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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-12
(45)【発行日】2024-11-20
(54)【発明の名称】神経細胞への分化誘導方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20241113BHJP
C12N 5/0793 20100101ALI20241113BHJP
C12N 5/02 20060101ALI20241113BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775 ZNA
C12N5/0793
C12N5/02
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2024527466
(86)(22)【出願日】2024-01-18
(86)【国際出願番号】 JP2024001296
【審査請求日】2024-05-09
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】512292315
【氏名又は名称】株式会社バイオ未来工房
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100181847
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 かおり
(72)【発明者】
【氏名】石塚 保行
【審査官】戸来 幸男
(56)【参考文献】
【文献】特表２００４－５２７２５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００５－３３０２０６（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００－５／２８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
Ｇｏｏｇｌｅ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）６０.０～９０.０ｖｏｌ％の基礎培地と、１０.０～４０.０ｖｏｌ％の生理食塩水と、
を含み、さらに、
１.０～１００.０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２と、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦと、
０．５～８．０ｍＭのリン酸アスコルビルマグネシウムと、
が添加されて構成される、幹細胞培養用培地で、間葉系幹細胞を１～１０日間培養し、
ｂ）その後、上記培養により得られた培養液のタンパク質成分を有機溶媒で沈殿させ、
ｃ）沈殿部分を分取して生理食塩水または基礎培地に溶解させることにより得られる、
細胞産生タンパク質（ＣＰＰｓ）組成物を含む培地を用いて、３×１０３～２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した間葉系幹細胞を１～３日間培養することにより、間葉系幹細胞を神経細胞に分化させる、神経細胞への分化誘導方法。
【請求項2】
前記ＣＰＰｓ組成物は、コラーゲンを含む、請求項１に記載の神経細胞への分化誘導方法。【請求項3】
前記コラーゲンは、Ｉ型のコラーゲンおよび／またはプロコラーゲンを含む、請求項２に記載の神経細胞への分化誘導方法。【請求項4】
前記ＣＰＰｓ組成物を含む培地が、ＴＡＴ‐ＶＨＬをさらに含む、請求項１に記載の神経細胞への分化誘導方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、神経細胞への分化誘導方法に関し、特に、所定の幹細胞培養用培地で間葉系幹細胞を培養することにより得られた細胞産生タンパク質組成物（ＣＰＰｓ組成物）により、間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導する方法を提供する。
【背景技術】
【0002】
近年、体性幹細胞と呼ばれる、成体の組織から採取可能な幹細胞が注目を集めている。体性幹細胞は、成体の皮膚、骨髄、脂肪などに存在しており、試験管内で未分化な状態で増殖可能である。また、特定の組織の細胞への分化が可能である。
【0003】
ここで、組織再生の中でも、重要度の高いものの一つとして、神経再生が挙げられる。神経細胞は、発生初期に増殖、分布することにより神経系が構築されて以降は自己再生能に乏しく、一度傷害を受けた神経組織は修復されないと考えられている。そのため、幹細胞から分化させた神経細胞を移植することで、傷害を受けた神経組織を修復する技術が求められている。
【0004】
例えば、特許文献１には、脂肪組織間質細胞が幼若な神経細胞のマーカーを発現するように分化誘導することが記載されており、脂肪組織間質細胞を脂肪組織から採取する段階と、脂肪組織間質細胞をｄｃＡＭＰまたはホルスコリンを含む培地で培養する段階とを有する分化誘導の方法が記載されている。
【0005】
また、特許文献２には、フォン・ヒッペル・リンドー(ＶＨＬ)蛋白質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドであるＶＨＬオリゴペプチド（配列番号１のアミノ酸配列：TLKERCLQVVRSLVK）に、細胞膜を容易に貫通する作用を有する融合蛋白ＴＡＴ（配列番号２のアミノ酸配列：YGRKKRRQRRRD）を結合させて合成したペプチドであるＴＡＴ－ＶＨＬ（１５７－１７１）を用いて、神経幹細胞を神経細胞へ分化させることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特開2013-63088号公報
【文献】特開2005-330206号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上述のように、神経細胞は原則として分裂・増殖しないため、移植等における治療のために、間葉系幹細胞から神経細胞を効率よく、安全に得る技術が望まれている。
また、一般的に、神経細胞分化誘導培地には、間葉系幹細胞を神経細胞に分化させる強い作用があり、細胞毒性を示す成分は含まれていないものの、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が使用されている。ＦＢＳは、異種動物由来成分で、抗原性と人畜共通ウイルス感染のリスクがあり、上記投与／移植先において使用することは難しい。
また、一般的に、神経細胞分化誘導培地には、間葉系幹細胞を神経細胞に分化させる強い作用があり、細胞毒性を示す成分は含まれていないものの、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が使用されている。ＦＢＳは、異種動物由来成分で、抗原性と人畜共通ウイルス感染のリスクがあり、上記投与／移植先において使用することは難しい。
【0008】
上記事情に鑑み、本発明者により更なる検討が進められた結果、神経細胞分化誘導培地に代えて使用可能であり、かつ、間葉系幹細胞から調製可能である、神経細胞分化誘導成分を含む細胞産生タンパク質（cell producing proteins、ＣＰＰｓ）を用いた神経細胞への分化誘導方法を新規に知見し、本発明に至った。
【0009】
本発明は、上述した実情に鑑みてなされたものであり、間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導することを目的とする。より具体的には、間葉系幹細胞の培養液から得られた成分を用いて、間葉系幹細胞を神経細胞に分化させることを可能にする、神経細胞への分化誘導方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、上記の知見に基づきなされたものであって、上記課題を有利に解決することを目的とするものであり、本発明の第１の態様は、
ａ）６０.０～９０.０ｖｏｌ％の基礎培地と、
１０.０～４０.０ｖｏｌ％の生理食塩水と、
を含み、さらに、
１.０～１００.０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２と、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦと、
０．５～８．０ｍＭのリン酸アスコルビルマグネシウムと、
が添加されて構成される、幹細胞培養用培地で、間葉系幹細胞を１～１０日間培養し、
ｂ）その後、上記培養により得られた培養液のタンパク質成分を有機溶媒で沈殿させ、
ｃ）沈殿部分を分取して生理食塩水または基礎培地に溶解させることにより得られる、
細胞産生タンパク質（ＣＰＰｓ）組成物を含む培地を用いて、３×１０３～２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した間葉系幹細胞を１～３日間培養することにより、間葉系幹細胞を神経細胞に分化させる、神経細胞への分化誘導方法である。
このような神経細胞への分化誘導方法によれば、神経細胞分化誘導培地を使用せずに、間葉系幹細胞から得られた成分を用いて、間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導することができる。
ａ）６０.０～９０.０ｖｏｌ％の基礎培地と、
１０.０～４０.０ｖｏｌ％の生理食塩水と、
を含み、さらに、
１.０～１００.０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２と、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦと、
０．５～８．０ｍＭのリン酸アスコルビルマグネシウムと、
が添加されて構成される、幹細胞培養用培地で、間葉系幹細胞を１～１０日間培養し、
ｂ）その後、上記培養により得られた培養液のタンパク質成分を有機溶媒で沈殿させ、
ｃ）沈殿部分を分取して生理食塩水または基礎培地に溶解させることにより得られる、
細胞産生タンパク質（ＣＰＰｓ）組成物を含む培地を用いて、３×１０３～２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した間葉系幹細胞を１～３日間培養することにより、間葉系幹細胞を神経細胞に分化させる、神経細胞への分化誘導方法である。
このような神経細胞への分化誘導方法によれば、神経細胞分化誘導培地を使用せずに、間葉系幹細胞から得られた成分を用いて、間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導することができる。
【0011】
上記態様においては、前記ＣＰＰｓ組成物は、コラーゲンを含み得る。
本願発明者は、ＣＰＰｓ組成物に含まれるコラーゲンが、幹細胞から神経細胞への分化誘導に寄与する特性を有することについても、新規に知見した。
また、上記コラーゲンは、Ｉ型のコラーゲンおよび／またはプロコラーゲンを含み得る。
本願発明者は、ＣＰＰｓ組成物に含まれるコラーゲンが、幹細胞から神経細胞への分化誘導に寄与する特性を有することについても、新規に知見した。
また、上記コラーゲンは、Ｉ型のコラーゲンおよび／またはプロコラーゲンを含み得る。
【0012】
上記態様においては、
前記ＣＰＰｓ組成物を含む培地が、ＴＡＴ‐ＶＨＬをさらに含むこととしてもよい。
このようにすることで、より高い効率で間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導することができる。
前記ＣＰＰｓ組成物を含む培地が、ＴＡＴ‐ＶＨＬをさらに含むこととしてもよい。
このようにすることで、より高い効率で間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導することができる。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、神経細胞分化誘導培地を使用せずに、間葉系幹細胞から得られた成分を用いて、間葉系幹細胞を神経細胞に分化させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明の第１の態様に係る神経細胞への分化誘導方法は、
ａ）６０.０～９０.０ｖｏｌ％の基礎培地と、
１０.０～４０.０ｖｏｌ％の生理食塩水と、
を含み、さらに、
１.０～１００.０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２と、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦと、
０．５～８．０ｍＭのリン酸アスコルビルマグネシウムと、
が添加されて構成される、幹細胞培養用培地で、間葉系幹細胞を１～１０日間培養し、
ｂ）その後、上記培養により得られた培養液のタンパク質成分を有機溶媒で沈殿させ、
ｃ）沈殿部分を分取して生理食塩水または基礎培地に溶解させることにより得られる、
細胞産生タンパク質（ＣＰＰｓ）組成物を含む培地を用いて、３×１０３～２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した間葉系幹細胞を１～３日間培養することにより、間葉系幹細胞を神経細胞に分化させることを特徴とする。
本発明の第１の態様に係る神経細胞への分化誘導方法は、
ａ）６０.０～９０.０ｖｏｌ％の基礎培地と、
１０.０～４０.０ｖｏｌ％の生理食塩水と、
を含み、さらに、
１.０～１００.０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２と、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦと、
０．５～８．０ｍＭのリン酸アスコルビルマグネシウムと、
が添加されて構成される、幹細胞培養用培地で、間葉系幹細胞を１～１０日間培養し、
ｂ）その後、上記培養により得られた培養液のタンパク質成分を有機溶媒で沈殿させ、
ｃ）沈殿部分を分取して生理食塩水または基礎培地に溶解させることにより得られる、
細胞産生タンパク質（ＣＰＰｓ）組成物を含む培地を用いて、３×１０３～２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した間葉系幹細胞を１～３日間培養することにより、間葉系幹細胞を神経細胞に分化させることを特徴とする。
【0016】
上記幹細胞培養用培地を用いて培養された間葉系幹細胞から、後述する細胞産生タンパク質（ＣＰＰｓ）組成物が得られることを、本発明者は新規に知見した。
基礎培地としては、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ、α‐ＭＥＭを使用することができる。上記幹細胞培養用培地の組成において、生理食塩水を加える目的は、上記基礎培地中のＣａ濃度を１０～４０％に下げることを目的とする。そのため、使用する基礎培地のＣａ濃度が４０～５０μｇ／ｍＬである場合には生理食塩水で希釈する必要はない。
基礎培地としては、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ、α‐ＭＥＭを使用することができる。上記幹細胞培養用培地の組成において、生理食塩水を加える目的は、上記基礎培地中のＣａ濃度を１０～４０％に下げることを目的とする。そのため、使用する基礎培地のＣａ濃度が４０～５０μｇ／ｍＬである場合には生理食塩水で希釈する必要はない。
【0017】
上記幹細胞培養用培地に添加される添加因子に関し、ＥＧＦは上皮成長因子（Epidermal Growth Factor）、ＦＧＦ－２は線維芽細胞増殖因子２（fibroblast growth factor 2）、ＰＤＧＦは血小板由来成長因子（Platelet-Derived Growth Factor）である。上記添加因子は、一般的には、細胞を増殖させるため等の目的で基礎培地への添加因子としてそれぞれ使用されるものである。
上記本発明の第１の態様に係る幹細胞培養用培地において、
ＥＧＦを１～１０ｎｇ／ｍＬ、
ＦＧＦ‐２を０．５～５．０ｎｇ／ｍＬ、
ＰＤＧＦを０．５～５．０ｎｇ／ｍＬ、
の範囲で添加すると、より効率よくＣＰＰｓ組成物を産生することができる。
上記本発明の第１の態様に係る幹細胞培養用培地において、
ＥＧＦを１～１０ｎｇ／ｍＬ、
ＦＧＦ‐２を０．５～５．０ｎｇ／ｍＬ、
ＰＤＧＦを０．５～５．０ｎｇ／ｍＬ、
の範囲で添加すると、より効率よくＣＰＰｓ組成物を産生することができる。
【0018】
また、上記幹細胞培養用培地において、
０．１～１０．０μｇ／ｍＬトランスフェリン、および／または
０．２～２０．０μｇ／ｍＬインスリン、および／または
０．１～３．０ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム
をさらに添加することは、細胞の増殖性能を高める観点から好適である。
０．１～１０．０μｇ／ｍＬトランスフェリン、および／または
０．２～２０．０μｇ／ｍＬインスリン、および／または
０．１～３．０ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム
をさらに添加することは、細胞の増殖性能を高める観点から好適である。
【0019】
幹細胞培養用培地の具体的は調製方法としては、例えば、
５００ｍＬ入りのＩＭＤＭから５０ｍＬから２００ｍLを除去し、等量の生理食塩水を添加して、５００ｍＬとし、これに抗生物質を５ｍＬ加え、
さらに、
ＥＧＦを１～１０ｎｇ／ｍＬ、
ＦＧＦ‐２を０．５～５．０ｎｇ／ｍＬ、
ＰＤＧＦを０．５～５．０ｎｇ／ｍＬ、
トランスフェリンを０．１～１０．０μｇ／ｍＬ、
インスリンを０．２～２０．０μｇ／ｍＬ、
亜セレン酸ナトリウムを０．１～３．０ｎｇ／ｍＬ、
リン酸Ｌ－アスコルビルマグネシウムを０．５～８．０ｍＭ、
の範囲で添加して作製することができる。
５００ｍＬ入りのＩＭＤＭから５０ｍＬから２００ｍLを除去し、等量の生理食塩水を添加して、５００ｍＬとし、これに抗生物質を５ｍＬ加え、
さらに、
ＥＧＦを１～１０ｎｇ／ｍＬ、
ＦＧＦ‐２を０．５～５．０ｎｇ／ｍＬ、
ＰＤＧＦを０．５～５．０ｎｇ／ｍＬ、
トランスフェリンを０．１～１０．０μｇ／ｍＬ、
インスリンを０．２～２０．０μｇ／ｍＬ、
亜セレン酸ナトリウムを０．１～３．０ｎｇ／ｍＬ、
リン酸Ｌ－アスコルビルマグネシウムを０．５～８．０ｍＭ、
の範囲で添加して作製することができる。
【0020】
（細胞産生タンパク質（ＣＰＰｓ）組成物）
上記ＣＰＰｓ組成物は、
間葉系幹細胞を上記幹細胞培養用培地で１～１０日間培養し、
その後、有機溶媒で上記培養により得られた培養液のタンパク質成分を沈殿させ、
沈殿部分を分取して生理食塩水または基礎培地に溶解させる、
ことにより得られる、間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導するための、ＣＰＰｓ組成物であることを特徴とする。
上記ＣＰＰｓ組成物は、
間葉系幹細胞を上記幹細胞培養用培地で１～１０日間培養し、
その後、有機溶媒で上記培養により得られた培養液のタンパク質成分を沈殿させ、
沈殿部分を分取して生理食塩水または基礎培地に溶解させる、
ことにより得られる、間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導するための、ＣＰＰｓ組成物であることを特徴とする。
【0021】
ＣＰＰｓ組成物は、Ｉ型プロコラーゲンとヒアルロン酸と、を含み、前記Ｉ型プロコラーゲンにはカルシウムが結合していることとしてもよい。
ＣＰＰｓ組成物には、例えば、Ｉ型プロコラーゲンは３０～１００μｇ／ｍＬ含まれ、ヒアルロン酸は４９～１４０μｇ／ｍＬ含まれる。Ｉ型プロコラーゲンとカルシウムの結合割合は、例えば、３０～４５％、好適には、３５～４２％である。
ＣＰＰｓ組成物には、例えば、Ｉ型プロコラーゲンは３０～１００μｇ／ｍＬ含まれ、ヒアルロン酸は４９～１４０μｇ／ｍＬ含まれる。Ｉ型プロコラーゲンとカルシウムの結合割合は、例えば、３０～４５％、好適には、３５～４２％である。
【0022】
上記第１の態様において、ＣＰＰｓ組成物の作成に使用される間葉系幹細胞としては、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯Wharton's Jelly(ウォートンジェリー)由来間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞等を使用することができる。基礎培地としては、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ、α‐ＭＥＭを使用することができる。培養期間は、１～１０日間であり、好適には、３～４日である。
【0023】
また、上記第１の態様において、「タンパク質成分を有機溶媒で沈殿」させる工程の後の「沈殿部分を分取して生理食塩水または基礎培地に溶解させる」工程においては、有機溶媒で沈殿させたタンパク質成分をｐＨ１の塩酸（例えば、１Ｎ ＨＣｌ）に懸濁して、ｖｏｒｔｅｘ（例えば、約１０分間）し、その後、（例えば、１．２Ｎ ＮａＯＨを用いて）中和することにより、ウイルス不活化処理を合わせて行うこととしてもよい。その場合には、中和した溶液を遠心分離し、得られた上清をＣＰＰｓ組成物とする。
【0024】
（間葉系幹細胞の神経細胞への分化誘導方法）
上記ＣＰＰｓ組成物を用いて、所定の条件で培養することにより、間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導できることを、本発明者は新規に知見した。
本願発明に係る分化誘導方法は、ＣＰＰｓ組成物を含む培地を用いて、３×１０３～２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した間葉系幹細胞を１～３日間培養することにより、間葉系幹細胞を神経細胞に分化させることを特徴とする。５×１０３～１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した間葉系幹細胞を１～３日間培養すると、より分化誘導効率が高いので好適である。
このような神経細胞への分化誘導方法によれば、神経細胞分化誘導培地を使用せずに、間葉系幹細胞から得られた成分を用いて、間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導することができる。
ＣＰＰｓ組成物は、タンパク質濃度として８０～１２０μｇ／ｍＬであるものを、培地：ＣＰＰｓ組成物＝１：１／８～１、すなわち、培地に対して１２．５～５０.０ｖｏｌ％含まれることが好ましい。
また、上記第１の態様において、前記間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪、末梢血、臍帯、臍帯血、または歯髄由来であることとしてもよい。
上記ＣＰＰｓ組成物を用いて、所定の条件で培養することにより、間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導できることを、本発明者は新規に知見した。
本願発明に係る分化誘導方法は、ＣＰＰｓ組成物を含む培地を用いて、３×１０３～２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した間葉系幹細胞を１～３日間培養することにより、間葉系幹細胞を神経細胞に分化させることを特徴とする。５×１０３～１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した間葉系幹細胞を１～３日間培養すると、より分化誘導効率が高いので好適である。
このような神経細胞への分化誘導方法によれば、神経細胞分化誘導培地を使用せずに、間葉系幹細胞から得られた成分を用いて、間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導することができる。
ＣＰＰｓ組成物は、タンパク質濃度として８０～１２０μｇ／ｍＬであるものを、培地：ＣＰＰｓ組成物＝１：１／８～１、すなわち、培地に対して１２．５～５０.０ｖｏｌ％含まれることが好ましい。
また、上記第１の態様において、前記間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪、末梢血、臍帯、臍帯血、または歯髄由来であることとしてもよい。
【0025】
上記第１の態様においては、
前記ＣＰＰｓ組成物は、コラーゲンを含み得る。
また、前記コラーゲンは、Ｉ型のコラーゲンおよび／またはプロコラーゲンを含み得る。
Ｉ型のコラーゲンとは、皮膚や骨に多く存在するコラーゲンであり、α１（Ｉ）鎖２本（α1鎖コラーゲン）とα２（Ｉ）鎖１本（α２鎖コラーゲン）からなるヘテロ三量体である。
プロコラーゲン（コラーゲン前駆体）とは、コラーゲンの合成過程における前駆体であり、ペプチド鎖のN末端とC末端にプロコラーゲンペプチドを有しているものである。
これまで、培養容器への細胞の接着性を高めるために、培養容器のコーティング等にアテロコラーゲン（テロペプチドが切断されたコラーゲン）が使用されることはあったが、コラーゲンを分化誘導因子として使用することはなかった。
このように、コラーゲンが、所定の条件で、幹細胞の神経細胞分化誘導に寄与する、分化誘導因子としての特性を有することについては知られておらず、当該特性は、本願発明者が新規に知見したものである。また、ＣＰＰｓ組成物に含まれるコラーゲンは、ＣＰＰｓ組成物の生成工程においてテロペプチドを切断するような処理（例えば、ペプシン処理）を行っていないことから、ＣＰＰｓ組成物に含まれるコラーゲンは、matureコラーゲン（ネイティブコラーゲン／トポコラーゲン）およびプロコラーゲンである可能性が高いと考えられる。
前記ＣＰＰｓ組成物は、コラーゲンを含み得る。
また、前記コラーゲンは、Ｉ型のコラーゲンおよび／またはプロコラーゲンを含み得る。
Ｉ型のコラーゲンとは、皮膚や骨に多く存在するコラーゲンであり、α１（Ｉ）鎖２本（α1鎖コラーゲン）とα２（Ｉ）鎖１本（α２鎖コラーゲン）からなるヘテロ三量体である。
プロコラーゲン（コラーゲン前駆体）とは、コラーゲンの合成過程における前駆体であり、ペプチド鎖のN末端とC末端にプロコラーゲンペプチドを有しているものである。
これまで、培養容器への細胞の接着性を高めるために、培養容器のコーティング等にアテロコラーゲン（テロペプチドが切断されたコラーゲン）が使用されることはあったが、コラーゲンを分化誘導因子として使用することはなかった。
このように、コラーゲンが、所定の条件で、幹細胞の神経細胞分化誘導に寄与する、分化誘導因子としての特性を有することについては知られておらず、当該特性は、本願発明者が新規に知見したものである。また、ＣＰＰｓ組成物に含まれるコラーゲンは、ＣＰＰｓ組成物の生成工程においてテロペプチドを切断するような処理（例えば、ペプシン処理）を行っていないことから、ＣＰＰｓ組成物に含まれるコラーゲンは、matureコラーゲン（ネイティブコラーゲン／トポコラーゲン）およびプロコラーゲンである可能性が高いと考えられる。
【0026】
上記第１の態様においては、
前記ＣＰＰｓ組成物を含む培地が、ＴＡＴ‐ＶＨＬをさらに含むこととしてもよい。
ＴＡＴ‐ＶＨＬは、特開2005-330206号公報に記載の通り、フォン・ヒッペル・リンドー(ＶＨＬ)蛋白質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドであるＶＨＬオリゴペプチド（配列番号１のアミノ酸配列：TLKERCLQVVRSLVK）に、細胞膜を容易に貫通する作用を有する融合蛋白ＴＡＴ（配列番号２のアミノ酸配列：YGRKKRRQRRRD）を結合させて合成したペプチドである。
ＣＰＰｓ組成物にＴＡＴ‐ＶＨＬを組み合わせて使用することで、より高い効率で間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導することができる。
ＴＡＴ‐ＶＨＬは、ＣＰＰｓ組成物を含む培地中に０．３４～３．４０ｎｇ／ｍＬで含まれることが好ましい。
前記ＣＰＰｓ組成物を含む培地が、ＴＡＴ‐ＶＨＬをさらに含むこととしてもよい。
ＴＡＴ‐ＶＨＬは、特開2005-330206号公報に記載の通り、フォン・ヒッペル・リンドー(ＶＨＬ)蛋白質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドであるＶＨＬオリゴペプチド（配列番号１のアミノ酸配列：TLKERCLQVVRSLVK）に、細胞膜を容易に貫通する作用を有する融合蛋白ＴＡＴ（配列番号２のアミノ酸配列：YGRKKRRQRRRD）を結合させて合成したペプチドである。
ＣＰＰｓ組成物にＴＡＴ‐ＶＨＬを組み合わせて使用することで、より高い効率で間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導することができる。
ＴＡＴ‐ＶＨＬは、ＣＰＰｓ組成物を含む培地中に０．３４～３．４０ｎｇ／ｍＬで含まれることが好ましい。
【実施例】
【0027】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0028】
（実施例１）幹細胞培養用培地およびＣＰＰｓ組成物の調製
５００ｍＬ入りの幹細胞増殖用ＢＳＣＭ－ＰＬ２培地（バイオ未来工房社製）に、抗生物質としてAntibiotic-Antimycotic Mixed Stock Solution（ナカライテスク社製、製品番号：02892‐54）を５ｍＬ加え、ＣＰＰｓ組成物を作成するための幹細胞培養用培地を準備した。
次に、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に属する脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）（Lonza社製、製品番号：PT‐2501）４×１０５cells/mLを、２％ヒト血清を含むＢＭＣＭ‐ＰＬ１培地（バイオ未来工房社製）を用いてＴ‐７５フラスコ（SARSTEDT社製、製品番号：83.3911.002）で９０％コンフルエントになるまで培養し、トリプシン‐ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製、製品番号：32777‐44）で剥離した。その後、ハイパーフラスコ（コーニング社製）に２×１０６cells/mLで播種し、１％ヒト血清を含むＢＭＣＭ－ＰＬ１培地（バイオ未来工房社製）５６０ｍLでコンフルエントになるまで再度培養した。
５００ｍＬ入りの幹細胞増殖用ＢＳＣＭ－ＰＬ２培地（バイオ未来工房社製）に、抗生物質としてAntibiotic-Antimycotic Mixed Stock Solution（ナカライテスク社製、製品番号：02892‐54）を５ｍＬ加え、ＣＰＰｓ組成物を作成するための幹細胞培養用培地を準備した。
次に、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に属する脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）（Lonza社製、製品番号：PT‐2501）４×１０５cells/mLを、２％ヒト血清を含むＢＭＣＭ‐ＰＬ１培地（バイオ未来工房社製）を用いてＴ‐７５フラスコ（SARSTEDT社製、製品番号：83.3911.002）で９０％コンフルエントになるまで培養し、トリプシン‐ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製、製品番号：32777‐44）で剥離した。その後、ハイパーフラスコ（コーニング社製）に２×１０６cells/mLで播種し、１％ヒト血清を含むＢＭＣＭ－ＰＬ１培地（バイオ未来工房社製）５６０ｍLでコンフルエントになるまで再度培養した。
【0029】
その後、幹細胞増殖用ＢＳＣＭ－ＰＬ２培地（バイオ未来工房社製）に培地を交換して、５日間培養し、培地を全量回収して新たな幹細胞培養用培地培地５６０ｍLを加え、５日間さらに培養した。この培地の全量回収と添加を細胞が剥離するまで継続し、このようにして回収した培養上清について、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）を行って細胞残渣を除去した。その後、８０％エタノールまたはアセトンによる有機溶媒沈殿法で、タンパク質画分を分離した。このタンパク質画分をＰＢＳ（－）（ナカライテスク社製、製品番号：07269‐84）に溶解させ、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）によって不溶画分を除去し、再度、８０％エタノールまたはアセトンで沈殿させた。
【0030】
この沈殿を１Ｎ塩酸（ナカライテスク社製、製品番号：18320‐15）１０ｍLで溶解し、室温、２，５００ｒｐｍで１０分間、ｖｏｒｔｅｘで撹拌し、１．２Ｎ苛性ソーダ（ナカライテスク社製、製品番号：31511‐05）で中和してウイルス不活化処理を行い、その後、遠心して不溶物を除去した。最後に、０．４５μｍのフィルター（Cytiva社製、製品番号：6900‐2504）を通して滅菌処理し、ＣＰＰｓ組成物を得た。
【0031】
（実施例２）神経細胞への分化誘導分析１（ＣＰＰｓ組成物）
ＣＰＰｓ組成物を含む培地を用いて、神経細胞への分化誘導性能を分析した。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に属する脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）（Lonza社製、製品番号：PT‐5006）４×１０５cells/mLを、２％ヒト血清を含むＢＭＣＭ‐ＰＬ１培地（バイオ未来工房社製）を用いてＴ‐７５フラスコ（SARSTEDT社製、製品番号：83.3911.002）で９０％コンフルエントになるまで培養し、トリプシン‐ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製、製品番号：32777‐44）で剥離した。
ＣＰＰｓ組成物を含む培地を用いて、神経細胞への分化誘導性能を分析した。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に属する脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）（Lonza社製、製品番号：PT‐5006）４×１０５cells/mLを、２％ヒト血清を含むＢＭＣＭ‐ＰＬ１培地（バイオ未来工房社製）を用いてＴ‐７５フラスコ（SARSTEDT社製、製品番号：83.3911.002）で９０％コンフルエントになるまで培養し、トリプシン‐ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製、製品番号：32777‐44）で剥離した。
【0032】
上記ＡＳＣを５％ＦＢＳ（cytiva製、製品番号：SH30910.03）を含むＩＭＤＭ培地に懸濁して、２４ウェルプレート（SARSTEDT社製、製品番号：83.3922）に１×１０４cells/mLで播種し、翌日、１μＭのＴＡＴ‐ＶＨＬとＣＰＰｓ組成物（タンパク質濃度として８０～１２０μｇ／ｍＬ溶液）：ＩＭＤＭ（1：1）に交換して３日間培養した。
【0033】
まず、以下の手順でＮｉｓｓｌ染色を行った。ＣＰＰｓ組成物を添加して上記のように３日培養した細胞に、１０％中性ホルムアルデヒド液（ナカライテスク社製、製品番号：37152‐51）を添加し、１０分間固定した後、水で洗浄した。次に、クリシルバイオレット液（武藤化学株式会社製、製品番号：41022）を滴下し、３０分間放置後に水で洗浄し、撮影した。結果を図１に示す。
対照としてＩＭＤＭで培養した細胞では染色箇所はみられなかった（図１Ａ）。これに対し、ＣＰＰｓ組成物を含む培地で培養した細胞は、矢印で示されるように、細胞質において顆粒状に青色で染色されている部分がみられた（ニッスル小体）（図１Ｂ）。これにより、ＣＰＰｓ組成物を含む培地で培養することにより、間葉系幹細胞が神経細胞に分化誘導されたことが、形態的な観点から確認された。
対照としてＩＭＤＭで培養した細胞では染色箇所はみられなかった（図１Ａ）。これに対し、ＣＰＰｓ組成物を含む培地で培養した細胞は、矢印で示されるように、細胞質において顆粒状に青色で染色されている部分がみられた（ニッスル小体）（図１Ｂ）。これにより、ＣＰＰｓ組成物を含む培地で培養することにより、間葉系幹細胞が神経細胞に分化誘導されたことが、形態的な観点から確認された。
【0034】
次に、以下の手順で抗βIII‐チューブリン抗体による染色を行った。Ｎｉｓｓｌ染色で行った手順と同様にして固定した細胞に、１％ヒトアルブミン水溶液を添加してブロッキングし、水で洗浄した。その後、抗βIII‐チューブリン抗体Alexa Fluor 488（Merck Millipore、製品番号：AB15708A）と1時間冷蔵で反応させて、水で洗浄した後に蛍光顕微鏡（キーエンス製、BZ‐X800）で撮影した。
上記の方法で抗ニューロン特異的抗βIII‐チューブリン抗体‐Alexa Fluor 488で細胞質を染色した後に、５μｇ／ｍＬのHoechst 33342（ThermoFisher社製、製品番号：H3570）水溶液を添加し、遮光下３～５分間インキュベートしてで核を染色した。水溶液を除去し、水洗して蛍光顕微鏡で撮影した。結果を図２に示す。
ＩＭＤＭでは突起伸展は見られなかった（図２Ａ）。これに対し、ＣＰＰｓ組成物を含む培地で培養した細胞は、突起の伸展やネットワーク化が見られ、抗βIII‐チューブリン抗体‐Alexa Fluor 488による染色で緑色に染色された（図２Ｂ）。これにより、ＣＰＰｓ組成物を含む培地で培養することにより、間葉系幹細胞が神経細胞に分化誘導されたことが、形状的な観点から確認された。
上記の方法で抗ニューロン特異的抗βIII‐チューブリン抗体‐Alexa Fluor 488で細胞質を染色した後に、５μｇ／ｍＬのHoechst 33342（ThermoFisher社製、製品番号：H3570）水溶液を添加し、遮光下３～５分間インキュベートしてで核を染色した。水溶液を除去し、水洗して蛍光顕微鏡で撮影した。結果を図２に示す。
ＩＭＤＭでは突起伸展は見られなかった（図２Ａ）。これに対し、ＣＰＰｓ組成物を含む培地で培養した細胞は、突起の伸展やネットワーク化が見られ、抗βIII‐チューブリン抗体‐Alexa Fluor 488による染色で緑色に染色された（図２Ｂ）。これにより、ＣＰＰｓ組成物を含む培地で培養することにより、間葉系幹細胞が神経細胞に分化誘導されたことが、形状的な観点から確認された。
【0035】
次に、遺伝子解析として、上記のように培養した細胞のＲＮＡ抽出をMaxwell RSC simplyRNA（Promega、製品番号：AS1390）で行い、ｑＰＣＲをStepOne PLUS（ThermoFisher）および以下のTaqMan primer（ThermoFisher）を用いて行い、神経前駆細胞、神経細胞、および神経幹細胞等に特異的に発現するとされる、以下の遺伝子発現を分析した：
Ｏｃｔ３／４：Hs00999632_g1、
Ｎｅｓｔｉｎ：Hs04187831_g1、
ＭＡＰ2：Hs00258900_m1。
ＩＭＤＭで培養した細胞（対照）と、ＴＡＴ‐ＶＨＬ入りの培地で培養した細胞と、ＣＰＰｓ組成物入りの培地で培養した細胞との神経特異的な遺伝子の発現を比較した。結果を図３に示す。グラフの縦軸はＩＭＤＭを基準にしたｍＲＮＡ発現比である。図３から、ＣＰＰｓ組成物で分化誘導した細胞のみ、神経細胞への分化誘導を評価するための指標の１つとされるネスチン（Nestin）の発現が大幅に高くなっていることがわかる。これにより、ＣＰＰｓ組成物を含む培地で培養することにより、間葉系幹細胞が神経細胞に分化誘導されたことが、遺伝子学的な観点から確認された。
以上の結果から、ＣＰＰｓ組成物を含む培地で培養した細胞が、神経細胞に分化誘導されたことがわかる。
Ｏｃｔ３／４：Hs00999632_g1、
Ｎｅｓｔｉｎ：Hs04187831_g1、
ＭＡＰ2：Hs00258900_m1。
ＩＭＤＭで培養した細胞（対照）と、ＴＡＴ‐ＶＨＬ入りの培地で培養した細胞と、ＣＰＰｓ組成物入りの培地で培養した細胞との神経特異的な遺伝子の発現を比較した。結果を図３に示す。グラフの縦軸はＩＭＤＭを基準にしたｍＲＮＡ発現比である。図３から、ＣＰＰｓ組成物で分化誘導した細胞のみ、神経細胞への分化誘導を評価するための指標の１つとされるネスチン（Nestin）の発現が大幅に高くなっていることがわかる。これにより、ＣＰＰｓ組成物を含む培地で培養することにより、間葉系幹細胞が神経細胞に分化誘導されたことが、遺伝子学的な観点から確認された。
以上の結果から、ＣＰＰｓ組成物を含む培地で培養した細胞が、神経細胞に分化誘導されたことがわかる。
【0036】
（実施例３）神経細胞への分化誘導分析２（ＣＰＰｓ組成物＋ＴＡＴ‐ＶＨＬ）
ＣＰＰｓ組成物とＴＡＴ‐ＶＨＬとを含む培地を用いて、神経細胞への分化誘導性能を分析した。
間葉系幹細胞としては、実施例２と同様に、ロットの異なるＡＳＣ（Lonza社製、製品番号：PT‐5006）を用いて、培地にＴＡＴ‐ＶＨＬを添加すること以外については、実施例２と同じ手順で分析を行った。
具体的には、上記ＡＳＣを５％ＦＢＳ（cytiva製、製品番号：SH30910.03）を含むＩＭＤＭ培地に懸濁して、２４ウェルプレート（SARSTEDT社製、製品番号：83.3922）に１×１０４cells/mLで播種し、翌日、
（Ａ）２μＭのＴＡＴ‐ＶＨＬ：ＩＭＤＭ（１：１）、
（Ｂ）１μＭのＴＡＴ‐ＶＨＬとＣＰＰｓ組成物（タンパク質濃度として８０～１２０μｇ／ｍＬ溶液）：ＩＭＤＭ（1：1）、
にそれぞれ交換して３日間培養した。ＩＭＤＭのままのものを対照とした。結果を図４に示す。
ＣＰＰｓ組成物とＴＡＴ‐ＶＨＬとを含む培地を用いて、神経細胞への分化誘導性能を分析した。
間葉系幹細胞としては、実施例２と同様に、ロットの異なるＡＳＣ（Lonza社製、製品番号：PT‐5006）を用いて、培地にＴＡＴ‐ＶＨＬを添加すること以外については、実施例２と同じ手順で分析を行った。
具体的には、上記ＡＳＣを５％ＦＢＳ（cytiva製、製品番号：SH30910.03）を含むＩＭＤＭ培地に懸濁して、２４ウェルプレート（SARSTEDT社製、製品番号：83.3922）に１×１０４cells/mLで播種し、翌日、
（Ａ）２μＭのＴＡＴ‐ＶＨＬ：ＩＭＤＭ（１：１）、
（Ｂ）１μＭのＴＡＴ‐ＶＨＬとＣＰＰｓ組成物（タンパク質濃度として８０～１２０μｇ／ｍＬ溶液）：ＩＭＤＭ（1：1）、
にそれぞれ交換して３日間培養した。ＩＭＤＭのままのものを対照とした。結果を図４に示す。
【0037】
実施例２と同様に、抗ニューロン特異的抗βIII‐チューブリン抗体‐Alexa Fluor 488で細胞質を染色し、Hoechst 33342で核を染色した。図４に示されるように、ＴＡＴ‐ＶＨＬのみ（図４Ａ）とＣＰＰｓ組成物＋ＴＡＴ－ＶＨＬ（図４Ｂ）とを比較すると、明らかにＣＰＰｓ組成物＋ＴＡＴ－ＶＨＬ（Ｂ）で誘導した細胞のほうが、突起伸展が多く、突起が長く伸展していることがわかる。これにより、ＣＰＰｓ組成物に加えてＴＡＴ－ＶＨＬを含む培地で培養することにより、より効率的に、間葉系幹細胞が神経細胞に分化誘導されたことが、形状的な観点から確認された。
【0038】
次に、実施例２と同様に、遺伝子解析として、上記のように培養した細胞のＲＮＡ抽出を行い、ｑＰＣＲを行って、神経前駆細胞、神経細胞、および神経幹細胞等に特異的に発現するとされる、以下の遺伝子発現を分析した：
Ｏｃｔ３／４：Hs00999632_g1、
Ｎｅｓｔｉｎ：Hs04187831_g1、
ＭＡＰ2：Hs00258900_m1。
結果を図５に示す。グラフの縦軸はＩＭＤＭを基準にしたｍＲＮＡ発現比である。
図５から、ＴＡＴ－ＶＨＬ、ＣＰＰｓ組成物、それぞれの単独よりも、ＣＰＰｓ組成物＋ＴＡＴ－ＶＨＬで分化誘導した細胞は、対照（ＩＭＤＭ）、ＴＡＴ－ＶＨＬ単独、ＣＰＰｓ組成物単独の培養と比較して、ネスチンとのＭＡＰ２の発現が大幅に高くなっていることがわかる。これにより、ＣＰＰｓ組成物に加えてＴＡＴ－ＶＨＬを含む培地で培養することにより、より効率的に、間葉系幹細胞が神経細胞に分化誘導されたことが、遺伝子学的な観点から確認された。
これらの結果から、ＴＡＴ－ＶＨＬ＋ＣＰＰｓ組成物を含む培地で誘導した細胞は、より効率よく、神経細胞に分化誘導されたことがわかる。
Ｏｃｔ３／４：Hs00999632_g1、
Ｎｅｓｔｉｎ：Hs04187831_g1、
ＭＡＰ2：Hs00258900_m1。
結果を図５に示す。グラフの縦軸はＩＭＤＭを基準にしたｍＲＮＡ発現比である。
図５から、ＴＡＴ－ＶＨＬ、ＣＰＰｓ組成物、それぞれの単独よりも、ＣＰＰｓ組成物＋ＴＡＴ－ＶＨＬで分化誘導した細胞は、対照（ＩＭＤＭ）、ＴＡＴ－ＶＨＬ単独、ＣＰＰｓ組成物単独の培養と比較して、ネスチンとのＭＡＰ２の発現が大幅に高くなっていることがわかる。これにより、ＣＰＰｓ組成物に加えてＴＡＴ－ＶＨＬを含む培地で培養することにより、より効率的に、間葉系幹細胞が神経細胞に分化誘導されたことが、遺伝子学的な観点から確認された。
これらの結果から、ＴＡＴ－ＶＨＬ＋ＣＰＰｓ組成物を含む培地で誘導した細胞は、より効率よく、神経細胞に分化誘導されたことがわかる。
【0039】
（実施例４）ＣＰＰｓ組成物の分析１
ＣＰＰｓ組成物について、Ｉ型アテロコラーゲン（第一ファインケミカル社製、製品番号：Y‐1）とともに、１０％ゲルのＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動後、ニトロセルロース膜に転写させて、ウエスタンブロッティング（Western Blotting）を行った（羊土社、タンパク質実験ノート下改定第４版に準じて実施）。結果を図６に示す。図６のＡはＣＢＢ染色（ナカライテスク社製、製品番号：04543‐51）の結果であり、図６のＢは抗Procollagen 1C-Terminal Propeptide（抗ＰＩＣＰ）抗体（Cloud-Clone Crop社製、製品番号：PAA570Hu08）と反応させて得られた泳動パターンである。
図６のＡ（b）に示されるように、I型アテロコラーゲンは、ＣＢＢ染色で約１２０ｋＤａ（質量）の２本鎖として示されたが、プロペプチドのＣ末端を標識する抗ＰＩＣＰ抗体には反応せず、図６のＢ（b）に示されるように、バンドは検出されなかった。
一方、図６の（c）および（d）で示されるＣＰＰｓ組成物は、約１２０～２００ｋＤａで少なくとも４つのバンド（４本鎖）が検出されている。この結果から、ＣＰＰｓ組成物のコラーゲンには、Ｉ型コラーゲンに加えて、Ｉ型プロコラーゲンが含まれていることが示された。なお、図６のＢの矢印はプロコラーゲンのバンドを示している。
ＣＰＰｓ組成物について、Ｉ型アテロコラーゲン（第一ファインケミカル社製、製品番号：Y‐1）とともに、１０％ゲルのＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動後、ニトロセルロース膜に転写させて、ウエスタンブロッティング（Western Blotting）を行った（羊土社、タンパク質実験ノート下改定第４版に準じて実施）。結果を図６に示す。図６のＡはＣＢＢ染色（ナカライテスク社製、製品番号：04543‐51）の結果であり、図６のＢは抗Procollagen 1C-Terminal Propeptide（抗ＰＩＣＰ）抗体（Cloud-Clone Crop社製、製品番号：PAA570Hu08）と反応させて得られた泳動パターンである。
図６のＡ（b）に示されるように、I型アテロコラーゲンは、ＣＢＢ染色で約１２０ｋＤａ（質量）の２本鎖として示されたが、プロペプチドのＣ末端を標識する抗ＰＩＣＰ抗体には反応せず、図６のＢ（b）に示されるように、バンドは検出されなかった。
一方、図６の（c）および（d）で示されるＣＰＰｓ組成物は、約１２０～２００ｋＤａで少なくとも４つのバンド（４本鎖）が検出されている。この結果から、ＣＰＰｓ組成物のコラーゲンには、Ｉ型コラーゲンに加えて、Ｉ型プロコラーゲンが含まれていることが示された。なお、図６のＢの矢印はプロコラーゲンのバンドを示している。
【0040】
（実施例５）ＣＰＰｓ組成物の分析２
ＣＰＰｓ組成物に少量含まれるコラーゲンを分析するために、別途精製した。
実施例２で使用したＡＳＣをＢＳＣＭ‐ＰＬ１培地にてＴ‐１７５フラスコで１００％コンフルエントにまで増殖させ、その後、５ｍＭのリン酸アスコルビルマグネシウムを添加した５０ｍＬの培地で４日間培養し、その培養上清を回収した。細胞が剥離するまで数回の培養を繰り返し、集めた培養上清から遠心で細胞破砕物等を除去し、塩析を行った。この塩析を８回繰り返して、コラーゲンを精製した。図７に、ＣＢＢ染色（ナカライテスク社製、製品番号：04543‐51）によるＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。観察されたバンドの位置から、（c）の精製コラーゲンにはα1鎖コラーゲンおよびα２鎖コラーゲンが比率２：１で含まれていることがわかる。このことから、ＣＰＰｓ組成物には、Ｉ型コラーゲンが含まれていることが、さらに確認された。
ＣＰＰｓ組成物に少量含まれるコラーゲンを分析するために、別途精製した。
実施例２で使用したＡＳＣをＢＳＣＭ‐ＰＬ１培地にてＴ‐１７５フラスコで１００％コンフルエントにまで増殖させ、その後、５ｍＭのリン酸アスコルビルマグネシウムを添加した５０ｍＬの培地で４日間培養し、その培養上清を回収した。細胞が剥離するまで数回の培養を繰り返し、集めた培養上清から遠心で細胞破砕物等を除去し、塩析を行った。この塩析を８回繰り返して、コラーゲンを精製した。図７に、ＣＢＢ染色（ナカライテスク社製、製品番号：04543‐51）によるＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。観察されたバンドの位置から、（c）の精製コラーゲンにはα1鎖コラーゲンおよびα２鎖コラーゲンが比率２：１で含まれていることがわかる。このことから、ＣＰＰｓ組成物には、Ｉ型コラーゲンが含まれていることが、さらに確認された。
【0041】
（実施例６）神経細胞への分化誘導分析３（精製コラーゲン）
図７の（c）精製コラーゲン（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含む培地を用いて、神経細胞への分化誘導性能を分析した。
間葉系幹細胞としては、実施例３と同様のＡＳＣ（Lonza社製、製品番号：PT‐5006）を用いて、培地に精製コラーゲン（０．１ｍｇ／ｍＬ）を添加すること以外については、実施例３と同じ手順で分析を行った。
具体的には、上記ＡＳＣを５％ＦＢＳ（cytiva製、製品番号：SH30910.03）を含むＩＭＤＭ培地に懸濁して、２４ウェルプレート（SARSTEDT社製、製品番号：83.3922）に１×１０４cells/mL/wellで播種し、翌日、
（Ａ）ＩＭＤＭ、
（Ｂ）５０μｇ／ｍＬ精製コラーゲン入りＩＭＤＭ、
（Ｃ）１μＭのＴＡＴ‐ＶＨＬ、
（Ｄ）５０μｇ／ｍＬ精製コラーゲン入りＩＭＤＭ：２μＭのＴＡＴ－ＶＨＬ：ＩＭＤＭ（１：１）、
にそれぞれ交換して３日間培養した。ＩＭＤＭのままのものを対照とした。結果を図８～１０に示す。
図７の（c）精製コラーゲン（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含む培地を用いて、神経細胞への分化誘導性能を分析した。
間葉系幹細胞としては、実施例３と同様のＡＳＣ（Lonza社製、製品番号：PT‐5006）を用いて、培地に精製コラーゲン（０．１ｍｇ／ｍＬ）を添加すること以外については、実施例３と同じ手順で分析を行った。
具体的には、上記ＡＳＣを５％ＦＢＳ（cytiva製、製品番号：SH30910.03）を含むＩＭＤＭ培地に懸濁して、２４ウェルプレート（SARSTEDT社製、製品番号：83.3922）に１×１０４cells/mL/wellで播種し、翌日、
（Ａ）ＩＭＤＭ、
（Ｂ）５０μｇ／ｍＬ精製コラーゲン入りＩＭＤＭ、
（Ｃ）１μＭのＴＡＴ‐ＶＨＬ、
（Ｄ）５０μｇ／ｍＬ精製コラーゲン入りＩＭＤＭ：２μＭのＴＡＴ－ＶＨＬ：ＩＭＤＭ（１：１）、
にそれぞれ交換して３日間培養した。ＩＭＤＭのままのものを対照とした。結果を図８～１０に示す。
【0042】
上記（Ｂ）５０μｇ／ｍＬ精製コラーゲン入りＩＭＤＭで培養した細胞では、図８において矢印で示されるように、細胞質において顆粒状に青色で染色されている部分がみられた（ニッスル小体）。これにより、ＣＰＰｓ組成物に含まれるコラーゲン成分は、間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導する作用に寄与していることが、形態的な観点から確認された。
【0043】
実施例２と同様に、抗ニューロン特異的抗βIII‐チューブリン抗体‐Alexa Fluor 488で細胞質を染色し、Hoechst 33342で核を染色したものを図９に示す。対照として（Ａ）ＩＭＤＭで培養した細胞（図９Ａ）と、（Ｄ）５０μｇ／ｍＬ精製コラーゲン入りＩＭＤＭで培養した細胞（図９Ｂ）と、を比較すると、明らかに（Ｂ）の細胞のほうが、突起伸展があることがわかる。これにより、ＣＰＰｓ組成物に含まれるコラーゲン成分は、間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導する作用に寄与していることが、形状的な観点から確認された。
【0044】
次に、実施例２と同様に、遺伝子解析として、上記のように培養した細胞のＲＮＡ抽出を行い、ｑＰＣＲを行って、神経前駆細胞、神経細胞、および神経幹細胞等に特異的に発現するとされる、以下の遺伝子発現を分析した：
Ｓｏｘ２：Hs00415716_m1、
Ｏｃｔ３／４：Hs00999632_g1、
Ｎｅｓｔｉｎ：Hs04187831_g1、
ＭＡＰ2：Hs00258900_m1、
ＮＦ（Neurofilament）：Hs00196245_m1。
結果を図１０に示す。縦軸はＩＭＤＭを基準にしたｍＲＮＡ発現比である。図１０から、（Ｂ）５０μｇ／ｍＬ精製コラーゲン入りＩＭＤＭで培養した細胞は、ニューロフィラメント（ＮＦ）が（Ｃ）１μＭのＴＡＴ‐ＶＨＬで培養した細胞と同等に発現されており、（Ｄ）５０μｇ／ｍＬ精製コラーゲン入りＩＭＤＭ：２μＭのＴＡＴ－ＶＨＬ：ＩＭＤＭ（１：１）で培養した細胞は、ＮＦに加えて、ネスチンの発現が顕著に高いことがわかる。これにより、ＣＰＰｓ組成物に含まれるコラーゲン成分は、間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導する作用に寄与していることが、遺伝子学的な観点から確認された。
これらの結果から、ＣＰＰｓ組成物に含まれるコラーゲン成分は、間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導する作用に寄与していることがわかる。
Ｓｏｘ２：Hs00415716_m1、
Ｏｃｔ３／４：Hs00999632_g1、
Ｎｅｓｔｉｎ：Hs04187831_g1、
ＭＡＰ2：Hs00258900_m1、
ＮＦ（Neurofilament）：Hs00196245_m1。
結果を図１０に示す。縦軸はＩＭＤＭを基準にしたｍＲＮＡ発現比である。図１０から、（Ｂ）５０μｇ／ｍＬ精製コラーゲン入りＩＭＤＭで培養した細胞は、ニューロフィラメント（ＮＦ）が（Ｃ）１μＭのＴＡＴ‐ＶＨＬで培養した細胞と同等に発現されており、（Ｄ）５０μｇ／ｍＬ精製コラーゲン入りＩＭＤＭ：２μＭのＴＡＴ－ＶＨＬ：ＩＭＤＭ（１：１）で培養した細胞は、ＮＦに加えて、ネスチンの発現が顕著に高いことがわかる。これにより、ＣＰＰｓ組成物に含まれるコラーゲン成分は、間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導する作用に寄与していることが、遺伝子学的な観点から確認された。
これらの結果から、ＣＰＰｓ組成物に含まれるコラーゲン成分は、間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導する作用に寄与していることがわかる。
【0045】
（実施例７）神経細胞への分化誘導分析４（骨髄由来幹細胞）
骨髄由来幹細胞（ＢＭ‐ＭＳＣ）（Lonza社製、製品番号：PT‐2501）４×１０５cells/mLを、２％ヒト血清を含むＢＭＣＭ‐ＰＬ１培地（バイオ未来工房社製）を用いてＴ‐７５フラスコ（SARSTEDT社製、製品番号：83.3911.002）で９０％コンフルエントになるまで培養し、トリプシン‐ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製、製品番号：32777‐44）で剥離した。
この細胞を用いて、ＢＭ‐ＭＳＣを５％FBS（cytiva製、カタログNo.SH30910.03）を含むＩＭＤＭ培地に懸濁し、２４ウェルプレート（SARSTEDT社製、製品番号：83.3922）に１×１０４cells/mL/wellで播種し、翌日、培地（Ａ）～（Ｄ）：
（Ａ）ＩＭＤＭ
（Ｂ）１μＭのＴＡＴ‐ＶＨＬ：ＩＭＤＭ（1：1）、
（Ｃ）ＣＰＰｓ組成物：ＩＭＤＭ（１：１）、
（Ｄ）２μＭのＴＡＴ‐ＶＨＬ：ＣＰＰｓ組成物１：１）
にそれぞれ交換して３日間培養した。ＩＭＤＭのままのものを対照とした。
実施例２と同様に、抗ニューロン特異的抗βIII‐チューブリン抗体‐Alexa Fluor 488で細胞質を染色し、Hoechst 33342で核を染色したものを図１１に示す。グラフの縦軸はＩＭＤＭを基準にしたｍＲＮＡ発現比である。
図１１に示されるように、培地（Ａ）では染色が薄く（図１１Ａ）、培地（Ｂ）ではあまり突起伸展が認められなかった（図１１Ｂ）。これに対し、培地（Ｃ）では突起伸展がみられ（図１１Ｃ）、さらに、培地（Ｄ）では突起伸展がより顕著にみられた（図１１Ｄ）。
この結果からＣＰＰｓ組成物を用いて培養することにより、骨髄由来幹細胞からも神経細胞に分化誘導できることが認められた。また、ＣＰＰｓ組成物にＴＡＴ‐ＶＨＬを組み合わせて使用することで、より高い効率で間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導できることが認められた。
骨髄由来幹細胞（ＢＭ‐ＭＳＣ）（Lonza社製、製品番号：PT‐2501）４×１０５cells/mLを、２％ヒト血清を含むＢＭＣＭ‐ＰＬ１培地（バイオ未来工房社製）を用いてＴ‐７５フラスコ（SARSTEDT社製、製品番号：83.3911.002）で９０％コンフルエントになるまで培養し、トリプシン‐ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製、製品番号：32777‐44）で剥離した。
この細胞を用いて、ＢＭ‐ＭＳＣを５％FBS（cytiva製、カタログNo.SH30910.03）を含むＩＭＤＭ培地に懸濁し、２４ウェルプレート（SARSTEDT社製、製品番号：83.3922）に１×１０４cells/mL/wellで播種し、翌日、培地（Ａ）～（Ｄ）：
（Ａ）ＩＭＤＭ
（Ｂ）１μＭのＴＡＴ‐ＶＨＬ：ＩＭＤＭ（1：1）、
（Ｃ）ＣＰＰｓ組成物：ＩＭＤＭ（１：１）、
（Ｄ）２μＭのＴＡＴ‐ＶＨＬ：ＣＰＰｓ組成物１：１）
にそれぞれ交換して３日間培養した。ＩＭＤＭのままのものを対照とした。
実施例２と同様に、抗ニューロン特異的抗βIII‐チューブリン抗体‐Alexa Fluor 488で細胞質を染色し、Hoechst 33342で核を染色したものを図１１に示す。グラフの縦軸はＩＭＤＭを基準にしたｍＲＮＡ発現比である。
図１１に示されるように、培地（Ａ）では染色が薄く（図１１Ａ）、培地（Ｂ）ではあまり突起伸展が認められなかった（図１１Ｂ）。これに対し、培地（Ｃ）では突起伸展がみられ（図１１Ｃ）、さらに、培地（Ｄ）では突起伸展がより顕著にみられた（図１１Ｄ）。
この結果からＣＰＰｓ組成物を用いて培養することにより、骨髄由来幹細胞からも神経細胞に分化誘導できることが認められた。また、ＣＰＰｓ組成物にＴＡＴ‐ＶＨＬを組み合わせて使用することで、より高い効率で間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導できることが認められた。
【0046】
このような本願発明に係る培養方法によれば、神経細胞分化誘導培地を使用せずに、間葉系幹細胞から得られた成分、さらには、自己細胞由来の成分を用いて、間葉系幹細胞を神経細胞に分化誘導することができる。
【要約】
ａ）６０.０～９０.０ｖｏｌ％の基礎培地と、
１０.０～４０.０ｖｏｌ％の生理食塩水と、
を含み、さらに、
１.０～１００.０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２と、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦと、
０．５～８．０ｍＭのリン酸アスコルビルマグネシウムと、
が添加されて構成される、幹細胞培養用培地で、間葉系幹細胞を１～１０日間培養し、
ｂ）その後、上記培養により得られた培養液のタンパク質成分を有機溶媒で沈殿させ、
ｃ）沈殿部分を分取して生理食塩水または基礎培地に溶解させることにより得られる、
細胞産生タンパク質（ＣＰＰｓ）組成物を含む培地を用いて、３×１０３～２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した間葉系幹細胞を１～３日間培養することにより、間葉系幹細胞を神経細胞に分化させる、神経細胞への分化誘導方法を提供する。
１０.０～４０.０ｖｏｌ％の生理食塩水と、
を含み、さらに、
１.０～１００.０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２と、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦと、
０．５～８．０ｍＭのリン酸アスコルビルマグネシウムと、
が添加されて構成される、幹細胞培養用培地で、間葉系幹細胞を１～１０日間培養し、
ｂ）その後、上記培養により得られた培養液のタンパク質成分を有機溶媒で沈殿させ、
ｃ）沈殿部分を分取して生理食塩水または基礎培地に溶解させることにより得られる、
細胞産生タンパク質（ＣＰＰｓ）組成物を含む培地を用いて、３×１０３～２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した間葉系幹細胞を１～３日間培養することにより、間葉系幹細胞を神経細胞に分化させる、神経細胞への分化誘導方法を提供する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】