫外線を照射すること、ポリヌクレオチドに変異を導入する方法が挙げられる。変異原となる薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン等の、当業者が通常用いる変異原性薬剤が挙げられる。このようなポリヌクレオチドへ変異を導入する方法は、前記例示したアミノ酸置換の導入に限られず、バリアント配列の構築（例えば、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加の導入や、前記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化）にも利用できる。

【0054】

本発明のポリヌクレオチドは、例えば、その全長配列を一括して取得してもよく、その部分配列をそれぞれ取得し連結することで取得してもよい。前記のような本発明のポリヌクレオチドを取得する手法についての説明は、その全長配列を一括して取得する場合に限られず、その部分配列を取得する場合にも準用できる。

【0055】

本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドは、具体的には、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え宿主に本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドを発現させることで製造できる。本明細書では、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え宿主を、「本発明の遺伝子組換え宿主」ともいう。本発明の遺伝子組換え宿主は、本発明のポリヌクレオチドを含むことに依拠して、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドを発現できる。すなわち、本発明の遺伝子組換え宿主は、言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドを発現可能な宿主である。

【0056】

本発明の遺伝子組換え宿主は、例えば、本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換することで得られる。すなわち、本発明の遺伝子組換え宿主は、例えば、本発明のポリヌクレオチドで遺伝子組換え（形質転換）された宿主であってよく、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主であってよく、また本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドを発現可能な宿主であってよい。遺伝子組換えに用いる宿主は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換されることで本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドを発現可能な宿主であれば特に制限されない。宿主としては、動物細胞、昆虫細胞、微生物が挙げられる。動物細胞としては、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、Ｓｆ９細胞、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞が挙げられる。微生物としては、酵母や細菌が挙げられる。酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ等のＰｉｃｈｉａ属酵母、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等のＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母が挙げられる。細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌が挙げられる。大腸菌としては、ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株が挙げられる。なお、酵母や大腸菌を宿主として用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。

【0057】

本発明のポリヌクレオチドは、発現可能に本発明の遺伝子組換え宿主に保持されていればよい。本発明のポリヌクレオチドは、具体的には、宿主で機能するプロモーターの制御下で発現するように保持されていればよい。宿主で機能するプロモーターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーターが挙げられる。

【0058】

本発明の遺伝子組換え宿主において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ゲノムＤＮＡ外で自律複製するベクター上に存在していてよい。すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターとして宿主に導入できる。すなわち本発明の遺伝子組換え宿主は、一態様において、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主であってよい。本明細書では、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、「本発明の発現ベクター」ともいう。本発明の発現ベクターは、例えば、発現ベクターの適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入することで得られる。なお発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限されない。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクターを例示できる。発現ベクターは、抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーを備えていてよい。また前記適切な位置とは、発現ベクター複製機能、選択マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモーター等の機能性ポリヌクレオチドに連結された状態で挿入すると好ましい。

【0059】

また本発明の遺伝子組換え宿主において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ゲノムＤＮＡ上に導入されていてもよい。ゲノムＤＮＡへの本発明のポリヌクレオチドの導入は、例えば、相同組み換えによる遺伝子導入法を利用して実施できる。相同組み換えによる遺伝子導入法としては、Ｒｅｄ－ｄｒｉｖｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ法（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ，ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：６６４０－６６４５（２０００））等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むベクターを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないベクターを用いる方法、ファージを用いたｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ法が挙げられる。

【0060】

本発明の発現ベクター等のポリヌクレオチドを用いた宿主の形質転換は、例えば、当業者が通常用いる方法で行なえる。例えば、宿主として大腸菌を選択する場合には、コンピテントセル法、ヒートショック法、エレクトロポレーション法等形質転換できる。形質転換後に適切な方法でスクリーニングすることで、本発明の遺伝子組換え宿主を取得できる。

【0061】

各種微生物において利用可能な発現ベクターやプロモーター等の遺伝子工学的手法に関する情報については、例えば、「微生物学基礎講座８ 遺伝子工学、共立出版、１９８７年」に詳細に記載されており、それらを利用できる。

【0062】

本発明の遺伝子組換え宿主が本発明の発現ベクターを含む場合、本発明の遺伝子組換え宿主から本発明の発現ベクターを調製できる。例えば、本発明の遺伝子組換え宿主を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等の市販の抽出キットを用いて本発明の発現ベクターを調製できる。

【0063】

本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドを発現できる。また本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドを発現させ、当該発現したポリペプチドを回収することで、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドを製造できる。すなわち本発明は、例えば、本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドを発現させる工程と、発現させた前記ポリペプチドを回収する工程とを含む、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドの製造方法を提供する。培地組成や培養条件は、宿主の種類や本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドの特性等の諸条件に応じて適宜設定できる。培地組成や培養条件は、例えば、宿主が増殖でき、かつ本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドを発現できるように設定できる。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、無機塩、その他の各種有機成分や無機成分を適宜含む培地を利用できる。例えば、宿主が大腸菌の場合、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（トリプトン１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム１％（ｗ／ｖ））が好ましい培地の一例として挙げられる。なお、本発明の発現ベクターの導入の有無に基づき、本発明の遺伝子組換え宿主を選択的に増殖させるために、培地に当該発現ベクターに含まれる抗生物質耐性遺伝子に対応した抗生物質を添加して培養すると好ましい。例えば、当該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は培地にカナマイシンを添加すればよい。本発明のポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ上に導入されている場合も同様である。また培地は、グルタチオン、システイン、シスタチン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでいてもよい。また、培地は、グリシン等の前記遺伝子組換え宿主から培養液へのポリペプチド分泌を促す試薬を含んでいてもよい。例えば、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は、例えば、宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であってよい。培地のｐＨは、例えば、宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後であってよい。また、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドを誘導性のプロモーターの制御下で発現する場合は、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドが良好に発現できるように誘導をかけると好ましい。発現誘導には、例えば、プロモーターの種類に応じた誘導剤を利用できる。誘導剤としては、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示できる。例えば、宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）が約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加し、引き続き培養することで、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドの発現を誘導できる。ＩＰＴＧの添加濃度は、例えば、０．００５から１．０ｍＭ、好ましくは０．０１から０．５ｍＭであってよい。ＩＰＴＧ誘導等の発現誘導は、例えば、当該技術分野において周知の条件で行なえる。

【0064】

本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドは、その発現形態に適した方法で培養物から分離して回収できる。なお、本明細書において「培養物」とは、培養で得られた培養液の全体またはその一部を意味する。当該一部は、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドを含む部分であれば特に制限されない。当該一部としては、培養された本発明の遺伝子組換え宿主の細胞や培養後の培地（すなわち培養上清）が挙げられる。例えば、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドが培養上清に蓄積する場合、細胞を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドを回収できる。また、本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドが細胞内（ペリプラズムを含む）に蓄積する場合、細胞を遠心分離操作にて回収した後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することで細胞を破砕して、破砕物から本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドを回収できる。培養上清や細胞破砕物からの本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドの回収は、例えば、ポリペプチドの分離精製に用いられる公知の方法で行なえる。そのような方法としては、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿が挙げられる。

【0065】

本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドは、例えば、免疫グロブリン（抗体）の分離または分析に使用できる。本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドは、例えば、不溶性担体に固定化して使用できる。すなわち、免疫グロブリン（抗体）の分離または分析は、具体的には、例えば、不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化された本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドとを含む、免疫グロブリン吸着剤を用いて実施できる。本明細書では、不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化された本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドとを含む、免疫グロブリン吸着剤を、「本発明の免疫グロブリン吸着剤」ともいう。なお「免疫グロブリンの分離」とは、夾雑物質共存化の溶液からの免疫グロブリンの分離に限らず、構造、性質または活性等に基づく免疫グロブリン間の分離も含まれる。不溶性担体は特に制限されない。不溶性担体としては、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や、シリカ等のセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー社製）等のヒドロキシ基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ社製）等のセルロースゲルが挙げられる。不溶性担体の形状は特に制限されない。不溶性担体は、例えば、カラムに充填できる形状であってよい。不溶性担体は、例えば、粒状物または非粒状物であってよい。また、不溶性担体は、例えば、多孔性または非多孔性であってもよい。

【0066】

本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドは、例えば、共有結合を介して不溶性担体に固定化できる。本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドは、具体的には、例えば、不溶性担体が有する活性基を介して本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドと不溶性担体とを共有結合させることで、不溶性担体に固定化できる。すなわち、不溶性担体は、活性基を有していてよい。不溶性担体は、例えば、その表面に活性基を有していてよい。活性基としては、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミドが挙げられる。活性基を有する不溶性担体としては、例えば、活性基を有する市販の不溶性担体をそのまま用いてもよいし、不溶性担体に活性基を導入して用いてもよい。活性基を有する市販の担体としては、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｅｐｏｘｙ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）が例示できる。

【0067】

担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。

【0068】

担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。

【0069】

また担体表面に存在するエポキシ基にカルボキシ基を導入する化合物としては、２－メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプト酪酸、グリシン、３－アミノプロピオン酸、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸を例示できる。

【0070】

また担体表面に存在するヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ－（ε－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酢酸ヒドラジド、２－アミノマレイミド、３－アミノマレイミド、４－アミノマレイミド、６－アミノマレイミド、１－（４－アミノフェニル）マレイミド、１－（３－アミノフェニル）マレイミド、４－（マレイミド）フェニルイソシアナート、２－マレイミド酢酸、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボニル－（６－アミノヘキサン酸）、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸、（ｐ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。

【0071】

また担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２－（ヨードアセトアミド）酢酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、４－（ヨードアセチル）アミノ安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。

【0072】

また担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にω－アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω－アルケニル部位をハロゲン化することで活性化する方法も例示できる。ω－アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３－ブテニルグリシジルエーテル、４－ペンテニルグリシジルエーテルを例示できる。ハロゲン化剤としては、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドを例示できる。

【0073】

また担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するカルボキシ基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性基を導入する方法も例示できる。縮合剤としては１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。添加剤としては、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４－ニトロフェノール、１－ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。

【0074】

本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチドの不溶性担体への固定化は、例えば、緩衝液中で実施できる。緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、Ｔｒｉｓ（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、例えば、活性基の反応性や免疫グロブリン結合性ポリペプチドの安定性等の諸条件に応じて適宜設定できる。固定化させるときの反応温度は、例えば、５℃から５０℃であってよく、好ましくは１０℃から３５℃であってよい。

【0075】

本発明の免疫グロブリン吸着剤は、例えば、カラムに充填して免疫グロブリン（抗体）の分離に使用できる。具体的には、例えば、本発明の免疫グロブリン吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させ、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させることで、免疫グロブリンを分離できる。すなわち、本発明は、例えば、本発明の免疫グロブリン吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、免疫グロブリンの分離方法を提供する。免疫グロブリンを含む溶液は、例えば、ポンプ等の送液手段を用いてカラムに添加できる。なお本明細書では、液体をカラムに添加することを、「液体をカラムに送液する」ともいう。なお免疫グロブリンを含む溶液は、カラムに添加する前に予め適切な緩衝液を用いて溶媒置換してよい。また、免疫グロブリンを含む溶液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化してよい。前記平衡化により、例えば、免疫グロブリンをより高純度に分離できると期待される。溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液が例示できる。そのような緩衝液には、例えば、さらに、１０ｍＭから１００ｍＭの塩化ナトリウム等の無機塩を添加してもよい。溶媒置換に用いる緩衝液と平衡化に用いる緩衝液は、同一であってもよく、同一でなくてもよい。また、免疫グロブリンを含む溶液のカラムへの通液後に夾雑物質等の免疫グロブリン以外の成分がカラムに残存している場合、免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出する前に、そのような成分をカラムから除去してよい。免疫グロブリン以外の成分は、例えば、適切な緩衝液を用いてカラムから除去できる。免疫グロブリン以外の成分の除去に用いる緩衝液については、例えば、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液についての記載を準用できる。免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、例えば、免疫グロブリンとリガンド（本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチド）との相互作用を弱めることで、溶出できる。免疫グロブリンとリガンド（本発明の免疫グロブリン結合性ポリペプチド）との相互作用を弱める手段としては、緩衝液によるｐＨの低下、カウンターペプチドの添加、温度上昇、塩濃度変化が例示できる。免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、具体的には、例えば、適切な溶出液を用いて溶出できる。溶出液としては、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液よりも酸性側の緩衝液が挙げられる。そのような緩衝液としては、クエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。溶出液のｐＨは、例えば、免疫グロブリンの機能（抗原への結合性等）を損なわない範囲で設定できる。

【0076】

このようにして免疫グロブリン（抗体）の分離を実施することで、例えば、分離された免疫グロブリンが得られる。すなわち、免疫グロブリンの分離方法は、一態様において、免疫グロブリンの製造方法であってよく、具体的には、分離された免疫グロブリンの製造方法であってよい。免疫グロブリンは、例えば、免疫グロブリンを含む溶出画分として得られる。すなわち、溶出された免疫グロブリンを含む画分を分取できる。画分の分取は、例えば、常法で行なえる。画分を分取する方法としては、一定の時間ごとや、一定の容量ごとに回収容器を交換する方法や、溶出液のクロマトグラムの形状に合わせて回収容器を換える方法や、オートサンプラー等の自動フラクションコレクター等画分の分取をする方法が挙げられる。さらに、免疫グロブリンを含む画分から免疫グロブリンを回収することもできる。免疫グロブリンを含む画分からの免疫グロブリンの回収は、例えば、タンパク質の分離精製に用いられる公知の方法で行なえる。

【実施例】

【0077】

以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。

【0078】

（免疫グロブリン結合性ポリペプチドの調製）
（比較例１） 配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる免疫グロブリン結合性ポリペプチドＳｐＡ１０ａのＣ末端側に不溶性担体へ固定化するためのタグ配列（Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ）を付加したポリペプチドＳｐＡ１０ａ－Ｋ３（配列番号９）を設計した。なおＳｐＡ１０ａは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる天然型ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（以下、ＳｐＡ）のドメインＣ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の２７０番目から３２７番目までのアミノ酸残基）に対し、Ａｓｎ３Ｈｉｓ（この表記は配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジンに置換されていることを表す、以下同じ）、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。

【0079】

（実施例１） 配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる免疫グロブリン結合性ポリペプチドＳｐＡ１０ｂのＣ末端側に不溶性担体へ固定化するためのタグ配列（Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ）を付加したポリペプチドＳｐＡ１０ｂ－Ｋ３（配列番号１３）を設計した。なおＳｐＡ１０ｂは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＳｐＡ１０ａに対し、Ａｓｎ１１Ａｒｇ、Ｌｙｓ３５Ａｒｇ、Ｌｙｓ４９ＭｅｔおよびＬｙｓ５０Ｔｒｐのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。

【0080】

（１）前記（比較例１）および（実施例１）で設計したＳｐＡ１０ａ－Ｋ３およびＳｐＡ１０ｂをコードするポリヌクレオチドを合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を各々含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成した各ポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１０（５’－ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣＣＧＡＴＡＴＴＣＧＣＴＴＴＡ－３’）および配列番号１１（５’－ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣ－３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、表１に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９８℃で３０秒間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で６０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で２分間熱処理することで行なった。

【0081】

【表1】

【0082】

（２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩとで消化後、予め制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化した発現ベクターｐＥＴ－２８ａにライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ニッポンジーン社製）を形質転換した。

【0083】

（３）得られた形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔを用いて発現ベクター（各々ｐＥＴ－ＳｐＡ１０ａ－Ｋ３、ｐＥＴ－ＳｐＡ１０ｂ－Ｋ３と命名）を抽出した。

【0084】

（４）得られた抽出物のうち、免疫グロブリン結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。

【0085】

配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ１０ａ－Ｋ３およびｐＥＴ－ＳｐＡ１０ｂ－Ｋ３に、ＳｐＡ１０ａ－Ｋ３をコードするポリヌクレオチドおよびＳｐＡ１０ｂ－Ｋ３をコードするポリヌクレオチドが各々挿入されていることを確認した。ＳｐＡ１０ａ－Ｋ３をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１２に示す。ＳｐＡ１０ｂ－Ｋ３をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１４に示す。

【0086】

（免疫グロブリン結合性ポリペプチドの調製）
（１）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地（トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ））２０ｍＬに、上記にて作製したｐＥＴ－ＳｐＡ１０ａ－Ｋ３またはｐＥＴ－ＳｐＡ１０ｂ－Ｋ３を含む遺伝子組換え大腸菌を接種し、前培養した（３０℃、１６時間）。

【0087】

（２）前培養後の培養液１０ｍＬを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地１Ｌに接種し、３７℃で２から３時間培養後、０．５ＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を２００μＬ加えて、さらに２０℃で終夜振とう培養した。

【0088】

（３）培養後の培養液を遠心分離し、湿重量８ｇの培養菌体を回収した。当該培養菌体のうち２ｇをＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（メルクミリポア社製）を用いて溶菌し、遠心分離により取得した上清をフィルターに通し、清澄化した。

【0089】

（４）あらかじめ０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０５ＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７．６）（以下、洗浄緩衝液と表記）により平衡化したＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに、（３）で清澄化した上清を添加し、前記カラムに充填した担体の１０倍量の洗浄緩衝液で洗浄後、０．１Ｍグリシン―塩酸緩衝液（ｐＨ ３．０）（以降、酸性溶液と表記）を通液することで、免疫グロブリン結合性ポリペプチドに相当する画分を回収した。

【0090】

（５）回収した画分の吸光度を分光光度計により測定し、当該画分に含まれるポリペプチド量を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、免疫グロブリン結合性ポリペプチド（ＳｐＡ１０ａ－Ｋ３またはＳｐＡ１０ｂ－Ｋ３）が純度よく精製されていることを確認した。

【0091】

（免疫グロブリン吸着剤の作製）
（１）前記にて調製した、精製免疫グロブリン結合性ポリペプチド（ＳｐＡ１０ａ－Ｋ３またはＳｐＡ１０ｂ－Ｋ３）を含む画分を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（メルクミリポア社製）により元の体積の１０分の１量まで濃縮した。当該濃縮溶液に対し１０倍量のリン酸ナトリウム緩衝液を加え、再度Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（メルクミリポア社製）により元の体積の１０分の１量まで濃縮した。これら操作により、前記画分の濃縮および緩衝液置換を行なった。

【0092】

（２）活性基としてホルミル基を有した不溶性担体である、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｆｏｒｍｙｌ－６５０（東ソー社製）を純水に置換後、吸引ろ過で乾燥した。吸引濾過後のサクションドライゲルの含水率を含水率計（メトラートレド社製）で測定後、共栓付き三角フラスコに、ゲルとして０．５から３．０ｇ加えた。

【0093】

（３）サクションドライゲルが入った共栓付き三角フラスコに、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む緩衝液（ホウ酸またはリン酸緩衝液）を加え、サクションドライゲルを膨潤させた。

【0094】

（４）（１）で調製した免疫グロブリン結合性ポリペプチドの濃縮液を、終濃度が５ｇ／Ｌとなるよう共栓付き三角フラスコに加え、室温で振とうすることで、当該フラスコ内に入っているゲルとポリペプチドとをシッフ塩基形成により結合した。１５分から４時間後に共栓付き三角フラスコの上清を一部回収し、結合していない免疫グロブリン結合性ポリペプチドの割合から、前記ポリペプチドのゲルへの固定化量を算出した。

【0095】

（５）１ＭのＮａＢＨ_４水溶液を適量加え、室温で１５分から２時間振とうすることで、残存シッフ塩基を還元し、免疫グロブリン吸着剤を作製した。作製した吸着剤は水洗後、２０％（ｖ／ｖ）エタノールに置換し保存した。

【0096】

（免疫グロブリン吸着剤の静的吸着量の測定）
（１）前記にて作製した免疫グロブリン吸着剤をそれぞれ５０％（ｗ／ｖ）スラリーに調製し、当該スラリー１００μＬをミニバイオスピンカラム（ＢＩＯＲＡＤ社製）へ添加した。

【0097】

（２）酸性溶液および洗浄緩衝液を通液して洗浄後、洗浄緩衝液で希釈した免疫グロブリン溶液（日本血液製剤機構社製）（４３ｍｇ／ｍＬ）を添加し、恒温振とう培養機（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて２５℃、１０００ｒｐｍで２時間振とうすることで、免疫グロブリンを不溶性担体に吸着させた。

【0098】

（３）洗浄緩衝液を通液することで未吸着の免疫グロブリンを洗浄後、酸性溶液を用いて吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出した。溶出液の吸光度（波長２８０ｎｍ）を分光光度計で測定し、当該溶出液に含まれる免疫グロブリンの量から、吸着剤の静的吸着量を算出した。得られた結果を表２に示す。

【0099】

【表2】

【0100】

免疫グロブリン結合性ポリペプチドとしてＳｐＡ１０ｂ（配列番号３）を用いることでＳｐＡ１０ａ（配列番号２）を用いたときよりも、静的吸着量が向上した。このことから免疫ブロブリン結合性ポリペプチドにＬｙｓ５０Ｔｒｐのアミノ酸置換を導入することで、免疫ブロブリンの静的吸着量が向上することがわかる。

【産業上の利用可能性】

【0101】

以上説明したように、本発明において、免疫グロブリン結合ドメインに、Ｌｙｓ５０Ｔｒｐのアミノ酸置換を導入することによって、免疫グロブリン（抗体）吸着量が向上した吸着剤が得られる。つまり本発明により、試料中に含まれる免疫グロブリンを、より高効率に取得できる。

【0102】

したがって、本発明は、抗体医薬や抗体診断薬分野におけるイムノグロブリンの製造、生体成分からのイムノグロブリン除去、成分分析等において有用である。

【配列表】

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